CN101334362A - Hiv蛋白酶活性测定指示剂、其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一个新型的多肽荧光试剂，HIV蛋白酶能大大增强该试剂的荧光强度。HIV蛋白酶将内淬灭的多肽断开后产生更强的荧光产物，该产物在近红外区发出高强度的荧光信号。该产物的近红外荧光强度与HIV蛋白酶活性量成正比。鉴于其荧光信号在近红外区，这种HIV蛋白酶指示剂非常适合测定各种生物样品中蛋白酶的生物活性。本发明还提供了高通量筛选HIV蛋白酶抑制剂的方法，这对研制治疗艾滋病新药时具有极大的应用价值。

Description

HIV蛋白酶活性测定指示剂、其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种新型的HIV蛋白酶活性测定指示剂及其制备方法，该指示剂是一种多肽荧光试剂，HIV蛋白酶能大大增强该试剂的荧光强度。本发明还涉及该指示剂的应用，所述的HIV蛋白酶指示剂可用于样品中蛋白酶生物活性的测定，特别适用于各种生物样品中蛋白酶生物活性的测定，并可用作HIV蛋白酶抑制剂的高通量筛选方法，这对研制治疗艾滋病新药具有极大的应用价值。

背景技术

在治疗获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者时，引入有效的具有特殊HIV蛋白酶抑制剂功能的化合物，在临床上已获得很大的成功。研究表明，人类免疫缺陷病毒(HIV)是艾滋病的元凶。HIV蛋白酶的作用是催化裂解HIV多肽中的gag和gag-pol，抑制该酶的活性会产生无感染能力的子代病毒，从而阻止病毒进一步感染。因此HIV蛋白酶是抗艾滋病病毒药物的理想靶点，HIV蛋白酶抑制剂可以降低甚至终止HIV蛋白酶的活性。

目前经美国食品药品管理局(FDA)批准上市，用于治疗艾滋病患者的HIV蛋白酶抑制剂有六种，amprenavir(安普那韦)，indinavir(茚地那韦)，lopinavir(洛匹那韦)，nelfinavir(奈非那韦)，ritonavir(利托那韦)，和saquinavir(沙奎那韦)。联合用药疗法(鸡尾酒疗法)是目前治疗艾滋病感染的基石，其中就包括HIV蛋白酶抑制剂和HIV逆转录酶抑制剂。但是，并非所有的艾滋病患者在进行鸡尾酒疗法时都能得到理想的效果，不同的患者对药物反应变化很大。蛋白酶抑制剂和抗病毒性的关系已经被临床数据所证实；当鸡尾酒疗法用于治疗患者时，潜在的药代动力学及药物之间的相互作用，既可以提高也可能降低治疗效果。患者的配合程度直接影响药效，同样也就影响治疗效果。

因此，测定患者体内的HIV蛋白酶的浓度是非常必要的，以确保药物在维持AIDS病人体内抗病毒活性方面是充分有效的；另外，生物样品中HIV蛋白酶的定量测定对药物的研发至关重要。在治疗艾滋病其它重要的方面包括：HIV蛋白酶代谢物的测定和抗HIV蛋白酶抗体的测定。HIV蛋白酶代谢物的测定可提供治疗效果方面的信息；抗HIV蛋白酶抗体则显示患者被HIV感染，因此抗体的测定可用来诊断感染的可能性。

定量测定在患者样品内HIV蛋白酶的经典方法是通过化验的方法，需要复杂而昂贵的仪器，使临床分析变得非常困难。例如，用色谱的方法(HPLC或者HPLC/MS/MS)分析血浆样品，可测定大量HIV蛋白酶的存在。(例如：Poirier，J.M.et al.，Ther.Drug Monit.22：465-473(2000)；Marzonlini，C.，et al.，J.Chromatogr.740：43-58(2000)；and Remmel，R.P.et al.，Clin.Chem.46(1)：73-81(2000))。通常在血浆样品检测前进行了固相萃取，这样血浆没有被直接分析而是进行了修饰，这种测定前的修饰增加了分析的复杂性并提高了分析成本。

放射性免疫测定通常在样品内含HIV蛋白酶类似物的放射标记物，与游离的的HIV蛋白酶之间存在竞争。受体一般是特定HIV蛋白酶的抗体。据报道在一放射性免疫测定的例子中，用I-125标记HIV蛋白酶的类似物，与病人血浆样品中任何接有抗体的HIV蛋白酶存在竞争。沉淀出的抗体化合物通过分析放射活性水平来测定HIV蛋白酶的浓度(例如：Wiltshire，H.R.et al.Analyt.Biochem.281：105-114(2000))。在利用放射性免疫法间接测定，是将HIV蛋白酶加入到含HIV蛋白酶培养基样品中，放射性标记抗体与分裂产物发生特异性结合，通过测定放射性活度来测定培养基的分裂。如果分裂产物不存在则意味着抗HIV蛋白酶抗体的存在(例如：U.S.Pat.No.5,171,662)。

所有这些测定HIV蛋白酶抑制剂和他们代谢物的方法都取得了一定的成功。但是，目前所有的HIV蛋白酶测定方法都存在测定速度慢，操作复杂以及生物样品干扰太大的缺点。本发明则提供了一种简单快速测定的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种新型荧光测试试剂，在HIV蛋白酶存在时它的荧光显著增强，因此可作为HIV蛋白酶活性测定指示剂，适用于快速测定具有HIV蛋白酶活性的物质。

本发明的荧光测试试剂被HIV蛋白酶消化后，在近红外区产生非常强的荧光信号。鉴于他们的荧光信号在近红外区，这些HIV蛋白酶荧光底物非常适合测定各种生物样品(特别是冰冻切片)中HIV蛋白酶的活性。利用荧光显微镜可以测定组织学样品以及流式细胞仪的悬浮样品。因此，本发明含荧光团的化合物HIV蛋白酶底物可以用来测定HIV蛋白酶活性和筛选HIV蛋白酶抑制剂。

本文中，本发明的荧光测试试剂也称为荧光指示剂，或被称为HIV蛋白酶荧光底物。

本发明提供了一种荧光指示剂，该指示剂可增强HIV蛋白酶的荧光强度，并具有下述通式结构：

荧光淬灭团——多肽链——荧光发射团........................(I)

