CN210481367U - 一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，包括若干个芯片单元，每个芯片单元包括依次相通的PCR反应室、DNA纯化腔和转化腔，PCR反应室通过加样流道Ⅰ与加样孔Ⅰ相通，转化腔通过加样流道Ⅱ与加样孔Ⅱ相通；DNA纯化腔内设有DNA吸附柱，DNA纯化腔的底部靠近转化腔的位置设有废液排出孔，转化腔的底部靠近加样流道Ⅱ的位置设有转化菌回收孔。本实用新型以多通道同时完成多个蛋白位点从突变质粒构建到转化为突变克隆的过程，具有提高实验效率，减少污染和人为操作失误等有益效果。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种微反应芯片，尤其是涉及一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，属于生物实验技术领域。
背景技术
定向改造技术对天然酶蛋白的催化活性、抗氧化性、底物特异性、热稳定性及拓宽酶反应的底物范围、改进酶的别构效应等进行了成功的改造，被广泛应用于蛋白质功能位点结构研究、酶活性优化、DNA元件功能或元件互作、基因治疗等方面。
定向改造技术首先通过计算机模拟蛋白质的三维空间结构，分析结构和功能的关系，选择潜在的有益突变位点，再利用适当的饱和突变技术改变蛋白质中的个别氨基酸，构建突变文库，通过循环迭代，筛选出功能改进的蛋白质。但是定点饱和突变的过程需要同时构建大量不同突变菌株克隆，操作过程复杂、繁琐、重复性高，易引起人为操作失误，而且实验过程根据所设计的突变位点的数量需要构建相应数量的突变克隆，实验过程中各独立反应容器易发生混淆或交叉污染，反复开盖关盖工作量大且易打翻。
实用新型内容
本实用新型主要是针对现有定向突变克隆过程中操作复杂、重复性高、反应容器容易发生混淆或交叉污染的问题，提供一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，该芯片以本体作为反应场所，设为一个集成度高的封闭操作系统，且以多通道同时完成多个蛋白突变位点从突变质粒构建到转化为突变克隆的过程，省略传统实验方法中的多个中间产物转移步骤，提高实验效率，减少污染和人为操作失误。
本实用新型的目的主要是通过下述方案得以实现的：
一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，包括若干个芯片单元，每个所述芯片单元包括依次相通的PCR反应室、DNA纯化腔和转化腔，所述PCR反应室通过加样流道Ⅰ与加样孔Ⅰ相通，所述转化腔通过加样流道Ⅱ与加样孔Ⅱ相通；所述DNA纯化腔内设有DNA吸附柱，所述DNA纯化腔的底部靠近所述转化腔的位置设有废液排出孔，所述转化腔的底部靠近所述加样流道Ⅱ的位置设有转化菌回收孔；通过采用上述技术方案，设计成多通道的微反应芯片，可将质粒的PCR-去模板-纯化-转化整个过程集中于一张芯片完成，独立有序的反应腔室可防止混淆或交叉污染，各步骤以独立腔室一次串联，免去了反复开盖关盖的工作量和由此带来的人为操作失误，每个独立的芯片单元可以组合、拆分，可以根据需要选择组合数量，一次性进行12-96种位点突变类型克隆的制备。
作为优选，所述加样流道Ⅰ采用30°-45°折角的通道或者正弦波形的通道，所述加样流道Ⅱ采用直线型通道；30°-45°折角或者正弦波形通道的设置以防循环加热时PCR反应室内液体溢出。
作为优选，所述加样流道Ⅰ、PCR反应室、DNA纯化腔、转化腔和加样流道Ⅱ之间均以30°-60°的斜坡形式连通；所有连通处的斜坡均利于上一级液体流入且防止液体流入下一级腔体或通道。
作为优选，所述加样流道Ⅰ与所述PCR反应室之间的流通面积逐渐增大，所述PCR反应室与所述DNA纯化腔之间的流通面积逐渐减小；所述DNA纯化腔与所述转化腔之间的流通面积逐渐减小，所述转化腔与所述加样流道Ⅱ之间的流通面积逐渐增大。
作为优选，所述DNA纯化腔采用纺锤形的腔体,其最大直径为500μm -1000μm，长度为1000μm -2000μm。
作为优选，所述DNA吸附柱设置在DNA纯化腔底部中间位置，方便PCR反应产物被DNA吸附柱吸附。
作为优选，所述PCR反应室的底部设有外置加热模块，用于提供PCR反应室内PCR反应温度。
作为优选，所述废液排出孔和所述转化菌回收孔分别与负压装置相连通，便于将PCR反应液从PCR反应室吸入DNA纯化腔。
作为优选，所述加样流道Ⅰ和加样流道Ⅱ的通道直径为50μm -200μm。
