CN116891838B - 烯还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及烯还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用。本发明发现了一种烯还原酶，其可用于西他列汀中间体的制备，进一步的，通过随机和定点突变获得烯还原酶突变体，将它们用于西他列汀中间体的合成，试验结果表明，本发明的烯还原酶突变体对底物选择性高、酶活力强，与传统合成方法相比，步骤简单、成本低、副产物低、产物手性纯度高，能够更好的满足工业化生产需求，具有广泛的应用潜力。

Description

烯还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及烯还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用。
背景技术
西他列汀(sitagliptin)，化学名为(2R)-4-氧代-4-[3-三氟甲基-5,6-二氢[1,2,4]三唑[4,3-α]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)-丁-2-胺，是由美国Merck公司研发的的首个获得FDA批准用于治疗II型糖尿病的二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制剂。西他列汀能够血糖依赖性地增加胰岛素的分泌，降糖作用较为适中，不会引发低血糖的发生，并且无增加体重、恶心、呕吐等副作用。西他列汀的商品名为捷诺维(Januvia)，目前已在全世界70多个国家批准使用，是国际上药物销售额前20强的药物。
（R）-3-氨基-4-（2,4 ,5-三氟苯基）-丁酸酯（化合物I，其中R1为甲基、乙基、或异丙基，结构如图1所示）是合成西他列汀的重要中间体，文献报道化合物I的合成方法较多，其中以3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁烯酸酯（化合物II，其中R1为甲基、乙基、或异丙基，结构如图2所示）为底物，通过化学或者酶催化不对称氢化方法为主要制备途径；文献“Tetrahedron: Asymmetry 17 (2006) 205~209”以手性配体铑催化剂在高压下催化氢化反应合成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，产率达到90％，ee值93％；专利WO2009064476公开了采用手性配体钌催化剂对烯的不对称氢化来制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯，催化剂为(R)-BINAP和Ru(COD)Cl2，产品纯度91.1%；专利CN102702205公开了 [(R)-(-)-2,2 '- 双 (3,5-二甲基苯基膦 )-1,1' -联萘]二乙酸钌催化高压氢化反应制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，得到ee值大于90%的产物；文献“Chem. Biochem. Eng. Q., 28 (1) 1~11 (2014)”研究了手性膦配体钌催化剂Ru(COD)Cl/(R)-BINAP高压氢化反应，制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯，产物光学纯度可达98.5%；文献Adv. Synth. Catal. 2016, 358, 1042~1047以手性路易斯碱和三氯硅烷在0℃下催化氢化反应合成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯，产率达到95％，ee值82％；专利CN112225666公开了两步催化反应合成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，第一步硼氢化物和路易斯酸及冠醚催化反应，第二步手性氨基醇配体催化反应，产物手性纯度含量大于99％。
上述化学合成方法，需要用昂贵的手性催化剂及高压条件，大多产物手性纯度不高，制备成本及工艺安全要求限制了其工业应用。
酶催化是绿色制药领域的主要方向，但是目前利用酶催化氢化制备（R）-3-氨基-4-（2,4,5-三氟苯基）-丁酸酯（化合物I）的报道很少。由于化学-酶法具有高选择性及环境优化的优势，目前逐步成为合成手性医药化学品及其中间体的首选方案。ω-氨基转移酶应用于合成西他列汀中间体的研究有非常多的报道，而烯还原酶是合成西他列汀中间体另一理想途径，但是目前报道很少，筛选新型烯还原酶并进行改造研究，可以高效高选择性催化合成西他列汀中间体，不仅可以拓宽烯还原酶的应用范围，提升其应用潜力，也为实现西他列汀中间体酶法合成开辟新途径。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供烯还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用。
本发明提供了如具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的烯还原酶在西他列汀制备中的应用。
进一步的，本发明提供了具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的烯还原酶在西他列汀中间体制备中的应用；
具体的本发明提供了具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的烯还原酶在如图1所示结构的西他列汀中间体制备中的应用。
本发明通过筛选获得了一种烯还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，它能够催化3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁烯酸酯（化合物II，图2所示）不对称还原制备(R)-3-氨基-4-(2,4 ,5-三氟苯基)-丁酸酯（产物I，图1所示），该反应立体选择性高，获得的产物I的ee值>99%，且目前没有该酶用于催化制备(R)-3-氨基-4-(2,4 ,5-三氟苯基)-丁酸酯（产物I）的报道。