其中所述的荧光淬灭剂是非荧光染料；所述的多肽是含有HIV蛋白酶氨基酸的聚合物，可被HIV蛋白酶诱导水解；以及所述的荧光发射团是可发射荧光的染料。

优选的，上述通式中的荧光淬灭团的吸收波长大于600nm；以及其中的荧光发射团的发射波长也大于600nm。即，其中所述的荧光淬灭剂是最大吸收波长大于600nm的非荧光染料；所述的多肽是含有HIV蛋白酶氨基酸的聚合物，可被HIV蛋白酶诱导水解；所述的荧光发射团是最大发射波长大于600nm的染料。

由于本发明的荧光测试试剂结构中采用了吸收波长和发射波长都位于近红外区的发色团，使该试剂有最大的荧光共振能量转移效率。因此而完成了本发明。例如，本发明说明书的附图1A和1B分别给出了可作为荧光淬灭剂的Super Quencher 5^TM和可作为荧光发射团的Cyanine 5的发射光谱。两个光谱重叠得非常好，因而说明了两者之间具有最大的荧光共振能量转移效率。

本发明的荧光指示剂中，荧光淬灭团，多肽链和荧光发射团具有可调节的多肽空间。所述的多肽是包含HIV蛋白酶结合点的氨基酸生物聚合物，此结合点极易被HIV蛋白酶诱导水解；所述的HIV蛋白酶结合点提供的氨基酸序列可以被HIV蛋白酶识别并切断，来显示HIV蛋白酶的水解活性。

本发明荧光指示剂中的多肽链，即HIV蛋白酶结合点通常是由大约2～50个氨基酸的多肽组成，优选2～20个氨基酸，更优选2～10个氨基酸。优选的，其中所述的多肽是选自以下片段：HVSFNFPQITH；Gaba-SQNYPIVQ；VSFNFPQITK；或SQNYPIVQK。

本发明特别优选如下方程式II和III的荧光化合物作为荧光指示剂，其荧光发射团的发射波长大于600nm，以及荧光淬灭剂团的吸收波长也大于600nm：

荧光淬灭团-HVSFNFPQITH-C(荧光发射团)...............(II)

荧光淬灭团-Gaba-SQNYPIVQ-荧光发射团................(III)

以上方程式中的简写字母代表不同的标准氨基酸。

本发明所用的术语“蛋白酶结合点”是指可被蛋白酶特定识别和切断的氨基酸序列。蛋白酶结合点含有可被蛋白酶水解的多肽键，肽键连接的氨基酸残基可形成切断点。

本发明所用的术语“荧光发射团”是指一个可吸收特定波长的光，然后发射出不同波长特定光的分子。常用的荧光发射团有菁染料，罗丹明及其衍生物，荧光素及其衍生物，香豆素和镧系元素螯合物。优选的，其中所述的荧光发射团是Cy5、Cy 5.5、Cy7、Cyanine 5、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 750、Super Fluor 647、Super Fluor 680或Super Fluor 750。最优选的荧光发射团是Cy5或Cyanine5。

本发明所用的术语“荧光淬灭团”是指一个能够吸收特定波长的光但是不会再发光的化学分子。常用的荧光淬灭团有偶氮染料，蒽醌类化合物，酞菁染料和重金属络合物等。优选的，其中所述的荧光淬灭剂是Super Quencher5或BHQ 3。

本发明所用的术语“肽”和“多肽”是指氨基酸组成的长链，它们的α-碳通过一个氨基酸与另一个氨基酸缩合形成的肽键相连。肽链的一端的氨基酸有一个自由的氨基，另一端有一个自由的羧基。术语“末端氨基”(简称N-terminus)指的是多肽末端氨基酸的自由氨基；同样，“末端羧基”或“羧基末端”(简称C-terminus)指的是多肽末端氨基酸的自由羧基。

在本发明中多肽的氨基末端在左边，羧基末端在右边。在本发明中，多肽中的氨基酸在蛋白酶的切断处编号，编号随着羧基氨基的方向从切断处连续递增。

本发明所用的术语“残基”或“氨基酸”是指形成多肽的氨基酸。除非另有说明，本文中的氨基酸是指自然产生的氨基酸，或者是天然氨基酸的类似物，但与天然氨基酸性质相同。

本发明所用的术语“蛋白酶活性”或“蛋白酶的活性”是指多肽被蛋白酶切断。蛋白酶活性“消化”一个或多个多肽形成大量的更小的多肽片断。特异性的蛋白酶可以识别特定蛋白的位置并水解。特异性的蛋白酶可以通过多肽片断上的特异氨基酸末端来表征。

优选的，本发明的荧光指示剂是如下化合物：

Super Quencher 5-HVSFNFPQITH-C(Cyanine 5)；

Super Quencher 5-Gaba-SQNYPIVQ-Cy5；

RG(Cy5)-VSFNFPQITK-(Super Quencher 5)-R；

Ac-RG(Alexa Fluor 647)-SQNYPIVQK-(Super Quencher 5)-R-NH₂；或

RRG(DyLight 647)-S QNYPIVQK-(Super Quencher 5)-RR。

更优选的本发明荧光指示剂是Super Quencher 5-HVSFNFPQITH-C(Cyanine 5)：

下面，对本发明的荧光测试试剂，即HIV蛋白酶活性的荧光指示剂做详细描述。

“给体荧光发射团”和“受体淬灭剂”

荧光发射团吸收光子被激发，随后发射出波长更长的光。但是，在另一种叫作“受体或荧光淬灭剂”分子存在下，给体发射团发出的光被受体吸收从而淬灭了荧光信号。这样，用最好的荧光团/生色团配对，使给体的发射光谱与受体的吸收光谱有最大的重叠，从而使多肽骨架的HIV蛋白酶底物达到淬灭的最优化，给体/受体高效率的能量传递便于测定低浓度HIV蛋白酶活性。本发明就是利用荧光团/生色团的分子内有效能量传递作为测定荧光蛋白酶的指示剂。

