ES2630222T3 - Partículas alfavíricas y métodos de preparación - Google Patents

Abstract

Un método de preparación de partículas de replicón alfavírico que comprende introducir un vector de replicón alfavírico y una o más moléculas de ácido nucleico colaborador en células permisivas de alfavirus por electroporación, en donde la concentración de las células permisivas de alfavirus en medio de cultivo durante la electroporación es de 5x107 a 5x108 células/ml y en donde la concentración del vector de replicón de ARN alfavírico añadido a las células antes de la electroporación es de aproximadamente 35 μg por ml.

Description

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DESCRIPCION

Partmulas alfavmcas y metodos de preparacion Antecedentes de la invencion

La presente invencion se refiere a la tecnologfa de ADN recombinante, y en particular a introducir un acido o acidos nucleicos ajenos en una celula eucariotica, y mas particularmente a metodos para producir partmulas vmcas o partmulas de tipo virus infecciosas con altos rendimientos, especialmente partmulas utiles en inmunoterapias y/o aplicaciones de terapia genica. En particular, la presente invencion da a conocer un proceso comercialmente factible de alto rendimiento compatible con las NCF para producir preparaciones de partmula de replicon alfavmco (ARP en ingles) altamente purificadas adecuadas para uso en medicina humana y veterinaria.

El genero de los alfavirus incluye una variedad de virus, todos los cuales son miembros de la familia de los Togaviridae. Los alfavirus incluyen virus de la encefalitis equina oriental (EEE), virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), virus de Everglades, virus de Mucambo, virus de Pixuna, virus de la encefalitis equina occidental (WEE), virus de Sindbis, virus del bosque Semliki, virus de Middleburg, virus de chikunguna, virus de O'nyong- nyong, virus del no Ross, virus del bosque Barmah, virus de Getah, virus de Sagiyama, virus de Bebaru, virus de Mayaro, virus de Una, virus de Aura, virus de Whataroa, virus de Babanki, virus de Kyzylagach, virus J de las Highlands, virus de Fort Morgan, virus de Ndumu y virus de Buggy Creek. El genoma vmco es un ARN monocatenario de sentido mensajero modificado en el extremo 5' con una caperuza metilada y en el extremo 3' con un tramo de poli(A) de longitud variable. Las unidades estructurales que contienen una unica protema vmca, la capsida, se asocian con el genoma de ARN en una nucleocapsida icosaedrica. En el virion, la capsida esta rodeada de una cubierta lipfdica cubierta con una disposicion regular de picos de protema de membrana, cada uno de los cuales consiste en un complejo heterodimerico de dos glicoprotemas, E1 y E2. Vease Pedersen et al., J. Virol. 14: 40 (1974). Los virus de Sindbis y del bosque Semliki se consideran los alfavirus prototfpicos y se han estudiado extensamente. Vease Schlesinger, “The Togaviridae and Flaviviridae”, Plenum Publishing Corp., Nueva York (1986). El virus VEE se ha estudiado extensamente, vease, p.ej. la patente de EE.UU. n° 5.185.440.

Los estudios de estos virus han conducido al desarrollo de tecnicas para vacunacion contra las enfermedades alfavmcas y contra otras enfermedades mediante el uso de vectores alfavmcos para la introduccion de genes ajenos. Veanse la patente de EE.UU. n° 5.185.440 de Davis et al. y la publicacion pCt WO 92/10578. El uso de los vectores alfavmcos para dirigir la expresion de genes ajenos en eucariotas se ha vuelto un tema de creciente interes. Es bien conocido que las vacunas vmcas vivas atenuadas estan entre los medios mas exitosos de control de enfermedades vmcas. Sin embargo, para algunos patogenos vmcos, la inmunizacion con una cepa de virus vivo puede ser impracticable o insegura. Una estrategia alternativa es la insercion de secuencias que codifican antfgenos inmunizantes de dichos agentes en una cepa viva replicante de otro virus. Uno de dichos sistemas que utiliza un vector VEE vivo se describe en las patentes de EE.UU. n° 5.505.947 y 5.643.576 de Johnston et al. Se describe otro de dichos sistemas por Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2679-2683 (1992), en el que constructos del virus de Sindbis expresan una forma truncada de protema hemaglutinina de la gripe. Es otro sistema el sistema de replicon alfavmco, como se describe en la patente de EE.UU. n° 6.190.666 de Garoff et al., las patentes de EE.UU. n° 5.792.462 y 6.156.558 de Johnston et al., las patentes de EE.UU. n° 5.814.482, 5.843.723, 5.789.245, 6.015.694, 6.105.686 y 6.376.236 de Dubensky et al.; la solicitud publicada de EE.UU. n° 2002-0015945 A1 (Polo et al.), la solicitud publicada de EE.UU. n° 2001-0016199 (Johnston et al.), Frolov et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11371-11377 y Pushko et al. (1997) Virology 239: 389-401.

Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad en la tecnica de metodos que permitan la produccion de partmulas alfavmcas infecciosas altamente inmunogenicas y derivados de las mismas con alta pureza y alto rendimiento, especialmente para uso en preparaciones de vacuna de alta pureza.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona proceso comercialmente factible de alto rendimiento compatible con las NCF para producir partmulas de replicon alfavmco (ARP) altamente purificado o preparaciones vmcas adecuadas para uso en medicina humana y veterinaria. La presente invencion es tambien aplicable a la produccion de vacunas alfavmcas atenuadas vivas y a composiciones inmunogenicas que contienen las mismas, pudiendo dichos alfavirus atenuados portar o no genes heterologos para expresion en la vacuna, como se describe en la patente de EE.UU. n° 5.643.576. El metodo de la presente invencion esta definido por las reivindicaciones adjuntas a esta descripcion. Un metodo adicional descrito en este documento comprende las etapas de (a) introducir un acido nucleico de replicon alfavmco (o un acido nucleico alfavmco) en una celula hospedadora, en la que dicho acido nucleico de replicon contiene al menos una senal de empaquetamiento en alfavirus y al menos una secuencia de codificacion de un gen o genes de interes expresables en dicho acido nucleico de replicon alfavmco, en la que la celula hospedadora es capaz de expresar protemas estructurales alfavmcas necesarias para producir ARP, para producir una celula hospedadora modificada; (b) cultivar dicha celula hospedadora modificada en un medio en condiciones que permitan la expresion de las protemas estructurales y la replicacion del acido nucleico de replicon alfavmco y empaquetar entonces el acido nucleico de replicon alfavmco formando ARP; (c) opcionalmente separar las celulas hospedadoras modificadas del medio, y (d) despues de la etapa (b) o (c) poner en contacto las celulas hospedadores modificadas

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con una solucion acuosa que tiene una fuerza ionica de al menos aproximadamente 0,20 M, o de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 5 M (en la presente memoria el “medio de liberacion”) para liberar las ARP en la disolucion acuosa para producir una disolucion que contiene ARP. La fuerza ionica del medio de liberacion puede conseguirse usando sales que no inactiven los viriones o ARP, y las sales adecuadas incluyen, pero sin limitacion, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de amonio, acetato de amonio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y bicarbonato de amonio. Ventajosamente, el medio de liberacion (lavado salino) comprende un tampon con un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, deseablemente de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5. Cuando las celulas no se separan del medio, puede elevarse la fuerza ionica del medio mediante la adicion de una sal solida o una disolucion salina concentrada, proporcionando la fuerza ionica aumentada para liberar las ARP (o viriones) de las celulas. El lavado salino de las celulas productoras con medio de liberacion parece mejorar la recuperacion de ARP, especialmente cuando hay cargas superficiales particulares en la superficie de las ARP; en el caso de VEE, los residuos aminoaddicos en E2-209 y/o E2-120 parecen proporcionar buenos sitios para introducir una carga positiva. Las sustituciones aminoaddicas que dan como resultado cambios de carga en ciertos mutantes de virus atenuados mejoran la recuperacion con lavado salino de ARP. El fosfato de sodio 16 mM, NaCl 0,5 M, es un medio de liberacion ejemplar usado en el lavado salino.

Las ARP o partmulas vmcas se producen en una celula que permita el empaquetamiento del acido nucleico del virus o replicon en partmulas infecciosas, concretamente en una celula permisiva de alfavirus. El vector de ARN de replicon alfavmco (o acido nucleico de replicon) puede derivar de VEE, virus de Sindbis, particularmente TR339, arbovirus sudafricano n° 86 y virus del bosque Semliki entre otros. Cuando se usa un acido nucleico de replicon, las funciones de empaquetamiento estan presentes en la celula en que se producen las partmulas, por un acido o acidos nucleicos introducidos en la celula en trans o ya presentes en la celula. Para algunos vectores de replicon alfavmco con ciertas secuencias de codificacion heterologas, los presentes inventores han observado que aumentar la relacion de acido nucleico colaborador de glicoprotema alfavmca mejora el empaquetamiento y/o rendimiento de ARP.

Ventajosamente, la celula en que se producen las ARP es una celula de mairnfero cultivada, pero son especialmente utiles celulas Vero, celulas de rinon de hamster recien nacido (BHK), fibroblastos de embrion de pollo (CEF), DF-1, 293, 293T, celulas de ovario de hamster chino (CHO) y celulas de insecto cultivadas. Las celulas de insecto cultivadas adecuadas disponibles incluyen, sin limitacion, celulas SF21, Spodoptera frugiperda; C6/36, Aedes albopictus; TRA-171, Toxorhynchites amboinensis; RML-12, Aedes aegypti; AP-61, Aedes pseudoscutellaris y MOS- 55, Anopheles gambiae.

Ventajosamente, las celulas en que se van a producir las ARP se sincronizan en la fase G2/M del ciclo celular antes de electroporacion con el acido o acidos nucleicos de vector de replicon alfavmco y colaborador. Sin desear ligarse a teona particular alguna, se cree que la mayor eficacia de electroporacion y transferencia de acido nucleico al nucleo (en aquellas realizaciones de la invencion que implican actividad nuclear) de la celula electroporada se consigue en dichas celulas en fase G2/M.

El acido nucleico de replicon alfavmco puede comprender una secuencia nucleortdica de interes para expresar en la celula hospedadora. La secuencia nucleortdica puede codificar un polipeptido inmunogenico, una citocina o una protema terapeutica, entre otros, o la secuencia nucleortdica puede transcribirse a la celula hospedadora produciendo un ARN funcional, tal como una ribozima, una molecula interferente o anticodificante. Si se usa un acido nucleico alfavmco, puede ser un virus de tipo silvestre, un virus recombinante que comprende una secuencia nucleortdica de interes como se describe anteriormente o puede ser un virus atenuado util para producir una respuesta inmunogenica en el hospedador.

Cuando se introducen el acido o acidos nucleicos de replicon vmco y/o colaborador por electroporacion, es especialmente eficaz electroporar las celulas cuando las celulas estan presentes a una concentracion de aproximadamente 107 a aproximadamente 109 celulas por ml, deseablemente de aproximadamente 5x107 a aproximadamente 1,5x108 por ml de medio de electroporacion, en presencia de suficiente acido o acidos nucleicos de replicon y colaborador para permitir un empaquetamiento eficaz. La molecula o moleculas de ARN colaborador no tienen que tener caperuza. En el metodo de la invencion, un vector de replicon alfavmco y una o mas moleculas de acido nucleico colaborador se introducen en celulas permisivas de alfavirus por electroporacion, en donde la concentracion de las celulas permisivas de alfavirus en medio de cultivo durante la electroporacion es de 5x107 a 5x108 celulas/mL y en donde la concentracion del vector de replicon de ARN alfavmco anadido a las celulas antes de la electroporacion es de aproximadamente 35 |ig por ml.

Despues de introducir el acido nucleico en las celulas en que se produciran las ARP, se disponen las celulas en recipientes de cultivo que contienen medio de crecimiento. Para aquellas celulas que crecen mejor como celulas adheridas, el recipiente comprende suficiente medio de crecimiento para permitir el crecimiento, replicacion de ARN de replicon, expresion de protema de empaquetamiento y produccion de pardcula de replicon vrtico, y suficiente area superficial para que estas celulas se adhieran y crezcan. La superficie puede ser paredes de recipiente, matraz o placa, o pueden disponerse en el recipiente fibras huecas, perlas u otros microportadores de material apropiado para el crecimiento de celulas adheridas. Las celulas Vero u otras celulas crecidas sobre microportadores (perlas o discos) pueden electroporarse exitosamente en los portadores y cultivarse, produciendo ARP a niveles comparables a los conseguidos con celulas no adheridas. Son tambien utiles las camaras de crecimiento de fibra hueca o “Cell

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cubes”. Despues de que las celulas hayan crecido y producido partmulas, tipicamente de aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas, se recolectan las partmulas. Las celulas pueden separarse del medio de crecimiento, preferiblemente prelavarse para retirar los desechos celulares y materiales externos y lavarse entonces con un pequeno volumen de medio de liberacion, con el resultado de que se liberan las ARP de las celulas y/o desechos celulares y pueden recuperarse en una disolucion purificada concentrada. Las partmulas pueden purificarse adicionalmente usando cualquiera de una serie de tecnicas bien conocidas en la tecnica, incluyendo pero sin limitarse a ella, cromatograffa de inmunoafinidad, cromatograffa de afinidad con heparina o cromatograffa de intercambio ionico y similares.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra la generacion de ARP usando ARN colaboradores con caperuza (barra izquierda de cada par) y ARN colaboradores sin caperuza (barra derecha de cada par) en diferentes tipos de celulas cultivadas. Se electroporaron las celulas con ARN de replicon con caperuza y moleculas de ARN colaborador con caperuza o sin caperuza. Se recogieron las ARP de los sobrenadantes de cultivo 24 despues de la electroporacion y se titularon en celulas Vero recientes.

La Figura 2 muestra el efecto del medio de crecimiento despues de electroporacion sobre el rendimiento de ARP. Los resultados se dan como tftulo en el medio de cultivo, tftulo en el lavado de NaCl 1 M de las celulas sedimentadas y tftulo total (medio mas lavado).

La Figura 3 muestra los efectos del pH del medio de crecimiento sobre el rendimiento de ARP. Se electroporaron celulas Vero usando un electrodo de placa Petri y se inocularon en matraces con medios de crecimiento completo ajustados a los valores de pH especificados.

La Figura 4 muestra el efecto de las diferentes disoluciones de lavado celular usadas justo antes de la elucion de las ARP con el medio de liberacion; se dan los detalles en el Ejemplo 7 a continuacion en la presente memoria.

La Figura 5 muestra el efecto de usar diferentes composiciones de sal en el medio de liberacion sobre el rendimiento de ARP. Las concentraciones y valores de pH de diversos medios de liberacion son como se muestran.

La Figura 6 muestra el rendimiento de ARP usando un intervalo de concentraciones de NaCl en el medio de liberacion.

Descripcion detallada de la invencion

Se proporcionan la siguiente discusion y definiciones para mejorar la claridad de la presente divulgacion para un especialista en la tecnica relevante.

En el contexto de la presente solicitud, nm significa nanometro, ml significa miftmetro, VEE significa virus de la encefalitis equina venezolana, EMC significa virus de la encefalomiocarditis, BHK significa celulas de rinon de hamster recien nacido, HA significa gen de hemaglutinina, GFP significa gen de protema fluorescente verde, N significa nucleocapsida, FACS significa clasificador celular activado por fluorescencia, IRES significa sitio de entrada de ribosoma interno, ufp significa unidades formadoras de placa, ui significa unidades infecciosas y FBS significa suero bovino fetal. La expresion “aminoacido de E2 numero (p.ej. Lys, Thr, etc.)” indica el aminoacido designado en el residuo designado de la protema E2, y se usa tambien para hacer referencia a aminoacidos en residuos espedficos en las protemas E3 o E1.

