CN112280754A

CN112280754A - 一种[4+2]环化酶的氨基酸序列及其应用

Info

Publication number: CN112280754A
Application number: CN201910673434.0A
Authority: CN
Inventors: 胡友财; 陈其宾; 高洁; 刘家旺; 柏健; 刘冰语; 张晨
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2019-07-24
Filing date: 2019-07-24
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2039-07-24
Also published as: CN112280754B

Abstract

本发明公开了一种[4+2]环化酶的氨基酸序列及其应用，具体公开了一种分子间[4+2]环化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；还提供了编码该[4+2]环化酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示，及经密码子优化后的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示，使优化后的[4+2]环化酶的基因可以在大肠杆菌中表达；同时提供了含有所述核苷酸序列的蛋白表达载体和宿主细胞。本发明还公开了该[4+2]环化酶在催化分子间[4+2]环加成反应以制备抗肿瘤化合物neosetophomone B及其衍生物或其类似物或其立体异构体中的应用。

Description

一种[4+2]环化酶的氨基酸序列及其应用

技术领域

本发明属于合成生物学、基因工程领域，具体地，本发明涉及一种催化分子间[4+2]环化反应的[4+2]环化酶，其氨基酸序列及其在制备抗肿瘤化合物neosetophomone B及其立体异构体、类似物或其衍生物中应用。

背景技术

[4+2]环加成反应，即共轭双烯(4个π电子)与亲双烯(2个π电子)反应形成环己烯骨架的反应，是有机合成中构建六元环最重要的方法之一，在六元碳环和杂环化合物的合成中占有重要地位，尤其在具有复杂结构的活性天然产物全合成中起到非常关键的作用。根据共轭双烯与亲双烯体进行反应的面的选择性不同，而底物为不对称取代时，该反应理论上可形成4个手性不同的立体异构体：包括2个endo型产物和2个exo型产物(即立体选择性)；而当反应底物具有多个可反应的位点时，该反应可生成不同结构的[4+2]环化反应产物(即区域选择性)。如何提高[4+2]环化反应的立体选择性和区域选择性一直是有机化学家们关注的焦点。

自1979年报道首例Lewis酸催化剂用于催化[4+2]环加成反应以来，越来越多的手性Lewis酸配体催化剂不断被发现。如Al、Zn等主族金属元素，Pd、Ti、Cu、Co、Rh、Ru等过渡金属元素，及镧系金属元素均可作为手性配体参与催化反应，与早期发现的热诱导的[4+2]环加成反应相比，立体选择性和区域选择性得到大大提高，且不需要高温反应。然而，多数手性催化剂价格昂贵、不易制得、需要较为严苛的反应条件(如隔绝空气、非质子性溶剂、低温等)，限制了他们在工业化生产中的应用。

近年来，随着生物技术和基因工程的发展，酶这种绿色(环境友好)、高效、高立体选择性的催化剂在天然产物及药物合成过程中扮演的角色愈发重要，同时合成生物学手段也越来越多地被应用于活性天然产物或药物的全合成过程中。目前，已有数个天然来源的[4+2]环化酶被发现能够催化分子内的[4+2]环加成反应，能够显著提高反应效率且具有很高的立体选择性，如来源于真菌Aspergillus flavus的LepI(M.Ohashi,et al.Nature,2017,549,502-506)和来源于放线菌Saccaropolyspora spinosa的SpnF(H.J.Kim,etal.Nature,2011,473,109-112)等。虽然分子内的[4+2]环化酶已有报道，但分子间的[4+2]环化酶从未被报道。然而，许多活性天然产物的生物合成途径被推测经由分子间[4+2]环加成反应而来，例如neosetophomone B。

