CN101446538A - 一种特定微生物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特定微生物的检测方法，包括以下步骤：a.捕捉步骤，选择对应于特定微生物种类的抗体，通过抗体和特定种类微生物之间的特异性反应捕捉被测样本中的特定微生物；b.分离步骤，分离捕捉到的特定微生物和被测样本；c.酶释放步骤，向分离后特定微生物的溶液中加入过氧化氢酶释放试剂，使得所述特定微生物中的过氧化氢酶释放，进入溶液中；d.检测步骤，向上述溶液中添加过氧化氢，并等待；检测得到过氧化氢酶的浓度，进而得到所述特定微生物的浓度。本发明具有检测精度高、检测灵敏度高、可检测特定微生物等优点，可广泛应用在食品安全检测中。

Description

一种特定微生物的检测方法

技术领域

本发明涉及微生物的检测，特别涉及一种特定微生物的检测方法，如细菌和真菌的检测。

背景技术

食品安全目前已成为人们非常关注的一个问题。据统计，在各种食品安全问题中，由于微生物污染，特别是有害、致病微生物污染所引起的占了很大的比例。因此，需要专门的技术检测食品中的微生物。

目前，食品中微生物检测的常规方法，大多数是以培养活的细胞生长为手段来达到检测目的，如平板菌落计数法等。虽然这些方法检测灵敏度很高，但这些方法均需要在实验室的无菌条件下进行，并且需要一定的培养时间，所以比较麻烦和费时，需要24小时或者更长的时间才能有结果。

在食品安全检测中，人们总希望尽快得到检测结果。若是像平板菌落计数法一样，所得到的结果往往只能作为事后的辅助验证了。

为了解决常规检测方法耗时长的不足，人们也开始研究各种快速的微生物检测方法，并得到了一定的结果，如：

ATP生物发光法，就是利用微生物细胞内存在的ATP即三磷酸腺苷，当荧光素酶系统和ATP接触时会发光，这样通过光强度的检测就可以推知样品中微生物的含量。

法国梅里埃公司推出了一种微生物生长过程中由于新陈代谢而改变培养基的成分，从而通过电阻抗的测量来达到微生物快速检测的Bactometer系统。与此相类似的还有Malthus的Malthus Microbial Analyser系统。

另外，随着免疫技术和分子生物学的发展，人们也开发出一些基于免疫反应或PCR技术的微生物检测技术。

但是，上述技术，特别是快速检测技术，还存在诸多不足，如：

1、目前所研究开发的快速检测方法中，检测时间还较长，检测灵敏度还比较低。

2、这些快速技术都是针对总菌进行检测的，对某一种或某一类特定菌的检测并没有报道，而在实际应用中，人们所需要测量绝大多数为特定的一种或一类细菌，如大肠杆菌、致病性大肠杆菌等，因为只有知道了细菌的具体种类，才有可能采取相应的办法进行处理。现在，随着免疫技术的发展，人们也开发出针对特定菌的快速免疫检测方法，但是，这类方法都需要两个抗体，首先是一个针对某一种或某一类特定菌的检测抗体，然后是一个用于信号检测的酶标抗体，比较复杂。

发明内容

为了解决现有技术中的上述不足，本发明提供了一种检测精度高、可检测特定微生物、检测灵敏度高的某一种或某一类特定微生物的检测方法。由于本发明所提供的方法不需细胞培养，所以也是一种快速的细菌检测方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种特定微生物的检测方法，包括以下步骤：