Como se usa en la presente memoria, el termino “alfavirus” tiene su significado convencional en la tecnica, e incluye las diversas especies tales como virus VEE, virus del bosque Semliki (SFV), virus de Sindbis, virus del no Ross, virus de la encefalitis equina occidental, virus de la encefalitis equina oriental, virus de chikunguna, S.A. AR86, virus de Everglades, virus de Mucambo, virus del bosque Barmah, virus de Middelburg, virus de Pixuna, virus de O'nyong- nyong, virus de Getah, virus de Sagiyama, virus de Bebaru, virus de Mayaro, virus de Una, virus de Aura, virus de Whataroa, virus de Banbanki, virus de Kyzylagach, virus J de las Highlands, virus de Fort Morgan, virus de Ndumu y virus de Buggy Creek. Los alfavirus preferidos usados en los constructos y metodos de la invencion reivindicada son VEE, S.A. AR86, Sindbis (p.ej. TR339, vease la patente de EE.UU. n° 6.008.035) y SFV.

Los terminos “secuencia de reconocimiento de replicacion alfavmca 5'” y “secuencia de reconocimiento de replicacion alfavmca 3'” hacen referencia a secuencias encontradas en alfavirus, o secuencias derivadas de las mismos, que se reconocen por las protemas replicasa alfavmcas no estructurales y conducen a la replicacion de ARN vftico. A veces se hace referencia a estas como los extremos 5' y 3' o las secuencias 5' y 3' alfavmicas. En los constructos descritos en la presente memoria, el uso de estos extremos 5' y 3' dara como resultado la replicacion de la secuencia de ARN codificada entre los dos extremos. La secuencia de reconocimiento de replicacion alfavmca 3' como se encuentra en alfavirus es ffpicamente de aproximadamente 300 nucleotidos de longitud, y contiene una secuencia de reconocimiento de replicacion 3' minima mejor definida. La secuencia de reconocimiento de replicacion 3' minima, conservada entre alfavirus, es una secuencia de 19 nucleotidos (Hill et al., J. Virology, 2693-2704, 1997). Estas secuencias pueden modificarse mediante tecnicas biologicas estandares para minimizar adicionalmente el

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potencial de recombinacion o introducir sitios de clonacion, con la condicion de que deben reconocerse por la maquinaria de replicacion alfavmca.

El termino “secuencia de reconocimiento de replicacion alfavmca 5' mmimo” hace referencia a la secuencia minima que permite el reconocimiento por las protemas no estructurales del alfavirus, pero que no da como resultado un empaquetamiento/recombinacion significativos de las moleculas de ARN que contienen la secuencia. En una realizacion preferida, la secuencia de reconocimiento de replicacion alfavmca 5' minima da como resultado una disminucion de 50 a 100 veces de la frecuencia observada de empaquetamiento/recombinacion del ARN que contiene esa secuencia. Puede valorarse el empaquetamiento/recombinacion de colaboradores mediante varios metodos, p.ej. el metodo descrito por Lu y Silver (J. Virol. Methods 2001, 91(1): 59-65).

Los terminos “replicon de ARN alfavmco”, “ARN de replicon alfavmco”, “replicon de vector de ARN alfavmco” y “ARN de replicon de vector” se usan intercambiablemente para hacer referencia a una molecula de ARN que expresa genes de protema no estructural de tal modo que puede dirigir su propia replicacion (amplificacion) y que comprende, como mmimo, secuencias de reconocimiento de replicacion alfavmca 5' y 3' (que pueden ser las secuencias mmimas, como se definen anteriormente, pero pueden ser como alternativa las regiones enteras del alfavirus), secuencias de codificacion de protemas no estructurales alfavmcas y un tramo de poliadenilacion. Puede contener adicionalmente un promotor o IRES. Puede genomanipularse tambien para expresar protemas estructurales alfavmcas. Johnston et al. y Polo et al. (citado en los antecedentes) describen numerosos constructos de dichos replicones de ARN alfavmco. Las realizaciones espedficas de replicones de ARN alfavmco utilizados en la invencion reivindicada pueden contener una o mas mutaciones atenuantes, siendo una mutacion atenuante una delecion, adicion o sustitucion nucleotfdica de uno o mas nucleotidos o una mutacion que comprende una redisposicion o construccion quimerica que da como resultado la perdida de virulencia en un virus vivo que contiene la mutacion, en comparacion con el alfavirus de tipo silvestre apropiado. Los ejemplos de sustitucion nucleotfdica atenuante (que da como resultado un cambio aminoaddico en el replicon) incluyen una mutacion en la posicion aminoaddica 538 de nsP1, la posicion aminoaddica 96 de nsP2, o la posicion aminoaddica 372 de nsP2 en el alfavirus S.A. AR86, y es un ejemplo de una mutacion atenuante en la region de no codificacion del acido nucleico de replicon la sustitucion de A o C en el nucleotido 3 de VEE.

Los terminos “protema o protemas estructurales alfavmcas” hacen referencia a una o una combinacion de protemas estructurales codificadas por alfavirus. Estas se producen por los virus como una poliprotema y se representan generalmente en la bibliograffa como C-E3-E2-6k-E1. E3 y 6k sirven como senales de translocacion/transporte de membrana para las dos glicoprotemas E2 y E1. Por tanto, el uso del termino E1 en la presente memoria puede hacer referencia a E1, E3-E1, 6k-E1 o E3-6k-E1, y el uso del termino E2 en la presente memoria puede hacer referencia a E2, E3-E2, 6k-E2 o E3-6k-E2. Pueden introducirse mutaciones atenuantes en una cualquiera o mas de las protemas estructurales alfavmcas.

El termino “colaborador o colaboradores” hace referencia a una molecula de acido nucleico que es capaz de expresar una o mas protemas estructurales alfavmcas.

Los terminos “celula colaboradora” y “celula de empaquetamiento” se usan intercambiablemente en la presente memoria y hacen referencia a la celula en que se producen las partmulas de replicon alfavmco. La celula colaboradora comprende un conjunto de colaboradores que codifican una o mas protemas estructurales alfavmcas. Como se da a conocer en la presente memoria, los colaboradores pueden ser ARN o ADN. La celula puede ser cualquier celula que sea permisiva de alfavirus, concretamente celulas que sean capaces de producir partmulas alfavmcas tras la introduccion de un transcrito de ARN vmco. Las celulas permisivas de alfavirus incluyen, pero sin limitacion, celulas Vero, de rinon de hamster recien nacido (BHK), 293, 293T, fibroblastos de embrion de pollo (CEF) y de ovario de hamster chino (CHO). En ciertas realizaciones de la invencion reivindicada, la celula colaboradora o de empaquetamiento puede incluir adicionalmente una ARN polimerasa dependiente de ARN heterologo y/o una protema espedfica de secuencia.

Los terminos “partmulas de replicon alfavmco”, “partmulas de replicon vmco” o “partmulas alfavmcas recombinantes”, usados intercambiablemente en la presente memoria, significan un complejo estructural de tipo virion que incorpora un ARN de replicon alfavmco que expresa una o mas secuencias de aRn heterologo. Tfpicamente, el complejo estructural de tipo virion incluye una o mas protemas estructurales alfavmcas embebidas en una cubierta lipfdica que encierra una nucleocapsida que, a su vez, encierra el ARN. La cubierta lipfdica deriva tfpicamente de la membrana plasmatica de la celula en que se producen las partmulas. Preferiblemente, el ARN de replicon alfavmco esta rodeado por una estructura de nucleocapsida que comprende la protema de capsida alfavmca, y las glicoprotemas alfavmcas estan embebidas en la cubierta lipfdica derivada de celula. Las protemas estructurales y ARN de replicon pueden derivar del mismo o diferentes alfavirus. En una realizacion espedfica, el ARN de replicon deriva de VEE y las protemas estructurales derivan del virus de Sindbis (vease, p.ej., Dubensky et al., patente de EE.UU. n° 6.376.236). Las partmulas de replicon alfavmco son infecciosas pero defectivas de propagacion, concretamente, el ARN de replicon no puede propagarse mas alla de la celula hospedadora en que se infectan inicialmente las partmulas en ausencia del acido o acidos nucleicos colaboradores que codifican las protemas estructurales alfavmcas.

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Los “constructos colaboradores”, concretamente moleculas de ADN recombinante que expresan las protemas estructurales alfavmcas, pueden generarse a partir de un unico colaborador que se resuelve en dos moleculas separadas in vivo. Por tanto, se conserva la ventaja de usar un unico colaborador en terminos de facilidad de fabricacion y eficacia de produccion, mientras que se adquieren las ventajas de un sistema colaborador bipartito en ausencia de empleo de un sistema de expresion bipartito. Puede usarse un constructo colaborador de ADN mientras que en un segundo conjunto se usa un vector colaborador de ARN. En el caso de constructos colaboradores de ADN que no empleen senales de reconocimiento alfavmcas para replicacion y transcripcion, la frecuencia teorica de recombinacion es menor que en los sistemas colaboradores de ARN bipartitos que emplean dichas senales.

Se emplea un promotor para dirigir la transcripcion de ARN a partir de ADN, concretamente una ARN polimerasa dependiente de ADN, para producir el replicon alfavmco y los acidos nucleicos colaboradores descritos en la presente memoria. En el presente contexto, un promotor es una secuencia de nucleotidos reconocida por una polimerasa y suficiente para causar la transcripcion de una secuencia asociada (en direccion 3'). El promotor puede ser constitutivo (vease a continuacion). Como alternativa, el promotor puede estar regulado, concretamente actuando no constitutivamente para causar la transcripcion de la secuencia asociada. Si es inducible, hay secuencias presentes que median la regulacion de la expresion de modo que la secuencia asociada se transcriba solo cuando (i) esta presente una molecula inductora en el medio en o sobre el que se cultivan las celulas, o (ii) se cambian las condiciones a las que estan expuestas las celulas para ser condiciones inductoras. En el presente contexto, una secuencia reguladoras de la transcripcion incluye una secuencia promotora y puede incluir adicionalmente secuencias activas en cis para la expresion regulada de una secuencia asociada en respuesta a senales ambientales.

En las realizaciones de colaborador de ARN y para producir el ARN de replicon, se utiliza el promotor para sintetizar ARN en una reaccion de transcripcion in vitro, y los promotores espedficos adecuados para este uso incluyen los promotores de ARN polimerasa SP6, T7 y T3. En las realizaciones de colaborador de ADN, el promotor funciona en una celula dirigiendo la transcripcion de ARN. Los promotores potenciales para la transcripcion in vivo del constructo incluyen promotores eucarioticos tales como promotores de aRn polimerasa II, promotores de ARN polimerasa III o promotores vmcos tales como LTR de MMTV y MoSV, la region temprana de SV40, RSV o CMV. Estan disponibles en la materia muchos otros promotores de mamffero y vmcos adecuados. Como alternativa, pueden emplearse promotores de ARN polimerasa dependientes de ADN de bacterias o bacteriofagos, p.ej., SP6, T7 y T3, para uso in vivo, proporcionandose a la celula la ARN polimerasa coincidente mediante un plasmido, vector de ARN o vector vmco separado. En una realizacion espedfica, la ARN polimerasa coincidente puede transformarse establemente en una estirpe celular colaboradora bajo el control de un promotor inducible.

Los constructos de ADN que funcionan en una celula pueden funcionar como plasmidos autonomos transfectados en la celula o pueden transformarse establemente en el genoma. En estas realizaciones, el promotor puede ser un promotor constitutivo, concretamente un promotor que, cuando se introduce en una celula y se liga operativamente con una secuencia en direccion 3', dirige la transcripcion de la secuencia en direccion 3' tras la introduccion en la celula, sin necesidad de adicion de moleculas inductoras o un cambio a condiciones inductoras. Como alternativa, el promotor puede ser inducible, de modo que la celula producira solo el ARN mensajero funcional codificado por el constructo cuando la celula se exponga al estfmulo apropiado (inductor). Cuando se usa un promotor inducible, se introducen los constructos colaboradores en la celula de empaquetamiento simultaneamente a, antes de o despues de la exposicion al inductor, y aparece la expresion de las protemas estructurales alfavmcas cuando estan presentes tanto constructos como inductor. Como alternativa, pueden introducirse en la celula los constructos disenados para funcionar en una celula mediante un vector vmco, p.ej. adenovirus, poxvirus, virus adenoasociados, SV40, retrovirus, nodavirus, picornavirus, virus de la estomatitis vesicular y baculovirus con promotores pol II de mairnfero.

Una vez esta presente en la celula colaboradora un transcrito de ARN (ARNm) que codifica los vectores colaborador o de replicon de ARN (por enfoques in vitro o in vivo, como se describen anteriormente), se traduce dado el caso para producir los polipeptidos o protemas codificados. En ciertas realizaciones, se transcribe el replicon de vector de ARN in vitro a partir de un plasmido de ADN y se introduce entonces en la celula hospedadora por electroporacion. En otras realizaciones, se transcribe el replicon de vector de ARN in vivo a partir de un plasmido de vector de ADN que se transfecta en la celula colaboradora (vease, p.ej., la patente de EE.UU. n° 5.814.482) o se suministra a la celula colaboradora mediante un virus o partfcula de tipo virus.

Se disena el replicon de vector de ARN alfavmco para expresar una o mas secuencias de codificacion heterologas o ARN funcional o funcionales de interes, a los que se hace referencia tambien en la presente memoria como ARN heterologo o secuencia heterologa, que pueden elegirse de una amplia variedad de secuencias derivadas de virus, procariotas o eucariotas. Los ejemplos de categonas de secuencias heterologas incluyen, pero sin limitacion, inmunogenos (incluyendo protemas, peptidos, epftopos o fragmentos inmunogenicos antigenicos nativos, modificados o sinteticos), citocinas, toxinas, protemas terapeuticas, enzimas, secuencias anticodificantes y moduladores de la respuesta inmunitaria.

Cualquier aminoacido que aparezca en las secuencias aminoaddicas a la que se hace referencia en la memoria descriptiva tiene sus abreviaturas habituales de tres y una letra usadas rutinariamente en la materia: A, Ala, alanina; C, Cys, cistema; D, Asp, acido aspartico; E, Glu, acido glutamico; F, Phe, fenilalanina; G, Gly, glicina; H, His,

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histidina; I, lle, isoleucina; K, Lys, lisina; L, Leu, leucina; M, Met, metionina; N, Asn, asparagina; P, Pro, prolina; Q, Gln, glutamina; R, Arg, arginina; S, Ser, serina; T, Thr, treonina; V, Val, valina; W, Try, triptofano; Y, Tyr, tirosina.

Como se usa en la presente memoria, la expresion dirigida por una secuencia particular es la transcripcion de una secuencia asociada en direccion 3'. Si es apropiado y deseado para la secuencia asociada, el termino expresion engloba tambien traduccion (smtesis de protema) del ARN transcrito o introducido. Como alternativa, pueden usarse diferentes secuencias para dirigir la transcripcion y traduccion.

Las celulas permisivas de alfavirus empleadas en los metodos de la presente invencion son celulas que, tras transfeccion con un transcrito de ARN vmico completo, son capaces de producir partmulas vmcas. Los alfavirus tienen un amplio intervalo de hospedadores. Los ejemplos de celulas de empaquetamiento adecuadas incluyen, pero sin limitacion, celulas Vero, celulas de rinon de hamster recien nacido (BHK), fibroblastos de embrion de pollo, DF-1, 293, 293T, celulas de ovario de hamster chino (CHO) y celulas de insecto.

