JP2007502108A - セファロスポリンcアシラーゼ変異体及び前記変異体を使用する7−acaの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Val121αがアラニンで置換されているか;
Gly139αがセリンで置換されているか;
Phe169αがチロシンで置換されているか;
Met31βがロイシンで置換されているか;
Phe58βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されているか;
His70βがセリン又はロイシンで置換されているか;
Ile75βがスレオニンで置換されているか;
Ile176βかバリンで置換されているか;または
Ser471βがシステインで置換されているものが好ましい。
<1−1>構造情報に基づくCPCアシラーゼ変異体の作製
<1−1−1>構造情報に基づく変異対象AcyIIアミノ酸残基の選択
CAD−GL−7−ACA複合体の三次構造が最近決定された(Kimら,Chem.Biol.8:1253−1264,2001;Kimら,J.Biol.Chem.276:48376−48381、2001)。図3に示すように、CADの基質結合部位に存在するArg57β、Tyr33β、Tyr149α及びArg155αはGL−7−ACAと直接水素結合を形成し、Phe177β、Leu24β及びVal70βは疎水性相互作用によりGL−7−ACAと結合する。更に、Gln50βはGL−7−ACAと直接相互作用しないが、Arg57β及びTyr149αと水素結合を形成し、これらの残基を触媒反応に適した位置に配置する。一方、CADとGL−7−ACAの結合において、アセトキシ基と6員環と4員βラクタム環を含むGL−7−ACAのβラクタムコアは活性部位残基との結合に有意な影響を与えない。逆に、GL−7−ACA側鎖としてのグルタル酸領域はArg57β、Tyr33β、Tyr149α及びPhe177βと正確に結合することにより基質結合に最大影響を及ぼす(図2及び3)。更に、Leu24βとVal70βは基質を適切な位置まで占有させることによりSer1βの触媒反応の刺激に役割を果たすと推定されている。
以下のように配列番号1のacyII構造遺伝子DNAフラグメントをpBC KS(+)ベクター(Stratagene,米国)のXhoI/XbaI部位に挿入することによりpBCPCプラスミドを構築した。まず、DNA合成器を使用することにより、シュードモナスsp.SE83に由来するCPCアシラーゼ遺伝子(acyII)のDNAヌクレオチド配列と前記配列によりコードされる蛋白質AcyIIのアミノ酸配列(GenBankアクセション番号M18278)に基づいてacyII構造遺伝子を合成した。この場合、acyII遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は文献に公開されている配列と同一としたが、そのヌクレオチド配列はacyII遺伝子が大腸菌に1個以上の好ましいコドンを含むように多少改変して合成した。
CPCに対する反応性の改善されたCPCアシラーゼ変異体を開発するために、以下のようにMet31β/Phe58β二重変異体を作製した。CAD−CPC複合体の三次構造モデリングに示すように、CPC側鎖はGL−7−ACA側鎖に比較して付加的に炭素骨格とD−アミノ基を含むので、CADはCPCと結合するためにGL−7−ACAよりも大きなスペースを必要とする。CPCとの結合に十分なスペースを確保するために、AcyIIの基質結合部位の内側の2個の残基を同時に変異させた。CPC側鎖の結合に最も重要な残基としてCADのArg57βに対応するAcyIIのHis57βを保存し、CPC側鎖の末端のカルボキシル基とD−アミノ基にぶつかると考えられるAcyIIのとMet31βをロイシンで置換した。同時に、AcyIIのHis57β側鎖にねじれ角の変化を誘導することによりCPC側鎖の結合スペースを更に確保するために、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、システイン又はアスパラギン等の比較的小さい側鎖をもつ別のアミノ酸残基でAcyIIのPhe58βを置換した。その結果、オーバーラップPCRによりM31βL/F58βM、M31βL/F58βC、M31βL/F58βL、M31βL/F58βA、M31βL/F58βV及びM31βL/F58βN二重変異体が作製された(Hoら,Gene 15:51−59,1989)。これらの二重変異体の作製方法を以下に詳述する。
6種の二重変異体のうちで最高の特異活性増加を示すM31βL/F58βMの特異活性を更に高めるために、活性部位S1βの触媒反応を刺激するCADのVal70βに対応するAcyIIのHis70βをセリン又はロイシンで置換し、三重変異体を作製した。
2種の三重変異体のうちで最高の特異活性増加を示すM31βL/F58βM/H70βSの特異活性を更に高めるために、活性部位S1βの効率的触媒反応に適した位置にCPCを配置するのを助長するCADのTyr149αに対応するAcyIIのPhe169αをチロシンで置換し、四重変異体F169αY/M31βL/F58βM/H70βSを作製した。チロシン側鎖はフェニルアラニン側鎖に比較して付加的にヒドロキシル(−OH)基をもつので、CPC側鎖及び/又はその隣接残基と水素結合を形成することによりS1βの触媒反応を刺激することができる。