以neosetophomone B为代表的杂萜类化合物是一类真菌次级代谢产物。该类化合物大多产自微紫青霉菌Penicillium janthinellum，Phoma sp.(J.Zhang,et al,Journalof Natural Products,2015,78,3058-3066)，Neosetophoma sp.(T.El-Elimat,et al,Organic Letters,2019,21,529-534)，Eupenicillium brefeldianum ATCC 74184(F.Mayerl,et al,Journal of Antibiotics,1993,46,1082-1088)，或Kionochaetaramifera BCC 7585(T.Bunyapaiboonsri,et al,Phytochemistry Letters,2008,1,204-206)等，对肿瘤细胞具有强烈的细胞毒作用。其中，neosetophomone B对人卵巢癌OVCAR-8细胞、人肺癌MSTO-211H细胞和大鼠腹水癌LLC细胞的半数抑制率分别为1.08μM、0.28μM和0.12μM。然而该类化合物在真菌代谢产物中的含量很低，限制了该类抗肿瘤化合物的进一步研究和开发。因此，找到该类杂萜化合物在真菌中的生物合成基因簇并对其中的关键蛋白进行功能鉴定，对于酶催化合成以neosetophomone B为代表的杂萜化合物或者通过合成生物学技术规模化制备该类化合物，减少由于化学合成以及提取分离等传统方法对环境造成的压力，从而促进社会可持续发展具有重要的意义。

本发明提供一种编码[4+2]环化酶的基因，命名为eupfF，并对其功能进行了鉴定。结果表明该[4+2]环化酶EupfF能够出乎意料的催化分子间的[4+2]环化反应。该步反应是制备抗肿瘤化合物neosetophomone B的关键反应。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种分子间[4+2]环化酶、编码该酶的核苷酸序列、含有该核苷酸序列的表达载体、含有该核苷酸序列或表达载体的宿主细胞，以及其在催化分子间[4+2]环化反应中的应用。该反应可用于制备抗肿瘤化合物neosetophomone B及其立体异构体、衍生物、或其类似物。

为解决本发明的技术问题，采用如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面提供了一种分子间[4+2]环化酶EupfF，其特征在于，其氨基酸序列为：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加1-35个氨基酸形成的基本上保持相同生物学功能的氨基酸序列。

以上所述的[4+2]环化酶EupfF，其特征在于，在[4+2]环化酶EupfF上可进行常规修饰；或者在[4+2]环化酶EupfF上还连接有用于检测或纯化的标签。

其中，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰；所述的标签包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、Profinity eXact。

本发明技术方案的第二方面提供了一种编码第一方面所述[4+2]环化酶EupfF的核酸分子，其特征在于：

(1)序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；

(2)基于SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列根据大肠杆菌的密码子偏好性进行序列优化得到的序列表中SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列；

(3)与上述(1)或(2)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

其中，以上(2)中所述的经密码子优化后的核苷酸序列更容易在大肠杆菌中表达形成可溶性的[4+2]环化酶EupfF。

术语“编码[4+2]环化酶EupfF的核酸分子”是指包括编码[4+2]环化酶EupfF多肽的核苷酸序列和包括附加编码和/或非编码的核苷酸序列，它包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的编码区序列相同或是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.1的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。

通过本文的阐述，这样的片段、类似物或衍生物被认为在本领域技术人员的知识范围内。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，“核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，优选是至少20-30个核苷酸，特别优选是至少50-60个核苷酸，非常特别的优选是至少100个核苷酸以上。核苷酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码的核苷酸序列。

本发明中特异核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离核苷酸序列。这些技术包括但不局限于：(1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的核苷酸序列；和(2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的核苷酸序列片段。

本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得：(1)从基因组DNA分离双链DNA序列；(2)常规化学合成方法合成该DNA序列以获得所述[4+2]环化酶EupfF的双链DNA。

在上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。更经常选用的方法是DNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，用试剂盒也可从商业途径获得。而构建cDNA文库也是通常的方法。当结合聚合酶链式反应技术(PCR)时，即使极少的表达产物也能克隆。

可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因，这些方法包括但不局限于：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因功能的出现或消失；(3)测定的转录本的水平；(4)通过免疫学技术测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的核苷酸序列的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，优选是至少30个核苷酸，特别优选是至少50个核苷酸，非常特别的优选是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2000个核苷酸之内，较佳的为1000个核苷酸之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki et al.,1985,Science,230,1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的核苷酸序列信息适当的选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明技术方案的第三方面提供了一种含有第二方面所述核苷酸分子的表达载体。

本发明也涉及含有编码[4+2]环化酶EupfF核苷酸序列和外源性调节序列元件结合进行功能性表达的重组表达载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。能够影响基因表达产物的序列元件包括有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

可用本领域的技术人员熟知的方法来构建含编码[4+2]环化酶EupfF的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York，1989)。所述的编码[4+2]环化酶EupfF的核苷酸序列可有效连接到表达载体的恰当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10-300bp，作用于启动子以增强基因的转录。如腺病毒增强子。