Las frases “protema estructural” o “protema estructural alfavmca” como se usan en la presente memoria hacen referencia a una o mas de las protemas codificadas por alfavirus que son necesarias para empaquetar el replicon de ARN, e incluyen tfpicamente la protema de capsida, glicoprotema E1 y glicoprotema E2 en los alfavirus maduros (ciertos alfavirus, tales como virus del bosque Semliki, contienen una protema adicional, E3, en la cubierta madura). El termino “protema o protemas estructurales alfavmcas” hace referencia a una o una combinacion de protemas estructurales codificadas por alfavirus. Estas se sintetizan (a partir del genoma vmico) en forma de una poliprotema y se representan generalmente en la bibliograffa como C-E3-E2-6k-E1. E3 y 6k sirven como senales de translocacion/transporte de membrana para las dos glicoprotemas E2 y E1. Por tanto, el uso del termino E1 en la presente memoria puede hacer referencia a E1, E3-E1, 6k-E1 o E3-6k-E1, y el uso del termino E2 en la presente memoria puede hacer referencia a E2, E3-E2, 6k-E2 o E3-6k-E2.

Como se describe en la presente memoria, las protemas estructurales del alfavirus se distribuyen entre una o mas moleculas de acido nucleico colaborador (p.ej., un primer ARN (o ADN) colaborador y un segundo ARN (o ADN) colaborador)). Ademas, una o mas protemas estructurales pueden estar localizadas en la misma molecula que el acido nucleico de replicon, a condicion de que se elimine al menos una protema estructural del ARN de replicon de tal modo que el replicon y la partmula alfavmca resultante sean defectivos de replicacion. Como se usa en la presente memoria, los terminos “eliminado” o “delecion” significan la delecion total del segmento especificado o la delecion de una porcion suficiente del segmento especificado para volver el segmento inoperativo o no funcional, de acuerdo con la utilizacion estandar. Vease, p.ej., la patente de EE.UU. n° 4.650.764 de Temin et al. El termino “defectivo de replicacion” como se usa en la presente memoria es sinonimo de “defectivo de propagacion” y significa que las partmulas producidas en una celula hospedadora dada no pueden producir partmulas de progenie en la celula hospedadora debido a la ausencia de la funcion colaboradora, concretamente las protemas estructurales alfavmcas necesarias para empaquetar el acido nucleico de replicon. Sin embargo, el acido nucleico de replicon es capaz de replicarse a sf mismo y expresarse en la celula hospedadora en que se ha introducido.

La celula colaboradora, a la que se hace referencia tambien como celula de empaquetamiento, usada para producir las partmulas alfavmcas infecciosas defectivas de replicacion debe expresar o ser capaz de expresar protemas estructurales alfavmcas suficientes para empaquetar el acido nucleico de replicon. Las protemas estructurales pueden producirse a partir de un conjunto de ARN, tfpicamente dos, que se introducen en la celula colaboradora simultaneamente a o antes de la introduccion del vector de replicon. El primer ARN colaborador incluye ARN que codifica al menos una protema estructural alfavmca pero que no codifica todas las protemas estructurales alfavmcas. El primer ARN colaborador puede comprender ARN que codifica la glicoprotema E1 alfavmca pero que no codifica la protema de capsida alfavmca y la glicoprotema E2 alfavmca. Como alternativa, el primer ARN colaborador puede comprender aRn que codifica la glicoprotema E2 alfavmca pero que no codifica la protema de capsida alfavmca y la glicoprotema E1 alfavmca. En una realizacion adicional, el primer ARN colaborador puede comprender ARN que codifica la glicoprotema E1 alfavmca y la glicoprotema E2 alfavmca pero no la protema de capsida alfavmca. En una cuarta realizacion, el primer ARN colaborador puede comprender ARN que codifica la capsida alfavmca pero ninguna de las glicoprotemas alfavmcas. En una quinta realizacion, el primer ARN colaborador puede comprender ARN que codifica la capsida y una de las glicoprotemas, concretamente E1 o E2, pero no ambas.

En combinacion con uno cualquiera de estos primeros ARN colaboradores, el segundo ARN colaborador codifica al menos una protema estructural alfavmca no codificada por el primer ARN colaborador. Por ejemplo, cuando el primer ARN colaborador codifica solo la glicoprotema E1 alfavmca, el segundo ARN colaborador puede codificar una o ambas de la protema de capsida alfavmca y la glicoprotema E2 alfavmca. Cuando el primer ARN colaborador codifica solo la protema de capsida alfavmca, el segundo ARN colaborador puede incluir ARN que codifica una o ambas de las glicoprotemas alfavmcas. Cuando el primer ARN colaborador codifica solo la glicoprotema E2 alfavmca, el segundo ARN colaborador puede codificar una o ambas de la protema de capsida alfavmca y la glicoprotema E1 alfavmca. Cuando el primer ARN colaborador codifica tanto la capsida como la glicoprotema E1 alfavmca, el segundo ARN colaborador puede incluir ARN que codifica una o ambas de la protema de capsida alfavmca y la glicoprotema E2 alfavmca.

En todos los acidos nucleicos colaboradores, se entiende que estas moleculas comprenden adicionalmente las secuencias necesarias para la expresion (que engloban senales de traduccion y, cuando sea apropiado,

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transcripcion o replicacion) de las secuencias de protema estructural codificadas en las celulas colaboradoras. Dichas secuencias pueden incluir, por ejemplo, promotores (vmcos, procarioticos o eucarioticos, inducibles o constitutivos) y secuencias de reconocimiento de replicasa vmca 5' y 3'. En el caso de que los acidos nucleicos colaboradores expresen una o mas glicoprotemas, se entiende en la materia que estas secuencias se expresan ventajosamente con una secuencia lfder o senal en el extremo N de la region de codificacion de la protema estructural en los constructos de acido nucleico. La secuencia lfder o senal puede derivar del alfavirus, por ejemplo E3 o 6k, o puede ser una secuencia heterologa tal como un peptido senal de activador de plasminogeno de tejido o una secuencia sintetica. Por tanto, como ejemplo, el primer acido nucleico colaborador puede ser una molecula de ARN que codifica capsida-E3-E1, y el segundo acido nucleico colaborador puede ser una molecula de ARN que codifica capsida-E3-E2. Como alternativa, el primer ARN colaborador puede codificar la capsida sola, y el segundo ARN colaborador puede codificar E3-E2-6k-E1. Adicionalmente, la senal de empaquetamiento o “secuencia de encapsidacion” que esta presente en el genoma vmco no esta presente en todos los acidos nucleicos colaboradores. Preferiblemente, se elimina la senal de empaquetamiento de todos los acidos nucleicos colaboradores.

Estos ARN colaboradores pueden introducirse en las celulas de una serie de modos. Pueden expresarse a partir de uno o mas modulos de expresion que se han transformado establemente en las celulas, estableciendo asf estirpes celulares de empaquetamiento (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 6.242.259). Como alternativa, los ARN pueden introducirse como moleculas de ARN o ADN que pueden expresarse en la celula hospedadora sin integrarse en el genoma celular. Los metodos de introduccion incluyen electroporacion, vectores vmcos (p.ej. SV40, adenovirus, nodavirus, astrovirus) y transfeccion mediada por lfpido.

Es una alternativa a los multiples ARN colaboradores el uso de una unica molecula de ADN que codifica todos los polipeptidos necesarios para empaquetar el ARN de replicon vmco en partfculas de replicon alfavmco infecciosas. El ADN colaborador unico puede introducirse en la celula de empaquetamiento mediante cualquier medio conocido en la materia incluyendo, pero sin limitacion, electroporacion, transfeccion mediada por lfpido (lipofeccion), transfeccion vectorizada por virus (p.ej. adenovirus o SV-40) o mediada por fosfato. Preferiblemente, se introduce el ADN mediante los metodos basados en electroporacion de esta invencion. El ADN se electropora tfpicamente en celulas con una disminucion del voltaje y un aumento de la capacitancia, en comparacion con los necesarios para la captacion de ARN. En todas las electroporaciones, debe fijarse el valor de voltaje y capacitancia para evitar destruir la capacidad de las celulas de empaquetamiento (hospedadoras) de producir partfculas alfavmcas infecciosas. Como alternativa, puede incorporarse la funcion colaboradora, en este formato y bajo un promotor inducible, al genoma de la celula de empaquetamiento antes de la introduccion/expresion del replicon de vector de ARN, e inducirse entonces con el estfmulo apropiado justo antes de, simultaneamente a o despues de la introduccion del replicon de vector de ARN.

Ventajosamente, uno o mas de los acidos nucleicos que codifican las protemas estructurales alfavmcas, concretamente capsida, glicoprotema E1 y glicoprotema E2, o el constructo de replicon, contienen una o mas mutaciones atenuantes. Las frases “mutacion atenuante” y “aminoacido atenuante”, como se usan en la presente memoria, significan una mutacion nucleotfdica (que puede estar o no en una region del genoma vmco que codifica polipeptidos) o un aminoacido codificado por una mutacion nucleotfdica, que en el contexto de un virus vivo da como resultado una probabilidad disminuida de que el alfavirus cause enfermedad en su hospedador (concretamente, una perdida de virulencia), de acuerdo con la terminologfa estandar en la materia, vease p.ej. B. Davis, et al., “Microbiology” 156-158, (4a ed. 1990), tanto si la mutacion es una mutacion por sustitucion como una mutacion por delecion o adicion en fase. La frase “mutacion atenuante” excluye mutaciones que senan letales para el virus, a menos que se use dicha mutacion en combinacion con una mutacion “restablecedora” que vuelva el virus viable, aunque atenuado. Son conocidos en la materia metodos para identificar mutaciones atenuantes adecuadas en el genoma alfavmco. Olmsted et al. (1984; Science 225: 424) describe un metodo de identificacion de mutaciones atenuantes en el virus de Sindbis mediante seleccion para crecimiento rapido en cultivo celular. Johnston y Smith (1988; Virology 162:437) describen la identificacion de mutaciones atenuantes en VEE aplicando presion selectiva directa para una penetracion acelerada de celulas BHK. Se han descrito mutaciones atenuantes en alfavirus en la materia, p.ej., White et al. 2001 J. Virology 75: 3706; Kinney et al. 1989 Virology 70: 19; Heise et al. 2000 J. Virology 74: 4207; Bernard et al. 2000 Virology 276: 93; Smith et al. 2001 J. Virology 75: 11196; Heidner y Johnston 1994 J. Virology 68: 8064; Klimstra et al. 1999 J. Virology 73: 10387; Glasgow et al. 1991 Virology 185:741; Polo y Johnston 1990 J. Virology 64: 4438 y Smerdou y Liljestrom 1999 J. Virology 73:1092.

En ciertas realizaciones, el ARN de replicon comprende al menos una mutacion atenuante. En otras realizaciones espedficas, el acido o acidos nucleicos colaboradores incluyen al menos una mutacion atenuante. En realizaciones que comprenden dos moleculas de acido nucleico colaboradores, al menos una molecula incluye al menos una mutacion atenuante, o ambas pueden codificar al menos una mutacion atenuante. Como alternativa, el acido nucleico colaborador, o al menos uno del primer o segundo acidos nucleicos colaboradores, incluye al menos dos o multiples mutaciones atenuantes. Las mutaciones atenuantes apropiadas dependen del alfavirus usado. Por ejemplo, cuando el alfavirus es VEE, pueden seleccionarse las mutaciones atenuantes adecuadas del grupo consistente en los codones en posicion aminoaddica 76 de E2 que especifican un aminoacido atenuante, preferiblemente lisina, arginina o histidina, como aminoacido 76 de E2; los codones en posicion aminoaddica 120 de E2 que especifican un aminoacido atenuante, preferiblemente lisina, como aminoacido 120 de E2; los codones en posicion aminoaddica 209 de E2 que especifican un aminoacido atenuante, preferiblemente lisina, arginina o

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histidina, como aminoacido 209 de E2; los codones en posicion aminoaddica 272 de E1 que especifican una mutacion atenuante, preferiblemente serina o treonina, como aminoacido 272 de E1; los codones en la posicion aminoaddica 81 de E1 que especifican una mutacion atenuante, preferiblemente isoleucina o leucina, como aminoacido 81 de E1 y los codones en el aminoacido 253 de E1 que especifican una mutacion atenuante, preferiblemente serina o treonina, como aminoacido 253 de E1. Las mutaciones atenuantes adicionales incluyen deleciones o mutaciones de sustitucion en el dominio de escision entre E3 y E2 tales que la poliprotema E3/E2 no se escinda; esta mutacion en combinacion con la mutacion en E1-253 es una cepa atenuada preferida para uso en esta invencion. De forma similar, las mutaciones presentes en cepas de vacuna viva existentes, p.ej., la cepa TC83 (vease Kinney et al., 1989, Virology 170: 19-30, particularmente la mutacion en el nucleotido 3), se emplean ventajosamente tambien en las partmulas purificadas por los metodos descritos en este documento.

Cuando el alfavirus es el arbovirus sudafricano n° 86 (S.A. AR86), pueden seleccionarse las mutaciones atenuantes adecuadas del grupo consistente en los codones en la posicion aminoaddica 538 de nsP1 que especifican un aminoacido atenuante, preferiblemente isoleucina, como aminoacido 538 de nsP1; los codones en la posicion aminoaddica 304 de E2 que especifican un aminoacido atenuante, preferiblemente treonina, como posicion aminoaddica 304 de E2; los codones en posicion aminoaddica 314 de E2 que especifican un aminoacido atenuante, preferiblemente lisina, como aminoacido 314 de E2; los codones en posicion aminoaddica 376 de E2 que especifican un aminoacido atenuante, preferiblemente alanina, como aminoacido 376 de E2; los codones en la posicion aminoaddica 372 de E2 que especifican un aminoacido atenuante, preferiblemente leucina, como aminoacido 372 de E2; los codones en posicion aminoaddica 96 de nsP2 que especifican un aminoacido atenuante, preferiblemente glicina, como aminoacido 96 en nsP2 y los codones en la posicion aminoaddica 372 de nsP2 que especifican un aminoacido atenuante, preferiblemente valina, como aminoacido 372 de nsP2. Las mutaciones atenuantes adecuadas en realizaciones en las que se emplean otros alfavirus son conocidas por los especialistas en la materia.

Las mutaciones atenuantes pueden introducirse en el ARN efectuando mutagenesis dirigida a sitio en el ADNc que codifica el ARN, de acuerdo con procedimientos conocidos. Vease Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985). Como alternativa, pueden introducirse mutaciones en el ARN mediante reemplazo de los fragmentos de restriccion homologos en el ADNc que codifica ARN, de acuerdo con procedimientos conocidos, o en copias de ADNc usando metodos de reaccion en cadena de la polimerasa mutagenicos.

La presente invencion proporciona metodos mejorados para la preparacion de partfculas de replicon alfavmco infecciosas, defectivas de propagacion y altamente inmunogenicas con altos rendimientos. En las partfculas de replicon antivmco (ARP), se genomanipula un vector alfavmco, al que se hace referencia en la presente memoria como replicon, para contener y expresar uno o mas genes de interes, en que el gen de interes puede codificar, por ejemplo, un antfgeno, una quimiocina, una citocina, una ribozima o una enzima. El vector de replicacion alfavmco puede derivar de cualquier alfavirus, tales como el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), el virus de Sindbis, p.ej. la cepa TR339, el arbovirus sudafricano n° 86 y el virus del bosque Semliki, entre otros. Se introduce entonces el vector en celulas de cultivo que permiten la replicacion de alfavirus y en que se expresan tambien las protemas estructurales de los alfavirus, de modo que el vector se empaqueta por las protemas estructurales en ARP que se liberan dado el caso de la celula. La presente invencion es tambien aplicable a la preparacion y recoleccion de partmulas alfavmcas vivas atenuadas, incluyendo partmulas como se describen en la patente de EE.UU. n° 5.643.576, y cepas alfavmcas atenuadas usadas como vacunas contra alfavirus.