a、捕捉步骤

选择对应于特定微生物种类的抗体，通过抗体和特定种类微生物之间的特异性反应捕捉被测样本中的特定微生物；

b、分离步骤

分离捕捉到的特定微生物和被测样本；

c、酶释放步骤

向分离后特定微生物的溶液中加入过氧化氢酶释放试剂，使得所述特定微生物中的过氧化氢酶释放，进入溶液中；

d、检测步骤

向上述溶液中添加过氧化氢，并等待；

检测得到过氧化氢酶的浓度，进而得到所述特定微生物的浓度。

作为优选，在所述步骤b中，利用免疫磁珠或免疫层析方法实现分离。

作为优选，在所述步骤d中，通过检测过氧化氢浓度的变化，从而得到过氧化氢酶的浓度。

作为优选，利用压力传感器或电化学方法来检测过氧化氢浓度的变化。

本发明的技术构思是：利用免疫反应捕捉特定微生物种类，然后分离特定微生物(一种或一类)和被测样本；再利用特定微生物自身含有的过氧化氢酶进行检测，从而避免了一般免疫检测中需要额外的第二抗体进行标记的弊端。同时，通过对过氧化氢酶催化底物的检测，充分利用酶的信号放大作用，实施高灵敏的检测。

如图1所示，第一步，通过抗原(特定微生物种类)和抗体(对应于特定种类微生物)之间的特异性反应，有选择的捕捉被测样本中的特定微生物。由于抗体和抗原间特异性反应的高度选择性，这样就保证了能够按实际要求检测特定微生物。

在抗原和抗体间特异性反应发生后，由于实际的被测样本中总是会含有各种各样复杂的成分，而这些不确定的复杂成分可能会对下一步的测量造成干扰，这也是很多快速检测方法会得到错误信号的原因。为了避免这一问题，本发明方法的第二步是采用分离方法，将被抗体捕捉到的特定微生物细胞和被测样本分离开来，然后加入特定的检测溶液。这样，在接下来的分析中，除了被捕捉到的微生物细胞的数量不知道外，其他所有溶剂和溶液都是预知成分的，这样就大大提高了检测的可靠性。被抗体所捕捉到的微生物细胞和被测样本的具体分离方法可以采用免疫磁珠方法、也可以采用层析分离的方法，这些方法都有相关报道。

第三步，自然界的微生物可大致分为好氧、厌氧和兼氧三大类。而对食品安全造成危害的绝大多数是好氧和兼氧菌。所有的好氧菌和兼氧性菌在呼吸的过程中都会产生过氧化氢，而过氧化氢对细胞有毒害作用。因此，好氧菌和兼氧性菌自身都含有过氧化氢酶以分解呼吸过程中产生的过氧化氢。本发明就是利用这一事实，将微生物细胞内所含的过氧化氢酶释放出来，通过检测过氧化氢酶的多少，来推知溶液中特定微生物细胞的浓度。因此，向特定微生物溶液中加入过氧化氢酶释放试剂，溶液中特定微生物含有的过氧化氢酶释放出。

第四步，向特定微生物溶液中加入一定量的过氧化氢，然后检测在过氧化氢酶的催化作用下，一定时间后过氧化氢浓度的变化情况。过氧化氢浓度的检测可以采用电化学检测方法，也可以采用物理的压力检测方法。通过过氧化氢浓度的变化可得知溶液中过氧化氢酶的浓度，进而得到特定微生物的浓度。

与现有技术相比较，本发明创造性地将免疫反应、分离技术和酶催化反应技术结合起来，提出了一种简单、准确的特定微生物的检测方法，具有诸多有益效果，如：

1、利用本发明的方法，只需要一种抗体，而不需要免疫检测中常需的酶标二抗就可以检测特定微生物(一种或一类)，简单方便。通常的检测特定菌的免疫方法除了检测抗体之外，还需要酶标抗体。酶标抗体中的抗体和酶都是生物物质，生产保存比较复杂。同时，由于这些方法需要两次抗体/抗原的反应，这样就加大了整个反应体系的复杂性，容易引起虚假、错误信号。而本发明直接利用被测细胞内的过氧化氢酶来作为“酶标”。这些过氧化氢酶就是被测细胞本身所带有的，一旦被测细胞被检测抗体捕捉后就自然存在了，无需第二步的免疫反应，所以本发明大大简化了检测过程，也降低了检测成本，具有很大的优势。