CPCに対するF169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重変異体特異活性の特異活性を更に高めるために、CPC側鎖の結合の妨害に関与していると思われるCADのPhe177βに対応するAcyIIのIle176βをバリンで置換し、五重変異体F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/Ile176βVを作製した。実施例<1−1−3>では、AcyIIのPhe58βをメチオニンで置換した。一方、AcyIIのIle176βはAcyIIのPhe58βに非常に近接して位置しており、CPC結合を妨害すると予想される。そこで、CPC基質側鎖の結合をより効率的にするために、イソロイシンと同様の構造でサイズが小さい側鎖をもつバリンでIle176βを置換した。
<1−2−1>Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β四重変異体の作製
7−ACAの大規模1段階酵素的製造方法に既存CPCアシラーゼを適用することは困難であるが、これは、7−ACAによる最終産物阻害とCPCに対するCPCアシラーゼの特異活性が低いことからCPCから7−ACAへの変換効率が非常に低いためである。一方、実施例<1−1>においてCPCアシラーゼ変異体の特異活性を増加させる一連の部位特異的変異誘発から明らかなように、His70βの変異はCPCに対するCPCアシラーゼ変異体の特異活性を有意に増加するが、7−ACAによる最終産物阻害レベルも著しく増加する。そこで、実施例<1−1−6>のF169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重変異体をH70βSの復帰変異誘発により野生型残基ヒスチジンに変異させ、F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重変異体を作製した(図5)。F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重変異体を鋳型とし、H70β−Fプライマー(配列番号34)とH70β−Rプライマー(配列番号35)を使用した以外は実施例<1−1−4>に記載したと同一方法に従い、F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重変異体を作製した。
CPCに対するF169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重変異体の反応性を更に高めるために、四重変異体DNAにエラープローンPCRを実施し、ランダム部位に点変異をもつ変異体ライブラリーを構築した。この場合、平均して四重変異体遺伝子1個当たりアミノ酸残基1個に置換が生じるように前記エラープローンPCRのエラー率を調節した。変異体ライブラリーの具体的な構築手順は以下の通りとした。
V121αA又はG139αS変異をF169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重変異体に組込むと、CPCに対するCPCアシラーゼ変異体の反応性が増加することが実施例<1−2−2>の結果から確認された。そこで、CPCに対する反応性を更に高めるために、#120変異体のG139αS変異を#213変異体に組込むことにより、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重変異体を作製した(図5)。本発明の六重変異体は#213変異体DNAを鋳型とし、G139αS−Fプライマー(配列番号36)とG139αS−Rプライマー(配列番号37)をPCRに使用した以外は、実施例<1−1−4>に記載したと同一方法に従って作製した。本発明では、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重変異体をコードするCPCアシラーゼ変異体遺伝子をTnS5と命名した。
V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重変異体をコードするTnS5遺伝子は、宿主細胞でαサブユニットとβサブユニットを別々に発現し、これらの2個のサブユニットの自然接触によりCPCアシラーゼの活性形を生成するように設計されたCPCアシラーゼ変異体遺伝子(例えばsem遺伝子)である。
<1−4−1>Val121α/Gly139α/Phe169α/Phe58β/Ile176β五重変異体の作製
本発明では、実施例<1−1>〜<1−3>で一連の部位特異的変異誘発とランダム変異誘発により、CPCに対する反応性の改善されたV121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重変異体をコードするCPCアシラーゼ変異体遺伝子TnS5及びTnS5αβを作製した。TnS5αβ六重変異体を作製するためのこれらの変異誘発操作では、CPC側鎖の末端のカルボキシル基とD−アミノ基にぶつかると予想されるMet31βをロイシンで置換し、Phe58βをメチオニン、システイン又はアスパラギンで同時に置換し、His57β側鎖のねじれ角を変化させることによりCPC側鎖の効率的結合に十分なスペースを確保した。即ち、本発明はCPCに対する反応性を更に高めるために、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重変異体のMet31β及びPhe58β残基を次のように最適化した。