Debido a que los metodos tradicionales de produccion y recoleccion de ARP son caros, ineficaces y laboriosos, los presentes inventores examinaron diversos parametros para conseguir un rendimiento de ARP mejorado simplificando el proceso y disminuyendo el coste por ARP. El proceso novedoso implica innovaciones en las etapas de preparacion de acido nucleico, cultivo celular, manipulacion celular para producir las ARP, recoleccion de ARP y formulacion de ARP, y este proceso tiene el beneficio de aumentar los rendimientos de ARP y reducir el coste por ARP significativamente.

En todos los informes anteriores, se purificaban las ARP a partir del medio, o sobrenadante de cultivo, en que credan las celulas que producen las ARP. Sorprendentemente, cuando los presentes inventores lavaron las celulas productoras de ARP con una disolucion acuosa que contema una sal a una concentracion mayor que la empleada tipicamente en un medio de crecimiento normal, se liberaba un numero significativo de ARP infecciosas de las celulas y/o desechos celulares. Se comparo la inmunogenicidad de las ARP recolectadas despues de la etapa de lavado salino con la de las ARP elaboradas segun metodos conocidos, y la potencia de respuesta ante las ARP recolectadas con lavado salino era tan buena como mejor que la de las partmulas de ARP liberadas inicialmente en el medio antes del lavado salino.

En muchas aplicaciones, el uso del proceso de lavado salino para recolectar ARP, como se describe anteriormente, puede obviar la necesidad de recolectar ARP del medio de cultivo celular, debido al gran numero de partfculas retenidas por las celulas antes del lavado salino. La relacion de ARP presentes en el medio antes de un lavado salino con las ARP retenidas por las celulas y liberadas con un lavado salino puede ser de 1:1 a 1:400, dependiendo de los tipos celulares, condiciones de crecimiento celular y condiciones de lavado salino. En celulas Vero, la relacion es tfpicamente de al menos 1:3, mas comunmente de 1:10, 1:100 o 1:400 (vease la Figura 4), dependiendo del grado de optimizacion de los demas parametros de la invencion reivindicada.

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Por lo tanto, se dan a conocer en la presente memoria un metodo o metodos para preparar ARP que comprenden las etapas de (a) introducir un acido nucleico de replicon alfavrnco en una celula hospedadora, conteniendo dicho acido nucleico de replicon al menos una senal de empaquetamiento alfavmica y al menos una secuencia de codificacion de un gen o genes de interes expresables en dicho acido nucleico de replicon alfavrnco, en los que la celula hospedadora es tambien capaz de expresar protemas estructurales de alfavirus para producir ARP, para producir una celula hospedadora modificada; (b) cultivar dicha celula hospedadora modificada en un medio en condiciones que permitan la expresion de las protemas estructurales y replicacion del acido nucleico de replicon alfavrnco, y empaquetando entonces el acido nucleico de replicon alfavrnco para formar ARP; (c) separar las celulas hospedadoras modificadas del medio, y (d) poner en contacto las celulas hospedadoras modificadas despues de la etapa (c) con una solucion tamponada que tiene una fuerza ionica de al menos aproximadamente 0,20 M (en la presente memoria el “medio de liberacion”) para liberar las ARP y producir una disolucion que contiene ARP.

La etapa (d) se puede efectuar con una cualquiera de un numero de diferentes Medios de Liberacion, y el rendimiento de “lavado salino” de ARP (concretamente las ARP recolectadas en el medio del liberacion) sera en parte funcion de la duracion del tiempo que las celulas esten expuestas a medio de liberacion. Este periodo de tiempo puede ser de 1 minuto a varias horas; de 5 a 20 minutos es tfpico. En una realizacion preferida, se usa una disolucion de sal 0,5 M y se incuban las celulas en esta disolucion durante aproximadamente 5 minutos. La combinacion optima de concentracion salina en el medio de liberacion y tiempo de incubacion puede determinarse directamente por un especialista en la materia, y sera adicionalmente funcion del tipo celular y del dispositivo de soporte celular.

La sorprendente observacion de que muchas de las ARP se retienen por las celulas proporciona la oportunidad de lavar las celulas concienzudamente antes de la liberacion de las ARP de las celulas a una disolucion que contiene sal, reduciendo asf significativamente la necesidad de purificacion posterior de las ARP. Se usan eficazmente por tanto monocapas celulares como matriz de afinidad para las ARP.

Por tanto, las celulas se pueden cultivar como se describe en la etapa (b) anterior, en un contenedor tal como un matraz de cultivo celular, botella rotatoria, dispositivo de Cell-cube, recipiente de cultivo (incluyendo biorreactor y matraz de agitacion) con perlas para crecimiento celular adherido, o un dispositivo de fibra hueca, en que las celulas se dejan incubar de aproximadamente 12 a 48 horas, preferiblemente 16-24 horas, generando ARP. En caso de que se utilicen celulas de mairnfero, las celulas se adhieren tfpicamente a las superficies internas del contenedor u otro soporte solido incluyendo, pero sin limitacion, perlas, partmulas de poliestireno, fibras huecas y similares, y despues del periodo de incubacion necesario, se retira deseablemente el medio de cultivo (se decanta, aspira o similar) de las celulas y se reserva o desecha, separando asf las celulas hospedadoras modificadas del medio de cultivo celular. Como alternativa, pueden centrifugarse las celulas que crecen en cultivo en suspension para retirar las celulas del medio de crecimiento. Pueden lavarse entonces las celulas extensamente en una disolucion de “lavado celular”, que es un medio bajo en sal o que no contiene sal que contiene opcionalmente componentes adicionales para ayudar a retirar materiales externos, p.ej. una preparacion de ADNasa u otros productos qmmicos que retiran el ADN celular o proteinasas residuales. Es una ADNasa comercialmente disponible la benzonasa, una desoxirribonucleasa de Serratia marcescens disponible en Novagen/EMD Biosciences, Madison, WI (vease tambien la patente de EE.UU. n° 5.173.418). Puede incorporarse al medio despues de la electroporacion a una concentracion de aproximadamente 10 a aproximadamente 1.000 unidades/ml. Cuando la ADNasa, p.ej. benzonasa, se incorpora a la preparacion de ARP, se usa a una concentracion de 100 a 5.000 unidades por ml, deseablemente a aproximadamente 500 unidades por ml, con incubacion a 30 a 37°C durante 10 a 90 minutos, deseablemente aproximadamente 30 minutos. Se presentan en la Figura 4 ejemplos de medios de liberacion utiles (disoluciones de lavado celular para la liberacion de ARP unidas). Estos resultados indican que la disolucion de lavado celular puede optimizarse para cada combinacion de cepa alfavmca y celula para maximizar la retencion de las ARP (o partmulas alfavmcas) por el sustrato celular y minimizar su liberacion en el medio antes de la adicion del medio de liberacion. Al maximizar la retencion de ARP por las celulas, puede no ser eficaz ni economico recolectar los numeros mucho menores de partmulas presentes en el medio de cultivo celular.

Despues de este extenso lavado, se exponen entonces las celulas al medio de liberacion y se liberan las ARP en el medio a partir de las celulas hospedadoras. El Medio de Liberacion puede ser una disolucion acuosa que contiene al menos aproximadamente sal de 0,20 M, preferiblemente entre 0,25 M y 5 M, y es tfpicamente un volumen mucho menor que el volumen de medio en que se hicieron crecer las celulas, p.ej. una reduccion de volumen de 10 a 50 veces. Puede contener componentes adicionales tales como ADNasa (particularmente si no se uso en la disolucion de lavado celular) y estabilizantes, p.ej. HSA y sacarosa. La temperatura de la etapa de liberacion no es cntica, se han obtenido resultados similares a 4°C, temperatura ambiente y 37°C. Se obtienen resultados similares con lavados salinos (en medio de liberacion) de 10 a 30 min.

El medio de liberacion puede elaborarse a la fuerza ionica deseada con sales que incluyen, pero sin limitacion, NaCl, KCl, MaCl2, CaCl2, NH4Cl, sulfato de NH4, acetato de NH4 y bicarbonato de NH4. Deseablemente, el pH del medio de liberacion es compatible con el mantenimiento de la integridad celular, p.ej. de aproximadamente 6 a aproximadamente 9,0, o de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5. El uso de sales volatiles en el medio de liberacion tales como sales de amonio volatiles, especialmente acetato o bicarbonato de amonio, puede permitir liofilizar la disolucion que contiene ARP resultante, con el resultado de que se retira la sal de la preparacion de ARP concentrada.

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Se ensayaron en varias sales sus capacidades de facilitar la recoleccion y recuperacion de ARP de celulas Vero a las 16 h y 24 horas despues de la electroporacion. NaCl 1 M a pH 7,2, acetato de amonio 1 M a pH 7,35, bicarbonato de amonio 1 M a pH 7,4, cloruro de magnesio 1 M a pH 7,2, acetato de sodio 1 M a pH 7,35 y sulfato de amonio 1 M a pH 7,35 dieron todos resultados equivalentes y buenos. Aumentar la concentracion salina en el medio de liberacion de 0,5 a 5 M no afectaba al rendimiento de ARP. Usar una concentracion hacia la menor cantidad eficaz evitaba la necesidad de cargar grandes volumenes diluidos en los medios cromatograficos. Fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, fosfato de sodio 20 mM a pH 6,5, fosfato de sodio 50 mM a pH 7,2 y fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2 con 0,1% de Tween 80 no sernan para liberar eficazmente ARP de las celulas productoras. Se llevaron a cabo los lavados con medio de liberacion a 4°C, temperatura ambiente y 37°C; la temperatura de lavado no afectaba al rendimiento.

Se estudio tambien el efecto del medio en el que se disponen las celulas inmediatamente despues de la electroporacion, concretamente el medio despues de electroporacion. Vease el Ejemplo 3. Sorprendentemente, se obtuvieron buenos rendimientos usando medio exento de suero, a menudo equivalentes a medio que contiene suero, ofreciendo por tanto ventajas respecto a la seguridad potencial de los productos usados y tambien en la reduccion de la cantidad de protema potencialmente asociada a las celulas permisivas de alfavirus y partfculas vmcas o partfculas de tipo virus.

El medio de cultivo que puede separarse de las celulas despues de la etapa (b), como se ha descrito anteriormente, puede combinarse con la disolucion que contiene ARP descrita anteriormente en la presente memoria, y las ARP pueden purificarse de una vez a partir de estas dos fracciones anteriormente separadas. Como alternativa, las ARP pueden purificarse separadamente del medio de cultivo y combinarse entonces con las partfculas retiradas por lavado salino.

En general, todas las etapas de la invencion reivindicada, incluyendo el crecimiento de celulas antes de la produccion de ARP, pueden efectuarse en medio exento de suero.

Aunque son conocidos muchos metodos para la introduccion de moleculas de acido nucleico en celulas hospedadoras, es un metodo particularmente util la electroporacion. Los presentes inventores determinaron que se obteman rendimientos de ARP mejorados cuando estaban presentes tanto celulas como acidos nucleicos de aporte en las mezclas de electroporacion a concentraciones mayores que las anteriormente recomendadas o usadas.

Generalmente, la funcion de la electroporacion es usar un campo electrico para crear poros o aberturas en las membranas celulares suficientes para permitir la entrada de acidos nucleicos. Estan actualmente disponibles comercialmente muchos dispositivos en que electroporar celulas, incluyendo cubetas desechables (tfpicamente que contienen entre 0,8 y 4 ml de medio), electrodos de placa Petri y aparatos de circulacion u otras camaras de electroporacion. Hay extensas ensenanzas en la materia sobre la optimizacion de estos dispositivos para la electroporacion de celulas para efectuar una transformacion genetica, variando parametros tales como voltaje, duracion de pulso, geometna del dispositivo, potencia de campo requerida (que es funcion de cada tipo celular y depende del radio celular y de su voltaje de degradacion cntico) y distancia entre los electrodos. Adicionalmente, la densidad de las celulas es tambien un factor, y las recomendaciones de los fabricantes estan entre 1-5x106 celulas/ml para celulas Vero y NIH-3T3, y ligeramente mayor para celulas BHK y CHO, siendo ambas menores que las celulas Vero (veanse, p.ej., Multiporator® Cuvette Manual, Brinkmann, Westbury, NY; Genetronics, San Diego, CA (BTX Division) Protocols for the ElectroCell Manipulator (ECM®) o ElectroSquarePorator™; Parham, J. et al. 1999 CytoTechnology 28: 1-9). La materia ensena que las densidades celulares mayores que las recomendadas dan como resultado condiciones de campo no homogeneas en el medio de electroporacion, que pueden conducir a la fusion celular. Liljestrom y Garoff, J. Virology 65: 4107-4113, 1991, usaron la electroporacion para introducir un unico colaborador de ARN con caperuza y un ARN de replicon del virus del bosque Semliki en celulas BHK a una concentracion de 5x106 celulas/ml.

De forma similar, la concentracion de acidos nucleicos usada en la materia se ha determinado empmcamente y se recomienda generalmente que este entre 5-20 |jg de ADN por ml de tampon de electroporacion, consideradas cantidades mayores eficaces solo para acidos nucleicos grandes. Liljestrom y Garoff (1991) estudiaron el efecto de la concentracion de ARN en la electroporacion y resenaron que la eficacia de captacion no era linealmente dependiente de la concentracion de ARN y que 2 jg eran suficientes para obtener una eficacia de transfeccion del 100% en una electroporacion en cubeta.

En la presente invencion, se obtienen resultados mejorados (rendimiento de ARP por celula hospedadora) cuando se lleva a cabo la electroporacion usando celulas hospedadoras a una densidad celular en el medio de electroporacion de 5x107 a 5x108 celulas por ml. Como se ejemplifica espedficamente en la presente memoria, se lleva a cabo la electroporacion en una cubeta de electroporacion, pero pueden usarse tambien una placa Petri o un dispositivo de electroporacion con circulacion, estando ambos comercialmente disponibles. Pueden usarse otros tipos de electroporacion. Se obtuvieron resultados mejorados con concentraciones de celulas Vero de aproximadamente 1x107 a aproximadamente 5x108 por ml. Por ejemplo, con 108 celulas en una cubeta de 0,4 cm de paso, se han obtenido de 1010 a 1011 ARP a partir de un unico evento de electroporacion. Pueden obtenerse rendimientos equivalentes basados en celula y volumen escalando apropiadamente los parametros en otros dispositivos de electroporacion. Como alternativa, pueden usarse CHO, BHK, CEF, 293T y fibroblastos de embrion

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de pollo. Pueden usarse tambien celulas de insecto cultivadas, como se discute anteriormente en la presente memoria.

Con un intervalo de concentracion celular optimizado para electroporacion de replicon-colaborador, cada ARN colaborador de aporte esta presente a aproximadamente 10 a 50, deseablemente a aproximadamente 35 microgramos por ml (pg/ml), y el ARN de replicon esta presente a aproximadamente 10 a 150 pg/ml, deseablemente a aproximadamente 35 pg/ml. En el metodo reivindicado, la concentracion de vector de replicon de ARN alfavmco anadido a las celulas antes de la electroporacion es de aproximadamente 35 pg/ml. En otras realizaciones, se usan uno o mas colaboradores de ADN. La concentracion de colaborador o colaboradores de ADN usados en electroporacion es tfpicamente mayor que la usada para colaboradores de ARN, p.ej. entre 100 y 200 pg/ml. Usando colaboradores de ARN o ADN, la cantidad de replicon de ARN alfavmco anadida a las celulas antes de la electroporacion es de aproximadamente al menos 35 pg/ml.