2、本发明中通过磁珠分离或层析分离，方便地排除掉被测样本中可能存在的各种干扰物质的干扰，提高了检测的精度。在实际样本，特别是环境样本的检测，样本内包含有各种不可预知的复杂成分。这些样本背景成分很有可能会对免疫检测带来干扰信号，这也是免疫检测所面临的一大挑战。本发明中，在避免了采用酶标抗体的基础上，进一步提出利用分离方法，特别是磁珠分离技术和层析分离技术，有选择性的去除被测样本的本底干扰信号，实现免疫检测，这样对促进本发明的适用性具有极大的帮助。

3、本发明利用了特定微生物自身所携带的过氧化氢酶，采用过氧化氢为底物，方便地利用压力法或电化学方法实现过氧化氢酶浓度的检测，大大地简化了检测装置，提高了检测的灵敏度。过氧化氢是一种重要的化学物质，人们也已经开发出各种诸如分光光学、化学发光等检测方法。本发明中结合所发明的方法在较短时间(<30分钟)检测特定种类菌的目的，并考虑到本发明方法有在环境、食品等领域中实现现场检测的巨大潜力，提出了主要采用压力法或电化学方法来对过氧化氢浓度进行检测，从而进一步对过氧化氢酶浓度进行检测，这些方法具有方便、快捷优点，能够实现现场样本的快速检测。

附图说明

图1是本发明检测方法的流程示意图；

图2是实施例1中检测方法的流程示意图；

图3是实施例2中检测方法的流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明作进一步详尽描述。

实施例1：

一种特定微生物的检测方法，用于检测食品中的致病性大肠杆菌O157：H7，如图2所示，所述方法包括以下步骤：

a、捕捉步骤

选择对应于大肠杆菌O157：H7的抗体，并将所述抗体固定在磁珠上；

所述磁珠可以按文献(如Colloids Surf.A：Physicochem.Eng.Aspects212(2003)219)上的方法制备，也可以购买商品化的产品。所用的抗体，可以按标准免疫方法制备，也可以购买商品化产品；抗体在磁珠上的固定也采用常用的分子生物固定方法；有一些商品化的产品(如自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所所提供的商品)已经将大肠杆菌O157：H7抗体固定在磁珠上，这样商品就可以直接使用；

取免疫磁珠20微升置于试管中，再加被测液1毫升，不断摇动防止磁珠沉淀，同时使被测液与磁珠充分混匀并结合，被测液中的大肠杆菌O157：H7与所述抗体发生特异性反应，从而捕捉到被测样本中的大肠杆菌O157：H7；

b、分离步骤

被测液与磁珠混合作用3-10分钟后打开管盖，用磁铁将磁珠吸于试管底部，小心吸出悬浮液弃掉，再用pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤磁珠多次，以确保消除被测液残留物对测量的影响，实现大肠杆菌O157：H7与被测液的分离，同时也提高了检测的精度；

c、酶释放步骤

向试管中加入pH7.1的磷酸盐缓冲液，使得最终的溶液体积为1毫升；

向溶液中加入过氧化氢酶释放试剂，如氯化甲基二乙基苯胺或其他常见的表面活性剂、杀菌剂，使得过氧化氢酶释放试剂在溶液中的最终浓度为1％；

大肠杆菌O157：H7内含有的过氧化氢酶释放出来，进入溶液中；

d、检测步骤

向溶液中加入过氧化氢，使得过氧化氢在溶液中的最终浓度为1％；

在确保试管内气压和外界大气压相同后，用橡皮塞密闭试管，并等待15分钟；

用针刺穿橡皮塞，用压力传感器测量密闭试管中的气压(所用的压力传感器应能检测1毫米水柱的压力变化)；根据实际传感器的性能，可用绝对压力传感器或相对压力传感器；

试管中气压的变化对应着溶液中过氧化氢浓度的变化(由于过氧化氢在过氧化氢酶的作用下，分解产生氧气：2H₂O₂＝2H₂O+O₂；在一密闭气室中，新产生的氧气将会导致气压上升，而且所产生的氧气的量对应着所消耗的过氧化氢的量)；而过氧化氢的浓度变化则对应于溶液中过氧化氢酶的浓度；在本检测条件下，这些变化最终对应于大肠杆菌O157：H7的浓度，从而达到检测目的。

