CN102183512B - 一种基于化学发光原理的活细胞检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以活细胞的胞内酶作为检测靶点，以化学发光作为胞内酶活性的检测信号，设计一种非培养、快速的活细胞检测的新方法。本发明方法以能穿过细胞膜的1，2-二氧环乙烷类化学发光剂为酶底物，该底物进入细胞内部后与胞内活性水解酶发生水解反应并产生化学发光，化学发光的强度取决于活细胞的数量和新陈代谢强度，因此可作为检测细胞活力的指标。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种基于化学发光原理的活细胞检测方法。
(二)背景技术
细胞活性检测的常规方法有MTT法、荧光染色法和ATP生物发光法等。MTT法是根据活细胞的线粒体脱氢酶能使四噻唑盐MTT裂解为蓝紫色的结晶物Formazan，其生成量与存活细胞数呈正比，根据颜色的深浅，用比色法进行检测。MTT法操作简便，敏感度高，可重复性比较好，给细胞培养技术带来了很大的方便。但是MTT法有无法克服的弱点：Formazan的生成受作用时间的影响，样品较多时测定的A值随时间而变，会增加实验误差。对悬浮细胞来说，经MTT染色后，用DMSO溶解后，必须将每孔中的细胞吸出，离心去除上清，沉淀用DMSO溶解后再测定A值，操作繁琐。ATP生物发光法是20世纪80年代发展起来的一种检测技术，ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，每种微生物细胞中的ATP含量是恒定的。通过测定样品中的ATP浓度，即可推算出活菌数。ATP生物发光法的检测过程无需细胞培养，操作简便，在短时间内即可得到检测结果，是目前检测微生物最快的方法之一。但是ATP生物发光法存在非菌类的“游离ATP”和其他成分干扰的问题，如何简易可靠地去除这个本底信号而又不影响“微生物ATP”检测的灵敏度目前还没有得到有效解决。此外，由于细胞表层有细胞膜和细胞壁包裹，样品未经处理是不能测定ATP的，如果ATP提取过程处理不当的话也会产生假阳性信号。综上所述，目前微生物快速检测方法均存在一定的局限性，还没有一种方法能够真正达到检测速度快、检测的准确率高并且检测限低的要求。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种基于化学发光原理的快速检测细胞活力的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种基于化学发光原理的活细胞检测方法，所述方法包括：以结构如式(I)所示的1，2-二氧环乙烷类化学发光剂为酶反应底物，加入待测细胞，于pH 8.0～8.5的缓冲液中室温下孵育10～20分钟后，取细胞液测定化学发光强度，根据发光强度大小判断细胞活力高低；
式(I)中X、Y为卤素，R为C1～C20的烷基，A为PO3 2-(此时为磷酸酶底物)、(此时为脂肪酶底物)或
(此时为乳糖酶底物)。
所述缓冲液为本领域常规用于细胞的缓冲液，如Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。
本发明的检测原理是基于活细胞内的水解酶能催化1，2-二氧环乙烷类酶底物使之发生水解反应并产生一种″辉光型″化学发光信号，该信号的强弱与细胞内水解酶的活性成正比，光强度值越高，细胞活力越强。由于不具有活力的细胞很快丧失新陈代谢能力，故而不能生成化学发光信号。本发明的技术方案是以活细胞内广泛存在的具有水解酶活性的碱性磷酸酶、脂肪酶或乳糖酶等作为检测靶点，选用一种能够快速穿透细胞膜的1，2-二氧环乙烷类化学发光底物(结构通式如式(I)中所示)，该底物可按本领域常规方法进行合成(合成步骤见后)。该酶底物能够穿透细胞膜，进入细胞内部后与胞内活性水解酶(包括脂肪酶、碱性磷酸酶和乳糖酶，可根据底物酶的不同，选择不同的A取代基)发生水解反应并产生化学发光，化学发光的强度取决于活细胞的数量和新陈代谢强度，因此可作为检测细胞活力的指标。该方法克服了ATP生物发光法的缺点，直接采用活细胞的胞内酶作为检测靶点，避免了外源性的生物残留物的影响；以化学发光作为胞内酶活性的检测信号，降低了其他方法中常出现的内生背景荧光，从而有效地降低本底干扰。
本发明无需细胞培养，可大大缩短检测时间，同时大幅度提高检测灵敏度。
具体的，所述方法包括：
(1)用DMSO溶解式(I)所示的1，2-二氧环乙烷类化学发光剂，制备成1mmol/l的底物储备液，2～8℃下密闭冷冻保存；将底物储备液加至pH8.0～8.5的Tris缓冲液中，配制成2μmol/l的底物溶液；
(2)吸取待测菌液样品0.2ml，移至96孔聚苯乙烯微孔板中；加入0.2ml上述底物溶液，搅匀后在室温下孵育15～20分钟，用微孔板发光仪测定477nm处的化学发光强度，根据发光强度大小判断细胞活力高低。
上述方法只是通过发光强度大小大致判断细胞活性的高低，为达到准确技术的效果，所述方法可同时以梯度浓度的标准菌液于相同条件下测定化学发光强度，以发光强度为纵坐标、标准菌液浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据样品细胞的发光强度，对照标准曲线，计算获得待测样品中活细胞的浓度。
本发明1，2-二氧环乙烷类化学发光剂可按本领域常规方法合成(例如CN1876663A，US5773628等)，具体合成路线如下：
磷酸酶底物：
脂肪酶底物：
乳糖酶底物：