本発明では実施例<1−1−5>でCPCに対するCPCアシラーゼ変異体の特異反応性を更に高めるためにM31βL/F58βM/H70βS三重変異体のPhe169αをチロシンで置換した。一方、実施例<1−2−1>では7−ACAによる最終産物阻害を低減するためにF169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重変異体のH70βS残基をヒスチジンに復帰変異誘発し、実施例<1−4−1>ではV121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重変異体のM31βL残基を野生型残基メチオニンに復帰変異誘発した。更に、V121αA/G139αS/F169αY/F58βM/I176βV五重変異体のF58βM変異残基及びI176β残基を夫々アスパラギンとバリンで置換した。こうして、F169αY変異残基を野生型残基フェニルアラニンに復帰変異誘発することによりV121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重変異体(F169)を作製した(図5)。
CPCに対するV121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重変異体の反応性を更に高めるために、V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重変異体をエラープローンPCRにかけ、ランダム変異体ライブラリーを構築した。上記のように構築したランダム変異体ライブラリーからV121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重変異体よりもCPCに対する反応性が更に増加した変異体をスクリーニングした。この場合の、エラープローンPCRの反応条件、前記変異体ライブラリーの作製方法及び変異体のスクリーニング方法は、CPCに対する反応性が更に増加した変異体を変異体ライブラリーからスクリーニングする際に5mM 7−ACA(終濃度)を反応混合物に添加した以外は実施例<1−2−2>に記載したものと同一とした。
CPCに対する反応性はV121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重変異体にIle75βT又はS471βC変異を導入することにより増加することが上記から確認された。そこで、CPCに対する反応性を更に高めるために、本発明では#59変異体のIle75βT変異を#76変異体に導入することによりV121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重変異体を作製した(図5)。本発明の六重変異体は、#76変異体DNAを鋳型とし、I75βT−Fプライマー(配列番号43)とI75βT−Rプライマー(配列番号44)をPCR増幅に使用した以外は、実施例<1−1−4>に記載したと同一の方法により作製した。本発明ではV121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重変異体をコードするCPCアシラーゼ変異体遺伝子をS12と命名した。
<2−1>CPCに対する特異活性の増加したCPCアシラーゼ変異体の精製
クロラムフェニコール25μg/mlを加えたテリフィックブロス(1.2%Bacto−Trypton,2.4%Yeast Extract,0.4%グリセロール,0.17M KH2PO4,0.72M K2HPO4)1リットル中で野生型又は本発明のCPCアシラーゼ変異体遺伝子を導入した組換えプラスミドを含む大腸菌MC1061形質転換細胞を30℃で16時間培養し、前培養液を得た。前培養液10mlを同一培地に接種した後、25℃、200rpmで48時間激しく振盪しながら培養した。培養液を4℃、8,000rpmで10分間遠心して沈殿を分離し、沈殿を20mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)で2回洗浄した。沈殿を同一緩衝液100mlに懸濁した。この懸濁液を4℃で20分間超音波処理し、細胞壁を破壊し、4℃、15,000rpmで20分間遠心して不溶性材料と細胞破片を除去し、以下に粗酵素溶液として使用する上清を得た。
実施例<2−1>に記載したと同一方法に従い、実施例<1−1−2>で作製したpBCPC又はpBSEMプラスミドを含む大腸菌形質転換細胞から野生型CPCアシラーゼを精製した。pBCPCプラスミドに由来する野生型CPCアシラーゼ(AcyII)とpBSEMプラスミドに由来する野生型CPCアシラーゼ(Sem)の物性と反応特徴を分析した結果、同一の物性(例えば分子量)と反応特徴(例えば特異活性、最適温度、最適pH)を示した。
