CN114137213A

CN114137213A - 一种体外检测ogt酶活性的方法

Info

Publication number: CN114137213A
Application number: CN202111418128.6A
Authority: CN
Inventors: 袁脉; 施杰
Original assignee: Wuxi Medicos Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuxi Medicos Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2022-03-04

Abstract

本发明公开了一种体外检测OGT酶活性的方法，即体外检测O‑连接‑N‑乙酰氨基葡萄糖基转移酶OGT的酶活性的方法，该方法构建成本低，操作简单，检测灵敏度高。本发明公布的方法包括步骤：1)OGT高活性底物多肽ZO3‑S371A的合成及纯化；2)OGT底物多肽ZO3‑S371A的偶联固定及非特异性位点的封闭；3)OGT对底物多肽的糖基化修饰4)通过WGA‑FITC或WGA‑HRP检测OGT糖基化的底物多肽。本发明所述的方法，底物多肽的活性高，制备成本低，检测操作简单，灵敏度高，可用于体外测定表达纯化的OGT及病理组织来源样品中OGT的酶活性，也可以用于评价OGT抑制剂药物的活性。

Description

一种体外检测OGT酶活性的方法

技术领域

本发明属于生物化学分析检测技术领域，具体涉及一种体外检测OGT酶活性的方法，即一种O-连接-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶OGT的酶活性的检测方法。

背景技术

O-连接-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶OGT负责催化真核细胞内蛋白质丝氨酸和苏氨酸侧链羟基的O连N-乙酰-葡糖胺修饰，简称为O-GlcNAc糖基化修饰。人体内能够被OGT酶介导O-GlcNAc糖基化修饰的底物蛋白质数量多，且涉及人体细胞活动和生物反应的多个层面，参与调控涉及STAT3、p53等重要转录因子介导的基因表达、调控组蛋白和细胞周期蛋白等介导的细胞周期、通过直接或者间接的细胞内底物蛋白质修饰控制细胞内关键蛋白或酶的生物活性而影响细胞内信号通路的转导和活性，最终影响人体的基本生理功能和病理变化反应。人体体内正常水平的O-GlcNAc糖基化修饰支持细胞生理活动的正常调控，而异常体内异常的O-GlcNAc糖基化修饰水平与多种肿瘤的发生发展有着紧密联系。肿瘤病理组织样本研究已经证明，在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌等肿瘤细胞中都呈现有过度的OGT酶活性及其介导的高度 O-GlcNAc糖基化修饰。因此，OGT酶活性的检测及其抑制剂的发现是开发其相关肿瘤诊断方法和药物的关键。

目前市场在售的OGT酶活性检测试剂盒非常有限，其中一款为基于生物冷发光的UDP-Glo检测方法，其是通过对OGT酶反应副产物UDP的间接检测，容易受到样品中UDP的干扰，且其生产成本和销售价格较高。学术研究中常用的OGT酶活性检测方法有液相色谱法、质谱法、荧光偏振法、点击化学法等。液相方法是对OGT糖基化底物极性改变的检测，质谱法是对OGT糖基化底物分子量改变的检测，两种方法对样品的前处理要求较高，很容易受到样品中其他物质的干扰。荧光偏振法中涉及到对供体底物或受体底物的修饰，不能体现OGT 的天然酶活性，且荧光底物合成较为繁琐。点击化学方法中利用非天然的OGT 酶供体底物如叠氮功能化修饰的UDP-GlcNAz，随后采用炔基功能的信号分子与其发生点击化学反应来检测OGT酶活性的方法，但该法涉及的化学合成步骤繁琐，其中叠氮的合成过程中存在安全隐患，同时生产成本较高，并且非天然的供体底物不具有与天然底物同样的活性。此外，也有报道以同位素标记的供体底物来检测OGT对底物蛋白质的活性，但其具有潜在的放射性危害，对环境不友好，对设备环境等要求很高，难以推广使用。

发明内容

发明目的：为了克服现有OGT酶活性检测技术中存在的缺陷和技术瓶颈，并提高OGT酶活检测技术的灵敏度和准确度，本发明提供了一种体外检测OGT 酶活性的方法，即一种基于OGT酶天然高活性底物多肽和生物化学发光原理的 OGT酶活性检测方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明是一种简单且高灵敏度的OGT酶活性的检测新技术。首先，设计并通过多肽固相合成方法制备天然的高活性OGT底物多肽ZO3-S371A，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；然后，将OGT底物多肽酶ZO3-S371A通过其氨基末端的半胱氨酸固定于含有马来酰亚胺的96孔酶标板；然后，在96孔板中加入半胱氨酸封闭液封闭96孔板未反应的马来酰亚胺基团；最后利用辣根过氧化物酶标记的麦芽凝集素WGA-HRP或荧光标记的麦芽凝集素WGA-FITC对含有 O-GlcNAc修饰的多肽进行标记，并进行随后的发光检测读取OGT酶活性。

本发明的目的一个在于，提供一种用于体外检测OGT酶活性的方法，该方法具体包括以下步骤：

1)OGT底物多肽的制备；

2)OGT底物多肽的偶联固定及非特异性位点的封闭；

3)加入含有待测样品的OGT酶样品反应体系，对OGT底物多肽进行糖基化修饰；

4)通过生物化学发光检测法检测糖基化的OGT底物多肽，所述生物化学发光检测法包括辣根过氧化物酶凝集素标记发光法，也可以用荧光分子凝集素标记发光法，此外，还包括基于抗体标记发光法。

进一步的，在本发明实施例中，步骤1)中，所述OGT底物多肽为ZO3-S371A，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步的，在本发明实施例中，所述底物多肽ZO3-S371A通过市售UDP-Glo 方法测定的的活性不低于60000RLU。