本发明所述的烯还原酶突变体，其包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第151位酪氨酸突变为天冬氨酸、苏氨酸、组氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，和如下突变中的至少一种：
第26位异亮氨酸突变为缬氨酸或甘氨酸；或
第29位甘氨酸突变为丙氨酸；或
第124位亮氨酸突变为苯丙氨酸；或
第130位精氨酸突变为组氨酸；或
第220位酪氨酸突变为组氨酸；或
第278位缬氨酸突变为丙氨酸；或
第286位缬氨酸替换为丙氨酸或甲硫氨酸。
进一步的，本发明所述烯还原酶突变体包括：
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第124位亮氨酸突变为苯丙氨酸和第151位酪氨酸突变为苏氨酸；或
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第130位精氨酸突变为组氨酸和第151位酪氨酸突变为缬氨酸；或
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第151位酪氨酸突变为缬氨酸和第286位缬氨酸突变为丙氨酸；或
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第26位异亮氨酸突变为缬氨酸，第151位酪氨酸突变为天冬氨酸和第278位缬氨酸突变为丙氨酸；或
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第130位精氨酸突变为组氨酸和第151位酪氨酸突变为天冬氨酸；或
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第29位甘氨酸突变为丙氨酸，第151位酪氨酸突变为苏氨酸和第220位酪氨酸突变为组氨酸；
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第151位酪氨酸突变为天冬氨酸和第286位缬氨酸突变为甲硫氨酸；或
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第130位精氨酸突变为组氨酸，第151位酪氨酸突变为天冬氨酸和第286位缬氨酸突变为甲硫氨酸；或
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第26位异亮氨酸突变为甘氨酸，第151位酪氨酸突变位组氨酸和第278位缬氨酸突变为丙氨酸（I26G/Y151H /V278A）；或
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第26位异亮氨酸突变为甘氨酸，第151位酪氨酸突变为天冬氨酸，第278位缬氨酸突变为丙氨酸和第286位缬氨酸突变为甲硫氨酸（I26G/Y151D/V278A/V286M）。
本发明所述的烯还原酶突变体是采用易错PCR和定点饱和突变技术获取，使用易错PCR技术对所述SEQ ID NO:2烯还原酶基因进行突变，PCR产物经纯化、酶切、连接到pET28a载体上，将获得的突变质粒以化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，对获得的菌株进行培养，建立酶活测定方法，筛选优势突变体，将优势突变体测序并保存，获得突变位点信息。对筛选出的突变位点采用全质粒PCR方法进行定点饱和突变以及多位点组合突变，获得突变菌株，突变菌株经培养后，进一步筛选出优势突变体，优势突变体测序验证并保存。所述突变体与野生型烯还原酶相比，不仅烯还原酶活力提高显著，而且3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁烯酸酯（化合物II）的反应浓度也有明显提高，由化合物II生成化合物I的转化率提高显著；且在突变过程中，突变位点不同，突变体在转化中的性能也呈现出差异，具体的，突变体I26G/Y151H /V278A和突变体I26G/Y151D/V278A/V286M的酶活力分别达到了1084.98U/L和1210.55U/L，转化率分别达到了95.14%和98.25%显示了较好的工业化应用潜力，并对促进该酶在药物合成中的应用具有重要意义。
本发明提供了组合物，其包括组合物1或组合物2中的任意一种，
所述组合物1包括：辅酶再生酶和烯还原酶；
所述组合物2包括：辅酶再生酶和本发明所述的烯还原酶突变体；
所述辅酶再生酶包括葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶中的任意一种；
所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
所述烯还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了烯还原酶制剂、烯还原酶突变体酶制剂，或所述组合物制剂，所示制剂可以为固体、液体或半固体，所述制剂中还可以包括稳定剂、表面活性剂、缓冲液等，用于维持或协助所述酶的保存或发挥作用。
本发明提供了生物材料，其包括如下A）~D）所示中的至少一种：
A）、编码本发明所述的烯还原酶突变体或本发明所述的组合物的核酸；
B）、含有A）所述核酸的重组载体；
C）、转化或转染如B）所述重组载体的宿主细胞；
D）、培养如C）所述的宿主细胞获得的混合物。
本发明所述的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本发明实施例中，所述核酸为DNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列（例如启动子或转录终止子）。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是载体（如表达或克隆载体）的一部分，或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。
