CN112646851B - 一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法快速制备β‑烟酰胺单核苷酸的方法，以PRPP为原料，在此基础上添加烟酸和/或喹啉酸、铵离子、ATP、镁离子和/或锰离子以形成反应体系，该反应体系在EC 6.3.4.21酶和EC 6.3.1.5酶催化下，或在EC 2.4.2.19酶和EC 6.3.1.5酶催化下，或在EC 6.3.4.21酶、EC 6.3.1.5酶以及EC 2.4.2.19酶的催化下发生反应，快速制得β‑烟酰胺单核苷酸。本发明与化工法和混合法相比较，合成工艺稳定而迅速，整个过程无有机溶剂等污染物添加，绿色环保，且生产安全；与其它酶法生产方法相比，反应速度快、转化率高，生产成本低，底物范围广。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸，简称NMN，分子量334.22。研究表明，其对人体细胞修复，减缓衰老有重要的作用。近年来，Science、Nature、Cell等期刊刊登了多篇NMN功效研究的文章，哈佛大学实验更是证实补充NMN可将哺乳动物寿命延长30％以上，因此，NMN被看作是“长生不老药”，倍受保健品药品市场的追捧。但是目前NMN市场价格偏高，最便宜的国产制品价格约为每9000毫克1500元，进口制品价格更高，无法使普通百姓真正获益。
现有的NMN生产方法有化工法、酶促法以及两者相结合的方法。化工法是目前生产NMN的主流方法，但是生产过程复杂，中间体较多且稳定性差，纯化过程中有机溶剂污染较严重，另外，某些底物，如三氯氧磷有强腐蚀性、遇水易爆炸，因此，化工法有生产成本高、污染大且存在大量隐患等缺点。化工和酶法相结合的方法(以下称混合法)是先化工法合成烟酰胺核糖(NR，由于其没有酶促反应直接合成的方法，因此只能化工法合成)，再加入核糖基烟酰胺激酶(EC 2.7.1.22)，利用三磷酸腺苷(ATP)作为能量和磷酸供体一步合成NMN。该方法看似简单，但是NR化工合成也较复杂，污染物多，且总成本并不比化工合成NMN低，因此应用于工业化生产前景不佳。新兴的酶促法主要是利用烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT，EC2.4.2.12)，在有ATP和镁离子的环境中，催化磷酸核糖焦磷酸(PRPP)和烟酰胺(Nam)生成NMN，但是NAMPT被证实是限速酶(rate-limiting enzyme)，在物质合成过程中起到控制反应速度的作用，且对其产生抑制作用的物质较多，因此，利用该酶进行的反应，反应速度相对缓慢，且底物转化率相对较低。
发明内容
本发明提供了一种酶法制备β-烟酰胺单核苷酸(NMN)的方法，该方法不使用限速的EC 2.4.2.12酶，而使用其它高效酶进行反应，通过该方法可快速制备NMN，速度快，转化率高，并使其生产成本大大降低。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，所述方法是以PRPP为原料，在此基础上添加烟酸和/或喹啉酸、铵离子、ATP、镁离子和/或锰离子以形成反应体系，该反应体系在EC 6.3.4.21酶和EC 6.3.1.5酶的共同催化下，或在EC 2.4.2.19酶和EC 6.3.1.5酶的共同催化下，或在EC 6.3.4.21酶、EC 2.4.2.19酶以及EC 6.3.1.5酶的共同催化下发生化学反应，快速制备得到β-烟酰胺单核苷酸。也就是说EC 6.3.1.5酶是反应必须酶，EC6.3.4.21酶和EC 2.4.2.19酶可以任选其中一种与EC 6.3.1.5酶搭配起催化反应，当然也可以使用EC 6.3.4.21酶、EC 2.4.2.19酶两者一起再与EC 6.3.1.5酶配合一起催化反应。
优选地，上述技术方案中，所述PRPP是以腺苷酸(AMP)为原料，在EC 2.4.2.7酶的催化下，或在EC 2.4.2.57酶和EC 2.7.4.23两种酶的共同催化下，或在EC 2.4.2.7酶、EC2.4.2.57酶和EC 2.7.4.23三种酶共同催化下发生化学反应，快速制备得到的。也就是说，本发明并不是直接以PRPP为原料，而是通过在原反应体系中添加AMP和各种酶的反应直接生成PRPP，生成的PRPP在反应罐中直接用于反应。