“给体”和“受体”匹配的选择一般是根据受体分子的吸收光谱和给体分子的发射光谱尽可能的完全重叠。另外，受体的吸收光谱和给体的发射光谱尽可能在近红外区域(＞600nm)。荧光团因而能提供测定生物样品中HIV蛋白酶活性的信号，这些生物样品包括：生物体液，组织匀浆等类似物。发射光谱，吸收光谱以及许多荧光团的化学结构已有很多报道(例如：Molecularprobe公司的产品说明书：Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals，R.P.Haugland编辑，第9版)。

HIV蛋白酶的活性的荧光指示剂

本发明提供了一种新型的荧光测试试剂，用于测定样品中HIV蛋白酶的活性。这种荧光HIV蛋白酶指示剂通常由荧光发射团(给体)与一个荧光淬灭团(受体)分子通过多肽相连，这个多肽的特定氨基酸序列可被HIV识别并切断。给体发色团被特定波长的光激发后，发出波长更长的光。当给体发色团与受体分子距离足够近的时候，受体分子吸收了给体发色团发出的光，从而淬灭了给体荧光发射团的荧光信号。不管两个发色团是否相同，淬灭过程都会产生。如实施例1所示，在本发明中我们用两种不同的染料标定了多肽。用同样荧光发射团双标定的多肽也可以作为蛋白酶的指示剂。在给体发射团和受体之间巧妙设计的断裂，使得两个分子分离，从而终止了淬灭过程而使荧光增强。

本发明中的荧光发射团分子一个基本的应用就是，无论在实验室还是工业上都可以作为检测HIV蛋白酶活性的试剂。与许多其它酶一样，HIV蛋白酶随着时间活性降低，特别是以活性形式存放。另外，很多蛋白酶以非活性的前体存放(酵母)，在使用前必须水解特定的肽键，从而转化成活性的形式。因为活度总是变化并且HIV蛋白酶活性随时间而降低，因此在应用特定的蛋白酶前，非常有必要经常测定HIV蛋白酶的活性和活度质量。

传统的确认和量化HIV蛋白酶活性方法，是用HIV蛋白酶倍数级的培养基消化一段时间后，用HPLC测定消化的蛋白质的数量。这种方法耗时，需要昂贵的试剂，很多的步骤和相当大的工作量。与此形成鲜明对照的是，本发明的荧光试剂可以在数分钟内一步快速测定HIV蛋白酶的活性。即HIV蛋白酶只需简单加入和荧光试剂接触，接着检测荧光变化(例如：可用荧光计或者荧光微板读取仪)。

另外，由于测定HIV蛋白酶活性是在“试剂”溶液中，因此本发明的荧光化合物可以用来测定生物样品中HIV蛋白酶的活性。这里的“生物样品”是指来自生物体或生物体成分(例如：细胞)的样品。样品也可以是任何生物组织和体液。样品往往是直接来自患者的“临床样品”。这些样品包括：唾液，血液，血细胞(如：白细胞)，组织或细针状组织切片，尿液，腹液或胸膜液和细胞。生物样品也包括组织学上的冰冻切片的部分组织。

现有的荧光HIV蛋白酶指示剂的吸收是在紫外或可见区，因此在测定生物样品特别是在紫外区有吸收的生物样品时(如蛋白质)样品干扰很大。与此相反，本发明的荧光指示剂无论吸收还是发射都在近红外区(＞600nm)。这些信号是不会被背景分子吸收后淬灭干扰测定，因此非常利于生物样品的测定。

本发明中的荧光HIV蛋白酶指示剂中含有高效率的荧光发射团，当多肽底物被切断后可以释放出非常强的荧光信号。这种强的荧光信号可以用来测定低浓度的HIV蛋白酶的活性。因此发明中的荧光HIV蛋白酶指示剂特别适合测定HIV蛋白酶的活性。

本发明的另一目的是提供了所述荧光指示剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将所需多肽底物用荧光发色团进行修饰，将所需的荧光发射团接到多肽末端氨基上；和

(2)然后将含有荧光发射团的多肽与含有荧光淬灭团的分子偶联，得到所需的荧光指示剂。

本发明方法中，所述的多肽底物或称为多肽骨架可从市场上购得，例如可从Bachem和Novabiochem公司买到；也可以按照常规方法合成，例如按照FMOC化学标准方法合成。[例如可参见G Barany和R.B.Merrifield，Solid-phase peptide synthesis，in The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，Vol.2，Academic Press，p 3-284，1979年，New York；R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，卷85，p2149～2156；N.Y.，1980and Stewart等人，SolidPhase Peptide Synthesis，第二版，Gross和Meienhofer编辑，Academic press，Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill.(1984)]。

具体的，有两种方法可用来制备荧光HIV蛋白酶能切断的多肽底物，它们是预先标记法和后标记法。所述的预先标记法是用染料标记的氨基酸作为骨架，按照标准的多肽化学利用FMOC和t-BOC基团的保护，可以非常容易的将染料标记的氨基酸连接成多肽。许多染料标记的FMOC保护的氨基酸可以从市场上买到，例如可从泛博生物化学有限公司买到。另一种方法是后标记法，利用标准序列的多肽与活性染料反应得到。对于后标记法应首先制备荧光HIV蛋白酶的多肽骨架，即HIV蛋白酶的切割点(P)。荧光团和淬灭剂然后通过化学方法键连到多肽上，荧光团或者直接与多肽相连，或者通过连接剂(linker)与多肽相连。最后，将荧光蛋白酶指示剂直接或间接地通过化学键连接在一起。

多肽骨架的制备

利用固相合成制备多肽，C-末端氨基酸序列连接到不溶性支撑体上，然后依次加入氨基酸形成多肽，本发明正是采取此方法制备多肽骨架。关于固相制备技术Barany和Merrifield在这方面已作有大量报道，参考文献同上。目前，固相合成是商业上利用FMOC和t-BOC保护合成多肽最简单的方法。荧光HIV蛋白酶抑制剂多肽成分的化学合成是实例在实施例1和2中有详细描述。

