JP7462574B2 - ジオキセタン化合物及び微生物検出のためのそれらの使用 - Google Patents
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Description
本発明は、ジオキセタン化合物、並びに適切な分子プローブへの代謝酵素、試薬酵素若しくは参照酵素の作用の化学発光的指標、試薬酵素による細菌代謝産物若しくは栄養素の酵素的酸化から生じた過酸化水素の指標、又は栄養素、基質、代謝産物若しくは試薬酵素による作用の副生成物の役割を担う無機リン酸塩の検出を利用した、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定のためのジオキセタン化合物の使用に関する。
例えば食品、水、血液貯蔵物及びその類似物のバクテリア汚染は、重大な健康問題を引き起こす。世界保健機関によれば、水系感染症、即ち水中に伝染した病原性微生物により誘発された疾患は、世界中の多くの疾病負荷に関連する。例えば水系の下痢疾患は、一年あたり推定２００万名の死亡を招いており、その大部分は、５歳未満の小児で起こっている。
したがって、微生物、特にバクテリアを検出するための方法及び手段が、大いに探求されている。これに関係して、バクテリアの属又は種が、これらのバクテリアにより生成された特定の酵素による切断の際に検出可能なシグナル（例えば光）を発生する化合物を使用して、特異的に検出され得ることが見出された。化学発光に基づく検出方法は、蛍光又は発色に基づく方法に比較して優れた感度及びより高いシグナルノイズ比があるため、微生物、特にバクテリアの検出に特に好適である。特に化学発光は、蛍光により実現されるものの約１００～１０００倍の、著しく高いシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ）を導くことが示されている。このことは次に、蛍光に比較した化学発光の著しく高い感度を導く。
微生物の検出のための確立された系が、ルシフェラーゼ－ルシフェリン系である。Ｄ－ルシフェリンは、酸素分子、ＡＴＰ及びマグネシウムの存在下でルシフェラーゼ（オキシドレダクターゼ）により酸化されて準安定中間体となり、次に、分解して青色～緑色光を放出する、生物発光原化合物（bioluminogenic compound）である。Ｄ－ルシフェリンは
、酵素不安定基でマスキングされて、ルシフェラーゼの存在下での光放出を、同じく酵素不安定基上で作用する酵素が存在する状況で、制限することができる。例えばMasuda-Nishimuraらは、Ｄ－ルシフェリン－６－Ｏ－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシドを発光原基質として用いた大腸菌群の検出を報告した(Masuda-Nishimura et al. (2000), Letters in Applied Microbiology, 30: 130-135)。
、酵素不安定基でマスキングされて、ルシフェラーゼの存在下での光放出を、同じく酵素不安定基上で作用する酵素が存在する状況で、制限することができる。例えばMasuda-Nishimuraらは、Ｄ－ルシフェリン－６－Ｏ－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシドを発光原基質として用いた大腸菌群の検出を報告した(Masuda-Nishimura et al. (2000), Letters in Applied Microbiology, 30: 130-135)。
現在用いられる化学発光及び生物発光プローブのほとんどと異なり、（化学）発光を惹起する酸化ステップを必要とせず、したがって広範囲の化学及び生物活性を検出することができる化学プローブが、近年になり開発された。これらの化学発光プローブは、安定したジオキセタン部分を含有する。国際公開第２０１７／１３０１９１号パンフレットは、そのようなジオキセタンに基づく化学発光プローブ、並びに診断目的及びインビボイメージングのためのそれらの使用を開示している。加えて、Greenら（Green, O., Eilon, T.,
Hananya, N., Gutkin, S., Bauer, CR., Shabat, D., ACS Central Sci., 2017, 4, 349-58)は、酵素不安定基（enzyme-labile groups）でマスキングされていて酵素活性の検出に適する、水性条件下での使用に適した化学発光ジオキセタンプローブを開示している。
Hananya, N., Gutkin, S., Bauer, CR., Shabat, D., ACS Central Sci., 2017, 4, 349-58)は、酵素不安定基（enzyme-labile groups）でマスキングされていて酵素活性の検出に適する、水性条件下での使用に適した化学発光ジオキセタンプローブを開示している。
しかし、特定の微生物の検出のための微生物学の分野における化学発光ジオキセタンプローブの使用の成功は、これまでに報告されていない。実際に、「実生活（real-life）
」の条件下で微生物を検出するための化学発光プローブの開発は、プローブと、酵素不安
定性保護基を脱離するのに必要となる微生物の酵素と、化学発光反応の環境（即ち、微生物を含む培地）との複雑な相互作用のため、特に困難な課題である。微生物の検出のための適切な化学発光プローブは、（ｉ）検出される微生物にとって非毒性でなければならず、（ｉｉ）水性培地中で高度な安定性を有さなければならず、（ｉｉｉ）所与の培地中で強い化学発光シグナルを発生することができなければならず、（ｉｖ）酵素不安定性保護基を脱離する酵素の部位（例えば、グラム陰性菌のペリプラズム空間、内膜の外面又は内面、サイトゾルなど）に到達することができなければならない。その上、明白な理由として、微生物の検出のための化学発光プローブは、安価で、かつ利便性がなければならない。
」の条件下で微生物を検出するための化学発光プローブの開発は、プローブと、酵素不安
定性保護基を脱離するのに必要となる微生物の酵素と、化学発光反応の環境（即ち、微生物を含む培地）との複雑な相互作用のため、特に困難な課題である。微生物の検出のための適切な化学発光プローブは、（ｉ）検出される微生物にとって非毒性でなければならず、（ｉｉ）水性培地中で高度な安定性を有さなければならず、（ｉｉｉ）所与の培地中で強い化学発光シグナルを発生することができなければならず、（ｉｖ）酵素不安定性保護基を脱離する酵素の部位（例えば、グラム陰性菌のペリプラズム空間、内膜の外面又は内面、サイトゾルなど）に到達することができなければならない。その上、明白な理由として、微生物の検出のための化学発光プローブは、安価で、かつ利便性がなければならない。
上記要件により、化学発光ジオキセタンプローブが微生物の「実生活」検出（水性培地中）に適するか否かという問題は、化学構造から導出又は予測することができない。プローブが、「検査室」条件下で良好な性能を示すとしても、それは「実生活」適用に不適な場合がある。したがって、特定のプローブが「実生活」条件下で微生物の検出に適するか否かを決定するのに、大規模な実験が必要とされる。
現在、ルシフェラーゼ－ルシフェリン系は、微生物の検出に利用可能な唯一の効率的な「実生活」（生物）発光手段である。しかしこの系は、現行の業界標準であるにもかかわらず、複数の短所を有する。例えばそれは、複雑な多成分系であり（標準の組成：１．プロルシフェリン酵素基質（例えば、ルシフェリン－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシド）、２．ルシフェラーゼ、３．ウシ血清アルブミン、４．ＡＴＰ、５．ＥＤＴＡ、６．Ｄ／Ｌ－システイン、７．ＭｇＳＯ４、８．ピロリン酸ナトリウム）、一般には一成分系よりも複雑である。さらにルシフェラーゼ－ルシフェリン系は、ルシフェラーゼの使用を必要とするが、市販のルシフェラーゼの悪名高い不安定性により、使用が極めて高価で、使用期限が限定される。その上、ルシフェラーゼ－ルシフェリン系の感度は限られており、したがって改善の余地がある。一般に化学発光は、生物発光、特に生物発光性ルシフェラーゼ－ルシフェリン系で実現される感度の約１０～１００倍の感度を示し、特に重要なこととして、特に非常に複雑な生物発光ルシフェラーゼ－ルシフェリン系に比較して、著しく簡単かつ率直な適用を可能にするため、生物発光より好ましい。
Masuda-Nishimura et al. (2000), Letters in Applied Microbiology, 30: 130-135
Green, O., Eilon, T., Hananya, N., Gutkin, S., Bauer, CR., Shabat, D., ACS Central Sci., 2017, 4, 349-58
上記の事柄を考慮し、本発明の目的は、一般に適用されるルシフェラーゼ－ルシフェリン系の欠点を克服し、特に有意に上昇した感度を有し、ルシフェラーゼ－ルシフェリンに基づく系よりも使用が容易である、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定のためのプローブ及び方法を提供することである。
特に、化学発光指標、例えば、適切な分子プローブへの代謝酵素、試薬酵素若しくは参照酵素の作用の化学発光指標、試薬酵素による微生物の代謝産物若しくは栄養素の酵素的
酸化から生じた過酸化水素の指標、又は栄養素、基質、代謝産物若しくは試薬酵素による作用の副生成物の役割を担う無機リン酸塩の検出を利用した、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定に用いられ得る化学発光プローブ（及び方法）が、提供されなければならない。
酸化から生じた過酸化水素の指標、又は栄養素、基質、代謝産物若しくは試薬酵素による作用の副生成物の役割を担う無機リン酸塩の検出を利用した、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定に用いられ得る化学発光プローブ（及び方法）が、提供されなければならない。
上記の目的は、化学発光を利用して、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定への利用に適した特定のジオキセタン化合物により実現される。以下により詳細に説明される通り、驚くべきことに、本発明によるジオキセタン化合物が、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定を、一般に適用されるルシフェラーゼ－ルシフェリン系としてより感度があり、かつより簡単な方法で可能にする、高度に効率的なプローブであることを見出した。
第一の形態において、本発明は、式Ｉ
（式中、
Ｒ１は、酵素不安定基、及び式－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋を有するホウ素含有基から選択される分析物応答基であり；
Ｚ及びＺ’は、独立して、Ｒ４及びＯＲ５から選択され、
ここでＲ４は、－ＯＨ、－Ｏ－Ｋａｔ＋、任意に置換されたＣ１～Ｃ４アルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルキニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、任意に置換されたＣ５～Ｃ６アリール、任意に置換されたＣ５～Ｃ６ヘテロアリール、任意に置換されたＣ６～Ｃ１０アラルキル、及び任意に置換されたＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルからなる群から選択され、
Ｒ５は、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ４アルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルキニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、任意に置換されたＣ５～Ｃ６アリール、任意に置換されたＣ５～Ｃ６ヘテロアリール、任意に置換されたＣ６～Ｃ１０アラルキル、及び任意に置換されたＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又は
２個のＲ４、２個のＲ５、若しくは１個のＲ４と１個のＲ５が、介在する原子と一緒になって、５～７員の任意に置換された複素環、好ましくは飽和されていて任意に置換された複素環を形成しており；
Ｚ’’は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉから選択され、好ましくはＺ’’は、Ｆであり；
Ｋａｔ＋は、有機又は無機のカチオン、好ましくアルカリ金属カチオンであり；
Ｌは、分析物応答基Ｒ１での分析物の作用の際に、式Ｉで示される化合物の残り部分から放出される自壊性リンカー基であり、Ｌは、ペプチド、好ましくは細胞貫通ペプチド、エンドリジン又はタンパク質により任意に機能化されており；
Ｒ１が、酵素不安定基である場合、ｎは１で、ｍは１であるか、又はｎは０で、ｍは１であり；
Ｒ１が、－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋である場合、ｎ及びｍは、両者とも０又は両者とも１であり；
Ｒ１が、
である場合、ｎは０であり、ｍは１であり；
ＲＡ及びＲＣは、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ３及びＲ２－Ｑ－から、好ましくはＨ、Ｃｌ及びＲ２－Ｑから選択されるか、又はＲＡ及びＲＣの一方は、ＲＢと一緒になって、中心芳香族環のπ系を延長する任意に置換された環若しくは複素環構造を形成しており、他方は、Ｈ若しくはＲ２－Ｑ－であるが；
但し、ＲＡ及びＲＣの両方がＨではないことを条件とし、
ＲＢは、Ｈであるか、又はＲＡ及びＲＣの一方と一緒になって、前記任意に置換された環若しくは複素環構造を形成しており；
Ｑは、式Ｉで示される化合物の中心芳香族環のπ系と共役されたπ系を含む基であり；
Ｒ２は、シアノ、ニトロ、スルホキシド、スルホン、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルケニル、
カルボニル、構造
を有するカルボニル、アミド、構造
を有するアミドから選択される基であり、
ここでＹは、Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであ
り、
Ｙ’及びＹ’’は、独立して、Ｈ及び任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルから選択されるか、又は窒素原子と一緒になって、任意に置換された複素環構造、好ましくは任意に置換されたマレイミド基を形成しており；
Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ３又はＲ２－Ｑ－であるが、
但し、Ｒ３が、Ｒ２－Ｑ－である場合、ＲＡ及びＲＣの少なくとも一方、好ましくはＲＡが、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ又はＣＦ３、好ましくはＣｌであることを条件とし；
ＲＤは、直鎖状又は分枝状Ｃ１～Ｃ１８アルキル又はＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択され；
ＲＥ及びＲＦは、独立して、分枝状Ｃ３～Ｃ１８アルキル若しくはＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択されるか、又はＲＥとＲＦが、付着された炭素原子と一緒になって、任意に置換された縮合環、スピロ環若しくは多環を形成している）で示される化合物を提供する。
Ｒ１は、酵素不安定基、及び式－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋を有するホウ素含有基から選択される分析物応答基であり；
Ｚ及びＺ’は、独立して、Ｒ４及びＯＲ５から選択され、
ここでＲ４は、－ＯＨ、－Ｏ－Ｋａｔ＋、任意に置換されたＣ１～Ｃ４アルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルキニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、任意に置換されたＣ５～Ｃ６アリール、任意に置換されたＣ５～Ｃ６ヘテロアリール、任意に置換されたＣ６～Ｃ１０アラルキル、及び任意に置換されたＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルからなる群から選択され、
Ｒ５は、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ４アルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルキニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、任意に置換されたＣ５～Ｃ６アリール、任意に置換されたＣ５～Ｃ６ヘテロアリール、任意に置換されたＣ６～Ｃ１０アラルキル、及び任意に置換されたＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又は
２個のＲ４、２個のＲ５、若しくは１個のＲ４と１個のＲ５が、介在する原子と一緒になって、５～７員の任意に置換された複素環、好ましくは飽和されていて任意に置換された複素環を形成しており；
Ｚ’’は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉから選択され、好ましくはＺ’’は、Ｆであり；
Ｋａｔ＋は、有機又は無機のカチオン、好ましくアルカリ金属カチオンであり；
Ｌは、分析物応答基Ｒ１での分析物の作用の際に、式Ｉで示される化合物の残り部分から放出される自壊性リンカー基であり、Ｌは、ペプチド、好ましくは細胞貫通ペプチド、エンドリジン又はタンパク質により任意に機能化されており；
Ｒ１が、酵素不安定基である場合、ｎは１で、ｍは１であるか、又はｎは０で、ｍは１であり；
Ｒ１が、－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋である場合、ｎ及びｍは、両者とも０又は両者とも１であり；
Ｒ１が、
ＲＡ及びＲＣは、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ３及びＲ２－Ｑ－から、好ましくはＨ、Ｃｌ及びＲ２－Ｑから選択されるか、又はＲＡ及びＲＣの一方は、ＲＢと一緒になって、中心芳香族環のπ系を延長する任意に置換された環若しくは複素環構造を形成しており、他方は、Ｈ若しくはＲ２－Ｑ－であるが；
但し、ＲＡ及びＲＣの両方がＨではないことを条件とし、
ＲＢは、Ｈであるか、又はＲＡ及びＲＣの一方と一緒になって、前記任意に置換された環若しくは複素環構造を形成しており；
Ｑは、式Ｉで示される化合物の中心芳香族環のπ系と共役されたπ系を含む基であり；
Ｒ２は、シアノ、ニトロ、スルホキシド、スルホン、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルケニル、
ここでＹは、Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであ
り、
Ｙ’及びＹ’’は、独立して、Ｈ及び任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルから選択されるか、又は窒素原子と一緒になって、任意に置換された複素環構造、好ましくは任意に置換されたマレイミド基を形成しており；
Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ３又はＲ２－Ｑ－であるが、
但し、Ｒ３が、Ｒ２－Ｑ－である場合、ＲＡ及びＲＣの少なくとも一方、好ましくはＲＡが、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ又はＣＦ３、好ましくはＣｌであることを条件とし；
ＲＤは、直鎖状又は分枝状Ｃ１～Ｃ１８アルキル又はＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択され；
ＲＥ及びＲＦは、独立して、分枝状Ｃ３～Ｃ１８アルキル若しくはＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択されるか、又はＲＥとＲＦが、付着された炭素原子と一緒になって、任意に置換された縮合環、スピロ環若しくは多環を形成している）で示される化合物を提供する。
第二の形態において、本発明は、標的分析物（例えば、過酸化水素）、標的微生物又は標的代謝産物、好ましくは微生物、例えばバクテリアの検出のための式Ｉで示される化合物の使用、並びに標的分析物、標的微生物又は標的代謝産物の検出のための方法を対象とする。
第三の形態において、本発明は、生育基質、栄養素、及び代謝産物の酵素的酸化による前記生育基質、栄養素、及び／又は代謝産物の検出のための式Ｉで示される化合物の使用、並びに生育基質、栄養素、及び代謝産物の酵素的酸化による前記生育基質、栄養素、及び／又は代謝産物の検出のための方法を対象とする。
第四の形態において、本発明は、カブトガニＣ因子を用いたバクテリア内毒素の検出のための式Ｉで示される化合物の使用、及びカブトガニＣ因子を用いたバクテリア内毒素の検出のための方法を対象とする。
第五の形態において、本発明は、乳製品の低温殺菌の検査のための式Ｉで示される化合物の使用、及び乳製品の低温殺菌の検査の方法を対象とする。
第六の形態において、本発明は、微生物における抗生物質耐性の検査のための式Ｉで示される化合物の使用、及び微生物における抗生物質耐性の検査のための方法を対象とする。
第七の形態において、本発明は、無機リン酸塩の検出のための式Ｉで示される化合物の使用、及び無機リン酸塩の検出のための方法を対象とする。
第八の形態において、本発明は、特に指標微生物のゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）のアルファ－Ｄ－グルコシダーゼ活性の検出を通した、滅菌工程のモニタリングのための式Ｉで示される化合物の使用、及び特に指標微生物のゲオバチルス・ステアロサーモフィルスのアルファ－Ｄ－グルコシダーゼ活性を検出することによる、滅菌工程のモニタリングのための方法を対象とする。
第九の形態において、本発明は、バクテリアの抗生物質耐性のエンドオポイント及びオンライン検出のため、そして抗生物質感受性検査のための式Ｉで示される化合物の使用、並びにバクテリアの抗生物質耐性のエンドポイント及びオンライン検出のため、そして抗生物質感受性検査のための方法を対象とする。
本発明の好ましい態様は、添付の特許請求の範囲に表されている。本発明のさらなる態
様、並びに他の目的、利点及び特色は、以下の本発明の詳細な記載及び実施例から明白となろう。
様、並びに他の目的、利点及び特色は、以下の本発明の詳細な記載及び実施例から明白となろう。
本発明は、ルシフェラーゼ－ルシフェリンに基づく系が複数の短所（上記に説明された）を示すが、そのような系が現在、微生物の検出に利用可能な唯一の「実生活」生物発光又は化学発光系である、という驚くべき知見に基づく。これに関係して、本発明の発明者らは、驚くべきことに、式Ｉで示されるジオキセタン化合物が微生物を検出するための高度に効率的なプローブであることを見出した。特に、式Ｉで示されるジオキセタン化合物が、水性溶媒中であっても化学発光を示し、微生物の検出に用いられた場合に著しく高い感度を示し、それが一般に適用されるルシフェラーゼ－ルシフェリン系のものよりも有意に高いことが見出された。その上、本発明の化合物の重要な特性、例えば膜透過性及び／又は溶解度は、存在するならば置換基Ｒ２を変動させることにより改変され得る。さらに、式Ｉで示されるジオキセタン化合物が、水性溶媒中で安定しており、特に細菌生育培地中で安定していることが見出された。特に、式Ｉで示されるジオキセタンに基づく化合物が、微生物の、容易で率直であり、安価かつ確実な検出を可能にすることが見出された。この化合物は、単にそのまま微生物を含む培地に添加することができ、それ以上の化合物を必要としない。特に式Ｉで示されるジオキセタン化合物が、一般に用いられるルシフェラーゼ－ルシフェリンに基づく系よりも優れていることが見出された。
第一の形態において、本発明は、式Ｉで示される化合物に関する。
（式中、
Ｒ１は、酵素不安定基、及び式－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋を有するホウ素含有基から選択される分析物応答基であり；
Ｚ及びＺ’は、独立して、Ｒ４及びＯＲ５から選択され、
ここでＲ４は、－ＯＨ、－Ｏ－Ｋａｔ＋、任意に置換されたＣ１～Ｃ４アルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルケニル、任意
に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルキニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、任意に置換されたＣ５～Ｃ６アリール、任意に置換されたＣ５～Ｃ６ヘテロアリール、任意に置換されたＣ６～Ｃ１０アラルキル、及び任意に置換されたＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルからなる群から選択され、
Ｒ５は、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ４アルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルキニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、任意に置換されたＣ５～Ｃ６アリール、任意に置換されたＣ５～Ｃ６ヘテロアリール、任意に置換されたＣ６～Ｃ１０アラルキル、及び任意に置換されたＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又は
２個のＲ４、２個のＲ５、若しくは１個のＲ４と１個のＲ５が、介在する原子と一緒になって、５～７員の任意に置換された複素環、好ましくは飽和されていて任意に置換された複素環を形成しており；
Ｚ’’は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉから選択され、好ましくはＺ’’は、Ｆであり；
Ｋａｔ＋は、有機又は無機のカチオン、好ましくアルカリ金属カチオンであり；
Ｌは、分析物応答基Ｒ１での分析物の作用の際に、式Ｉで示される化合物の残り部分から放出される自壊性リンカー基であり、Ｌは、ペプチド、好ましくは細胞貫通ペプチド、エンドリジン又はタンパク質により任意に機能化されており；
Ｒ１が、酵素不安定基である場合、ｎは１で、ｍは１であるか、又はｎは０で、ｍは１であり；
Ｒ１が、－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋である場合、ｎ及びｍは、両者とも０又は両者とも１であり；
Ｒ１が、
である場合、ｎは０であり、ｍは１であり；
ＲＡ及びＲＣは、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３及びＲ２－Ｑ－から、好ましくはＨ、Ｃｌ及びＲ２－Ｑから選択されるか、又はＲＡ及びＲＣの一方は、ＲＢと一緒になって、中心芳香族環のπ系を延長する任意に置換された環若しくは複素環構造を形成しており、他方は、Ｈ若しくはＲ２－Ｑ－であるが；
但し、ＲＡ及びＲＣの両方がＨではないことを条件とし、
ＲＢは、Ｈであるか、又はＲＡ及びＲＣの一方と一緒になって、前記任意に置換された環若しくは複素環構造を形成しており；
Ｑは、式Ｉで示される化合物の中心芳香族環のπ系と共役されたπ系を含む基であり；
Ｒ２は、シアノ、ニトロ、スルホキシド、スルホン、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルケニル、
カルボニル、構造
を有するカルボニル、アミド、構造
を有するアミドから選択される基であり、
ここでＹは、Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、
Ｙ’及びＹ’’は、独立して、Ｈ及び任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルから選択されるか、又は窒素原子と一緒になって、任意に置換された複素環構造、好ましくは任意に置換されたマレイミド基を形成しており；
Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ３又はＲ２－Ｑ－であるが、
但し、Ｒ３が、Ｒ２－Ｑ－である場合、ＲＡ及びＲＣの少なくとも一方、好ましくはＲＡが、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ又はＣＦ３、好ましくはＣｌであることを条件とし；
ＲＤは、直鎖状又は分枝状Ｃ１～Ｃ１８アルキル又はＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択され；
