CN116218892A - 一种clm24(de3)菌株的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CLM24(DE3)菌株的构建方法及其应用与无细胞糖蛋白合成，本发明通过基因编辑技术将T7RNAP基因导入大肠杆菌W3110中，由此获得了使W3110可特异高效生产蛋白的潜力，进一步地通过敲除waal基因获得了CLM24(DE3)菌株，该菌株获得了高效生产糖蛋白的潜力；通过无细胞蛋白合成体系表征了其相对于出发菌株，不仅可以进行高效的蛋白合成，并且可以进行蛋白的完全修饰，实现糖蛋白的合成；这是赋予大肠杆菌无细胞合成的关键因素，可以认为CLM24(DE3)菌株对合成生物学中糖蛋白的合成具有潜在应用价值。

Description

一种CLM24(DE3)菌株的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于基因编辑领域，具体涉及一种CLM24(DE3)菌株的构建方法及其应用。

技术背景

糖蛋白的合成在合成生物学领域中十分受研究者关注，因其具有多种生物学、生理学的功能，在生命体的生长发育，神经、免疫系统的过程控制，炎症及免疫反应，癌细胞的增殖转移等过程中都起到了关键性的作用。目前，糖蛋白的合成有化学键的连接合成，真核工程细胞的内源性糖蛋白合成，合成成本都较高。

大肠杆菌W3110作为一种工程化的原核模式菌株，具有生长速度快，表达能力强，代谢易于控制，理论上可以全基因组编辑等特点。T7RNA聚合酶是来源于噬菌体的RNA转录酶，具有高度的启动子转移性，且只会转录位于T7启动子下游的DNA。此酶在大肠杆菌中的蛋白表达中应用广泛，与pET系列载体搭配，可获得高表达量的目的蛋白。

Waal蛋白是W3110菌株的周质腔中存在的糖基转移酶，Waal蛋白能够把O-抗原多糖链转移到类脂A-核心多糖复合体上，通过其他酶的作用穿过细胞外膜而在细菌表面形成脂多糖。此过程消耗了大量的糖基，因此，若在大肠杆菌中合成糖蛋白，就需要敲除waal基因。大肠杆菌自身作为原核模式菌株不具备蛋白糖基化修饰过程，目前，研究人员通过将空肠弯曲杆菌的糖基化蛋白修饰过程引入大肠杆菌中可以实现大肠杆菌蛋白合成后的糖基化修饰。因此提供一种大肠杆菌合成糖蛋白的新方法，对于合成生物学和医药领域的低成本的规模化生产具有十分重大的意义。

本申请将提供一种菌株可直接合成T7RNA聚合酶特异高效合成目的蛋白，并可对目的蛋白直接进行糖基化修饰。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一株高效合成糖蛋白的大肠杆菌的菌株及构建方法。该大肠杆菌CLM24(DE3)与pET系列载体搭配不仅能够进行高效的蛋白合成，同时可以利用空肠弯曲杆菌糖基化机制将合成的蛋白质直接进行翻译后糖基化修饰。

本发明提供技术方案之一，所述工程菌株以大肠杆菌W3110为出发菌株，首先将敲除lac操纵序列中lacZ基因，并且在lacI基因后插入T7RNA聚合酶基因；

进一步地在基因组上敲除糖基转移酶编码基因waal；

本发明提供技术方案之二，是技术方案一所述基因工程菌的应用，特别是在以无细胞蛋白合成体系中合成荧光蛋白sfGFP的应用，

具体地，无细胞蛋白合成体系方法如下：

将技术方案一所述基因工程菌按1％接种量接入2×YTPG培养基中，在OD600＝0.8时加入0.25mM的IPTG诱导T7RNA聚合酶表达，37℃，220rpm，培养2.5h，收取菌体，制备细胞提取物；

2×YTPG培养基组成如下：10g/L酵母提取物，16g/L胰蛋白胨，5g/LNaCl，7g/LK2HPO4，3g/LKH2PO4，18g/L葡萄糖，其余为水；调节pH至7.2左右；

进一步地，配置无细胞反应体系(15μl)组成如下：20-53.3％(v/v％)S30细胞提取物，8-20mM谷氨酸镁，16ng/μl DNA模板，10mM谷氨酸胺，130mM谷氨钾钾，1.2mMATP，0.85mMUTP，0.85mMGTP，0.85mMCTP，0.034mg/ml叶酸，0.171mg/ml大肠杆菌tRNA，20种氨基酸各2mM，30mMPEP，0.4mMNAD，0.27mM辅酶A，4mM草酸，1mM腐胺，1.5mM亚精胺和57mMHEPES；其余为水；