现在普遍应用的多肽合成是利用FMOC合成化学来实现的。Asp，Ser，Thr和Tyr的侧链是用叔丁基保护，Cys的侧链残基是用S-三苯甲基(trityl)和S-叔丁基硫基保护，Lys残基是用t-Boc(叔丁氧羰基)，Fmoc(9-芴甲基羰基)和S-叔丁基硫基保护，所用的氨基酸保护剂都是可以买到的。多种保护基团的利用可以选择性的脱保护，从而将荧光团连接到预想的侧链位置上。例如：t-Boc可在二氯甲烷中用TFA脱保护；Fmoc可在20％哌啶DMF或N-甲基吡咯烷酮溶液中脱保护；4-甲基三苯甲基用1～5％的TFA水溶液和5％三异丙基硅烷在二氯甲烷中脱保护；S-叔丁基硫基使用10％的巯基乙醇的水溶液脱保护；叔丁基、t-Boc和S-三苯甲基可用TFA∶苯酚∶水∶苯硫醚∶二巯基乙醇(85∶5∶5∶2.5∶2.5)一起脱保护；叔丁基和t-Boc可用TFA∶苯酚∶水(95∶5∶5)一起脱保护；详细的合成、保护以及荧光团的连接过程在实施例1和2中通过实例进行了详尽的描述。

另外，荧光HIV蛋白酶指示剂的多肽合成也可利用DNA重组技术来合成。简单来说，就是将带有想要的氨基酸序列密码的DNA分子通过各种化学方法合成出来，这些方法包括Beaucage和Carruthers报道的磷酰亚胺法(Tetra.Letts.22：1859-1862(1981))；和Matteucci的磷酸三酯法(J.Am.Chem.Soc.，103：3185(1981))；商业上合成DNA的方法是采用的是β-腈乙基磷酰亚胺法合成。

如果必要的话，寡聚核糖核酸可以通过以下技术纯化，经典的纯化技术有：凝胶电泳，离交换色谱(如：Mono-Q column，Pharmacia-LKB，Piscataway，N.J.，USA)，或者反相高效液相色谱(HPLC)。蛋白质和多肽纯化方法的标准技术例如可参见Methods in Enzymology，Vol.182，Guide to ProteinPurification，M.Deutscher编辑，(1990)，p619-626。

寡聚核糖核酸可转换为双链DNA或者通过DNA聚合酶聚合，然后在启动子的控制下DNA插入到载体中，用来转化主体细胞表达氨基酸序列密码。克隆技术和多肽的表达技术有如下文献：

Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)；

Methods in Enzymology，Vol.152：Guide to Molecular Cloning TechniquesBerger和Kimmel编辑，San Diego：Academic Press，Inc.(1987)，

Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑，GreenePublishing and Wiley-lnterscience，New York(1987)。

荧光发射团和淬灭剂与多肽骨架的连接

按照常规方法将所需的荧光发射团接到多肽末端氨基上，然后将含有荧光发射团的多肽与含有荧光淬灭团的分子偶联，得到所需的荧光指示剂。

荧光发射团和淬灭剂可采用很多方式连接到多肽骨架上。例如可直接将荧光团的反应位点与多肽的反应位点如末端氨基或羧基相连，或者是氨基酸侧链的活性基团如巯基，羟基或羧基部分。许多荧光发射团和淬灭剂一般都含有合适的反应位点。而且，荧光发射团和淬灭剂的衍生物可提供连接其它分子的反应位点。带有反应官能团的荧光发射团和淬灭剂，可以从市场上买到。荧光发射团的衍生化只需要接上一个简单的取代基或者具有官能团的连接剂。

如上所述，荧光发射团和淬灭剂可直接与HIV蛋白酶指示剂的多肽骨架相连。例如：Cy5琥珀酰亚胺酯可通过氨基酸的α氨基与天门冬氨酸相连。Cy5荧光团的碘代乙酰胺可以通过与巯基反应而与半胱氨酸相连。这类结合方法已有很多报道。

本发明所使用的多肽空间长度，从空间构型上荧光团更适合与末端分别是氨基和羧基的多肽C₁或C₂氨基末端侧链上的活性基团连接。

多肽长度和固相支持物的选择

本发明中的荧光HIV蛋白酶指示剂的肽链可以在溶液中与固相支持物相连。本发明所用的术语“固相支持物”是指不溶于溶液或不与溶液中任何组分发生反应的固体材料。这些组分是指本发明中用来检测HIV蛋白酶活性荧光HIV蛋白酶指示剂的分子，和用来连接荧光分子的功能化基团。常用的固体材料有二氧化硅，可控孔度玻璃(CPG)，聚苯乙烯，聚苯乙烯/乳胶，羧基修饰的聚四氟乙烯，葡聚糖，聚糖的衍生物例如：含有氨基，羧基和巯基的琼脂，各种塑料如聚乙烯，聚丙烯酸等。另外，还可以使用“半固体支持物”，所述的“半固体支持物”例如是细胞和脂质体内的脂肪膜。固体支持物最好带有功能性基团(如：羟基，氨基，羧基，酯基和巯基)，以提供与多肽直接或间接相连的反应位点。

通过多肽骨架将底物连接到固相支持物上的时候，多肽骨架的长度可能会增加。本发明所述的氨基或羧基末端的多肽骨架空间约有2～50个氨基酸，优选的是2～20个氨基酸，更优选的是2～10个氨基酸长度。

多肽骨架中的有些氨基酸成分是用来为阻止不希望的相互作用，多肽骨架中用来作为连接用的氨基酸必须选择含支链的氨基酸(如Cys，Lys)，这些氨基酸很容易与连接剂或固相支持物偶合。

具体来讲，多肽骨架实际上通过连接剂与固相支持物相连。本发明所使用的术语“连接剂”是指用来连接多肽和其它分子(如：固相支持物，荧光团)的分子。连接剂是指含有不同或相同双官能团的分子，第一个反应点能够与多肽共价相连，第二个反应点能够与固相支持物的反应基团共价相连。多肽骨架的共价连接基团可以是末端氨基或羧基，也可以是氨基酸支链的氨基(如：通过双硫键与Cys相连)。