ＲＥ及びＲＦは、独立して、分枝状Ｃ３～Ｃ１８アルキル若しくはＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択されるか、又はＲＥとＲＦが、付着された炭素原子と一緒になって、任意に置換された縮合環、スピロ環若しくは多環を形成している）
Ｒ１は、酵素不安定基、及び式－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋を有するホウ素含有基から選択される分析物応答基であり；
Ｚ及びＺ’は、独立して、Ｒ４及びＯＲ５から選択され、
ここでＲ４は、－ＯＨ、－Ｏ－Ｋａｔ＋、任意に置換されたＣ１～Ｃ４アルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルケニル、任意
に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルキニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、任意に置換されたＣ５～Ｃ６アリール、任意に置換されたＣ５～Ｃ６ヘテロアリール、任意に置換されたＣ６～Ｃ１０アラルキル、及び任意に置換されたＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルからなる群から選択され、
Ｒ５は、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ４アルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４アルキニル、任意に置換されたＣ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、任意に置換されたＣ５～Ｃ６アリール、任意に置換されたＣ５～Ｃ６ヘテロアリール、任意に置換されたＣ６～Ｃ１０アラルキル、及び任意に置換されたＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又は
２個のＲ４、２個のＲ５、若しくは１個のＲ４と１個のＲ５が、介在する原子と一緒になって、５～７員の任意に置換された複素環、好ましくは飽和されていて任意に置換された複素環を形成しており；
Ｚ’’は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉから選択され、好ましくはＺ’’は、Ｆであり；
Ｋａｔ＋は、有機又は無機のカチオン、好ましくアルカリ金属カチオンであり；
Ｌは、分析物応答基Ｒ１での分析物の作用の際に、式Ｉで示される化合物の残り部分から放出される自壊性リンカー基であり、Ｌは、ペプチド、好ましくは細胞貫通ペプチド、エンドリジン又はタンパク質により任意に機能化されており；
Ｒ１が、酵素不安定基である場合、ｎは１で、ｍは１であるか、又はｎは０で、ｍは１であり；
Ｒ１が、－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋である場合、ｎ及びｍは、両者とも０又は両者とも１であり；
Ｒ１が、
ＲＡ及びＲＣは、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３及びＲ２－Ｑ－から、好ましくはＨ、Ｃｌ及びＲ２－Ｑから選択されるか、又はＲＡ及びＲＣの一方は、ＲＢと一緒になって、中心芳香族環のπ系を延長する任意に置換された環若しくは複素環構造を形成しており、他方は、Ｈ若しくはＲ２－Ｑ－であるが；
但し、ＲＡ及びＲＣの両方がＨではないことを条件とし、
ＲＢは、Ｈであるか、又はＲＡ及びＲＣの一方と一緒になって、前記任意に置換された環若しくは複素環構造を形成しており；
Ｑは、式Ｉで示される化合物の中心芳香族環のπ系と共役されたπ系を含む基であり；
Ｒ２は、シアノ、ニトロ、スルホキシド、スルホン、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルケニル、
ここでＹは、Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、
Ｙ’及びＹ’’は、独立して、Ｈ及び任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルから選択されるか、又は窒素原子と一緒になって、任意に置換された複素環構造、好ましくは任意に置換されたマレイミド基を形成しており；
Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ３又はＲ２－Ｑ－であるが、
但し、Ｒ３が、Ｒ２－Ｑ－である場合、ＲＡ及びＲＣの少なくとも一方、好ましくはＲＡが、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ又はＣＦ３、好ましくはＣｌであることを条件とし；
ＲＤは、直鎖状又は分枝状Ｃ１～Ｃ１８アルキル又はＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択され；
ＲＥ及びＲＦは、独立して、分枝状Ｃ３～Ｃ１８アルキル若しくはＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択されるか、又はＲＥとＲＦが、付着された炭素原子と一緒になって、任意に置換された縮合環、スピロ環若しくは多環を形成している）
本明細書で用いられる用語「アルキル」は、直鎖状又は分枝状炭化水素ラジカルをいい、例えばメチル、エチル，ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル他を包含する。したがって、例えば本明細書で用いられる用語「Ｃ１～Ｃ１２アルキル」（又は「Ｃ１～Ｃ１２アルキル」）は、１～１２個の炭素原子を有する「アルキル」をいう。
本明細書で用いられる用語「アルケニル」は、１個又は複数の炭素－炭素二重結合を有する直鎖状又は分枝状炭化水素ラジカルをいう。
本明細書で用いられる用語「アルキニル」は、１個又は複数の炭素－炭素三重結合を有する直鎖状又は分枝状炭化水素ラジカルをいう。
本明細書で用いられる用語「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」及び「ヘテロアルキニル」は、骨格残基内に１個又は複数のＯ、Ｓ若しくはＮヘテロ原子又はそれらの組み合わせを含有する、対応するヒドロカルビル（アルキル、アルケニル、及びアルキニル）基をいい、したがって、対応するアルキル、アルケニル又はアルキニル基の少なくとも１個の炭素原子が、あるヘテロ原子の１種により置き換えられて、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、又はヘテロアルキニル基を形成している。
本明細書で用いられる用語「アリール」は、単環又は縮合多環からなる芳香族炭素環基を意味し、例えば、フェニル、ナフチル、フェナントリル、及びビフェニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「アリール」は、置換されていても、又は非置換であってもよい。
本明細書で用いられる用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１種のヘテロ原子（即ち、炭素又は水素と異なる原子、例えばＮ、Ｓ、Ｏ、Ｐ、Ｓｅ、Ｔｅ、好ましくはＮ、Ｓ、Ｏ、Ｐ）を環員として含有する芳香族基をいう。
「任意に置換された」又は「置換された」基の適切な置換基は、独立して、ハロゲン；－（ＣＨ２）０～４Ｒｏ；－（ＣＨ２）０～４ＯＲｏ；－Ｏ（ＣＨ２）０～４Ｒｏ、－Ｏ－（ＣＨ２）０～４Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；－（ＣＨ２）０～４ＣＨ（ＯＲｏ）２；－（ＣＨ２）０～４ＳＲｏ；Ｒｏで置換され得る－（ＣＨ２）０～４Ｐｈ；Ｒｏで置換され得る－(
ＣＨ２)０～４Ｏ(ＣＨ２)０～１Ｐｈ；Ｒｏで置換され得る－ＣＨ=ＣＨＰｈ；Ｒｏで置換され得る－（ＣＨ２）０～４Ｏ（ＣＨ２）０～１－ピリジル；－ＮＯ２；－ＣＮ；－Ｎ３；－（ＣＨ２）０～４Ｎ（Ｒｏ）２；－（ＣＨ２）０～４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｓ）Ｒｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＮＲｏ ２；－Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｓ）ＮＲｏ ２；－（ＣＨ２）０～４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；－Ｎ（Ｒｏ）Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｎ（Ｒｏ）Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＮＲｏ ２；－Ｎ（Ｒｏ）Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｃ（Ｓ）Ｒｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｃ（Ｏ）ＳＲｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲｏ ３；－（ＣＨ２）０～４ＯＣ（Ｏ）Ｒｏ；－ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０～４ＳＲｏ－；－（ＣＨ２）０～４ＳＣ（Ｏ）Ｒｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｃ（Ｏ）ＮＲｏ ２；－Ｃ（Ｓ）ＮＲｏ ２；－Ｃ（Ｓ）ＳＲｏ；－ＳＣ（Ｓ）ＳＲｏ、－（ＣＨ２）０～４ＯＣ（Ｏ）ＮＲｏ ２；－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲｏ）Ｒｏ；－Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｃ（ＮＯＲｏ）Ｒｏ；－（ＣＨ２）０～４ＳＳＲｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｓ（Ｏ）２Ｒｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｓ（Ｏ）２ＯＲｏ；－（ＣＨ２）０～４ＯＳ（Ｏ）２Ｒｏ；－Ｓ（Ｏ）２ＮＲｏ ２；－（ＣＨ２）０～４Ｓ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｎ（Ｒｏ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲｏ ２；－Ｎ（Ｒｏ）Ｓ（Ｏ）２Ｒｏ；－Ｎ（ＯＲｏ）Ｒｏ；－Ｃ（ＮＨ）ＮＲｏ ２；－Ｐ（Ｏ）２Ｒｏ；－Ｐ（Ｏ）Ｒｏ ２；－ＯＰ（Ｏ）Ｒｏ ２；－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｏ）２；－ＳｉＲｏ ３；－（Ｃ１～４直鎖状又は分枝状アルキレン）Ｏ－Ｎ（Ｒｏ）２；又は－（Ｃ１～４直鎖状又は分枝状アルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｎ（Ｒｏ）２（ここで各Ｒｏは、独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、－ＣＨ２Ｐｈ、－Ｏ（ＣＨ２）０～１Ｐｈ、－ＣＨ２－（５～６員ヘテロアリール環）、又は独立して窒素、酸素若しくは硫黄から選択されるヘテロ原子を０～４個有する５～６員飽和、部分的に不飽和若しくはアリール環であるか、又は上記定義にもかかわらず、Ｒｏの２回の独立した出現は、介在する原子（複数可）と一緒になって、窒素、酸素若しくは硫黄から独立して選択される０～４個のヘテロ原子を有する３～１２員飽和、部分的に不飽和、若しくはアリール単環若しくは二環を形成している）；或いは＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＲｏ ２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒｏ、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＯＲｏ、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒｏ、＝ＮＲｏ、＝ＮＯＲｏ、－Ｏ（Ｃ（Ｒｏ ２））２～３Ｏ－、又は－Ｓ（Ｃ（Ｒｏ ２））２～３Ｓ－であり、ここでＲｏの各独立した出現は、水素、Ｃ１～６アルキル、又は窒素、酸素若しくは硫黄から独立して選択されるヘテロ原子を０～４個有する非置換の５～６員飽和、部分的に不飽和若しくはアリール環から選択される。
ＣＨ２)０～４Ｏ(ＣＨ２)０～１Ｐｈ；Ｒｏで置換され得る－ＣＨ=ＣＨＰｈ；Ｒｏで置換され得る－（ＣＨ２）０～４Ｏ（ＣＨ２）０～１－ピリジル；－ＮＯ２；－ＣＮ；－Ｎ３；－（ＣＨ２）０～４Ｎ（Ｒｏ）２；－（ＣＨ２）０～４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｓ）Ｒｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＮＲｏ ２；－Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｓ）ＮＲｏ ２；－（ＣＨ２）０～４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；－Ｎ（Ｒｏ）Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｎ（Ｒｏ）Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＮＲｏ ２；－Ｎ（Ｒｏ）Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｃ（Ｓ）Ｒｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｃ（Ｏ）ＳＲｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲｏ ３；－（ＣＨ２）０～４ＯＣ（Ｏ）Ｒｏ；－ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０～４ＳＲｏ－；－（ＣＨ２）０～４ＳＣ（Ｏ）Ｒｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｃ（Ｏ）ＮＲｏ ２；－Ｃ（Ｓ）ＮＲｏ ２；－Ｃ（Ｓ）ＳＲｏ；－ＳＣ（Ｓ）ＳＲｏ、－（ＣＨ２）０～４ＯＣ（Ｏ）ＮＲｏ ２；－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲｏ）Ｒｏ；－Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｃ（ＮＯＲｏ）Ｒｏ；－（ＣＨ２）０～４ＳＳＲｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｓ（Ｏ）２Ｒｏ；－（ＣＨ２）０～４Ｓ（Ｏ）２ＯＲｏ；－（ＣＨ２）０～４ＯＳ（Ｏ）２Ｒｏ；－Ｓ（Ｏ）２ＮＲｏ ２；－（ＣＨ２）０～４Ｓ（Ｏ）Ｒｏ；－Ｎ（Ｒｏ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲｏ ２；－Ｎ（Ｒｏ）Ｓ（Ｏ）２Ｒｏ；－Ｎ（ＯＲｏ）Ｒｏ；－Ｃ（ＮＨ）ＮＲｏ ２；－Ｐ（Ｏ）２Ｒｏ；－Ｐ（Ｏ）Ｒｏ ２；－ＯＰ（Ｏ）Ｒｏ ２；－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｏ）２；－ＳｉＲｏ ３；－（Ｃ１～４直鎖状又は分枝状アルキレン）Ｏ－Ｎ（Ｒｏ）２；又は－（Ｃ１～４直鎖状又は分枝状アルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｎ（Ｒｏ）２（ここで各Ｒｏは、独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、－ＣＨ２Ｐｈ、－Ｏ（ＣＨ２）０～１Ｐｈ、－ＣＨ２－（５～６員ヘテロアリール環）、又は独立して窒素、酸素若しくは硫黄から選択されるヘテロ原子を０～４個有する５～６員飽和、部分的に不飽和若しくはアリール環であるか、又は上記定義にもかかわらず、Ｒｏの２回の独立した出現は、介在する原子（複数可）と一緒になって、窒素、酸素若しくは硫黄から独立して選択される０～４個のヘテロ原子を有する３～１２員飽和、部分的に不飽和、若しくはアリール単環若しくは二環を形成している）；或いは＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＲｏ ２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒｏ、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＯＲｏ、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒｏ、＝ＮＲｏ、＝ＮＯＲｏ、－Ｏ（Ｃ（Ｒｏ ２））２～３Ｏ－、又は－Ｓ（Ｃ（Ｒｏ ２））２～３Ｓ－であり、ここでＲｏの各独立した出現は、水素、Ｃ１～６アルキル、又は窒素、酸素若しくは硫黄から独立して選択されるヘテロ原子を０～４個有する非置換の５～６員飽和、部分的に不飽和若しくはアリール環から選択される。
ｎ又はｍが、０である場合、このことは、それぞれの置換基が存在しないことを意味する。したがって、ｍが０である場合、リンカーＬは、中心の芳香族環（即ち、式Ｉの中で示された芳香族環）に直接結合されている。その他に、ｎが０である場合、Ｒ１は、酸素原子（ｍが１であれば）、又は中心の芳香族環に（ｍが０であれば）結合されている。
本明細書で用いられる、化学的部分の結合を終了させる記号
は、別の部分への連結を示す。例えば、ｎが０であり、ｍが１であり、Ｒ１が
である、式Ｉで示される化合物は、以下の構造：
の化合物を表す。
本明細書で用いられる用語「ジオキセタン化合物」は、部分
を含む化合物、より具体的には式Ｉで示される化合物をいう。
本明細書で用いられる用語「分析物応答基（an analyte-responsive group）」は、特
定の分析物を用いて脱離（少なくとも一部）又は修飾され得る基を意味し、ここで、脱離又は修飾は発光が惹起されるようなものである。好ましくはｎが１である場合（即ち、リンカー基Ｌが存在する場合）、この分析物応答基への分析物の作用が、分析物応答基Ｒ１を－ＯＨ又は－ＮＨ２部分に変換して（Ｌが基Ｘを含む場合、部分「Ｘ－Ｒ１」は、好ましくは－ＯＨ又は－ＮＨ２部分に変換されて）、リンカー基「Ｌ」の脱離、例えば１，６－脱離が惹起される。ｎが０である場合（即ち、リンカー基Ｌが存在しない場合）、この分析物応答基Ｒ１への分析物の作用が、分析物応答基Ｒ１を－ＯＨ又は別の酸性基に変換することが好ましい（ｍが１である場合、部分「Ｏ－Ｒ１」は、－ＯＨ又は別の酸性基に変換される）。
定の分析物を用いて脱離（少なくとも一部）又は修飾され得る基を意味し、ここで、脱離又は修飾は発光が惹起されるようなものである。好ましくはｎが１である場合（即ち、リンカー基Ｌが存在する場合）、この分析物応答基への分析物の作用が、分析物応答基Ｒ１を－ＯＨ又は－ＮＨ２部分に変換して（Ｌが基Ｘを含む場合、部分「Ｘ－Ｒ１」は、好ましくは－ＯＨ又は－ＮＨ２部分に変換されて）、リンカー基「Ｌ」の脱離、例えば１，６－脱離が惹起される。ｎが０である場合（即ち、リンカー基Ｌが存在しない場合）、この分析物応答基Ｒ１への分析物の作用が、分析物応答基Ｒ１を－ＯＨ又は別の酸性基に変換することが好ましい（ｍが１である場合、部分「Ｏ－Ｒ１」は、－ＯＨ又は別の酸性基に変換される）。
本明細書で用いられる用語「酵素不安定基（an enzyme-labile group）」は、特定の酵素を用いて脱離（少なくとも一部）又は修飾され得る基をいう。
本明細書で用いられる標的分析物、標的微生物又は標的代謝産物という用語は、式Ｉで示される化合物を用いて検出されるべき分析物、微生物又は代謝産物をいう。
好ましくは、ＲＡ及びＲＣは、独立して、Ｈ及びＲ２－Ｑ－から選択されるか、又はＲＡ及びＲＣの一方が、ＲＢと一緒になって、中心の芳香族環のπ系を延長する任意に置換された環又は複素環構造を形成し、他方が、Ｈ又はＲ２－Ｑ－であり、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、
Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉである。
Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉである。
好ましい態様によれば、ＲＡ及びＲＣの一方は、ＲＢと一緒になって、中心の芳香族環のπ系を延長する任意に置換された環又は複素環構造を形成し、他方は、Ｈ又はＲ２－Ｑ－である。
別の好ましい態様によれば、ＲＡ及びＲＣの一方は、Ｒ２－Ｑ－であり、他方は、Ｈである。特に好ましい態様によれば、ＲＡは、Ｒ２－Ｑ－であり、ＲＣは、Ｈである。別の好ましい態様によれば、ＲＣは、Ｒ２－Ｑ－であり、ＲＡは、Ｈである。
Ｑは、式Ｉで示される化合物の中心の芳香族環のπ系と共役されたこのπ系を含む基である。前記共役のために、基Ｑ（潜在的に、結合した基Ｒ２と一緒になって）、式Ｉで示される化合物の発光を適合させるために用いられ得ることが示された。例えば、基Ｑが、発光波長、発光動力学（フラッシュ発光に対してグロー発光（glow emission））及び量
子収率に影響を及ぼし得ることが示された。
子収率に影響を及ぼし得ることが示された。
好ましい態様によれば、Ｑは、－（Ｈ２Ｃ＝ＣＨ２)q－、
（ここでアスタリスク（＊）は、Ｒ２に連結された原子を示す）からなる群から選択される。ｑ及びｒは、１、２、３、４、５、及び６からなる群から選択され、好ましくは、ｑ及びｒは１である。特に好ましい態様によれば、Ｑは－（Ｈ２Ｃ＝ＣＨ２)q－であり、より好ましくは、Ｑは－Ｈ２Ｃ＝ＣＨ２－である。
別の好ましい態様によれば、ＲＡ及びＲＣの一方が、ＲＢと一緒になって、中心の芳香族環のπ系を延長する任意に置換された環又は複素環構造を形成している。この場合、ＲＡ及びＲＣの他方は、Ｒ２－Ｑ又はＨ、好ましくはＨである。「中心の芳香族環のπ系を延長する」は、任意に置換された環又は複素環構造が、中心の芳香族環のπ系と共役するπ系を含むことを意味する。
好ましくは、ＲＢと一緒になってＲＡ及びＲＣの一方により形成された任意の置換された環又は複素環構造は、６員環である。より好ましくは、前記６員環は
からなる群から選択され、ＲＧは、置換又は非置換のＣ１～Ｃ１２アルキルから選択され、Ｒ２は、上記及び下記に定義された通りである。上記部分が、任意の方法でＲＡ及びＲＢに、又はＲＣ及びＲＢに連結され得ることが理解できる。これは、ＲＡがＲＢと一緒になって、部分
を形成している式Ｉで示される化合物が、以下の選択肢：
の両方を包含することを意味する
ＲＢと一緒になってＲＡ及びＲＣの一方により形成された、任意に置換された環又は複素環構造が、非置換の
であることが、特に好ましい。
驚くべきことに、分析物との相互作用を利用したＲ１基の脱離（少なくとも一部）又は修飾の際に、ＲＢと一緒になってＲＡ及びＲＣの一方により、特にＲＢと一緒になってＲＣにより形成された前記環構造
を含む式Ｉで示される化合物が、非常に長期間持続する発光（グロー発光）を示すことが見出された。対照的に、ＲＡ及びＲＣの一方がＲ２－Ｑ－、特にＭｅＯＯＣ－ＣＨ＝ＣＨ－である式Ｉで示される化合物は、短いが強い発光（フラッシュ発光）を示す（実施例１３参照）。さらに、驚くべきことに、ＲＢと一緒になってＲＡ及びＲＣの一方により、特にＲＢと一緒になってＲＣにより形成された環構造
を含む式Ｉで示される化合物が、これまで実現されていない５０％を超える異常に高い発光量子収率を示すことが見出された。したがって、ＲＢと一緒になってＲＡ及びＲＣの一方により、特にＲＢと一緒になってＲＣにより形成された環構造
を含む式Ｉで示される化合物は、ＲＡ及びＲＣの一方がＲ２－Ｑ－、特にＭｅＯＯＣ－ＣＨ＝ＣＨ－である式Ｉで示される化合物の約２０倍の発光強度を示す（実施例１３参照）。
さらに、発光特性が置換基Ｒ３を用いてさらに微調整され得ることが、見出された（実施例１３参照）。好ましい態様によれば、ＲＥ及びＲＦは、結合した炭素原子と一緒になって、任意に置換された縮合環、スピロ環、架橋環又は多環を形成している。基ＲＥ及びＲＦの主たる機能は、式Ｉで示される化合物のジオキセタン部分を立体的に保護することである。
好ましくは前記任意に置換された縮合環、スピロ環、架橋環又は多環は、任意に置換されたプロペラン；式［Ａ．Ｂ．１］ペンタン、［Ａ．Ｂ．１］ヘキサン、［Ａ．Ｂ．１］ヘプタン、［Ａ．Ｂ．１］オクタン、［Ａ．Ｂ．１］ノナン、［Ａ．Ｂ．１］デカン、［Ａ．Ｂ．１］ウンデカン、［Ａ．Ｂ．１］ドデカンにより定義された任意に置換された二環（bicyclus）（ここでＡ及びＢは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択される）、又は任意に置換されたアダマンタンから選択される。より好ましくはＲＥ及びＲＦは、結合した炭素原子と一緒になって、好ましくは任意に置換された
部分、任意に置換された
部分、又は任意に置換された
部分を形成している。さらにより好ましくは、ＲＥ及びＲＦは、結合した炭素原子と一緒になって、任意に置換された
部分を形成している。特に好ましくは、ＲＥ及びＲＦは、結合した炭素原子と一緒になって、非置換の
部分を形成している。
好ましい態様によれば、ＲＤは、メチル、エチル、又はイソプロピルである。好ましくは、ＲＤはメチルである。
特に好ましい化合物は、
からなる群から選択される。
好ましい態様によれば、式Ｉで示される化合物は、式Ｉ’
により表される。
好ましい態様によれば、Ｒ１は、酵素不安定基である。好ましくは、Ｒ１は、アセチル、ブチリル、オクタノイル、ノナノイル、ミオイノシトールホスホリル、ホスホリル、アミノアシジル（amino acidyl）基、Ｌ－ピログルタミックアシジル（L-pyroglutamic acidyl）、ジペプチジル基、トリペプチジル基、ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシジル、アル
ファ－Ｄ－ガラクトピラノシジル、アルファ－Ｄ－グルコピラノシジル、ベータ－Ｄ－グ
ルコピラノシジル、ベータ－Ｄ－グルクロニル、ベータ－Ｄ－グルクロニルナトリウム塩、ｎ－アセチル－ベータ－Ｄ－ガラクトサミニジル、Ｎ－アセチルノイラミニジル、セロビオシジル、アルファ－Ｄ－リボフラノシジル、ベータ－Ｄ－リボフラノシジル、コリンホスホリル、－ＮＯ２、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレイル、Ｔｏｓ－Ｌ－アラニル、アルファ－マンノシル、ベータ－マンノシル、アルファ－フコシル、ベータ－フコシル、アルファ－イデウロノシル（ideuronosyl）、ベータ－イデウロノシル
、アルファ－（オリゴ）マルトエシル（（oligo）maltoesyl）、式－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）を有する基（式中Ｚ及びＺ’は、上記に定義された通りである）、－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋、オキサリルエステル、ＳｕｃＯＭｅ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－チロシニル、ベータ－ラクタマーゼ不安定基、好ましくはベータ－ラクタム系抗生物質、より好ましくはペニシリン、第一～五世代のセファロスポリン、セファマイシン、又はカルバペネム、Ａｃ－ＱＬＱ－、Ａｃ－ＦＱＬＱ－、Ａｃ－ＥＦＱＬＱ－、Ａｃ－ＤＥＦＱＬＱ－からなる群から選択される。
ファ－Ｄ－ガラクトピラノシジル、アルファ－Ｄ－グルコピラノシジル、ベータ－Ｄ－グ
ルコピラノシジル、ベータ－Ｄ－グルクロニル、ベータ－Ｄ－グルクロニルナトリウム塩、ｎ－アセチル－ベータ－Ｄ－ガラクトサミニジル、Ｎ－アセチルノイラミニジル、セロビオシジル、アルファ－Ｄ－リボフラノシジル、ベータ－Ｄ－リボフラノシジル、コリンホスホリル、－ＮＯ２、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレイル、Ｔｏｓ－Ｌ－アラニル、アルファ－マンノシル、ベータ－マンノシル、アルファ－フコシル、ベータ－フコシル、アルファ－イデウロノシル（ideuronosyl）、ベータ－イデウロノシル
、アルファ－（オリゴ）マルトエシル（（oligo）maltoesyl）、式－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）を有する基（式中Ｚ及びＺ’は、上記に定義された通りである）、－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋、オキサリルエステル、ＳｕｃＯＭｅ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－チロシニル、ベータ－ラクタマーゼ不安定基、好ましくはベータ－ラクタム系抗生物質、より好ましくはペニシリン、第一～五世代のセファロスポリン、セファマイシン、又はカルバペネム、Ａｃ－ＱＬＱ－、Ａｃ－ＦＱＬＱ－、Ａｃ－ＥＦＱＬＱ－、Ａｃ－ＤＥＦＱＬＱ－からなる群から選択される。