Por tanto, se da a conocer en la presente memoria un metodo para preparar ARP que comprende introducir un vector de replicon alfavmco en un cultivo celular permisible de alfavirus mediante electroporacion, en el que la concentracion de las celulas en el medio de cultivo durante la electroporacion esta 5x107 y 5x108 celulas/ml de medio. Aunque los metodos preferidos de la invencion reivindicada implican el uso de un aRn de replicon que se introduce entonces en la celula, un enfoque alternativo que no forma parte de la invencion reivindicada es introducir el ARN de replicon a traves de una molecula de ADNc que codifica el ARN de replicon. Se hace referencia a veces a este enfoque como un sistema de iniciacion de vectores eucarioticos por capas (ELVIS), como se describe en las patentes de EE.UU. n° 5.814.482 y 6.015.686.

Las protemas estructurales alfavmcas producidas en la celula hospedadora pueden codificarse por una o mas secuencias de acido nucleico integradas establemente en el genoma de dicha celula hospedadora, o pueden introducirse en la celula hospedadora de forma transitoria, simultaneamente o antes de la introduccion del acido nucleico de replicon alfavmco. Deseablemente, las protemas estructurales alfavmcas proporcionadas en la celula hospedadora se expresan a partir de una o dos moleculas de acido nucleico (ARN o ADN) que codifican una protema de capsida alfavmca capaz de unirse a un acido nucleico de replicon alfavmco y al menos una glicoprotema alfavmca, en las que dicha glicoprotema alfavmca se asocia con el acido nucleico de replicon alfavmco y la protema de capsida. Cuando se anaden como acidos nucleicos mediante electroporacion, el uno o mas acidos nucleicos colaboradores pueden coelectroporarse con el ARN de replicon. En la practica del metodo de esta invencion con un unico acido nucleico colaborador, es un intervalo util para la relacion molar de ARN de replicon:acido nucleico colaborador entre 1:2 y 1:8, y es un intervalo util para la relacion molar de ARN de replicon:primer colaborador:segundo colaborador entre 1:2:2 y 1:5:5. Generalmente, puede optimizarse la concentracion de cada colaboradora por experimentacion rutinaria, y no es necesario ni esperado que ambos colaboradores se usen en cantidades equimolares, particularmente si un colaborador es una molecula de ARN y el otro colaborador es una molecula de ADN. Las cantidades de molecula o moleculas colaboradoras pueden aumentarse respecto a la cantidad de acido nucleico de replicon, pero independientemente entre sf en el caso de dos colaboradores, para determinar la concentracion de colaborador o colaboradores que genera la maxima concentracion de ARP. En una realizacion espedfica de un unico colaborador de ADN que expresa todas las protemas estructurales alfavmcas (p.ej., un colaborador que expresa todas las protemas estructurales de VEE es de aproximadamente 8,7 kb de longitud), es una relacion molar util de ARN de replicon:colaborador de ADN aproximadamente 1:6. De forma similar, se electroporaron 30 pg de vector de replicon de VEE que codifica la protema gag de VIH y 100-150 pg de colaborador de ADN (promotor de CMV) en celulas Vero para produccion de ARP. El ADN estaba altamente purificado para retirar los contaminantes toxicos y se concentro a aproximadamente 5 mg/ml antes de la electroporacion. Generalmente, es preferible concentrar el ADN a entre 1 y 8 mg/ml, preferiblemente entre 5 y 8 mg/ml. El colaborador de ADN esta presente en la mezcla de electroporacion a aproximadamente 20-500, deseablemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 300, por ejemplo a aproximadamente 150 pg por 0,8 ml de mezcla de electroporacion, que contiene deseablemente de aproximadamente 5x107 a aproximadamente 2x108 celulas, por ejemplo aproximadamente 1,2x108 celulas.

Es un aspecto del proceso eficaz de la presente invencion, para aquellas realizaciones que utilizan ARN de replicon y/o colaborador, llevar a cabo la transcripcion a partir del vector de ADN linealizado que codifica los acidos nucleicos de replicon y colaborador sin purificacion de ese ADN despues de su linealizacion por digestion con enzima de restriccion. Se desarrollo un protocolo para digestion con enzima de restriccion y transcripcion de ARN en el mismo tampon de transcripcion de ARN (reaccion acoplada). El rendimiento del ARN, si se calcula por peso de ADN de aporte, era 2-3 veces mayor en la reaccion acoplada en comparacion con los metodos anteriores en que se purifico el ADN despues de la linealizacion y antes de la transcripcion de ARN.

Proceden ahorros adicionales en costes, reactivos y esfuerzos que contribuyen a esta invencion del descubrimiento de que pueden usarse el o los ARN colaboradores sin caperuza en la reaccion de electroporacion. El Ejemplo 1 describe los experimentos que se llevaron a cabo para determinar la eficacia del o de los ARN sin caperuza para uso en electroporacion junto con un ARN de replicon (vease tambien la Figura 1).

Se examino si era necesaria una estructura de caperuza en los ARN colaboradores para que se replicaran y proporcionaran protemas estructurales con las que empaquetar los ARN de replicon (Ejemplo 1). Aunque no debena haber un requisito teorico de caperuza en los ARN colaboradores, los datos existentes de los laboratorios de los

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inventores, as^ como de otros laboratorios, indicaban que los colaboradores sin caperuza no funcionaban eficazmente (como mucho) cuando generaban ARP. No obstante, debido al gasto asociado a la caperuza de los ARN colaboradores y al potencial de aumentar significativamente el rendimiento de ARN de las reacciones de transcripcion si no se usaba el analogo de caperuza, se iniciaron estudios sobre el uso de colaboradores sin caperuza para generar ARP. Se electroporaron celulas Vero con ARN de replicon junto con ARN colaboradores con caperuza o sin caperuza. Sorprendentemente, se generaron ARP de tffulo equivalente con colaboradores de ARN con caperuza o sin caperuza (Figura 1), a condicion de que los colaboradores de ARN se purificaran suficientemente antes de la electroporacion. Se intento entonces la generacion de ARP con colaboradores sin caperuza en otros tipos celulares (celulas CHO, 293T y DF-1) para confirmar que este resultado no estaba limitado a las celulas Vero. Se usaron ARN colaboradores sin caperuza para generar ARP en celulas Vero, CHO, DF-1 y 293T. Las ARP generadas con colaboradores de ARN sin caperuza eran equivalentes en tftulo a las ARP generadas con colaboradores de ARN con caperuza en todos los tipos celulares ensayados (Figura 1). La capacidad de usar moleculas de ARN colaboradores sin caperuza permite significativos ahorros de costes en terminos de reactivos y rendimiento de ARN. En contraposicion, los rendimientos eran mayores para ARN de replicon con caperuza que para ARN de replicon sin caperuza. Las caperuzas pueden incluir la caperuza G, caperuza C, caperuza A, G metilada (m7G(5'ppp(5')pppG(5)A); G no metilada (G(5'ppp(5')A); ARCA (analogo de caperuza antiinverso, 3-O-Me- m7G(5')pppG(5); los reactivos de caperuza son bien conocidos en la materia y estan comercialmente disponibles, por ejemplo, en Promega, Madison, WI y Ambion, Austin, TX. El coste de la produccion de ARN disminuye significativamente debido a que el reactivo analogo de caperuza es un componente caro del proceso y porque cada reaccion de transcripcion procura mas ARN.

Al comparar los resultados con ARN purificados y no purificados en electroporacion, se determino que era necesaria una purificacion de ARN al menos parcial (usando kits comercialmente disponibles y metodos que incluyen, pero sin limitacion, cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa en columna de sflice o LiCl) para unos buenos rendimientos de ARP. La purificacion retira moleculas tales como EDTA, HEPES y TRIS (constituyentes comunes en la manipulacion de acido nucleico), que son conocidos por causar efectos perjudiciales sobre las eficacias de transfeccion obtenidas por electroporacion (vease, p.ej., el manual de instrucciones de Brinkmann Instruments), asf como los componentes del tampon de transcripcion usado para generar los ARN (vease el Ejemplo 2). Las preparaciones de acido nucleico usadas en la electroporacion estan preferiblemente a una relacion de A260/A280 de aproximadamente 1,7 a 1,9 y se suspenden en agua destilada antes de la electroporacion. La purificacion de ARN tiene la ventaja anadida de lograr una concentracion de las disoluciones de ARN. Con un menor volumen para la disolucion de ARN que se va a anadir a las celulas en el medio de electroporacion, pueden usarse mas celulas en la electroporacion. Sin desear ligarse a teona particular alguna, se cree que la retirada del cation de Mg divalente o la reduccion del cation divalente de Mg a una concentracion menor de 5 mM antes de la electroporacion mejora el rendimiento de ARP definitivo.

Puede usarse un unico colaborador de ADN para producir ARP cuando se electropora junto con el ARN de replicon alfavmco portador de la secuencia de interes. Aunque las electroporaciones de onda cuadrada y onda exponencial daban resultados similares, cuanto mayor es la pureza del colaborador de ADN mejor es el rendimiento de ARP. Se encontro que era preferible un menor voltaje (con una mayor capacitancia) para introducir eficazmente las moleculas de ADN en las celulas, en comparacion con introducir solo moleculas de ARN.

Despues de haber recogido las ARP de las celulas por lavado salino, y recogido opcionalmente del sobrenadante exento de celulas, pueden purificarse las ARP mediante una o mas etapas que incluyen, pero sin limitacion, cromatograffa de intercambio ionico y cromatograffa de afinidad con heparina. La cromatograffa de heparina parece funcionar con varias de las protemas estructurales alfavfficas mutantes atenuadas incorporadas a las ARP, pero no para las protemas estructurales del virus VEE 3000.

Es un alfavirus preferido para uso en la presente invencion el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE). Preferiblemente, la cepa de VEE usada para producir las ARP contiene al menos una mutacion atenuante. Como clase representativa de dichas mutaciones atenuantes, se disenaron primero como mutantes “de penetracion rapida” (Johnston y Smith, Virology 162: 437-443, 1988), muchos de los cuales se mostro despues que portaban mutaciones en la glicoprotema E2 que daban como resultado una carga positiva neta (Davis et al., Virology 183: 20-31, 1991) y confenan tambien una capacidad potenciada de unirse a glicosaminoglicanos, p.ej. sulfato de heparano (veanse tambien Klimstra, WB et al. 1998 72: 7357-7366; Bernard et al., Virology 276: 93-103, 2000). Son conocidas mutaciones similares en otros alfavirus, p.ej. Sindbis (Olmsted et al., Virology 148: 245, 1986; Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6771, 1986); es un mutante de VEE atenuado de union a heparina espedficamente ejemplificado la cepa 3014. Los virus, o las ARP derivadas de los mismos, que portan mutaciones que confieren la capacidad de union a glicosaminoglicanos son particularmente bien adecuados para purificacion usando la etapa de lavado salino, y pueden purificarse adicionalmente tambien usando cromatograffa de afinidad con heparina.

Las celulas colaboradoras, en el contexto de esta invencion, son celulas que, cuando estan presentes acidos nucleicos colaboradores y de replicon en las mismas, producen parffculas de replicon alfavmco. Pueden usarse tambien para empaquetar ARP celulas en que las funciones colaboradoras estan codificadas en una o mas secuencias integradas establemente. Puede introducirse el ADN o ARN mediante cualquier medio conocido en la materia que sea apropiado para el tipo particular de celula, incluyendo sin limitacion, transformacion, lipofeccion o electroporacion. Como alternativa, pueden usarse tambien las celulas transformadas establemente en que los genes

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estructurales necesarios para el empaquetamiento del acido nucleico de replicon en partmulas vmcas estan integrados en el genoma para preparar ARP usando los metodos dados a conocer en la presente memoria.

Se reconoce por los especialistas en la materia que las secuencias de codificacion pueden variar debido a la degeneracion del codigo genetico y la utilizacion de codones. Estan incluidas dentro del alcance de esta invencion todas las secuencias sinonimas que codifican el antigeno u otro polipeptido o protema de interes.

Adicionalmente, se reconoce por los especialistas en la materia que pueden aparecer variaciones alelicas en las secuencias de codificacion que no cambien significativamente la actividad de las secuencias aminoaddicas de los peptidos que codifican esas secuencias. Todas dichas secuencias de ADN equivalentes estan incluidas dentro del alcance de esta invencion y la definicion de promotor.

Son tecnicas estandares para clonacion, aislamiento, amplificacion y purificacion de ADN, para reacciones enzimaticas que implican aDn ligasa, ADN polimerasa, endonucleasas de restriccion y similares, y diversas tecnicas de separacion, aquellas conocidas y empleadas comunmente por los especialistas en la materia. Se describe una serie de tecnicas estandares en Sambrook et al. (1989) “Molecular Cloning”, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nueva York; Maniatis et al. (1982) “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nueva York; Wu (ed.) (1993) “Meth. Enzymol.” 218, Parte I; Wu (ed.) (1979) “Meth. Enzymol.” 68; Wu et al. (eds.) (1983) “Meth. Enzymol.” 100 y 101; Grossman and Moldave (eds.) “Meth. Enzymol.” 65; Miller (ed.) (1972) “Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York; Old y Primrose (1981) “Principles of Gene Manipulation”, University of California Press, Berkeley; Schleif y Wensink (1982) “Practical Methods in Molecular Biology”; Glover (ed.) (1985) “DNA Cloning” Vol. I y II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (eds.) (1985) “Nucleic Acid Hybridization”, IRL Press, Oxford, UK; Setlow y Hollaender (1979) “Genetic Engineering: Principles and Methods”, vol. 1-4, Plenum Press, Nueva Yorky Ausubel et al. (1992) “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene/Wiley, Nueva York, NY. Las abreviaturas y nomenclatura, cuando se emplearon, se consideran estandares en el campo y usadas comunmente en revistas profesionales tales como las citadas en la presente memoria.

Las formulaciones farmaceuticas, tales como vacunas u otras composiciones inmunogenicas, pueden comprender una cantidad inmunogenica de partmulas de replicon alfavmco infecciosas defectivas de propagacion o partmulas vivas atenuadas en combinacion con un portador farmaceuticamente aceptable. Una “cantidad inmunogenica” es una cantidad de partmulas alfavmcas infecciosas que es suficiente para provocar una respuesta inmunitaria en el sujeto al que se administra la formulacion farmaceutica. Se cree adecuada una cantidad de aproximadamente 104 a aproximadamente 109, especialmente de 106 a 108, unidades infecciosas o ARP por dosis, dependiendo de la edad y la especie del sujeto que se este tratando. Los portadores farmaceuticamente aceptables ejemplares incluyen, pero sin limitacion, agua esteril exenta de pirogenos y disolucion salina fisiologica esteril exenta de pirogenos. Los sujetos a los que pueden administrarse cantidades inmunogenicas de las partmulas alfavmcas infecciosas defectivas de replicacion de la presente invencion incluyen sujetos humanos y animales (p.ej., perro, gato, bovino, caballo, asno, raton, hamster, monos, conejillos de Indias, aves y huevos). La administracion puede ser por cualquier medio adecuado, tal como administracion intraperitoneal, intramuscular, intradermica, intranasal, intravaginal, intrarrectal, subcutanea o intravenosa.

Pueden incorporarse una o mas moleculas inmunopotenciadoras, tales como quimiocinas y/o citocinas, a las composiciones inmunogenicas que comprenden las partmulas de replicon alfavmco preparadas como se describe en la presente memoria. Como alternativa, las composiciones inmunogenicas pueden comprender partmulas de replicon alfavmco que dirigen la expresion de una o mas quimiocinas y/o citocinas en el paciente o animal al que se administra la composicion. Las quimiocinas y/o citocinas ejemplares incluyen, sin limitacion, interleucina 4, interleucina 12, interferon y, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos y ligando de FLT-3. Se entiende que la eleccion de la citocina y/o quimiocina puede variar segun la neoplasia, parasito o patogeno al que esta orientado la respuesta inmunitaria.