已报道的具有此功能的连接剂有：直链或支链的碳连接剂，杂环碳连接剂或多肽连接剂。如上所述，连接剂可与氨基酸末端的氨基和羧基或带反应活性的支链相连。

特别好的连接剂是能与氨基，羧基或巯基形成共价键。与氨基结合的连接剂包含的反应基团有：羧基，异氰酸酯，异硫氰酸酯，酯基，氯代烷烃等。与羧基结合的连接剂含有的反应基团有：各种氨，羟基等。最后，巯基连接剂的反应基团有：巯基，丙烯酸酯，异氰酸酯，异硫氰酸酯等。首选的连接剂有SulfoMBS(间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯)(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)，用来连接巯基固定在固相支持物上的氨基(特别是多肽上Lys支链上的氨基)；其它连接剂例如有EDC：1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropryl)-carbodiimide)和双-(磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯(bis-(sulfosuccinimidyl suberate)等。

本发明的另一目的是提供了一种用于检测HIV蛋白酶活性的试纸，该试纸是将本发明的HIV蛋白酶荧光指示剂吸附到固体支持物而形成的。

优选的，本发明用于检测HIV蛋白酶活性的试纸的基质是天然的或合成的，具有一定刚性的固体支撑物，优选的是纸或塑料薄膜。

本发明的另一目的是提供了测定HIV蛋白酶活性的方法，该方法包括使欲测定的蛋白酶样品和本发明的一种或多种荧光指示剂接触，然后测定所述的样品的荧光强度。本发明所用的术语“接触”是指欲测样品以固态、液态的形式与本发明的荧光指示剂接触或混合。本发明提供了试剂与样品接触测定蛋白酶HIV活性的方法，并且通过测定荧光基团荧光的变化来指示HIV蛋白酶的活性。

本发明测定HIV蛋白酶活性的方法包括以下步骤：

(1)将一定量的测试样品与本发明所述的HIV蛋白酶荧光指示剂或试纸接触或混合；

(2)测定所述样品与本发明所述的HIV蛋白酶荧光指示剂或试纸接触或混合后的荧光强度值，以本发明所述的HIV蛋白酶荧光指示剂或试纸本身的荧光强度值为空白，计算所测试样品的HIV蛋白酶的活性。

在应用上述方法测试HIV蛋白酶的活性时，可用HIV蛋白酶/指示剂的标准曲线来量化，所述的标准曲线可通过测定已知活性的HIV蛋白酶溶液产生的荧光变化速率来绘制。

当所述于测定样品是组织样品时，所述的“接触”或“混合”时间即是温育时间，使生长的HIV蛋白酶切断荧光HIV蛋白酶指示剂。通常该温育时间为10～60分钟，温度≥37℃，优选37℃～38℃。

本发明所例举的荧光指示剂都可以用来测定样品中HIV蛋白酶的活性。样品可以是“储存”有HIV蛋白酶的样品，例如用于研究或工业生产的样品，也可以是生物样品。所述的样品可以是组织切片，或悬浮的细胞，或是含有生物体液的样品，例如唾液、血液、活组织切片组织样品，或是上述各种样品的代谢产物的细胞样品，即是来自组织、血液、尿液、唾液或其他生物体液、淋巴和活组织切片中的代谢产物，特别是部分组织，代谢细胞，代谢组织等。所述样品的测定可以组织切片、细胞悬浮液、培养基溶液等各种形式进行。

检测方法包括使用荧光显微镜、酶标仪、流式细胞仪、荧光计或吸收光谱，优选使用分光荧光计或采用荧光检测器的HPLC方法检测荧光的变化。设定分光荧光计激发给体荧光团的激发波长，并检测其发射波长处产生的荧光，然后进行对比和计算。

本发明的荧光指示剂的吸收或是发射都在近红外区(＞600nm)。因此，本发明的测定方法中，所述的检测在近红外区(＞600nm)进行。

优选的，本发明利用荧光HIV蛋白酶底物测定HIV蛋白酶活性的方法还提供了在实验室和工业上利用荧光抑制剂检验或定量测定HIV蛋白酶活性，特别是HIV蛋白酶储存液活性的方法。实践中，在使用前检验HIV蛋白酶储存液活性是非常必要的，因为HIV蛋白酶活性常常随着时间而降低(例如：通过自身水解)，并且可以显示酵母菌前体活化后活度的变化。

只需将一定量的HIV蛋白酶的备用液加入到本发明的荧光HIV蛋白酶底物中，就可通过检测荧光的增长来检测。备用液和荧光指示剂也要在优化的HIV蛋白酶的活性“消化缓冲液”内使用和检测。适合测定HIV蛋白酶活性的缓冲溶液已有很多报道。通常，选择的缓冲溶液pH值是HIV蛋白酶最适合的pH值。测量可以用荧光计，这个装置有激发荧光分子的光源，并能测定随后发出的特定波长的光。与可调的不含HIV蛋白酶指示剂溶液相比较，可以得到HIV蛋白酶的活性。活性水平可以用HIV蛋白酶/指示剂的标准曲线来量化，标准曲线可通过测定已知活性的HIV蛋白酶溶液产生的荧光变化速率来绘制。

荧光化合物的测定最好用荧光计测定，也可通过其它已知的方法测定。例如：本发明中的荧光团发出的是可见光，肉眼就能观测到荧光的变化；也可通过接有数码转换器的相机进行镜像分析来测定；也可通过滤光器在荧光显微镜下进行测定，荧光显微镜只是给操作者提供一个形象的信号，但是这个信号可以被胶片或视频分析系统记录，信号也可以非常容易的被镜像分析仪或光度计量化。

在检测样品中HIV蛋白酶活性时，将样品悬浮或溶解在缓冲溶液中(待检测的HIV蛋白酶最适宜的pH值)，将本发明中的一种荧光HIV蛋白酶指示剂加入到此缓冲溶液中，并用分光荧光计检测荧光的变化。设定分光荧光计激发给体荧光团的激发波长，并检测其发射波长处产生的荧光。

本发明中的HIV蛋白酶指示剂同样可用来检测生物样品中HIV蛋白酶的活性。特别指出的是，本发明的HIV蛋白酶指示剂可测定分离出的生物样品中HIV蛋白酶的活性，这些生物样品包括：唾液，血液，血细胞，肿瘤切片等，以及培养基中的细胞和组织等。这些信号可以被荧光显微镜，荧光微板读取计，荧光计和流式细胞仪量化。