好ましい第一～五世代のセファロスポリンは、セファクテリル（cefacteril）、セフラジン、セフロキサジン、セファログリシン、セファクロル、セファレキシン、セファドキシル、セファトリジン、セファゼドン、セファピリン、セフテゾール、セファゾリン、セフェザフルル（cefezaflur）、セファロチン、セファロリジン、セファロニウムから選択され、そのカルボン酸基が結合した炭素原子の隣の炭素原子が、セファロスポリンを式Ｉで示される化合物に結合させるために用いられる
好ましいカルバペネムは、
好ましくは
好ましくは
から選択される。
特に好ましいカルバペネムは、部分
好ましくは
好ましくは
である。驚くべきことに、これらの部分が、本明細書に記載された他のカルバペネム部分より安定していて、有意に低いバックグランドを示すことが見出されており、それは、スルフィド基又はスルホキシド基を安定化するベータラクタムによると考えられる。
特に好ましいベータ－ラクタマーゼ不安定基は、
好ましくは
好ましくは
好ましくは
からなる群から選択される。
好ましい態様によれば、Ｒ１は、Ａｃ－ＱＬＱ－、Ａｃ－ＦＱＬＱ－、Ａｃ－ＥＦＱＬＱ－、又はＡｃ－ＤＥＦＱＬＱ－である。これらの基は、ノロウイルスの検出に適している。
別の好ましい態様によれば、Ｒ１は、式－Ｂ（Ｚ）（Ｚ'）又は－ＢＦ３
－Ｋａｔ＋を
有する基であり、式中、好ましくは、Ｚ及びＺ’の少なくとも一方はＯＲ５であり、より好ましくは、Ｚ及びＺ’の両方はＯＲ５であるか、又は式－Ｂ（Ｚ）（Ｚ'）を有する基
は、好ましくは－Ｂ（ＯＨ）２、－ＢＦ３ －Ｋａｔ＋、
からなる群から選択され、より好ましくは
－Ｂ（ＯＨ）２、又は－ＢＦ３
－Ｋａｔ＋である。
有する基であり、式中、好ましくは、Ｚ及びＺ’の少なくとも一方はＯＲ５であり、より好ましくは、Ｚ及びＺ’の両方はＯＲ５であるか、又は式－Ｂ（Ｚ）（Ｚ'）を有する基
は、好ましくは－Ｂ（ＯＨ）２、－ＢＦ３ －Ｋａｔ＋、
リンカー基「Ｌ」は、本発明が作成される前には知られていなかった複数の利点を有する。一方でそれは、式Ｉで示される化合物のより良好な加水分解安定性をもたらし、そのことは式Ｉで示される化合物が好ましくは水性溶媒中で用いられるため、特に重要である。他方でそれは、式Ｉで示される化合物の残りの部分から基Ｒ１を立体的に離すことにより、基Ｒ１の良好な利用可能性をもたらす。より良好な（加水分解）安定性は、より少ない非特異的加水分解をもたらし、それによってより低いバックグランドをもたらし、より良好なシグナルノイズ比に、そしてその結果より高い感度に導く。基Ｒ１の利用可能性が上昇することで、標的分析物、特に酵素へのより良好な結合に導き、それによってより高いターンオーバーに導いて、より高いシグナルノイズ比をもたらし、そしてその結果より高い感度をもたらす。基Ｒ１の利用可能性を高めることは、標的分析物、特に酵素へのより良い結合をもたらし、それにより、より高いターンオーバーをもたらし、それはシグナルノイズ比の増加につながり、その結果、より高い感度につながる。さらに、改善された生物学的利用性が、膜結合酵素の検出を改善する。
好ましくは、Ｌは、分析物応答基Ｒ１への分析物の作用（それにより分析物応答基Ｒ１の少なくとも一部の脱離又は修飾に導くこと）の際に、式Ｉで示される化合物の残りの部分から放出される、自壊性基である。Ｌは、式Ｉで示される化合物へのペプチド（好ましくは細胞透過ペプチド）、エンドリジン、又はタンパク質の結合に好ましい部分である。特に、これらの基によるＬの機能化（functionalization）が、式Ｉで示される化合物の
発光をクエンチしないことが見出された。いずれかの理論に拘束されるのを望むものではないが、この驚くべき現象の理由が、発光が惹起される前に、一般的に、リンカーＬが式Ｉで示される化合物の残り部分から切除されるという事実であると考えられる。したがって一態様において、Ｌは、ペプチド（好ましくは細胞透過ペプチド）、エンドリジン、又はタンパク質で機能化されている。別の態様において、Ｌは、ペプチド（好ましくは細胞透過ペプチド）、エンドリジン、又はタンパク質で機能化されていない。
発光をクエンチしないことが見出された。いずれかの理論に拘束されるのを望むものではないが、この驚くべき現象の理由が、発光が惹起される前に、一般的に、リンカーＬが式Ｉで示される化合物の残り部分から切除されるという事実であると考えられる。したがって一態様において、Ｌは、ペプチド（好ましくは細胞透過ペプチド）、エンドリジン、又はタンパク質で機能化されている。別の態様において、Ｌは、ペプチド（好ましくは細胞透過ペプチド）、エンドリジン、又はタンパク質で機能化されていない。
好ましくはＬは、
からなる群から選択され、これらのリンカーのそれぞれは、ペプチド、好ましくは細胞透過ペプチド、エンドリジン又はタンパク質で機能化されてもよく、Ｘは、－Ｏ－、－Ｎ+
（ＲＧ）２－、好ましくは－Ｎ+（ＣＨ３）２－又は－ＮＨ－であり、Ｒ１が－Ｂ（Ｚ）
（Ｚ’）又は－ＮＯ２である場合には、Ｘは、存在せず、Ｘ’は、Ｓ、Ｏ、ＮＨ及びＮＲＧから選択され、Ｘは、Ｒ１に結合している。
（ＲＧ）２－、好ましくは－Ｎ+（ＣＨ３）２－又は－ＮＨ－であり、Ｒ１が－Ｂ（Ｚ）
（Ｚ’）又は－ＮＯ２である場合には、Ｘは、存在せず、Ｘ’は、Ｓ、Ｏ、ＮＨ及びＮＲＧから選択され、Ｘは、Ｒ１に結合している。
好ましくは、Ｌは、
である。
好ましくは、Ｒ１が
好ましくは
である場合、Ｘは－Ｎ+（ＣＨ３）２－である。
好ましい態様によれば、Ｘは、－Ｏ－である。別の好ましい態様によれば、Ｘは、－ＮＨ－である。
好ましい態様によれば、ｎは１であり、ｍは１である。別の好ましい態様によれば、ｎは０であり、ｍは１である。
好ましい態様によれば、Ｒ２は、水溶性基である。
好ましくは、Ｒ２は、シアノ及び
からなる群から選択され、ここでＹは、Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、ここでアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチルプロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルである。
好ましくはＲ２は、
である。Ｒ２が
である態様において、Ｙは、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、又はアルカリ金属イオンであり、このアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチルプロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、このＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチルプロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくは、Ｙは、－Ｈ又はメチルである。さらにより好ましくは、Ｒ２は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＯＯ－である。
好ましい態様によれば、Ｒ３は、Ｈ及びＣｌからなる群から選択され、好ましくはＣｌである。
好ましい式Ｉで示される化合物は、式ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、Ｖａ、ＶＩ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩｃ、ＶＩＩ及びＶＩＩａ：
（式中、Ｙは、Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、又はアルカリ金属イオンである）で示される化合物からなる群から選択される。特に好ましい化合物は、ＹがＨである化合物である。
式ＩＩ、特にＩＩａで示される化合物は、サルモネラ（Salmonella）、特にサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）の検出に特に適することが立証されている。
式ＩＩＩ、特にＩＩＩｂで示される化合物は、リステリア（Listeria）、特にリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）の検出に特に適することが立証されている。
式ＩＶ、特にＩＶａで示される化合物は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の検出に特に適することが立証されている。
式Ｖ、特にＶｂで示される化合物は、大腸菌群（coliform）及び大腸菌（E. coli）の
検出に特に適することが立証されている。
検出に特に適することが立証されている。
式ＶＩ、特にＶＩｃで示される化合物は、その起源とは無関係に、Ｈ２Ｏ２の検出に特に適することが立証されている。
式ＶＩＩ及びＶＩＩＩ、好ましくはＶＩＩｂ及びＶＩＩＩａで示される化合物は、カルバペネム耐性菌をカルバペネム感受性菌と識別するのに特に適することが示されている。
一般に、基Ｒ１が存在する場合に、式Ｉで示される化合物が水性溶媒中であっても安定していて、光子が放出されないことが見出されている。分析物との相互作用を利用したＲ１基の脱離（少なくとも一部）又は修飾は、不安定な種を生成し、化学励起過程を通して分解して、励起された中間体を生成し、次に、光子の放出によって基底状態に崩壊する。したがって分析物応答基Ｒ１は、分析物応答基Ｒ１に作用する分析物が存在する状況での発光を制限する。
Ｒ１が、酵素不安定基である場合、式Ｉで示される化合物は、酵素の検出に適し、結果としてこの酵素を発現する微生物の検出に適する。酵素との接触の際、前記酵素不安定基Ｒ１が脱離（少なくとも一部）又は修飾されて、自壊性リンカーが存在する場合、自壊性リンカーが式Ｉで示される化合物の残り部分から脱離され、不安定種が形成され、その後、化学励起過程を通して分解して、励起された中間体を生成し、次に、光子の放出を通して基底状態に崩壊する。
Ｒ１が、酵素不安定基である場合、特定の酵素を発現する微生物がこの酵素を発現しない他の微生物の存在下で検出され得るように、Ｒ１が唯一の特定の酵素に応答することが好ましい。この方法では、例えば、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）及び大腸菌（Escherichia coli）などの他のバクテリアの存在下でサルモネラ（例えば、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）及びサルモネラ・エンテリティディス（Salmonella Enteritidis））を特異的に検出することが可能である。
（とりわけ）本発明で用いられ得る例示的な分析物応答基Ｒ１、並びにそれぞれの標的分析物、標的微生物及び標的代謝産物が、表１に示されている。さらなる分析物応答基Ｒ１、それぞれの分析物、標的分析物／標的微生物／標的代謝産物は、例えば、Orenga et al, Journal of Microbiological Methods, 79, 2009, 139-155；及びVaradi et al., Che. Soc. Rev., 2017, 46, 4818-4832から認識できる。
構造の表示を伴った例示的な好ましいＲ１基と、Ｌが
である場合のそれぞれの好ましいＸ基が、表２に示されている。しかし、表２に示された基Ｒ１もまた、他のリンカー部分と共に用いられてもよく、又はリンカー部分を含まずに用いられてもよいことが、理解されたい。
本明細書で用いられる用語「アミノアシジル」は、カルボン酸基によってジオキセタン
化合物の残りの部分に結合したアミノ酸部分をいう。アミノ酸が、１個より多くのカルボン酸基を含む場合、前記カルボン酸の各々が、このアミノ酸をジオキセタン化合物の残りの部分に結合されていてもよい。好ましくは、アミノ酸が１個より多くのカルボン酸を含む場合、それは、アルファ－カルボン酸基によってジオキセタン化合物の残りの部分に結合している。
化合物の残りの部分に結合したアミノ酸部分をいう。アミノ酸が、１個より多くのカルボン酸基を含む場合、前記カルボン酸の各々が、このアミノ酸をジオキセタン化合物の残りの部分に結合されていてもよい。好ましくは、アミノ酸が１個より多くのカルボン酸を含む場合、それは、アルファ－カルボン酸基によってジオキセタン化合物の残りの部分に結合している。
結果として、Ｒ１がアミノアシジル基又はジ－若しくはトリ－ペプチジル基であり、Ｘが－ＮＨ－である場合、アミノアシジル基又はジ－若しくはトリ－ペプチジル基のカルボン酸基（結合形成に関与する）が、－ＮＨ－基と一緒になって、アミド基（－ＣＯＮＨ－）を形成している。
好ましいアミノアシジル基は、アラニル(Ａ－）、好ましくはＬ－アラニル、ピログル
タミックアシジル、好ましくはＬ－ピログルタミックアシジル、アルギニニル（Ｒ－)、
アスパラギニル（Ｎ－）、アスパルティックアシジル（aspartic acidyl）（Ｄ－）、シ
ステイニル（Ｃ－）、グルタミニル（Ｑ－）、グルタミックアシジル（Ｅ－）、グリシニル（Ｇ－）、ヒスチジニル（Ｈ－）、イソロイシニル（Ｉ－）、ロイシニル（Ｌ－）、リシニル（Ｋ－）、メチオニニル（Ｍ－）、フェニルアラニル（Ｆ－）、プロリニル（Ｐ－）、セリニル（Ｓ－）、トレオニニル（Ｔ－）、トリプトファニル（Ｗ－）、チロシニル（Ｙ－）、及びバリニル（Ｖ－）である。
タミックアシジル、好ましくはＬ－ピログルタミックアシジル、アルギニニル（Ｒ－)、
アスパラギニル（Ｎ－）、アスパルティックアシジル（aspartic acidyl）（Ｄ－）、シ
ステイニル（Ｃ－）、グルタミニル（Ｑ－）、グルタミックアシジル（Ｅ－）、グリシニル（Ｇ－）、ヒスチジニル（Ｈ－）、イソロイシニル（Ｉ－）、ロイシニル（Ｌ－）、リシニル（Ｋ－）、メチオニニル（Ｍ－）、フェニルアラニル（Ｆ－）、プロリニル（Ｐ－）、セリニル（Ｓ－）、トレオニニル（Ｔ－）、トリプトファニル（Ｗ－）、チロシニル（Ｙ－）、及びバリニル（Ｖ－）である。
特に好ましいアミノアシジル基は、Ｌ－アラニル、Ｌ－ピログルタミックアシジル、Ｌ－ロイシニル、又はβ－アラニルである。
好ましいトリペプチジル基は、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－アルギニニル、Ｂｏｃ－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｐｒｏ－アルギニニル、及びＳｕｃＯＭｅ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－チロシニル（ＳｕｃＯＭｅ－ＲＰＹ－）である。
Ｒ１が、ミオイノシトールホスホリルである場合、式Ｉで示される化合物は、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ－ＰＬＣ）を発現する微生物、例えばリステリア、特にリステリア・モノサイトゲネスを検出するのに特に適する。
Ｒ１が、オクタノイルである場合、式Ｉで示される化合物は、Ｃ８エステラーゼを発現する微生物、例えばサルモネラ、特にサルモネラ・エンテリカを検出するのに特に適する。
Ｒ１が、ホスホリルである場合、式Ｉで示される化合物は、ホスファターゼを発現する微生物、例えば抗生物質耐性の主要なキャリアであるＳ．アウレウスを検出するのに特に適する。したがってこの基質は、理想的には、Ｓ．アウレウスの耐性株を検出するのに適切である（抗生物質を生育培地に添加することによる：光＝耐性）（実施例８参照）。
好ましい態様によれば、Ｒ１は、アミノアシジル基、好ましくはＬ－アラニル又はＬ－ピログルタミックアシジル、ジペプチジル基又はトリペプチジル基である（この場合、Ｘは、好ましくは－ＮＨである）。
好ましい態様によれば、Ｒ１は、アミノアシジル基である。
好ましい態様によれば、Ｒ１は、ミオイノシトールホスホリル、ホスホリル、又はオクタノイルであり、Ｒ２は、
（ここでＹは、－Ｈ又は上記に定義された、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、ここでＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチルである）である。特に好ましい態様によれば、Ｒ１は、ミオイノシトールホスホリルであり、Ｒ２は、
（ここでＹは、メチルである）である。別の特に好ましい態様によれば、Ｒ１は、オクタノイルであり、Ｒ２は、
（ここでＹは、－Ｈである）である。別の特に好ましい態様によれば、Ｒ１は、ホスホリルであり、Ｒ２は、
（ここでＹは、－Ｈである）である。
特に好ましい化合物は、置換基及び変数が、以下の通り定義される（別の置換基は、上記に説明された通り定義される）、式Ｉで示される化合物である（表Ａ参照；Ｌが、存在する場合、Ｌは、
であり、「Ｃａｒｂ」は、
を表す）。
一般に、本明細書の以下に議論される全ての使用及び方法は、インビトロでの使用及び
方法であることが理解されなければならない。
方法であることが理解されなければならない。
第二の形態において、本発明は、標的分析物（例えば、過酸化水素）／標的微生物／標的代謝産物（起源とは無関係に）の検出のための、第一の形態に記載された式Ｉで示される化合物の使用に関する。より好ましくは、本発明は、標的微生物、より好ましくは病原性微生物、さらにより好ましくはバクテリア、ウイルス又は真菌の検出のための、第一の態様に記載された式Ｉで示される化合物の使用に関する。
特に本発明は、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定のための、第一の形態に記載された式Ｉで示される化合物の使用に関する。より詳細には本発明は、適切な分子プローブへの代謝酵素、試薬酵素若しくは参照酵素の作用の化学発光的指標、試薬酵素による細菌代謝産物若しくは栄養素の酵素的酸化から生じた過酸化水素の指標、又は栄養素、基質、代謝産物若しくは試薬酵素による作用の副生成物の役割を担う無機リン酸塩の検出を利用した、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定のための、第一の形態に記載された式Ｉで示される化合物の使用に関する。
特に本発明は、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定のための、第一の形態に記載された式Ｉで示される化合物の使用に関する。より詳細には本発明は、適切な分子プローブへの代謝酵素、試薬酵素若しくは参照酵素の作用の化学発光的指標、試薬酵素による細菌代謝産物若しくは栄養素の酵素的酸化から生じた過酸化水素の指標、又は栄養素、基質、代謝産物若しくは試薬酵素による作用の副生成物の役割を担う無機リン酸塩の検出を利用した、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定のための、第一の形態に記載された式Ｉで示される化合物の使用に関する。
好ましくはこの微生物は、サルモネラ；サルモネラ・エンテリカ；リステリア、好ましくはリステリア・モノサイトゲネス；Ｓ．アウレウス；大腸菌；カルバペネム耐性菌、好ましくはシュードモナス・エルギノーサ、及びクレブシエラ・ニューモニエ；カンピロバクター・ジェジュニ；Ｃ．コリ；Ｃ．ラリ；バチルス；スタフィロコッカス；クロストリジウム；マイコバクテリウム・ツベルクローシス；クロストリジウム・パーフリンゲンス;Ｓ.アガラクティエ；カンジダ属菌；グラム陰性菌、酵母、カビ、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロコッカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス；シトロバクター、大腸菌群；クロノバクター・サカザキ；ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス；リステリア属菌、ＥＳＢＬ生成エンテロバクター；ビブリオ；クロストリジウム・ディフィシル；カンジダ・アルビカンス；プレボテラ；シゲラ、アピラーゼ含有微生物、好ましくはシゲラ；レジオネラ・ニューモフィラ;及びカリシウイルス科のウイルス、
好ましくはラゴウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、ネボウイルス、レコウイルス、より好ましくはノロウイルスからなる群から選択される。
好ましくはラゴウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、ネボウイルス、レコウイルス、より好ましくはノロウイルスからなる群から選択される。
好ましくはこの微生物は、サルモネラ、サルモネラ・エンテリカ、リステリア、好ましくはリステリア・モノサイトゲネス、Ｓ．アウレウス、大腸菌、カルバペネム耐性菌、好ましくはシュードモナス・エルギノーサ及びクレブシエラ・ニューモニエからなる群から選択される。
式Ｉで示される化合物のどの置換基Ｒ１が、どの標的分析物（例えば、過酸化水素）／標的微生物／標的代謝産物の検出に適するかは、第一の形態、特に表１から明白であり、他の置換基は、第一の形態に定義された通り選択されてもよい（このことは、本発明の全ての形態及び態様に適用される）。
上記の通り、驚くべきことに、式Ｉで示される化合物が、微生物の検出に用いられる際に複数の利点を示すことが見出された。特に式Ｉで示される化合物は、微生物が含有する培地に単にそのままの状態で添加され得、任意のさらなる化合物又は培地の追加の調製を必要としないため、微生物の著しく容易で率直かつ信頼性のある検出を可能にする。これは、一般に適用されるルシフェラーゼ－ルシフェリン系を超える莫大な利点であり、ルシフェラーゼ－ルシフェリン系は、複数の化合物の使用を必要とし、その１つ、即ちルシフェラーゼは、極めて高価であり悪名高い不安定性のために使用期間が限定される。さらに、式Ｉで示される化合物は、水性溶媒中で安定しておりルシフェラーゼ－ルシフェリン系よりも有意に高い感度を有することが示された。（実施例９及び１０参照）。
微生物の検出に用いられる場合、式Ｉで示される化合物は、微生物（１種又は複数）、特に微生物を含有する培地（好ましくは水性）に、固体の形態又は溶液中で添加することができる。しかし、溶液、好ましくはＤＭＳＯ溶液中で、式Ｉで示される化合物を用いることが、以下の理由から好ましい：高い感度のため（ルシフェラーゼ－ルシフェリン系よりも有意に高い）、式Ｉで示される化合物は非常に少量しか必要とならない。通常、式Ｉで示される化合物は、０．１μｇ未満、好ましくは０．０９μｇ未満、より好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇの量で用いられる。したがって、溶液、好ましくはＤＭＳＯ溶液中で、式Ｉで示される化合物を用いることで、既知濃度の原液からの分取（aliquotation）を利用して微生物を含有する培地に添加される正確な量を容易に決定することが可能になる。さらに、式Ｉで示される化合物は、ＤＭＳＯ溶液中で高度に安定していることが見出されている（室温で数ヶ月、４℃で数年）。
好ましい形態によれば、式Ｉで示される化合物は、標的分析物（例えば、過酸化水素）／標的微生物／標的代謝産物、好ましくは微生物の検出に用いられ、基Ｒ１は、分析物、特に前記微生物により発現される酵素に反応する。基Ｒ１が、特定の分析物、例えば酵素に反応するか否かは、単に、前記基Ｒ１を含む式Ｉで示される化合物をそれぞれの分析物に添加すること（又はその逆）、及びもし存在するならば放出された光子（即ち、光）を検出すること、により決定されてもよい。
好ましい態様によれば、この微生物は、サルモネラ、好ましくはサルモネラ・エンテリカ、リステリア、好ましくはリステリア・モノサイトゲネス、Ｓ．アウレウス又は大腸菌である。
好ましい態様によれば、この微生物は、サルモネラ、好ましくはサルモネラ・エンテリカであり、この化合物は、式ＩＩ：
（式中、Ｙは、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、このアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである）で示される化合物である。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくは、Ｙは－Ｈ又はメチルである。好ましくは、式ＩＩａで示される化合物が用いられる。
特に好ましい態様によれば、この微生物は、サルモネラ、好ましくはサルモネラ・エンテリカであり、この化合物は、式ＩＩａで示される化合物である。
別の好ましい態様によれば、この微生物は、リステリア、好ましくはリステリア・モノサイトゲネスであり、この化合物は、式ＩＩＩ：
（式中、Ｙは、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、このアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである）で示される化合物である。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくはＹは、－Ｈ又はメチルである。好ましくは式ＩＩＩａ又はＩＩＩｂ、より好ましくはＩＩＩｂで示される化合物が、用いられる。
特に好ましい態様によれば、この微生物は、リステリア、好ましくはリステリア・モノサイトゲネスであり、この化合物は、式ＩＩＩｂで示される化合物である。
別の好ましい態様によれば、この微生物は、Ｓ．アウレウスであり、この化合物は、式ＩＶ：
（式中、Ｙは、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、又はアルカリ金属イオンであり、このアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである）で示される化合物である。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくはＹは、－Ｈ又はメチルである。好ましくは、式ＩＶａで示される化合物が用いられる。
特に好ましい態様によれば、この微生物は、Ｓ．アウレウスであり、この化合物は、式ＩＶａで示される化合物である。
別の好ましい態様によれば、この微生物は、大腸菌であり、この化合物は、式Ｖ：
（式中、Ｙは、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、このアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである）で示される化合物である。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくは、Ｙは、－Ｈ又はメチルである。好ましくは式Ｖａ又はＶｂ、より好ましくはＶｂで示される化合物が、用いられる。
特に好ましい態様によれば、この微生物は、大腸菌であり、この化合物は、式Ｖｂで示される化合物である。
好ましい形態によれば、標的分析物／標的微生物／標的代謝産物は、過酸化水素であり、式Ｉで示される化合物は、式ＶＩ、ＶＩａ、ＶＩｂ、又はＶＩｃで示される化合物である。特に、Ｒ１が第一の形態で定義された－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）であり、他の置換基が、第一の形態（好ましくは式ＶＩ、ＶＩａ、ＶＩｂ又はＶＩｃで示される化合物）に定義された通りである式Ｉで示される化合物を、適切な過酸化水素放出酵素（例えば、オキシダーゼ）と組み合わせて用いる場合に、グルコースなどの生育基質及び代謝産物は、化学発光により細菌培養液の上清中で直接検出され得る。好ましくは式ＶＩで示される化合物、特に、式ＶＩａ、ＶＩｂ若しくはＶＩｃ、最も好ましくはＶＩｃで示される化合物、又は関連する化合物が用いられる。
別の好ましい態様によれば、この微生物は、カルバペネム耐性菌、例えば、シュードモナス・エルギノーサ又はクレブシエラ・ニューモニエであり、この化合物は、式ＶＩＩ又はＶＩＩＩ：
（式中、Ｙは、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、又はアルカリ金属イオンであり、このアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである）で示される化合物である。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくは、Ｙは、－Ｈ又はメチルである。好ましくは式ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ又はＶＩＩＩａ、より好ましくはＶＩＩｂ又はＶＩＩＩａ、さらにより好ましくはＶＩＩＩａで示される化合物が、用いられる。
ロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである）で示される化合物である。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくは、Ｙは、－Ｈ又はメチルである。好ましくは式ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ又はＶＩＩＩａ、より好ましくはＶＩＩｂ又はＶＩＩＩａ、さらにより好ましくはＶＩＩＩａで示される化合物が、用いられる。
特に好ましい態様によれば、この微生物は、カルバペネム耐性シュードモナス・エルギノーサ及びクレブシエラ・ニューモニエであり、この化合物は、式ＶＩＩｂ又はＶＩＩＩａで示される化合物である。
