CN112322592B

CN112322592B - 一种参与紫草素生物合成的cyp76b100蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN112322592B
Application number: CN201910718772.1A
Authority: CN
Inventors: 刘涛; 宋皖; 庄以彬; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2019-08-05
Filing date: 2019-08-05
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2039-08-05
Also published as: CN112322592A

Abstract

本发明提供了一种参与紫草素生物合成的CYP76B100蛋白及其编码基因与应用。具体地，本发明提供了一种CYP76B100蛋白，它可催化2‑香叶基‑对苯二酚的3″位碳原子的羟基化反应。本发明的CYP76B100蛋白为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。

Description

一种参与紫草素生物合成的CYP76B100蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种参与紫草素生物合成的CYP76B100蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

紫草是我国传统中药，其味苦、性寒，归屯、肝经，有凉血活血、清热解毒的功效，临床上用来治疗血热毒盛、斑疹紫黑、麻疫不透、烫伤、疫疹等症。在我国，主要有3种紫草科植物作为紫草入药：拟紫草属植物新疆紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst、内蒙紫草Arnebia guttata Bunge及紫草属植物硬紫草Lithospermum erythrorhizon Sieb.etZucc。紫草素类化合物被认为是紫草的主要有效成分，主要包括紫草素(Shikonin，化学结构见图1)或其对映异构体阿卡宁(Alkannin)以及它们的成酯衍生物，本质为羟基萘醌基类化合物，并含有异己烯侧链。目前，已从紫草中分离得到30余种紫草素类化合物。该类化合物被证实具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎镇痛、免疫调节等多种生物活性。此外，紫草素类化合物作为天然紫色染料，可用于真丝织物的着色；作为食品添加剂，亦可用于果汁、饮料、雪糕、冰棍、果洒。因此，紫草素类化合物作为天然色素广泛应用于医药、化妆品和印染工业中，具有很大的开发应用前景。

随着分子生物学及生理生化等学科的发展，关于植物次生代谢产物的研究也越来越深入。

然而，植物次生代谢产物种类繁多，结构各异，次生代谢途径也是多样而复杂的，许多途径目前仍不清楚，或者仅仅是了解了合成途径的大致路线。

因此，本领域迫切需要开发一种可以提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体的克隆相关酶。

发明内容

本发明的目的就是提供一种参与紫草素生物合成的CYP76B100蛋白及其编码基因与应用。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的CYP76B100多肽，所述多肽选自下组：

a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

b)由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基较佳地，1-50个，更佳地，1-30个，更佳地，1-10个，最佳地，1-6个)的取代、缺失或添加而形成的且具有催化2-香叶基-对苯二酚活性的衍生蛋白；

(c)序列中含有(a)或(b)中所述蛋白序列的衍生蛋白；

(d)氨基酸序列与SEQ ID NOs.:1所示氨基酸序列的同源性≥65％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)，并具有催化2-香叶基-对苯二酚活性的衍生蛋白。

在另一优选例中，所述的序列(c)为由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

在另一优选例中，所述CYP76B100多肽来自紫草科，较佳地，来自选自下组的一种或多种植物：硬紫草，新疆紫草，内蒙紫草，车前叶蓝蓟，小花紫草。

在另一优选例中，所述CYP76B100多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码上如SEQ ID NO.:1所示CYP76B100多肽的核苷酸序列；

(b)如SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID NOs.:2所示序列的同源性≥75％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)的核苷酸序列；

(d)在SEQ ID NOs.:2所示核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸所形成的核苷酸序列；

(e)与(a)-(d)任一所述的核苷酸序列互补(较佳地完全互补)的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的核苷酸的序列如SEQ ID NOs.:2所示。

在另一优选例中，序列如SEQ ID NOs.:2所示的多核苷酸编码氨基酸序列如SEQID NOs.:1所示的多肽。

本发明第三方面提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体选自下组：表达载体、穿梭载体、整合载体、或其组合。

在另一优选例中，所述载体选自下组：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述载体包括在酵母中表达的载体，如pESC系列载体、pYES系列载体、pUG系列载体、pSH系列载体、pRS系列载体。

