CN103412017B - 一种病原微生物的快速检测方法及检测设备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于多功能磁性纳米材料和压电电化学传感器的病原微生物的检测方法以及一种实施该方法的流动检测设备，所述方法具有检测快速、灵敏和特异的优点，适用于病原微生物的现场快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种现场病原微生物的快速检测方法及检测设备，属于微生物快速检测技术领域。
背景技术
石英晶体微天平(QCM，QuartzCrystalMicrobalance)利用了石英晶体谐振器的压电特性，将石英晶振电极表面质量变化转化为石英晶体振荡电路输出电信号的频率变化，进而通过计算机等其他辅助设备获得高精度的数据，其测量精度可达纳克级。而电化学石英晶体微天平(EQCM，electrochemicalquartzcrystalmicrobalance)则是同时利用了电化学检测的高灵敏度及QCM可实时检测表面质量及阻尼的特点，可现场检测电极表面纳克级的质量变化、溶液粘度和密度性质以及修饰膜粘弹性等参数的改变，所获得的信息量远比单纯电化学检测的丰富，在生物医学的研究和应用领域具有非常好的应用前景。
传染病病原的现场快速检测对于重大疫情防控和预防生物恐怖具有非常重要的意义。传统的细菌检测手段如细胞培养、荧光测试等不仅检测周期长而且耗费大量的人力物力，很难适应疫情现场复杂环境下的检测要求。目前，酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)、聚合酶链反应法(polymerasechainreaction，PCR)等常用的检测手段与传统方法相比，虽然能够有效的缩短分析时间，但仍需3-4个小时左右，而且不能检测复杂介质体系的样本。基于EQCM的生物传感器检测技术相比以上方法虽具有快速、灵敏、简便等特点，然而在现场条件下，受样本复杂介质体系的影响，常常出现背景干扰大、可靠性差等严重影响现场检测性能的问题，目前还难以在现场得到有效的应用。
发明内容
针对目前传染病病原现场检测中存在的样本背景干扰大和依赖单一传感技术可靠性差等诸多问题，本发明的目的是提供现场病原微生物的快速检测方法及检测设备。
本发明提供的检测方法是基于多功能磁性纳米材料和压电电化学传感器建立的，所述方法包括：
(1)以抗待检测病原微生物抗原的抗体修饰具有电化学活性的磁性纳米材料；
(2)以步骤(1)所述抗体修饰压电电化学流动检测传感器的金表面；
所述压电电化学流动检测传感器是由压电传感器、电化学传感器和一个流动进样泵三个主体部分组成，实际为一个工作系统(即压电电化学工作系统)，一个传感界面(即修饰有敏感材料的电极表面)，所述金表面是指镀在压电电化学传感界面的金(基质为石英材料，表面镀镉，再镀金)；
(3)将步骤(1)得到的磁性纳米材料与待检测病原微生物抗原样本在37℃培养箱的环境中共孵育，形成纳米材料和目标抗原的复合物，将复合物置于磁场环境中(磁铁)，利用磁铁对磁性纳米材料的吸附力，获得从复杂体系分离出并在磁铁作用下得到富集的待测样品；
(4)将步骤(3)获得的待测样品注入流动检测系统，所述检测系统含有步骤(2)所述的压电电化学流动检测器；
(5)检测所述传感器金表面的压电和电化学信号。
在本发明的一个优选技术方案中，在步骤(3)和(4)之间，所述方法还包括以PBS洗液对所述共孵育物及分离和富集后获得的待测样品进行流动清洗的步骤。
在本发明的另一个优选技术方案中，在步骤(4)和(5)之间，所述方法还包括以PBS洗液对所述待测样品进行流动清洗的步骤。
在本发明的又一个优选技术方案中，步骤(2)所述抗体为单克隆抗体。
在本发明的一个优选技术方案中，在步骤(1)中，采用戊二醛介导法对所述磁性纳米材料进行所述抗体的修饰。