さらなる標的分析物／標的微生物／標的代謝産物、及びそれらの検出に適した式Ｉで示される特定の化合物、特に基Ｒ１は、本発明の第一の形態から認識できる。
さらに本発明は、標的分析物（例えば、過酸化水素）／標的微生物／標的代謝産物の検出のための方法に関する。
好ましくは、本発明は標的微生物の検出のための方法に関する。特に本発明は、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定のための方法に関する。より詳細には、本発明は、適切な分子プローブへの代謝酵素、試薬酵素若しくは参照酵素の作用の化学発光的指標、試薬酵素による細菌代謝産物若しくは栄養素の酵素的酸化から生じた過酸化水素の指標、又は栄養素、基質、代謝産物若しくは試薬酵素による作用の副生成物の役割を担う無機リン酸塩の検出を利用した、バクテリア、バクテリア断片（例えば、ＬＰＳ、内毒素）、ウイルス、真菌及び他の病原体をはじめとする微生物の有無の検出、定量及び同定のための方法に関する。
この方法は、ａ）１種又は複数の標的分析物（例えば、過酸化水素）／標的微生物／標的代謝産物を含む培地を提供するステップと、ｂ）第一の態様に記載された式Ｉで示される化合物を培地に添加して、式Ｉで示される化合物が光を放出するステップと、ｃ）この放出された光を検出するステップと、を含む。
式Ｉで示される化合物が、－Ｎ＋（ＣＨ３）２－部分（上記参照）によってリンカーに結合する
好ましくは
である基Ｒ１を含む場合、酸化剤（好ましくは過酸化水素）もまた、好ましくはステップｂ）で添加される。これは、カルバペネマーゼを用いたベータラクタム環の開環が、直接、発光種の発生につながらないためである。むしろスルフィド部分の酸化は、ホフマン脱離反応を開始して、最終的にリンカーの自壊に導き、こうして発光種の発生に導く必要がある。
好ましい態様によれば、この方法は、追加の溶解ステップを含み、この溶解ステップは、ステップａ）とｂ）の間で、又はステップｂ）で、式Ｉで示される化合物を培地に添加すると同時に、又は添加した後に実施されてもよい。一例において、エタノール又は別の適切な溶媒混合物などの不特定の溶解試薬が（好ましくは１５％の量で）、培地に添加されてもよい。この方法では、細胞内酵素は、培地中に放出され、式Ｉで示される化合物を用いて検出され得る。別の例において、ファージ、ペプチド、タンパク質（特にエンドリジン及びその誘導体）などの選択的溶解試薬が、培地に添加されてもよい。前記選択的溶解試薬は、特定の細胞（即ち、それぞれの選択的溶解試薬に反応する細胞）のみの細胞内酵素の放出を導く。したがって前記選択的溶解試薬は、検出された酵素に加えて、偽陽性結果を予防して特異性を上昇させるさらなる選択基準を示す。これは、基本的に、本明細書に開示された全てのさらなる形態にも適用される。
特異性を上昇させるさらなる例が、抗体に基づく捕捉方法の利用である。例えば抗体で機能化された磁気ビーズが、ステップａ）及びステップｂ）の後に添加されてもよい。したがって特定の細胞が、他の細胞から回収／分離されてもよく、それによって特異性が上昇する。この方法では、代謝活性のあるバクテリアを高感度で検出するために、抗体の高い特異性が、式Ｉで示される化合物の能力と組み合わせられ得る。これは、基本的には、本明細書に開示された全てのさらなる態様に適用される。
好ましくは、この溶媒は、水性溶媒である。
好ましくは、この標的分析物／標的微生物／標的代謝産物は、微生物である。
好ましくは、この微生物は、表１に開示された微生物である。
好ましくはこの微生物は、サルモネラ；サルモネラ・エンテリカ；リステリア、好ましくはリステリア・モノサイトゲネス；Ｓ．アウレウス；大腸菌；カルバペネム耐性菌、好ましくはシュードモナス・エルギノーサ、及びクレブシエラ・ニューモニエ；カンピロバクター・ジェジュニ；Ｃ．コリ；Ｃ．ラリ；バチルス；スタフィロコッカス；クロストリジウム；マイコバクテリウム・ツベルクローシス；クロストリジウム・パーフリンゲンス;Ｓ.アガラクティエ；カンジダ属菌；グラム陰性菌、酵母、カビ、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロコッカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス；シトロバクター、大腸菌群；クロノバクター・サカザキ；ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス；リステリア属菌、ＥＳＢＬ生成エンテロバクター；ビブリオ；クロストリジウム
・ディフィシル；カンジダ・アルビカンス；プレボテラ；シゲラ、アピラーゼ含有微生物、好ましくはシゲラ；レジオネラ・ニューモフィラ;及びカリシウイルス科のウイルス、
好ましくはラゴウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、ネボウイルス、レコウイルス、より好ましくはノロウイルスからなる群から選択される。
・ディフィシル；カンジダ・アルビカンス；プレボテラ；シゲラ、アピラーゼ含有微生物、好ましくはシゲラ；レジオネラ・ニューモフィラ;及びカリシウイルス科のウイルス、
好ましくはラゴウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、ネボウイルス、レコウイルス、より好ましくはノロウイルスからなる群から選択される。
好ましくはこの微生物は、サルモネラ、サルモネラ・エンテリカ、リステリア、好ましくはリステリア・モノサイトゲネス、Ｓ．アウレウス、大腸菌、及びカルバペネム耐性菌、好ましくはシュードモナス・エルギノーサ及びクレブシエラ・ニューモニエからなる群から選択される。
好ましくは式Ｉで示される化合物の０．１μｇ未満が、より好ましくは０．０９μｇ未満、さらにより好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇが、ステップｂ）で添加される。
好ましくは、ステップｂ）で培地に添加される化合物は、ＤＭＳＯ溶液中に存在する。この場合、ステップｂ）で添加される式Ｉで示される化合物の総量は、単に、既知濃度の原液からの分取を利用して決定され得る。
好ましくはステップｂ）の後の培地中のこの化合物の最終濃度は、２～５０μＭ、好ましくは２～４０μＭ、より好ましくは２～３０μＭ、より好ましくは５～２０μＭ、より好ましくは８～１５μＭ、さらにより好ましくは９～１１μＭ、最も好ましくは約１０μＭである。
好ましくはこの微生物は、病原性微生物、より好ましくはバクテリア、さらにより好ましくはサルモネラ、リステリア又はＳ．アウレウスである。
好ましい態様によれば、この微生物は、サルモネラ、好ましくはサルモネラ・エンテリカであり、この化合物は、式ＩＩ：
（式中、Ｙは、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、このアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである）で示される化合物である。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくは、Ｙは、－Ｈ又はメチルである。
特に好ましい態様によれば、この微生物は、サルモネラ、好ましくはサルモネラ・エンテリカであり、この化合物は、式ＩＩａで示される化合物である。
別の特に好ましい態様によれば、この微生物は、リステリア、好ましくはリステリア・モノサイトゲネスであり、この化合物は、式ＩＩＩ：
（式中、Ｙは、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、このアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである）で示される化合物である。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくは、Ｙは、－Ｈ又はメチルである。
特に好ましい態様によれば、この微生物は、リステリア、好ましくはリステリア・モノサイトゲネスであり、この化合物は、式ＩＩＩａ又はＩＩＩｂ、好ましくはＩＩＩｂで示される化合物である。
別の好ましい態様によれば、この微生物は、Ｓ．アウレウスであり、この化合物は、式ＩＶ：
（式中、Ｙは、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、このアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである）で示される化合物である。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくは、Ｙは、－Ｈ又はメチルである。
特に好ましい態様によれば、この微生物は、Ｓ．アウレウスであり、この化合物は、式ＩＶａで示される化合物である。
別の好ましい態様によれば、この微生物は、大腸菌であり、この化合物は、式Ｖ：
（式中、Ｙは、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、このアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである）で示される化合物である。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくは、Ｙは、－Ｈ又はメチルである。
特に好ましい態様によれば、この微生物は、大腸菌であり、この化合物は、式Ｖａ又はＶｂ、好ましくはＶｂで示される化合物である。
別の好ましい態様によれば、この微生物は、カルバペネム耐性菌、好ましくはシュードモナス・エルギノーサ及びクレブシエラ・ニューモニエであり、この化合物は、式ＶＩＩ又はＶＩＩＩ：
（式中、Ｙは、－Ｈ、任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、このアルカリ金属イオンは、好ましくはナトリウム又はカリウムであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである）で示される化合物である。好ましくは、Ｙは、－Ｈ又は任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、この任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルは、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔｅｒｔ－ブチルである。より好ましくは、Ｙは、－Ｈ又はメチルである。
特に好ましい態様によれば、この微生物は、カルバペネム耐性シュードモナス・エルギノーサ及びクレブシエラ・ニューモニエであり、この化合物は、式ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ又はＶＩＩＩａ、好ましくはＶＩＩＩａで示される化合物である。
検出に適したさらなる標的分析物／標的微生物／標的代謝産物、及び式Ｉで示される特定の化合物、特に基Ｒ１は、本発明の第一の形態から認識可能である。
その上、この培地が、１種を超える微生物を含み、前記微生物のうちの１種が培地中に存在する前記微生物の１種以上のものの少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍の光放出に導くことが、好ましい。
第二の形態の副次的形態と見なされ得る第三の形態において、本発明は、生育基質、栄養素、及び代謝産物の酵素的酸化による前記生育基質、栄養素、及び／又は代謝産物の検出のための、第一の形態で記載された式Ｉで示される化合物の使用に関する。
生育基質、栄養素及び代謝産物の検出は、病原体の間接的な検出を可能にする。
生育基質、栄養素及び代謝産物の検出は、病原体の間接的な検出を可能にする。
この形態において、生育基質、栄養素及び／又は代謝産物は、それらを、この生育基質、栄養素及び／又は代謝産物を酸化し、それにより過酸化水素を生成する酵素と接触させることにより検出される。したがってこの生育基質、栄養素又は代謝産物は、この生育基質、栄養素又は代謝産物に作用する酵素により生成された過酸化水素を検出することにより、間接的に検出される。
一態様において、この栄養素は、炭水化物及びアミノ酸であり、この酵素は、対応するオキシダーゼである。例えばこの栄養素は、グルコースであり、この酵素は、グルコースオキシダーゼであるか；又はこの栄養素は、Ｄ－アミノ酸であり、この酵素は、アミノ酸オキシド（ＤＡＯ）であるか；又はこの栄養素は、Ｄ－アスパラギン酸であり、この酵素は、Ｄ－アスパラギン酸オキシダーゼである。
好ましい態様において、この代謝産物は、ヒスタミンであり、この酵素は、ジアミノオキシダーゼである。
この態様において、Ｒ１は、好ましくは第一の形態に定義された－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－ＢＦ３ －Ｋａｔ＋であり、他の置換基は、同じく第一の形態にも定義されている。
この態様において、Ｒ１は、好ましくは第一の形態に定義された－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－ＢＦ３ －Ｋａｔ＋であり、他の置換基は、同じく第一の形態にも定義されている。
一態様において、ｎは０である。別の態様において、ｎは１である。
特に好ましい化合物は、Ｒ１が、
である、表Ａで開示された化合物である。
式Ｉで示される化合物は、固体の形態又は溶液中で用いられ得る。しかし、溶液、好ましくはＤＭＳＯ溶液中で、式Ｉで示される化合物を使用することが、上記に説明された理由から好ましい。好ましくは式Ｉで示される化合物は、０．１μｇ未満、好ましくは０．０９μｇ未満、より好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇの量で用いられる。
好ましい態様によれば、この化合物は、１～１００μＭ、好ましくは５～８０μＭ、より好ましくは１０～７０μＭ、より好ましくは２０～６０μＭ、より好ましくは３０～５０μＭ、さらにより好ましくは３５～４５μＭの最終濃度で用いられる。
別の好ましい態様によれば、この化合物は、１０～５００μＭ、好ましくは１０～２５０μＭ、より好ましくは１０～５０μＭの最終濃度で用いられる。
好ましくはこの培地は、原核細胞を含む培地、原核生物の培養液の上清、真核細胞を含む培地、真核生物の培養液の上清、血清又は全血である。
さらに本発明は、生育基質、栄養素及び代謝産物の酵素的酸化による、前記生育基質、栄養素及び／又は代謝産物の検出のための方法に関する。
この方法は、ａ）酵素により酸化されることが可能な生育基質、栄養素及び／又は代謝産物を含む培地を提供するステップと、ｂ）（ｂ１）この生育基質、栄養素及び／又は代謝産物を酸化することが可能な酵素を添加し、それにより過酸化水素を生成するステップと、（ｂ２）Ｒ１が－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）であり、他の置換基が第一の形態に記載された通りである、式Ｉで示される化合物をこの培地に添加して、式Ｉで示される化合物が過酸化水素との接触の際に光を放出するステップであって、ステップ（ｂ１）及び（ｂ２）が、同時又は逐次実施されてもよいステップと、ｃ）この放出された光を検出するステップと、を含む。
好ましくはこの培地は、水性培地である。
より好ましくはこの培地は、原核細胞を含む培地、原核生物の培養液の上清、真核細胞を含む培地、真核生物の培養液の上清、血清又は全血である。
一態様において、この栄養素は、炭水化物又はアミノ酸であり、この酵素は、対応するオキシダーゼである。例えばこの栄養素は、グルコースであり、この酵素は、グルコースオキシダーゼであるか；又はこの栄養素は、Ｄ－アミノ酸であり、この酵素は、アミノ酸オキシド（ＤＡＯ）であるか；又はこの栄養素は、Ｄ－アスパラギン酸であり、この酵素は、Ｄ－アスパラギン酸オキシダーゼである。
好ましい態様において、この代謝産物は、ヒスタミンであり、この酵素は、ジアミノオキシダーゼである。
エタノール又は別の適切な溶媒若しくは溶媒混合物が、好ましくは１５％の量で、ステップａ）及びｂ）（サブステップｂ１及びｂ２を含む）のいずれかで、又はステップａ）とステップｂ）の間、又はそれらの後に添加されてもよい。上記の通り、他の溶解試薬が、代わりに用いられてもよい。
式Ｉで示される化合物は、固体の形態又は溶液中で用いられ得る。しかし、溶液、好ましくはＤＭＳＯ溶液中で、式Ｉで示される化合物を用いることが、上記に説明された理由から好ましい。
好ましくは式Ｉで示される化合物は、０．１μｇ未満、好ましくは０．０９μｇ未満、より好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇの量で添加される。
好ましくは、培地中の式Ｉで示される化合物の最終濃度が、２～５０μＭ、好ましくは２～４０μＭ、より好ましくは２～３０μＭ、より好ましくは５～２０μＭ、より好ましくは８～１５μＭ、さらにより好ましくは９～１１μＭ、最も好ましくは約１０μＭにな
るように、式Ｉで示される化合物が添加される。
るように、式Ｉで示される化合物が添加される。
或いは、また好ましくは、培地中の式Ｉで示される化合物の最終濃度が、１～１００μＭ、好ましくは５～８０μＭ、より好ましくは１０～７０μＭ、より好ましくは２０～６０μＭ、より好ましくは３０～５０μＭ、さらにより好ましくは３５～４５μＭになるように、式Ｉで示される化合物が添加される。
第二の形態の副次的形態と見なされ得る第四の形態において、本発明は、カブトガニＣ因子の検出を介したバクテリア内毒素の検出のための、第一の形態で定義された式Ｉで示される化合物の使用に関する。
この形態において、基Ｒ１は、カブトガニＣ因子に対して応答性／不安定性である。好ましくは、Ｒ１は、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－アルギニニル又はＢｏｃ－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｐｒｏ－アルギニニルであり、他の置換基は、第一の形態に定義された通りである。
式で示される化合物は、固体の形態又は溶液中で、好ましくはＤＭＳＯ溶液中で用いられてもよい。好ましくは式Ｉで示される化合物は、溶液中で、好ましくはＤＭＳＯ溶液中で用いられる。
好ましくは式Ｉで示される化合物は、０．１μｇ未満、好ましくは０．０９μｇ未満、より好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇの量で用いられる。
さらに本発明は、式Ｉで示される化合物及びカブトガニＣ因子が内毒素を含む培地に添加される、カブトガニＣ因子の検出を介したバクテリア内毒素の検出のための方法に関する。
好ましくは、Ｒ１は、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－アルギニニル又はＢｏｃ－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｐｒｏ－アルギニニルであり、他の置換基は、第一の形態に定義された通りである。特に好ましくは、この化合物は、Ｒ１が、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－アルギニニル又はＢｏｃ－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｐｒｏ－アルギニニルである、表Ａに開示された式Ｉで示される化合物である。
それぞれの内毒素の存在下で、カブトガニＣ因子のペプチダーゼ活性が活性化されて、このペプチダーゼ活性が、Ｒ１を、式Ｉで示される化合物の残り部分から切断して、化学発光を生じる。それぞれの内毒素の非存在下では、ペプチダーゼ活性が存在しない。
好ましくはこの方法で用いられる培地は、水性培地である。
エタノール又は別の適切な溶媒若しくは溶媒混合物が、好ましくは１５％の量で、培地に添加されてもよい。上記の通り、他の溶解試薬が、代わりに用いられてもよい。
式Ｉで示される化合物は、固体の形態又は溶液中で用いられ得る。しかし、溶液、好ましくはＤＭＳＯ溶液中で、式Ｉで示される化合物を用いることが、上記に説明された理由から好ましい。
好ましくは式Ｉで示される化合物は、０．１μｇ未満、好ましくは０．０９μｇ未満、
より好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇの量で用いられる。
より好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇの量で用いられる。
好ましくは、培地中の式Ｉで示される化合物の最終濃度は、２～５０μＭ、好ましくは２～４０μＭ、より好ましくは２～３０μＭ、より好ましくは５～２０μＭ、より好ましくは８～１５μＭ、さらにより好ましくは９～１１μＭ、最も好ましくは約１０μＭである。
第二の形態の副次的形態と見なされ得る第五の形態において、本発明は、乳製品、例えば乳の低温殺菌の検査のための、第一の形態に記載された式Ｉで示される化合物の使用に関する。
好ましくは、用いられる化合物は、Ｒ１がホスホリルであり、他の置換基が第一の形態に定義された通りである、式Ｉで示される化合物である。
好ましくは式Ｉで示される化合物は、０．１μｇ未満、好ましくは０．０９μｇ未満、より好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇの量で用いられる。
好ましくはこの化合物は、１～１００μＭ、好ましくは５～８０μＭ、より好ましくは１０～７０μＭ、より好ましくは２０～６０μＭ、より好ましくは３０～５０μＭ、さらにより好ましくは３５～４５μＭの最終濃度で用いられる。
別の態様において、式Ｉで示される化合物は、１～５０μＭ、好ましくは５～４０μＭ、より好ましくは１０～３０μＭ、より好ましくは１５～２５μＭ、より好ましくは１８～２２μＭ、より好ましくは１９～２１μＭの最終濃度で用いられる。
さらに本発明は、乳製品、好ましくは乳の低温殺菌を検査する方法に関する。
この方法は、ａ）乳製品媒体、好ましくは乳を提供するステップと、ｂ）低温滅菌のステップと、ｃ）Ｒ１がホスホリルである第一の態様に記載された式Ｉで示される化合物を、任意に緩衝液とともに、媒体に添加して、式Ｉで示された化合物が光を放出するステップと、ｄ）この放出された光を検出するステップと、を含む。
乳製品中に自然に存在するホスファターゼは、滅菌の間に分解する。したがって滅菌が成功すれば、活性ホスファターゼがこの乳製品中に存在しなくなるため、光の放出が検出されない。
好ましくは、ステップｂ）で媒体に添加された化合物は、ＤＭＳＯ溶液中に存在する。
好ましくは、式Ｉで示される化合物が、２～５０μＭ、好ましくは２～４０μＭ、より好ましくは２～３０μＭ、より好ましくは５～２０μＭ、より好ましくは８～１５μＭ、さらにより好ましくは９～１１μＭ、最も好ましくは約１０μＭの最終濃度で存在するように、式Ｉで示される化合物が媒体に添加される。
別の態様において、式Ｉで示される化合物が、１～５０μＭ、好ましくは５～４０μＭ
、より好ましくは１０～３０μＭ、より好ましくは１５～２５μＭ、より好ましくは１８～２２μＭ、より好ましくは１９～２１μＭの最終濃度で存在するように、式Ｉで示される化合物が、媒体に添加される。
、より好ましくは１０～３０μＭ、より好ましくは１５～２５μＭ、より好ましくは１８～２２μＭ、より好ましくは１９～２１μＭの最終濃度で存在するように、式Ｉで示される化合物が、媒体に添加される。
好ましくは式Ｉで示される化合物の０．１μｇ未満、より好ましくは０．０９μｇ未満、さらにより好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇが、媒体に添加される。
好ましくは、ステップｂ）で媒体に添加される化合物は、ＤＭＳＯ溶液中に存在する。この場合、ステップｂ）で添加される式Ｉで示される化合物の総量は、単に、既知濃度の原液からの分取を利用して決定され得る。
第二の形態の副次的形態と見なされ得る第六の形態において、本発明は、微生物中における抗生物質耐性を検査するための式Ｉで示される化合物の使用に関する。
好ましくは、Ｒ１は、第一の形態で定義されたベータラクタマーゼ不安定基、好ましくはベータラクタム系抗生物質、より好ましくはペニシリン、第一～五世代のセファロスポリン、セファマイシン、又はカルバペネムであり、他の置換基は、第一の形態で定義された通りである。
好ましくは式Ｉで示される化合物は、表Ａに定義された通りであり、Ｒ１は、好ましく表されたカルバペネム部分である。
好ましくはこの微生物は、サルモネラ；サルモネラ・エンテリカ；リステリア、好ましくはリステリア・モノサイトゲネス；Ｓ．アウレウス；大腸菌；カルバペネム耐性菌、好ましくはシュードモナス・エルギノーサ、及びクレブシエラ・ニューモニエ；カンピロバクター・ジェジュニ；Ｃ．コリ；Ｃ．ラリ；バチルス；スタフィロコッカス；クロストリジウム；マイコバクテリウム・ツベルクローシス；クロストリジウム・パーフリンゲンス;Ｓ.アガラクティエ、カンジダ属菌；グラム陰性菌、酵母、カビ、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロコッカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス；シトロバクター、大腸菌群；クロノバクター・サカザキ；ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス；リステリア属菌、ＥＳＢＬ生成エンテロバクター；ビブリオ；クロストリジウム・ディフィシル；カンジダ・アルビカンス；プレボテラ；シゲラ；レジオネラ・ニューモフィラ;及びカリシウイルス科のウイルス、好ましくはラゴウイルス、ノロウイルス、サ
ポウイルス、ネボウイルス、レコウイルス、より好ましくはノロウイルスからなる群から選択される。
ポウイルス、ネボウイルス、レコウイルス、より好ましくはノロウイルスからなる群から選択される。
より好ましくはこの微生物は、サルモネラ；サルモネラ・エンテリカ；リステリア、好ましくはリステリア・モノサイトゲネス；Ｓ．アウレウス；大腸菌；カルバペネム耐性菌、好ましくはシュードモナス・エルギノーサ、及びクレブシエラ・ニューモニエ；カンピロバクター・ジェジュニ；Ｃ．コリ；Ｃ．ラリ；バチルス；スタフィロコッカス；クロストリジウム；マイコバクテリウム・ツベルクローシス；クロストリジウム・パーフリンゲンス;Ｓ.アガラクティエ、カンジダ属菌；グラム陰性菌、酵母、カビ、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロコッカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス；シトロバクター、大腸菌群；クロノバクター・サカザキ；ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス；リステリア属菌、ＥＳＢＬ生成エンテロバクター；ビブリオ；クロストリジウム・ディフィシル；カンジダ・アルビカンス；プレボテラ；シゲラ、及びレジオネラ・ニューモフィラからなる群から選択される。
さらにより好ましくは、この微生物は、シュードモナス・エルギノーサ及びクレブシエラ・ニューモニエから選択される。
この化合物は、固体の形態又は溶液中で用いられてもよい。しかし、溶液、好ましくはＤＭＳＯ溶液中で、式Ｉで示される化合物を使用することが、好ましい。
好ましくは式Ｉで示される化合物は、０．１μｇ未満、好ましくは０．０９μｇ未満、より好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇの量で用いられる。
好ましくはこの化合物は、１～１００μＭ、好ましくは５～８０μＭ、より好ましくは１０～７０μＭ、より好ましくは２０～６０μＭ、より好ましくは３０～５０μＭ、さらにより好ましくは３５～４５μＭの最終濃度で用いられる。
別の態様において、この化合物は、約１～５０μＭ、好ましくは２～４０μＭ、より好ましくは３～３０μＭ、より好ましくは４～２０μＭ、より好ましくは５～１５μＭ、より好ましくは７～１３μＭ、より好ましくは９～１１μＭの最終濃度で用いられる。
さらに本発明は、微生物における抗生物質、特にペニシリン、セファロスポリン、セファマイシン、又はカルバペネムなどのベータラクタム系抗生物質の耐性を検査するための方法に関する。
この方法は、ａ）１種又は複数の微生物を含む培地を提供するステップと、ｂ）Ｒ１が、ベータラクタマーゼ不安定基、好ましくはペニシリン、第一～五世代のセファロスポリン、セファマイシン、又はカルバペネムなどのベータラクタム系抗生物質であり、他の置換基が、第一の形態で定義された通りである、式Ｉで示される化合物を培地に添加して、抗生物質、好ましくはペニシリン、セファロスポリン、セファマイシン、又はカルバペネムなどのベータラクタム系抗生物質の耐性菌が、培地中に存在する場合に、式Ｉで示される化合物が光を放出するステップと、ｃ）この放出された光を検出するステップと、を含む。
好ましくは式Ｉで示される化合物は、表Ａに定義された通りであり、Ｒ１は、カルバペネミル（carbapenemyl）である。
好ましくはこの培地は、水性培地である。
エタノール又は別の適切な溶媒若しくは溶媒混合物が、好ましくは１５％の量で、ステップａ）及びｂ）のいずれかで、又はステップａ）とステップｂ）の間、又はそれらの後に添加されてもよい。上記の通り、他の溶解試薬が、代わりに用いられてもよい。