优选地，上述技术方案中，所述AMP是以腺苷(Ado)为原料，在EC 2.7.1.20酶的催化下发生化学反应，制备得到的。也就是说，本发明并不是直接以PRPP为原料，而是通过在原反应体系中加入Ado和各种酶的反应，先生成AMP，再利用AMP和各种酶的反应直接生成PRPP，生成的PRPP在反应罐中直接用于反应。
也就是说，本申请的PRPP优选是以腺苷酸为原料经催化制得，而腺苷酸优选以腺苷为原料制得。当然，本发明并不以此为限，本领域技术人员可根据需要选择其他方式制备PRPP。当然，使用本发明的整体的制备方法能够实现快速、无污染、低成本、高转化地获得目的产物，同时生产中消耗的酶量少，更适用于工业生产。优选地，上述技术方案中，无论反应是从PRPP直接开始，还是以AMP或Ado开始，反应体系中均还包括钠离子和/或钾离子、Tris和/或磷酸根离子，所述体系反应的pH值为5.0-9.0，优选6.0-8.0；反应的温度20℃-50℃，优选30℃-45℃。
优选地，上述技术方案中，无论反应是从PRPP直接开始，还是以AMP或Ado开始，若非偶联ATP再生进行反应，反应体系中还包括ATP，所述反应的pH值为5.0-9.0，优选6.0-8.0；反应的温度20℃-50℃，优选30℃-45℃。反应体系未偶联ATP再生酶的反应中，各物质的添加量为：烟酸10-150mM和/或喹啉酸10-150mM、ATP 10-150mM、AMP 10-200mM(以AMP开始则需要添加)、腺苷10-200mM(以腺苷开始则需要添加)、镁离子10-150mM和/或锰离子10-100mM、铵离子10-500mM。除上述外，还可添加钠离子0-500mM和/或钾离子0-500mM、Tris 0-100mM和/或磷酸根0-100mM。
优选地，上述技术方案中，无论反应是从PRPP直接开始，还是以AMP或Ado开始，该方法均可还包括偶联ATP再生体系进行循环反应，所述循环反应的反应体系中还包括多聚磷酸盐以及EC 2.7.4.3酶、EC2.7.4.1酶和EC 2.7.4.B2酶的一种或多种。反应体系偶联ATP再生酶的反应中，ATP添加量可为0mM，AMP添加量可为0mM，多聚磷酸盐(以分子量平均600计算)根据反应所用腺苷和AMP总摩尔量相应添加，其它反应物添加量不变，烟酸10-150mM和/或喹啉酸10-150mM、腺苷10-200mM、镁离子10-150mM和/或锰离子10-100mM、铵离子10-500mM。除上述外，还可添加钠离子0-500mM和/或钾离子0-500mM、Tris 0-100mM和/或磷酸根0-100mM。
优选地，上述技术方案中，各酶添加量均为10-5000U，其中按照酶活比例来计算，催化相邻反应的酶活比为0.1-10，优选0.2-5。其中EC 6.3.4.21酶与EC 6.3.1.5酶活性比例优选为0.5-5，EC 2.4.2.19酶与EC 6.3.1.5酶活性比例优选为0.5-2。
优选地，上述技术方案中，所述烟酸可由烟酰胺经EC 3.5.1.19酶催化得来，所述喹啉酸可经EC 2.5.1.72酶和EC 1.4.3.16酶由L-天门冬氨酸催化得来。
本发明原理如下：
本发明不使用烟酰胺为底物(合成NMN路线一)，即通过效率较低的EC 2.4.2.12酶(MAMPT限速酶)催化PRPP生成NMN，而利用烟酸或/和喹啉酸为底物(合成NMN路线二)，通过效率较高的EC 6.3.4.21酶或/和EC 2.4.2.19酶催化PRPP生成β-烟酰胺单核苷酸(NaMN)，同时利用EC 6.3.1.5酶催化NaMN生成NMN。
两支路相对比，看似左侧支路用酶少，但实际在生产中，EC 2.4.2.12酶速度较慢，且转化率低，与之相反，右侧支路各酶速度均较快，可达左侧支路的2-5倍及以上，同时底物转化率较高，另外，通过调节酶的使用比例，烟酸利用率可达90％以上，且可有效避免副产物生成；左侧支路使用的两种或三种酶获取及纯化方式基本相同，成本方面并没有较多增加，因此很适合用于工业化生产。
由于底物PRPP成本较高，本发明利用AMP和/或腺苷生产PRPP，进一步降低生产成本。加入EC 2.7.1.20酶，催化腺苷生成腺苷酸(AMP)，再通过EC 2.4.2.7酶或者EC2.4.2.57酶和EC 2.7.4.23酶组合生成PRPP(EC 2.4.2.57酶和EC 2.7.4.23酶为捆绑式组合使用)，其中EC 2.4.2.57酶催化AMP生成1,5-二磷酸核糖，EC 2.7.4.23酶催化1,5-二磷酸核糖生成PRPP。
