CN114736949B - 一种萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对生物荧光的生物检测技术和试剂盒。为解决因细胞自身或药物作用导致的信号弱时，使用常规测试盒检测不到信号的问题，本申请提出了一种萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，包括缓冲液与检测底物，所述的缓冲液包括Tris、磷酸、甘氨酸、还原剂、金属离子掩蔽剂、ATP、甘油、二价Mg离子、表面活性剂。本发明在提高检测信号的同时，提高了检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术，具体涉及一种萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒。
背景技术
当母细胞缺少适宜的检测指示物,但待测物作用位点表达适量并存在特异性激活的转录因子时,可将相应的DNA反应元件与报告基因序列结合并导入母细胞,建立反应性报告基因细胞系。通常选择导入的报告基因可表达易被检测的蛋白质或酶,如绿色荧光蛋白、荧光素酶等,作为检测指示物来反映待测物的活性。
荧光素酶(luciferase)是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。目前，最有代表性的是从甲虫中分离得到的萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase)和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶(Renilla luciferase)。
萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶都是非分泌型蛋白，所以在检测之前需要对表达报告基因的细胞进行裂解处理，依据特性可将荧光素酶裂解型检测试剂盒分为高灵敏型、稳定型、高通量型。高灵敏度会损耗一定的稳定性，对于信号高的细胞，普通试剂盒的灵敏度即可满足检测需求。对于某些细胞，由于自身限制或药物作用导致信号弱的情况，需要更为灵敏的检测方法，以减少假阴性导致的重要信息的丢失。
发明内容
为解决细胞自身原因或药物作用导致的信号弱时无法使用常规试剂盒检测信号的问题，本申请提出了一种萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，实现了高敏感、易检测、重现性好的检测手段。
本发明是通过以下技术方案实现的，一种萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒包括缓冲液与检测底物。利用萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,fluc)能催化荧光素(luciferin)产生生物荧光反应，反应过程如下所示：
本发明试剂盒采用裂解缓冲液,具有高度灵敏、线性范围宽、快速简便的特点，特别适合于在细胞信号低，药物作用效果弱，多细胞互作信号等方面的检测和高通量筛选应用。所述的缓冲液包括Tris、磷酸、甘氨酸、还原剂、金属离子掩蔽剂、ATP、甘油、二价Mg离子、表面活性剂。
所述Tris在缓冲液中的含量为150mM；
所述磷酸在缓冲液中的含量为50mM；
所述甘氨酸在缓冲液中的含量为100mM；
所述还原剂包括DTT，在缓冲液中含量为30-45mM，优选为40mM，还原剂起到稳定剂的作用。
所述金属离子掩蔽剂包括1,2-环己二胺四乙酸，在缓冲液中含量为3-4mM作用，在一定酸度条件下，可以掩蔽金属离子。
所述ATP在缓冲液中的含量为1-5mM，优选为2.3-4.5mM，在缓冲液中作为酶的底物。
所述甘油在缓冲液中的体积含量为15-20％，优选为20％，起到稳定剂的作用。
所述二价Mg离子的含量为2-4mM，优选为3.6mM，起到辅助因子的作用。
表面活性剂包含Triton X-100、NP-40、Tween-20中的一种，体积含量为1-4％，优选为2％，起到稳定剂的作用。
所述的检测底物为D-荧光素钾盐，含量为200-350ug/ml，优选为300ug/ml。
当检测底物存在时，萤火虫荧光素酶在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化荧光素氧化，生成氧化荧光素，同时产生黄绿色光，荧光亮度和荧光素酶的量成正比。
检测方法为以下步骤：
(1)细胞铺板
(1.1)培养基配制
(1.2)37度预热培养基和1×DPBS；
(1.3)去除旧培养基，加入1ml DPBS润洗细胞；
(1.4)加入1ml 0.25％胰酶，再加入培养基将细胞重悬计数；移取离心获得细胞；去除上清后，重悬细胞到2.2E5 cells/ml,加入90ul细胞到96孔中。
(2)细胞刺激检测
(2.1)hTNF-α刺激
稀释TNF-a至0.15ng/ml。TNF-a经三倍梯度稀释后,分别取10ul至细胞中，37度孵育4h。
细胞铺板并经TNFa刺激后，表达萤火虫荧光素酶。在加入检测试剂后发生化学反应，即可检测到信号。
(2.2)萤火虫荧光素酶的检测
先将检测底物和缓冲液在4℃-室温下分别溶解，然后离心，集中液体到瓶底，按照1:100的体积比将检测底物加入到缓冲液中得到检测试剂，混匀。在测试细胞样本中加入等体积的检测试剂96孔板检测体系，100μl培养基中的细胞添加100μl检测试剂，测量前震荡3-5分钟，最后检测化学发光信号值。
由于检测底物是液体，体积较小，在储存及运输过程中易在盖子或者管壁处残留溶液，所以需要先离心将所有液体集中在管底。
将检测试剂、测试细胞样本平衡至室温。
96孔板检测体系，100μl培养基中的细胞添加100μl检测试剂，在测量前震荡3-5分钟,充分震荡。
作为优选，使用Envision检测化学发光信号值。