好ましくは、式Ｉで示される化合物が、２～５０μＭ、好ましくは２～４０μＭ、より好ましくは２～３０μＭ、より好ましくは５～２０μＭ、より好ましくは８～１５μＭ、さらにより好ましくは９～１１μＭ、最も好ましくは約１０μＭの最終濃度で存在するように、式Ｉで示される化合物が培地に添加される。
別の態様において、式Ｉで示される化合物が、約１～５０μＭ、好ましくは２～４０μＭ、より好ましくは３～３０μＭ、より好ましくは４～２０μＭ、より好ましくは５～１
５μＭ、より好ましくは７～１３μＭ、より好ましくは９～１１μＭの最終濃度で存在するように、式Ｉで示される化合物が添加される。
５μＭ、より好ましくは７～１３μＭ、より好ましくは９～１１μＭの最終濃度で存在するように、式Ｉで示される化合物が添加される。
好ましくは式Ｉで示される化合物の０．１μｇ未満、より好ましくは０．０９μｇ未満、さらにより好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇが、培地に添加される。
好ましくは、ステップｂ）で培地に添加される化合物は、ＤＭＳＯ溶液中に存在する。この場合、ステップｂ）で添加される式Ｉで示される化合物の総量は、単に、既知濃度の原液からの分取を利用して決定され得る。
特に、光の放出は、抗生物質耐性菌のみで生じるため、この方法は、抗生物質耐性菌を抗生物質感受性菌と識別するのに適する。
第二の形態の副次的形態と見なされ得る第七の態様において、本発明は、無機リン酸塩、好ましくは酵素反応により生成された無機リン酸塩の検出のための式Ｉで示される化合物の使用に関する。
好ましくはＲ１は、オキサリルエステルであり、他の置換基は、第一の形態で定義された通りである。
好ましくはこの無機リン酸塩は、アピラーゼ、好ましくはシゲラアピラーゼにより生成される。この場合、この化合物は、世界中の下痢の主たる細菌の原因の１つであるシゲラを検出するのに適する。
好ましくは式Ｉで示される化合物は、０．１μｇ未満、好ましくは０．０９μｇ未満、より好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇの量で用いられる。
この化合物は、固体の形態又は溶液中で用いられてもよい。しかし、式Ｉで示される化合物を溶液中で、好ましくはＤＭＳＯ溶液中で用いることが、好ましい。
好ましくはこの化合物は、１～１００μＭ、好ましくは５～８０μＭ、より好ましくは１０～７０μＭ、より好ましくは２０～６０μＭ、より好ましくは３０～５０μＭ、さらにより好ましくは３５～４５μＭの最終濃度で用いられる。
さらに本発明は、無機リン酸塩、好ましくは酵素反応により生成された無機リン酸塩を検出するための方法に関する。
この方法は、ａ）無機リン酸塩を含む培地を提供するステップと、ｂ）Ｒ１がオキサリルエステルであり、他の置換基が第一の形態で定義された通りである、式Ｉで示される化合物を培地に添加して、式Ｉで示される化合物が光を放出するステップと、ｃ）この放出された光を検出するステップと、を含む。
好ましくは式Ｉで示される化合物は、表Ａに定義された通りであり、Ｒ１は、オキサリルエステルである。
好ましくは、培地に含まれる無機リン酸塩は、アピラーゼ、好ましくはシゲラアピラーゼにより生成される。したがって、ステップａ）の培地が、アピラーゼ、好ましくはシゲラアピラーゼを含むことが、好ましい。ステップａ）の培地が、シゲラを含むことが、特に好ましい。
好ましくはこの培地は、水性培地である。
エタノール又は別の適切な溶媒若しくは溶媒混合物が、好ましくは１５％の量で、ステップａ）及びｂ）のいずれかで、又はステップａ）とステップｂ）の間、又はそれらの後に添加されてもよい。上記の通り、他の溶解試薬が、代わりに用いられてもよい。
好ましくは式Ｉで示される化合物の０．１μｇ未満は、より好ましくは０．０９μｇ未満、さらにより好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇである。
好ましくは、ステップｂ）で培地に添加される化合物は、ＤＭＳＯ溶液中に存在する。
好ましくは、培地中のこの化合物の最終濃度は、２～５０μＭ、好ましくは２～４０μＭ、より好ましくは２～３０μＭ、より好ましくは５～２０μＭ、より好ましくは８～１５μＭ、さらにより好ましくは９～１１μＭ、最も好ましくは約１０μＭである。
第二の形態の副次的形態と見なされ得る第八の形態において、本発明は、好ましくは指標微生物ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスのアルファ－Ｄ－グルコシダーゼ活性の検出を通した、滅菌工程のモニタリングのための式Ｉで示される化合物の使用に関する。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスは、アルファ－グルコシダーゼを生成するが、アルファ－グルコシダーゼは滅菌で不活性化される。
好ましくは、Ｒ１は、アルファ－Ｄ－グルコピラノシジルであり、他の置換基は、第一の形態で定義された通りである。したがって、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス及びアルファ－グルコシダーゼが、滅菌により不活化されれば、アルファ－Ｄ－グルコピラノシジル部分を切除することができず、結果的に光が放出されない。
好ましくは式Ｉで示される化合物は、０．１μｇ未満、好ましくは０．０９μｇ未満、より好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇの量で用いられる。
この形態でも、式Ｉで示される化合物は、固体の形態又は溶液中で用いられてもよい。しかし、溶液、好ましくはＤＭＳＯ溶液中で、式Ｉで示される化合物を使用することが、好ましい。
好ましくはこの化合物は、１～１００μＭ、好ましくは５～８０μＭ、より好ましくは１０～７０μＭ、より好ましくは２０～６０μＭ、より好ましくは３０～５０μＭ、さらにより好ましくは３５～４５μＭの最終濃度で用いられる。
さらに本発明は、好ましくは指標微生物ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスのアル
ファ－Ｄ－グルコシダーゼ活性の検出を通した、滅菌工程のモニタリングのための方法に関する。
ファ－Ｄ－グルコシダーゼ活性の検出を通した、滅菌工程のモニタリングのための方法に関する。
この方法は、ａ１）通常の条件下でアルファ－グルコシダーゼを生成する微生物、好ましくはゲオバチルス・ステアロサーモフィルスを含む培地を提供するステップと、ａ２）この培地を滅菌するステップと、ｂ）Ｒ１がアルファ－Ｄ－グルコピラノシジルであり、他の置換基が第一の形態に定義された通りである、式Ｉで示される化合物をこの培地に添加するステップと、ｃ）存在すれば、放出された光を検出するステップと、を含む。
好ましくは、式Ｉで示される化合物は、表Ａに定義された通りであり、Ｒ１は、アルファ－Ｄ－グルコピラノシジルであり、他の置換基は、第一の形態に定義された通りである。
好ましくはこの培地は、水性培地である。
エタノール又は別の適切な溶媒若しくは溶媒混合物が、好ましくは１５％の量で、ステップｂ）で、又はステップｂ）の後に添加されてもよい。上記の通り、他の溶解試薬が、代わりに用いられてもよい。
好ましくは式Ｉで示される化合物の０．１μｇ未満は、より好ましくは０．０９μｇ未満、さらにより好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇである。
好ましくは、培地に添加される化合物は、ＤＭＳＯ溶液中に存在する。
好ましくは、培地中のこの化合物の最終濃度は、２～５０μＭ、好ましくは２～４０μＭ、より好ましくは２～３０μＭ、より好ましくは５～２０μＭ、より好ましくは８～１５μＭ、さらにより好ましくは９～１１μＭ、最も好ましくは約１０μＭである。
第二の形態の副次的形態と見なされ得る第九の形態において、本発明は、バクテリアの抗生物質耐性のエンドポイント及びオンライン検出のため、並びに抗生物質感受性検査のための、第一の形態に記載された式Ｉで示される化合物の使用に関する。
この形態において、この化合物は、培養の開始時、又は測定時に、細菌及び抗生物質を含有する培地に添加されてもよい。抗生物質耐性菌は、抗生物質の存在下であっても増殖し、基Ｒ１とそれぞれのバクテリア（特に酵素又はその類似物）との相互作用によって、式Iで示される化合物の光放出が生じる（実施例８参照）。
どの基Ｒ１が、バクテリアの抗生物質耐性の前記エンドポイント及びオンライン検出に、そして抗生物質感受性検査に用いられ得るかは、表１から認識できる。例えば、Ｒ１がホスホリルである、式Ｉで示される化合物は、スタフィロコッカス・アウレウス、特にＭＲＳＡ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、Ｓ．アガラクティエ、又はカンジダの抗生物質耐性のエンドポイント及びオンライン検出に、そしてそれらの抗生物質感受性検査に用いられてもよい。別の例において、Ｒ１がＬ－ピログルタミックアシジルである、式Ｉで示される化合物は、エンテロコッカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、又はシトロバクターの抗生物質耐性のエンドポイント及びオンライン検出に、そしてそれらの抗生物質感受性検査に用いられてもよい。さらなる例において、Ｒ１がベータ－Ｄ－ガラクトピラノシジルである、式Ｉで示される化合物は、大腸菌群又は大腸菌の抗生物質耐性のエ
ンドポイント及びオンライン検出に、そしてそれらの抗生物質感受性検査に用いられてもよい。
ンドポイント及びオンライン検出に、そしてそれらの抗生物質感受性検査に用いられてもよい。
好ましくは式Ｉで示される化合物は、０．１μｇ未満、好ましくは０．０９μｇ未満、より好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇの量で用いられる。
この形態でも、式Ｉで示される化合物は、固体の形態又は溶液中で用いられてもよい。しかし、溶液、好ましくはＤＭＳＯ溶液中で、式Ｉで示される化合物を使用することが、好ましい。
好ましくはこの化合物は、１～１００μＭ、好ましくは５～８０μＭ、より好ましくは１０～７０μＭ、より好ましくは２０～６０μＭ、より好ましくは３０～５０μＭ、さらにより好ましくは３５～４５μＭの最終濃度で用いられる。
さらに本発明は、バクテリアの抗生物質耐性のエンドポイント及びオンライン検出のため、並びに抗生物質感受性検査のための方法に関する。
この方法は、ａ）微生物、好ましくはバクテリアを含む培地を提供するステップと、ｂ）抗生物質を添加するステップと、ｃ）Ｒ１が前記微生物、特に前記微生物により生成された酵素に対して反応する式Ｉで示される化合物を添加するステップであって、ステップｃ）がステップｂ）の前、ステップｂ）と同時、又はステップｂ）の後に実施されてもよい、ステップと、ｄ）存在すれば、放出された光を検出するステップと、を含む。
どの基Ｒ１が、バクテリアの抗生物質耐性の前記エンドポイント及びオンライン検出に、並びに抗生物質感受性検査に用いられ得るかは、表１から認識できる。
好ましくは式Ｉで示される化合物の０．１μｇ未満は、より好ましくは０．０９μｇ未満、さらにより好ましくは０．０８μｇ未満、さらにより好ましくは０．０７μｇ未満、さらにより好ましくは０．０６５μｇ未満、さらにより好ましくは０．０４～０．０６μｇ、さらにより好ましくは０．０４５～０．０５５μｇ、最も好ましくは約０．０５μｇである。
好ましくは、培地に添加される化合物は、ＤＭＳＯ溶液中に存在する。
好ましくは、培地中のこの化合物の最終濃度は、２～５０μＭ、好ましくは２～４０μＭ、より好ましくは２～３０μＭ、より好ましくは５～２０μＭ、より好ましくは８～１５μＭ、さらにより好ましくは９～１１μＭ、最も好ましくは約１０μＭである。
好ましくはこの培地は、水性培地である。
エタノール又は別の適切な溶媒若しくは溶媒混合物が、好ましくは１５％の量で、ステップｂ）で、又はステップｂ）の後に添加されてもよい。上記の通り、他の溶解試薬が、代わりに用いられてもよい。
ここで本発明が、以下の非限定的な実施例によりさらに示される。
一般的方法：
全ての反応は、特に記載のない限り、室温で実施された。化学物質及び溶媒は、Ａ．Ｒ．グレード（A.R. grade）であるか、又は標準的な技術により精製された。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）:シリカゲルプレートＭｅｒｃｋ ６０ F２５４：化合物は、ＵＶ光の照射により視覚化された。カラムクロマトグラフィー（ＦＣ）:シリカゲルＭｅｒｃ
ｋ ６０（粒度０．０４０～０．０６３ｍｍ）、溶離液がカッコ内に示される。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）:Ｃ１８ ５ｕ、２５０×４．６ｍｍ、溶離
液がカッコ内に示される。分取ＲＰ－ＨＰＬＣ:Ｃ１８ ５ｕ、２５０×２１ｍｍ、溶離
液がカッコ内に示される。蛍光及び化学発光は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘで記録された。
特に記載のない限り、全ての化学物質が、Ｍｅｒｋ及びＢｉｏｓｙｎｔｈ ＡＧから購
入され、受け取ったままの状態で使用された。
略語．ＡｃＯＨ － 酢酸、ＭｅＣＮ － アセトニトリル、ＤＣＭ － ジクロロメタン、ＤＭＦ － Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド、ＥｔＯＡｃ － 酢酸エチル、Ｈｅｘ － ヘキサン、ＭｅＯＨ－メタノール、ＴＦＡ － トリフルオロ酢酸、ＴＨＦ －テトラヒドロフラン、ＴＩＰＳＣｌ － トリイソプロピルシリルクロリド。
一般的方法：
全ての反応は、特に記載のない限り、室温で実施された。化学物質及び溶媒は、Ａ．Ｒ．グレード（A.R. grade）であるか、又は標準的な技術により精製された。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）:シリカゲルプレートＭｅｒｃｋ ６０ F２５４：化合物は、ＵＶ光の照射により視覚化された。カラムクロマトグラフィー（ＦＣ）:シリカゲルＭｅｒｃ
ｋ ６０（粒度０．０４０～０．０６３ｍｍ）、溶離液がカッコ内に示される。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）:Ｃ１８ ５ｕ、２５０×４．６ｍｍ、溶離
液がカッコ内に示される。分取ＲＰ－ＨＰＬＣ:Ｃ１８ ５ｕ、２５０×２１ｍｍ、溶離
液がカッコ内に示される。蛍光及び化学発光は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘで記録された。
特に記載のない限り、全ての化学物質が、Ｍｅｒｋ及びＢｉｏｓｙｎｔｈ ＡＧから購
入され、受け取ったままの状態で使用された。
略語．ＡｃＯＨ － 酢酸、ＭｅＣＮ － アセトニトリル、ＤＣＭ － ジクロロメタン、ＤＭＦ － Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド、ＥｔＯＡｃ － 酢酸エチル、Ｈｅｘ － ヘキサン、ＭｅＯＨ－メタノール、ＴＦＡ － トリフルオロ酢酸、ＴＨＦ －テトラヒドロフラン、ＴＩＰＳＣｌ － トリイソプロピルシリルクロリド。
合成の実施例１：化合物ＩＩａの合成
ＤＣＣ（４５７ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ、１．１当量）が、ＤＣＭ（２ｍｌ）中のオクタン酸（３５０μｌ、２．２１ｍｍｏｌ、１．１当量）と４－ヒドロキシベンジルアルコール（２５０ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ、１当量）との混合物に添加された。反応混合物が室温で撹拌され、ＴＬＣ（４０：６０ ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）を介してモニタリングされた。完了したら、ＤＣＣが濾別され、粗生成物がシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（３０：７０ ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）により精製されて、化合物１ａ（２４６ｍｇ、４９％収率）を黄色がかった固体として生成した。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.35 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.63 (s, 2H), 2.55 (t, J = 7.5 Hz, 2H),
1.76 (dt, J = 15.1, 7.5 Hz, 2H), 1.50 - 1.18 (m, 8H), 0.97 - 0.82 (m, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.75, 150.68, 133.71, 129.49, 121.78, 65.50, 34.48, 31.72, 29.16, 29.14, 29.11, 28.98, 25.01, 22.67, 14.13。
1.76 (dt, J = 15.1, 7.5 Hz, 2H), 1.50 - 1.18 (m, 8H), 0.97 - 0.82 (m, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.75, 150.68, 133.71, 129.49, 121.78, 65.50, 34.48, 31.72, 29.16, 29.14, 29.11, 28.98, 25.01, 22.67, 14.13。
濾過されて溶媒が減圧下で蒸発され、化合物１ｂ（１８５ｍｇ、６４％収率）をオフホワイト色の固体として生成した。この化合物は、さらに精製されることなく反応された。1H
NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.45 (s, 2H), 2.54 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 1.74 (dt, J = 15.1, 7.5 Hz, 2H), 1.44 - 1.24 (m, 8H), 0.90 (t, J = 6.9 Hz, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.35, 150.33,
133.73, 129.82, 129.40, 121.93, 121.68, 43.20, 34.36, 34.28, 31.62, 30.71, 29.03, 28.88, 24.90, 22.57, 14.04。
D., ACS Central Sci., 2017, 4, 349-58に従って調製)（３０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ
、１．１当量）が、アルゴン雰囲気下で脱水ＤＭＦに溶解され、０℃に冷却された。水素化ナトリウム（６．４ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、２．２当量）が添加され、反応物が室温まで昇温された。１５分間撹拌した後、化合物１ｂ（２６ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、１当量）が添加され、反応物をＲＰ－ＨＰＬＣ（水中の９０－１００％ＡＣＮ、２０分)によ
りモニタリングされた。完了したら、反応混合物が減圧下で蒸発されて濃縮されて、粗生成物が分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（水中の９５－１００％ＡＣＮ、２０分）により精製されて、化合物１ｄ（１８ｍｇ、４５％収率）を白色固体として生成した。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.78 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.17 - 7.05 (m, 3H), 6.58 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 4.96 (d, J = 12.9 Hz, 2H), 3.21 (s, 3H), 3.17 (s, 2H), 2.56 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.92 (dd, J = 34.0, 9.0 Hz, 4H), 1.82 - 1.55 (m, 10H), 1.37 - 1.14 (m, 8H), 0.89 - 0.80 (m, 3H)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 172.09, 159.35, 153.04, 150.78, 139.79, 137.52, 133.86, 130.71, 130.06, 129.93, 129.00, 128.20, 126.30, 122.28, 75.34, 56.92, 36.88, 33.89, 32.83, 31.53, 29.46, 28.78, 28.12, 27.98, 24.75, 22.51, 14.31。
２０分）により精製されて、化合物ＩＩａ（１５ｍｇ、７９％収率）をオフホワイト色の固体として生成した。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.94 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.79 (d,
J = 8.4 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.13 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.63 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 4.92 (q, J = 10.9 Hz, 2H), 3.11 (s, 3H), 2.88 (s, 1H), 2.56 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.22 (d, J = 11.5 Hz, 1H), 1.89 (d,
J = 3.8 Hz, 1H), 1.77 - 1.50 (m, 19H), 1.46 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 1.40 - 1.16 (m, 8H), 0.90 - 0.80 (m, 3H)。13C NMR (126 MHz, DMSO) δ 172.35, 167.74, 154.08, 151.18, 136.97, 134.67, 133.84, 132.01, 130.34, 129.10, 127.38, 126.70, 123.90, 122.50, 111.79, 96.02, 75.65, 50.03, 36.48, 34.07, 33.89, 33.68, 32.44, 32.26, 31.71, 31.48, 30.43, 29.60, 26.10, 25.77, 22.64, 14.54。
合成の実施例２：化合物ＩＩＩａの合成
１，２：４，５－ジ－Ｏ－イソプロピリデン－ミオイノシトール（1,2:4,5-Di-O-isopropylidene-myo-inositol）（２５０ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ、１当量）及びイミダゾール（９８ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ、１．５当量）が脱水ピリジン（３ｍｌ）に溶解されて、－1０℃に冷却された。ｔ－ブチルジフェニルシリルクロリド（t-Butyldiphenylsilyl chloride）（２７５μｌ、１．０６ｍｍｏｌ、１．１当量）が、シリンジを介して緩やかに添加された。反応物が室温まで昇温され、ＴＬＣ（５０：５０ ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）を介してモニタリングされた。完了したら、反応混合物がＥｔＯＡｃで希釈され、飽和ＮＨ４Ｃｌで洗浄された。有機層が分離され、Ｎａ２ＳＯ４で脱水されて濾過され、溶媒が減圧下で蒸発された。粗生成物がシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（５０：５０ ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）により精製されて、化合物１ａ（３５０ｍｇ、７３％収率）を白色泡状物として生成した。Ｃ２８Ｈ３８Ｏ６ＳｉのＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ計算値:４９８．
２４；観測値：４９９．４［Ｍ＋Ｈ］＋。
２４；観測値：４９９．４［Ｍ＋Ｈ］＋。
ルエンスルホン酸ピリジニウム（pyridinium p-toluene sulfonic acid）（３９ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ、０．４５当量）が添加された。反応物がＴＬＣ（２０：８０ ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）を介してモニタリングされ、完了したら、反応物がＥｔ２Ｏで希釈された。この有機層が５％ＮａＨＣＯ３で洗浄され、その後、ブラインで洗浄された。有機層が分離され、Ｎａ２ＳＯ４で脱水されて濾過され、溶媒が減圧下で蒸発された。粗生成物が、シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（１５：８５ ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）により精製されて、化合物１ｂ（１５０ｍｇ、７７％収率）を透明油状物として生成した。
：Ｈｅｘ）により精製されて、化合物１ｄ（３７ｍｇ、６０％収率）を白色固体として生成した。Ｃ２４Ｈ３５ＣｌＯ１１ＰのＭＳ（ＥＳ+）： ｍ/ｚ計算値:５３０．１９;観測
値：５５３．５［Ｍ+Ｎａ］＋。
がＤＣＭで希釈され、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄された。有機層が分離され、Ｎａ２ＳＯ４で脱水されて濾過され、溶媒が減圧下で蒸発されて、１ｆの化合物を産出し、さらに精製されることなく使用された。Ｃ２５Ｈ３９ＣｌＯ１３ＰＳのＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ計算値：６１０．１８；観測値：６３３．２６［Ｍ＋Ｎａ］＋。化合物１ｆ及び化合物１ｇ（Green, O., Eilon, T., Hananya, N., Gutkin, S., Bauer, CR., Shabat, D., ACS Central Sci., 2017, 4, 349-58に従って調製）（２８８ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、１．３当量）が脱水ＤＭＦに溶解されて、Ｋ２ＣＯ３が添加された（１９７ｍｇ、１．４３ｍｍｏｌ、２．５当量）。反応物が、ＴＬＣ（３０：７０ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（水中に７０－１００％ＡＣＮ、２０分）によりモニタリングされた。完了したら、溶媒が減圧下で除去された。粗生成物が、シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（７５：２５ ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）により精製されて、化合物１ｈ（２３１ｍｇ、２ステップで４５％収率)を白色泡状物として生成した。Ｃ４６Ｈ６０ＣｌＯ１４ＰのＭＳ（ＥＳ＋）
：ｍ／ｚ計算値:９０２．３４；観測値：９２５．６０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１：４に添加され、得られた懸濁液が０℃で撹拌された。２４時間後に、溶媒がエタノールでの蒸発により除去された。粗生成物が分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（１５－７０％ＡＣＮ、炭酸アンモニウム１５ｍＭ緩衝液、２０分）により精製されて、化合物ＩＩＩａ（０．７ｍｇ、６％収率）をオフホワイト色の固体として生成した。Ｃ３５Ｈ４２ＣｌＯ１５ＰのＭＳ（ＥＳ－）：ｍ／ｚ計算値:７６８．１９；観測値：７６７．５［Ｍ－Ｈ］－。
合成の実施例３：化合物ＩＶａの合成