在本发明的另一个优选技术方案中，在步骤(2)中，先以巯基十一酸溶液浸泡传感器金表面以形成表面含有羧基的单分子层，再以碳二亚胺孵育以激活金表面的羧基，最后再滴加抗体进行修饰。
本发明还提供了一种采用本发明所述检测方法的流动检测设备，所述设备包括样品池、流动进样装置、进样流路、具有金表面的压电电化学传感器、谐振器、计数器及工作电脑，所述金表面被抗待检测抗原抗体修饰，所述设备的工作流程为：
(1)将经磁分离后获得的待测样品盛装于样品池中，由流动进样装置吸入进样流路；
(2)待测样品由进样流路流经压电电化学传感器金表面，引起压电传感器表面振动频率改变，经谐振器、计数器将频率改变信号转换为电信号，同时由于所制备的磁性纳米材料具有电化学活性，电化学传感器接收到电流改变，两种电信号分别输入工作电脑；
(3)工作电脑界面显示频率-时间谱图和电流-时间谱图。
在一个优选技术方案中，所述流动进样装置包括一六通进样阀和一注射泵。
在一个优选技术方案中，步骤(1)所述的磁分离是将被抗待检测抗原抗体修饰的磁性纳米材料与待检测病原微生物抗原样本共孵育，形成纳米材料和目标抗原的复合物，利用磁力获得富集的待测样品。
在一个优选技术方案中，所述设备的检测系统的传感界面在上，待检测缓冲液在下。所述传感界面是指修饰有敏感材料的电极表面。
本发明将多功能磁性纳米材料引入到压电电化学传感检测，通过制备具有电化学活性和特异结合能力的多功能磁性纳米材料，利用其兼具样本快速前处理和增强压电电化学传感信号的优势，首次建立基于多功能磁性纳米材料和压电电化学传感流动检测的系统，具有特异亲和、均相结合、快速分离、易于在传感器表面富集，和同时增强电化学和压电传感信号的优点，在样本前处理和传感信号增强两个环节均可发挥作用。本发明选取土壤、粪便稀释液等复杂介质中志贺菌这种代表性传染病病原为检测对象，系统检测时间约为30min，检测灵敏度为1000CFU/ml，比酶联免疫吸附法提高了50倍，同时该系统检测特异性很高，可以将志贺菌从其相近菌种中特异识别出来。本发明公开的多功能磁性纳米材料和压电电化学传感器整合联用检测方法，解决了传染病病原现场检测中普遍存在的背景干扰这一关键问题，提高了传染病病原现场快速检测能力，能为疫情防控和生物反恐提供重要技术支持。
附图说明
图1压电电化学传感流动检测系统示意图；
图2基于多功能磁性纳米材料和压电电化学传感流动检测系统的检测原理示意图；
图3压电传感流动检测志贺菌的实时频率响应图；
图4电化学传感流动检测志贺菌的电流响应图；
图5志贺菌单克隆抗体修饰的压电电化学传感流动检测系统对志贺菌的检测结果；
图6志贺菌单克隆抗体修饰的压电电化学传感流动检测系统对志贺菌及其相近菌种的响应。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权利要求所限定的范围构成进一步的限定。
制备实施例：
(1)共沉淀法制备具有电化学活性的磁性纳米材料。具体制备方法是：选择FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O为铁源，取4.25gFeCl2·4H2O和2gFeCl3·6H2O溶于25mL36.5％的HCl溶液中，将该混合液逐滴加入到250mL、1.5MNaOH中，同时进行机械搅拌，待出现黑色沉淀后，然后离心清洗，将所得产物在60℃烘箱干燥待用；取0.25g制备所得产物依次分散在10mL去离子水、10mL36.5％的盐酸和10mL苯胺单体溶液中，机械搅拌15min后，加入氧化剂25mL、1.5M过硫酸铵溶液，与苯胺单体聚合于磁性纳米颗粒表面，在冰水浴(0℃)中机械搅拌5h。反应完毕后，将所得黑色溶液离心，用盐酸冲洗直至颜色消失，并依此用甲醇和二乙酯清洗3次，所得粉体与室温下晾置。
(2)戊二醛介导法制备具有电化学活性和特异结合能力的磁性纳米材料。具体制备方法是：将志贺菌单克隆抗体、2％戊二醛、具有电化学活性的磁性纳米材料室温下共孵育2h，再1％的牛血清白蛋白(BSA)封阻未修饰抗体的活性位点，以降低非特异性吸附。