经过30℃，4h的孵育收集反应液，检测sfGFP的含量及荧光强度如图3；

优选地，无细胞反应液中添加16mM谷氨酸镁，40％(v/v％)S30细胞提取物，无细胞反应的蛋白合成水平最优。

本发明表明，该菌株蛋白合成水平较出发菌株大大增强，合成体系通过添加PglB(空肠弯曲杆菌寡糖转移酶)可直接应用空肠弯曲杆菌糖基化机制。结果表明，大肠杆菌CML24(DE3)具有高效合成糖蛋白的能力。

附图说明

图1菌株E.coliW3110ΔlacZ::T7RNAP基因组PCR验证图

泳道M-marker；泳道1-菌株E.coliW3110ΔlacZ::T7RNAP；泳道2-菌株W3110；

验证长度：7314bp(验证插入的T7RNAP替换lacZ)

验证长度：5211bp

验证引物：lac-JD-F：tattctggtggccggaaggc

T7JD-R：cggtagcaaagaacgaagtaaaga

图2菌株CLM24(DE3)基因组PCR验证图

泳道M-marker；泳道1-菌株E.coliW3110ΔlacZ::T7RNAP；泳道2-菌株CLM24(DE3)；

验证长度：1516bp

验证长度：216bp(验证消除kana抗性基因)

验证引物：waalYZ-F：agatggtatgtagggctccaagag

waalYZ-R：tgcattttaccctaattcacgtac

图3.1 CLM24(DE3)的无细胞提取物表达荧光蛋白sfGFP的western blot检测图，W3110作对照

图3.2 CLM24(DE3)的无细胞提取物表达荧光蛋白sfGFP的荧光表达水平图，W3110做对照

图4 CLM24(DE3)的无细胞合成反应中Mg²⁺(8mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM)及细胞提取物含量(3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl)对反应的合成能力影响图

图5 CLM24(DE3)的无细胞糖蛋白合成反应图，以蛋白迁移水平发生改变说明进行了糖基化修饰，W3110(DE3)作对照

具体实施方案:

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

实施例1菌株W3110(DE3)的构建

菌株E.coliW3110ΔlacZ::T7RNAP的构建

以大肠杆菌W3110为原始菌株，敲除lac操纵序列中lacZ基因，并且在lacI基因后插入T7RNAP基因，使W3110菌株具有自身合成T7RNAP的能力，具有特异高效的转录能力。

构建此菌株使用的方法为λRed重组。主要是构建同源重组片段，及消除卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO.1)，以pKD46(GenBank:MF287367)作为同源重组质粒，进行基因的敲除及整合。同源重组片段包含上下游同源臂、卡那霉素抗性基因和T7RNAP基因。以下详细描述具体方法：

1、第一步同源重组片段T7RNAP-FRT-kana-FRT的构建。构建T7RNAP-FRT-kana-FRT片段，其中FRT-kana-FRT来源于pKD13质粒，kana为氯霉素抗性基因(SEQ ID NO.1)，T7RNAP(SEQ ID NO.2)来源于BL21(DE3)基因组，以大肠杆菌BL21(DE3)为模板，以lacI-T7-F/T7-pkd13-R为引物，PCR得到上游同源臂、T7RNAP基因；以pKD13质粒为模板，以T7-pkd13-F/pkd13-lacI-R为引物，PCR得到FRT-kana-FRT基因；以W3110为模板，以pkd13-lacI-F/l-down-R为引物，PCR得到下游同源臂。以三个片段，包括上游同源臂T7RNAP，FRT-kana-FRT，下游同源臂，overlap PCR得到同源重组片段T7RNAP-FRT-kana-FRT。

2、制备大肠杆菌W3110化学转化感受态细胞并将质粒pKD46化转其中。

3、第一步同源重组。将构建好的同源重组片段T7RNAP-FRT-kana-FRT电转入含pKD46质粒的感受态细胞中，30℃下LB平板倒置培养24h，卡那霉素抗性筛选，挑去转化子进行菌落PCR鉴定后，提取基因组进行基因组PCR验证，以出发菌株W3110做对照(验证图见图1)。