本发明第四方面提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为低等真核细胞，如酵母细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞为高等真核细胞，如哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞，如细菌细胞，较佳地，大肠杆菌。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：酿酒酵母、大肠杆菌、或其组合。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为酿酒酵母细胞。

本发明第五方面提供了一种CYP76B100多肽的制备方法，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述CYP76B100多肽。

本发明第六方面提供了一种如本发明第一方面所述的CYP76B100多肽或其衍生多肽、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞的用途，它被用于催化以下反应，或被用于制备催化以下反应的催化制剂：将2-香叶基-对苯二酚的3″位碳原子进行羟基化反应，生成3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚。

本发明第七方面提供了一种催化反应的方法，包括步骤：在本发明第一方面所述的多肽或其衍生多肽存在的条件下，进行2-香叶基-对苯二酚的3″位碳原子的羟基化的催化反应。

在另一优选例中，所述的方法还包括将所述的多肽及其衍生多肽分别加入催化反应；和/或

将所述的多肽及其衍生多肽同时加入催化反应。

在另一优选例中，所述方法在辅酶因子的存在下进行。

在另一优选例中，所述辅酶因子为NADPH和/或NADH。

在另一优选例中，所述辅酶因子为NADPH。

在另一优选例中，所述辅酶因子的用量(mM)为0.5-6.0mM，较佳地，0.5-5.0mM，更佳地，1.0-3.0mM。

在另一优选例中，所述方法在氧气存在下进行。

在另一优选例中，所述方法还包括：向反应体系中提供用于调节酶活性的添加物。

在另一优选例中，所述的用于调节酶活性的添加物是：提高酶活性或抑制酶活性的添加物。

在另一优选例中，所述的用于调节酶活性的添加物选自下组：Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Al³⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、或Fe²⁺。

在另一优选例中，所述的用于调节酶活性的添加物是：可以生成Ca²⁺、Co2+、Mn²⁺、Ba²⁺、Al³⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、或Fe²⁺的物质。

在另一优选例中，反应体系的pH为：6.5-8.5，优选pH为7.4-7.6。

在另一优选例中，反应体系的温度为：25℃-35℃，优选28℃-30℃。

在另一优选例中，反应体系的时间为0.5h-24h，较佳地，1h-10h，更佳地，2h-3h。

本发明第八方面提供了一种3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚的制备方法，包括：

在本发明第一方面所述的多肽或其衍生多肽的存在下，催化2-香叶基-对苯二酚(GHQ)，从而得到3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚(GHQ-3″-OH)；

在另一优选例中，所述方法在辅酶因子的存在下进行。

在另一优选例中，所述辅酶因子为NADPH和/或NADH。

在另一优选例中，所述辅酶因子为NADPH。

在另一优选例中，所述方法在氧气存在下进行。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了紫草素、2-香叶基-对苯二酚和3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚的结构。

图2显示了底物添加实验HPLC检测结果。

图3显示了CYP76B100催化产物的LC-MS检测结果。

图4显示了微粒体酶促反应HPLC检测结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种参与紫草素生物合成的CYP76B100蛋白。具体地，本发明的CYP76B100蛋白能特异和高效地催化2-香叶基-对苯二酚催化生成3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚(结构见图1)。本发明的羟化酶基因的克隆和功能研究是解析硬紫草素中紫草及衍生物生物合成途径的关键，为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。在此基础上完成了本发明。

定义

如本文所用，术语“活性多肽”、“本发明的多肽及其衍生多肽”、“本发明的酶”、“本发明的CYP76B100”，均指CYP76B100(SEQ ID NO.:1)多肽及其衍生多肽。

如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。

本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CYP76B100蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含CYP76B100多肽以及编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

应用

本发明涉及的活性多肽以及用途包括(但不限于)：特异和高效地将2-香叶基-对苯二酚催化为3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚。

在所述方法中，还可以添加酶活性添加物(提高酶活性或抑制酶活性的添加物)。所述酶活性的添加物可以选自下组：Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、或Fe2+；或为可以生成Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、或Fe2+的物质。