在本发明中，所述核酸可以是经优化的也可以是未经优化的，这些优化包括但不限于：密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点等。
本发明中还提供了包含所述核酸的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly（A）信号等。
本发明所述重组载体，是指重组的核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对原核细胞中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知原核细胞利用启动子，增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。具体实施例中，所述核酸可构建于各种原核表达载体中，例如，pET系列载体，本发明的具体实施例中为pET28a。
本发明的宿主细胞，其转化或转染所述重组载体，使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞，这样转化的宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。
进一步的，所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。所述的病毒转染包括腺病毒转染、腺相关病毒转染、慢病毒转染等。
更进一步的，本发明提供的宿主细胞，其来源包括植物、动物、细菌、真菌、噬菌体或病毒，本发明对此不做限定。本发明的一些具体实施例中，所述宿主为细菌，具体的为大肠杆菌，更具体的为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明提供了如下i）~iv）所示中的至少一种在西他列汀中间体合成中的应用:
i）、氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的烯还原酶；
ii）、本发明所述的烯还原酶突变体；
iii）、本发明所述的组合物；
iv）、本发明所述的生物材料。
本发明提供了西他列汀中间体的制备方法，其包括利用如下I）~IV）所示中的至少一种进行西他列汀中间体合成：
I）、氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的烯还原酶；
II）、本发明所述的烯还原酶突变体；
III）、本发明所述的组合物；
IV）、本发明所述的生物材料。
进一步的，所述的制备方法，包括如下步骤：
在催化剂、辅酶再生酶、辅底物、辅酶存在的条件下，将如式II所示的底物反应生成如式I所示的西他列汀中间体；
式I和式II所示的结构如下：
式I；
式II;
其中，
R1选自甲基、乙基、或异丙基，优选乙基；
R2选自甲基、乙基、或异丙基，优选乙基；
R1与R2相同；
所述催化剂为如SEQ ID NO:1所示的烯还原酶或本发明所述的烯还原酶突变体中的任意一种；所述烯还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述辅酶再生酶包括葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶中的任意一种；
所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
所述辅底物包括异丙醇、葡萄糖或甲酸铵；
所述辅酶为NADP。
进一步的，
所述辅酶再生酶为异丙醇脱氢酶，则辅底物为异丙醇；
所述辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶，则辅底物为葡萄糖；
所述辅酶再生酶为甲酸脱氢酶，则辅底物为甲酸铵。
更进一步的，
所述底物、催化剂与辅酶再生酶的浓度比为（1~3）：4：（1~2）；
具体的，在本发明的具体实施例中，
所述底物的浓度为0.01g/ml~ 0.03g/ml;
含有所述催化剂的菌体的浓度为0.04g/ml；
含有所述辅酶再生酶的菌体的浓度为0.01g/ml~ 0.02g/ml；
所述异丙醇的浓度为50μL/ml；
所述葡萄糖的浓度为0.05g/ml~0.06g/ml；
所述甲酸铵的浓度为0.05g/ml；
所述NADP在反应体系中，使用的是质量分数5%的NADP水溶液，所述质量分数5%的NADP水溶液在反应体系中的用量为5μL/ml；
所述反应的缓冲液为pH 8.0的0.1M磷酸钾缓冲液；
所述反应的条件为20℃~50℃、pH为6~10，优选35℃、pH为8.0；
所述底物在反应前需要溶解于DMSO。
具体的，本发明所述的制备方法中，对底物和反应条件进行了优化，从式II所示的底物R1基团优选为乙基时的转化率最高，显著高于R1基团为甲基以及异丙基；同时所述反应的条件为20℃~50℃、pH为6~10时，35℃、pH为8.0的转化率优于其他条件。
本发明中，所述烯还原酶、烯还原酶突变体、辅酶再生酶均通过将目的基因与载体重组获得重组载体后构建基因工程菌株，所述基因工程菌株经培养和诱导获得上所述酶，将上述酶用于西他列汀中间体的合成中，与化学合成相比较，合成步骤简单、成本低、副产物低、产物手性纯度高。
进一步的，本发明所述的制备方法中，所述培养利用的培养基为任何可使菌体生长并诱导产生前述酶的培养基，优选LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，pH 7.0），培养方法和培养条件可以根据宿主类型和培养方法、实验条件等因素的不同按需调整。
本发明发现了一种烯还原酶，其可用于西他列汀中间体的制备，进一步的，通过随机和定点突变获得烯还原酶突变体，将它们用于西他列汀中间体的合成，试验结果表明，本发明的烯还原酶突变体对底物选择性高、酶活力强，与传统合成方法相比，步骤简单、成本低、副产物低、产物手性纯度高，能够更好的满足工业化生产需求，具有广泛的应用潜力。
附图说明
图1示化合物I的结构式，其中，(R)表示立体构型为R-型；R1选自甲基、乙基、或异丙基；
