CN104946577A - 基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法 - Google Patents

Abstract

基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，属于酶基因工程技术领域。以整合载体pDGIEF为出发载体，删除原有的壮观霉素(spc)抗生素抗性基因，引入lox71-spc-lox66新的抗生素抗性基因片段，得质粒pDGI-7S6；将ATCC 35704的DPE酶基因，在其上游融合P43启动子构建P43-DPE，将其构建至pDGI-7S6中得pDGI-7S6-P43-DPE；再转化1A751感受态，在淀粉酶同源臂作用下，P43-DPE和lox71-spc-lox66整合至1A751染色体上；利用Cre/lox系统将spc抗性基因敲除，得一株食品级安全的产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的1A751/lox-DPE，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.002，保藏编号：CCTCC NO:M 2015258。发酵液总酶活达到6U/mL，具有重要的工业应用价值。

Description

基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

技术领域

一种基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，涉及一种DPE酶在枯草芽孢杆菌中的食品级表达，属于酶基因工程技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶（DPE酶）属于D-塔格糖 3-差向异构酶（简称DTE）家族酶，可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可单独或与其他酶偶联合成多种碳水化合物，被广泛的应用于化学、食品和制药等领域。目前，DPE酶可催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化，利用D-果糖生产D-阿洛酮糖。

随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研究仍是功能性甜味剂领域具有重要的经济价值的当务之急。D-阿洛酮糖是一种天然己酮糖，D-阿洛酮糖拥有蔗糖甜度的70%，能量值却只有蔗糖的0.3%，具有较高的溶解度，较低的血糖反应。因此它是一种理想的甜味剂，也是蔗糖的完美替代品。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA认定为GRAS食品。此外D-阿洛酮糖还可以减少脂肪堆积和清除活性氧等生理作用，在制药业中有很大的应用前景。

自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少，近年来通过新技术开发可实现其大规模生产。D-阿洛酮糖的生产方法有化学法和生物法。化学合成法存在工艺复杂、副产物多、分离纯化困难、食品安全性等问题。而通过D-阿洛酮糖 3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase , DPEase, EC 5.1.3.30)把D-果糖差向异构化为D-阿洛酮糖的生物转化法因具有反应简单、产物单一、纯化步骤容易等优点而逐渐吸引了众多科学家的关注，也成为D-阿洛酮糖商业化生产的热点和焦点。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌的一个种，有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，且不产生毒素和致热致敏蛋白，被美国食品药物管理局(FDA)和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株。Bacillus subtilis表达系统没有明显的密码子偏好性，表达产物不容易形成包涵体，具有很强的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和纯化等后续操作，并且遗传背景研究比较清楚，并具有多年的工业生产技术基础。

发明内容

本发明目的是提供一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的食品级安全的重组枯草芽孢杆菌，并可用于转化D-果糖生成D-阿洛酮糖。对D-阿洛酮糖的食品生产具有重要的意义。

本发明的技术方案：一株基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为1A751/lox-DPE，分类命名为（Bacillus subtilis）SK38.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2015258。

所述的基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括含有来源于梭状芽胞杆菌（Clostridium scindens）ATCC 35704的DPE酶基因的整合载体pDGI-7S6-P43-DPE；再利用整合载体pDGI-7S6-P43-DPE将DPE酶基因和抗生素抗性基因lox71-spc-lox66整合至枯草芽孢杆菌(Bacillus subtils )1A751染色体上，然后利用Cre重组酶敲除染色体上的spc抗性基因，获得一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751/lox-DPE，命名为（Bacillus subtilis）SK38.002，即CCTCC NO：M 2015258。

重组菌的制备方法，其具体步骤为：

（1）以整合载体pDGIEF(NCBI-Gene ID: 86278326)为出发载体，将质粒p7S6用SalⅠ/XmaⅠ双酶切得到lox71-spc-lox66片段；将整合载体pDGIEF用SalⅠ/XmaⅠ双酶切，将lox71-spc-lox66片段连入相应酶切位点，得到新的整合载体pDGI-7S6。

（2）设计引物将DPE酶基因扩增出来，在引物中引入NheⅠ/SalⅠ酶切位点，通过重叠延伸PCR将启动子P43融合在DPE酶基因上游。将扩增的DPE酶基因连接至pMD-19T中，得到质粒T-P43-DPE。

（3）将整合载体pDGI-7S6和T-P43-DPE同时用NheⅠ/SalⅠ双酶切，将P43-DPE表达基因构建至整合载体pDGI-7S6中，得到整合载体pDGI-7S6-P43-DPE。

（4）将整合载体pDGI-7S6-P43-DPE转入枯草芽孢杆菌1A751感受态，发生同源重组，P43-DPE表达基因和lox71-spc-lox66整合至枯草芽孢杆菌1A751染色体上，得到1A751-P43-DPE-spc。

