CN107446906A - 一种复合酶及其应用以及酶解几丁质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物酶领域，公开了一种复合酶及其应用以及酶解几丁质的方法。具体地，本发明提供了一种复合酶，其中，所述复合酶包含几丁质还原端外切酶、几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶中的至少两种。本发明还提供了上述复合酶在酶解几丁质中的应用。另外，本发明还提供了一种酶解几丁质的方法，其中，该方法包括：使用本发明提供的上述复合酶对几丁质原料进行酶解。按照本发明提供的酶解几丁质的方法，可以获得较高的几丁质转化率。另外，本发明提供的酶解几丁质方法具有条件温和、产物品质高及环境友好等特点。

Description

一种复合酶及其应用以及酶解几丁质的方法
技术领域
本发明涉及生物酶领域，具体地，涉及一种复合酶及其在酶解几丁质中的应用，并提供了一种酶解几丁质的方法。
背景技术
几丁寡糖是一类具有重要应用前景的功能寡糖，在医药及农业领域具有广泛的应用前景。在医药领域，几丁寡糖已经表现出的生物活性包括抑制肿瘤生长、治疗哮喘、增加骨强度及抗菌等方面。在农业领域，几丁寡糖已被证明可以作为植物免疫激活剂。
目前，生产几丁寡糖的方法主要有化学法和生物法等，其中，生物法主要为酶水解法，即使用酶水解含几丁质的原料以生产几丁寡糖，该法由于具有条件温和、产物品质高及环境友好等特点，近年来受到了广泛的关注。但是，现有的酶水解法主要是利用细菌或真菌发酵产生的天然酶，存在酶含量低、降解效率低及不同类型几丁质降解酶配比不当等问题。因此，急需寻求水解效率高的几丁质酶。
发明内容
本发明的目的是为了克服采用几丁质酶对几丁质进行酶解的过程中所具有的上述缺陷，提供了一种复合酶及其在酶解几丁质中的应用以及酶解几丁质的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种复合酶，其中，所述复合酶包含几丁质还原端外切酶、几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶中的至少两种。
本发明还提供了上述复合酶在酶解几丁质中的应用。
本发明还提供了一种酶解几丁质的方法，其中，该方法包括：使用上述复合酶对几丁质原料进行酶解。
本发明的发明人在研究过程中创造性的发现几丁质还原端外切酶、几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶中的至少两种在酶解几丁质过程中具有协同作用，并且，进一步发现上述三种酶中的至少两种以特定的比例进行配比可以获得较高的几丁质转化率，并且，本发明提供的酶解几丁质的方法具有条件温和、产物品质高及环境友好等特点，因此，该方法具有工业应用前景。此外，在本发明的一种优选的实施方式中，将SmChiA、SmChiB和SmChiC中的至少两种以特定的比例对几丁质原料进行酶解，获得的几丁质转化率高达22％以上。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的一种优选的实施方式中几丁质酶SmChiA、SmChiB和SmChiC的SDS-PAGE检测的结果图；
图2是本发明测试实施例1和2中不同几丁质原料经酶解后产生还原糖的量的示意图；
图3是本发明测试实施例4中几丁质酶SmChiA、SmChiB和SmChiC三者之间的不同摩尔配比的等值线模式图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种复合酶，其中，所述复合酶可以包含几丁质还原端外切酶、几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶中的至少两种。
在本发明中，所述几丁质内切酶可以从几丁质链的中间随机内切产生二糖；所述几丁质外切非还原酶可以从几丁质链的非还原端起始降解，释放二糖；所述几丁质外切还原酶可以从几丁质链的还原端起始降解，释放二糖。
根据本发明，所述复合酶可以包含几丁质还原端外切酶、几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶；优选地，所述几丁质还原端外切酶、几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶之间的摩尔比可以为1-10：1-5：1-10，更优选为1-5：1-3：1-5；进一步优选为1-3：1-3：1-3；最优选为3：1：1、1：3：1、1：1：3、2：2：1、1：2：2或2：1：2。
根据本发明，所述复合酶可以包含几丁质还原端外切酶和几丁质非还原端外切酶；优选地，所述几丁质还原端外切酶与所述几丁质非还原端外切酶的摩尔比为1-6：1-6，更优选为1-4：1-4，，最优选为4：1、1：4、3：2或2：3。