所述方法的pH条件为：pH 6.5-8.5，优选pH为7.4-7.6。

所述方法的温度条件为：25℃-35℃，优选28℃-30℃。

所述方法的时间条件为0.5h-24h，较佳地，1h-10h，更佳地，2h-3h。

本发明的主要优点包括：

1)本发明首次从硬紫草(L.erythrorhizon)转录组中挖掘到对苯二酚2-香叶基-3″羟化酶CYP76B100，是紫草素生物合成过程中的一个关键酶；CYP76B100能将对2-香叶基-对苯二酚转化为3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚，该羟化产物与紫草素和紫草呋喃类化合物的合成密切相关。

(2)本发明对于调节生产植物萘醌类化合物和通过生物技术提高紫草中萘醌类活性成分紫草素及其衍生物的含量具有重要的理论和实际意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料与试剂

TESB缓冲液：含0.6M山梨醇和1mM EDTA的50mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液。

TEK缓冲液：含0.1M KCl和1mM EDTA的50mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液。

TEG缓冲液：含20％(v/v)甘油的TE缓冲液。

YPD培养基：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，若制固体培养基，加入20g/L琼脂粉；

SC-Ura培养基：6.7g/L无氨基酵母氮源，2g/L，20g/L葡萄糖，0.9g/L SCDropoutmix-Ura；

酿酒酵母BY4742作为候选P450酶的表达宿主，表达载体pESC-URA3从invitrogen公司购买，表达载体pCf302记载于如下文献中：Jingjie Jiang,et al.“MetabolicEngineering of Saccharomyces cerevisiae for High-Level Production ofSalidroside from Glucose.”J.Agric.Food Chem.2018,66,4431-4438.

2-香叶基-对苯二酚(GHQ,图1)由本实验室合成，纯度大于90％；NADPH购买自索莱宝生物科技有限公司；反转录试剂盒TransScript One-step gDNA Removal and cDNASynthesis Supermix购买自北京全式金有限责任公司；平末端快速克隆试剂盒pEASY-Blunt Cloning Kit购买自北京全式金有限责任公司；

密码子优化的拟南芥来源ATR1由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

实施例1.

CYP蛋白及其编码基因的获得

通过对硬紫草Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc.根部和茎叶组织的转录组数据进行序列分析、基因表达量分析，获得根部上调表达候选基因。以硬紫草红色根部组织RNA样品为模板反转录获得第一链cDNA文库。根据候选基因全长ORF序列设计引物，以反转录的cDNA为模板PCR扩增得到目的基因产物，使用平末端快速克隆试剂盒将其克隆到pEASY-Blunt克隆载体上，挑取三个单克隆在金唯智生物科技有限公司进行测序，PCR扩增得到的序列与转录组得到的序列完全一致，其DNA编码序列及蛋白质如分别如SEQ IDNO.:2和1所示。

实施例2.

CYP蛋白功能分析

2.1重组菌株的构建

1)构建重组质粒pCf302-ATR1-CYP76B100。以pCf302为出发载体，将合成的拟南芥来源ATR1基因构建到启动子P_TDH3后，得到重组质粒pCf302-ATR1。以质粒pCf302-ATR1为出发载体，将序列表中的DNA序列插入到启动子P_PGK1后，得到重组质粒pCf302-ATR1-CYP76B100。

2)将上述构建的重组质粒pCf302-ATR1-CYP76B100转化酿酒酵母BY4742，得到重组菌株BY4742-ATR1-CYP76B100；将空载质粒pCf302转化酿酒酵母BY4742，得到重组菌株BY4742-pCf302，此菌株作为空白对照菌株。