为进一步降低成本，反应可偶联ATP再生体系，减少ATP和/或AMP用量或者完全不使用ATP和/或AMP。具体原理为加入EC 2.7.4.3酶、EC2.7.4.1酶和EC 2.7.4.B2酶中的一种或几种。EC2.7.4.1酶催化ADP与多聚磷酸或其盐反应生成ATP，EC 2.7.4.3酶酶催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，EC 2.7.4.B2酶催化AMP与多聚磷酸或其盐反应生成ADP。
另外，生物体内的大部分EC 6.3.1.5酶催化烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，少数EC 6.3.1.5酶催化NaMN生成NMN，本发明使用的是后者。
本发明具有如下有益效果：
第一，与化工法和混合法相比较，优势明显，生物酶高效专一，因此使整个合成工艺稳定而迅速，且整个过程无有机溶剂等污染物添加，绿色环保，且生产安全。
第二，与其它酶法生产方法相比，本发明也有较大优势，主要体现在以下几方面：
1.反应速度快，转化率高：不使用限速酶EC 2.4.2.12酶，而使用速度较高的EC6.3.4.21酶或/和EC 2.4.2.19酶以及EC 6.3.1.5酶组合，因此反应高效迅速。NMN生成量可达30g/L反应液以上，底物转化率可达90％以上。
2.生产成本低：不使用高成本原料，如将PRPP替代以价格适中的ATP、AMP或低价的腺苷，若与ATP再生酶偶联，可仅以低价原料腺苷来生产，价格优势巨大。另一底物烟酸或/和喹啉酸市场价格均不高(市场价：烟酸等于烟酰胺低于喹啉酸)，且来源广泛。
3.底物范围广：PRPP可被ATP、AMP和腺苷三种原料中的一种或几种替代；另一方面，烟酸可由烟酰胺经EC 3.5.1.19酶催化得来，而喹啉酸可经EC 2.5.1.72酶和EC1.4.3.16酶由L-天门冬氨酸两步催化得来，合理添加用酶，原料可以为烟酸、喹啉酸、烟酰胺和L-天门冬氨酸，不受限于单一原料市场。
4.用酶成本低廉：本发明看似使用酶量较多，实则由于酶的高效性，反应添加总量并不多，且整个反应均可为廉价的粗纯酶，不使用高价纯酶。酶的纯化方式也基本相同，成本方面并没有较多增加。由于当今自动化、发酵工业成熟，制酶成本低廉。使用固定化技术可将酶重复利用，使酶成本进一步降低。
附图说明
图1为本发明酶促反应原理图。
图2为实施例1中所述部分酶的SDS-PAGE电泳图。
图3为实施例1中所述部分酶的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。
实施例1酶的制备
本发明方法中的所有酶可以商购获得，或者是经过人工改造获得的具有同样催化功能的酶。
酶的制备过程如下：
本专利所有涉及的酶编号(包括对比例)分别为EC 6.3.4.21、EC 2.4.2.19、EC6.3.1.5、EC 2.4.2.57、EC 2.7.4.23、EC 2.4.2.7、EC 2.4.2.12、EC2.7.4.1、EC 2.7.1.20、EC 2.7.4.3和EC 2.7.4.B2。
根据反应用酶各酶基因序列设计引物，通过PCR分别扩增出基因片段，并将其分别连接至相应载体(市售，可选择单表达载体或多表达载体)，经测序正确后，分别转入E.coliBL21(DE3)菌株(市售)。
将转化后的E.coli BL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导5小时收集菌体，使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。
将筛选出的高表达菌株分别使用发酵罐发酵，离心收集菌体。
其中LB培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％NaCl；种子培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化钠；发酵培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、5％磷酸氢二钠、1％磷酸二氢钠、0.01％硫酸镁和1％甘油。