根据本发明，所述复合酶可以包含几丁质还原端外切酶和几丁质内切酶；优选地，所述几丁质还原端外切酶与所述几丁质内切酶的摩尔比为1-6：1-6，更优选为1-4：1-4，最优选为4：1、1：4、3：2或2：3。
根据本发明，所述复合酶可以包含几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶；优选地，所述几丁质非还原端外切酶与所述几丁质内切酶的摩尔比为1-6：1-6，更优选为1-4：1-4，最优选为4：1、1：4、3：2或2：3。
在本发明中，本发明对所述几丁质还原端外切酶、几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶的来源没有特别的限定，可以通过本领域常规使用的手段获得，例如，可以通过商购或者基因工程的手段获得。
在优选的情况下，所述几丁质还原端外切酶、几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶的纯度为90％以上，优选为95％以上。
在本发明中，本发明对所述复合酶的形态没有特别的限定，只要所述复合酶具有一定的酶活性即可，在优选的情况下，所述复合酶为固态的或液态的。
在本发明中，所述复合酶还可以包含添加剂，本发明对所述添加剂没有特别的限定，只要该添加剂可以提高所述复合酶的酶活力即可。
根据本发明，所述几丁质还原端外切酶可以为本领域的常规选择，在优选的情况，所述几丁质还原端外切酶为SmChiA(Serratia marcescens chitinase A)。
根据本发明，所述几丁质非还原端外切酶可以为本领域的常规选择，在优选的情况，所述几丁质非还原端外切酶为SmChiB(Serratia marcescens chitinase B)。
根据本发明，所述几丁质内切酶可以为本领域的常规选择，在优选的情况，所述几丁质内切酶为SmChiC(Serratia marcescens chitinase C)。
在本发明中，所述SmChiA、SmChiB和SmChiC均属于粘质沙雷氏菌的几丁质酶。本发明对所述SmChiA、SmChiB和SmChiC的来源没有特别的限定，可以通过本领域常规使用的手段获得，例如，可以通过商购或者基因工程的手段获得。在优选的情况下，所述SmChiA、SmChiB和SmChiC可以通过基因工程的手段获得。
本发明还提供了上述复合酶在酶解几丁质中的应用。
本发明还提供了一种酶解几丁质的方法，其中，该方法包括：使用上述复合酶对几丁质原料进行酶解。
根据本发明，对所述酶解的条件没有特别的限定，可以为本领域常规的选择。在优选的情况下，所述酶解的条件包括：酶解温度为37-42℃，酶解时间为10-48小时，pH值为6-8。
根据本发明，所述几丁质原料可以为纯的几丁质，也可以为含有几丁质的物料。优选地，所述几丁质原料中几丁质的含量为8.8-22.4重量％。本发明对所述几丁质原料的来源没有特别的限定，可以为本领域的常规选择。在优选的情况下，所述几丁质原料来源于真菌和/或动物外壳，更优选为真菌，进一步优选为丝状真菌(如曲霉属真菌)，最优选为黑曲霉。
在本发明中，所述方法还可以包括：在酶解前，对几丁质原料进行预处理。预处理的过程可以为本领域常规使用的获得几丁质原料的过程。在优选的情况下，当所述几丁质原料为真菌时，所述预处理可以包括以下步骤：
1)灭菌及固液分离，以获得菌体；
2)将由步骤1)获得的菌体烘干和研磨。
在步骤1)中，所述灭菌可以使用本领域常规使用的灭菌方法，优选地，所述灭菌可以使用干热灭菌法、湿热灭菌法和放射灭菌中的至少一种，更优选为湿热灭菌法。
在步骤1)中，本发明对所述固液分离没有特别的限定，只要能够将菌体从培养基中分离出即可，在优选的情况下，所述固液分离可以使用过滤法、离心法和沉淀中的至少一种，更优选为使用过滤法。
在步骤2)中，所述烘干的条件可以包括：烘干温度为60-90℃，优选为65-70℃；烘干的时间为24-72小时，优选为24-48小时。
在步骤2)中，对于所述研磨的方式无特殊要求，可以采用本领域常用的各种方法，优选地，采用液氮研磨方法。对于研磨的程度，只要研磨产物调浆后适于酶解即可。
根据本发明的优选实施方式，所述方法还包括：在酶解前，降解几丁质原料中的蛋白质。其中，可以采用本领域常规使用的手段降解几丁质原料中的蛋白质。在优选的情况下，使用蛋白酶降解几丁质原料中的蛋白质。本发明对所述蛋白酶的来源没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，例如，通过商购获得。在优选的情况下，所述蛋白酶为Alcalase2.4LFG(购于诺维信公司)。
在本发明中，使用蛋白酶降解几丁质原料中的蛋白质的条件可以包括：pH值为7.5-8.5，温度为50-70℃，时间为10-20小时。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，“mM”表示mmol/L；“μM”表示“μmol/L”；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自Takara公司；灭菌的条件为121℃下高压灭菌20min。