与现有技术相比，本申请的有益效果是：本发明的试剂盒，在保证检测信号稳定性的基础上，通过添加组分和调整各组分间比例，提高信号值和信号窗口，最终达到提高检测灵敏度的效果。
附图说明
图1为实施例1试剂盒检测化学发光信号值示意图；
图2为本申请制备的试剂盒与同类产品灵敏度比较图；
图3为甘油的含量对测试信号值影响比较图；
图4为表面活性剂的含量对测试信号值影响比较图；
图5为表面活性剂的成分对测试信号值影响图；
图6为ATP浓度变化对测试信号值影响图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，实施例中所用原料均可市购或采用常规方法制备。
实施例1：试剂盒由缓冲液和检测底物组成
缓冲液组分和含量：所述的缓冲液包括Tris 150mM，磷酸50mM、甘氨酸100mM、还原剂DTT 40mM、金属离子掩蔽剂1,2-环己二胺四乙酸3mM、ATP4.5mM、甘油的体积含量为20％、MgCl2 3.6mM、Tritone X-100的体积含量为2％，检测底物组成为：D-荧光素钾盐300ug/ml。
实施例2：试剂盒由缓冲液和检测底物组成
缓冲液组分和含量：所述的缓冲液包括Tris 150mM，磷酸50mM、甘氨酸100mM、还原剂DTT 30mM、金属离子掩蔽剂1,2-环己二胺四乙酸4mM、ATP 2.3mM、甘油的体积含量为15％、MgCl2 2mM、NP-40的体积含量为1％，检测底物组成为：D-荧光素钾盐250ug/ml。
实施例3：试剂盒由缓冲液和检测底物组成
缓冲液组分和含量：所述的缓冲液包括Tris 150mM，磷酸50mM、甘氨酸100mM、还原剂DTT 45mM、金属离子掩蔽剂1,2-环己二胺四乙酸30mM、ATP 4.5mM、甘油的体积含量为20％、MgCl2 4mM、Tween-20的体积含量为4％，检测底物组成为：D-荧光素钾盐350ug/ml。
测试例1
(1)反应原料型号
(2)检测方法
(2.1)细胞铺板
(2.1.1)培养基配制:DMEM+10％FBS+25mM HEPES+0.5μg/mL puromycin；
(2.1.2)37度预热培养基和1×DPBS；
(2.1.3)去除旧培养基，加入1ml DPBS润洗细胞；
(2.1.4)加入1ml 0.25％胰酶用于消化细胞，加入5ml培养基将细胞重悬计数；吸取需要的细胞数量，离心收集细胞；去除上清后，重悬细胞至2.2E5cells/ml,加入90ul细胞到96孔中。
(2.2)细胞刺激检测
(2.2.1)hTNF-α刺激
稀释TNF-a到0.15ng/ml，经三倍梯度稀释后,分别取10ul加入细胞(90ul)中，37度孵育4h。
(2.2.2)萤火虫荧光素酶的检测
先将实施例1试剂盒的检测底物和缓冲液在4℃-室温下分别溶解，然后离心，集中液体到瓶底，按照1:100的体积比将检测底物加入到缓冲液中得到检测试剂，混匀；然后在测试细胞样本中加入等体积的检测试剂96孔板检测体系，100μl培养基中的细胞添加100μl检测试剂，在测量前震荡3-5分钟。
使用Envision检测化学发光信号值，如图1所示。
对比例1：
使用市购A型号增强型化学发光检测试剂盒(Bright-Lite Luciferase AssaySystem,Vazyme,Cat:DD1204-01)试剂盒，按照测试例1的过程进行测试。
对比例2：
使用市购B型号普通型化学发光检测试剂盒(Firefly Luciferase ReporterGene Assay Kit，Beyotime,Cat:RG005)试剂盒，按照测试例1的过程进行测试
测试结果如图2所示，说明本申请制备的试剂盒与常规市购试剂盒相比，灵敏度高。
对比例3：
与实施例1相比，试剂盒中的甘油体积含量为10％。
对比例4：
与实施例1相比，试剂盒中的甘油体积含量为4％。
测试比较结果如图3所示：说明本申请试剂盒中的甘油对测试信号值产生一定的影响。
对比例5：
与实施例1相比，试剂盒中Tritone X-100的体积含量为4％。
对比例6：
与实施例1相比，试剂盒中Tritone X-100的体积含量为8％。
测试比较结果如图4所示：说明本申请试剂盒中的表面活性剂的含量对测试信号值会产生影响。
对比例7
与实施例1相比，试剂盒中表面活性剂为Triton X-100：NP40：Tween-20＝1:1:1的混合液。
对比例8
与实施例1相比，试剂盒中表面活性剂为NP40：Tween-20＝1:1的混合液。
测试比较结果如图5所示：说明本申请试剂盒中表面活性剂的成分对测试信号值会产生影响。
对比例9
与实施例1相比，试剂盒中ATP浓度降低到到0.5mM,信号显著降低。
测试比较结果如图6所示：ATP浓度变化对测试灵敏度会产生影响，本申请试剂盒ATP浓度范围内的高浓度ATP显著提高了荧光信号的灵敏度。
由上所述，使用本发明的试剂盒检测细胞，在保证信号稳定性的基础上，通过添加组分和调整各组分间比例，提高信号值和信号窗口，最终达到提高检测灵敏度的效果。
Claims (1)
1.一种萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括缓冲液与检测底物，所述的缓冲液包括Tris，磷酸、甘氨酸、还原剂、金属离子掩蔽剂、ATP、甘油、二价Mg离子、表面活性剂；所述Tris的含量为150mM；所述磷酸在缓冲液中的含量为50mM；所述甘氨酸在缓冲液中的含量为100mM；
所述还原剂为DTT，含量为30-45mM；所述金属离子掩蔽剂包括1,2-环己二胺四乙酸，含量为3-4mM；所述ATP的含量为 1-5mM；所述甘油的含量为15-20%；
所述二价Mg离子的含量为2-4mM；表面活性剂包含Triton X-100、NP-40、Tween-20中的一种，含量为1%-4%；所述的检测底物为D-荧光素钾盐，含量为200-350 ug/ml。
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