本发明技术方案的第四方面提供了一种含有第三方面所述表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌，酵母，曲霉菌，植物细胞，昆虫细胞；优选为大肠杆菌或酵母菌，所述酵母菌包括但不限于毕赤酵母，酿酒酵母等；更优选的宿主细胞为大肠杆菌。

本发明涉及用含有本发明编码[4+2]环化酶EupfF的核苷酸序列的重组载体或直接用编码[4+2]环化酶EupfF的核苷酸序列经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，编码[4+2]环化酶EupfF的核苷酸序列或含有该核苷酸序列的重组表达载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该核苷酸序列或重组表达载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。宿主细胞的代表性例子有：原核细胞如大肠杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞如油菜、烟草、大豆；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组表达载体转化宿主细胞可用本领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期收集菌体，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域是众所周知的。也可用MgCl₂，电穿孔等方法进行。当宿主是真核生物，可选用DNA转染法、显微注射、电穿孔、脂质体包装等方法。

本发明技术方案的第五方面提供了第一方面所述的[4+2]环化酶EupfF或第二方面所述核苷酸分子或第三方面所述表达载体或第四方面所述宿主细胞在催化分子间[4+2]环化反应中的应用，该反应可用于抗肿瘤化合物neosetophomone B的制备。

以上所述的[4+2]环化酶EupfF能够催化式(III)代表的底物与式(I)或式(II)代表的底物发生分子间[4+2]环化反应。

其中：

式(I)和(II)中X可选自O、N、C或S原子；优选为O或N原子；最优选为O原子。

式(I)中的R₁和式(II)中的R₇各自独立选自氢、C_1-4烷基、C_1-4羟烷基、C_2-4烯基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯甲酰基、苯乙烯酰基、苄基或卤代苄基；优选为氢或C_1-4烷基，更优选为氢或甲基，最优选为氢。

式(I)中的R₂与R₄以及式(II)的R₆与R₈各自独立选自氢、羟基、卤素、C_1-4烷氧基、苄氧基、苯甲酰氧基或苯乙烯酰氧基；优选为氢或C_1-4烷基，更优选为氢或甲基，最优选为氢。

式(I)中的R₃和式(II)中的R₅各自独立选自氢、C_1-4烷基、C_1-4羟烷基、卤代的C_1-4烷基、C_2-4烯基或卤代C_2-4烯基；优选为氢或C_1-4烷基，更优选为氢或甲基，最优选为甲基。

式(III)中的R₉选自氢、羟基、C_1-4烷氧基、苄氧基、苯甲酰氧基或苯乙烯酰氧基。优选为氢或羟基或甲氧基，更优选为氢或羟基，最优选为羟基。

式(III)中C-10的立体构型可以是S，也可以是R。优选为S。

式(III)中Δ^8,9-双键的构型可以是Z，也可以是E。优选为Z。

以上所述的[4+2]环化酶EupfF催化的底物优选为stipitol和1E,4E,8Z-humulenol。

以上所述的[4+2]环化酶EupfF催化底物stipitol和1E,4E,8Z-humulenol发生[4+2]环加成反应生成的产物为neosetophomone B。

该方法是这样实现的，根据宿主细胞，用本领域技术人员所共知的方法生长或培养。比如微生物细胞通常是在0-100℃，优选10-60℃，同时还要氧气。培养基中含有碳源，如葡萄糖；氮源，通常是有机氮的形式，如酵母提取物、氨基酸；盐，如硫酸铵；微量元素，如铁、镁盐；如果需要的话还有维生素。在此期间培养基的pH可以保持固定的值，就是说，在培养期间进行控制或不控制。培养可以分批培养、半不连续培养或连续培养形式进行。在培养之后，收集细胞，破碎或直接使用。可将式(III)代表的底物同式(I)或(II)代表的底物与上述破碎后的宿主细胞在缓冲溶液中孵育，所述缓冲溶液包括但不限于磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基胺基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)、N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液(Bicine)、2-吗啉代乙磺酸缓冲液(MES)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)等，孵育温度为10-40℃，优选20-30℃，即可获得分子间[4+2]环加成反应产物。亦可将式(III)代表的底物同式(I)或(II)代表的底物喂养至上述宿主细胞，在10-50℃，优选25-37℃，培养1-10天(原核宿主优选1-2天，真核宿主优选3-7天)，破碎或不破碎细胞，加入有机溶剂萃取，即可获得分子间[4+2]环加成反应产物。还可将式(III)代表的底物同式(I)或(II)代表的底物与第一方面所述的[4+2]环化酶EupfF在缓冲溶液中孵育，所述缓冲溶液包括但不限于磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基胺基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)、N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液(Bicine)、2-吗啉代乙磺酸缓冲液(MES)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)等，孵育温度为10-40℃，优选20-30℃，即可获得分子间[4+2]环加成反应产物。