4、卡那霉素抗性消除。将鉴定成功的E.coliW3110ΔlacZ::T7RNAPFRT-kana-FRT菌株制备电转化感受态细胞将pCP20质粒转化其中，30℃下LB平板倒置培养24h，氯霉素抗性筛选，挑取转化子进行基因组提取测序验证，37℃培养数代消除pKD46，pCP20质粒，得到构建成功的菌株W3110(DE3)。

表1：T7RNAP基因替换lacZ基因所用引物

实施例2菌株CLM24(DE3)构建(敲除waal基因)

菌株CLM24(DE3)构建，使用实施例1构建的W3110(DE3)菌株作为底盘菌株，敲除基因组上的waal基因(糖基转移酶)

构建此菌株使用方法为λRed重组。主要是构建同源重组片段，及消除卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO.1)，以pKD46(GenBank:MF287367)作为同源重组质粒，进行基因的敲除。同源重组片段包含上下游同源臂、卡那霉素抗性基因。

以下详细描述具体方法：

1、第一步同源重组片段FRT-kana-FRT的构建。构建T7RNAP-FRT-kana-FRT片段，其中FRT-kana-FRT来源于pKD13质粒，kana为氯霉素抗性基因(SEQ ID NO.1)，以pKD13质粒为模板，以waal-FRT-F/FRT-waal-R为引物，PCR得到FRT-kana-FRT基因；以W3110为模板，以800waal-F/waal-FRT-R，waal-FRT-F/800waal-R为引物，PCR得到上、下游同源臂。以三个片段，包括上游同源臂，FRT-kana-FRT，下游同源臂，overlap PCR得到同源重组片段FRT-kana-FRT。

2、制备大肠杆菌W3110(DE3)化学转化感受态细胞并将质粒pKD46化转其中。

3、第一步同源重组。将构建好的同源重组片段FRT-kana-FRT电转入含pKD46质粒的感受态细胞中，30℃下LB平板倒置培养24h，卡那霉素抗性筛选，挑去转化子进行菌落PCR鉴定，以出发菌株W3110(DE3)做对照。

4、卡那霉素抗性消除。将鉴定成功的E.coliW3110(DE3)Δwaal::kana菌株制备电转化感受态细胞将pCP20质粒转化其中，30℃下LB平板倒置培养24h，氯霉素抗性筛选，挑取转化子进行基因组提取测序验证，37℃培养数代消除pKD46，pCP20质粒，得到构建成功的菌株CLM24(DE3)提取基因组进行PCR验证(验证图见图2)。

表2：敲除waal基因所用引物

800waal-F	gttgagcgagttattcctgtgg
		800waal-R	tcttctcacaaatagaaagggtg
waal-FRT-F	gcagttttggaaaagttatcatcattataaaggtaaaacatctgtcaaacatgagaattaa
		FRT+waal-R	agtgagttttaactcacttcttaaacttgtttattcttaagtgtaggctggagctgcttc

实施例3CLM24(DE3)的蛋白合成能力及糖基化修饰分析

CLM24(DE3)的蛋白合成能力及糖基化修饰分析，使用实施例2中构建的菌株CLM24(DE3)作为实验菌株，蛋白合成能力使用western blot、荧光强度水平检测，糖基化修饰使用western blot检测蛋白迁移率。

以下描述具体方法：

1、无细胞反应的配置：将技术方案一所述基因工程菌按1％接种量接入2×YTPG培养基中，在OD600＝0.8时加入0.25mM的IPTG诱导T7RNA聚合酶表达，37℃，220rpm，培养2.5h，收取菌体，制备细胞提取物；

2×YTPG培养基组成如下：10g/L酵母提取物，16g/L胰蛋白胨，5g/LNaCl，7g/LK₂HPO₄，3g/L KH₂PO₄，18g/L葡萄糖，其余为水；调节pH至7.2左右；

进一步地，配置无细胞反应体系(15μl)组成如下：20.0、26.7、33.3、40.0、46.7、53.3％(v/v)S30细胞提取物，8、10、12、14、16、18、20mM谷氨酸镁，16ngμl-1sfGFP DNA模板，10mM谷氨酸胺，130mM谷氨钾钾，1.2mMATP，0.85mMUTP，0.85mMGTP，0.85mMCTP，0.034mg/ml叶酸，0.171mg/ml大肠杆菌tRNA，20种氨基酸各2mM，30mMPEP，0.4mMNAD，0.27mM辅酶A，4mM草酸，1mM腐胺，1.5mM亚精胺和57mMHEPES；其余为水；