(3)本发明所述压电电化学流动检测传感器金表面修饰志贺菌单克隆抗体，具体修饰方法是：将传感器金表面置于H2SO4和30％H2O2混合溶液(体积比为7∶3)中清洗，除去金表面杂质，然后将传感器金表面置于10mL巯基十一酸(11-MUA)溶液中浸泡10h以形成表面含有羧基的单分子层；接着用75mL碳二亚胺(EDC)溶液孵育2h，用以激活金表面的羧基，完成志贺菌单克隆抗体固定前的修饰；然后向金表面滴加一定浓度(几十微克每毫升)的志贺菌单克隆抗体溶液，4℃过夜，最后用1％的牛血清白蛋白(BSA)封阻未修饰抗体的活性位点。
检测实施例：
图1显示了本发明的压电电化学传感流动检测系统示意图，该传感检测系统采用传感界面在上，待检测缓冲液在下的设计方案，可以减少介质中生物大分子对传感器传感界面的重力干扰。其中，压电电化学传感界面修饰有可特异识别目标病原的单克隆抗体，注射泵用作流动检测的动力，待测样品通过六通阀注入流动PBS缓冲液中。
本发明系统检测传染病病原的具体过程如下：志贺菌多克隆抗体修饰的具有电化学活性的磁性纳米材料同待检测目标抗原室温下共孵育2h，形成纳米材料和目标抗原的复合物，在磁场作用下(磁铁)将其与复杂介质主体分离，这主要利用了磁铁对磁性纳米材料的强吸引力；采用对复合介质施加磁场(磁铁)的方法将磁性纳米-抗原复合物富集，实现进一步浓缩分离。未结合目标抗原的磁性纳米颗粒，通过撤销外加磁场后经由流动液(PBS)清洗，而识别目标物的磁性纳米颗粒则经流动进样装置被修饰在传感器金表面的单克隆抗体捕获，形成免疫夹心复合物，引起压电传感器振动频率的下降，以及时间-电流(或交流阻抗值)的改变，即得到双重检测响应信号。
图2显示了基于多功能磁性纳米材料和压电电化学传感流动检测系统的检测原理示意图。其中，EQCM晶振片为压电电化学传感器的金表面。
(1)采用美国stanfordresearchsystem公司QCM-200压电石英晶体微天平、上海辰华仪器有限公司CHI660D电化学工作站和保定兰格恒流泵有限公司LSP01-1A流动注射泵整合联用装置对样品志贺菌进行检测。图3为利用本发明系统在流动进样的检测模式下对志贺菌的实时响应情况。从图3中可以看出，当通入志贺菌抗原后压电频率值立即呈现出快速下降趋势，大约在10min内下降约26Hz，之后频率值便趋于相对稳定，再次通入PBS缓冲液后，频率出现了大约15Hz的上升，这可能是由于传感器金表面结合不牢固的志贺菌抗原被冲洗下来的原因。整个检测过程可在30min之内完成，而且可以避免进样时的扰动，具有快速、稳定的特点。从图4中可以看出，在样品流过传感器表面30s内，当通入不同浓度志贺菌抗原(曲线a代表为PBS缓冲液，作空白对照组；曲线b代表志贺菌浓度为3.5×103CFU/ml；曲线c代表志贺菌浓度为3.5×104CFU/ml；曲线d代表志贺菌浓度为3.5×105CFU/ml；)，即时电流随样品浓度增大而增大。
(2)采用美国stanfordresearchsystem公司QCM-200压电石英晶体微天平、上海辰华仪器有限公司CHI660D电化学工作站和保定兰格恒流泵有限公司LSP01-1A流动注射泵整合联用装置对样品志贺菌进行检测。图5为本发明系统与酶联免疫吸附法(ELISA)在检测系列浓度志贺菌的对比结果。图5中的QCM为压电传感器。从中可以看出，传统的ELISA方法在检测较高浓度志贺菌抗原时具有很好的信号响应，但对较低浓度的志贺菌却未能表现出较好的梯度信号值，可分辨的检测下限仅能达到3.5×107CFU/ml的水平，整个检测过程至少需要3小时；而本发明系统的检测灵敏度(1000CFU/ml)，比酶联免疫吸附法提高了2个数量级，且检测时间仅需要0.5小时，由此可见，同ELISA方法相比，该发明系统具有灵敏、快速的特点。