制备例1
1)SmChiA酶的制备
SmChiA(Genbank登录号Z36294.1氨基酸残基24-563aa，碱基70-1689bp)的基因序列是以粘质沙雷氏菌的基因组DNA为模板，通过PCR的方法获得，引物为SmChiA-F1(SEQ IDNO：1)和SmChiA-R1(SEQ ID NO：2)，如表1所示。将获得的基因连接至pMD18-T载体，并测序以确定序列的正确性。之后，将基因连接至pET28(a)，酶切位点为EcoRI和NotI，获得质粒pET28(a)-SmChiA。然后，以质粒pET28(a)-SmChiA模板，PCR扩增，将SmChiA目的基因连接至pET22b，引物为SmChiA-F2(SEQ ID NO：3)和SmChiA-R2(SEQ ID NO：4)，如表1所示，酶切位点为NcoI(CCATGG)和XhoI(CTCGAG)。
重组表达质粒pET22b–SmChiA热击法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。表达菌在37℃生长至OD600为1.8时，添加0.5mM IPTG。随后，细胞在16℃诱导表达20h。在4℃条件下，8000rpm离心5min收集菌体，并重悬在Buffer A(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，pH7.4)中。采用高压匀质机破碎菌体，压力为800bar。在4℃条件下，10000rpm离心10min，去除未破碎的菌体以及包涵体，0.22μm滤器过滤上清。采用金属螯合层析分离纯化蛋白，蛋白在Buffer E(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，50mM咪唑，pH 7.4)下洗脱杂质蛋白，蛋白在Buffer F(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，150mM咪唑，pH 7.4)下洗脱并收集。以考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，使用SDS-PAGE检验目标蛋白的纯度。
结果表明，得到的SmChiA酶的浓度为1.7mg/mL(即，29.8μM)，SmChiA酶的产量约为13mg/L，具有较高的纯度，如图1所示。
2)SmChiB酶的制备
SmChiB(Genbank登录号Z36295.1氨基酸残基2-499aa，碱基4-1497bp)的基因序列是以粘质沙雷氏菌的基因组DNA为模板，通过PCR的方法获得，引物为SmChiB-F(SEQ ID NO：5)和SmChiB-R(SEQ ID NO：6)，如表1所示。将获得的基因连接至pMD18-T载体，并测序以确定序列的正确性。之后，将基因连接至pET28(a)，酶切位点为EcoRI和NotI。
pET28(a)-SmChiB通过热击法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。表达菌在37℃生长至OD600为1.8时，添加0.05mM IPTG。随后，细胞在16℃诱导表达20h。在4℃条件下，8000rpm离心5min收集菌体，并重悬在Buffer A(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，pH 7.4)中。采用高压匀质机破碎菌体，压力为800bar。在4℃条件下，10000rpm离心10min，去除未破碎的菌体以及包涵体，0.22μm滤器过滤上清。采用金属螯合层析分离纯化蛋白，在Buffer C(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，150mM咪唑，pH 7.4)下洗脱杂蛋白，Buffer D(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，300mM咪唑，pH 7.4)下洗脱目的蛋白并收集。以考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，使用SDS-PAGE检验目标蛋白的纯度。
结果表明，得到的SmChiB酶的浓度为2.5mg/mL(即，48μM)，SmChiB酶的产量约为30mg/L，具有较高的纯度，如图1所示。
3)SmChiC酶的制备
SmChiC(Genbank登录号AJ630582.1，氨基酸残基1–480aa，碱基222–1664bp)的基因序列是以粘质沙雷氏菌的基因组DNA为模板，通过PCR的方法获得，引物为SmChiC-F1(SEQID NO：7)和SmChiC-R1(SEQ ID NO：8)，如表1所示。将获得的基因连接至pMD18-T载体，并测序以确定序列的正确性。之后，将基因连接至pET28(a)，酶切位点为EcoRI和NotI。以pET28(a)-SmChiC质粒为模板，SmChiC-F2(SEQ ID NO：9)和SmChiC-R2(SEQ ID NO：10)为引物(见表1)，PCR扩增，将SmChiC目的基因连接至pET22(b)。