图2示化合物II的结构式，其中，R1选自甲基、乙基、或异丙基；
图3示重组烯还原酶催化反应过程；
图4示R1优选乙基时重组烯还原酶催化反应过程。
具体实施方式
本发明提供了烯还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
野生型烯还原酶PsERED氨基酸序列为: MNQNDQRSKHEATSAGERNRPSVTIIGLGPMGQAMAAVFLDRGYEVTVWNRTAGKSDALAAKGAIKASSVDEAIAANDLIILSLTDYDAMYAILEKAARDLSGKVFVNLSSDTPEKAREAAKWLEARGARHLTGGVQVPPSGIGKAESSTYYSGTREVFDAHKKTLEVLTGADYRGEDPGLAALYYQIQMDMFWTSMLSYLHALSLAGANGLTAEQIRPYAIETMKSLPMFIEFYTPRIDAGEHPGDVDRLGMGVASVDHIVHTSKDAGIDASLPAAVLEVFKRGVANGQAGNSFTSLIEVFKKPAPSA（SEQ ID NO:1）；
野生型烯还原酶PsERED核苷酸序列为：atgaatcaaaatgatcaacgatcaaaacatgaagcgacgtcagcaggggaacgtaaccgtccatctgtaaccataatcggtctgggcccgatgggccaagcgatggcagccgtattcctggatcggggctatgaggtaaccgtgtggaaccggactgccggcaaatcggacgctttagcagctaagggtgccattaaagcgtctagtgttgacgaggcgatagctgcgaatgatttaattatcctcagcctcacggattatgacgcgatgtacgcgatcctagaaaaggctgcaagggacttgagcggtaaagtcttcgtcaacctgagctcagacactccggaaaaagccagagaggcggcgaagtggctcgaagcgcgcggagcacgccacctaacgggcggcgttcaggtcccgccatcgggtattggcaaagcggaatcctcaacatactacagcggtacaagagaggtttttgatgcccataaaaagacgcttgaggtcctgacgggggccgactatcggggcgaggatccggggcttgcagcgctgtactatcagattcagatggatatgttctggacctccatgctcagttatttgcatgccctttctcttgctggcgcgaatggcctcacggctgagcagatccgcccatatgccattgagacgatgaaatcactgccgatgttcatcgagttctatacgcctcggatcgatgctggcgagcatccaggggatgtagaccggctcggcatgggcgtggcgagtgtcgatcacattgtacatacgagcaaggatgccggcatcgacgcatcccttcccgcagctgtcttagaggtgttcaagcgaggtgtggctaatggtcaagcggggaatagcttcaccagtctgatcgaagtattcaagaagcccgctccatcggcctga（SEQ ID NO:2）；
葡萄糖脱氢酶BsGDH核苷酸序列为：atgtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgctattacaggagctgcttcagggctcggaaaggcgatggccattcgcttcggcaaggagcaggcaaaagtggttatcaactattatagtaataaacaagatccgaacgaggtaaaagaagaggtcatcaaggcgggcggtgaagctgttgtcgtccaaggagatgtcacgaaagaggaagatgtaaaaaatatcgtgcaaacggcaattaaggagttcggcacactcgatattatgattaataatgccggtcttgaaaatcctgtgccatctcacgaaatgccgctcaaggattgggataaagtcatcggcacgaacttaacgggtgcctttttaggaagccgtgaagcgattaaatatttcgtagaaaacgatatcaagggaaatgtcattaacatgtccagtgtgcacgaagtgattccttggccgttatttgtccactatgcggcaagtaaaggcgggataaagctgatgacagaaacattagcgttggaatacgcgccgaagggcattcgcgtcaataatattgggccaggtgcgatcaacacgccaatcaatgctgaaaaattcgctgaccctaaacagaaagctgatgtagaaagcatgattccaatgggatatatcggcgaaccggaggagatcgccgcagtagcagcctggcttgcttcgaaggaagccagctacgtcacaggcatcacgttattcgcggacggcggtatgacacaatatccttcattccaggcaggccgcggttaa（SEQ ID NO:3）；