本发明的其他方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明的有益技术效果：以neosetophomone B，pughiinin A为代表的杂萜类化合物是一类由真菌Penicillium janthinellum，Kionochaeta pughii，Phoma sp.(J.Zhang,et al,J.Nat.Prod.,2015,78,3058-3066)等产生的次级代谢产物，大多具有显著的抗肿瘤作用。然而该类化合物在真菌代谢产物中的含量低，目前尚无全合成研究报道，限制了其进一步的研究和开发，给相关创新药物的研制带来了困难。本发明技术方案提供的[4+2]环化酶EupfF能够在温和条件下高效、高立体选择性地催化式(III)代表的底物与式(I)或(II)代表的底物发生分子间的[4+2]环化反应，形成neosetophomone B及其立体异构体、类似物或其衍生物，该反应可用于抗肿瘤化合物neosetophomone B及其立体异构体、类似物或其衍生物的制备。这是首次发现的能够催化分子间[4+2]化反应的酶，解决了在有机合成中分子间[4+2]化反应需要高温封闭(条件苛刻)、金属催化剂(环境不友好)、立体选择性低、收率低等问题，同时首次提出了抗肿瘤化合物neosetophomone B的合成方法。

附图说明

图1：eupfF基因PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳分析结果，其中M是DNA分子量标准。

图2：重组质粒pET28a-eupfF示意图。

图3：EupfF重组蛋白SDS-PAGE分析结果，其中M为蛋白分子量标准。

图4：EupfF催化stipitol和1E,4E,8Z-humulenol的分子间[4+2]环化反应。

图5：Neosetophomone B的¹H NMR谱图(CDCl₃，600MHz)。

图6：Neosetophomone B的¹³C NMR谱图(CDCl₃，150MHz)。

图7：Neosetophomone B的HSQC谱图(CDCl₃，600MHz)。

图8：Neosetophomone B的HMBC谱图(CDCl₃，600MHz)。

图9：Neosetophomone B的NOESY谱图(CDCl₃，600MHz)。

图10：EupfF催化stipitol和1E,4E,8E-humulenol的分子间[4+2]环化反应。

图11：EupfF催化stipitol和1E,4E,8Z-humulene的分子间[4+2]环化反应。

图12：EupfF催化底物A1和1E,4E,8Z-humulenol的分子间[4+2]环化反应。

图13：EupfF催化底物B1和1E,4E,8Z-humulene的分子间[4+2]环化反应。

具体实施方式

本发明通过如下实施例进行进一步的说明，这些实施例仅用于说明性的，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。

实施例1.eupfF基因的获取及表达载体的构建

将微紫青霉菌P.janthinellum接种至马铃薯葡萄糖培养基(PDB)中，于28℃摇床(220rpm)培养4天，取少量菌丝体于研钵中加入液氮研磨成细粉状。采用Trizol提取法提取微紫青霉菌总RNA，总RNA经RQ1RNase-Free DNase消化DNA获得无DNA污染的总RNA。采用RT-PCR法将纯化后的总RNA反转录成cDNA。反转录体系和程序如下：20μL的反应体系中包含总RNA13μL，50μM Oligo dT Primer 1μL，100μM Random 6mers 1μL，5×PrimeScript buffer4μL，PrimeScript RT enzyme Mix 1μL；该体系在37℃温育30min后85℃变性5sec，完成cDNA的合成。cDNA保存于-20℃备用。