图2和图3均为大肠杆菌表达的各酶的SDS-PAGE图，如图2所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(市售)；泳道2为EC 6.3.4.21酶，43kDa；泳道3为EC 2.4.2.19酶，40kDa；泳道4为EC 6.3.1.5酶，28kDa；泳道5为EC 2.4.2.57酶，52kDa；泳道6为EC 2.7.4.23酶，20kDa；泳道7为EC 2.4.2.7酶，23kDa；泳道8为EC 2.4.2.12酶，50kDa。如图3所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(市售)；泳道2为EC 2.7.4.1酶，38kDa；泳道3为EC 2.7.1.20酶，40kDa；泳道4为EC 2.7.4.3酶，26kDa；泳道5为EC 2.7.4.B2酶，55kDa。
收获的菌体可分别或按照反应用量混合，经超声或高压匀浆破菌后，离心收集上清。通过盐析方法一步沉淀蛋白，离心收集沉淀制得混合粗酶，可直接用于反应。
实施例2烟酸和PRPP为底物的反应
50ml的反应体系中含有0.15g烟酸、0.5g PRPP、0.3g Tris、0.2g氯化钾、0.25g六水氯化镁、0.25g硫酸铵和1.0g ATP，调节pH值至7.0，加入500U EC 6.3.4.21酶和500U EC6.3.1.5酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为35℃。
反应1小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为5.2g/L，2小时后检测NMN生成量为6.9g/L，3小时后检测NMN生成量7.4g/L，之后NMN几乎没有增加。烟酸转化率超过90％。
实施例3喹啉酸和PRPP为底物的反应
50ml的反应体系中含有0.2g喹啉酸、0.5g PRPP、0.3g Tris、0.2g氯化钾、0.25g六水氯化镁、0.25g硫酸铵和1.0g ATP，调节pH值至7.0，加入500U EC 2.4.2.19酶和500U EC6.3.1.5酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为35℃。
反应1小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为4.6g/L，2小时后检测NMN生成量为6.3g/L，3小时后检测NMN生成量6.7g/L，之后NMN几乎没有增加。烟酸转化率约为84％。
实施例4AMP为底物的反应
50L的反应体系中含有0.5kg烟酸、0.75kg十二水磷酸氢二钠、0.2kg氯化钠、0.5kg七水硫酸镁、0.3kg氯化铵、1.25kg AMP和1.5kg ATP，调节pH值至7.2，加入800U EC6.3.4.21酶、1000U EC 6.3.1.5酶、1200U EC 2.4.2.57酶和1200U EC 2.7.4.23酶开始反应。反应期间控制pH值为7.2，温度为37℃。
反应4小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为22g/L。
实施例5腺苷为底物的反应
50L的反应体系中含有0.75kg喹啉酸、0.25kg六水氯化镁、0.35kg硫酸铵、0.2kg焦磷酸钠、1.0kg腺苷和2.5kg ATP，调节pH值至7.5，加入1000U EC 2.4.2.19酶、2000U EC6.3.1.5酶、2500U EC 2.4.2.7酶和2000U EC 2.7.1.20酶开始反应。反应期间控制pH值为7.5，温度为30℃。
反应5小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为21g/L。
实施例6加入再生酶的反应
50L的反应体系中含有0.75kg烟酸、0.2kg氯化钾、0.5kg七水硫酸镁、0.4kg氯化铵、1.0kg腺苷和1.75kg多聚磷酸盐，调节pH值至6.8，加入1500U EC 6.3.4.21酶、750U EC6.3.1.5酶、1000U EC 2.4.2.57酶、1000U EC 2.7.4.23酶、2000U EC 2.7.1.20酶和1000UEC 2.7.4.1酶开始反应。1.5小时后补加1.0g腺苷，反应期间控制pH值为6.8，温度为40℃。