2.2底物添加实验

将重组菌株BY4742-ATR1-CYP76B100和空白菌株BY4742-pCf302的单菌落接种于3mL含20g/L葡萄糖的Ura(尿嘧啶)缺陷的SC-Ura液体培养基中，30℃、220rpm培养24h，由于载体上使用的组成型启动子，此时蛋白已经得到表达；在3mL发酵液中添加底物GHQ，30℃、220rpm培养约48h后，4000g离心5min，收集菌体沉淀。将菌体沉淀用1mL甲醇超声提取1h，上清转移到另一个离心管中，沉淀再次用1mL甲醇超声提取1h，上清合并后为胞内甲醇萃取组分；同时向发酵液上清中加入等体积的乙酸乙酯，超声萃取1h，收集上清有机相，保留下层菌液再次加入等体积乙酸乙酯，超声萃取1h，收集上清有机相，合并两次萃取得到的上清有机相为乙酸乙酯发酵液萃取组分；合并胞内甲醇萃取组分和乙酸乙酯发酵液萃取组分，用氮气吹干，在得到的混合物中加入等体积甲醇溶解，0.22μM微孔滤膜过滤，用于HPLC-MS检测。HPLC-MS测采用Agilent 1200HPLC system串联a Bruker-MicrOTOF-II massspectrometer(Bruker,Germany)系统。

HPLC检测参数如下：色谱柱Agela Innoval C18(4.6×250mm，5μM)；洗脱液由溶液A和溶液B组成：溶液A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，溶液B为甲醇，进样量30μL，检测波长254nm、201nm，流速1mL/min，柱温40℃。采用梯度洗脱方法：0min，45％(v/v)溶液B；3min，45％(v/v)溶液B；22min，100％(v/v)溶液B；32min，100％(v/v)溶液B；33min，45％(v/v)溶液B；43min，45％(v/v)溶液B。质谱条件如下：化模式为电喷雾(ESI)正离子，毛细管电压为-4500V，雾化气压为1bar，除溶剂气体为氮气，流速6.0L/min，除溶剂温度和离子源温度均为180℃，扫描范围m/z为50-1000，LC-MS数据收集软件为MassLynx 4.0(Waters,USA)，精确分子量用三氟乙酸钠作校正液。

HPLC结果如图2所示，空白菌株BY4742-pCf302的GHQ吸收峰和标准品GHQ吸收峰(RT＝25.7min)的保留时间一致，而重组菌株BY4742-ATR1-CYP76B100的胞内底物GHQ吸收峰消失，在极性增大的地方(RT＝21.1min)出现了一个新的吸收峰，说明CYP76B100能够有效转化底物GHQ生成一个羟化产物。通过HPLC-MS检测(图3)，该化合物的精确分子量([M+H]⁺＝263.1639)为2-香叶基-对苯二酚精确分子量([M+H]⁺＝247.16926)加上一个氧原子。

实施例3CYP催化产物结构确认

为了鉴定催化产物的结构，发酵1.5L重组菌株BY4742-ATR1-CYP76B100，添加30mg底物2-香叶基-对苯二酚，从而分离获得2-香叶基-对苯二酚羟化产物。将重组菌株BY4742-ATR1-CYP76B100和空白菌株BY4742-pCf302的单菌落接种于5mL含20g/L葡萄糖的SC-Ura液体培养基中，30℃、220rpm培养18h，得到种子液；取2mL培养种子液接种至100mL含20g/L葡萄糖的Ura(尿嘧啶)的SC-Ura液体培养基中，30℃、220rpm培养24h，使OD600达到2.0；每瓶发酵液(100mL)中添加2mg底物GHQ，共15瓶，1.5L发酵液，在30℃、220rpm条件下培养48h；4000g离心10min，分别收集菌体沉淀和发酵液上清，产物萃取方法和上述体外添加实验相同。将菌体沉淀用甲醇超声提取1h，上清转移到另一个离心管中，沉淀再次甲醇超声提取1h，上清合并后为胞内甲醇萃取组分；同时向发酵液上清中加入等体积的乙酸乙酯，超声萃取1h，收集上清有机相，保留下层菌液再次加入等体积乙酸乙酯，超声萃取1h，收集上清有机相，合并两次萃取得到的上清有机相为乙酸乙酯发酵液萃取组分；合并胞内甲醇萃取组分和乙酸乙酯发酵液萃取组分，用真空浓缩旋转蒸发仪将其浓缩蒸干后用5mL甲醇溶解，0.22μM微孔滤膜过滤，用于半制备液相分离纯化2-香叶基-对苯二酚羟化产物。