以上述微紫青霉菌cDNA为模板，设计两条特异引物(正向引物：5’-ATGCTTTTCACCGTGTCCC-3’，SEQ ID NO.4；反向引物：5’-CTACAGATGGAACCCAGTAGTATC-3’，SEQ ID NO.5)，通过PCR克隆去内含子eupfF基因。PCR体系(50μL)中含5×Q5 buffer 10μL，10mM dNTPs 1μL，GC Enhancer 5μL，10μM的正向引物(SEQ ID NO.4)和10μM的反向引物(SEQ ID NO.5)各2.5μL，cDNA 2μL，Q5 DNA聚合酶0.5μL，dd H₂O 26.5μL。PCR程序：预变性：98℃，1min；循环：98℃变性10sec，55℃复性30sec，72℃延伸1min，共34个循环；终延伸：72℃延伸5min，12℃保温。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，结果表明，扩增得到一条长约为1104bp大小的条带(图1)。将该PCR产物进行DNA测序，表明其序列为SEQ ID NO.2所述DNA序列。将该DNA序列连接于pET-28a(+)蛋白表达载体上，得到相应表达质粒。或者将SEQ IDNO.2所述的DNA序列经本领域技术人员熟知的方法进行化学合成，并连接于pET-28a(+)蛋白表达载体上，得到相应质粒。此外，可根据大肠杆菌的密码子偏好性进行序列优化得到序列表中SEQ ID NO.3所述的DNA序列，该序列经本领域技术人员熟知的方法进行全合成并连接于pET-28a(+)蛋白表达载体上，得到pET28a-eupfE质粒

实施例2.重组EupfF蛋白的诱导表达和纯化

将构建好的质粒pET28a-eupfF用热激法转化至蛋白表达宿主BL21(DE3)大肠杆菌，转化菌涂布于含卡那霉素(终浓度50μg/mL)的Luria-Bertani(LB)固体培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉)上，于37℃培养过夜，直至长出单克隆。挑取单克隆转接入5mL含卡那霉素(终浓度50μg/mL)的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠)，37℃，220rpm培养过夜以获得种子液。取1mL种子液接入1L含卡那霉素(终浓度50μg/mL)的LB液体培养基，37℃，220rpm培养至OD₆₀₀为0.55时，加入终浓度为50μM的IPTG，在16℃，220rpm诱导20小时。菌液于4℃，4000rpm离心10min，弃上清，加入50mL预冷裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM咪唑，150mM氯化钠，10％甘油)重悬菌体，低温高压破碎。破碎液于4℃，14000rpm离心20min，吸取上清为EupfF粗蛋白。粗蛋白采用Ni-NTA亲和层析柱纯化，并用Ultra-15 10K超滤管浓缩并替换至Buffer C(50mMTris-HCl，pH 8.0，150mM氯化钠,10％甘油)，测定蛋白浓度。EupfF的SDS-PAGE分析结果如图3所示，表达纯化得到一条长约为42kDa的特异性条带，与EupfF的理论大小一致。

实施例3.EupfF催化底物stipitol和1E,4E,8Z-humulenol的分子间[4+2]环化反应

本实验以stipitol和1E,4E,8Z-humulenol为底物探讨[4+2]环化酶EupfF催化的[4+2]环化反应，结果表明，EupfF能催化底物进行[4+2]环化反应形成产物neosetophomoneB。

为验证[4+2]环化酶EupfF的催化功能，建立100μL反应体系(含50mM Bicine缓冲液，pH 8.0，1mM 1E,4E,8Z-humulenol，4mM新制得stipitol和50μM EupfF)，26℃反应2h后，加入100μL乙酸乙酯终止反应。将乙酸乙酯萃取物浓缩干燥用甲醇溶解，液-质联用仪分析。流动相为乙腈-水(均加入0.02％甲酸)，流速0.4mL/min，梯度洗脱条件：0-8min，5-99％乙腈；8-12min，99％乙腈。LC-MS结果(图4)表明，[4+2]环化酶EupfF能催化底物stipitol和1E,4E,8Z-humulenol进行[4+2]环化反应形成产物neosetophomone B。Neosetophomone B的结构通过¹H NMR(图5)、¹³C NMR(图6)、HSQC(图7)、HMBC(图8)和NOESY(图9)谱图解析，鉴定为neosetophomone B(表1)。