実施例<2−1>に記載したと同一方法に従い、M31βL/F58βM二重変異体、M31βL/F58βM/H70βS三重変異体、F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重変異体及びF169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重変異体をコードする各CPCアシラーゼ変異体遺伝子を含むプラスミドで形質転換した組換え大腸菌から各CPCアシラーゼ変異体を精製した。
実施例<2−1>に記載したと同一方法に従い、実施例<1−3>のV121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重変異体をコードするCPCアシラーゼ変異体遺伝子(TnS5αβ)又は実施例<1−4−4>のV121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重変異体をコードするCPCアシラーゼ変異体遺伝子(S12)を含むプラスミドで形質転換した組換え大腸菌から各六重CPCアシラーゼ変異体を精製した。
<3−1>pBC KS(+)ベクターを使用したCPCアシラーゼ変異体の生産
V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重CPCアシラーゼ変異体をコードする遺伝子TnS及びTnS5αβと、V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重CPCアシラーゼ変異体をコードする遺伝子S12をpBC KS(+)ベクターに挿入し、夫々pBC−TnS5、pBC−TnS5αβ及びpBC−S12組換えプラスミドを得、得られた各組換えプラスミドで大腸菌MC1061を形質転換した。
<3−2−1>pET29−TnS5αβ及びpET29−S12プラスミドの作製
pET29−Fプライマー(配列番号40)とpET29−Rプライマー(配列番号41)を夫々使用して組換えプラスミドpBC−TnS5αβ及びpBC−S12をPCR増幅し、各々2.5kbのPCR産物を得た。PCR増幅後、PCR産物をXbaI/XhoIで消化し、精製キット(QIAEX II Gel Extraction Kit;Qiagen,ドイツ)で精製し、インサートDNAを得た。更に、pET29−a(+)ベクターDNA(Novagen,米国)をXbaI/XhoIで消化し、CIPで脱リン酸化し、ベクターDNAを得た。T4DNAリガーゼ(Roche,ドイツ)を使用してインサートDNAをベクターDNAに16℃で16時間連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌MC1061株に形質転換した。カナマイシン20μg/mlを加えたLB寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、30℃インキュベーターで一晩培養し、変異体遺伝子を含む形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートDNAのヌクレオチド配列を分析し、pET29−TnS5αβ及びpET29−S12プラスミドを得た。
pET29−TnS5αβ及びpET29−S12プラスミドの各々をエレクトロポレーションにより大腸菌BL21(DE3)に形質転換し、夫々pET29−TnS5αβ及びpET29−S12プラスミドを含む組換え大腸菌を作製し、各組換え大腸菌における六重CPCアシラーゼ変異体の生産性を測定した。これらの組換えプラスミドにおけるTnS5αβ及びS12CPCアシラーゼ変異体遺伝子はpET29−a(+)ベクター上に存在するLacIオペレーターの制御下のT7プロモーターの作用により転写された。
カナマイシン20μg/mlとラクトース2%を加えたLBブロス5ml中で実施例<3−2>のpET29−TnS5αβ及びpET29−S12プラスミド各1個を含む大腸菌BL21(DE3)形質転換細胞を25℃、200rpmで72時間激しく振盪しながら培養した。更に、クロラムフェニコール25μg/mlを加えたLBブロス10リットル中で野生型CPCアシラーゼ遺伝子を含む大腸菌MC1061(pBCPC)も25℃、200rpmで48時間激しく振盪しながら培養した。その後、野生型CPCアシラーゼ、TnS5αβ及びS12CPCアシラーゼ変異体を夫々実施例<2−1>に記載したと同一方法に従って各培養ブロスから精製した。上記のようにして得られた精製蛋白質を50mM燐酸緩衝液(pH8.5)で透析し、透析により得られた透析物をCPC変換反応に使用した。
Claims (30)
- 配列番号4のCPCアシラーゼαサブユニットのVal121α、Gly139α及びPhe169αならびに配列番号5のCPCアシラーゼβサブユニットのMet31β、Phe58β、His70β、Ile75β、Ile176β及びSer471βから構成される群から選択される少なくとも1個のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されていることを特徴とするCPCアシラーゼ変異体又はその機能的に等価な誘導体。
- Val121αがアラニンで置換されているか;
Gly139αがセリンで置換されているか;
Phe169αがチロシンで置換されているか;
Met31βがロイシンで置換されているか;
Phe58βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されているか;
His70βがセリン又はロイシンで置換されているか;
