CN105754890A

CN105754890A - 一株产井冈霉素的吸水链霉菌及其应用

Info

Publication number: CN105754890A
Application number: CN201510967302.0A
Authority: CN
Inventors: 李青; 夏建荣; 程治国; 邹维; 唐维坤; 周莉; 万俊; 潘瑜; 王梦婕; 刘华梅
Original assignee: WUHAN KERNEL BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: WUHAN KERNEL BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2035-12-21
Also published as: CN105754890B

Abstract

本发明公开了一株产井冈霉素的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)KN?055，该菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2015605。该菌能提高井冈霉素发酵液中井冈霉素A的含量，降低井冈霉素B的含量，与出发菌株相比，井冈霉素A含量提高了26.8％，B/A降低了18.2％，且井冈霉素产量稳定在25000μg/mL以上，KN?055菌株的遗传稳定性好，传至四代产井冈霉素水平与第一代相当。

Description

一株产井冈霉素的吸水链霉菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产井冈霉素的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，本发明还涉及该菌株的应用。

背景技术

井冈霉素是一种农用抗生素，具有较强的内吸性，易被菌体细胞吸收并在体内迅速传导，干扰和抑制菌体细胞的生长和发育，主要用途是防治水稻纹枯病和小麦纹枯病，是“防效高、无药害、无污染”的环保型农药。

井冈霉素由A、B、C、D、E、F等组分组成，但只有A组分对水稻纹枯病的防治作用最强，高含量的井冈霉素A不仅可以作为农药使用，还可以作为生产医药的中间体，其应用前景广阔。然而目前生产的井冈霉素杂质含量较高，尤其是井冈霉素B的含量较高，产品质量普遍较差。

发明内容

本发明的目的是通过对产井冈霉素的吸水链霉菌进行人工诱变，从而获得一株能提高井冈霉素A含量，降低井冈霉素B含量的吸水链霉菌。

申请人以生产用产井冈霉素的吸水链霉菌为出发菌株，将其采用能量为7KEV，剂量为10×10¹³N+/CM的离子束进行第一轮诱变，获得一株KN-05菌株，该菌株比出发菌株的效价(产井冈霉素A的含量)高出10％，然后再用紫外线对KN-05菌进行第二轮诱变，获得一株KN-051菌株，比KN-05的效价提高12％。将KN-051菌株进行再一次抗性筛选，用高纯度、杂质含量低的自身代谢物处理该菌株，杀死或抵制绝大多细胞的繁殖，选出有大量产生该代谢物的抗反馈突变株，得到1株正突变KN-055菌株，该菌株产井冈霉素A的含量比KN-051菌株高19％，产井冈霉素B/A的含量比KN-051菌株低约18％。

该菌株经鉴定为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，命名为KN-055，申请人于2015年10月15日将该菌保藏于位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015605。

为验证KN-055菌生产井冈霉素的性能，申请人将KN-055菌株投入生产并进行了两批次的中试研究，首先将KN-055菌株进行活化，活化后的菌悬液进行二级种子培养，培养液再进入发酵罐进行发酵，放罐后用高效液相色谱法对发酵液进行检测，结果表明：发酵液中井冈霉素A的含量高达2.505％，井冈霉素B与井冈霉素A的含量比(B/A)仅为11.71％，与出发菌株(KN-05)相比，井冈霉素A含量提高了27.16％，B/A降低了29.0％，且井冈霉素产量稳定在25000μg/mL以上，比CK菌株也有所提高。试验结果还表明，KN055菌株的遗传稳定性好，传至四代产井冈霉素水平与第一代相当。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1菌株的诱变和筛选

1.利用离子束诱变处理菌悬液以得到突变菌株

取井冈霉素生产新鲜的斜面细胞或孢子适量，置于含有玻璃珠的无菌水中，使其细胞或孢子浓度在10⁶～10⁸个/毫升，充分摇匀打散。吸取此悬菌液0.2毫升于直径9厘米的培养皿中，用涂棒涂匀，于超净台中无菌风吹0.5小时至干成菌斑。利用氮离子能量为7Kev，剂量为5×10¹³、10×10¹³、15×10¹³、20×10¹³、25×10¹³五个水平进行诱变，各实验做相应处理后与出发菌株同上摇瓶，经重复实验确定诱变剂量10×10¹³N+/CM时，菌株的正突变率最高，达到25％，因此将10×10¹³N+/CM确定为最适诱变剂量。

将诱变后的菌悬液稀释进行平板计数，在诱变后的菌斑上加入2毫升无菌水，浸泡0.5小时，用1毫升移液器反复吹洗菌斑数次后转移至无菌试管中，以此管为10-1管，依次做10倍稀释涂布。37℃恒温培养3天，观察长势，挑选菌落直径大、长势快、吸水快的、菌苔饱满中间凸起的菌落进行摇瓶筛选，与出发菌株相比，获得一株高产菌KN-05菌株，比出发菌株效价高出10％。