重组表达质粒pET22(b)-SmChiC热击法转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞。表达菌于含有50μg/mL Ampicillin的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至值OD600值至0.7，加入0.5mmol/L的IPTG，37℃，200rpm，诱导表达约5h。在4℃，8000rpm离心10min收集菌体。缓冲液A(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，pH 7.4)重悬菌体，高压匀浆机1000bar破碎细胞。在4℃，12000rpm离心5min，以除去细胞碎片。对离心后的样品用0.45μm孔径的滤器过滤。采用HisTrap HP亲和层析柱(5mL)进一步纯化。该层析柱首先用Buffer A预平衡5个柱体积，之后将样品上柱。上样完毕，待基线水平后，用Buffer B(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，50mM咪唑，pH 7.4)清洗20个柱体积，以去除非特异性结合的杂蛋白。最终，目标蛋白在Buffer C(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，150mM咪唑，pH7.4)中洗脱并收集。以考马斯亮蓝法测蛋白浓度，用SDS-PAGE检验目标蛋白的纯度。
结果表明，得到的SmChiC酶的浓度为0.7mg/mL(即，14.5μM)，SmChiC酶的产量约为7mg/L，具有较高的纯度，如图1所示。
表1
制备例2
几丁质原料的制备
在30℃，将黑曲霉以马铃薯培养基平板活化过夜，转接至马铃薯液体培养基培养5天，灭菌，以200目筛子过滤收集菌体，水洗，70℃烘箱中烘干24小时，液氮研磨成粉状，溶于100mM磷酸钾缓冲液(pH 8)，加入购于诺维信公司的Alcalase2.4LFG(酶：原料＝2g：50g)，在60℃反应约14小时，离心，弃上清，水洗至中性，烘干研磨保存，以获得几丁质原料a。
制备例3
几丁质原料的制备
在30℃，将黑曲霉以马铃薯培养基平板活化过夜，转接至马铃薯液体培养基培养5天，灭菌，以200目筛子过滤收集菌体，水洗，70℃烘箱中烘干24小时，液氮研磨成粉状，以获得几丁质原料b。
测试实施例1
1)标准曲线的制作
以几丁二糖标准品，将标准品配制成不同浓度(分别为0mM、0.5mM、1mM、1.5mM和2mM)的样品，取60μL样品加180μL铁氰化钾溶液(2g/L)，沸水浴15min，取200μL测吸光度值A405，制作还原糖标准曲线。
2)酶解实验
使用磷酸盐缓冲液(pH 6，20mM磷酸二氢钠)将几丁质原料a定量至终浓度5mg/mL，加入SmChiA、SmChiB和SmChiC(各单酶的摩尔浓度为0.4μM)，总反应体系为200μL，于2mL离心管中，在40℃恒温水浴锅中静置反应24h，12000rpm离心取60μL上清，加180μL铁氰化钾溶液(2g/L)，沸水浴15min，取200μL测吸光度值A405。据还原糖标准曲线，得知水解产物中还原糖的含量。将酶液沸水浴5min后(使酶失活)，加入几丁质原料a及缓冲液中，作为阴性对照。每组反应设置2组平行重复。结果如图2所示。
测试实施例2
根据测试实施例1的方法进行酶解实验，其中，所不同的是使用几丁质原料b代替几丁质原料a。结果如图2所示。
测试实施例3
协同实验
使用磷酸盐缓冲液(pH 6，20mM磷酸二氢钠)将几丁质原料a定量至终浓度5mg/mL，分别加入SmChiA、SmChiB、SmChiC、SmChiA+SmChiB、SmChiA+SmChiC、SmChiB+SmChiC和SmChiA+SmChiB+SmChiC，其中，各单酶的摩尔浓度为0.4μM，总反应体系为200μL，于2mL离心管中，在40℃恒温水浴锅中静置反应24h，12000rpm离心取60μL上清，加180μL铁氰化钾溶液(2g/L)，沸水浴15min，取200μL测吸光度值A405。据还原糖标准曲线，得知水解产物中还原糖的含量。将酶液沸水浴5min后(使酶失活)，加入黑曲霉底物及缓冲液中，作为阴性对照。每组反应设置2组平行重复。结果如表2所示：
表2
测试实施例4
比例实验
使用磷酸盐缓冲液(pH 6，20mM磷酸二氢钠)将几丁质原料a定量至终浓度10mg/mL，加入1μM的反应酶液(以20摩尔％含量作为梯度，分别设置各单酶不同摩尔配比的反应酶液)。每组反应总体系为200μL，于2mL离心管中，在40℃恒温水浴锅中静置反应24h，12000rpm离心取60μL上清，加180μL铁氰化钾溶液，沸水浴15min，取200μL测吸光度值A405。据还原糖标准曲线，得知水解产物中还原糖的含量以及几丁质转化率(＝还原糖的摩尔量×180/(几丁质原料的重量×15重量％)，下同)。将酶液沸水浴5min后(使酶失活)，加入几丁质原料a及缓冲液中，作为阴性对照。每组反应设置2组平行重复。21组还原糖含量结果，用Minitab 17进行混料分析，得到混料等值线图，如图3所示。其中，具体的不同酶之间的不同摩尔配比的结果如表3所示。