异丙醇脱氢酶TbIPADH核苷酸序列为：atgaaaggttttgcaatgctcagtatcggtaaagttggctggattgagaaggaaaagcctgctcctggcccatttgatgctattgtaagacctctagctgtggccccttgcacttcggacattcataccgtttttgaaggcgccattggcgaaagacataacatgatactcggtcacgaagctgtaggtgaagtagttgaagtaggtagtgaggtaaaagattttaaacctggtgatcgcgttgttgtgccagctattacccctgattggcggacctctgaagtacaaagaggatatcaccagcactccggtggaatgctggcaggctggaaattttcgaatgtaaaagatggtgtttttggtgaattttttcatgtgaatgatgctgatatgaatttagcacatctgcctaaagaaattccattggaagctgcagttatgattcccgatatgatgaccactggttttcacggagctgaactggcagatatagaattaggtgcgacggtagcagttttgggtattggcccagtaggtcttatggcagtcgctggtgccaaattgcgtggagccggaagaattattgccgtaggcagtagaccagtttgtgtagatgctgcaaaatactatggagctactgatattgtaaactataaagatggtcctatcgaaagtcagattatgaatctaactgaaggcaaaggtgtcgatgctgccatcatcgctggaggaaatgctgacattatggctacagcagttaagattgttaaacctggtggcaccatcgctaatgtaaattattttggcgaaggagaggttttgcctgttcctcgtcttgaatggggttgcggcatggctcataaaactataaaaggcgggctatgccccggtggacgtctaagaatggaaagactgattgaccttgttttttataagcgtgtcgatccttctaagctcgtcactcacgttttccggggatttgacaatattgaaaaagcctttatgttgatgaaagacaaaccaaaagacctaatcaaacctgttgtaatattagcataa（SEQ ID NO:4）；
甲酸脱氢酶BstFDH核苷酸序列为atggcgaccgtcctctgcgtgctctaccccgatcccgtcgacggctatccgccgcactacgtgcgcgacacgattccggtcatcacgcgatacgcggacggacaaaccgcgccgacgccggccggcccgcccggtttccggcccggcgaactcgtcggctcggtgtccggcgcgctcgggctgcgcggctacctggaagcgcacggtcacacgctgatcgtgacgagtgacaaggacggccccgattccgaattcgaacgccggctgcccgacgcggacgtggtgatttcgcagccgttctggcccgcgtacctgaccgccgaacggatcgcccgcgcgccgaagctcaggctcgcgctgacggccggcatcggctccgatcatgtcgatctcgacgccgcggcgcgcgcacacatcaccgtcgcggaagtcaccggctcgaacagcatcagcgtggccgaacacgtggtgatgacgacgctcgcgctggtgcgcaactacctgccgtcgcatgcgatcgcgcagcaaggcggctggaacatcgccgattgcgtgtcgcgcagctacgacgtcgaagggatgcacttcggcacggtcggcgcgggacgcatcggtctcgcggtgttgcgccggctgaagccgttcggcctgcacctgcactacacacagcggcaccggctcgacgccgcgatcgagcaggaactcgggctcacgtatcacgccgatcccgcgtcgctcgccgccgcggtcgacatcgtcaacctgcagatcccgctgtatccgtcgaccgagcacctgttcgacgcggcgatgatcgcgcggatgaaacgcggcgcgtacctgatcaacaccgcgcgcgcgaagctggtcgatcgcgatgccgtggtgcgcgcggtcacgtccggccatctcgccggctacggcggcgacgtgtggtttccgcagcccgcgccggccgatcacccgtggcgcgcgatgccgttcaacgggatgacgccgcacatctccggcacgtcgctgtcggcgcaggcgcgctatgcggccggcacgctggagatcctgcagtgctggttcgacggccggccgatccgcaatgaatacctgatcgtcgacggcggcacgctcgcgggaacgggcgcgcagtcgtaccggctgacatga（SEQ ID NO:5）；
ERED-F：ccggaattcatgaatcaaaatgatcaacgatcaa（SEQ ID NO:6）；
ERED-R：cccaagctttcaggccgatggagcg（SEQ ID NO:7）；
I26-F：ccatctgtaaccatannnggtctgggcccgatg（SEQ ID NO:8），其中，n代表碱基a、t、c、g中的任意一种；
I26-R：gccttactggttagcagaatg（SEQ ID NO:9）；
Y151-F：gcggaatcctcaacannntacagcggtacaaga（SEQ ID NO:10），其中，n代表碱基a、t、c、g中的任意一种；
Y151-R：gccttactggttagcagaatg（SEQ ID NO:11）；
V286-F：gtgttcaagcgaggtnnngctaatggtcaagcg（SEQ ID NO:12），其中，n代表碱基a、t、c、g中的任意一种；
V286-R：gccttactggttagcagaatg（SEQ ID NO:13）；
葡萄糖脱氢酶BsGDH氨基酸序列为： MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG（SEQID NO:14）；
异丙醇脱氢酶TbIPADH氨基酸序列为：MKGFAMLSIGKVGWIEKEKPAPGPFDAIVRPLAVAPCTSDIHTVFEGAIGERHNMILGHEAVGEVVEVGSEVKDFKPGDRVVVPAITPDWRTSEVQRGYHQHSGGMLAGWKFSNVKDGVFGEFFHVNDADMNLAHLPKEIPLEAAVMIPDMMTTGFHGAELADIELGATVAVLGIGPVGLMAVAGAKLRGAGRIIAVGSRPVCVDAAKYYGATDIVNYKDGPIESQIMNLTEGKGVDAAIIAGGNADIMATAVKIVKPGGTIANVNYFGEGEVLPVPRLEWGCGMAHKTIKGGLCPGGRLRMERLIDLVFYKRVDPSKLVTHVFRGFDNIEKAFMLMKDKPKDLIKPVVILA（SEQ ID NO:15）；