（5）将温敏性质粒pTSC导入整合的重组枯草芽孢杆菌1A751-P43-DPE-spc中，在IPTG的诱导下，表达重组酶Cre，在Cre酶的作用下，lox71和lox66位点发生重组，抗生素抗性基因spc被删除，提高温度培养，pTSC质粒丢失。最终获得一株无抗性基因的重组枯草芽孢杆菌1A751/lox-DPE，命名为（Bacillus subtilis）SK38.002，即CCTCC NO：M 2015258。

为增强表达，在DPE基因的上游添加启动子P43，P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中1-300位所示。

整合载体pDGI-7S6-P43-DPE，其中含有所述的DPE酶基因(SEQ ID NO.1中301-1170位所示)、作为筛选标记的抗生素抗性基因lox71-spc-lox66片段以及淀粉酶同源臂amyE。

所述的重组枯草芽孢杆菌1A751/lox-DPE的应用，可用于生产D-阿洛酮糖，在化学、食品和制药领域中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751/lox-DPE，命名为（Bacillus subtilis）SK38.002，即CCTCC NO：M 2015258。其可以D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖。该重组枯草芽孢杆菌在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。

生物材料样品保藏：一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国  武汉  武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2015258，保藏日期2015年4月28日。

附图说明

图1：整合载体pDGI-7S6-P43-DPE的构建过程。

图2：染色体整合及抗性基因spc敲除。

图3：重组菌SK38.001的发酵及酶活曲线。

具体实施方式

实施例1：P43-DPE表达单元的构建

通过重叠PCR引入P43启动子，利用引物对P1/P2扩增P43启动子，利用引物对P3/P4扩增DPE酶基因连接，设计引物如下：

P1: 5’-CCGCTAGCTG ATAGGTGGTA TGTTTTC-3’

P2: 5’-TAATAAATAC CATGCTTCAT GTGTACATTC CTCTCT-3’

P3: 5’-AGAGAGGAAT GTACACATGA AGCATGGTAT TTATTA-3’

P4: 5’-GTCGACTTAC TTCCATTCAA GCATG -3’

通过PCR的方法，利用P1和P2为引物获得PCR产物1。利用P3和P4为引物获得PCR产物2。

以PCR产物1和PCR产物2为模板，利用P1和P4为引物，进行重叠PCR。其反应体系如下：

反应程序如下：98℃ 预变性1 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸5 min，降温至4℃。最终得到P43-DPE表达单元。

实施例2：整合载体pDGI-7S6-P43-DPE的构建

将质粒p7S6和pDGIEF，分别用SalⅠ和XmaⅠ进行双酶切，回收lox71-spc-lox66和载体pDGIEF基因片段，经T4连接酶连接过夜后转化入E. coli DH5α感受态细胞，涂布到LB固体培养基（含100 μg/mL spc）上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取质粒，进行双酶切验证。验证正确的质粒被命名为pDGI-7S6。

将质粒pDGI-7S6和pP43-DPE，分别用NheⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收基因片段pDGI-7S6和P43-DPE，经T4连接酶连接过夜后转化入E. coli DH5α感受态细胞，涂布含有spc(100 μg/mL)的LB平板，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，抽提质粒，进行双酶切和测序验证。验证及测序正确的质粒命名为pDGI-7S6-P43-DPE（图1）。

实施例3：染色体整合

将重组质粒pDGI-7S6-P43-DPE用XhoI线性化后转化入宿主菌B. subtilis 1A751感受态中，涂布到LB固体培养基（含100 μg/mL spc）上，37℃培养过夜，挑取阳性克隆转化子即为B. subtilis 1A751-DPE-spc（图2）。制作重组菌B. subtilis 1A751-DPE-spc感受态，将带有Cre基因的pTSC质粒转化入感受态中，利用含有Em（250 μg/mL）的LB平板筛选，挑取阳性克隆子，用牙签接种到含有Em（250 μg/mL）和Spc（100 μg/mL）的双抗性平板和仅含Em（250 μg/mL）的抗性平板，选取仅具有Em抗性而不具有Spc抗性的阳性克隆子，再提高温度，丢失质粒pTSC即获得重组菌B. subtilis 1A751/lox-DPE。

实施例4： 重组菌的发酵

1. DPE酶活测定方法：1mL的反应体系中，加入800μL的用磷酸盐缓冲液（50mM, pH7.0）溶解的100g/L的D-果糖，200μL的发酵液，55℃保温10min，然后煮沸10min以终止酶反应。

2. 用HPLC检测D-阿洛酮糖的生成量，计算酶活。酶活单位（U）：每分钟催化产生1μmol D-psicose 所需要的酶的量。

3. 用接种环从平板上挑取新鲜的菌落接种至种子培养基中，37℃、200rpm，培养12~14h。以3%的接种量接种至发酵培养基中，37℃、200rpm，并定时取样，测定OD₆₀₀，酶活数据（图3）。