Ile75βがスレオニンで置換されているか;
Ile176βかバリンで置換されているか;または
Ser471βがシステインで置換されている、請求項1に記載のCPCアシラーゼ変異体。 - Met31βがロイシンで置換されており、Phe58βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されている、請求項2に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- His70βが更にセリン又はロイシンで置換されている、請求項3に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- Phe169αが更にチロシンで置換されている、請求項4に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- Ile176βが更にバリンで置換されている、請求項5に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- Phe169αが更にチロシンで置換されており、Ile176βが更にバリンで置換されている、請求項3に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- Val121αが更にアラニンで置換されている、請求項7に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- Gly139αが更にセリンで置換されている、請求項7に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- Val121αが更にアラニンで置換されており、Gly139αが更にセリンで置換されている、請求項7に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- Val121αがアラニンで置換されており;Gly139αがセリンで置換されており;Phe58βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されており;Ile176βがバリンで置換されている、請求項2に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- Phe169αが更にチロシンで置換されている、請求項11に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- Ile75βが更にスレオニンで置換されている、請求項11に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- Ser471βが更にシステインで置換されている、請求項11に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- Ile75βが更にスレオニンで置換されており、Ser471βが更にシステインで置換されている、請求項11に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- 配列番号7のCPCアシラーゼαサブユニットと配列番号8のCPCアシラーゼβサブユニットを含むアミノ酸配列をもつ、請求項15に記載のCPCアシラーゼ変異体。
- 請求項1に記載のCPCアシラーゼ変異体又はその機能的に等価な誘導体をコードする遺伝子。
- 配列番号6に記載のヌクレオチド配列をもつ、請求項17に記載の遺伝子。
- 請求項17に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
- pET29−S12である請求項19に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項19に記載の組換え発現ベクターで形質転換された微生物。
- 大腸菌(E.coli)BL21(DE3)(pET29−S12)(受託番号:KCTC 10503BP)である、請求項21に記載の微生物。
- 請求項21に記載の微生物を適切な条件下で培養する段階と、培養ブロスからCPCアシラーゼ変異体を回収する段階を含む請求項1に記載のCPCアシラーゼ変異体の作製方法。
- 初期培養段階にインデューサーとしてラクトースを培養ブロスに添加する段階を更に含む、請求項23に記載の方法。
- 1段階酵素法により7−ACAを製造するための請求項1に記載のCPCアシラーゼ変異体を含有する組成物。
- CPCアシラーゼ変異体が請求項21に記載の微生物の培養ブロスの形態で、請求項25に記載の組成物で、培養液から精製されたCPCアシラーゼ変異体の遊離形態で、又はCPCアシラーゼ変異体の固定化形態で使用される、請求項26に記載の方法。
- 式Iの化合物とCPCアシラーゼ変異体の接触反応を水溶液中で実施する、請求項26に記載の方法。
- 式Iの化合物の濃度が1〜500mMであり、CPCアシラーゼ変異体の添加量が0.1〜100U/mlである、請求項26に記載の方法。
- 式Iの化合物とCPCアシラーゼ変異体の接触反応をpH7から10、4から40℃で0.1から24時間実施する、請求項26に記載の方法。
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