2.利用紫外线诱变处理经离子束诱变后筛选的突变菌株，以得到少数性能优良的菌株

经过离子束诱变后的菌株，大多数细胞死亡，但有少数细胞中的DNA发生突变，将这些突变后的菌株再次进行紫外诱变，可以影响DNA损伤的修复作用，使之出现更多的差错，提高诱变率，得到性能更优的高产菌株。

将KN-05菌制成10×10⁸个/ml单孢子悬液，取5ml到直径为90mm的无菌平板中，在磁力搅拌下进行紫外线诱变(波长253.7nm，功率15W，照射距离30cm)，照射时间分别为0，5，10，15，30min，然后取经过不同剂量照射的菌悬液0.1mL到平板培养基上37℃恒温培养5天，待菌落长出后进行活菌计数，并绘制致死曲线，在得到致死曲线后，用致死率在80-90％的照射时间照射菌株，再次37℃恒温培养5天。将致死率在80-90％的菌株稀释并涂布到含有最大耐受井冈霉素A浓度的菌株上，37℃恒温培养3-5天，将长出的菌落编号摇瓶测定井冈霉素A的含量及B组分的含量，获得一株KN-051菌株，摇瓶比KN-05菌株产井冈霉素A含量高12％。

3.通过抗性筛选得到高产井冈霉素A、B组份低的菌株

井冈霉素A为氨基糖苷类抗生素，是放线菌的次级代谢产物，其代谢途径复杂，研究表明，抗生素发酵受反馈抑制非常明显，特别是氨基糖苷类抗生素。次级代谢产物是某些生物为了避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。由于次级代谢和初级代谢有共同的分差中间体，既可以合成初级代谢产物，又可以合成次级代谢产物。当菌体生长的环境中营养物质不均衡时，即某些营养过剩、某些营养缺乏，菌体不能有效的摄入营养，在代谢系统的作用下，其生长繁殖速率下降，并通过代谢途径的改变将过剩的营养物质转变成与生长繁殖无关的次级代谢产物。因此，在筛选井冈霉素菌株时，我们就以消除初级代谢产物对那些共同中间体的反馈调节，使之大量积累，这样就有利于井冈霉素A的合成，降低杂质含量。

将KN-051菌株进行再一次抗性筛选，用64A高纯度、B/A为18％杂质含量低的自身代谢物井冈霉素A(标准品)按不同浓度(有效含量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)放入生长培养基中共培养，从而杀死或抵制绝大多细胞的繁殖，选出有大量产生该代谢物的抗反馈突变株。将菌液稀释合适浓度后取0.1ml在4.0A的抗板上涂布，37℃培养5-6天，挑取100个突变株在正常斜面上扩增，经过摇瓶发酵筛选，获得1株正突变株KN-055菌株，该菌株产井冈霉素A的含量比KN-051菌株高19％，产井冈霉素B的含量比KN-051菌株低约18％。

4.菌株的鉴定

该菌株出发菌株为吸水链霉菌，革兰氏阳性菌，通过复合诱变后，该菌株形态孢子丝螺旋形，孢子卵圆形，表面光滑，菌落为鼠灰色，色素透入培养基内，基丝为深褐色，气丝鼠灰色。形态与出发菌相同，未出现菌属的改变，菌株鉴定仍为吸水链霉菌。

5.菌株的遗传稳定性

将改良菌种经4次传代实验，以检验改良菌株的遗传稳定性良好。

表1 KN055菌株的传代稳定性考核

数据显示，KN-055菌株传至四代产井冈霉素水平与第一代相当，证明该菌株遗传稳定，可作为工程菌投入生产。

实施例2利用菌株生产井冈霉素的试验研究

1)菌株活化

将保藏的吸水链霉菌KN-055菌株在高氏一号斜面培养基上活化，28℃培养7天，用无菌水将菌苔洗下，得到种子菌悬液；

2)二级种子培养

将步骤1)所得种子菌悬液接入种子发酵罐，200rpm，37℃培养22-24hr，种子发酵培养基成分为：玉米粉5％，淀粉2.4％，豆粕0.5％，NaCl 0.05％，CaCO₃0.05％，KH₂PO₄0.05％，余量为水，各成分的含量均按质量体积比；

3)发酵培养

将步骤2)发酵后得到的种子发酵液移入大罐发酵罐中培养，设置发酵参数为：通气比1：1，搅拌速度420rpm，发酵温度37℃，培养时间48-50hr，放罐后得到含有井冈霉素的发酵液，发酵培养基的成分为：玉米粉10％，淀粉4％，豆粕2.5％，NaCl 0.05％，CaCO₃0.05％，KH₂PO₄0.05％，消泡剂0.01％，余量为水，所述消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂，各成分的含量均按质量体积比。