Las composiciones inmunogenicas que comprenden las ARP (que dirigen la expresion de la secuencia o secuencias de interes cuando se administran las composiciones a un ser humano o animal) producidas usando los metodos de la presente invencion pueden formularse mediante cualquiera de los medios conocidos en la materia. Dichas composiciones, especialmente vacunas, se preparan tfpicamente como inyectables, en forma de disoluciones o suspensiones lfquidas. Pueden prepararse tambien formas solidas adecuadas para disolucion o suspension en lfquido antes de la inyeccion. Son tambien adecuadas preparaciones liofilizadas.

Los ingredientes inmunogenicos activos (las ARP) se mezclan a menudo con excipientes o portadores que son farmaceuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados incluyen, pero sin limitacion, agua esteril, disolucion salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos, asf como estabilizantes, p.ej. HSA u otras protemas y azucares reductores adecuados.

Ademas, si se desea, las vacunas pueden contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH y/o coadyuvantes que potencien la eficacia de la vacuna. Los ejemplos de coadyuvantes que pueden ser eficaces incluyen, pero sin limitacion: hidroxido de aluminio, W-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP); W-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP

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11637, a la que se hace referencia como nor-MDP), W-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2-(1’-2’- dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)etilamina (CGP 19835A, a la que se hace referencia como MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extrafdos de bacterias: monofosforil-Kpido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de pared celular (MPL+tDm+CWS) en una emulsion de escualeno/Tween 80 al 2%. Puede determinarse la eficacia de un coadyuvante midiendo la cantidad de anticuerpos dirigidos contra el producto inmunogenico de la ARP resultante de la administracion del inmunogeno en vacunas que comprenden tambien diversos coadyuvantes. Pueden usarse tambien dichas formulaciones y modos de administracion adicionales como son conocidos en la materia.

Se administran las composiciones inmunogenicas (o biologicamente activas de otro modo) que contienen ARP de manera compatible con la formulacion de dosificacion, y en aquella cantidad que sea profilactica y/o terapeuticamente eficaz. La cantidad para administrar, que esta generalmente en el intervalo de aproximadamente 104 a aproximadamente 109 unidades infecciosas por ml en una dosis, depende del sujeto para tratar, la via mediante la que se administran la ARP, la inmunogenicidad del producto de expresion, los tipos de respuestas inmunitarias efectoras deseadas y el grado de proteccion deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo necesarias para administrar pueden depender del criterio del medico, veterinario u otro profesional sanitario y pueden ser caractensticas de cada individuo, pero dicha determinacion esta dentro de las habilidades de dicho profesional.

La vacuna u otra composicion inmunogenica pueden procurarse en un programa de dosis unica o dosis multiples. Es un programa de dosis multiples aquel en que el curso primario de vacunacion puede incluir de 1 a 10 o mas dosis separadas, seguido de otras dosis administradas en intervalos temporales posteriores segun sea necesario para mantener y/o reforzar la respuesta inmunitaria, p.ej. semanalmente o al cabo 1 a 4 meses para una segunda dosis y, si es necesario, una o varias dosis posteriores despues de varios meses/anos.

Se proporcionan los siguientes ejemplos con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la invencion como se reivindica en la presente memoria. Se pretende que cualquier variacion en los artmulos y metodos ejemplificados que se le ocurra al especialista entre dentro del alcance de la presente invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1. Parametros de ARN que afectan al rendimiento de ARP

A. Uso de ARN colaboradores sin caperuza en diversos tipos celulares Celulas 293T

Se hicieron crecer celulas 293T en medio DMEM con FBS al 10%. Se efectuo la electroporacion en una cubeta de 0,4 cm de paso con un electroporador de onda cuadrada BTX (Modelo 830; Genetronics, Inc., San Diego, CA) usando 4,8x107 celulas en PBS y 30 |jg de cada uno de los siguientes tres ARN (purificados usando el kit RNeasy Midi n° 75142, Qiagen Corp., Valencia, CA): colaborador de capsida de VEE, colaborador de glicoprotema de VEE y replicon de GFP de VEE. Se prepararon los ARN colaboradores mediante transcripcion in vitro con ("con caperuza”) o sin (“sin caperuza”) la adicion de nucleotido con caperuza G en la reaccion de transcripcion. En las reacciones que inclrnan el analogo de caperuza, se reducfa la concentracion de GTPr proporcionalmente. Se usaron 4 pulsos a 360

V con una longitud de pulso de 450 js. Despues de la electroporacion, se sembraron las celulas en matraces T-75 que conteman 25 ml de medios. Se recolectaron las ARP de los medios y se titularon en celulas Vero.

Celulas CHO

Se hicieron crecer celulas CHO en medio F-12 con FBS al 10%. Se efectuo la electroporacion en un electroporador de onda cuadrada BTX usando 1,2x107 celulas en PBS y 30 jg de cada uno de los siguientes tres ARN: colaborador de capsida de VEE, colaborador de glicoprotema de VEE y replicon de GFP de VEE. Se usaron cuatro pulsos a 580

V con una longitud de pulso de 450 js. Despues de la electroporacion, se sembraron las celulas en matraces T-75 que conteman 25 ml de medios. Se recolectaron las ARP de los medios y se titularon en celulas Vero.

DF-1 (pollo)

Se hicieron crecer celulas DF-1 en medio DMEM con FBS al 10%. Las condiciones eran como las descritas para celulas CHO.

Vero

Se hicieron crecer celulas Vero en medio EMEM con FBS al 10%. Las condiciones eran como las descritas para celulas CHO.

Se presentan los resultados en la Figura 1, que muestra las Ul/ml obtenidas cuando se usan ARN colaboradores sin caperuza frente a con caperuza en los tipos celulares indicados.

B. Efecto de la purificacion de ARN y la adicion de caperuza sobre el rendimiento de ARP

En un experimento que emplea un ARN de vector de replicon que codifica gag de VIH y dos ARN colaboradores que codifican los genes de capsida y glicoprotema de VEE, se efectuaron las reacciones de transcripcion in vitro usando un kit comercialmente disponible en Promega Corporation (Madison, WI; n° de cat. P1300). Se anadio G con 5 caperuza a la reaccion de transcripcion para preparar ARN colaboradores con caperuza y de replicon, y se redujo la concentracion de GTPr a 1,4 mM en comparacion con los demas NTPr. Para preparar ARN colaborador sin caperuza, se usaron los cuatro NTPr a concentraciones equimolares. Se logro la purificacion de ARN usando el sistema de aislamiento de ARN total Promega SV (Promega Corp., Madison, WI; n° de catalogo Z3100, una resina de sflice) y eluyendo el ARN con agua exenta de ARNasa. Son tambien adecuados otros metodos de purificacion de 10 ARN, tales como cromatograffa de exclusion por tamano, pero es un parametro clave usar un metodo que genere una disolucion de ARN concentrada muy pura, concretamente de al menos 0,5 pg/pl, preferiblemente al menos 2-3 |jg/|jl. Se determinaron las concentraciones de los ARN purificados usando un espectrofotometro, mientras que se estimo la concentracion de ARN no purificados (obtenidos usando la reaccion de transcripcion directamente) operando con una alfcuota de 1 pl en gel de formaldehndo con alfcuotas de cantidades de ARN conocidas.

15 Se electroporaron cantidades iguales de cada uno de los ARN colaboradores, 5 o 30 pg, con caperuza o sin caperuza, en 1,2x107 celulas Vero en un volumen final de 800 pl usando una cubeta de electroporacion de 0,4 cm de paso (4 pulsos a 580 V, 25 pF), junto con 30 pg de ARN de vector de replicon que codifica gag de VIH. Despues de la electroporacion, se sembraron las celulas en un matraz T75 con 25 ml de HyQMEM + FBS al 10% y se incubaron durante una noche a 37°C y 5% de CO2. Se recolectaron las ARP a las 24 horas, se filtraron y se titularon en celulas 20 Vero. Se presentan los resultados en la Tabla 1.

Tabla 1. Parametros de ARN

Cantidad de ARN

^ARN purificado? ^ARN con caperuza? Rendimiento de ARP

5 pg

No Sf 3,84 x 103

5 pg

No No 4,27 x 102

5 pg

Sf Sf 2,77 x 105

5 pg

Sf No 4,27 x 103

30 pg

No Sf 2,56 x 104

30 pg

No No 1,07 x 103

30 pg

Sf Sf 2,13 x 106

30 pg

Sf No 2,56 x 106

La purificacion del ARN (tanto ARN de colaboradores como de replicon de vector) antes de la electroporacion en celulas mejora drasticamente el rendimiento de ARP (comparar las filas 1 y 2 con 3 y 4 y las filas 5 y 6 con 7 y 8). Ademas, con el uso de ARN purificado, la adicion de caperuza a los aRn colaboradores no es necesaria a las 25 concentraciones de ARN mayores (comparar la fila 1 con la fila 2, 3 con 4, 5 con 6 y 7 con 8).

Se obtuvieron resultados similares usando ARN colaborador o colaboradores sin caperuza con un vector de replicon alfavmco en que se inserto una secuencia que codifica PSMA (antfgeno de cancer de prostata).

Ejemplo 2. Parametros clave en la purificacion de ARN

Se prepararon ARN de replicon y colaborador como se describe en el Ejemplo 1. Para electroporacion, se 30 combinaron 30 pg de cada ARN de replicon y colaborador en tubos de microcentnfuga exentos de ARNasa. Los tubos de control teman ARN purificados o no purificados solos, mientras que los tubos restantes recibieron adicionalmente tampon de reaccion de transcripcion 5x [HEPES-KOH 400 mM (pH 7,5); MgCh 120 mM; espermidina 10 mM y DTT 200 mM), enzima de restriccion Not I, mezcla enzimatica T7 (ARN polimerasa dependiente de ARN de T7, inhibidor de ARNasa, pirofosfatasa) o combinaciones de estos tres. Las concentraciones finales de cada 35 componente de la reaccion de transcripcion eran aproximadamente equivalentes a la de un volumen igual de ARN no purificado. Se anadieron 1,2x107 celulas Vero a cada tubo de microcentnfuga y se transfirio la mezcla a una cubeta de electroporacion de 0,4 cm de paso. Se sometieron a pulsos las celulas 4 veces a 580 V y 25 pF y se dejaron recuperar a temperatura ambiente durante 10 min. Se sembraron las celulas electroporadas en matraces T75 que conteman 25 ml de HyQMEM con suero fetal bovino al 10% y antibioticos. Se sembraron alfcuotas en 40 placas de 96 pocillos para analisis de las eficacias de electroporacion.

Se fijaron celulas Vero en placas de 96 pocillos con MeOH y se analizo la expresion de protema de replicon o colaborador mediante ensayo de inmunofluorescencia (IFA). Las eficacias de los ARN purificados eran mayores del 90% para los tres ARN, mientras que las eficacias de los controles de ARN no purificados eran de 50% o menos. La adicion de Not I o mezcla enzimatica T7 sola a ARN purificados tema de poco a ningun efecto sobre las eficacias de 45 electroporacion. La adicion de tampon de transcripcion solo o en combinacion con otros componentes de la reaccion de transcripcion disminma las eficacias de electroporacion al 10% o menos.

Se recogio el medio de cultivo de matraces T7 y se filtro para retirar los desechos celulares. Se determino el rendimiento de ARP de cada electroporacion titulando en celulas Vero en placas de 96 pocillos. Como se muestra en la Tabla 2, los rendimientos de ARP usando ARN no purificados disminuyeron en dos unidades logantmicas en

comparacion con los rendimientos usando ARN purificados. Not I o la mezcla enzimatica T7 no teman un efecto significativo sobre los rendimientos de ARP cuando se anad^an a ARN purificados solos; sin embargo, la adicion de tampon de reaccion de transcripcion de T7 en cualquier combinacion daba como resultado una disminucion de 4 unidades logantmicas o mayor de los rendimientos de ARP en comparacion con ARN purificados.

5 Estos resultados sugieren que uno o mas componentes del tampon de la reaccion de transcripcion pueden tener un efecto negativo sobre las eficacias de electroporacion y en ultima instancia sobre el rendimiento de ARP. La disminucion significativa de los rendimientos de ARP cuando se anade tampon de transcripcion de T7 a ARN purificado en comparacion con ARN no purificados que contienen tampon de transcripcion de T7 sugiere que el efecto es cuantitativo, puesto que la concentracion de componentes del tampon era mayor en la muestra de ARN 10 purificado.

Tabla 2. Efecto de la manipulacion de ARN sobre el rendimiento de ARP

ARN

Componente de transcripcion in vitro Rendimiento de ARP

Purificado

Ninguno 1,4 x 10'

No purificado

Ninguno 1,1 x 105

Purificado

1x tampon LDD*

Purificado

Enzima Not I 1,9 x 10'

Purificado

Mezcla enzimatica T7 3,2 x 10b

Purificado

1x tampon + enzima Not I LDD

Purificado

1x tampon + mezcla enzimatica T7 LDD

Purificado

Enzima Not I + mezcla enzimatica T7 1,4 x 10'

Purificado

1x tampon, Not I, mezcla enzimatica T7 LDD

*LDD= en o por debajo del lfmite de deteccion (aprox. 2,1 x 103 ARP/ml)

Ejemplo 3. Efecto de las condiciones de electroporacion sobre el rendimiento de ARP

En experimentos iniciales con la electroporacion de ciertas estirpes celulares para electroporacion, por ejemplo con celulas 293T y CEF, se observo que podfan obtenerse mayores rendimientos de ARP aumentando la concentracion 15 de celulas en la mezcla de electroporacion, manteniendo la misma cantidad de acidos nucleicos de aporte.

A. Experimento 1

Se resuspendieron celulas Vero a la concentracion indicada en PBS en una cubeta de 0,4 cm de paso, con 30 |jg de ARN de replicon (que codifica un antfgeno de tumor canceroso), 26,8 jg de colaborador de ARN de capsida de VEE y 55,6 jg de colaborador de ARN de glicoprotema de VEE. Despues de la electroporacion, se sembraron las celulas 20 en uno o mas matraces, segun fuera necesario, a una densidad de 1,4x105 celulas/cm2 de area de crecimiento con aproximadamente 0,3 ml de medios de crecimiento por cm2. 23 horas despues de la electroporacion, se recogieron los medios de cada matraz y se lavaron las monocapas celulares con aproximadamente 10 ml de medios exentos de suero. Se anadio esta disolucion de lavado a los medios recogidos de cada matraz. Se efectuo entonces un lavado salino en cada matraz usando NaCl 0,5 M durante 10 minutos. Se recogio el lavado salino y se analizo 25 separadamente. Cuando estuviera indicado, se efectuo un segundo lavado salino y se analizo separadamente. Se presentan en la Tabla 3 los rendimientos de ARP como el numero total de partfculas obtenidas de una unica cubeta de electroporacion.

Tabla 3. Parametros de lavado y rendimiento de ARP

Concentracion celular en celulas/ml; unidad relativa

Volumen de medios o lavado salino Rendimiento de ARP Rendimiento de ARP total (lavado salino + medios)

3 x 10' 2x

50 ml de medios 9,0 x 10'

10 ml de lavado salino 6,9 x 108 ',8 x 108

9 x 10' 6x

150 ml de medios 6,2 x 108

30 ml de lavado salino n° 1 1,1 x 109

30 ml de lavado salino n° 2 4,5 x 108 2,2 x 109

1,2 x 108 8x

225 ml de medios 3,2 x 108

30 ml de lavado salino n° 1 2,4 x 109

30 ml de lavado salino n° 2 1,2 x 109 3,9 x 109

1,5 x 108 10x

300 ml de medios 4,8 x 108

60 ml de lavado salino n° 1 3,8 x 109

60 ml del lavado salino n° 2 1,4 x 109 5,' x 109

Por tanto, un aumento de 5 veces de la concentracion celular, sin ningun aumento de la cantidad de ARN usada en 30 la electroporacion, da como resultado un aumento de casi 10 veces del rendimiento de ARP.