作为优选，所述芯片单元设有8个或12个，12联通道结构适配实验室常用的12联排枪，通量上可一次构建12种（或11种，设置1个阴性对照）突变类型的克隆，且实际应用中可以一种八联卡槽平行插入8个芯片单元提高一次实验的通量。
因此，本实用新型具备下述优点：（1）芯片结构简单，操作方便，提高了检测效率和精度，并大大减少了资源的消耗；（2）以多通道同时完成多个蛋白位点从突变质粒构建到转化为突变克隆的过程，省略传统实验方法中的多个中间产物转移步骤，提高实验效率，减少污染和人为操作失误。
附图说明
图1是本实用新型的一种结构示意图；
图2是本实用新型芯片单元的结构示意图；
图3是本实用新型芯片单元的纵剖图；
图4是本实用新型芯片单元的底面示意图。
图示说明：1-加样孔Ⅰ，2-加样流道Ⅰ，3- PCR反应室，4- DNA纯化腔，5- DNA吸附柱，6-转化腔，7-加样流道Ⅱ，8-加样孔Ⅱ，9-加热模块，10-废液排出孔，11-转化菌回收孔，12-芯片单元。
具体实施方式
下面通过实施例，并结合附图，对本实用新型的技术方案作进一步具体的说明。
如图1和图2所示，本实用新型提供一种技术方案，一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，由12个芯片单元12，每个所述芯片单元12包括依次相通的PCR反应室3、DNA纯化腔4和转化腔6，所述PCR反应室3通过加样流道Ⅰ2与加样孔Ⅰ1相通，所述转化腔6通过加样流道Ⅱ7与加样孔Ⅱ8相通；所述加样流道Ⅰ2采用30°折角的通道，所述加样流道Ⅱ7采用直线型通道，加样流道Ⅰ2和加样流道Ⅱ7的通道直径为50μm -200μm，所述加样流道Ⅰ2、PCR反应室3、DNA纯化腔4、转化腔6和加样流道Ⅱ7之间均以45°的斜坡形式连通，且加样流道Ⅰ2与PCR反应室3之间的流通面积逐渐增大，PCR反应室3与DNA纯化腔4之间的流通面积逐渐减小，DNA纯化腔4与转化腔6之间的流通面积逐渐减小，转化腔6与加样流道Ⅱ7之间的流通面积逐渐增大；所述DNA纯化腔4采用纺锤形的腔体,其最大直径为800μm，长度为1500μm，DNA纯化腔4内底部中间位置还设有DNA吸附柱5。
如图3和图4所示，DNA纯化腔4的底部靠近所述转化腔6的位置设有废液排出孔10，转化腔6的底部靠近所述加样流道Ⅱ7的位置设有转化菌回收孔11，转化菌回收孔11连通有负压装置，PCR反应室3的底部设有外置加热模块9，废液排出孔10连通有负压装置。
根据本实用新型一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片定向突变克隆制备的过程步骤如下：
1、以12联排枪从加样孔Ⅰ1向PCR反应室3中注射10μLPCR Mix（含模板质粒、突变引物、buffer、Pfu Turbo聚合酶、SYBR GREEN I），每个PCR反应室3中的引物突变位点各不相同；
2、进行质粒环状PCR，通过荧光检测系统监视PCR扩增情况，反应条件如下：95℃10min，（95℃ 10s，54℃ 10s，72℃ 10s）*15循环，4℃ 10min；
3、通过负压装置引导PCR反应体系流经质粒DNA吸附柱5，使PCR突变产物附着于DNA吸附柱5上，其余液体从下方废液排出孔10排出；
4、从加样孔Ⅰ1中注入Dpn I酶切体系（包含Dpn I酶、buffer），通过负压装置将酶切体系吸入DNA吸附柱5腔室，反应液以充满腔室为宜，37℃温育3h，特异降解模板链；
5、酶切消化完成后，通过负压装置将反应体系从下方废液排出孔10吸除；
6、从加样孔Ⅰ1注入洗脱液（70%乙醇水溶液），洗去DNA吸附柱5腔室内的残留物，重复洗脱一次，废液从下方废液排出孔10排出；
8、从加样孔Ⅰ1向DNA纯化腔4注入无核酸酶水，洗脱DNA吸附柱5上的PCR突变片段，洗脱片段通过负压吸入转化腔6；
9、从加样孔Ⅱ8中注入大肠杆菌感受态，将突变质粒转化进入大肠杆菌感受态中，得到突变克隆；
10、从转化菌回收孔11收集转化后的突变克隆，平板涂布筛选。
本实施例中以12联通道的微反应芯片，可将质粒的PCR-去模板-纯化-转化整个过程集中于一张芯片完成，独立有序的反应腔室可防止混淆或交叉污染，各步骤以独立腔室一次串联，免去了反复开盖关盖的工作量和由此带来的人为操作失误，12联通道结构适配实验室常用的12联排枪，通量上可一次构建12种（或11种，设置1个阴性对照）突变类型的克隆。以多通道同时完成多个蛋白位点从突变质粒构建到转化为突变克隆的过程，提高实验效率，减少污染和人为操作失误。芯片单元可以组合、拆分，可以根据需要选择组合数量，一次性进行12-96种位点突变类型克隆的制备，方便实用。