本发明的有益效果主要体现在：(1)适用多种细胞的检测：可以分析哺乳动物、植物、细菌和酵母等多种细胞；具水解酶活性的磷酸酶、脂肪酶或乳糖酶广泛存在于各种细胞内，因而光信号能够在各种活细胞上产生，这样才能真正做到广谱检测，用起来不会有漏检的问题。(2)减少检测时间：不需进行繁琐的样品准备和耗时的孵育步骤，化学发光底物能够在较短的时间内穿过细胞膜，并与细胞内的活性酶发生水解反应，产生足够的光信号便于检测，从而实现快速检测；(3)水解产生的光信号能定位在活细胞上，实现活细胞的“原位”检测；因细胞死后，胞内的水解酶很快便失去了活性，也就不会产生化学发光，这种与活细胞相伴生的光信号提高了该检测方法的特异性和可靠性；(4)高灵敏度：化学发光检测法的背景发光很低，信噪比比率很高，具有很高的灵敏度。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1)用1ml无水DMSO溶解1mg磷酸酶底物(I-1)(R为辛基，X为5位氯元素、Y为邻位氯元素)，制备成1mmol/l的磷酸酶底物储备液，2～8℃下密闭冷冻保存；加10μl磷酸酶底物储备液至5ml Tris缓冲液中，配制成2μmol/l、0.2％DMSO的磷酸酶底物溶液。
2)将已知浓度的人工大肠杆菌菌液离心收集菌群，去除上清液，加入Tris缓冲液(pH8.0)，10倍稀释成一系列浓度的菌液标准品(细菌数量调整为104、105、106、107个/ml)。
3)分别吸取上述不同浓度的大肠杆菌菌液0.2ml，移至96孔聚苯乙烯微孔板中，加入0.2ml上述磷酸酶底物溶液，搅匀后在室温下孵育15分钟，引发化学发光，并迅速用微孔板发光仪测定477nm处的化学发光强度，以发光强度为纵坐标、标准菌液浓度为横坐标，绘制标准曲线并拟合线性回归方程。
4)取已知浓度的大肠杆菌菌液进行检测，根据样品在477nm处的发光强度，对照标注曲线，计算出待测样品中大肠杆菌的浓度，计算所得结果与实际浓度基本符合，偏差在5％以内。
实施例2：
1)用1ml无水DMSO溶解1mg脂肪酶底物(I-2)(R为甲基，X为5位氯元素、Y为邻位氯元素)，制备成1mmol/l的脂肪酶底物储备液，2-8℃下密闭冷冻保存。加10μl脂肪酶底物储备液至5ml Tris缓冲液中，配制成2μmol/l、0.2％DMSO的脂肪酶底物溶液。
2)将已知浓度的毕赤酵母GS115菌液离心收集菌群，去除上清液，加入Tris缓冲液(pH8.5)，10倍稀释成一系列浓度的菌液标准品(酵母数量调整为104、105、106、107个/ml)。
3)分别吸取上述不同浓度酵母菌液0.2ml，移至96孔聚苯乙烯微孔板中，加入0.2ml上述脂肪酶底物溶液，搅匀后在室温下孵育15分钟，引发化学发光，并迅速用微孔板发光仪测定477nm处的化学发光强度，以发光强度为纵坐标、标准菌液浓度为横坐标，绘制标准曲线并拟合线性回归方程。
4)取已知浓度的毕赤酵母GS115菌液进行检测，根据样品在477nm处的发光强度，对照标准曲线，计算出待测样品中酵母的浓度，计算所得结果与实际浓度基本符合，偏差在3％以内。
实施例3：
1)用1ml无水DMSO溶解1mg乳糖酶底物(I-3)(R为乙基，X为5位氯元素、Y为邻位氯元素)，制备成1mmol/l的乳糖酶底物储备液，2～8℃下密闭冷冻保存。加10μl乳糖酶底物储备液至5ml Tris缓冲液中，配制成2μmol/l、0.2％DMSO的乳糖酶底物溶液。
2)将已知浓度的乳酸菌液离心收集菌群，去除上清液，加入Tris缓冲液(pH8.0)，配制成一定浓度的菌液样品(乳酸菌数量调整为105和106个/ml)。
3)吸取上述不同浓度的乳酸菌液0.2ml，移至96孔聚苯乙烯微孔板中，加入0.2ml上述乳糖酶底物溶液，搅匀后在室温下孵育15分钟，引发化学发光，并迅速用微孔板发光仪测定477nm处的化学发光强度；
4)根据样品在477nm处的发光强度大小，可判断不同待测样品中乳酸菌的活性大小，结果显示：106个/ml的菌液样品的发光强度明显强于105个/ml的菌液样品。
Claims (3)
1.一种基于化学发光原理的活细胞检测方法，所述方法包括：以结构如式（Ⅰ）所示的1,2－二氧环乙烷类化学发光剂为酶反应底物，加入待测细胞样品，于pH8.0~8.5的缓冲液中室温下孵育10~20分钟后，取细胞液测定化学发光强度，根据发光强度大小判断细胞活力高低；
式（Ⅰ）中X、Y为卤素，R为C1~C20的烷基，A为PO3 2-、或
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括：
（1）用DMSO溶解式（Ⅰ）所示的1,2－二氧环乙烷类化学发光剂，制备成1mmol/l的底物储备液，2~8℃下密闭冷冻保存；将底物储备液加至pH8.0~8.5的Tris缓冲液中，配制成2μmol/l的底物溶液；
（2）吸取待测细胞样品0.2ml，移至96孔聚苯乙烯微孔板中；加入0.2ml上述底物溶液，搅匀后在室温下孵育15~20分钟，用微孔板发光仪测定477nm处的化学发光强度，根据发光强度大小判断细胞活力高低；所述待测细胞样品为菌液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的标准菌液于相同条件下测定化学发光强度，以发光强度为纵坐标、标准菌液浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据待测细胞样品的发光强度，对照标准曲线，计算获得待测细胞样品中活细胞的浓度。
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