４－ヒドロキシベンジルアルコール（１）（０．０４００ｍｏｌ、４．９７ｍｏｌ）がＤＣＭ（８０ｍＬ）に溶解されて、ＤＭＡＰ（２当量、０．０８００ｍｏｌ、９．７７ｇ）が添加された。別のフラスコで、トリアリルホスファイト（２．２当量、０．０８８０ｍｏｌ、１７．８ｇ、１７．８ｍＬ）がＤＣＭ（８０ｍＬ）に溶解されて、混合物が０℃に冷却され、ヨウ素（２当量、０．０８０ｍｏｌ、２０．３ｇ）が少量ずつ添加され、全てのヨウ素が消失するまで、混合物を０℃で撹拌させて（約（ｃｃａ）２０分）、無色溶液を形成させた。この溶液（ホスホニウム塩を含有する）に、エステル１及びＤＭＡＰの溶液が少量ずつ添加された。得られた混合物が室温で撹拌された。１時間後に、反応混合物（黄色溶液）にブライン（８０ｍＬ）が添加され、分離された有機物が乾燥され（ＭｇＳＯ４）、真空濃縮されて、淡黄色油状物を産出した。この残渣がカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ２：１－１：１－２：１）により精製されて、アルコール２を無色油状物２．０ｇ、１８％として産出した。
ｇ、８４％として生成した； 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ ppm 1.60 - 2.03 (m, 12 H) 2.12 (br s, 1 H) 3.33 (br s, 1 H) 3.37 (s, 3 H) 3.86 (s, 3 H) 4.70 (ddq, J = 8.5, 5.7, 1.3, Hz, 4 H) 5.02 (m, 2 H) 5.28 - 5.47 (m, 4 H) 5.93 - 6.06 (m, 2 H) 6.51 (d, J = 16.2 Hz, 1 H) 7.13 (dd, J = 8.1, 0.5 Hz, 1 H) 7.27 - 7.31 (m, 2 H) 7.49 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) 7.53 (d, J = 8.3 Hz, 2 H) 7.98 (d, J = 16.2 Hz, 1 H)。
1H NMR (300 MHz, D2O) δ ppm 1.53 - 1.95 (m, 13 H) 3.05 (br s, 1 H) 3.25 (br s, 3 H) 4.98 (br s, 2 H) 6.44 (br d, J = 16.0 Hz, 1 H) 7.10 (br d, J = 7.8 Hz, 3 H)
7.37 (br d, J = 8.0 Hz, 2 H) 7.45 - 7.63 (m, 2 H)。
ナトリウム原子（複数可）が水素と交換されて、当業者に公知の手段、例えばイオン交換により「ＯＨ」基を産出してもよい。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 1.40 (br. s., 2 H) 1.52 (d, J = 10.8 Hz, 1 H) 1.62 - 1.89 (m, 7 H) 2.00 (br. s., 2H) 2.40 (d, J = 12.5 Hz, 1 H) 2.96 (br. s., 1 H) 3.18 (s, 3 H) 6.58 (d, J = 16.1 Hz, 1 H) 7.24 (d, J = 7.8 Hz, 2 H) 7.40 (d, J = 8.4 Hz, 2 H) 7.72 (d, J = 8.3 Hz, 1 H) 7.78 (d, J = 15.9 Hz, 1 H) 7.84 (d, J =
8.4 Hz, 1 H)。[コメント：ベンジル基の２Ｈピークは、ＣＤ３ＯＤ中のＨ２Ｏピークに
隠れている]
合成の実施例４：化合物Ｖａの合成
エステル２（０．００６４４ｍｏｌ、２．５１ｇ）がＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解されて、得られた混合物が０℃に冷却された。Ｋ２ＣＯ３（１．２当量、０．００７７３ｍｏｌ、１．０７ｇ）が０℃で添加され、混合物が０℃で撹拌された。１０分後に、ＤＭＦ（１４ｍＬ）中の臭化物１（１．２当量、０．００７７３ｍｏｌ、４．００ｇ）の溶液が添加され、得られた混合物が室温で撹拌された。２０時間後に、混合物にＮＨ４Ｃｌ（２００ｍＬ）の飽和溶液が添加され、得られた混合物がＥｔ２Ｏ（６０ｍＬで３回）で抽出され、ひとまとめにされた有機物がブライン（６０ｍＬ）で洗浄され、乾燥されて（ＭｇＳＯ４）、真空濃縮されて、淡黄色油状物を産出した。この残渣が、カラムクロマトグラフィーにより精製されて、エステル３（５．２ｇ、９８％）を白色固体として産出した。
ィルター（０．４５ｍｍ）に通された。この透明溶液がＭＰＬＣポンプ（Ｌａｂｏｍａｔｉｃ ＭＤ８０／１００）により気液混合セル（Ｐｅｓｃｈｌ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ）に送り出され、酸素（１．０バール）と混合された。その後、この酸素飽和溶液が室温で連続流れの中で、ＬＥＤランプ（６２５ｎｍ、ｎｏｖａＬＩＧＨＴ ＦＬＥＤ １００－６２５、Ｐｅｓｃｈｌ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ）で照射された。混合物が２５０ｍＬの丸底フラスコに回収され、溶液が窒素で連続的にパージされた。得られた反応混合物が２０ｍＬ ＥｔＯＡｃで希釈され、短いシリカパッドで濾過されて、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（１２０ｍＬ、９：１）で洗浄された。濾液が遮光の下、室温で濃縮され、得られた固体残渣がＥｔ２Ｏで研和された。生成化合物Ｖａがオフホワイト色の固体（３２ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ、６１％）として単離された。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δppm 1.29 - 1.39 (m, 3 H), 1.46 (d, J = 13.1 Hz, 1 H), 1.57 - 2.1 (m, 12 H), 2.32 (d, J = 13.1 Hz, 1 H), 3.02 (br. s, 1 H), 3.21 (s, 3 H), 3.68 (br. s, 1 H), 3.72 - 3.80 (m, 4 H), 3.83 - 4.07 (m, 3 H), 4.13 (br. s, 1 H), 4.80 - 4.91 (m, 2 H), 4.93 (d, J = 7.5 Hz, 1 H) , 6.36 (dd, J = 16.2, 5.2 Hz, 1 H), 7.02 (d, J = 8.7, 2 H), 7.32 (d, J = 6.4 Hz, 2 H), 7.52 (dd, J = 7.9, 3.4 Hz, 1 H), 7.74 (dd, J = 16.1, 5.4 Hz, 1 H), 7.89 (d, J = 8.5 Hz, 1 H)。
合成の実施例５：化合物ＶＩａの合成
ＤＣＭ（４０ｍＬ）中のフェノール１（０．００１００ｍｏｌ、３．５４ｇ）の溶液が０℃に冷却され、Ｔｆ２Ｏ（１．２当量、０．００１２ｍｏｌ、３．４ｇ、２．０ｍＬ）がアルゴン下で添加され、次にＥｔ３Ｎ（２．５当量、０．００２５ｍｏｌ、２．５ｇ、３．５ｍＬ）が滴加された。得られた混合物が０℃で撹拌された。３０分後に、反応混合物にブライン（５０ｍＬ）が添加され、分離された水層がＤＣＭ（６０ｍＬ）で抽出され、ひとまとめにされた有機物が乾燥され（ＭｇＳＯ４）、真空濃縮されて、褐色油状物を産出した。混合物がカラムクロマトグラフィー(ヘキサン－ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ９：
１）により精製されて、トリフラート２（５．０５ｇ、９７％）を無色油状物として生成した。
１）により精製されて、トリフラート２（５．０５ｇ、９７％）を無色油状物として生成した。
製されて、ボロン酸（boronate）３（３．８３ｇ、８３％）をオフホワイト色の固体として生成した。
合成の実施例６：化合物ＶＩＩａの合成
（Ｒ）－４－ニトロベンジル４－（（２Ｒ，３Ｓ）－３－（（Ｒ）－１－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）エチル）－４－オキソアゼチジン－２－イル）－２－ジアゾ－３－オキソペンタノエート（３）
アルゴン雰囲気下で、無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の市販のメロペネム中間体２（２．６ｇ、６．８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＤＭＳＣｌ（４．０ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）及びイ
ミダゾール（２．８ｇ、４０．８ｍｍｏｌ）が添加された。得られた混合物が室温で５時間撹拌された。酢酸エチル（５０ｍＬ）での希釈の後、溶液が水（２０ｍＬ×３回）及びブライン（２０ｍＬ×１回）で逐次、洗浄された。有機層がＮａ２ＳＯ４で脱水され、濃縮された。残渣がシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製されて、表題化合物３を白色固体（３．３ｇ、９８％）として生成した。Ｃ２３Ｈ３２Ｎ４ＮａＯ７Ｓｉ［Ｍ＋Ｎａ］＋のＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ計算値５２７．２、観測値５２７．４。
アルゴン雰囲気下で、無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の市販のメロペネム中間体２（２．６ｇ、６．８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＤＭＳＣｌ（４．０ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）及びイ
ミダゾール（２．８ｇ、４０．８ｍｍｏｌ）が添加された。得られた混合物が室温で５時間撹拌された。酢酸エチル（５０ｍＬ）での希釈の後、溶液が水（２０ｍＬ×３回）及びブライン（２０ｍＬ×１回）で逐次、洗浄された。有機層がＮａ２ＳＯ４で脱水され、濃縮された。残渣がシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製されて、表題化合物３を白色固体（３．３ｇ、９８％）として生成した。Ｃ２３Ｈ３２Ｎ４ＮａＯ７Ｓｉ［Ｍ＋Ｎａ］＋のＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ計算値５２７．２、観測値５２７．４。
カルボキシレート（４）
アルゴン下の丸底フラスコに、ＺｎＣｌ２（無水、２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、化合物３（２．４ｇ、４．８ｍｍｏｌ）、Ｒｈ２（ＯＡｃ）４（２１．５ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及びＣＨ２Ｃｌ２（無水、１５ｍＬ）を添加し、その後、化合物３の消失まで（ＴＬＣによりモニタリング）９０分間、加熱還流された。得られた混合物が－５０℃に冷却され、トリエチルアミン（２３５μＬ、１．７ｍｍｏｌ）とジイソプロピルアミン（６８０μＬ、４．８ｍｍｏｌ）の混合物が滴加され、次にＴｆ２Ｏ（８５０μＬ、５．０ｍｍｏｌ）が緩やかに添加された。その懸濁液が－５０℃で６０分間撹拌され、ジクロロメタンを溶離液として用いた短いシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーにより精製されて、所望の化合物４を白色固体として生成した（２．５ｇ、８５％）。Ｃ２４Ｈ３２Ｆ３Ｎ２Ｏ９ＳＳｉ［Ｍ＋Ｎａ］＋のＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ計算値６０９．１、観測値６０９．４。
エノールエーテル５ （Green, O., Eilon, T., Hananya, N., Gutkin, S., Bauer, CR., Shabat, D., ACS Central Sci., 2017, 4, 349-58に従って調製）（５００ｍｇ、１．
３ｍｍｏｌ）が３ｍＬ脱水ＤＭＦに溶解されて、０℃に冷却された。Ｋ２ＣＯ３（１９５ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）が添加され、その溶液が０℃で１０分間撹拌された後、化合物６（Karton-Lifshin N.,Albertazzi L.,Bendikov M.,Baran PS.,Shabat D.,J Am Chem Soc., 2012, 134(50), 20412-20参照)（５３６．６ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）が添加された。反応混合物が室温で３０分間撹拌され、ＴＬＣによりモニタリングされた。完了後に、反応混合物がＥｔＯＡｃ（３０ｍｌ）で希釈され、飽和ＮＨ４Ｃｌ（１０ｍｌ）で洗浄された。有機層が分離され、ブラインで洗浄されて、Ｎａ２ＳＯ４で脱水され、減圧下で蒸発された。粗生成物がシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製されて、表題化合物７を白色固体（６６１ｍｇ、８１％）として生成した。Ｃ３５Ｈ４２ＢＣｌＮａＯ６［Ｍ＋Ｎａ］＋のＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ計算値６２７．２、観測値６２７．５。
ルボキシレート（８）
ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）とＤＭＦ（１．１ｍＬ）の混合物中のピナコールボロン酸７（３０４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）及びビニルトリフラート４（３０４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ（ｄｂａ）２（１４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及び３Ｍ 水性Ｋ２ＣＯ３（０．５ｍＬ,、１．５ｍｍｏｌ）を添加された。混合物は３７℃で２．５時間撹
拌され、ＴＬＣによりモニタリングされた。完了後に、反応混合物がＥｔＯＡｃ（２０ｍｌ）で希釈され、飽和ＮＨ４Ｃｌ（１０ｍｌ）で洗浄された。有機層が分離され、ブラインで洗浄され、Ｎａ２ＳＯ４で脱水されて、減圧下で蒸発された。粗生成物がシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製されて、表題化合物８（３５８ｍｇ、７６％）を生成した。Ｃ５２Ｈ６２ＣｌＮ２Ｏ１０Ｓｉ［Ｍ＋Ｎａ］＋のＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ計算値９３７．４、観測値９３７．８。
室温でＮ－メチルピロリジノン／ＤＭＦ（１：３、０．７ｍＬ）中の８（３５０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）の溶液にフッ化水素アンモニウム（１５０ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）が添加されて、得られた反応混合物が室温で７２時間撹拌された（ＴＬＣによりモニタリング）。その後、反応物が酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈され、水及びブラインで洗浄された。Ｎａ２ＳＯ４で脱水され、減圧濃縮された後、残渣がシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製されて、表題化合物９（２９０．６ｍｇ、７３％）を生成した。Ｃ４６Ｈ４８ＣｌＮ２Ｏ１０［Ｍ＋Ｎａ］＋のＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ計算値８２３．４、観測値８２３．６。
０］ヘプタ－２－エン－２－カルボン酸（１０）
２０℃で、ＤＭＥ ０．５ｍＬ中の化合物７（２０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、０．２ｍＬリン酸緩衝液（０．３５Ｍ、ｐＨ６．０）及び活性化亜鉛粉末が添加された。その後、反応混合物が同じ温度で１時間撹拌された。沈殿物が０．２２μＭ ＰＴＦＥシリンジフィルターで除去され、濾液がＣＨ３ＣＮ－Ｈ２Ｏ（３０ｍｍｏｌ ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝水、ＣＨ３ＣＮは３０％緩衝水を含有）を移動相とする分取ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて精製された。Ｃ３９Ｈ４２ＣｌＮＮａＯ８［Ｍ＋Ｎａ］＋のＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ計算値７１０．２、観測値７１０．５。
オキソプロパ－１－エン－１－イル）－３－（（１ｒ，３ｒ，５Ｓ，７Ｓ）－４’－メトキシスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２］ジオキセタン］－４’－イル］フェノキシ）メチル）フェニル）－６－（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－４－メチル－７－オキソ－１－アザビシクロ［３.２．０］ヘプタ－２－エン－２－カルボン酸（１）
エノールエーテル１０及び数ミリグラムのメチレンブルーが、１５ｍｌＤＣＭに溶解された。黄色光で２０分間照射されながら、酸素がその溶液にバブリングされた。反応物は、ＲＰ－ＨＰＬＣによりモニタリングされた。完了後に、反応混合物が減圧下で蒸発されて濃縮された。粗生成物がＣＨ３ＣＮ－Ｈ２Ｏ（３０ｍｍｏｌ ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝水、ＣＨ３ＣＮは３０％緩衝水を含有）を移動相とする分取ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製され、化合物ＶＩＩａを白色固体（３ｍｇ、３０％）として生成した。Ｃ３９Ｈ４２ＣｌＮＮａＯ１０［Ｍ＋Ｎａ］＋のＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ計算値７４２．２、観測値７４２．５。
合成の実施例７：Ｄ－ルシフェリン－スペーサー－カプリレートの合成
５００ｍｌ三つ口フラスコに１０ｇ ｐ－クレゾール（９２．５ｍｍｏｌ／１当量）が充填され、次に脱水ＤＣＭ（２００ｍＬ）が充填された。混合物が氷水の冷却バスで冷却された。この溶液に、ピリジン（１０．２４ｇ／１２．９ｍｍｏｌ／１．４当量）が添加された。反応混合物の温度を１２℃未満に保持しながら、塩化カプリロイル（１８ｇ／１１０．７ｍｍｏｌ／１．２当量）（脱水ＤＣＭ ５０ｍｌに溶解）が滴下漏斗から滴加された。１５分後に、冷却バスが除去され、混合物が周囲温度で撹拌された。反応が５０分後に完了された（ＴＬＣによるコントロール（石油エーテル（petrolether）／ＡｃＯＥｔ
＝２／１））。反応混合物が２００ｍＬ水により洗浄され、次に０．２Ｍ ＮａＯＨ溶液の２００ｍＬで２回洗浄された。有機層がＮａ２ＳＯ４で脱水され、濾過されてロータリーエバポレータにより濃縮された。残渣（およそ２３ｇ)が、シリカゲルの短いプラグ（
ｈ＝４５ｍｍ、ｄ＝１００ｍｍ）を用いてＤＣＭでの溶出により精製された。無色で果実香の油状（２０．９ｇ／９６％収率）の形態の生成物が、さらに精製されることなく次の合成ステップで用いられた。
＝２／１））。反応混合物が２００ｍＬ水により洗浄され、次に０．２Ｍ ＮａＯＨ溶液の２００ｍＬで２回洗浄された。有機層がＮａ２ＳＯ４で脱水され、濾過されてロータリーエバポレータにより濃縮された。残渣（およそ２３ｇ)が、シリカゲルの短いプラグ（
ｈ＝４５ｍｍ、ｄ＝１００ｍｍ）を用いてＤＣＭでの溶出により精製された。無色で果実香の油状（２０．９ｇ／９６％収率）の形態の生成物が、さらに精製されることなく次の合成ステップで用いられた。
プリレート（２０．９ｇ／９２．５ｍｍｏｌ／１当量）が添加され、次にＮＢＳ（１９．８４ｇ／１１１．５ｍｍｏｌ／１．２５当量）が添加された。懸濁液がオイルバス（１００℃）内で１５分間撹拌された。オイルバスが除去されて、ＡＩＢＮ（９１５ｍｇ／５．６ｍｍｏｌ／５ｍｏｌ％）が一度に添加された。集中的な還流（intensive reflux）により反応が開始し、およそ２分後に、還流がかなり穏やかになったら、混合物が再度、高温の加熱バスに浸漬された。２０分後のＴＬＣ（石油エーテル／ＡｃＯＥｔ＝１０／１）は、完全な変換を示した。反応混合物が、冷却水で１５℃に冷却された。この温度で、混合物がＳ３フリット（S3 fritt）で濾過され、ＤＣＭ １０ｍＬで洗浄され、濾液が真空濃縮された。未加工の生成物（２７．７ｇ／９９％収率）が、精製されることなく次の合成ステップで用いられた。
本明細書に開示される他の化合物は、出発原料のそれぞれの選択により上記に説明された手順に従って合成された。
合成の実施例８：実施例１３で用いられた化合物Ａ及びＣの合成
一般的合成スキーム
一般的合成スキーム
無水ＴＨＦに溶解された。反応混合物が８０℃で２時間撹拌され、モニタリングされ、完了したら溶媒が減圧下で蒸発された。粗生成物がシリカゲルカラム（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ
６５：３５）に通されて、１．７３ｇ（８３％収率）の白色固体が得られ、さらに精製されることなく次のステップに持ち込まれた。
７０：３０）に通されて、１．８４ｇ（８９％収率）の白色固体が得られ、さらに精製されることなく次のステップに持ち込まれた。
り、９００ｍｇ（４７％収率）の白色固体を生成した。
ＤＣＭに溶解された。その後、黄色光を照射されながら、酸素が溶液にバブリングされた。反応物がＲＰ－ＨＰＬＣによりモニタリングされた。完了したら（１０分）、溶媒が減圧濃縮され、生成物が分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（水中のＡＣＮの勾配、０．１％ ＴＦＡ）により精製された。生成物が、白色固体（３６ｍｇ、６７％）として得られた。
実施例１：
化合物ＩＩａを用いたブタ肝臓エステラーゼ活性の酵素アッセイ
化合物ＩＩａが、１０％ｖ／ｖジメチルスルホキシドを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に最終濃度６２．５μＭになるように添加された。アッセイ混合物が室温で２０分間プレインキュベートされ、その後、種々の酵素濃度を含有する１：５ｖ／ｖのブタ肝臓エステラーゼ溶液が添加され、発光モードのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５リーダーにより発光が室温で２０分間記録された。アッセイは、総液容量０．２５ｍＬで黒色マイクロタイタープレート内で実施された。２０分の測定期間内のブタ肝臓エステラーゼ濃度及び最大ＲＬＵ（相対光単位）値が、２桁を超える正の直線的相関を呈した。図１は、この実施例の結果を示す。
化合物ＩＩａを用いたブタ肝臓エステラーゼ活性の酵素アッセイ
化合物ＩＩａが、１０％ｖ／ｖジメチルスルホキシドを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に最終濃度６２．５μＭになるように添加された。アッセイ混合物が室温で２０分間プレインキュベートされ、その後、種々の酵素濃度を含有する１：５ｖ／ｖのブタ肝臓エステラーゼ溶液が添加され、発光モードのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５リーダーにより発光が室温で２０分間記録された。アッセイは、総液容量０．２５ｍＬで黒色マイクロタイタープレート内で実施された。２０分の測定期間内のブタ肝臓エステラーゼ濃度及び最大ＲＬＵ（相対光単位）値が、２桁を超える正の直線的相関を呈した。図１は、この実施例の結果を示す。
実施例２：
化合物ＩＩａを用いたサルモネラ・エンテリカの検出
シトロバクター・フロインディＡＴＣＣ８０９０（Ｃ．ｆ．、Ｃ８Ｅ陰性）大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２（Ｅ.ｃ.、Ｃ８Ｅ陰性）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｄ）ＡＴＣＣ１４０２８（Ｓ.Ｔ.、サルモネラ・エンテリカｓｓｐ. Ｉ ｓｅｒ．ティフィムリウム
、Ｃ８Ｅ陽性）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｄ）ＡＴＣＣ１３０７６（Ｓ.Ｅ.１、サルモネラ・エンテリカｓｓｐ.エンテリカｓｅｒ.エンテリティディス、Ｃ８Ｅ陽性）及びサルモネラ・エンテリティディスＲＫＩ ０５／０７９９２（Ｓ.Ｅ.２、サルモネラ・エンテリカｓｓｐ. エンテリカｓｅｒ.エンテリティディス、Ｃ８Ｅ陽性）が、栄養ブロス(５ｇ／ｌ ペプトン、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／ｌ 牛
肉エキス、ｐＨ７．４）中で１７時間培養され、その後、滅菌生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）で段階希釈された。同様の細胞濃度の全菌株が、栄養ブロスと共に三連試験管に接種された。加えて、滅菌生理食塩水中のＳ.Ｅ.２細胞のさらなる希釈物が、三連試験管に接種された。滅菌生理食塩水が、陰性対照試験管に添加された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの養成の６時間後に、試料が培養液（０．２０５ｍＬ）から取り出され、白色マイクロタイタープレート内のジメチルスルホキシド中の化合物ＩＩａ溶液４５μＬと混合された。化合物ＩＩａの最終濃度は１０μＭであり、ジメチルスルホキシドの最終濃度は１５％ｖ／ｖであった。光放出が、発光検出システムを具備されたプレートリーダーで記録された。化学発光基質の添加後２７～３０分の期間の平均ＲＬＵ（相対的光単位）値が、比
較された（表３）。同様の接種密度１０５ＣＦＵ／ｍＬでは、検査されたサルモネラ菌株は、シトロバクター・フロインディの３５～６０倍の光放出及び大腸菌の６５～１１１倍の光放出を示した。滅菌対照に比較したシグナルノイズ比２に示される通り、インキュベーションの６時間後に、１０ＣＦＵ／ｍＬのサルモネラ・エンテリティディスを検出することが可能であった。
化合物ＩＩａを用いたサルモネラ・エンテリカの検出
シトロバクター・フロインディＡＴＣＣ８０９０（Ｃ．ｆ．、Ｃ８Ｅ陰性）大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２（Ｅ.ｃ.、Ｃ８Ｅ陰性）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｄ）ＡＴＣＣ１４０２８（Ｓ.Ｔ.、サルモネラ・エンテリカｓｓｐ. Ｉ ｓｅｒ．ティフィムリウム
、Ｃ８Ｅ陽性）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｄ）ＡＴＣＣ１３０７６（Ｓ.Ｅ.１、サルモネラ・エンテリカｓｓｐ.エンテリカｓｅｒ.エンテリティディス、Ｃ８Ｅ陽性）及びサルモネラ・エンテリティディスＲＫＩ ０５／０７９９２（Ｓ.Ｅ.２、サルモネラ・エンテリカｓｓｐ. エンテリカｓｅｒ.エンテリティディス、Ｃ８Ｅ陽性）が、栄養ブロス(５ｇ／ｌ ペプトン、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／ｌ 牛
肉エキス、ｐＨ７．４）中で１７時間培養され、その後、滅菌生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）で段階希釈された。同様の細胞濃度の全菌株が、栄養ブロスと共に三連試験管に接種された。加えて、滅菌生理食塩水中のＳ.Ｅ.２細胞のさらなる希釈物が、三連試験管に接種された。滅菌生理食塩水が、陰性対照試験管に添加された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの養成の６時間後に、試料が培養液（０．２０５ｍＬ）から取り出され、白色マイクロタイタープレート内のジメチルスルホキシド中の化合物ＩＩａ溶液４５μＬと混合された。化合物ＩＩａの最終濃度は１０μＭであり、ジメチルスルホキシドの最終濃度は１５％ｖ／ｖであった。光放出が、発光検出システムを具備されたプレートリーダーで記録された。化学発光基質の添加後２７～３０分の期間の平均ＲＬＵ（相対的光単位）値が、比
較された（表３）。同様の接種密度１０５ＣＦＵ／ｍＬでは、検査されたサルモネラ菌株は、シトロバクター・フロインディの３５～６０倍の光放出及び大腸菌の６５～１１１倍の光放出を示した。滅菌対照に比較したシグナルノイズ比２に示される通り、インキュベーションの６時間後に、１０ＣＦＵ／ｍＬのサルモネラ・エンテリティディスを検出することが可能であった。
実施例３：
化合物ＩＩＩａを用いたＰＩ－ＰＬＣ活性の酵素アッセイ
化合物ＩＩＩａが、１％ｖ／ｖ ジメチルスルホキシドを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に、最終濃度１０μＭになるように添加された。種々の濃度のホスファチジルイノシトール特異的なホスホリパーゼＣ（ＰＩ－ＰＬＣ）が添加され、発光が室温で記録された（表４）。アッセイは、白色マイクロタイタープレート内で総液体容量０．２５ｍＬで実施された。２０分の測定期間内のＰＩ－ＰＬＣの濃度及び最大ＲＬＵ（相対的光単位）値は、２桁を超える正の相関を呈した。