(3)采用美国stanfordresearchsystem公司QCM-200压电石英晶体微天平、上海辰华仪器有限公司CHI660D电化学工作站和保定兰格恒流泵有限公司LSP01-1A流动注射泵整合联用装置对样品志贺菌进行检测。图6考察了本发明系统的特异性，如图所示，志贺菌单克隆抗体修饰的压电电化学传感流动检测系统在静态加样检测模式下对3.5×105CFU/ml志贺菌以及同等浓度的沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、李斯特菌等相近菌种的响应情况，结果显示该系统对志贺菌产生了约132Hz的响应信号，而对相近菌种的响应均小于5Hz。其中，对李斯特菌几乎无响应，而对志贺菌却表现出随浓度增加而增加的响应信号值，结果表明该系统可以将志贺菌从其相近菌种中特异识别出来。
Claims (10)
1.一种病原微生物的检测方法，所述方法包括：
(1)以抗待检测病原微生物抗原的抗体修饰具有电化学活性的磁性纳米材料；其中，所述具有电化学活性的磁性纳米材料是由FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O为铁源通过共沉淀法与苯胺单体聚合于纳米颗粒表面制得的；
(2)以步骤(1)所述抗体修饰压电电化学流动检测传感器的金表面；
(3)将步骤(1)得到的磁性纳米材料与待检测病原微生物抗原样本在具有37℃培养箱的环境中共孵育，形成纳米材料和目标抗原的复合物，将复合物置于磁场环境中，利用磁铁对磁性纳米材料的吸附力，从复杂体系中分离出并在磁铁作用下得到富集的待测样品；
(4)将步骤(3)获得的待测样品注入流动检测系统，所述检测系统含有步骤(2)所述的压电电化学流动检测传感器；
(5)检测所述传感器金表面的压电和电化学信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)和(4)之间，所述方法还包括以PBS洗液对所述共孵育物及分离和富集后获得的待测样品进行流动清洗的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)和(5)之间，所述方法还包括以PBS洗液对所述待测样品进行流动清洗的步骤。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述抗体为单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用戊二醛介导法对所述磁性纳米材料进行所述抗体的修饰。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，先以巯基十一酸溶液浸泡传感器金表面以形成表面含有羧基的单分子层，再以碳二亚胺孵育以激活金表面的羧基，最后再滴加抗体进行修饰。
7.一种采用权利要求1所述检测方法的流动检测设备，所述设备包括样品池、流动进样装置、进样流路、具有金表面的压电电化学传感器、谐振器、计数器及工作电脑，所述金表面被抗待检测抗原抗体修饰，所述设备的工作流程为：
(1)将经磁分离后获得的待测样品盛装于样品池中，由流动进样装置吸入进样流路；
(2)待测样品由进样流路流经压电电化学传感器金表面，引起压电传感器表面振动频率改变，经谐振器、计数器将频率改变信号转换为电信号，同时由于所制备的磁性纳米材料具有电化学活性，电化学传感器接收到电流改变，两种电信号分别输入工作电脑；
(3)工作电脑界面显示频率-时间谱图和电流-时间谱图。
8.根据权利要求7所述的设备，其特征在于，所述流动进样装置包括一六通进样阀和一注射泵。
9.根据权利要求7所述的设备，其特征在于，步骤(1)所述的磁分离是将被抗待检测抗原抗体修饰的磁性纳米材料与待检测病原微生物抗原样本共孵育，形成纳米材料和目标抗原的复合物，利用磁力获得富集的待测样品。
10.根据权利要求7所述的设备，其特征在于，所述设备的检测系统的传感界面在上，待检测缓冲液在下。
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