表1.EupfF催化的反应产物neosetophomone B的NMR数据

^a测定溶剂为CDCl₃(¹H NMR为600MHz；¹³C NMR为150MHz)；

实施例4.EupfF催化底物stipitol和1E,4E,8E-humulenol的分子间[4+2]环化反应

本实验以stipitol和1E,4E,8E-humulenol为底物，探讨[4+2]环化酶EupfF催化的分子间[4+2]环化反应。

首先，建立100μL反应体系(含50mM Bicine缓冲液，pH 8.0，1mM 1E,4E,8E-humulenol，4mM新制得的stipitol和50μM EupfF)，26℃反应2h后，加入100μL乙酸乙酯终止反应。将乙酸乙酯萃取物浓缩干燥后采用液-质联用仪分析，结果表明[4+2]环化酶EupfF能催化底物stipitol和1E,4E,8E-humulenol发生分子间[4+2]环化反应形成产物epolone B(m/z 385[M+H]⁺)(图10)。

实施例5.EupfF催化底物stipitol和1E,4E,8Z-humulene的分子间[4+2]环化反应

本实验以stipitol和1E,4E,8Z-humulene为底物，探讨[4+2]环化酶EupfF催化的分子间[4+2]环化反应。

首先，建立100μL反应体系(含50mM Bicine缓冲液，pH 8.0，1mM 1E,4E,8Z-humulene，4mM新制得的stipitol和50μM EupfF)，26℃反应2h后，加入100μL乙酸乙酯终止反应。将乙酸乙酯萃取物浓缩干燥后采用液-质联用仪分析，结果表明[4+2]环化酶EupfF能催化底物stipitol和1E,4E,8Z-humulene发生分子间[4+2]环化反应形成产物dehydroxyneosetophomone B(m/z 369[M+H]⁺)(图11)。

实施例6.EupfF催化底物A1和1E,4E,8Z-humulenol的分子间[4+2]环化反应

本实验以A1和1E,4E,8Z-humulenol为底物，探讨[4+2]环化酶EupfF催化的分子间[4+2]环化反应。

首先，建立100μL反应体系(含50mM Bicine缓冲液，pH 8.0，1mM 1E,4E,8Z-humulenol，4mM新制得的A1和50μM EupfF)，26℃反应2h后，加入100μL乙酸乙酯终止反应。将乙酸乙酯萃取物浓缩干燥后采用液-质联用仪分析，结果表明[4+2]环化酶EupfF能催化底物A1和1E,4E,8Z-humulenol发生分子间的[4+2]环化反应形成产物pughiinin A(m/z357[M+H]⁺)(图12)。

实施例7.EupfF催化底物B1和1E,4E,8Z-humulene的分子间[4+2]环化反应

本实验以B1和1E,4E,8Z-humulene为底物，探讨[4+2]环化酶EupfF催化的分子间[4+2]环化反应。

首先，建立100μL反应体系(含50mM Bicine缓冲液，pH 8.0，1mM 1E,4E,8Z-humulene，4mM新制得的B1和50μM EupfF)，26℃反应2h后，加入100μL乙酸乙酯终止反应。将乙酸乙酯萃取物浓缩干燥后采用液-质联用仪分析，结果表明[4+2]环化酶EupfF能催化底物B1和1E,4E,8Z-humulene发生分子间的[4+2]环化反应形成产物B2(m/z 357[M+H]⁺)(图13)。

序列表

<110> 中国医学科学院药物研究所

<120> 一种[4+2]环化酶的氨基酸序列及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 367

<212> PRT

<213> 微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)

<400> 1

Met Leu Phe Thr Val Ser Leu Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ala Val Ser

1 5 10 15

Pro Ser Leu Ser Ala Val Leu Pro Arg Ala Ser Ser Ala Thr Gly Ser

20 25 30

Val Pro Leu Pro Glu Arg Leu Leu His His Trp Pro Asn Gly Thr Trp

35 40 45

Val Glu Asn Ile Ala Val Arg Pro Asn Gly Asn Leu Leu Leu Thr Thr

50 55 60

Ser Thr Pro Asn Gly Thr Val Trp His Val Lys Lys Pro Trp Thr Asp

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Glu Leu Ala Tyr Asn Phe Asp Glu Trp Val Asp Arg