化合物ＩＩＩａを用いたＰＩ－ＰＬＣ活性の酵素アッセイ
化合物ＩＩＩａが、１％ｖ／ｖ ジメチルスルホキシドを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に、最終濃度１０μＭになるように添加された。種々の濃度のホスファチジルイノシトール特異的なホスホリパーゼＣ（ＰＩ－ＰＬＣ）が添加され、発光が室温で記録された（表４）。アッセイは、白色マイクロタイタープレート内で総液体容量０．２５ｍＬで実施された。２０分の測定期間内のＰＩ－ＰＬＣの濃度及び最大ＲＬＵ（相対的光単位）値は、２桁を超える正の相関を呈した。
実施例４：
化合物ＩＩＩａを用いたリステリア・モノサイトゲネスの検出
リステリア・モノサイトゲネスＡＴＣＣ７６４４(Ｌ.ｍ.１、ＰＩ－ＰＬＣ陽性）、リ
ステリア・モノサイトゲネス（４ｂ)ＡＴＣＣ１９１１５(Ｌ.ｍ.２、ＰＩ－ＰＬＣ陽性)
、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）(６ａ） ＡＴＣＣ３３０９０(Ｌ.ｉ.、ＰＩ－ＰＬＣ陰性）及び大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２(Ｅ.ｃ.、ＰＩ－ＰＬＣ陰性）が、Ｍ
５２ブロス（１．３５ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、９．６ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム、１．１１ｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム、６ｇ／Ｌ 酵母エキス、１７ｇ／Ｌ トリプトン、３ｇ／Ｌ ｐｈｙｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、２．５ｇ／Ｌ グルコース、ｐＨ７．３)中で１９時間培養され、その後、滅菌生理食塩水（０．９％ Ｎ
ａＣｌ）で段階希釈された。同様の細胞濃度の全菌種が、Ｍ５２ブロスと共に三連試験管に接種された。加えて、滅菌生理塩水中のＬ．ｍ．２細胞のさらなる希釈物が、三連試験管に接種された。滅菌生理食塩水が、陰性対照の試験管に添加された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの培養の６時間後に、試料が培養液から取り出され（０．９９ｍＬ）、白色マイクロタイタープレート内でジメチルスルホキシド中の化合物ＩＩＩａ溶液１μＬと混合された。化合物ＩＩＩａの最終濃度は１０μＭであり、ジメチルスルホキシドの最終濃度は１％ｖ／ｖであった。光放出が、発光検出システムを具備されたプレートリーダーで記録された。化学発光基質の添加後１６～２０分の平均ＲＬＵ（相対的光単位）値が、比較された（表５）。同様の接種密度１０５ＣＦＵ／ｍＬで、検査されたリステリア・モノサイトゲネス菌株がリステリア・イノキュアの３１１～３６１倍の光放出を示し、大腸菌の１４６５～１７０２倍の光放出を示した。滅菌対照に比較したシグナルノイズ比２に示される通り、インキュベーションの６時間後に、１０３ＣＦＵ／ｍＬのリステリア・モノサイトゲネスを検出することが可能であった。
化合物ＩＩＩａを用いたリステリア・モノサイトゲネスの検出
リステリア・モノサイトゲネスＡＴＣＣ７６４４(Ｌ.ｍ.１、ＰＩ－ＰＬＣ陽性）、リ
ステリア・モノサイトゲネス（４ｂ)ＡＴＣＣ１９１１５(Ｌ.ｍ.２、ＰＩ－ＰＬＣ陽性)
、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）(６ａ） ＡＴＣＣ３３０９０(Ｌ.ｉ.、ＰＩ－ＰＬＣ陰性）及び大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２(Ｅ.ｃ.、ＰＩ－ＰＬＣ陰性）が、Ｍ
５２ブロス（１．３５ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、９．６ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム、１．１１ｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム、６ｇ／Ｌ 酵母エキス、１７ｇ／Ｌ トリプトン、３ｇ／Ｌ ｐｈｙｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、２．５ｇ／Ｌ グルコース、ｐＨ７．３)中で１９時間培養され、その後、滅菌生理食塩水（０．９％ Ｎ
ａＣｌ）で段階希釈された。同様の細胞濃度の全菌種が、Ｍ５２ブロスと共に三連試験管に接種された。加えて、滅菌生理塩水中のＬ．ｍ．２細胞のさらなる希釈物が、三連試験管に接種された。滅菌生理食塩水が、陰性対照の試験管に添加された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの培養の６時間後に、試料が培養液から取り出され（０．９９ｍＬ）、白色マイクロタイタープレート内でジメチルスルホキシド中の化合物ＩＩＩａ溶液１μＬと混合された。化合物ＩＩＩａの最終濃度は１０μＭであり、ジメチルスルホキシドの最終濃度は１％ｖ／ｖであった。光放出が、発光検出システムを具備されたプレートリーダーで記録された。化学発光基質の添加後１６～２０分の平均ＲＬＵ（相対的光単位）値が、比較された（表５）。同様の接種密度１０５ＣＦＵ／ｍＬで、検査されたリステリア・モノサイトゲネス菌株がリステリア・イノキュアの３１１～３６１倍の光放出を示し、大腸菌の１４６５～１７０２倍の光放出を示した。滅菌対照に比較したシグナルノイズ比２に示される通り、インキュベーションの６時間後に、１０３ＣＦＵ／ｍＬのリステリア・モノサイトゲネスを検出することが可能であった。
実施例５：
化合物ＩＩａとカプリル酸４－メチルウンベリフェリルを用いたサルモネラ・エンテリカ検出の比較（図２）
サルモネラ・エンテリティディスＲＫＩ０５／０７９９２が、栄養ブロス(５ｇ／ｌ
ペプトン、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／ｌ 牛肉エキス、ｐＨ７．４）中で２０時間（３７℃、１５０ｒｐｍ）培養され、その後、リン酸緩衝生理食塩水で段階希釈された。細胞懸濁液が、ジメチルスルホキシド（アッセイでの最終濃度１５％）及び化合物ＩＩａ（最終濃度１０μＭ）又はカプリル酸４－メチルウンベリフェリル（ＭＵＣＡＰ、最終濃度０．１ｍＭ）のいずれかを含有するリン酸緩衝生理食塩水と１：１ｖ／ｖで混合された。アッセイはマイクロプレートで実施され、総液体容量は０．２ｍＬであった。光放出及び蛍光（励起３６０ｎｍ、発光４５５ｎｍ）は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国カリフォルニア州サニーベール）
プレートリーダーで記録された。未希釈の培養液の細胞濃度は、光学密度（６００ｎｍ）から推定された。結論：サルモネラ・エンテリカの検出限界は、ＭＵＣＡＰの代わりに化合物ＩＩａを用いた場合には、６２５分の１となった。
図２は、発光原性化合物ＩＩａ（白い記号）又は蛍光基質ＭＵＣＡＰ（黒い記号）のい
ずれかを用いたサルモネラ・エンテリカの検出限界を示す。
化合物ＩＩａとカプリル酸４－メチルウンベリフェリルを用いたサルモネラ・エンテリカ検出の比較（図２）
サルモネラ・エンテリティディスＲＫＩ０５／０７９９２が、栄養ブロス(５ｇ／ｌ
ペプトン、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／ｌ 牛肉エキス、ｐＨ７．４）中で２０時間（３７℃、１５０ｒｐｍ）培養され、その後、リン酸緩衝生理食塩水で段階希釈された。細胞懸濁液が、ジメチルスルホキシド（アッセイでの最終濃度１５％）及び化合物ＩＩａ（最終濃度１０μＭ）又はカプリル酸４－メチルウンベリフェリル（ＭＵＣＡＰ、最終濃度０．１ｍＭ）のいずれかを含有するリン酸緩衝生理食塩水と１：１ｖ／ｖで混合された。アッセイはマイクロプレートで実施され、総液体容量は０．２ｍＬであった。光放出及び蛍光（励起３６０ｎｍ、発光４５５ｎｍ）は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国カリフォルニア州サニーベール）
プレートリーダーで記録された。未希釈の培養液の細胞濃度は、光学密度（６００ｎｍ）から推定された。結論：サルモネラ・エンテリカの検出限界は、ＭＵＣＡＰの代わりに化合物ＩＩａを用いた場合には、６２５分の１となった。
図２は、発光原性化合物ＩＩａ（白い記号）又は蛍光基質ＭＵＣＡＰ（黒い記号）のい
ずれかを用いたサルモネラ・エンテリカの検出限界を示す。
実施例６：
化合物ＩＶａを用いたスタフィロコッカス・アウレウスの検出
スタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ２９２１３(Ｓ.ａ.、ホスファターゼ陽性）
及びスタフィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyticus）ＲＫＩ０６－
０１３５４（Ｓ.ｈ.、弱いホスファターゼ活性）が、栄養ブロス(５ｇ／ｌ ペプトン、
５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／ｌ 牛肉エキス、ｐＨ７．４）中で１７時間培養され、その後、滅菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で段階希釈された。同様の細胞濃度のＳ．ａ．及びＳ．ｈ．が、栄養ブロスと共に三連試験管に接種された。加えて、滅菌生理食塩水中のＳ．ａ．細胞のさらなる４種の希釈系列が、三連試験管に接種された。滅菌生理食塩水が、陰性対照の試験管に添加された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの培養の６時間後に、試料が培養液から取り出され（０．１９６ｍＬ）、白色マイクロタイタープレート内でジメチルスルホキシド中の化合物ＩＶａ溶液４μＬと混合された。化合物ＩＶａの最終濃度は１０μＭであり、ジメチルスルホキシドの最終濃度は２％ｖ／ｖであった。光放出が、発光検出システムが具備されたプレートリーダーで記録された。化学発光基質の添加後１５～２０分の期間の平均ＲＬＵ（相対的光単位）値が、比較された（表６）。結論：スタフィロコッカス・アウレウスは、化合物ＩＶａを用いて高感度で検出され得る。
化合物ＩＶａを用いたスタフィロコッカス・アウレウスの検出
スタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ２９２１３(Ｓ.ａ.、ホスファターゼ陽性）
及びスタフィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyticus）ＲＫＩ０６－
０１３５４（Ｓ.ｈ.、弱いホスファターゼ活性）が、栄養ブロス(５ｇ／ｌ ペプトン、
５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／ｌ 牛肉エキス、ｐＨ７．４）中で１７時間培養され、その後、滅菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で段階希釈された。同様の細胞濃度のＳ．ａ．及びＳ．ｈ．が、栄養ブロスと共に三連試験管に接種された。加えて、滅菌生理食塩水中のＳ．ａ．細胞のさらなる４種の希釈系列が、三連試験管に接種された。滅菌生理食塩水が、陰性対照の試験管に添加された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの培養の６時間後に、試料が培養液から取り出され（０．１９６ｍＬ）、白色マイクロタイタープレート内でジメチルスルホキシド中の化合物ＩＶａ溶液４μＬと混合された。化合物ＩＶａの最終濃度は１０μＭであり、ジメチルスルホキシドの最終濃度は２％ｖ／ｖであった。光放出が、発光検出システムが具備されたプレートリーダーで記録された。化学発光基質の添加後１５～２０分の期間の平均ＲＬＵ（相対的光単位）値が、比較された（表６）。結論：スタフィロコッカス・アウレウスは、化合物ＩＶａを用いて高感度で検出され得る。
実施例７：
化合物ＩＶａを用いた乳の低温殺菌のモニタリング
ＵＨＴ全乳（乳１）及び低温殺菌された全乳（乳２）が、スイスのスーパーマーケットから得られた。子ウシ腸由来のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が、０．５Ｕ／ｍＬの最終濃度で乳試料に添加された。ポリプロピレン試験管中の三重測定の乳試料（アルカリホスファターゼが添加されている）が水浴中、７０℃で２０分間加熱され、同様の参照試料が室温で保存された。白色マイクロタイタープレート内で、２：１ｖ／ｖ検出ミックス（２０μＭ 化合物ＩＶａ、１００ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩
ｐＨ９．７、１ｍＭ 塩化マグネシウム、室温で２０分間、プレインキュベートされている）を添加することにより、加熱及び非加熱の乳試料のアルカリホスファターゼ活性が分析された。発光がＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで記録され、総アッセイ容量は０．３ｍＬであった。低温殺菌された乳試料の平均ＲＬＵ（相対的光単位）値は、室温で保存された試料に比較して８分の１～１０分の１であった（図３：化合物ＩＶａを用いた乳中のアルカリホスファターゼ活性への低温殺菌の効果の化学発光分析。３回の反復実験の平均値及び標準偏差）。非添加の乳中の残留するアルカリホスファターゼ活性
を検出することも可能であり、測定されたＲＬＵ値は、ＵＨＴ乳（乳１）中のアルカリホスファターゼ活性が低温殺菌乳（乳２）のものより低いことを示した。
化合物ＩＶａを用いた乳の低温殺菌のモニタリング
ＵＨＴ全乳（乳１）及び低温殺菌された全乳（乳２）が、スイスのスーパーマーケットから得られた。子ウシ腸由来のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が、０．５Ｕ／ｍＬの最終濃度で乳試料に添加された。ポリプロピレン試験管中の三重測定の乳試料（アルカリホスファターゼが添加されている）が水浴中、７０℃で２０分間加熱され、同様の参照試料が室温で保存された。白色マイクロタイタープレート内で、２：１ｖ／ｖ検出ミックス（２０μＭ 化合物ＩＶａ、１００ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩
ｐＨ９．７、１ｍＭ 塩化マグネシウム、室温で２０分間、プレインキュベートされている）を添加することにより、加熱及び非加熱の乳試料のアルカリホスファターゼ活性が分析された。発光がＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで記録され、総アッセイ容量は０．３ｍＬであった。低温殺菌された乳試料の平均ＲＬＵ（相対的光単位）値は、室温で保存された試料に比較して８分の１～１０分の１であった（図３：化合物ＩＶａを用いた乳中のアルカリホスファターゼ活性への低温殺菌の効果の化学発光分析。３回の反復実験の平均値及び標準偏差）。非添加の乳中の残留するアルカリホスファターゼ活性
を検出することも可能であり、測定されたＲＬＵ値は、ＵＨＴ乳（乳１）中のアルカリホスファターゼ活性が低温殺菌乳（乳２）のものより低いことを示した。
結論：化合物ＩＶａ及び関連する化合物は、乳の低温殺菌及び同様の工程のモニタリングに適する。
実施例８：
化合物ＩＶａを用いたメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）の検出
メチシリン及びオキサシリンなどのペニシリン誘導体への耐性がある菌株メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ３３５９２(ＭＲＳＡ）、及びメチシリン感
受性スタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ２９２１３（ＭＳＳＡ）が、栄養ブロス(
５ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ 肉エキス、ｐＨ７．４）中で、３７℃で一晩培養され、滅菌生理食塩水で希釈された。ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ菌株が、最終濃度１０μＭの化合物ＩＶａを含有する栄養ブロス中でおよそ１０６ＣＦＵ／ｍＬで接種された。各菌株で、１つの培養液はオキサシリン(２０ｍ
ｇ／Ｌ最終濃度）を追加され、１つの培養液は抗生物質を追加されなかった。試験管培養液は、３７℃及び１５０ｒｐｍでインキュベートされた。滅菌対照（１０μＭの化合物ＩＶａを含む栄養ブロス）が、並行してインキュベートされた。培養試料（白色マイクロタイタープレート内の０．２ｍＬ）の発光が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで６時間、規則的な間隔で記録された（図４：オキサシリン抗生物質の存在下及び非存在下でのＭＲＳＡ及びＭＳＳＡの培養における発光生成）。発光強度のタイムコースは、ＭＲＳＡ菌株はオキサシリンの存在下及び非存在下の両方で増殖するが、ＭＳＳＡ菌株は、抗生物質含まない培養のみで発光の増加を呈することを示した。生育培養液と非生育培養液は、インキュベーションの１時間後に識別され得た。
結論：化合物ＩＶａ及び関連する化合物は、短時間（１～２時間）でのメチシリン耐性Ｓ．アウレウス（ＭＲＳＡ）の検出に適する。
化合物ＩＶａを用いたメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）の検出
メチシリン及びオキサシリンなどのペニシリン誘導体への耐性がある菌株メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ３３５９２(ＭＲＳＡ）、及びメチシリン感
受性スタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ２９２１３（ＭＳＳＡ）が、栄養ブロス(
５ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ 肉エキス、ｐＨ７．４）中で、３７℃で一晩培養され、滅菌生理食塩水で希釈された。ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ菌株が、最終濃度１０μＭの化合物ＩＶａを含有する栄養ブロス中でおよそ１０６ＣＦＵ／ｍＬで接種された。各菌株で、１つの培養液はオキサシリン(２０ｍ
ｇ／Ｌ最終濃度）を追加され、１つの培養液は抗生物質を追加されなかった。試験管培養液は、３７℃及び１５０ｒｐｍでインキュベートされた。滅菌対照（１０μＭの化合物ＩＶａを含む栄養ブロス）が、並行してインキュベートされた。培養試料（白色マイクロタイタープレート内の０．２ｍＬ）の発光が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで６時間、規則的な間隔で記録された（図４：オキサシリン抗生物質の存在下及び非存在下でのＭＲＳＡ及びＭＳＳＡの培養における発光生成）。発光強度のタイムコースは、ＭＲＳＡ菌株はオキサシリンの存在下及び非存在下の両方で増殖するが、ＭＳＳＡ菌株は、抗生物質含まない培養のみで発光の増加を呈することを示した。生育培養液と非生育培養液は、インキュベーションの１時間後に識別され得た。
結論：化合物ＩＶａ及び関連する化合物は、短時間（１～２時間）でのメチシリン耐性Ｓ．アウレウス（ＭＲＳＡ）の検出に適する。
実施例９：
化合物Ｖａを用いた大腸菌の検出及びＤ－ルシフェリン－６－Ｏ－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシドとの比較
大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２(Ｅ.ｃ.、ベータ－ガラクトシダーゼ陽性）及びサルモネラ
・エンテリティディスＲＫＩ０５／０７９９２（Ｓ．Ｅ．、ベータ－ガラクトシダーゼ陰性）が、栄養ブロス中で１７時間培養され、その後、滅菌生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）で段階希釈された。希釈された細胞懸濁液が、完全（full-strength）ＬＢ培地（１
０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）又は超純水で１：２０ｖ／ｖに希釈されたＬＢ培地（ＬＢ １：２０）のいずれかと共に試験管に１：１００ｖ／ｖで接種された。全ての培地が、ベータ－ガラクトシダーゼの誘導のために１ｍＭ
ＩＰＴＧを含有した。滅菌生理食塩水が、陰性対照の試験管に添加された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの培養の６時間後に、試料（０．２５５ｍＬ）が、培養液から取り出され、白色マイクロタイタープレート内でエタノール中の化合物Ｖａの原液４５μＬと混合された。化合物Ｖａの最終濃度は２０μＭであり、エタノールの最終濃度は１５％ｖ／ｖであった。光放出が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで記録された。化学発光基質の添加後９～１０分の期間の平均ＲＬＵ（相対光単位）値が、比較された（表ＶＩａ）。比較のために、同一の大腸菌菌株が予め培養され、同様の方法で希釈され、その後、希釈されたミュラー・ヒントンブロス（ＭＨ１：２０、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２で１：２０ｖ／ｖに希釈された完全培地）に接種された。培地は、１ｍＭ ＩＰＴＧが補充された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの養成の６時間後に、培養試料（４５μＬ）がマイクロタイタープレートに移され、２％ｗ／ｖ ドデシル－トリメチルアンモニウムブロミド、１ｍＭ Ｄ－ルシフェリン－６－Ｏ－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシド（市販品、
Ｂｉｏｓｙｎｔｈ Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｌ－８６００）及び１０ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する１０倍溶解試薬 ５μＬと混合された。溶解、及びＤ－ルシフェリン－６－Ｏ－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシドとの反応は、３７℃で１時間行われた。その後、０．２ｍＬのルシフェラーゼアッセイミックスが添加された（５：１ ｖ／ｖ）。アッセイミックスは、６２．５ｍＭ トリス酢酸塩（ｐＨ７．８）、１２．５ｍＭ 硫酸マグネシウム、２．５ｇ／Ｌ ウシ血清アルブミン、７．５ｍＭ Ｄ／Ｌ－システイン、１．２５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸塩、２５μＭ ピロリン酸ナトリウム、１０ｇ／Ｌ シクロデキストリン、１．２５ｍＭ アデノシン５－三リン酸塩及び１３．１μｇ／ｍＬの市販のホタル（Photinus pyralis）由来ルシフェラーゼ（組換え体）を含有した。光放出は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで記録された。測定の開始２分の平均相対光単位（ＲＬＵ）が、表ＶＩｂに示される。
化合物Ｖａを用いた大腸菌の検出及びＤ－ルシフェリン－６－Ｏ－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシドとの比較
大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２(Ｅ.ｃ.、ベータ－ガラクトシダーゼ陽性）及びサルモネラ
・エンテリティディスＲＫＩ０５／０７９９２（Ｓ．Ｅ．、ベータ－ガラクトシダーゼ陰性）が、栄養ブロス中で１７時間培養され、その後、滅菌生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）で段階希釈された。希釈された細胞懸濁液が、完全（full-strength）ＬＢ培地（１
０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）又は超純水で１：２０ｖ／ｖに希釈されたＬＢ培地（ＬＢ １：２０）のいずれかと共に試験管に１：１００ｖ／ｖで接種された。全ての培地が、ベータ－ガラクトシダーゼの誘導のために１ｍＭ
ＩＰＴＧを含有した。滅菌生理食塩水が、陰性対照の試験管に添加された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの培養の６時間後に、試料（０．２５５ｍＬ）が、培養液から取り出され、白色マイクロタイタープレート内でエタノール中の化合物Ｖａの原液４５μＬと混合された。化合物Ｖａの最終濃度は２０μＭであり、エタノールの最終濃度は１５％ｖ／ｖであった。光放出が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで記録された。化学発光基質の添加後９～１０分の期間の平均ＲＬＵ（相対光単位）値が、比較された（表ＶＩａ）。比較のために、同一の大腸菌菌株が予め培養され、同様の方法で希釈され、その後、希釈されたミュラー・ヒントンブロス（ＭＨ１：２０、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２で１：２０ｖ／ｖに希釈された完全培地）に接種された。培地は、１ｍＭ ＩＰＴＧが補充された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの養成の６時間後に、培養試料（４５μＬ）がマイクロタイタープレートに移され、２％ｗ／ｖ ドデシル－トリメチルアンモニウムブロミド、１ｍＭ Ｄ－ルシフェリン－６－Ｏ－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシド（市販品、
Ｂｉｏｓｙｎｔｈ Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｌ－８６００）及び１０ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する１０倍溶解試薬 ５μＬと混合された。溶解、及びＤ－ルシフェリン－６－Ｏ－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシドとの反応は、３７℃で１時間行われた。その後、０．２ｍＬのルシフェラーゼアッセイミックスが添加された（５：１ ｖ／ｖ）。アッセイミックスは、６２．５ｍＭ トリス酢酸塩（ｐＨ７．８）、１２．５ｍＭ 硫酸マグネシウム、２．５ｇ／Ｌ ウシ血清アルブミン、７．５ｍＭ Ｄ／Ｌ－システイン、１．２５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸塩、２５μＭ ピロリン酸ナトリウム、１０ｇ／Ｌ シクロデキストリン、１．２５ｍＭ アデノシン５－三リン酸塩及び１３．１μｇ／ｍＬの市販のホタル（Photinus pyralis）由来ルシフェラーゼ（組換え体）を含有した。光放出は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで記録された。測定の開始２分の平均相対光単位（ＲＬＵ）が、表ＶＩｂに示される。
結論：大腸菌の最小試験接種密度で実現されたシグナルノイズ比は、ベータ－ガラクトシダーゼの検出がＤ－ルシフェリン－６－Ｏ－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシドの代わりに化合物Ｖａによる場合、５分の１の作用濃度を利用したにもかかわらず９倍になった。
実施例１０：
Ｄ－ルシフェリン－６－Ｏ－フェニル－カプリレートを用いたサルモネラ・エンテリカの検出
Ｄ－ルシフェリン－６－Ｏ－フェニル－カプリレートが、当業者に公知の手順に従って合成された。サルモネラ・エンテリティディスＲＫＩ０５／０７９９２(Ｓ.Ｅ.、サルモ
ネラ・エンテリカｓｓｐ.エンテリカｓｅｒ.エンテリティディス、Ｃ８エステラーゼ陽性）が、栄養ブロス(５ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、
１ｇ／Ｌ 酵母エキス、ｐＨ７．４）中で１６時間培養され、その後、滅菌生理食塩水（
０．９％ＮａＣｌ）で段階希釈された。希釈された細胞懸濁液が、試験管内で、０．１ｍＭ Ｄ－ルシフェリン－６－Ｏ－フェニル－カプリレートを含有する栄養ブロスに１：１００ｖ／ｖで接種された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの培養の６．５時間後に、試料（５０μＬ）が培養液から取り出され、マイクロタイタープレート内で０．２ｍＬのルシフェラーゼアッセイミックス（実施例９に記載された組成）と混合された。ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドなどの細胞溶解試薬の使用は、必要でなかった（データは示されない）。光放出が、発光検出システムを具備されたプレートリーダーで記録された。ルシフェラーゼアッセイミックスの添加後最初の３分の平均ＲＬＵ（相対光単位）値が、比較された（表ＶＩＩ）。