种子培养基：胰蛋白胨(10g/L)，酵母提取物(5g/L)，NaCl(10g/L)，以纯净水配制。

发酵培养基：葡萄糖(15g/L)，酵母膏(15g/L)，NaCl(8g/L)，MgSO₄(1g/L)，Na₂HPO₄(1g/L)，pH 7.25，以纯净水配制。

<210>  SEQ ID NO: 1

<211>  1170

<212>  DNA

<213>  1-300位为P43启动子，301-1170为DPE酶基因

 

<400>  1

Tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt     60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg    120

tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt    180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc    240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac    300

atgaagcatg gtatttatta cgcgtactgg gaacaggaat gggcagcaga ttacaagcgg    360

tatgtagaga aggcggcaaa gcttggattc gatatactgg aggttggcgc ggcgccactg    420

ccggactatt ctgcgcagga ggtaaaggaa ctgaaaaaat gcgccgatga taacggtatc    480

cagctgaccg cgggatatgg tcccgccttc aatcataata tgggttcctc agatccgaag    540

atcagggaag aggcgcttca atggtataaa cgcctgttcg aggtgatggc aggccttgat    600

attcatctga ttggcggagc gctttattca tactggccgg tggactttgc cacagccaat    660

aaggaagagg actggaagca cagcgtggag ggaatgcaga ttctggcgcc catcgccagc    720

cagtatggca tcaatctggg aatggaagtc ctgaaccgct ttgagagcca tatcttaaat    780

acttcggaag aaggcgtgaa gttcgtgacg gaagtaggca tggataatgt gaaagtcatg    840

ctggatacgt tccacatgaa catcgaggaa tcgagcattg gcgacgcgat ccgccatgcc    900

gggaaacttc ttggacactt ccacaccggc gagtgcaacc gcatggtacc cggaaagggc    960

cgcaccccat ggagggagat cggggatgcc ttgcgcgaga ttgagtatga cggaaccgtg   1020

gttatggagc catttgtacg catgggcgga caggtaggct ctgatatcaa ggtctggaga   1080

gacatcagca agggcgcggg agaggaccgg ctggatgagg atgcaaggcg cgcggtagag   1140

ttccagagat acatgcttga atggaagtaa                                    1170

 

Claims (6)

1.一株基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为1A751/lox-DPE，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2015258。

2.权利要求1所述的基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括含有来源于梭状芽胞杆菌（Clostridium scindens）ATCC 35704的DPE酶基因的整合载体pDGI-7S6-P43-DPE；再利用整合载体pDGI-7S6-P43-DPE将DPE酶基因和抗生素抗性基因lox71-spc-lox66整合至枯草芽孢杆菌1A751染色体上，然后利用Cre重组酶敲除染色体上的spc抗性基因，获得一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751/lox-DPE，命名为（Bacillus subtilis）SK38.002，即CCTCC NO：M 2015258。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于具体步骤为：

（1）以整合载体pDGIEF为出发载体，将质粒p7S6用SalⅠ/XmaⅠ双酶切得到lox71-spc-lox66片段；将整合载体pDGIEF用SalⅠ/XmaⅠ双酶切，将lox71-spc-lox66片段连入相应酶切位点，得到新的整合载体pDGI-7S6；

（2）设计引物将DPE酶基因扩增出来，在引物中引入NheⅠ/SalⅠ酶切位点，通过重叠延伸PCR将启动子P43融合在DPE酶基因上游，将扩增的DPE酶基因连接至pMD-19T中，得到质粒T-P43-DPE；

（3）将整合载体pDGI-7S6和T-P43-DPE同时用NheⅠ/SalⅠ双酶切，将P43-DPE表达基因构建至整合载体pDGI-7S6中，得到整合载体pDGI-7S6-P43-DPE；

（4）将整合载体pDGI-7S6-P43-DPE转入枯草芽孢杆菌1A751感受态，发生同源重组，P43-DPE表达基因和lox71-spc-lox66整合至枯草芽孢杆菌1A751染色体上，得到1A751-P43-DPE-spc；

（5）将温敏性质粒pTSC导入整合的重组枯草芽孢杆菌1A751-P43-DPE-spc中，在IPTG的诱导下，表达重组酶Cre，在Cre酶的作用下，lox71和lox66位点发生重组，抗生素抗性基因spc被删除，提高温度培养，pTSC质粒丢失，获得一株无抗性基因的重组枯草芽孢杆菌1A751/lox-DPE，命名为（Bacillus subtilis）SK38.002，即CCTCC NO：M 2015258。

4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于为增强表达，在DPE基因的上游添加启动子P43，P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中1-300位所示。

5.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于整合载体pDGI-7S6-P43-DPE，其中含有所述SEQ ID NO.1中301-1170位所示的DPE酶基因、作为筛选标记的抗生素抗性基因lox71-spc-lox66片段以及淀粉酶同源臂amyE。

6.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌1A751/lox-DPE的应用，其特征在于可用于生产D-阿洛酮糖，在化学、食品和制药领域中的应用。