反应7小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为30g/L。
实施例7加入再生酶的反应
50L的反应体系中含有0.2kg氯化钾、0.5kg七水硫酸镁、0.13kg一水硫酸锰、0.4kg氯化铵、1.5kg多聚磷酸盐、1.0kg腺苷和0.05kg ATP，调节pH值至6.8，加入2000U EC2.7.1.20酶、1000U EC 2.7.4.1酶和100U EC 2.7.4.3酶开始反应。反应期间控制pH值为6.8，温度为37℃。反应2小时后，补加0.93kg烟酸、1.0kg腺苷和750U EC 6.3.4.21酶、1500UEC 6.3.1.5酶、1000U EC 2.4.2.57酶、1000U EC 2.7.4.23酶进行反应。
反应4小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为32g/L。
实施例8加入再生酶的反应
50L的反应体系中含有0.5kg烟酸、0.5kg喹啉酸、0.2kg氯化钾、0.5kg七水硫酸镁、0.4kg氯化铵、2.0kg腺苷和1.75kg多聚磷酸盐，调节pH值至6.8，加入2000U EC 6.3.4.21酶、1000U EC 2.4.2.19酶、2000U EC 6.3.1.5酶、1000U EC 2.4.2.57酶、1000U EC2.7.4.23酶、1000U EC 2.7.1.20酶和1000U EC 2.7.4.1酶开始反应。1.5小时后补加1.0kg腺苷，反应期间控制pH值为6.8，温度为40℃。
反应7小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为37g/L。
实施例9
按照实施例2和3配制溶液和加入酶，分别调节反应液pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，调节反应温度为20、25、30、35、40、45、50℃，反应结果如下表：
表1.pH值对NMN生成量的影响(单位：g/L，反应温度35℃)
表2.温度对NMN生成量的影响(单位：g/L，反应pH值7.0)
实施例10
按照实施例2配制溶液，分别调节反应液pH值至7.0，调节反应温度至35℃，EC6.3.1.5加入量为500U，按照一定比例调节反应用酶，结果如下表：
表3.以烟酸为底物反应不同酶配比NMN产量(单位：g/L，反应温度35℃)
按照实施例3配制溶液，分别调节反应液pH值至7.0，调节反应温度至35℃，按照一定比例调节反应用酶，结果如下表：
表4.以喹啉酸为底物反应不同酶配比NMN产量(单位：g/L，反应温度35℃)
实施例11
50L的反应体系中含有0.06kg烟酸、0.08kg喹啉酸、0.12kg Tris、0.25kg十二水磷酸氢二钠、0.2kg氯化钾、0.1kg六水氯化镁、0.027kg氯化铵、0.17kg AMP和0.27kg ATP，调节pH值至7.0，加入10U EC 6.3.4.21酶、10U EC 2.4.2.19酶、10U EC 6.3.1.5酶、10U EC2.4.2.57酶和10U EC 2.7.4.23酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为35℃。
反应4小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量约为1.2g/L。
实施例12
50L的反应体系中含有0.95kg烟酸、0.75kg氯化镁、1.9kg氯化钾、1.35kg氯化铵、1.7kg腺苷和2.25kg ATP，调节pH值至6.8，加入5000U EC 6.3.4.21酶、5000U EC 6.3.1.5酶、5000U EC 2.4.2.7酶和5000U EC 2.7.1.20酶开始反应。反应2小时后，补加1.0kg腺苷和2.0kg ATP。反应期间控制pH值为6.8，温度为35℃。
