CN108330161A - 一种热稳定性显著的atp荧光检测试剂 - Google Patents

一种热稳定性显著的atp荧光检测试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，在酶反应基本溶液体系和缓冲溶液中加入具备特定比例的热稳定性加强试剂，所述ATP荧光检测试剂由三部分组成：酶反应基本溶液体系、缓冲体系和热稳定性加强试剂，所述酶反应基本溶液体系包括荧光素酶、荧光素和金属离子，所述荧光素酶优选为虫荧光素酶，所述荧光素优选为D‑虫荧光素钾盐，所述虫荧光素酶和D‑虫荧光素钾盐的浓度分别优选为10mg/L和40mg/L，所述金属离子为Mg2+，所述金属离子Mg2+的浓度优选为12.5mM。该热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，ATP荧光检测试剂极大地增强了检测试剂的热稳定性，在极端高温(75℃)条件下一定时间内仍可维持试剂活性，使检测试剂的保存时间显著延长。

Description

一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂
技术领域
本发明涉及ATP荧光检测技术领域，具体为一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂。
背景技术
食品与人们的生活、健康密切相关。因此，确保食品的质量不容忽视。我国目前的食品安全问题主要集中在食品掺假及微生物污染等方面。其中细菌总数是食品被污染程度的标志。细菌总数的量直接反应食品的污染程度，并可用以预测食品可能存放的期限，因此细菌总数是判断食品卫生质量的重要依据之一。传统的细菌学检验方法采用平板计数法，该方法虽然准确可靠，但操作复杂、耗时长。随着分子生物学、微电子及生物等技术的发展，除了传统方法涌现出一大批新型的细菌总数快速检测技术手段，如免疫学方法、荧光显微技术滤膜法、阻抗测定法、三磷酸腺苷(ATP)荧光检测法。其中免疫学方法虽快速灵敏度高但易出现假阳性和假阴性；荧光显微技术易实现自动化，但设备昂贵、检测成本高；阻抗法干扰因素多致其应用受限；ATP荧光检测法以其简便、快速、便携、成本低、灵敏度高、特异性好等优点被广泛使用，成为国内外研究的热点。
ATP是生物能量的主要来源，普遍存在于所有活的生物体中，其含量一般相对恒定。研究表明并证实，ATP含量和微生物数量之间存在着较好的线性关系，可通过测定ATP的浓度来反映微生物数量。研究发现荧光素酶在有O2、Mg2+、ATP存在条件下，催化D-荧光素氧化脱羧，将化学能转化为光能，并释放出光量子，发出绿光，反应式如下方程式，此即ATP生物发光的原理。
ATP荧光检测法作为一种酶促反应，检测试剂的稳定性受pH、温度、酶活性等的影响。由于检测试剂中的荧光素酶的活性中心含大量巯基氨基酸，它们很容易被氧化而失活而使检测试剂失效。ATP荧光检测试剂对温度及其敏感，目前市售的商品化ATP荧光检测试剂基本为干粉状态，干粉状态的荧光检测试剂在低温条件下保存较为稳定，在-20℃冰箱中可以保存数年。但试剂进入溶液态之后，其活性和稳定性急剧下降。为了延长其保存时间并维持活性，扩大其应用范围，研究人员尝试往荧光检测试剂中加入各种保护剂，如甘油、牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽(还原型)等。虽然市售的各种ATP荧光检测试剂均在一定程度提高了溶液态试剂的稳定性，但试剂的保存期及热稳定性还不够令人满意，亟需一种能显著提高ATP荧光检测试剂热稳定性的试剂配方，为ATP荧光检测试剂的大规模应用及细菌总数的快速检测扫除障碍。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，解决了现有市售ATP荧光检测试剂盒热稳定性差和保存时间短的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，在酶反应基本溶液体系和缓冲溶液中加入具备特定比例的热稳定性加强试剂。
优选的，所述ATP荧光检测试剂由三部分组成：酶反应基本溶液体系、缓冲体系和热稳定性加强试剂。
优选的，所述酶反应基本溶液体系包括荧光素酶、荧光素和金属离子，所述荧光素酶优选为虫荧光素酶，所述荧光素优选为D-虫荧光素钾盐，所述虫荧光素酶和D-虫荧光素钾盐的浓度分别优选为10mg/L和40mg/L，所述金属离子为Mg2+，所述金属离子Mg2+的浓度优选为12.5mM。
优选的，所述缓冲体系优选为甘氨酰甘氨酸缓冲体系，所述甘氨酰甘氨酸缓冲体系的浓度优选为25mM，所述甘氨酰甘氨酸缓冲体系的pH为7.8。