甲酸脱氢酶BstFDH氨基酸序列为：MATVLCVLYPDPVDGYPPHYVRDTIPVITRYADGQTAPTPAGPPGFRPGELVGSVSGALGLRGYLEAHGHTLIVTSDKDGPDSEFERRLPDADVVISQPFWPAYLTAERIARAPKLRLALTAGIGSDHVDLDAAARAHITVAEVTGSNSISVAEHVVMTTLALVRNYLPSHAIAQQGGWNIADCVSRSYDVEGMHFGTVGAGRIGLAVLRRLKPFGLHLHYTQRHRLDAAIEQELGLTYHADPASLAAAVDIVNLQIPLYPSTEHLFDAAMIARMKRGAYLINTARAKLVDRDAVVRAVTSGHLAGYGGDVWFPQPAPADHPWRAMPFNGMTPHISGTSLSAQARYAAGTLEILQCWFDGRPIRNEYLIVDGGTLAGTGAQSYRLT（SEQ ID NO:16）。
本发明提供烯还原酶及其突变体在催化底物3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁烯酸酯（化合物II）不对称还原反应制备光学纯产物(R)-3-氨基-4-(2,4 ,5-三氟苯基)-丁酸酯（化合物I）中的应用。所述化合物II和化合物I，其中R1为甲基、乙基、或异丙基，优选为乙基；对应的R2为甲基、乙基、或异丙基，优选为乙基。所述的应用方法为：将含烯还原酶及其突变体基因的重组基因工程菌经诱导培养获得湿菌体、然后制备所需生物催化剂，用于催化底物II还原，获得目标产物I，具体如图3所示。
本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 基因工程菌的构建
一、重组野生型烯还原酶基因工程菌的构建
野生型烯还原酶来源于Paenibacillus sp.，其氨基酸序列（NCBI ID：WP_144878318.1）如SEQ ID NO:1所示，编码该氨基酸的核苷酸序列（NCBI ID：NZ_VEIJ01000018.1）如SEQ ID NO:2所示，通过全基因合成烯还原酶基因，在基因的两端分别引入EcoR I和Hind III位点，并克隆到pET28a载体上。构建好的重组质粒经过化学转化方法，转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃下培养8~12h，挑取单克隆细胞，获得可以诱导表达烯还原酶的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-PsERED。
二、辅酶再生酶基因工程菌的构建
葡萄糖脱氢酶基因工程菌：Bacillus subtilis葡萄糖脱氢酶BsGDH（NCBI ID：NC_000964.3，SEQ ID NO:3）通过全基因合成获得，并通过双酶切连接到pET28a载体上，将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组葡萄糖脱氢酶大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-BsGDH。
异丙醇脱氢酶基因工程菌：Thermoanaerobacter brockii异丙醇脱氢酶TbIPADH(NCBI ID：NC_010321.1，SEQ ID NO:4)通过全基因合成获得，并通过双酶切连接到pET28a载体上，将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组异丙醇脱氢酶大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-TbIPADH。
甲酸脱氢酶基因工程菌：Burkholderia stabilis甲酸脱氢酶BstFDH (NCBI ID：EU825923.1，SEQ ID NO:5)通过全基因合成获得，并通过双酶切连接到pET28a载体上，将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组甲酸脱氢酶大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-BstFDH。
三、重组酶基因工程的诱导培养及生物催化剂制备
种子液培养：将烯还原酶、辅酶再生酶基因工程菌分别接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12~16h。
酶的诱导表达：种子液以体积分数1％(v/v)接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养2~3h，OD600在0.6~0.8之间时加入诱导剂IPTG，IPTG的终浓度为0.2mM，25℃培养20h。
生物催化剂制备：诱导培养结束后，收集发酵液通过高速离心获得基因工程菌全细胞菌体。菌体用0.1M pH 7.5的磷酸钾缓冲液悬浮（湿菌体浓度为200g/L），然后采用超声破碎或者均质机破碎方法对菌悬液进行破碎，得到酶液。酶液再通过真空冷冻干燥制备成酶粉。
实施例2 烯还原酶突变体文库的构建及筛选
一、易错PCR突变文库的构建及筛选
以如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的野生型烯还原酶为模板，引物设计如表1所示，向PCR混合物中加入适量的MnCl2和MgCl2溶液控制诱变率，以此获得随机突变体。
PCR反应体系为：2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，DNA模板1μL，Mg2+终浓度为2mM，Mn2+终浓度为1mM，加水至50 μL。