4.放罐有效含量及杂质含量的检测

采用高效液相色谱法对发酵液进行检测，检测条件和方法是：

(1)试剂和溶液准备

蒸馏水(新蒸二次蒸馏水)，甲醇(色谱纯)，磷酸(分析纯)，无水磷酸氢二钾(分析纯)。缓冲溶液：称取435.0mg无水K₂HPO₄于1000mL容量瓶中，加二次蒸馏水溶解，并稀释至刻度，摇匀。用磷酸调至pH＝7.0备用，使用前须用0.45μm的微孔滤膜过滤。

井冈霉素标样：已知井冈霉素A质量分数，井冈霉素A≥90％。

(2)仪器

高效液相色谱仪：具可变波长紫外检测器或二极管阵列检测器。

色谱数据处理工作站。

色谱柱：250mm×4.6mm(id)不锈钢柱，YMC-PACK ODS-AQ，粒径5μm。

微量进样器：10μL。

过滤器：滤膜孔径0.45μm。

(3)样品处理

标样稀释方法：称取井冈霉素标样适量(精确至0.1mg，使井冈霉素A终浓度在200μg/ml左右)至50mL容量瓶，加入2.2mL0.05mol/L H₂SO4，双蒸水定容，再分别移4、5、6mL至3个50mL容量瓶，双蒸水定容，配成具有一定浓度梯度的标样溶液Ⅰ、标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ。

试样稀释方法：分别称取适量井冈霉素试样2次于2支50mL容量瓶中，双蒸水定容。量取2mL此溶液于100mL容量瓶，双蒸水定容，0.22μm过滤器过滤后进样。选择合适的称样量，使稀释后的试样进样浓度与标样溶液Ⅱ相当。

(4)操作条件：

流动相：缓冲液+甲醇＝99+1

流速：1.2mL/min

柱温：30℃。

检测波长：210nm

进样体积：10μL

(5)测定

在上述色谱条件下，待仪器基线稳定后，按标样溶液Ⅰ、标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ、样品溶液、样品溶液的顺序进样测定。

(6)数据分析

在色谱工作站调出3种浓度的标样图谱，进行较准、绘制标准曲线。

根据井冈霉素A、B的峰面积计算B/A的含量比，同时根据对照和标准曲线计算井冈霉素A的含量，检测两批次生产的数据，同时以出发菌株为对照，结果见下表。

表2 KN-055菌株与对照菌株的液相峰面积及数据统计

菌株编号	批次	B峰面积	A峰面积	B/A面积％	A％
						CK	14375	92.74	576.29	16	1.98
CK	14376	98.12	577.87	16.98	1.96
						KN-055	15224	97.01	791	12.26	2.51
KN-055	15226	98.13	879	11.16	2.5

由表2数据显示，CK菌株放罐井冈霉素A含量平均为1.97％，B/A平均为16.49％；KN-055菌株放罐井冈霉素A含量平均为2.505，B/A平均为11.71％；KN-055菌株的井冈霉素A含量比CK菌株提高了27.16％，B/A降低了29.0％。

KN-055菌株的井冈霉素产量稳定在25000μg/mL以上，比CK菌株也有所提高。

Claims

1.一株产井冈霉素的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)KN-055，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2015605。

2.权利要求1所述的吸水链霉菌KN-055在井冈霉素生产中的应用。

3.一种井冈霉素生产方法，其特征在于：以权利要求1所述的吸水链霉菌KN-055为发酵菌株。

4.如权利要求3所述的井冈霉素生产方法，其特征在于包括以下步骤：

1)菌株活化：将所述的吸水链霉菌KN-055菌株在高氏一号斜面培养基上活化，28℃培养7天，用无菌水将菌苔洗下，得到种子菌悬液；

2)二级种子培养：将步骤1)所得种子菌悬液接入种子发酵罐，200rpm，37℃培养22～24hr，种子发酵培养基成分为：玉米粉5％，淀粉2.4％，豆粕0.5％，NaCl 0.05％，CaCO₃ 0.05％，KH₂PO₄ 0.05％，余量为水，各成分的含量均按质量体积比；

3)发酵培养：将步骤2)发酵后得到的种子发酵液移入大罐发酵罐中培养，设置发酵参数为：通气比1∶1，搅拌速度420rpm，发酵温度37℃，培养时间48～50hr，发酵培养基的成分为：玉米粉10％，淀粉4％，豆粕2.5％，NaCl 0.05％，CaCO₃ 0.05％，KH₂PO₄ 0.05％，消泡剂0.01％，余量为水，各成分的含量均按质量体积比，放罐后得到含有井冈霉素的发酵液。