应理解，该实施例中DNA吸附柱、加热模块和负压装置均为现有技术或本领域技术人员知晓的部件，其结构和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知，此外应理解，该实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。此外应理解，在阅读了本实用新型讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，其特征在于：该芯片包括若干个芯片单元（12），每个所述芯片单元（12）包括依次相通的PCR反应室（3）、DNA纯化腔（4）和转化腔（6），所述PCR反应室（3）通过加样流道Ⅰ（2）与加样孔Ⅰ（1）相通，所述转化腔（6）通过加样流道Ⅱ（7）与加样孔Ⅱ（8）相通；所述DNA纯化腔（4）内设有DNA吸附柱（5），所述DNA纯化腔（4）的底部靠近所述转化腔（6）的位置设有废液排出孔（10），所述转化腔（6）的底部靠近所述加样流道Ⅱ（7）的位置设有转化菌回收孔（11）。
2.根据权利要求1所述的一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，其特征在于：所述加样流道Ⅰ（2）采用30°-45°折角的通道或者正弦波形的通道，所述加样流道Ⅱ（7）采用直线型通道。
3.根据权利要求1所述的一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，其特征在于：所述加样流道Ⅰ（2）、PCR反应室（3）、DNA纯化腔（4）、转化腔（6）和加样流道Ⅱ（7）之间均以30°-60°的斜坡形式连通。
4.根据权利要求3所述的一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，其特征在于：所述加样流道Ⅰ（2）与所述PCR反应室（3）之间的流通面积逐渐增大，所述PCR反应室（3）与所述DNA纯化腔（4）之间的流通面积逐渐减小；所述DNA纯化腔（4）与所述转化腔（6）之间的流通面积逐渐减小，所述转化腔（6）与所述加样流道Ⅱ（7）之间的流通面积逐渐增大。
5.根据权利要求4所述的一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，其特征在于：所述DNA纯化腔（4）采用纺锤形的腔体,其最大直径为500μm -1000μm，长度为1000μm -2000μm。
6.根据权利要求5所述的一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，其特征在于：所述DNA吸附柱（5）设置在DNA纯化腔（4）底部中间位置。
7.根据权利要求1所述的一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，其特征在于：所述PCR反应室（3）的底部设有外置加热模块（9）。
8.根据权利要求7所述的一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，其特征在于：所述废液排出孔（10）和所述转化菌回收孔（11）分别与负压装置相连通。
9.根据权利要求1所述的一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，其特征在于：所述加样流道Ⅰ（2）和加样流道Ⅱ（7）的通道直径为50μm -200μm。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片，其特征在于：所述芯片单元（12）设有8个或12个。
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| CN201921464393.6U CN210481367U (zh) | 2019-09-04 | 2019-09-04 | 一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113481096A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-10-08 | 生物岛实验室 | 一种检测芯片及其使用方法 |
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- 2019-09-04 CN CN201921464393.6U patent/CN210481367U/zh active Active
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