Ｄ－ルシフェリン－６－Ｏ－フェニル－カプリレートを用いたサルモネラ・エンテリカの検出
Ｄ－ルシフェリン－６－Ｏ－フェニル－カプリレートが、当業者に公知の手順に従って合成された。サルモネラ・エンテリティディスＲＫＩ０５／０７９９２(Ｓ.Ｅ.、サルモ
ネラ・エンテリカｓｓｐ.エンテリカｓｅｒ.エンテリティディス、Ｃ８エステラーゼ陽性）が、栄養ブロス(５ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、
１ｇ／Ｌ 酵母エキス、ｐＨ７．４）中で１６時間培養され、その後、滅菌生理食塩水（
０．９％ＮａＣｌ）で段階希釈された。希釈された細胞懸濁液が、試験管内で、０．１ｍＭ Ｄ－ルシフェリン－６－Ｏ－フェニル－カプリレートを含有する栄養ブロスに１：１００ｖ／ｖで接種された。３７℃及び１５０ｒｐｍでの培養の６．５時間後に、試料（５０μＬ）が培養液から取り出され、マイクロタイタープレート内で０．２ｍＬのルシフェラーゼアッセイミックス（実施例９に記載された組成）と混合された。ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドなどの細胞溶解試薬の使用は、必要でなかった（データは示されない）。光放出が、発光検出システムを具備されたプレートリーダーで記録された。ルシフェラーゼアッセイミックスの添加後最初の３分の平均ＲＬＵ（相対光単位）値が、比較された（表ＶＩＩ）。
結論：同様の濃度のサルモネラ・エンテリカで化合物ＩＩａにより実現されたシグナルノイズ比は、Ｄ－ルシフェリン－６－Ｏ－カプリレートに比較して９～１７０倍であり、より低い検出限界を容易にした（実施例２参照）。
実施例１１：
グルコースオキシダーゼと組み合わせた化合物ＶＩａを用いた大腸菌の培養上清中のグルコースの検出
大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２が、栄養ブロス(５ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ
、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ 酵母エキス、ｐＨ７．４）中で１６時間養成された。細胞が、遠心分離（１３’０００×ｇ、２分）により培養上清から分離された。種々の濃度のグルコースが、水中の１００倍濃縮原液から培養上清に添加され、同様の量の水が、陰性対照に添加された。第二の陰性対照もまた、５ｍＭグルコースを含有したが、グルコースオキシダーゼは含有しなかった。グルコースを含む、又は含まない培養上清（０．１ｍＬ）が、白色マイクロタイタープレート内で、４０μＭ 化合物ＶＩａを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液０．１ｍＬ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）と混合され、過酸化水素及び１ｍｇ／ｍＬの市販のアスペルギルス・ニガー由来グルコースオキシゲナーゼと反応された。発光のタイムコースが、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで２０分間記録され、結果が図５に示されている（過酸化水素で惹起される発光基質の化合物ＶＩａをグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）と組み合わせて使用した大腸菌培養上清中の直接のグルコース検出）。化合物ＶＩａ及びグルコースオキシダーゼが存在する場合も、グルコースの存在が、連続的な発光増加につながった。増加率は、グルコース濃度と正の相関を示した。
グルコースオキシダーゼと組み合わせた化合物ＶＩａを用いた大腸菌の培養上清中のグルコースの検出
大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２が、栄養ブロス(５ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ
、２ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ 酵母エキス、ｐＨ７．４）中で１６時間養成された。細胞が、遠心分離（１３’０００×ｇ、２分）により培養上清から分離された。種々の濃度のグルコースが、水中の１００倍濃縮原液から培養上清に添加され、同様の量の水が、陰性対照に添加された。第二の陰性対照もまた、５ｍＭグルコースを含有したが、グルコースオキシダーゼは含有しなかった。グルコースを含む、又は含まない培養上清（０．１ｍＬ）が、白色マイクロタイタープレート内で、４０μＭ 化合物ＶＩａを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液０．１ｍＬ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）と混合され、過酸化水素及び１ｍｇ／ｍＬの市販のアスペルギルス・ニガー由来グルコースオキシゲナーゼと反応された。発光のタイムコースが、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで２０分間記録され、結果が図５に示されている（過酸化水素で惹起される発光基質の化合物ＶＩａをグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）と組み合わせて使用した大腸菌培養上清中の直接のグルコース検出）。化合物ＶＩａ及びグルコースオキシダーゼが存在する場合も、グルコースの存在が、連続的な発光増加につながった。増加率は、グルコース濃度と正の相関を示した。
結論：化合物ＶＩａ又は関連する化合物を適切な過酸化水素放出酵素（例えば、オキシダーゼ）と組み合わせて用いた場合、グルコースなどの生育基質及び代謝産物は、化学発光により細菌培養の上清中で直接検出され得る。
実施例１２：
化合物ＶＩＩａを用いたのカルバペネム耐性菌の検出
カルバペネム耐性菌の菌株シュードモナス・エルギノーサＲＫＩ４８／０９（ＩＭＰ－２）（Ｐ．ａ．－ＩｍｐＲ）及びクレブシエラ・ニューモニエＲＫＩ９２／０８（ＫＰＣ－２）（Ｋ．ｐ.－ＩｍｐＲ）が、それぞれ８ｍｇ／Ｌ及び４ｍｇ／ｍＬ イミペネムを
添加されたトリプチケースソイ寒天上で培養された。カルバペネム感受性菌株大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２（Ｅ．ｃ．）が、トリプチケースソイ寒天上で養成された。イミペネムを含む、及び含まない栄養ブロス（組成及びｐＨについてはこれまでの実施例を参照。１５ｍＬ試験管内に３ｍＬ）に、寒天プレートからイミペネム耐性菌及び感受性菌が接種された。試験管培養液が、３７℃及び１５０ｒｐｍで６時間インキュベートされた。培養試料（０．２５５ｍＬ）が、白色マイクロタイタープレートのウェルに移され、エタノール中の化合物ＶＩＩａの原液４５μＬと混合された。化合物ＶＩＩａ、エタノール及びジメチルスルホキシドの最終濃度は、それぞれ１０μＭ、１４％ｖ／ｖ及び１％ｖ／ｖであった。発光が、化合物ＶＩＩａの添加後にプレートリーダーで３０分間記録された。測定期間の最大発光シグナル（相対光単位）が、表ＶＩＩに示される。
化合物ＶＩＩａを用いたのカルバペネム耐性菌の検出
カルバペネム耐性菌の菌株シュードモナス・エルギノーサＲＫＩ４８／０９（ＩＭＰ－２）（Ｐ．ａ．－ＩｍｐＲ）及びクレブシエラ・ニューモニエＲＫＩ９２／０８（ＫＰＣ－２）（Ｋ．ｐ.－ＩｍｐＲ）が、それぞれ８ｍｇ／Ｌ及び４ｍｇ／ｍＬ イミペネムを
添加されたトリプチケースソイ寒天上で培養された。カルバペネム感受性菌株大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２（Ｅ．ｃ．）が、トリプチケースソイ寒天上で養成された。イミペネムを含む、及び含まない栄養ブロス（組成及びｐＨについてはこれまでの実施例を参照。１５ｍＬ試験管内に３ｍＬ）に、寒天プレートからイミペネム耐性菌及び感受性菌が接種された。試験管培養液が、３７℃及び１５０ｒｐｍで６時間インキュベートされた。培養試料（０．２５５ｍＬ）が、白色マイクロタイタープレートのウェルに移され、エタノール中の化合物ＶＩＩａの原液４５μＬと混合された。化合物ＶＩＩａ、エタノール及びジメチルスルホキシドの最終濃度は、それぞれ１０μＭ、１４％ｖ／ｖ及び１％ｖ／ｖであった。発光が、化合物ＶＩＩａの添加後にプレートリーダーで３０分間記録された。測定期間の最大発光シグナル（相対光単位）が、表ＶＩＩに示される。
結論:化合物ＶＩＩａを培養試料に添加すること、及び発光を記録することにより、カ
ルバペネム耐性菌が、カルバペネム感受性菌と識別され得る。
ルバペネム耐性菌が、カルバペネム感受性菌と識別され得る。
実施例１３：
異なる置換基ＲＡ、ＲＢ及びＲＣを含む化合物の発光特性
化合物Ａ、化合物Ｂ及び化合物Ｃの化学発光動力学特性及び放出される全ての光が、ＰＢＳ緩衝溶液（１０％ＤＭＳＯ）中、ｐＨ７．４、［１μＭ］で決定された。
化合物Ａ、Ｂ及びＣは、Ｒ１と分析物との相互作用の際のそれぞれの式Ｉで示される化合物から形成される（発光）種を表す。
化合物Ａ及びＢの化学発光動力学特性が、図６Ａで比較され（挿入：最初の２時間を拡大）；化合物Ａ及びＢで放出された全ての光が、図６Ｂで比較されている。
化合物Ａ及びＣの化学発光動力学特性が、図７Ａで比較され；化合物Ａ及びＣで放出された全ての光が、図７Ｂで比較されている。
異なる置換基ＲＡ、ＲＢ及びＲＣを含む化合物の発光特性
化合物Ａ、化合物Ｂ及び化合物Ｃの化学発光動力学特性及び放出される全ての光が、ＰＢＳ緩衝溶液（１０％ＤＭＳＯ）中、ｐＨ７．４、［１μＭ］で決定された。
化合物Ａ及びＢの化学発光動力学特性が、図６Ａで比較され（挿入：最初の２時間を拡大）；化合物Ａ及びＢで放出された全ての光が、図６Ｂで比較されている。
化合物Ａ及びＣの化学発光動力学特性が、図７Ａで比較され；化合物Ａ及びＣで放出された全ての光が、図７Ｂで比較されている。
Claims (21)
- 式Ｉで示される化合物。
Ｒ１は、アセチル、ブチリル、オクタノイル、ノナノイル、ミオイノシトールホスホリル、ホスホリル、アミノアシジル（amino acidyl）基、Ｌ－ピログルタミックアシジル（L-pyroglutamic acidyl）、ジペプチジル基、トリペプチジル基、ベータ－Ｄ－ガラクト
ピラノシジル、アルファ－Ｄ－ガラクトピラノシジル、アルファ－Ｄ－グルコピラノシジル、ベータ－Ｄ－グルコピラノシジル、ベータ－Ｄ－グルクロニル、ベータ－Ｄ－グルクロニルナトリウム塩、ｎ－アセチル－ベータ－Ｄ－ガラクトサミニジル、Ｎ－アセチルノイラミニジル、セロビオシジル、アルファ－Ｄ－リボフラノシジル、ベータ－Ｄ－リボフラノシジル、コリンホスホリル、－ＮＯ２、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレイル、Ｔｏｓ－Ｌ－アラニル、アルファ－マンノシル、ベータ－マンノシル、アルファ－フコシル、ベータ－フコシル、アルファ－イドロノシル、ベータ－イドロノシル、アルファ－（オリゴ）マルトシル、オキサリルエステル、ＳｕｃＯＭｅ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－チロシニル、ベータ－ラクタマーゼ不安定基、第一～五世代のセファロスポリン、セファマイシン、カルバペネム、Ａｃ－ＱＬＱ－、Ａｃ－ＦＱＬＱ－、Ａｃ－ＥＦＱＬＱ－、
及びＡｃ－ＤＥＦＱＬＱ－から選択される酵素不安定基、並びに式－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋を有するホウ素含有基から選択される分析物応答基であり；
Ｚ及びＺ’は、独立して、Ｒ４及びＯＲ５から選択され、
ここでＲ４は、－ＯＨ、－Ｏ－Ｋａｔ＋、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、Ｃ５～Ｃ６アリール、Ｃ５～Ｃ６ヘテロアリール、Ｃ６～Ｃ１０アラルキル、及びＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルから選択され、
Ｒ５は、－Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、Ｃ５～Ｃ６アリール、Ｃ５～Ｃ６ヘテロアリール、Ｃ６～Ｃ１０アラルキル、及びＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルから選択されるか、又は
２個のＲ４、２個のＲ５、若しくは１個のＲ４と１個のＲ５が、介在する原子と一緒になって、５～７員の複素環を形成しており；
Ｚ’’は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され；
Ｋａｔ＋は、有機又は無機のカチオンであり；
Ｌは、
但し、
Ｒ１が、酵素不安定基である場合、ｎは１で、ｍは１であるか、又はｎは０で、ｍは１であり；
Ｒ１が、－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’）３ －Ｋａｔ＋である場合、ｎ及びｍは、両者とも０又は両者とも１であり；
Ｒ１が、酵素不安定基
ＲＡ及びＲＣの一方は、ＲＢと一緒になって、
Ｒ２は、シアノ、ニトロ、スルホキシド、スルホン、アリール、アルケニル、
ここでＹは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、
Ｙ’及びＹ’’は、独立して、Ｈ及びＣ１～Ｃ１２アルキルから選択されるか、又は窒素原子と一緒になって、複素環構造を形成しており；
Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ３又はＲ２－Ｑ－であり；
Ｑは、式Ｉで示される化合物の中心芳香族環のπ系と共役されたπ系を含む基であり；
但し、Ｒ３が、Ｒ２－Ｑ－である場合、ＲＡ及びＲＣの一方が、Ｈであることを条件とし；
ＲＤは、直鎖状又は分枝状Ｃ１～Ｃ１８アルキル又はＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択され；
ＲＥ及びＲＦは、独立して、分枝状Ｃ３～Ｃ１８アルキル若しくはＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択されるか、又はＲＥとＲＦが、結合された炭素原子と一緒になって、縮合環、スピロ環若しくは多環を形成しており；
Ｒ Ｇ は、独立して、Ｃ１～Ｃ１２アルキルから選択される） - Ｒ Ａ は、Ｈであり；
Ｒ Ｃ は、Ｒ Ｂ と一緒になって、
- （ｉ）Ｚ’’は、Ｆであり；
（ｉｉ）Ｋａｔ ＋ は、アルカリ金属カチオンであり；
（ｉｉｉ）Ｌは、
（ｉｖ）Ｘは、－Ｏ－又は－Ｎ + （ＣＨ ３ ） ２ －であり；又は
（ｖ）Ｙ’及びＹ’’は、窒素原子と一緒になって、マレイミド基を形成している、請求項１又は２に記載の化合物。 -
- 式ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩ、及びＶＩＩＩａで示される化合物から選択される、化合物。
- 標的分析物、標的微生物又は標的代謝産物の検出のための、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物の使用。
- 標的微生物の検出のための、請求項６に記載の使用。
- 前記標的微生物がバクテリアである、請求項７に記載の使用。
- 前記微生物が、サルモネラ（Salmonella）；サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）；リステリア（Listeria）；Ｓ．アウレウス（S. aureus）；大腸菌（E. coli）
；カルバペネム耐性菌；カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）；Ｃ．コリ（C. coli）；Ｃ．ラリ（C. lari）；バチルス（Bacillus）；スタフィロコッカス（Staphylococcus）；クロストリジウム（Clostridium）；マイコバクテリウム・ツベルク
ローシス（Mycobacterium tuberculosis）；クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）；Ｓ．アガラクティエ（S. agalactiae）；カンジダ属菌（Candida spp.）；グラム陰性菌；酵母；カビ；シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）；エンテロコッカス（Enterococci）；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）；シトロバクター（Citrobacter）；大腸菌群（Coliform）；クロ
ノバクター・サカザキ（Cronobacter sakazakii）；ＭＲＳＡ；ＶＲＥ；ゲオバチルス・
ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）；リステリア属菌（Listeria spp.）；ＥＳＢＬ生成エンテロバクター；ビブリオ（Vibrio）；クロストリジウム・
ディフィシル（Clostridium difficile）；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans
）；プレボテラ（Prevotella）；シゲラ（Shigella）；アピラーゼ含有微生物；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophilia）；及びカリシウイルス科（Caliciviridae）のウイルスから選択される、請求項６～８のいずれか１項に記載の使用。 - 前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）であり；前記カルバペネム耐性菌がシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）又はクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）であり；前記アピラーゼ含有微生物がシゲラ（Shigella）であり；前記カリシウイルス科（Caliciviridae）のウイルス
がラゴウイルス（Lagovirus）、ノロウイルス（Norovirus）、サポウイルス（Sapovirus
）、ネボウイルス（Nebovirus）、及びレコウイルス（Recovirus）から選択される、請求項９に記載の使用。 - Ｒ１、並びに前記それぞれの標的分析物、標的微生物又は標的代謝産物が、以下の表に示された通り定義される、請求項６～１０のいずれか１項に記載の使用。
- （ｉ）生育基質、栄養素、及び代謝産物の酵素的酸化による前記生育基質、栄養素、及
び／又は代謝産物の検出のための；
（ｉｉ）カブトガニＣ因子の検出を利用したバクテリア内毒素の検出のための；
（ｉｉｉ）乳製品の低温殺菌の検査のための；
（ｉｖ）微生物における抗生物質耐性を検査するための；
（ｖ）無機リン酸塩の検出のための；
（ｖｉ）滅菌工程のモニタリングのための；又は
（ｖｉｉ）バクテリアの抗生物質耐性のエンドポイント及びオンライン検出のため、及び抗生物質感受性検査のための、
請求項６～１１のいずれか１項に記載の使用。 - 前記滅菌工程のモニタリングが、指標生物ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスのアルファ－Ｄ－グルコシダーゼ活性の検出を通して行われる、請求項１２に記載の使用。
- 標的微生物の検出のための化合物の使用であって、
前記化合物が式Ｉに示される化合物である、使用。
Ｒ １ は、アセチル、ブチリル、オクタノイル、ノナノイル、ミオイノシトールホスホリル、ホスホリル、アミノアシジル（amino acidyl）基、Ｌ－ピログルタミックアシジル（L-pyroglutamic acidyl）、ジペプチジル基、トリペプチジル基、ベータ－Ｄ－ガラクト
ピラノシジル、アルファ－Ｄ－ガラクトピラノシジル、アルファ－Ｄ－グルコピラノシジル、ベータ－Ｄ－グルコピラノシジル、ベータ－Ｄ－グルクロニル、ベータ－Ｄ－グルクロニルナトリウム塩、ｎ－アセチル－ベータ－Ｄ－ガラクトサミニジル、Ｎ－アセチルノイラミニジル、セロビオシジル、アルファ－Ｄ－リボフラノシジル、ベータ－Ｄ－リボフラノシジル、コリンホスホリル、－ＮＯ ２ 、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレイル、Ｔｏｓ－Ｌ－アラニル、アルファ－マンノシル、ベータ－マンノシル、アルファ－フコシル、ベータ－フコシル、アルファ－イドロノシル、ベータ－イドロノシル、アルファ－（オリゴ）マルトシル、オキサリルエステル、ＳｕｃＯＭｅ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－チロシニル、ベータ－ラクタマーゼ不安定基、第一～五世代のセファロスポリン、セファマイシン、カルバペネム、Ａｃ－ＱＬＱ－、Ａｃ－ＦＱＬＱ－、Ａｃ－ＥＦＱＬＱ－、及びＡｃ－ＤＥＦＱＬＱ－から選択される酵素不安定基、並びに式－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’） ３ － Ｋａｔ ＋ を有するホウ素含有基から選択される分析物応答基であり；
Ｚ及びＺ’は、独立して、Ｒ ４ 及びＯＲ ５ から選択され、
ここでＲ ４ は、－ＯＨ、－Ｏ － Ｋａｔ ＋ 、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、Ｃ５～Ｃ６アリール、Ｃ５～Ｃ６ヘテロアリール、Ｃ６～Ｃ１０アラルキル、及びＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルから選択され、
Ｒ ５ は、－Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニ
ル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ２～Ｃ４ヘテロアルキニル、Ｃ５～Ｃ６アリール、Ｃ５～Ｃ６ヘテロアリール、Ｃ６～Ｃ１０アラルキル、及びＣ６～Ｃ１０ヘテロアラルキルから選択されるか、又は
２個のＲ ４ 、２個のＲ ５ 、若しくは１個のＲ ４ と１個のＲ ５ が、介在する原子と一緒になって、５～７員の複素環を形成しており；
Ｚ’’は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択され；
Ｋａｔ ＋ は、有機又は無機のカチオンであり；
Ｌは、
但し、
Ｒ １ が、酵素不安定基である場合、ｎは１で、ｍは１であるか、又はｎは０で、ｍは１であり；
Ｒ １ が、酵素不安定基
Ｒ １ が、－Ｂ（Ｚ）（Ｚ’）又は－Ｂ（Ｚ’’） ３ － Ｋａｔ ＋ である場合、ｎ及びｍは、両者とも０又は両者とも１であり；
Ｒ Ａ 及びＲ Ｃ は、独立して、Ｈ及びＲ ２ －Ｑ－から選択され、但し、Ｒ Ａ 及びＲ Ｃ の両方がＨではないことを条件とし；
Ｒ Ｂ は、Ｈであり；
Ｒ ２ は、シアノ、ニトロ、スルホキシド、スルホン、アリール、アルケニル、
ここでＹは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル又はアルカリ金属イオンであり、
Ｙ’及びＹ’’は、独立して、Ｈ及びＣ１～Ｃ１２アルキルから選択されるか、又は窒素原子と一緒になって、複素環構造を形成しており；
Ｒ ３ は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ ３ 又はＲ ２ －Ｑ－であるが、
Ｑは、式Ｉで示される化合物の中心芳香族環のπ系と共役されたπ系を含む基であり；
Ｒ Ｄ は、直鎖状又は分枝状Ｃ１～Ｃ１８アルキル又はＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択され；
Ｒ Ｅ 及びＲ Ｆ は、独立して、分枝状Ｃ３～Ｃ１８アルキル若しくはＣ３～Ｃ７シクロアルキルから選択されるか、又はＲ Ｅ とＲ Ｆ が、結合された炭素原子と一緒になって、縮合環、スピロ環若しくは多環を形成しており；
Ｒ Ｇ は、独立して、Ｃ１～Ｃ１２アルキルから選択される） - （ｉ）Ｚ’’は、Ｆであり；
（ｉｉ）Ｋａｔ ＋ は、アルカリ金属カチオンであり；
（ｉｉｉ）Ｌは、
（ｉｖ）Ｘは、－Ｏ－又は－Ｎ + （ＣＨ ３ ） ２ －であり；又は
（ｖ）Ｙ’及びＹ’’は、窒素原子と一緒になって、マレイミド基を形成している、請求項１４に記載の使用。 - 前記化合物が
- 前記化合物が、式ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩｃ、ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩ、及びＶＩＩＩａから選択される化合物である、請求項１６に記載の使用。
- 前記標的微生物がバクテリアである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の使用。
- 前記標的微生物が、サルモネラ（Salmonella）；サルモネラ・エンテリカ（Salmonella
enterica）；リステリア（Listeria）；Ｓ．アウレウス（S. aureus）；大腸菌（E. coli）；カルバペネム耐性菌；カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）；
Ｃ．コリ（C. coli）；Ｃ．ラリ（C. lari）；バチルス（Bacillus）；スタフィロコッカス（Staphylococcus）；クロストリジウム（Clostridium）；マイコバクテリウム・ツベ
ルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）；クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）；Ｓ．アガラクティエ（S. agalactiae）；カンジダ属菌（Candida spp.）；グラム陰性菌；酵母；カビ；シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）；エンテロコッカス（Enterococci）；ストレプトコッカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes）；シトロバクター（Citrobacter）；大腸菌群（Coliform）
；クロノバクター・サカザキ（Cronobacter sakazakii）；ＭＲＳＡ；ＶＲＥ；ゲオバチ
ルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）；リステリア属菌（Listeria spp.）；ＥＳＢＬ生成エンテロバクター；ビブリオ（Vibrio）；クロストリジ
ウム・ディフィシル（Clostridium difficile）；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）；プレボテラ（Prevotella）；シゲラ（Shigella）；アピラーゼ含有微生物；レ
ジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophilia）；及びカリシウイルス科（Caliciviridae）のウイルスから選択される、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の使用。 - 前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）であり；前記カルバペネム耐性菌がシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）又はクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）であり；前記アピラーゼ含有微生物がシゲラ（Shigella）であり；前記カリシウイルス科（Caliciviridae）のウイルス
がラゴウイルス（Lagovirus）、ノロウイルス（Norovirus）、サポウイルス（Sapovirus
）、ネボウイルス（Nebovirus）、及びレコウイルス（Recovirus）から選択される、請求項１９に記載の使用。 - Ｒ １ 及び前記それぞれの標的微生物が、以下の表に示された通り定義される、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| EP18174403.8 | 2018-05-25 | ||
| EP18174403 | 2018-05-25 | ||
| PCT/EP2019/063418 WO2019224338A1 (en) | 2018-05-25 | 2019-05-24 | Dioxetane compounds and their use for the detection of microorganisms |
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