经过30℃，4h的孵育收集反应液，以出发菌株W3110作为对照。

2、western blot检测sfGFP的含量和荧光强度检测

(1)、将收集的无细胞蛋白合成反应，进行80℃孵育变性蛋白，冷却离心后，将总蛋白进行SDS PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，用5％(w/v)脱脂奶粉溶液封闭NC膜1h，TBST溶液洗涤三次后，4℃孵育一抗过夜，TBST洗涤三次后，室温避光孵育二抗(1：5000稀释比例)2h，重复洗涤，将NC膜平铺于Odyssey红外激光成像系统中，设置程序，进行数据分析。

(2)、将收集的无细胞蛋白合成反应按10％(v/v)用57mMHEPES稀释，避光条件下加入黑色不透光的96孔板中，每个样品空中加入50ul稀释后样品，将设置程序30s混匀，酶标仪激发波长和发射波长为488nm和510nm,进行数据分析。

3、将收集的无细胞反应液进行第二步蛋白糖基化反应，配置使得反应体系终浓度为10mM MnCl₂和0.1％(w/v)DDM，加入2μg寡糖转移酶(PglB)和5μg脂连接寡糖(LLOs)，30℃下孵育16h，将收集的无细胞糖蛋白合成反应，将收集的无细胞蛋白合成反应，进行80℃孵育变性蛋白，冷却离心后，将总蛋白进行SDS PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，用5％(w/v)脱脂奶粉溶液封闭NC膜1h，TBST溶液洗涤三次后，4℃孵育一抗过夜，TBST洗涤三次后，室温避光孵育二抗(1：5000稀释比例)2h，重复洗涤，将NC膜平铺于Odyssey红外激光成像系统中，设置程序，进行数据分析。

4、无细胞蛋白合成反应的Mg²⁺及细胞提取物含量优化

Mg²⁺作为转录过程中T7RNAP的辅因子，细胞提取物中的核糖体、转录因子等都是影响无细胞蛋白合成的关键性因素；因此对CLM24(DE3)无细胞蛋白合成反应的Mg²⁺(8mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM)及细胞提取物含量(3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl)进行优化实验，

其余无细胞反应体系(15μl)组成如下：16ng/μl sfGFP DNA模板，10mM谷氨酸胺，130mM谷氨钾钾，1.2mMATP，0.85mMUTP，0.85mMGTP，0.85mMCTP，0.034mg/ml叶酸，0.171mg/ml大肠杆菌tRNA，20种氨基酸各2mM，30mMPEP，0.4mMNAD，0.27mM辅酶A，4mM草酸，1mM腐胺，1.5mM亚精胺和57mMHEPES；其余为水；

经过30℃，4h的孵育收集反应液，按10％(v/v)用57mMHEPES稀释，避光条件下加入黑色不透光的96孔板中，每个样品空中加入50ul稀释后样品，将设置程序30s混匀，酶标仪激发波长和发射波长为488nm和510nm,进行数据分析。

Claims (6)

1.一种CLM24(DE3)菌株的构建方法及其应用，特征在于：将大肠杆菌W3110的lacZ基因替换为T7RNAP，并敲除waal基因，所获得菌株为CLM24(DE3)。

2.根据权利要求1所述的一种CLM24(DE3)菌株的构建方法及其应用，其：在大片段及二次λRed重组时，同源臂需延长至800-1000bp。

3.根据权利要求1所述的一种CLM24(DE3)菌株的构建方法及其应用，其特征在于：CLM24(DE3)菌株较出发菌株具有高效生产蛋白的潜力。

4.根据权利要求1所述的一种CLM24(DE3)菌株的构建方法及其应用，其特征在于：大肠杆菌CLM24(DE3)菌株具有进行糖蛋白合成的潜力。

5.根据权利要求1所述的一种CLM24(DE3)菌株的构建方法及其应用，其特征在于：CLM24(DE3)菌株具有应用于无细胞合成的Mg²⁺工作浓度为16mM。

6.根据权利要求1所述的一种CLM24(DE3)菌株的构建方法及其应用，其特征在于：CLM24(DE3)菌株具有应用于无细胞合成及无细胞糖蛋白合成的应用潜力。

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