优选的，所述热稳定性加强试剂包含如下组分：磷酸化合物保护剂、糖类和巯基保护剂，所述糖类优选为二乙胺基乙基葡聚糖，所述二乙胺基乙基葡聚糖的浓度优选为0.01％-0.1％，所述巯基保护剂优选为二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇的浓度优选为0.5-4mM，所述磷酸化合物保护剂可为磷酸铵、多聚磷酸盐或磷酸三乙酯，所述磷酸化合物保护剂优选为磷酸三乙酯，所述磷酸三乙酯的浓度优选为200-2000mg/mL，所述二乙胺基乙基葡聚糖、二硫苏糖醇和磷酸化合物保护剂的使用比例优选为3:3:4。
(三)有益效果
本发明提供了一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，与现有技术相比，本发明的有益效果是：该热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，ATP荧光检测试剂极大地增强了检测试剂的热稳定性，在极端高温(75℃)条件下一定时间内仍可维持试剂活性，使检测试剂的保存时间显著延长。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，在酶反应基本溶液体系和缓冲溶液中加入具备特定比例的热稳定性加强试剂，ATP荧光检测试剂由三部分组成：酶反应基本溶液体系、缓冲体系和热稳定性加强试剂，酶反应基本溶液体系包括荧光素酶、荧光素和金属离子，荧光素酶优选为虫荧光素酶，荧光素优选为D-虫荧光素钾盐，虫荧光素酶和D-虫荧光素钾盐的浓度分别优选为10mg/L和40mg/L，金属离子为Mg2+，金属离子Mg2+的浓度优选为12.5mM，缓冲体系优选为甘氨酰甘氨酸缓冲体系，甘氨酰甘氨酸缓冲体系的浓度优选为25mM，甘氨酰甘氨酸缓冲体系的pH为7.8，热稳定性加强试剂包含如下组分：磷酸化合物保护剂、糖类和巯基保护剂，糖类优选为二乙胺基乙基葡聚糖，二乙胺基乙基葡聚糖的浓度优选为0.01％-0.1％，巯基保护剂优选为二硫苏糖醇，二硫苏糖醇的浓度优选为0.5-4mM，磷酸化合物保护剂可为磷酸铵、多聚磷酸盐或磷酸三乙酯，磷酸化合物保护剂优选为磷酸三乙酯，磷酸三乙酯的浓度优选为200-2000mg/mL，二乙胺基乙基葡聚糖、二硫苏糖醇和磷酸化合物保护剂的使用比例优选为3:3:4，酶反应基本溶液体系配制于甘氨酰甘氨酸缓冲体系中，在酶反应基本溶液体系和甘氨酰甘氨酸缓冲体系中添加入各种比例的热稳定性加强试剂得到不同的检测试剂，通过加入特定浓度的ATP标准溶液，用Hyginea ATP荧光检测仪对荧光强度进行检测。
实施例一
一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，在酶反应基本溶液体系和缓冲溶液中加入具备特定比例的热稳定性加强试剂，ATP荧光检测试剂由三部分组成：酶反应基本溶液体系、缓冲体系和热稳定性加强试剂，酶反应基本溶液体系包括荧光素酶、荧光素和金属离子，荧光素酶优选为虫荧光素酶，荧光素优选为D-虫荧光素钾盐，虫荧光素酶和D-虫荧光素钾盐的浓度分别优选为10mg/L和40mg/L，金属离子为Mg2+，金属离子Mg2+的浓度优选为12.5mM，缓冲体系优选为甘氨酰甘氨酸缓冲体系，甘氨酰甘氨酸缓冲体系的浓度优选为25mM，甘氨酰甘氨酸缓冲体系的pH为7.8，热稳定性加强试剂包含如下组分：磷酸化合物保护剂、糖类和巯基保护剂，糖类优选为二乙胺基乙基葡聚糖，二乙胺基乙基葡聚糖的浓度优选为0.01％，巯基保护剂优选为二硫苏糖醇，二硫苏糖醇的浓度优选为0.5mM，磷酸化合物保护剂可为磷酸铵、多聚磷酸盐或磷酸三乙酯，磷酸化合物保护剂优选为磷酸三乙酯，磷酸三乙酯的浓度优选为200mg/mL，二乙胺基乙基葡聚糖、二硫苏糖醇和磷酸化合物保护剂的使用比例优选为3:3:4，酶反应基本溶液体系配制于甘氨酰甘氨酸缓冲体系中，在酶反应基本溶液体系和甘氨酰甘氨酸缓冲体系中添加入各种比例的热稳定性加强试剂得到不同的检测试剂，通过加入特定浓度的ATP标准溶液，用Hyginea ATP荧光检测仪对荧光强度进行检测。
实施例二