B. Empaquetamiento de ARP con un unico colaborador de ADN

Se resuspendieron celulas Vero en medio exento de suero InVitrus a las densidades celulares indicadas. Se electroporaron las celulas usando 30 jg de un ARN de replicon de gag de VIH de VEE y 100-150 jg de colaborador

17

de ADN de VEE que expresa todas las protemas estructurales de VEE bajo un promotor CMV. Se purifico el colaborador de ADN y se concentro a al menos 5 mg/ml antes de usar en electroporacion.

Despues de la electroporacion, se incubaron las celulas durante 10 minutos a temperatura ambiente y se transfirieron entonces a 4 ml de OptiPro, que se dividio entonces equitativamente en dos matraces T300 que 5 conteman cada uno 100 ml de OptiPro. Se incubaron las celulas durante una noche a 37°C y 5% de CO2. Se

recolectaron las ARP aspirando en primer lugar los medios de las celulas y pasandolos a traves de un filtro de 0,2 pm a un envase esteril. Se lavaron las celulas en el matraz durante 5 minutos a temperatura ambiente con 10 ml de una disolucion de NaCl 1 M en NaPi 20 mM, pH 7,2-7,4. Se transfirio el lavado salino al filtro usado y se incubo durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se paso este lavado salino a traves del filtro a un envase limpio y 10 separado de los medios. Se mantuvieron y titularon separadamente medios y lavado salino. Las UI totales, resenadas en la Tabla 4, representan la suma de lavado salino y medios; generalmente, los medios conteman un numero insignificante de ARP en comparacion con el lavado salino. Se obtuvieron resultados similares usando una disolucion de lavado salino de NaCl 0,5 M.

C. Experimento 3

15 Se uso un Cell Cube de Corning (Corning, Inc., Acton, MA) para hacer crecer una gran cantidad de celulas. Se efectuo una unica electroporacion usando 5x108 celulas Vero en una cubeta de electroporacion de 1 cm de paso. Se electroporaron 150 pg de cada uno de replicon de VEE (que codifica gag de VIH), colaborador de capsida de VEE y colaborador de glicoprotema de VEE en las celulas usando 4 pulsos a 1150 V, 25 pF en un electroporador Bio-Rad (Gene Pulser II, BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA; n° de catalogo 165-2105). Despues de la electroporacion, 20 se sembraron las celulas en 5 matraces T-300 que conteman 100 ml de OptiPro SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA; n° de catalogo 12309019). 24 horas despues de la electroporacion, se recogieron los medios de cada matraz y se combinaron para titulacion. Se efectuo entonces un lavado salino en cada matraz usando 20 ml de NaCl 1,0 M en cada matraz, y se combinaron los lavados salinos para titulacion. El rendimiento total de ARP en los medios era de 1x108 u.i.; el rendimiento total de ARP en el lavado salino era de 2,2x1011 u.i.

25 Ejemplo 4. Parametros de cultivo despues de electroporacion

A. Medio de crecimiento despues de electroporacion

En los informes anteriores de produccion de ARP, se siembran las celulas en medio que contiene FBS al 10% despues de la electroporacion. Para examinar los efectos del suero sobre el rendimiento de ARP, se sembraron celulas en diferentes medios con concentraciones variables de suero. Un medio despues de electroporacion optimo 30 no requerina el uso de suero y tendna una baja concentracion de protema. Se examinaron los medios con contenidos rebajados de suero asf como tres medios exentos de suero para uso en electroporaciones de alta densidad celular: medio exento de suero OptiPro, Gibco Cell Culture/Invitrogen, San Diego, CA; VP-SFM, medio exento de suero VP, Gibco Cell Culture/Invitrogen, San Diego, CA; Ex-Cell 505, JRH Biosciences, Lenexa, KS y medio de cultivo celular definido qmmicamente InVitrus, (Cell Culture Technologies GmbH, Zurich, CH; n° de 35 catalogo IVT). Todos estos medios tienen un pH tamponado entre 7,0 y 7,4. Se electroporaron celulas Vero con ARN colaborador y de replicon. Se dividio la mezcla de electroporacion entre 8 matraces T-75 que conteman diferentes medios. Se cultivaron las celulas durante 18-24 horas a 37°C. El analisis de los rendimientos de ARP revelo que pueden reducirse los niveles sericos en EMEM de 10 a 1% sin disminucion significativa de los rendimientos de aRp. Tambien el medio OptiPro dio rendimientos de ARP equivalentes a aquellos en EMEM + FBS al 10%. OptiPro, que 40 esta exento de protemas humanas y/o animales, dio rendimientos de ARP equivalentes a los obtenidos usando EMEM + FBS al 10% para varias ARP diferentes. Los medios exentos de suero utiles para el crecimiento despues de la electroporacion incluyen varios medios comercialmente disponibles.

B. Efecto del pH del medio de crecimiento despues de la electroporacion

Se examino tambien el efecto del pH del medio de crecimiento despues de la electroporacion sobre el rendimiento 45 de ARP. Se electroporaron celulas Vero en un aparato de electrodo de placa Petri y se inocularon almuotas en medio de crecimiento completo ajustado al pH de interes. Se muestran los resultados en la Figura 4.

C. Cartuchos de fibra hueca para crecimiento celular despues de la electroporacion

Se ha descubierto que las celulas electroporadas se adhieren subitamente a fibras de polisulfona, tales como aquellas del cartucho FiberCell HF (Fibercell Systems, Inc.; Frederick, MO; n° de catalogo: 4300-C2011). Disponer 50 las celulas electroporadas en una fibra hueca proporciona ventajas para recolectar las ARP producidas por las celulas en las fibras huecas. El volumen final en que pueden eluirse las ARP puede ser tan bajo como de 40 ml (usando un cartucho pequeno que puede contener 109 celulas) a 100 ml (cartucho mayor que puede contener 5x1010 celulas).

Tabla 4. Densidad celular y rendimiento de ARP

Densidad de celulas Vero en la cubeta de electroporacion (celulas/ml)

Rendimiento de ARP (UI totales)

2,5 x 10'

6,5 x 108

5,0 x 10'

9,5 x 108

5

10

15

20

25

30

35

Densidad de celulas Vero en la cubeta de electroporacion (celulas/ml)

Rendimiento de ARP (UI totales)

7,5 x 10'

3,6 x 109

1,0 x 108

3,45 x 109

1,3 x 109

6,4 x 109

Ejemplo 5. Efecto de la concentracion de ARN colaborador sobre los rendimientos de ARP

Se efectuo la electroporacion en una cubeta de 0,4 cm de paso usando 1x108 celulas Vero. Cada electroporacion inclma 30 |jg de cada uno de ARN de replicon de VEE de gag de VIH y colaborador de glicoprotema de VEE; la concentracion de colaborador de capsida de VEE variaba como se indica. Se efectuo la electroporacion en un instrumento Bio-Rad usando las siguientes condiciones: 4 pulsos a 580 V, 25 jF (longitud de pulso resultante: aprox. 0,8 ms). Se sembraron las celulas en 50 ml de EMEM + fBs u OptiPro, como se indica, en matraces T175. 24 horas despues de la electroporacion, se recolecto el medio de cada matraz y se filtro. Se anadieron 5 ml de NaCl 1 M a cada matraz y se dejaron incubar con las celulas adheridas durante 5 minutos. Se retiro entonces la disolucion de lavado salino y se filtro a traves del mismo filtro usado para el medio anteriormente recogido.

Tabla 5. Concentracion de ARN, medio y rendimiento de ARP

Medios Lavado salino

30 jg de ARN de capsida/EMEM + FBS

2,20 x 109 9,70 x 10IU

30 jg de ARN de capsida/Optipro

2,12 x 109 9,10 x 10m

90 jg de ARN de capsida/Optipro

3,12 x 109 7,70 x 10m

80 jg de ARN de capsida/Optipro

4,80 x 108 8,00 x 10™

30 jg de ARN de capsida truncado/Optipro

1,50 x 109 9,00 x 10m

90 jg de ARN de capsida truncado/Optipro

2,36 x 109 8,30 x 10m

Ejemplo 6. Colaborador de ADN y condiciones de electroporacion

Tfpicamente, se necesitan cantidades mayores de ADN y condiciones de electroporacion algo diferentes para obtener la electroporacion eficaz de colaboradores de ADN en celulas Vero, en comparacion con las cantidades y condiciones usadas para colaboradores de ARN. Por ejemplo, se electroporan los colaboradores de ADN usando 250 V, 950 jF o 2-3 pulsos (30 ms) a 250 V, 800 jF, mientras que se electroporan los colaboradores de ARN usando 580 V, 25 jF (cuatro pulsos).

Como con el ARN, el colaborador de ADN (o colaboradores) se purifican deseablemente antes de la electroporacion. Se llevo a cabo la electroporacion en una cubeta de electroporacion de 0,4 cm de paso con 1x108 celulas Vero y un unico colaborador de aDn que codifica todas las protemas estructurales de VEE usando dos dispositivos de electroporacion diferentes. La primera maquina proporciona un pulso de voltaje inicial que decae exponencialmente. Usando 100 o 150 jg de ADN (de una disolucion purificada a una concentracion de al menos 5 mg/ml), es un conjunto util de condiciones un unico pulso a 250 V, 950 jF, que suministra un pulso de aproximadamente 20 a 30 ms. La capacitancia puede reducirse, p.ej. a 800 jF, y 2-3 pulsos a 250 V proporcionan aproximadamente el mismo rendimiento de ARP. En una segunda maquina que suministra el voltaje en forma de una onda cuadrada, un pulso de entre 20 y 50 ms a 300 V proporciono resultados similares a la primera maquina. Este procedimiento puede optimizarse para todos los tipos celulares variando longitud de pulso, forma, voltaje, capacitancia y numero. Las celulas Vero tfpicamente no sobreviven a un pulso de 25 ms superior a 400 V. Puesto que estas condiciones son mas duras que las necesarias para suministrar el ARN de replicon de vector, se electroporan las partmulas preparadas usando un colaborador de ADN en las condiciones optimizadas para ADN, y el ARN de replicon de vector entra en las celulas eficazmente en estas condiciones.

Se electroporaron 108 celulas en 0,8 ml usando 30 jg de un ARN de replicon de gag de VIH de VEE y 150 jg de colaborador de ADN de VEE que expresa todas las protemas estructurales de VEE bajo el control regulador de un promotor CMV. Despues de la electroporacion, se manipularon las celulas, se recogieron las ARP, se titularon como se describe anteriormente y se muestran los resultados en la tabla siguiente.

Tabla 6. Condiciones de electroporacion y rendimiento de ARP

Voltaje (V)

Capacitancia (mF) N° de pulsos UI totales

250

950 1 5,2 x 106

300

“ 1 3,9 x 106

350

“ 1 2,9 x 106

400

“ 1 0

450

“ 1 0

“

“

1 0

250

800 2 5,2 x 106

“

“

3 4,3 x 106

350

650 2 0

“

“

3 1,4 x 106

250

950 2 4,7 x 106

5

10

15

20

25

30

35

40

Se observa que, en el experimento para el que se presentan los datos anteriores, se cree que la pureza insuficiente de la preparacion de colaborador de ADN es responsable de los rendimientos globales relativamente bajos, pero estos datos documentan los efectos relativos de los parametros de electroporacion.

Ejemplo 7. Sincronizacion de celulas para la produccion de ARP

Se examino el efecto de sincronizar celulas en la fase G2/M del ciclo celular sobre la eficacia de electroporacion. Se trataron las celulas 2 horas despues de plantar con afidicolina 1 pg/ml en DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) durante 20 h, se dejaron reposar durante 4 h y se recolectaron para electroporacion (Golzio et al. (2002) Biochem. Biophys. Acta 1563: 23-28). Se llevaron a cabo las electroporaciones de ADN colaborador (junto con ARN de replicon) como se describe en la presente memoria. Se observo el crecimiento y morfologfa celular de las celulas a lo largo del proceso de tratamiento. Con cada grupo de celulas, se llevo un matraz que contema el tratamiento de control con DMSO con los matraces tratados con afidicolina/DMSO. No habfa efectos negativos sobre la salud general de las celulas durante el tratamiento en los matraces de prueba o control. Se determino que era beneficioso obtener la confluencia al cabo de una incubacion de 2 h antes de empezar el protocolo de sincronizacion. La laminacion celular era mejor a 90-100% antes del inicio del tratamiento con afidicolina porque se evitaba la division celular posterior por el tratamiento. Usando celulas Vero, se encontro que una densidad de 4,0x105 celulas/cm2 era demasiado alta; una densidad celular de 1,1x104 celulas/cm2 daba como resultado un 90% de confluencia a las 2 h.

Ejemplo 8. Disoluciones prelavado y rendimientos de ARP

Despues de producir las ARP por las celulas electroporadas, pueden lavarse extensamente las celulas con una disolucion de lavado celular para retirar los materiales externos antes de empezar la recoleccion de ARP. La eleccion de la disolucion de lavado celular afecta al numero de ARP liberadas durante esta etapa prelavado.

Se efectuo una unica electroporacion en una cubeta de 0,4 cm de paso usando 1x108 celulas Vero y 30 pg de cada uno de ARN de replicon de gag de VIH de VEE, ARN colaborador de capsida de VEE y ARN colaborador de glicoprotema de VEE. Se sembraron las celulas igualmente en 8 matraces T75, conteniendo cada uno 25 ml de medios OptiPro. Despues de 24 horas, se retiraron los medios, se lavaron las monocapas celulares con 6 ml de la disolucion de lavado celular indicada y se lavaron finalmente las celulas con 6 ml de NaCl 1 M (fosfato tamponado a pH 7,2). Se analizo separadamente en medios, lavado celular y disoluciones de lavado salino el rendimiento de ARP titulando en celulas Vero. Se presentan los resultados en la Figura 4.

Ejemplo 9. Parametros de lavado salino

A. Composicion salina

Se llevo a cabo la electroporacion en una cubeta de 10 mm de paso usando 5x108 celulas Vero, 150 pg de cada uno de ARN de replicon de gag de VIH de VEE, ARN colaborador de capsida de VEE y ARN colaborador de glicoprotema de VEE. Se efectuo la electroporacion usando 4 pulsos a 1150 V, 25 pF. Se sembraron las celulas electroporadas igualmente entre 40 matraces T-75. Se recolecto un matraz a las 16 horas, se realimento con medio reciente y se recolecto a las 24 horas despues de la electroporacion. Se recolectaron los demas matraces a las 24 horas. Se retiraron los medios de cada matraz y se anadieron 5 ml de la disolucion de lavado salino indicada a cada matraz y se incubaron durante 5 minutos. Se retiro entonces la disolucion de lavado salino y se titulo. Se muestran en la Figura 5 los resultados obtenidos usando estas diferentes disoluciones de lavado. La cantidad de ARP (medida por titulacion) liberadas en el medio de crecimiento a partir de las celulas esta levemente afectada por el pH en el intervalo de pH 7,0-8,0 (vease la Figura 3).