半制备液相分离纯化采用岛津LC-6AD系统。具体如下：色谱柱型号YMC-pack ODS-A(10×250mm,5μm)；进样量300μL；检测波长254nm、201nm，流速4mL/min，梯度洗脱方法：0min，45％(v/v)溶液B；1min，45％(v/v)溶液B；18min，100％(v/v)溶液B；23min，100％(v/v)溶液B；28min，45％(v/v)溶液B；33min，45％(v/v)溶液B；柱温40℃；目标成分保留时间约为16min，手动收集馏分。取收集的馏分经HPLC检测目标成分的纯度后合并，蒸干，得到纯化合物(约8mg)，产物溶于0.5mL氘代甲醇，通过核磁鉴定产物化学结构。

表1. 3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚的¹H、¹³C-NMR数据

¹H、¹³C-NMR以及二维谱表征结果分析见表1。分析结果表明，CYP76B100酶能催化2-香叶基-对苯二酚(GHQ)的3″位碳原子进行羟基化反应，生成3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚(GHQ-3″-OH)。

实施例4.

体外酶促反应

4.3体外酶促实验

4.3.1将重组菌株BY4742-ATR1-CYP76B100和空白菌株BY4742-pCf302的单菌落接种于5mL含20g/L葡萄糖的Ura(尿嘧啶)缺陷的SC-Ura液体培养基中，30℃、220rpm培养18h，得到种子液；取4mL培养种子液接种至100mL含20g/L葡萄糖的SC-Ura液体培养基中，30℃、220rpm培养约30h；4000g离心5min，收集菌体沉淀。

4.3.2提取酵母微粒体蛋白

1)将上述菌体沉淀重悬在50mL TEK缓冲液，4℃、4000rpm离心10min，收集菌体，弃上清，将收集的菌体重悬在500μL冰浴的TESB缓冲液，得到菌悬液；

2)向菌悬液中加入玻璃珠，使其刚好接触菌悬液表面，旋涡震荡破碎4×1min，每两次之间，将细胞置于冰上3min，将破碎后的细胞用2mL的TESB缓冲液洗3次，回收然后合并上清；

3)将回收的上清液在4℃、12000rpm条件下离心15min，收集上清，弃去沉淀；

4)将此上清液在4℃、150000×g超速离心1.5h，小心其去上清，得到微粒体沉淀；

5)采用300μL TEG缓冲液溶解沉淀，得到酵母微粒体蛋白，立即使用或者与-80℃保存。

注：所有操作在冰上进行，缓冲液和离心机均需要提前预冷到4℃。

4.3.3体外微粒体酶促反应

取上述提取的酵母微粒体蛋白溶液进行体外酶促反应，反应体系为200μL，由微粒体蛋白30μL、Tris-HCl(pH 7.5)50mM、NADPH 1mM、底物2-香叶基-对苯二酚(100μM)和蒸馏水组成。反应条件：30℃、150rpm反应3h。向反应产物中加入等体积的乙酸乙酯，涡旋震荡1min，离心收集上清有机相，保留下层菌液再次加入等体积乙酸乙酯，涡旋震1min，离心收集上清有机相，合并两次萃取得到的上清有机相，用氮气吹干乙酸乙酯，得到混合物，加入等体积甲醇溶解，0.22μM微孔滤膜过滤，用于HPLC检测。HPLC检测条件和上述HPLC-MS中高效液相色谱条件一致。

结果如图4所示：与空白菌株BY4742-pCf302相比，重组菌株BY4742-ATR1-CYP76B100的微粒体蛋白的酶促反应产物在RT＝21.1min出现了一个新的吸收峰，且与上述底物添加实验的产物GHQ-3″-OH出峰时间一致。说明硬紫草来源的CYP76B100能够有效催化GHQ生成GHQ-3″-OH，参与紫草素的生物合成。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种参与紫草素生物合成的CYP76B100蛋白及其编码基因与应用

<130> P2019-0764

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 496

<212> PRT

<213> 硬紫草(L .erythrorhizon)