85 90 95

Leu Ile Gly Ile Gly Glu Thr Thr Pro Asp Lys Tyr Ile Val Val Gly

100 105 110

Ser Arg Phe Tyr Ser Pro Asp Ala Tyr Ser Ser His Val Asp Arg Thr

115 120 125

Phe Ala Ala Met Glu Leu Asp Phe Thr Lys Glu Pro Pro Ser Thr Arg

130 135 140

Met Val Ala Trp Met Pro Glu Ala Glu Leu Leu Gln Gly Val Ala Ala

145 150 155 160

Leu Pro Trp Asp Arg Ser Ile Val Leu Ile Ser Asp Gln Tyr Val Leu

165 170 175

Arg Pro Arg Tyr Lys Gln Val Asp Trp Thr Pro Ser Pro Gly Gln Ile

180 185 190

Trp Arg Leu Asp Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Glu Leu Val Met Thr Asp

195 200 205

Tyr Ala Glu Met Asn Thr Thr Tyr Ala His Gly Pro Asp Val Gly Ile

210 215 220

Asn Gly Ile Arg Ile Leu Gly Asn Glu Leu Tyr Trp Val Asn Gln Asp

225 230 235 240

Asn Gly Gly Val Tyr Arg Val Glu Ile Gln Lys Asn Gly His Pro Val

245 250 255

Pro Pro Ala Val Pro Glu Val Val Ser Val Val Glu Ser Gln Leu Trp

260 265 270

Asp Asp Phe Ala Phe Gly Pro Gly Asp Glu Asp Leu Leu Trp Val Thr

275 280 285

Gly Leu Asn Ala Val Tyr Ala Val Ser Lys Lys Asn Gly Thr Ala Val

290 295 300

Val Val Asp Gly Val Gly Thr Ser Asn Asn Met Ser Phe Pro Gly Pro

305 310 315 320

Thr Ser Cys Gln Phe Gly Arg Thr Lys His Asp Ser Asn Val Leu Tyr

325 330 335

Val Thr Gly Asn Leu Tyr Ser Val Pro Asp Ser Leu Leu Asp Val Lys

340 345 350

Ile Gly Gly Trp Val Arg Ala Ile Asp Thr Thr Gly Phe His Leu

355 360 365

<210> 2

<211> 1104

<212> DNA

<213> 微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)

<400> 2

atgcttttca ccgtgtccct cctcctctcg ggcctcctgg ccgtctcgcc ctccttgtca 60

gcggttcttc cgcgcgcctc tagcgcaacc gggtctgttc ctctccctga gcgcctgttg 120

caccattggc caaacggaac ctgggttgaa aacatcgcgg tccggcccaa tggcaacctt 180

ctgctcacga cgtccacccc caacggcacc gtgtggcatg tgaagaagcc atggaccgat 240

acgcccgagg tggagcttgc ctacaacttc gacgagtggg ttgaccgtct cattggaatt 300

ggcgaaacca ctccggacaa gtacatcgtc gttgggtcgc gcttctattc gcccgatgcc 360

tattccagcc acgtcgaccg gaccttcgct gccatggagc tcgacttcac caaggaacca 420

ccctccactc gtatggttgc ctggatgccc gaggccgagc ttctccaggg cgtcgccgcc 480

ctaccgtggg accggtcaat cgtccttatc tccgaccagt acgtcctgcg cccgcggtac 540

aagcaagtgg actggacgcc cagcccgggc cagatctggc ggcttgacac gaagactggc 600

gattatgagc tcgtcatgac cgactatgcc gagatgaaca ccacctacgc ccacggtccg 660

gacgtgggca tcaacggtat caggatcctc ggaaatgagc tgtactgggt gaaccaggat 720

aatggcggcg tctaccgggt cgaaatccag aagaacggcc accccgtacc tcccgcagtc 780

cccgaggtcg tctcggttgt ggaatctcag ctttgggacg atttcgcctt cggacccggc 840

gacgaggatc tgctgtgggt gacgggcctt aacgccgttt atgccgtttc gaaaaagaat 900

gggactgctg ttgtcgtcga tggcgttggc acaagcaaca atatgagttt cccaggacca 960

acctcttgcc agtttggcag gaccaagcac gattcgaatg tgctgtatgt cacgggtaat 1020

ctgtatagcg tccctgatag cctccttgac gttaagatcg gcggctgggt tcgggctatt 1080

gatactactg ggttccatct gtag 1104

<210> 3

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgctgttca ccgttagcct gctgctgagc ggtctgctgg cggttagccc gagcctgagc 60