PCR扩增程序为：（1）94℃，预变性5min；（2）94℃，变性30s；（3）60℃退火30s；（4）72℃延伸60s；步骤(2)~(4)进行35个循环，72℃充分延伸5min，4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察结果后，用清洁试剂盒纯化PCR产物。
分别将PCR产物和质粒pET28a经酶切、连接后转化到BL21（DE3）感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上。用灭菌过的牙签挑取平板上的突变子，在96孔板中诱导培养后吸取上清酶液进行初次筛选。
酶活力筛选体系（200μL）：0.13mM底物3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁烯酸乙酯，0.27 mM NADPH，0.1M pH 7.0磷酸钾缓冲液，酶液 50 μL，30℃下测1min内340nm 处吸光值变化值，计算酶活力，从而初步筛选出对底物活性较高的突变体。
将初步筛选获得的活性较高的突变体，按实施例1方法制备得到突变体烯还原酶酶液，进行复筛并计算酶活力，确定活力提高突变体。
结果如表2所示，通过突变体文库的筛选获得5个活力提高明显的烯还原酶突变体，分别命名为ERED-1、ERED-2、ERED-3、ERED-4、ERED-5，测序分析获得突变位点信息。
复筛反应体系(2 mL)：1 mM底物 3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁烯酸酯，0.20mMNADPH，一定浓度的酶液及0.1M pH 7.0磷酸钾缓冲液，30℃下测1min内340 nm 处吸光值变化值。
酶活计算公式如下所示：U=（EW×V×103）/（6220×l）；
其中，EW代表340nm处吸光值1min内的变化值；V代表反应液体系的体积量(mL)；6220代表消光系数(L·mol−1·cm−1)；l代表光程距离值(cm)。
二、定点突变构建烯还原酶突变文库及筛选
将表2中筛选到的第26位异亮氨酸、151位酪氨酸和286位缬氨酸作为突变位点，分别将其转化为其他19种氨基酸，覆盖所有可能的其他氨基酸。利用全质粒PCR法将突变碱基引入烯还原酶基因序列中，突变引物的设计如表3所示。
第一轮PCR反应体系：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板DNA 1μL，PrimeSTARMax Premix（2×）12.5μL，加水至25μL。
第一轮PCR扩增程序为：（1）95℃，预变性4min；（2）98℃，变性10s；（3）58℃退火5s；（4）72℃延伸3min；步骤(2)~(4)共30个循环，72℃充分延伸10min，4℃保存。
第二轮PCR反应体系：第一轮PCR产物5μL，PrimeSTAR Max Premix（2×）12.5μL，加水至25μL。
第二轮PCR扩增程序为：（1）95℃，预变性5min；（2）98℃，变性10s；（3）58℃退火15s；（4）72℃延伸2min；步骤(2)~(4)共30个循环，72℃充分延伸10min，4℃保存。
DpnI消化：在PCR产物中加入1μL DpnI，37℃消化3h。
将消化后的PCR产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养12~18h后，获得烯还原酶突变体。
按实施例1方法制备酶液后按前述酶活力复筛方法（即利用复筛反应体系）测定突变体酶活力，并进行酶反应测试：
酶反应测试反应体系(1ml)：烯还原酶突变体酶液200μL，0.1M pH 8.0 磷酸盐缓冲液600μL，5% NADP水溶液5μL，底物3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁烯酸乙酯10mg，DMSO100μL，异丙醇50μL，异丙醇脱氢酶TbIPADH酶液100μL。反应条件：温度30℃、振荡反应器速度1200r/min，反应时间24h。反应结束后，取样进行HPLC检测转化率及ee值。结果如表4所示。
HPLC分析方法：Agilent1260或其它类似液相色谱仪，色谱柱ZORBAX EclipseXDB-C18 4.6mm´150mm´5μm，柱温25℃，流速1ml/min，检测波长210nm，进样量10μL，流动相A：30 mM pH 6.80 KH2PO4:ACN= 9：1（v/v）； 流动相B：ACN
手性分析方法：Agilent1260或其它类似液相色谱仪，色谱柱DAICEL CHIRALPAKAD-H 250mm´4.6mm´5μm，柱温30℃，流速1.5 ml/min，检测波长270nm，进样量5μL，流动相正己烷:甲醇:乙醇:二乙胺=90:5:5:0.2（V/V/V/V）。
实施例3重组烯还原酶突变体ERED-20反应测试
一、重组烯还原酶突变体ERED-20催化不同原料转化反应
以实施例1方法制备烯还原酶突变体ERED-20酶液、辅酶再生酶酶液，以3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁烯酸酯为底物，进行生物催化反应制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯。
酶反应体系（20ml）：烯还原酶突变体ERED-20酶液4.0 ml，pH 8.0的0.1M磷酸钾缓冲液13mL，5% NADP水溶液100μL，底物3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁烯酸酯0.4g，DMSO2mL，葡萄糖1.0g，葡萄糖脱氢酶液1.0ml。
反应条件：温度35℃、磁力搅拌速度150r/min，反应时间24h，反应过程控制pH8.0。反应结束后，取样进行HPLC检测转化率和ee％值。结果如表5所示。
二、野生型和突变体烯还原酶酶不同条件反应测试
突变体ERED-20，按前述方法制备烯还原酶野生型或突变体酶液、辅酶再生酶酶液，进行测试反应：
反应体系为20ml，其中原料0.4g、0.1M磷酸钾缓冲液、溶剂DMSO 2mL、5% NADP水溶液100μL，其他包括：