反应7小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为28g/L。
实施例13
50L的反应体系中含有0.95kg烟酸、1.9kg氯化钾、0.85kg一水硫酸锰、1.35kg氯化铵、1.7kg腺苷、2.5kg AMP和3.0kg多聚磷酸盐，调节pH值至6.8，加入5000U EC 6.3.4.21酶、1000U EC 6.3.1.5酶、5000U EC 2.4.2.57酶、500U EC 2.7.4.23酶、1000U EC2.7.1.20酶和5000U EC 2.7.4.1酶开始反应。1.5小时后补加1.0kg腺苷和1.0kg AMP，反应期间控制pH值为6.8，温度为40℃。
反应7小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为22g/L。
实施例14使用固定化酶进行反应
将实施例1中所述酶按照2500U EC 6.3.4.21酶、2000U EC 6.3.1.5酶、5000U EC2.4.2.7酶、3000U EC 2.7.1.20酶、1000U EC 2.7.4.1酶和1000U EC 2.7.4.B2酶混合配成混合酶液。在恒温搅拌反应罐中加入LX1000HA湿载体，按照固定化载体与酶质量比为20:1混合，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0)清洗2遍，即得固定化混合酶。将混合固定酶20kg装入反应柱设备，排尽气泡后制得酶反应柱。
配制反应液，50L的反应体系中含有0.75kg烟酸、0.2kg氯化钾、0.5kg七水硫酸镁、0.3kg氯化铵、1.5kg腺苷、1.5kg多聚磷酸盐和0.05kg ATP，调节pH值至6.8。使用恒流泵将反应液以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为35-40℃。反应6小时后，收集反应液，高效液相色谱(HPLC)高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为28g/L。
实施例15以烟酰胺为底物
50ml的反应体系中含有0.15g烟酰胺、0.5g PRPP、0.3g Tris、0.2g氯化钾、0.25g六水氯化镁、0.25g硫酸铵和1.0g ATP，调节pH值至7.0，加入500U EC 6.3.4.21酶、500U EC6.3.1.5酶和500U EC 3.5.1.19酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为35℃。
反应1小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为4.7g/L，2小时后检测NMN生成量为6.3g/L，3小时后检测NMN生成量6.9g/L，之后NMN几乎没有增加。烟酰胺转化率超过80％。
对比例1烟酰胺和PRPP为底物的反应
50ml的反应体系中含有0.15g烟酰胺、0.5g PRPP、0.3g Tris、0.2g氯化钾、0.25g六水氯化镁、0.25g硫酸铵和1.0g ATP，调节pH值至7.0，加入500U EC 2.4.2.12酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为35℃。
反应1小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为2.2g/L，2小时后检测NMN生成量为3.0g/L，4小时后检测NMN生成量为3.3g/L，之后NMN几乎没有增加。烟酰胺转化率约为42％。
该对比例1与实施例2、实施例3对比可知，使用EC 2.4.2.12酶反应速度较慢，且底物转化率低。
对比例2
50L的反应体系中含有0.5kg烟酰胺、0.2kg氯化钾、0.5kg七水硫酸镁、0.3kg氯化铵、1.0kg腺苷和1.0kg多聚磷酸盐，调节pH值至6.8，加入2000U EC 2.4.2.12酶、1000U EC2.4.2.57酶、1000U EC 2.7.4.23酶、2000U EC 2.7.1.20酶和1000U EC 2.7.4.1酶开始反应。反应期间控制pH值为6.8，温度为37℃。
反应7小时后，高效液相色谱(HPLC)检测NMN的生成量为11g/L。