<400> 1

Met Gly Thr Tyr Thr Ile Leu Leu Gly Leu Leu Phe Gly Phe Thr Ile

1 5 10 15

Leu Val Val Val Thr Ser Leu Ser Arg Lys Lys Lys Asn Leu Pro Pro

20 25 30

Gly Pro Ser Pro Leu Pro Ile Ile Gly Ser Leu His Leu Leu Gly Ser

35 40 45

Gln Ala Leu Leu Ser Leu Leu Asn Leu Thr Asn Lys Tyr Gly Pro Ile

50 55 60

Met Cys Leu Asn Leu Gly Ser Ile Pro Thr Ile Ile Val Ser Thr Pro

65 70 75 80

Asn Ile Ala Arg Glu Phe Leu Gln Lys Asn Asp Leu Ala Phe Ser Gly

85 90 95

Lys Arg Ile Pro Asp Ala Leu His Ala His Asp His Phe Lys Tyr Ser

100 105 110

Val Ser Trp Leu Pro Ala Asn Thr Gln Trp Arg Ser Ile Arg Lys Val

115 120 125

Leu Thr Ser Asn Ile Phe Thr Asn Asn Arg Leu Glu Ala Asn Gln His

130 135 140

Leu Arg Ser Arg Lys Val Gln Glu Leu Ile Thr Phe Cys His Lys Ser

145 150 155 160

Cys Lys Thr Gly Glu Ala Val Glu Val Gly Gln Ala Phe Phe Arg Thr

165 170 175

Thr Leu Asn Leu Leu Ser Asn Thr Ile Phe Ser Lys Asp Leu Thr Asp

180 185 190

His Ser Met Lys Thr Lys Ala Ala Glu Glu Phe Lys Asp Cys Val Trp

195 200 205

Asn Ile Leu Val Glu Ser Ala Lys Pro Asn Leu Val Asp Phe Phe Pro

210 215 220

Ile Leu Arg Ile Phe Asp Pro Gln Gly Ile Arg Arg Arg Asn Thr Ala

225 230 235 240

Leu Phe Gly Lys Ile Leu Asp Ile Phe Asp Gly Leu Ile Asn Glu Arg

245 250 255

Met Glu Gln Arg Lys Leu Asn Gly Phe Arg Asn Thr Asp Val Leu Asp

260 265 270

Thr Phe Leu Thr Tyr Gln Glu Glu His Pro Asp Glu Leu Asp Ala Lys

275 280 285

His Val Lys His Ser Leu Met Asp Leu Phe Ile Ala Gly Val Asp Thr

290 295 300

Thr Ala Ser Ile Ser Glu Trp Ala Leu Ala Glu Leu Ile Lys Asn Pro

305 310 315 320

Ala Ile Met Lys His Ala Lys Asn Glu Leu Glu Asp Val Ile Gly Lys

325 330 335

Gly Lys Val Leu Glu Glu Asp Asp Ile Ser His Leu Pro Tyr Leu Lys

340 345 350

Asn Ile Val Lys Glu Thr Val Arg Leu His Pro Pro Gly Pro Phe Leu

355 360 365

Phe Pro Arg Gln Pro Glu Lys Asp Val Glu Val Cys Gly Tyr Thr Ile

370 375 380

Pro Lys Gly Ser Gln Val Leu Val Ser Ile Trp Ala Leu Gly Arg Asp

385 390 395 400

Pro Asn Leu Trp Glu Asn Pro Leu Met Phe Asn Pro Asp Arg Tyr Lys

405 410 415

Lys Ser Asp Leu Asp Phe Arg Gly Gln Asn Phe Glu Leu Ile Pro Phe

420 425 430

Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Ile Pro Leu Ala Val Lys Met

435 440 445

Val Pro Leu Met Leu Gly Ser Met Ile Asn Ser Phe Asn Trp Glu Leu

450 455 460

Glu Gly Ala Met Lys Pro Glu Glu Leu Asn Met Glu Glu Arg Ile Gly

465 470 475 480

Leu Thr Leu Gln Met Ala Phe Pro Leu Arg Ala Val Pro Val Pro Leu

485 490 495

<210> 2

<211> 1491

<212> DNA

<213> 硬紫草(L .erythrorhizon)