测试对比例1
按照测试实施例4所述的方法进行检测，其中，所不同的是加入的反应酶液仅含有SmChiA。结果如表3所示。
测试对比例2
按照测试实施例4所述的方法进行检测，其中，所不同的是加入的反应酶液仅含有SmChiB。结果如表3所示。
测试对比例3
按照测试实施例4所述的方法进行检测，其中，所不同的是加入的反应酶液仅含有SmChiC。结果如表3所示。
表3
测试实施例5
(1)按照测试实施例3所述的方法进行检测，其中，所不同的是以SmChiA，SmChiB，SmChiC三者(A：B：C＝1：1：1，摩尔比)降解几丁质原料a，离心取上清，进行MADI-TOF质谱进行产物分析：1μL样品与2,5-二羟基甲酸(溶于乙腈：水＝80：20的溶液中，80：20为体积比，2,5-二羟基甲酸终浓度为20mg/mL)等体积添加，之后加入0.1μL 0.1摩尔％的三氟乙酸，混合物置于MALDI micro MX的板上干燥。检测模式采用正离子反射式。以(GlcNAc)n(n＝1-6)为质谱的标准品。质谱结果表明，酶解产物为几丁二糖(GlcNAc)2。
(2)按照步骤(1)相同的方式对测试实施例4(表2)中的SmChiA、SmChiB、SmChiC三者酶液组合降解几丁质原料a后的产物进行MADI-TOF质谱分析，结果表明，酶解产物均为几丁二糖(GlcNAc)2。
通过将测试实施例1与测试实施例2的结果相对比可知，当几丁质原料来源于黑曲霉时，黑曲霉菌体经蛋白酶处理后得到的几丁质原料更利于几丁质的酶解，这可能是由于蛋白酶使黑曲霉细胞壁中的蛋白发生了降解，使得几丁质更好的暴露，从而有利于随后的几丁质酶的酶解。
通过将测试实施例3-4和测试对比例1-3的结果相对比可知，几丁质酶SmChiA、SmChiB和SmChiC三者之间明显具有协同作用，并且，按照本发明提供的酶解几丁质的方法，可以获得较高的几丁质转化率。另外，本发明提供的酶解几丁质方法具有条件温和、产物品质高及环境友好等特点。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种复合酶，其特征在于，所述复合酶包含几丁质还原端外切酶、几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶中的至少两种。
2.根据权利要求1所述的复合酶，其中，所述复合酶包含几丁质还原端外切酶、几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶；优选地，所述几丁质还原端外切酶、几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶之间的摩尔比为1-10：1-5：1-10，更优选为1-5：1-3：1-5。
3.根据权利要求1所述的复合酶，其中，所述复合酶包含几丁质还原端外切酶和几丁质非还原端外切酶；优选地，所述几丁质还原端外切酶与所述几丁质非还原端外切酶的摩尔比为1-6：1-6，更优选为1-4：1-4。
4.根据权利要求1所述的复合酶，其中，所述复合酶包含几丁质还原端外切酶和几丁质内切酶；优选地，所述几丁质还原端外切酶与所述几丁质内切酶的摩尔比为1-6：1-6，更优选为1-4：1-4。
5.根据权利要求1所述的复合酶，其中，所述复合酶包含几丁质非还原端外切酶和几丁质内切酶；优选地，所述几丁质非还原端外切酶与所述几丁质内切酶的摩尔比为1-6：1-6，更优选为1-4：1-4。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的复合酶，其中，所述几丁质还原端外切酶为SmChiA；
和/或，所述几丁质非还原端外切酶为SmChiB；
和/或，所述几丁质内切酶为SmChiC。
7.权利要求1-6中任意一项所述的复合酶在酶解几丁质中的应用。
8.一种酶解几丁质的方法，其特征在于，该方法包括：使用权利要求1-6中任意一项所述的复合酶对几丁质原料进行酶解。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述酶解的条件包括：酶解温度为37-42℃，酶解时间为10-48小时，pH值为6-8；
优选地，所述几丁质原料来源于真菌和/或动物外壳，更优选为真菌，最优选为黑曲霉。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述方法还包括：在酶解前，降解几丁质原料中的蛋白质；优选地，使用蛋白酶降解几丁质原料中的蛋白质。
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