实施例2：

一种特定微生物的检测方法，用于检测食品中的沙门氏菌，如图3所示，所述方法包括以下步骤：

a、捕捉步骤

选择沙门氏菌抗体，并将所述抗体固定在免疫层析材料的检测带上；

将所述免疫层析材料的一端置于被测样本溶液中，被测样本中的沙门氏菌与免疫层析材料检测带上的抗体发生特异性反应，从而捕捉到样品中的沙门氏菌；

b、分离步骤

将层析片上检测带部分剪下，确保消除了被测样本残留物对测量的影响，同时也提高了检测的精度；将检测带部分放入1毫升pH7.2的磷酸盐缓冲液中，完成了沙门氏菌和被测样本的分离；

c、酶释放步骤

向溶液中加入过氧化氢酶释放试剂，如氯化甲基二乙基苯胺或其他常见的表面活性剂、杀菌剂，使得过氧化氢酶释放试剂在溶液中最终的浓度为1％；

沙门氏菌内含有的过氧化氢酶释放出来，进入溶液中；

d、检测步骤

向溶液中加入过氧化氢，使得其在溶液中的最终浓度为1％；

在确保试管内气压和外界大气压相同后，将试管用橡皮塞密闭，等待15分钟；

过氧化氢在过氧化氢酶的作用下，分解产生氧气；在一密闭气室中，新产生的氧气将会导致气压上升，而且所产生的氧气的量对应着所消耗的过氧化氢的量；

采用标准电化学三电极安培检测法，检测溶液中的过氧化氢浓度；铂电极上的所施加的工作电压为相对于银/氯化银参比电极的电压为0.7伏；由于过氧化氢为一电化学活性物质，在此外加电压的铂工作电极上，过氧化氢将会被氧化分解：

2H₂O₂＝2H₂O+O₂

过氧化氢的氧化电流和溶液中过氧化氢的浓度成一定的比例关系，因此通过电流的测量就可以推知溶液中过氧化氢的浓度；比较反应前后溶液中过氧化氢浓度的变化，即可推知过氧化氢酶的浓度，进而得到沙门氏菌的浓度，从而达到检测的目的。

需要指出的是，上述实施方式不应理解为对本发明保护范围的限制。本发明的关键是，利用免疫反应捕捉特定微生物，然后分离特定微生物和被测样本；向特定微生物溶液中加入过氧化氢，从而检测得到特定微生物自身含有的过氧化氢酶，进而得到特定微生物的浓度。在不脱离本发明精神的情况下，对本发明作出的任何形式的改变均应落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1、一种特定微生物的检测方法，包括以下步骤：

a、捕捉步骤

选择对应于特定微生物种类的抗体，通过抗体和特定种类微生物之间的特异性反应捕捉被测样本中的特定微生物；

b、分离步骤

分离捕捉到的特定微生物和被测样本；

c、酶释放步骤

向分离后特定微生物的溶液中加入过氧化氢酶释放试剂，使得所述特定微生物中的过氧化氢酶释放，进入溶液中；

d、检测步骤

向上述溶液中添加过氧化氢，并等待；

检测得到过氧化氢酶的浓度，进而得到所述特定微生物的浓度。

2、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：在所述步骤b中，利用免疫磁珠或免疫层析方法实现分离。

3、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：在所述步骤d中，通过检测过氧化氢浓度的变化，从而得到过氧化氢酶的浓度。

4、根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：利用压力传感器或电化学方法来检测过氧化氢浓度的变化。

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