<400> 2

atgggtactt atacaatcct cttaggcctt ctctttggct tcacaatctt ggtagttgtt 60

acctcactct caagaaaaaa gaaaaatctt cctccaggac cttcaccatt accaattatt 120

ggtagcctac acttgcttgg tagtcaagct ttattgtcct tactcaattt aaccaacaaa 180

tatggtccaa taatgtgctt aaatcttgga agcattccca caattatagt ttcaacacca 240

aacatagcca gagaatttct tcagaaaaat gatttagcct tctctggaaa aagaatccca 300

gatgccctcc atgctcatga ccatttcaaa tactctgtca gttggcttcc agcaaatact 360

caatggagaa gtatccgaaa agtcttgact tccaacattt tcacaaacaa caggcttgaa 420

gccaatcaac atcttaggtc aaggaaagtt caagaactga ttacattttg tcacaaaagt 480

tgtaaaacag gggaagctgt tgaagttgga caggcctttt tcaggacgac gttgaatttg 540

ttgtcgaata ctatattttc gaaggactta actgatcatt caatgaaaac caaggctgct 600

gaagagttca aagattgtgt gtggaacatt ttggttgagt ctgctaagcc aaacctggta 660

gatttctttc ctattcttag aatctttgat ccacaaggta tcaggcgaag gaatactgcc 720

ctttttggga agattcttga tatttttgat ggattgatta atgagcgtat ggaacaaagg 780

aaacttaatg ggtttcgtaa cactgatgtt ttggatacct ttctcactta ccaggaggaa 840

caccctgatg agcttgatgc caaacatgtg aaacactcat tgatggattt atttatagct 900

ggagttgata ctactgcaag tatttctgag tgggcattgg cggaattgat caagaatcca 960

gcaatcatga aacatgccaa gaacgaactt gaagatgtca taggcaaagg aaaggtttta 1020

gaagaggacg atatctctca tctaccttat ttgaaaaata ttgtaaaaga aacagtaaga 1080

ttacaccccc caggtccatt tttatttcct cgccagccag aaaaagatgt tgaagtttgt 1140

ggttatacaa ttcccaaagg atcacaagtt ctagttagta tatgggcact tgggcgtgac 1200

ccaaatttgt gggaaaatcc attaatgttt aatcctgata gatacaagaa atcggacttg 1260

gattttcgag gtcaaaattt cgagttgatt ccttttggag cgggaagaag aatttgtcca 1320

ggcataccac tcgcggttaa aatggttccg ctaatgttgg gatcaatgat taattctttt 1380

aattgggaac tggagggtgc catgaaacct gaagagttga acatggagga aagaattggt 1440

cttacattgc aaatggcctt tcctcttcgt gctgtccctg tccctcttta a 1491

Claims

1.一种分离的CYP76B100多肽，其特征在于，所述多肽为如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码如SEQ ID NO.1所示CYP76B100多肽的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合权利要求2所述的多核苷酸，所述宿主细胞选自下组：酿酒酵母、大肠杆菌、或其组合。

6.一种CYP76B100多肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)培养权利要求5所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述CYP76B100多肽。

7.一种如权利要求1所述的CYP76B100多肽、权利要求4所述的载体、或权利要求5所述的宿主细胞的用途，其特征在于，它被用于催化以下反应，或被用于制备催化以下反应的催化制剂：将2-香叶基-对苯二酚的3″位碳原子进行羟基化反应，生成3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚。

8.一种催化反应的方法，其特征在于，包括步骤：在权利要求1所述的多肽存在的条件下，进行2-香叶基-对苯二酚的3″位碳原子的羟基化的催化反应。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法在辅酶因子的存在下进行。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法在氧气存在下进行。

11.一种3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚的制备方法，其特征在于，包括：

在权利要求1所述的多肽的存在下，催化2-香叶基-对苯二酚，从而得到3″-羟基-2-香叶基-对苯二酚。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法在辅酶因子的存在下进行。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述辅酶因子为NADPH和/或NADH。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述辅酶因子的用量为0.5-6.0mM。

15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法在氧气存在下进行。