（1）以异丙醇脱氢酶/异丙醇为辅酶再生系统反应：烯还原酶酶液4mL、异丙醇脱氢酶酶液1mL、异丙醇1.0mL、缓冲液12.0mL；
（2）以葡萄糖脱氢酶/葡萄糖为辅酶再生系统反应：烯还原酶酶液4mL、葡萄糖脱氢酶酶液1mL、葡萄糖1g、缓冲液13mL；
（3）以甲酸脱氢酶/甲酸盐为辅酶再生系统反应：烯还原酶酶液4mL、甲酸脱氢酶酶液1mL、甲酸铵1g、缓冲液13mL。
反应条件：设定不同温度，磁力搅拌速度150r/min，反应24h，反应过程控制设定的pH。反应结束取样处理，样品HPLC分析转化率和产物I的ee％值，结果如表6所示。
实施例4 重组烯还原酶突变体ERED-20催化制备反应
以实施例1方法制备烯还原酶突变体ERED-20酶液、辅酶再生酶酶液，以3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁烯酸乙酯为底物，进行生物催化还原反应制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯（将突所示化合物I和II中的R1优选乙基；对应的R2为乙基），反应过程如图4
反应体系(500ml)：烯还原酶突变体ERED-20酶液100 ml，pH 8.0的0.1M磷酸钾缓冲液325 ml，底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁烯酸乙酯15g，DMSO 50 ml，葡萄糖30g，葡萄糖脱氢酶BsGDH酶液25 ml，5% NADP水溶液2.5ml。
反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应过程控制pH8.0，反应时间36h。反应结束后，取样进行HPLC检测，底物的转化率为95.47％，ee>99％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.烯还原酶突变体，其特征在于，为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第26位异亮氨酸突变为甘氨酸，第151位酪氨酸突变为天冬氨酸，第278位缬氨酸突变为丙氨酸和第286位缬氨酸突变为甲硫氨酸。
2.组合物，其特征在于，包括辅酶再生酶和权利要求1所述的烯还原酶突变体；
所述辅酶再生酶包括葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶中的任意一种；
所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
3.生物材料，其特征在于，包括如下A）~D）所示中的至少一种：
A）、编码权利要求1所述的烯还原酶突变体的核酸；
B）、含有A）所述核酸的重组载体；
C）、转化或转染如B）所述重组载体的宿主细胞；
D）、培养如C）所述的宿主细胞获得的混合物。
4.如下i）~iii）所示中的至少一种在将如式II所示的底物反应生成如式I所示的西他列汀中间体中的应用：
i）、权利要求1所述的烯还原酶突变体；
ii）、权利要求2所述的组合物；
iii）、权利要求3所述的生物材料；
式I和式II所示的结构如下：
式I；
式II;
其中，
R1选自甲基、乙基、或异丙基；
R2选自甲基、乙基、或异丙基；
R1与R2相同。
5.西他列汀中间体的制备方法，其特征在于，包括利用如下I）~III）所示中的至少一种将如式II所示的底物反应生成如式I所示的西他列汀中间体：
I）、权利要求1所述的烯还原酶突变体；
II）、权利要求2所述的组合物；
III）、权利要求3所述的生物材料；
式I和式II所示的结构如下：
式I；
式II;
R1与R2相同。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
在催化剂、辅酶再生酶、辅底物、辅酶存在的条件下，将如式II所示的底物反应生成如式I所示的西他列汀中间体；
所述催化剂为如权利要求1所述的烯还原酶突变体；
所述辅酶再生酶包括葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶中的任意一种；
所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
所述辅底物包括异丙醇、葡萄糖或甲酸铵；
所述辅酶为NADP。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
所述辅酶再生酶为异丙醇脱氢酶，则辅底物为异丙醇；
所述辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶，则辅底物为葡萄糖；
所述辅酶再生酶为甲酸脱氢酶，则辅底物为甲酸铵。
8.根据权利要求5~7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述底物、催化剂与辅酶再生酶的浓度比为（1~3）：4：（1~2）。
9.根据权利要求5~7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反应的条件为20℃~50℃、pH为6~10。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2009064476A1 (en) * 2007-11-13 2009-05-22 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Preparation of sitagliptin intermediate
CN115948354A (zh) * 2022-10-17 2023-04-11 浙江工业大学 一种烯还原酶突变体、编码基因、工程菌及应用
CN116410940A (zh) * 2021-12-31 2023-07-11 上海合全药业股份有限公司 一种使用烯还原酶及其突变体对潜手性碳碳双键的不对称还原方法

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