下面对检测分离的生物样品中HIV蛋白酶活性的方法进行详细描述。

分离生物样品的化验

本发明提供了检测分离的生物样品中HIV蛋白酶活性的方法，可以通过样品与本发明中荧光HIV蛋白酶指示剂简单的接触，随着时间变化检测指示剂荧光的变化。样品可以悬浮在以上所述的“消化缓冲液”中；也可以是透明的细胞残骸，例如在分析前进行离心分离。

本发明的荧光HIV蛋白酶指示剂也可以被吸附到固体支持物上的，吸附有指示剂的固体支持物在化验时与样品溶液接触。由于指示剂的消化作用而产生的荧光随时间的变化可通过以上所述的任何方式进行检测。组织切片的原位检测

本发明还提供了组织切片原位检测HIV蛋白酶活性的方法。这种检测HIV蛋白酶活性的方法与以前的方法(如：染色和抗体标记)相比有明显的优势，与简单标记的方法不同的是，原位检测的方法用的是HIV蛋白酶指示剂指示真实的活性，而不是简单指出HIV蛋白酶是否存在。HIV蛋白酶常常以非活性的前体(酶原)存在于组织中，这种前体是可以与HIV蛋白酶标记物结合的，传统的标记方法无法提供生理状态的信息和组织中HIV蛋白酶当时的活性信息。

原位检测的方法一般包括：提供组织切片(特别是冷冻组织切片)，与组织切片接触的本发明中的荧光HIV蛋白酶，肉眼观测到的荧光结果。利用荧光显微镜可进行清楚的观察。荧光显微镜的“激发”光源引发“给体”荧光团发出荧光，荧光显微镜装备有滤光片优化荧光的检测。

有多种方法可将荧光指示剂引入到组织切片中。例如：如上所述在缓冲溶液中放入荧光蛋白酶指示剂，来检测组织切片。另外，荧光蛋白酶指示剂可放在半固体介质如凝胶或琼脂，这种介质可在组织样品上扩散。在提供了HIV蛋白酶活性信号的同时，凝胶保持了样品的潮湿度。荧光HIV蛋白酶指示剂也可以接到聚合物上如塑料膜，步骤类似于Western Blots方法。将塑料膜放到组织切片的样品上滑动，在显微镜下观测指示剂分子在样品组织中被切断而产生的荧光。

通常，组织样品必须温育一段时间，让生长的HIV蛋白酶切断荧光HIV蛋白酶指示剂。温育时间为10～60分钟，温度37℃～38℃。

培养基细胞和组织切片细胞悬浮液的原位检测

另外的一个具体例子是，本发明提供了一种培养基细胞和组织切片细胞悬浮液的原位检测的方法，这些细胞来自组织切片样品，或生物体液(如：唾液，血液，尿液，血浆等)。培养细胞可以是在细胞培养板中培养的，或者是组织切片中的悬浮细胞经离心过滤得到的。同样地，细胞的悬浮溶液按照标准方法制备并转移到组织切片上。切片用磷酸盐的盐水缓冲液洗涤，然后用半固体聚合物或用含荧光HIV蛋白酶指示剂覆盖。切片在37℃培养必要的时间以利于HIV蛋白酶的生长来切断HIV蛋白酶指示剂。然后，如前所述，用装备有合适的滤光器的荧光显微镜检测切片。

另一种方法是将细胞在37℃与HIV蛋白酶指示剂培养后，用缓冲溶液洗涤，然后转移到毛细管中，在荧光显微镜下观测。用流式细胞仪量化细胞内酶的活性时，带荧光指示剂的细胞在37℃培养后，用缓冲溶液简单洗涤后分析。

本发明的又一目的是提供了一种应用本发明的荧光指示剂筛选HIV蛋白酶抑制剂的方法。使用该方法可以高通量筛选HIV蛋白酶抑制剂，这在研制治疗艾滋病新药时具有极大的实际应用价值。

具体的，本发明筛选HIV蛋白酶抑制剂的方法包括以下步骤：

(1)在没有“测试物”存在的情况下，按照本发明测定HIV蛋白酶活性的方法，测定某一HIV蛋白酶的活性，作为空白实验；

(2)在有“测试物”存在的情况下，按照本发明测定HIV蛋白酶活性的方法，测定该HIV蛋白酶的活性；和

(3)通过比较步骤(1)和步骤(2)所得到的所述HIV蛋白酶的活性，计算和评述上述“测试物”对HIV蛋白酶的抑制作用。

根据所述方法，通过各种“测试物”对HIV蛋白酶活性抑制作用的比较，筛选出可以作为HIV蛋白酶抑制剂的“测试物”。

通过以上描述可以看出，应用本发明的荧光指示剂可以简单快速的测定HIV蛋白酶的活性，和筛选HIV蛋白酶抑制剂。本发明的荧光指示剂的应用将对抗艾滋病药物的开发具有非常重要的意义。

附图说明

图1A是泛博生化Super Quencher 5在甲醇溶液(0.5uM)中的吸收光谱；图2B是Cyanine 5在甲醇溶液(0.1uM)中的发射光谱。这两个光谱重叠得非常好，说明两者之间具有最大的荧光共振能量转移效率。

图2显示了荧光蛋白酶指示剂的荧光强度随酶反应时间的变化。

图3表示在不同的HIV蛋白酶抑制剂存在下，HIV蛋白酶受到抑制后荧光蛋白酶指示剂的荧光增长。

具体实施方式

本发明通过以下实例进行详细说明。这些实例是为了能够更清楚全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1本发明荧光指示剂的合成

按照下述反应流程合成具有下述化合物10结构的HIV蛋白酶的近红外荧光指示剂。

将从Bachem公司购买的HIV多肽HVSFNFPQITH溶解在二甲亚砜(DMSO)中，浓度为5mg/mL；将从北京泛博生物化学有限公司购买的Cyanine5碘化乙酰胺(型号为#1054)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，浓度为10mg/mL。然后，将上述0.1mL的多肽DMSO溶液与0.1mL染料DMF溶液在室温混合，向其中加入与染料等当量的二异丙基乙基胺，得到的混合物在室温搅拌6～12小时。