B. Concentracion salina en el medio de liberacion

Tabla 7. Parametros de lavado salino

Concentracion de NaCl en el medio de liberacion

Temperatura del medio (° C) Rendimiento de ARP

5 M

4 3,7 x 108

5 M

TA 4,45 x 108

5 M

37 3,5 x 108

2,5 M

4 3,1 x 108

2,5 M

TA 3,55 x 108

2,5 M

37 4,60 x 108

1 M

4 4,05 x 108

1 M

TA 3,75 x 108

1M

37 4,35 x 108

0,5 M

4 3,45 x 108

0,5 M

TA 3,84 x 108

Ejemplo 10. Purificacion de ARP

Las ARP pueden purificarse mediante cromatograffa de afinidad usando diversas resinas. Generalmente, puede usarse un intervalo de condiciones de elucion, dependiendo de la resina elegida, teniendo cuidado de no someter las

20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

ARP a un pH menor de aproximadamente 6. Se observa que el anffgeno codificado por el ARN de replicon se incorpora habitualmente a las ARP; las propiedades del anffgeno pueden afectar al comportamiento de las ARP durante la purificacion. El especialista sabe como reconocer dichos efectos y modificar el procedimiento de purificacion de ARP en consecuencia.

A. Cromatograffa de afinidad con heparina

Se diluyen las ARP en una disolucion de lavado salino con fosfato de sodio 5 mM, pH 7,4, hasta un contenido de cloruro de sodio de 0,12 M o menos. Se carga entonces la disolucion en una columna que contiene resina Heparin Sepharose Fast Flow (Amersham, Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; n° de catalogo 17-0998-01) o resina Heparin HyperD M (Biosepra, Marlboro, MA) a una velocidad lineal de 100 cm/h o menos. Por ejemplo, las ARP de VEE 3014 eluyen a una concentracion de cloruro de sodio de aproximadamente 0,3 M a pH 7,4. Se recogen las ARP de VEE 3014 y se formulan mediante dilucion directa o mediante diafiltracion. Son rendimientos ffpicos para las ARP purificadas mediante este procedimiento del 70%. Pueden usarse gradientes salinos por etapas o lineales para eluir las ARP.

La mayoffa de contaminantes del suero y de las celulas Vero se reducen por la etapa de cromatograffa de heparina; la mayoffa de dichos contaminantes no se unen a la resina.

B. Cromatograffa de afinidad con sulfato de Cellufine

Se diluyen las ARP en una disolucion de lavado salino con fosfato de sodio 5 mM, pH 7,4, a un contenido de cloruro de sodio de 0,25 M o menos. Se carga entonces la disolucion en una columna que contiene resina de sulfato de Cellufine (Millipore) con gradiente de contenido creciente de cloruro de sodio. Las ARP eluyen a una concentracion de cloruro de sodio de aproximadamente 0,7 M a un pH de 7,4. Se recolectan la ARP y se formulan mediante dilucion directa o diafiltracion. Son rendimientos ffpicos para ARP purificadas mediante este metodo de 85%.

C. Cromatograffa de interaccion hidrofoba

Se diluyen las ARP en una disolucion de lavado salino con NaCl 5 M/fosfato de sodio 20 mM a pH 7,4 hasta una concentracion final de NaCl 3 M. Se cargan las ARP en una columna que contiene resina Toyopearl phenyl 650-M a una velocidad lineal de 100 cm/h y se eluyen con un gradiente lineal de cloruro de sodio de 3 a 0 M. La recuperacion de ARP mediante este metodo es de aproximadamente un 77%.

D. Cromatograffa de intercambio anionico

Se cargan las ARP directamente, o despues de una dilucion adecuada, sobre resina de intercambio anionico, por ejemplo Toyopearl superQ o Amersham Q Sepharose, o en membranas de intercambio anionico, por ejemplo Mustang Q (Pall Trincor, Exton, PA). Los materiales de cromatograffa Q se basan en aminas cuaternarias para unir grupos acidos a materiales pasados sobre ellas. Se manipulan las condiciones de carga para proporcionar la union o circulacion de muchos tipos de ARP, estando influidas las propiedades de union por la protema de interes expresada codificada por el vector de replicon alfavffico y expresada en las celulas en que se producen las ARP. En ciertos casos, la resina de intercambio anionico es suficiente para que una unica etapa de purificacion de como resultado la reduccion de las protemas sericas, protemas de celula hospedadora y ADN. Las propiedades de union a ARP en una resina dada son funcion de la resina elegida, la especie de ARP y el pH y contenido salino de la disolucion portadora de la preparacion de ARP.

Por ejemplo, cuando la protema Musoke de Marburg (una glicoprotema) es el anffgeno de interes codificado y la protema de cubierta de ARP es la protema de cubierta de VEE 3014, se recolectan las ARP usando el procedimiento de lavado salino. Se carga directamente el material de lavado salino (preparacion de ARP) en la membrana Mustang Q. Se pasan las protemas del material de lavado salino a traves de la membrana y se lava la membrana con NaCl 0,5 M, fosfato de sodio 10 mM, para eluir cualquier ADN. Se eluyen entonces las ARP usando un gradiente por etapas, con elucion con NaCl 1,5 M, fosfato de sodio 10 mM.

Ejemplo 11. Efecto de diferentes colaboradores de capsida

Se resuspendieron celulas AlphaVax WCB p146 en PBS a 1,6x108 celulas/ml. Para las electroporaciones 1-4, el ARN de replicon (con la secuencia de codificacion de gD de herpesvirus) tema una caperuza G y se purifico por cromatograffa de exclusion por tamano. Los ARN colaboradores no teman caperuza y se purificaron por precipitacion con LiCl para las electroporaciones 1-3. Para la electroporacion 4, los ARN colaboradores no teman caperuza y se purificaron por cromatograffa de exclusion por tamano. Se mezclaron 700 pl de celulas (1,1x108 celulas) con ARN y se electroporaron en cubetas de 0,4 cm (electroporador BioRad, 580 V, 25 pF, 4 pulsos). Se sembraron las celulas en dos matraces T300cm2 con 100 ml de medio OptiPro en cada uno. Se recolectaron las ARP aproximadamente 18 horas despues de la electroporacion en 30 ml de NaCl 0,5 M/NaPO4 10 mM y se filtraron a traves de un filtro de 0,2 pm.

5

10

15

20

25

30

35

40

Tabla 8. Relacion de ARN y parametros de capsida

Electroporacion

ARN colaborador de capsida Relacion de ARN (en Mg) de replicon:caperuza:gp Tttulo de ARP Ul/ml Ul totales Ul por celula Tttulo de capsida Ul/ml Tttulo de gp Ul/ml

1

hcap4-3 30:30:60 1,1 x 109 3,3 x 1010 330 1,9 x 105 4,9 x 105

2

hcap4 19 nt 30:30:60 3,5 x 108 1,1 x 1010 110 1,1 x 104 2,95

3

hcap4 121 nt 30:30:60 5,1 x 108 1,5 x 1010 150 1,2 x 104 3,0 x 105

4

hcap4-3 30:100:100 3,4 x 108 1,0 x 1010 100 1,1 x 104 1,7 x 105

Tambien se describen en el presente documento:

1. Un metodo para preparar partmulas de replicon alfavmco (ARP), comprendiendo dicho metodo las etapas de:

(a) introducir un acido nucleico de replicon alfavmco en una celula hospedadora, comprendiendo dicho acido nucleico de replicon al menos una senal de empaquetamiento vmco y al menos una secuencia de codificacion heterologa expresable en dicho acido nucleico de replicon alfavmco, en el que dicha celula hospedadora comprende al menos una funcion colaboradora, produciendo una celula hospedadora modificada;

(b) cultivar dicha celula hospedadora modificada en condiciones que permitan la expresion de la al menos una funcion colaboradora, que permite la replicacion de dicho acido nucleico de replicon alfavmco y el empaquetamiento de dicho acido nucleico de replicon alfavmco, formando ARP;

(c) poner en contacto las celulas hospedadoras modificadas despues de la etapa (b) con una disolucion acuosa que tiene una fuerza ionica de 0,2 a 5 M para liberar las ARP con capacidad de union a glicosaminoglicano en la disolucion acuosa, para producir una disolucion que contiene ARP;

(d) recoger las ARP de la disolucion que contiene ARP de la etapa (c).

2. El metodo de la caractenstica 1, en el que la al menos una funcion colaboradora en la celula hospedadora de la etapa (a) 5x107 a 5x108 por ml, esta codificada por una secuencia de acido nucleico integrada establemente en el genoma de dicha celula hospedadora.

3. El metodo de la caractenstica 1, en el que la al menos una funcion colaboradora en la celula hospedadora se introduce en al menos un acido nucleico colaborador que codifica una protema de capsida capaz de unirse a dicho acido nucleico de replicon alfavmco y al menos una glicoprotema alfavmca, en el que dicha glicoprotema alfavmca se asocia con dicho acido nucleico de replicon alfavmco y dicha protema de capsida, en el que la al menos una molecula de acido nucleico colaborador se introduce en la celula hospedadora junto con dicho acido nucleico de replicon alfavmco.

4. El metodo de la caractenstica 1, en el que la al menos una funcion colaboradora esta codificada por al menos dos moleculas de acido nucleico colaborador, en el que cada una de dichas dos moleculas de acido nucleico colaborador codifica al menos una funcion colaboradora vmca.

5. El metodo de la caractenstica 1, en el que la fuerza ionica es entre 0,5 M y 5 M.

6. El metodo de la caractenstica 1, en el que la al menos una funcion colaboradora esta codificada en una molecula de ADN.

7. El metodo de la caractenstica 1, en el que se introduce un acido nucleico de replicon alfavmco en dicha celula hospedadora por electroporacion.

8. El metodo de la caractenstica 8, en el que las celulas hospedadoras estan presentes en una mezcla de electroporacion a una concentracion de 5x107 a 5x108 por ml.

9. El metodo de la caractenstica 9, en el que las celulas hospedadoras estan presentes en una mezcla de electroporacion a una concentracion de 5x107 a 1,5x108 por ml.

10. El metodo de la caractenstica 1, que comprende adicionalmente una etapa de lavado celular, antes de la etapa (c) de la caractenstica 1.

11. El metodo de la caractenstica 1, en el que el alfavirus es el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana.

12. El metodo de la caractenstica 10, en el que la disolucion de lavado celular no contiene sal y comprende adicionalmente desoxirribonucleasa.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

13. El metodo de la caractenstica 3 o 4, en el que el acido nucleico colaborador es una molecula de ARN sin caperuza.

14. El metodo de la caractenstica 4, en el que estan presentes un ARN de replicon alfavmco y una primera molecula de ARN colaborador y una segunda molecula de ARN colaborador en una mezcla de electroporacion a una relacion de 1:0,3:0,3 a 1:20:20.

15. El metodo de la caractenstica 14, en el que la relacion es 1:0,5:0,5.

16. El metodo de la caractenstica 15, en el que la relacion es 1:5:5.

17. Un metodo para preparar partmulas de replicon alfavmco que comprende un vector de replicon alfavmco y una o mas moleculas de acido nucleico colaborador en celulas hospedadoras permisivas de alfavirus por electroporacion, en el que la concentracion de las celulas hospedadoras permisivas de alfavirus en el medio de cultivo durante la electroporacion es de 5x107 a 5x108 celulas/ml, y en el que la concentracion de vector de replicon de ARN alfavmco anadido a las celulas antes de la electroporacion es de aproximadamente 35 |jg por ml.

18. El metodo de la caractenstica 11, en el que se lleva a cabo la electroporacion en una camara de electroporacion en la que un paso entre electrodos es de entre 0,4 y 1,0 cm.

19. El metodo de la caractenstica 11, en el que la funcion colaboradora esta codificada en una unica molecula colaboradora de ADN que codifica todas las protemas estructurales alfavmcas.

20. El metodo de la caractenstica 15, en el que la concentracion de la molecula colaboradora de ADN es de al menos 100 jg/ml.

21. El metodo de cualquiera de las caractensticas 1 a 18, en el que las celulas permisivas de alfavirus son celulas Vero.

22. El metodo de cualquiera de las caractensticas 1 a 18, en el que la etapa (d) va seguida de una etapa de intercambio ionico, cromatograffa de afinidad con heparina, cromatograffa hidrofobica o de afinidad.

23. El metodo de cualquiera de las caractensticas 1 a 17, en el que el alfavirus es un alfavirus atenuado.

24. El metodo de la caractenstica 17, en el que el alfavirus es el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE).

24. El metodo de cualquiera de las caractensticas 1 a 21, en el que la sal en la etapa de lavado salino se selecciona del grupo consistente en NaCl, KCl, MgCh, CaCl2, NH4Cl, (NH4)2SO4, acetato de NH4 y bicarbonato de NH4.

25. Un metodo para preparar parffculas de replicon alfavmco (ARP), comprendiendo dicho metodo las etapas de:

(a) introducir un acido nucleico de replicon alfavmco en una celula hospedadora, comprendiendo dicho acido nucleico de replicon al menos una senal de empaquetamiento en alfavirus y al menos una secuencia de codificacion expresable en dicho acido nucleico de replicon alfavmco, en el que dicha celula hospedadora comprende al menos una funcion colaboradora, para producir una celula hospedadora modificada, en donde dicho acido nucleico de replicon se introduce en la celula hospedadora por electroporacion de celulas hospedadoras a una concentracion de desde 5x107 a 5x108 celulas por mililitro;

(b) cultivar dicha celula hospedadora modificada en condiciones que permitan la expresion de la al menos una funcion colaboradora, permitiendo la replicacion de dicho acido nucleico de replicon alfavmco y el empaquetamiento de dicho acido nucleico de replicon alfavmco para formar ARP;

(c) poner en contacto las celulas hospedadoras modificadas despues de la etapa (b) con una disolucion acuosa que tiene una fuerza ionica de 0,2 M a 5 M para liberar los ARP en la disolucion acuosa para producir una disolucion que contiene ARP;

(d) recoger las ARP de la disolucion que contiene ARP de la etapa (c).

26. El metodo de la caractenstica 9, en el que las celulas hospedadoras estan presentes en una mezcla de electroporacion a una concentracion de desde 5x107 a 1,5x108 por ml.

27. El metodo de la caractenstica 17, en el que el alfavirus es el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE).

28. El metodo de la caractenstica 25, en el que el acido nucleico colaborador es una molecula de ARN sin caperuza.

29. Una preparacion de parffculas de replicon alfavmco preparada por el metodo de cualquiera de las caractensticas 1 a 28.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de preparacion de partmulas de replicon alfavmco que comprende introducir un vector de replicon alfavmco y una o mas moleculas de acido nucleico colaborador en celulas permisivas de alfavirus por electroporacion, en donde la concentracion de las celulas permisivas de alfavirus en medio de cultivo durante la electroporacion es de 5x107 a 5x108 celulas/ml y en donde la concentracion del vector de replicon de ARN alfavmco anadido a las celulas antes de la electroporacion es de aproximadamente 35 |jg por ml.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la electroporacion se lleva a cabo en una camara de electroporacion en la que un espacio entre electrodos esta entre 0,4 y 1,0 cm.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la funcion colaboradora esta codificada dentro de una unica molecula colaboradora de ADN que codifica todas las protemas estructurales alfavmcas.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la concentracion de la molecula colaboradora de ADN es de al menos 100 jg/ml.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las celulas permisibles de alfavirus son celulas Vero.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la partfcula de replicon alvanrico es una partmula de replicon alfavmco

   atenuada.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la partmula de replicon alfavmco es un Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE).
8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las celulas hospedadoras estan presentes en una mezcla de electroporacion a una concentracion de 5x107 a 1,5x108 por ml.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el acido nucleico colaborador es una molecula de ARN sin caperuza.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 1, en el que un ARN de replicon alfavmco y una primera molecula de ARN colaborador y una segunda molecula colaboradora de ARN estan presentes en una mezcla de electroporacion en una relacion de 1:0,3:0,3 a 1:20:20.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 10, en el que la relacion es de 1:0,5:0,5.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que la relacion es de 1:5:5.