一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，在酶反应基本溶液体系和缓冲溶液中加入具备特定比例的热稳定性加强试剂，ATP荧光检测试剂由三部分组成：酶反应基本溶液体系、缓冲体系和热稳定性加强试剂，酶反应基本溶液体系包括荧光素酶、荧光素和金属离子，荧光素酶优选为虫荧光素酶，荧光素优选为D-虫荧光素钾盐，虫荧光素酶和D-虫荧光素钾盐的浓度分别优选为10mg/L和40mg/L，金属离子为Mg2+，金属离子Mg2+的浓度优选为12.5mM，缓冲体系优选为甘氨酰甘氨酸缓冲体系，甘氨酰甘氨酸缓冲体系的浓度优选为25mM，甘氨酰甘氨酸缓冲体系的pH为7.8，热稳定性加强试剂包含如下组分：磷酸化合物保护剂、糖类和巯基保护剂，糖类优选为二乙胺基乙基葡聚糖，二乙胺基乙基葡聚糖的浓度优选为0.05％，巯基保护剂优选为二硫苏糖醇，二硫苏糖醇的浓度优选为2.25mM，磷酸化合物保护剂可为磷酸铵、多聚磷酸盐或磷酸三乙酯，磷酸化合物保护剂优选为磷酸三乙酯，磷酸三乙酯的浓度优选为1100mg/mL，二乙胺基乙基葡聚糖、二硫苏糖醇和磷酸化合物保护剂的使用比例优选为3:3:4，酶反应基本溶液体系配制于甘氨酰甘氨酸缓冲体系中，在酶反应基本溶液体系和甘氨酰甘氨酸缓冲体系中添加入各种比例的热稳定性加强试剂得到不同的检测试剂，通过加入特定浓度的ATP标准溶液，用Hyginea ATP荧光检测仪对荧光强度进行检测。
实施例三
一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，在酶反应基本溶液体系和缓冲溶液中加入具备特定比例的热稳定性加强试剂，ATP荧光检测试剂由三部分组成：酶反应基本溶液体系、缓冲体系和热稳定性加强试剂，酶反应基本溶液体系包括荧光素酶、荧光素和金属离子，荧光素酶优选为虫荧光素酶，荧光素优选为D-虫荧光素钾盐，虫荧光素酶和D-虫荧光素钾盐的浓度分别优选为10mg/L和40mg/L，金属离子为Mg2+，金属离子Mg2+的浓度优选为12.5mM，缓冲体系优选为甘氨酰甘氨酸缓冲体系，甘氨酰甘氨酸缓冲体系的浓度优选为25mM，甘氨酰甘氨酸缓冲体系的pH为7.8，热稳定性加强试剂包含如下组分：磷酸化合物保护剂、糖类和巯基保护剂，糖类优选为二乙胺基乙基葡聚糖，二乙胺基乙基葡聚糖的浓度优选为0.1％，巯基保护剂优选为二硫苏糖醇，二硫苏糖醇的浓度优选为4mM，磷酸化合物保护剂可为磷酸铵、多聚磷酸盐或磷酸三乙酯，磷酸化合物保护剂优选为磷酸三乙酯，磷酸三乙酯的浓度优选为2000mg/mL，二乙胺基乙基葡聚糖、二硫苏糖醇和磷酸化合物保护剂的使用比例优选为3:3:4，酶反应基本溶液体系配制于甘氨酰甘氨酸缓冲体系中，在酶反应基本溶液体系和甘氨酰甘氨酸缓冲体系中添加入各种比例的热稳定性加强试剂得到不同的检测试剂，通过加入特定浓度的ATP标准溶液，用HygineaATP荧光检测仪对荧光强度进行检测。
综上可得，该热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，ATP荧光检测试剂极大地增强了检测试剂的热稳定性，在极端高温(75℃)条件下一定时间内仍可维持试剂活性，使检测试剂的保存时间显著延长。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，其特征在于：在酶反应基本溶液体系和缓冲溶液中加入具备特定比例的热稳定性加强试剂。
2.根据权利要求1所述的一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，其特征在于：所述ATP荧光检测试剂由三部分组成：酶反应基本溶液体系、缓冲体系和热稳定性加强试剂。
3.根据权利要求1所述的一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，其特征在于：所述酶反应基本溶液体系包括荧光素酶、荧光素和金属离子，所述荧光素酶优选为虫荧光素酶，所述荧光素优选为D-虫荧光素钾盐，所述虫荧光素酶和D-虫荧光素钾盐的浓度分别优选为10mg/L和40mg/L，所述金属离子为Mg2+，所述金属离子Mg2+的浓度优选为12.5mM。
4.根据权利要求1所述的一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，其特征在于：所述缓冲体系优选为甘氨酰甘氨酸缓冲体系，所述甘氨酰甘氨酸缓冲体系的浓度优选为25mM，所述甘氨酰甘氨酸缓冲体系的pH为7.8。
5.根据权利要求1所述的一种热稳定性显著的ATP荧光检测试剂，其特征在于：所述热稳定性加强试剂包含如下组分：磷酸化合物保护剂、糖类和巯基保护剂，所述糖类优选为二乙胺基乙基葡聚糖，所述二乙胺基乙基葡聚糖的浓度优选为0.01％-0.1％，所述巯基保护剂优选为二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇的浓度优选为0.5-4mM，所述磷酸化合物保护剂可为磷酸铵、多聚磷酸盐或磷酸三乙酯，所述磷酸化合物保护剂优选为磷酸三乙酯，所述磷酸三乙酯的浓度优选为200-2000mg/mL，所述二乙胺基乙基葡聚糖、二硫苏糖醇和磷酸化合物保护剂的使用比例优选为3:3:4。
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