(1)合成多肽骨架

多肽骨架即可从Bachem和Novabiochem公司买到，也可以按照FMOC化学标准方法合成。合成的多肽用温和的酸(乙酸∶二氯甲烷∶三氟乙酸体积比＝2∶7∶1)在室温下处理30分钟，就可以从2-氯三苯甲基氯的树脂上切割下来。合成中所涉及到的支链保护基包括：保护Asp，Ser，Thr，and Tyr残基的叔丁基，保护Cys残基的S-三苯甲基和S-叔丁基硫基，以及保护赖氨酸残基的t-Boc，Fmoc和4-甲基三苯甲基。

支链保护基和FMOC基团在合成多肽的α-氨基上，不会被温和酸从多肽树脂上用试剂切割下来。含保护基的多肽溶液被冻干，冻干后的多肽进一步用30％TFA(三氟乙酸)二氯甲烷溶液处理，以脱掉t-Boc，20％哌啶的DMF或者N-甲基吡咯烷溶液脱掉Fmoc保护基，1～5％(v/v)TFA水溶液，或1％TFA/5％三异丙基硅烷二氯甲烷溶液脱掉4-甲基三苯甲基保护基，10％巯基乙醇溶液脱掉S-叔丁基硫基，用TFA∶苯酚∶水∶甲硫酚∶二巯基乙烷＝85∶5∶5∶2.5∶2.5脱掉叔丁基，t-Boc和S-三苯甲基，用TFA∶苯酚∶水＝90∶5∶5脱掉叔丁基和t-Boc基团。

完全或部分脱掉支链的多肽后用C18反相柱HPLC纯化，以含0.075％TFA的水/乙腈为流动相进行梯度洗脱。

然后，得到的多肽用给体发色团和受体淬灭剂进行修饰。

(2)引入荧光发射团

将从Bachem公司购买的HIV多肽或按照上述方法制备的多肽溶解在二甲亚砜(DMSO)中，浓度为5mg/mL；将从北京泛博生物化学有限公司购买的Cyanine 5碘化乙酰胺(泛博生化公司生产，型号为#1054)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，浓度为10mg/mL。然后，将上述0.1mL的多肽DMSO溶液与0.1mL染料DMF溶液在室温混合，向其中加入与染料等当量的二异丙基乙基胺(DIEA)，得到的混合物在室温(37℃)搅拌6～12小时。

首先将Cyanine 5给体发射团接到带末端氨基的多肽上。将多肽和荧光探针按照摩尔比1∶5溶解到尽可能少的N-甲基吡咯烷(NMP)中，一般为20～60uL。1摩尔等当量的二异丙基乙基胺(DIEA)也加入到反应混合物中。反应在37℃维持6～12小时。

(3)引入荧光淬灭团

将上述已经引入荧光发射团(Cyanine 5)的多肽与含有荧光淬灭团的分子(Super Quencher 5)偶联导入淬灭团。该偶联反应是通过多肽的氨基与Super Quencher 5活性酯(琥珀酰亚胺酯)进行。

具体地是，将HPLC纯化的多肽与Super Quencher 5的活性酯以3∶1的比例混合。反应混合物于室温搅拌6～12小时，然后用Waters的HPLC分离纯化，得到的最终产物即本发明的荧光测试试剂。其中所述HPLC的分离条件是：C3的分析用的反相柱，0.1％TFA/乙腈梯度洗脱，流速1mL/min。

上述产品的分子量是通过基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(KratosAnalytical公司Kompact MADLI I)进行测定的。质谱仪用Leucine-Enkaphelin(556.6amu)，Bradykinin(1061.2amu)，和Mellitin(2847.5amu)进行了校准。辅助样品是α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)。将样品放到靶上，1mL 0.1％TFA的乙醇溶液滴到靶上后干燥。数据经50次累计，每个样品峰加1代表分子离子峰。实验数值和计算数值吻合的非常好表明最终纯化的荧光团结合的多肽没有任何副反应产物。

实施例2本发明荧光指示剂的制备

按照与实施例1类似的方法，采用相应的原料，制备下述荧光指示剂：

Super Quencher 5-Gaba-SQNYPIVQ-Cy5；

RG(Cy5)-VSFNFPQITK-(Super Quencher 5)-R；

Ac-RG(Alexa Fluor 647)-SQNYPIVQK-(Super Quencher 5)-R-NH₂；

和

RRG(DyLight 647)-SQNYPIVQK-(Super Quencher 5)-RR。

实施例3应用本发明的荧光蛋白酶指示剂测定HIV蛋白酶活性

为了证明本发明中的荧光蛋白酶指示剂非常容易被HIV蛋白酶消化分解，我们用实施例1制备的化合物10为底物，分析了在HIV蛋白酶存在下化合物10的荧光强度变化。

化合物10的DMSO备用液用缓冲溶液稀释到荧光HIV蛋白酶指示剂浓度在5～10uM之间(缓冲溶液是用50mM醋酸钠，1M NaCl，1mM EDTA，1mM二巯基乙醇和1mg/mL BSA配制的，pH＝5.4)。向此溶液中加入10个单位的HIV蛋白酶(35nM)开始酶的反应。同时，在加入HIV蛋白酶之前和之后30min进行HPLC分析。HIV蛋白酶消化反应在37℃进行。HPLC分离的样品在650nm检测，多肽片断上的荧光团和淬灭剂都可被检测。

分析结果见图2，图2的谱图显示了荧光蛋白酶指示剂的荧光强度随酶反应时间的变化。其中1表示没有HIV蛋白酶时的曲线；2表示有HIV蛋白酶时的曲线，两者均是孵化10分钟后的结果。由图2可以看出，在HIV蛋白酶的作用下，荧光HIV蛋白酶指示剂水解使体系的荧光强度随时间而增强，根据此结果可以确认的是，本发明的HIV蛋白酶底物可以被用来快速检测HIV蛋白酶活性。

实施例4用本发明的荧光HIV蛋白酶指示剂筛选HIV蛋白酶抑制剂

本实施例中，在有或没有荧光蛋白酶在抑制剂的情况下分别进行了实验，用于本实施例的HIV多肽抑制剂2-5的是氨基酸序列为SQNYPIVQ、TATIMMQRGE、RVSFNFPQITR和ATLNFPISQE的多肽。