该对比例与实施例6对比，使用EC 2.4.2.12酶底物转化率明显低。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (9)
1. 一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，
所述方法是以PRPP为原料，在此基础上添加烟酸、铵离子、ATP、镁离子和/或锰离子以形成反应体系， EC 6.3.4.21酶催化烟酸和PRPP生成NaMN，EC 6.3.1.5酶进一步催化NaMN，生成β-烟酰胺单核苷酸；或
所述方法是以PRPP为原料，在此基础上添加喹啉酸、铵离子、ATP、镁离子和/或锰离子以形成反应体系，EC 2.4.2.19酶催化喹啉酸和PRPP生成NaMN，EC 6.3.1.5酶进一步催化NaMN生成β-烟酰胺单核苷酸；或
所述方法是以PRPP为原料，在此基础上添加烟酸和喹啉酸、铵离子、ATP、镁离子和/或锰离子以形成反应体系，在EC 6.3.4.21酶及EC 2.4.2.19酶催化烟酸、喹啉酸和PRPP生成NaMN，EC 6.3.1.5酶进一步催化NaMN，生成β-烟酰胺单核苷酸。
2. 根据权利要求1所述的一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述PRPP是以AMP为原料，在EC 2.4.2.7酶的催化下，或在EC 2.4.2.57酶和EC 2.7.4.23酶共同催化下，或在EC 2.4.2.7酶、EC 2.4.2.57酶和EC 2.7.4.23酶共同催化下发生化学反应，快速制备得到的。
3. 根据权利要求2所述的一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述AMP是以腺苷为原料，在EC 2.7.1.20酶的催化下发生化学反应，制备得到的。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述反应体系中还包括钠离子和/或钾离子、Tris和/或磷酸根离子，所述体系反应的pH值为5.0-9.0；反应的温度20℃-50℃。
5. 根据权利要求4所述的一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述反应体系中底物添加量为：烟酸10-150 mM和/或喹啉酸10-150 mM、ATP 10-150 mM、镁离子10-150 mM和/或锰离子10-100 mM、铵离子10-500 mM、钠离子0-500 mM和/或钾离子0-500 mM、Tris 0-100 mM和/或磷酸根0-100 mM。
6. 根据权利要求1-3任一所述的一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，各酶添加量均为10-5000 U，其中按照酶活比例来计算， EC 6.3.4.21酶与EC6.3.1.5酶活性比例为0.5-5，EC 2.4.2.19酶与EC 6.3.1.5酶活性比例为0.5-2。
7. 根据权利要求1-3任一所述的一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述方法还包括偶联ATP再生体系进行循环反应，所述循环反应的反应体系中还包括多聚磷酸盐以及EC 2.7.4.3酶、EC 2.7.4.1酶和EC 2.7.4.B2酶的一种或多种。
8. 根据权利要求7所述的一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述偶联ATP再生体系进行循环反应中，底物添加量为：烟酸10-150 mM和/或喹啉酸10-150mM、镁离子10-150 mM和/或锰离子10-100 mM、铵离子10-500 mM。
9. 根据权利要求1所述的一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述烟酸由烟酰胺经EC 3.5.1.19酶催化得来，所述喹啉酸经EC 2.5.1.72酶和EC1.4.3.16酶由L-天门冬氨酸催化得来。
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