gcggtgctgc cgcgtgcgag cagcgcgacc ggtagcgtgc cgctgccgga gcgtctgctg 120

caccactggc cgaacggcac ctgggttgaa aacatcgcgg tgcgtccgaa cggtaacctg 180

ctgctgacca ccagcacccc gaacggcacc gtttggcacg tgaagaaacc gtggaccgac 240

accccggaag tggaactggc gtataacttc gacgagtggg tggatcgtct gatcggtatt 300

ggcgaaacca ccccggataa gtacattgtg gttggtagcc gtttttacag cccggacgcg 360

tatagcagcc acgttgatcg taccttcgcg gcgatggagc tggactttac caaagaaccg 420

ccgagcaccc gtatggttgc gtggatgccg gaggcggaac tgctgcaagg cgtggcggcg 480

ctgccgtggg accgtagcat cgttctgatt agcgatcagt acgtgctgcg tccgcgttat 540

aagcaagttg attggacccc gagcccgggt cagatctggc gtctggacac caaaaccggc 600

gattacgagc tggtgatgac cgactatgcg gaaatgaaca ccacctacgc gcacggtccg 660

gatgttggta tcaacggcat ccgtattctg ggcaacgagc tgtattgggt gaaccaagac 720

aacggtggcg tttaccgtgt ggaaattcag aagaacggtc acccggttcc gccggcggtg 780

ccggaagtgg ttagcgtggt tgaaagccaa ctgtgggacg atttcgcgtt tggtccgggc 840

gacgaggatc tgctgtgggt taccggtctg aacgcggttt atgctgtgag caagaaaaac 900

ggtaccgcgg tggttgtgga tggtgtgggc accagcaaca acatgagctt tccgggtccg 960

accagctgcc agtttggtcg taccaagcac gatagcaacg ttctgtacgt gaccggtaac 1020

ctgtatagcg tgccggacag cctgctggat gttaaaatcg gtggctgggt gcgtgcgatt 1080

gataccaccg gctttcacct gtaa 1104

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcttttca ccgtgtccc 19

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctacagatgg aacccagtag tatc 24

Claims

1.一种[4+2]环化酶，其特征在于，其氨基酸序列为：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

2.根据权利要求1所述的[4+2]环化酶，其特征在于，在该[4+2]环化酶上可进行常规修饰；或者还连接有用于检测或纯化的标签。

3.根据权利要求2所述的[4+2]环化酶的修饰，其特征在于，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰；所述的标签包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、ProfinityeXact。

4.一种编码权利要求1所述[4+2]环化酶的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：

(1)序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；

(3)与上述(1)或(2)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

6.一种含有权利要求4-5任一所述核酸分子的表达载体。

7.一种含有权利要求4-5任一所述核酸分子或权利要求6所述表达载体的宿主细胞。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，其宿主细胞选自细菌，酵母，曲霉菌，植物细胞，或昆虫细胞。

9.权利要求1-3任一项所述的[4+2]环化酶或权利要求4-5任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体或权利要求7-8任一项所述的宿主细胞在催化分子间[4+2]环化反应中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的[4+2]环化酶能够催化式(III)代表的底物与式(I)或式(II)代表的底物发生分子间[4+2]环化反应；

其中：

式(I)和(II)中X为O、N、C或S原子；

式(I)中的R₁和式(II)中的R₇各自独立选自氢、C_1-4烷基、C_1-4羟烷基、C_2-4烯基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯甲酰基、苯乙烯酰基、苄基或卤代苄基；

式(I)中的R₂与R₄以及式(II)的R₆与R₈各自独立选自氢、羟基、卤素、C_1-4烷氧基、苄氧基、苯甲酰氧基或苯乙烯酰氧基；

式(I)中的R₃和式(II)中的R₅各自独立选自氢、C_1-4烷基、C_1-4羟烷基、卤代的C_1-4烷基、C_2-4烯基或卤代C_2-4烯基；

式(III)中的R₉选自氢、羟基、C_1-4烷氧基、苄氧基、苯甲酰氧基或苯乙烯酰氧基；

式(III)中C-10的立体构型可以是S或R；

式(III)中Δ^8,9-双键的构型可以是Z或E。

11.根据权利要求10所述的应用，其中式(I)代表的底物的特征在于X为O，且R₁、R₂、R₄均为氢，R₃为甲基；式(III)代表的底物的特征在于R₉为羟基，C-10的立体构型为S或R,Δ^8,9-双键的构型为Z或E。

12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述[4+2]环化酶催化形成的产物为neosetophomone B。