所用的所有HIV多肽抑制剂的浓度都是10uM。

将含有方程式II，III的不同荧光HIV指示剂的DMSO备用液用缓冲溶液稀释到荧光HIV蛋白酶指示剂浓度为10uM(缓冲溶液是用50mM醋酸钠，1M NaCl，1mM EDTA，1mM二巯基乙醇和1mg/mLBSA配置的，pH＝5.4)。向此溶液中加入10个单位的HIV蛋白酶(35nM)和HIV蛋白酶抑制剂开始酶的反应。在加入HIV蛋白酶之前和之后30分钟进行荧光强度分析。

结果如图3所示，图3说明了存在和不存在荧光蛋白酶抑制剂的情况下的实验结果。比较HIV蛋白酶底物荧光变化，在不同的HIV蛋白酶抑制剂存在下，HIV蛋白酶受到抑制后荧光蛋白酶指示剂的荧光增长，荧光强度变化大小与HIV蛋白酶抑制剂的强弱直接相关，相对荧光强度越低说明HIV蛋白酶抑制剂活性越强。根据上述实验结果，即可对HIV蛋白酶抑制剂进行评价。因此，通过此方法用本发明的荧光HIV蛋白酶指示剂可筛选HIV蛋白酶抑制剂。

以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。本文中所引用的所有出版物、专利和专利公开文献均全文引用作为参考。

Claims (10)

1、一种荧光指示剂，该指示剂可增强HIV蛋白酶的荧光强度，具有下述通式结构：

荧光淬灭剂——多肽链——荧光发射团 ......................(I)

其中所述的荧光淬灭剂是最大吸收波长大于600nm的非荧光染料；所述的多肽链是含有HIV蛋白酶氨基酸的聚合物，可被HIV蛋白酶诱导水解；所述的荧光发射团是最大发射波长大于600nm的荧光染料。

2、按照权利要求1所述的荧光指示剂，其中所述的多肽链含有2个到50个可被HIV蛋白酶识别并切断的氨基酸；优选所述的多肽链含有2～20个氨基酸；更优选含有2～10个氨基酸；最优选的多肽链是选自以下的片段：HVSFNFPQITH；Gaba-SQNYPIVQ；VSFNFPQITK或SQNYPIVQK。

3、按照权利要求1所述的荧光指示剂，其中所述的荧光发射团选自菁染料、罗丹明及其衍生物、荧光素及其衍生物、香豆素和镧系元素螯合物中的一种或多种；优选的荧光发射团选自Cy5、Cy 5.5、Cy7、Cyanine5、AlexaFluor 647、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 750、Super Fluor 647、Super Fluor 680或Super Fluor 750；更优选的荧光发射团是Cy5或Cyanine5；以及其中所述的荧光淬灭剂选自偶氮染料、蒽醌类化合物、酞菁染料和重金属络合物；优选的荧光淬灭剂是Super Quencher 5。

4、按照权利要求1-3任意一项所述的荧光指示剂，其中所述的荧光指示剂是：

Super Quencher 5-HVSFNFPQITH-C(Cyanine 5)；

Super Quencher 5-Gaba-SQNYPIVQ-Cy5；

RG(Cy5)-VSFNFPQITK-(Super Quencher 5)-R；

Ac-RG(Alexa Fluor 647)-SQNYPIVQK-(Super Quencher 5)-R-NH₂；或

RRG(DyLight 647)-SQNYPIVQK-(Super Quencher 5)-RR；

其中优选的荧光指示剂是Super Quencher 5-HVSFNFPQITH-C(Cyanine 5)。

5、用于检测HIV蛋白酶活性的试纸，该试纸是将权利要求1-4任意一项所述的HIV蛋白酶荧光指示剂吸附到固体支持物而制成的；优选的，所述试纸的基质是纸或塑料薄膜。

6、按照权利要求1-4任意一项所述荧光指示剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将所需多肽底物用荧光发色团进行修饰，将所需的荧光发射团接到多肽末端氨基上；和

(2)然后将含有荧光发射团的多肽与含有荧光淬灭团的分子偶联，得到所需的荧光指示剂；

其中所述的多肽底物可按照常规方法合成。

7、测定HIV蛋白酶活性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将一定量的测试样品与权利要求1-4任意一项所述的HIV蛋白酶荧光指示剂或权利要求5的试纸接触或混合；和

(2)测定步骤(1)所述接触或混合后样品的荧光强度值，以权利要求1-4任意一项所述的HIV蛋白酶荧光指示剂或权利要求5的试纸本身的荧光强度值为空白，计算所测试样品的HIV蛋白酶的活性；

其中所述的荧光指示剂的吸收或是发射都在近红外区(＞600nm)；

其中HIV蛋白酶的活性可用HIV蛋白酶/指示剂的标准曲线来量化，所述的标准曲线可通过测定已知活性的HIV蛋白酶溶液产生的荧光变化速率来绘制；以及

其中所述的HIV蛋白酶活性的检测可用荧光显微镜，酶标仪，流式细胞仪，荧光计或吸收光谱实施，优选分光荧光计法或采用配备荧光检测器的HPLC方法。

8、按照权利要求7所述的测定方法，其中所述的测试样品可以是用于研究或工业生产的样品，或是生物样品；优选的，其中所述的生物样品可以是组织切片，悬浮的细胞，或是含有生物体液的样品；所述的生物体液可以是来自组织、淋巴、血液、尿液、唾液或其他的生物体液，或是上述各种样品的代谢产物；更优选的其中所述的生物样品可以是组织切片、细胞悬浮液或培养基溶液的形式。

9、按照权利要求8所述的测定方法，其中所述的测试样品是生物样品时，所述样品需要与与权利要求1-4任意一项所述的HIV蛋白酶荧光指示剂一起温育10～60分钟，温育温度37℃～38℃。

10、筛选HIV蛋白酶抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：

(1)在没有“测试物”存在的情况下，按照权利要求7-9任意一项所述测定HIV蛋白酶活性的方法，测定某一HIV蛋白酶的活性；

(2)在有“测试物”存在的情况下，按照权利要求7-9任意一项所述测定HIV蛋白酶活性的方法，测定该HIV蛋白酶的活性；和

(3)通过比较步骤(1)和步骤(2)所得到的所述HIV蛋白酶的活性，计算或评述上述“测试物”对HIV蛋白酶的抑制作用。

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