进一步的，在本发明实施例中，所述底物多肽ZO3-S371A通过市售UDP-Glo 方法测定的的活性为74500RLU。

进一步的，在本发明实施例中，步骤1)中，所述OGT底物多肽的制备包括OGT底物多肽的固相合成及纯化。

进一步的，在本发明实施例中，所述OGT底物多肽ZO3-S371A经固相合成所得，包括以下步骤：以5-100mM氨基树脂为固相合成载体，使用固相合成仪按照SEQ ID No.2的序列进行合成，序列中涉的所有氨基酸均为标准氨基酸，所有氨基酸的氨基端均含有Fmoc保护基团，合成完成后在强酸条件下脱去保护基团，经半制备HPLC纯化所得。

进一步的，在本发明实施例中，步骤2)中，所述OGT底物多肽的氨基末端含有具有固定作用的第一功能基团，所述OGT底物多肽通过所述第一功能基团与吸附有第二功能基团的载体材料反应，进行固定、封闭，

所述第一功能基团、第二功能基团为能够发生点击化学反应的成对基团，包括半胱氨酸与马来酰亚胺基团、氨基与活化脂、端基炔及叠氮，

所述载体材料包括96-孔板、磁珠、芯片；

当所述OGT底物多肽的氨基末端含有半胱氨酸时，所述OGT底物多肽通过半胱氨酸巯基与所述载体材料的马来酰亚胺基团反应，进行固定、封闭。

进一步的，在本发明实施例中，步骤2)中，所述OGT底物多肽的氨基末端含有半胱氨酸，所述OGT底物多肽通过半胱氨酸巯基与96-孔板的马来酰亚胺基团反应进行固定、封闭。

进一步的，在本发明实施例中，所述的高活性OGT底物多肽的固定、封闭方法，包括以下步骤：

2.1)将所述的OGT底物多肽溶解于固定缓冲液，该固定缓冲液含有0.05-0.50 mMNa₃PO₄，0.05-0.5mM NaCl，1-100mM EDTA，pH 7.0-7.5，OGT多肽底物的浓度为10-100ug/ml；

2.2)将步骤2.1)中的OGT底物多肽溶液与含有马来酰亚胺的载体材料进行孵育，时间0.5-4h，温度为4-37℃；

2.3)将步骤2.2)孵育完成后的载体材料用洗涤缓冲液漂洗；

2.4)加入5-50ug/ml的半胱氨酸缓冲液，对上述步骤2.3)的载体材料进行孵育封闭，时间0.5-2h，温度为4-37℃。

进一步的，在本发明实施例中，所述洗涤缓冲液含有0.05-0.50mM Na₃PO₄， 0.05-0.5mM NaCl，0.01-0.1％tween-20，pH 7.0-7.5。

进一步的，在本发明实施例中，步骤3)中，所述OGT酶样品反应体系包括OGT酶反应缓冲液、OGT酶供体底物UDP-GlcNAc及OGT酶样品，

所述OGT酶反应缓冲液为1-100mM Tris-HCl，0.1-100mM DTT，10-125 mM MgCl₂，

所述OGT酶供体底物为UDP-GlcNAc或与UDP-GlcNAc类似的人工修饰物，所述OGT酶供体底物的浓度为50-1000uM。

进一步的，在本发明实施例中，OGT酶反应缓冲液为1-100mM Tris-HCl， 0.1-100mM DTT，10-125mM MgCl₂。

进一步的，在本发明实施例中，OGT酶供体底物UDP-GlcNAc浓度为50-1000 uM。

进一步的，在本发明实施例中，步骤3)中，所述糖基化修饰是指OGT酶样品与载体材料进行孵育，所述孵育的时间为1-12h，温度为12-37℃。

进一步的，在本发明实施例中，步骤4)中，所述凝集素标记发光法包括 WGA-FITC荧光信号检测法或WGA-HRP酶促显色检测法；

所述WGA-FITC荧光信号检测法的检测限为5ug/ml，所述WGA-HRP酶促显色检测法的检测限为3.125ug/ml。

进一步的，在本发明实施例中，所述WGA-FITC浓度1-20ng/ml与96-孔板的孵育时间为0.5-2h，温度为16-37℃。

进一步的，在本发明实施例中，酶标仪检测WGA-FITC荧光信号的检测，设定的激发波长为485-500nM，发射波长为510-520nm。

进一步的，本发明实施例中，所述的WGA-HRP浓度为1-20ng/ml与96- 孔板的孵育时间为0.5-2h，温度为16-37℃。

进一步的，在本发明实施例中，孵育完成后加入TMB底物20-100uL，孵育时间为5-20min，温度为16-37℃。随后加入50-200uL的2M H₂SO₄终止反应。

进一步的，在本发明实施例中，酶标仪检HRP酶反应的吸光值，设定的波长为610-630nm。

进一步的，在本发明实施例中，所述基于抗体标记发光法的的检测限为0.3125ug/ml。

本发明的另一个目的在于，提供上述的方法在体外检测OGT酶活性中的应用。

本发明的另一个目的在于，提供一种体外检测OGT酶活性的装置，使用上述的方法，所述装置包括检测板、检测盒及试纸条。

有益效果：本发明提供的用于检测OGT酶活性的方法，与现有技术相比，具有以下优势：本发明提供了一个高活性的OGT底物多肽，利用化学定点修饰方法高效的固定于包括96-孔板在内的载体材料，通过能够识别O-GlcNAc糖基化修饰多肽底物的凝集素来识别被OGT糖基化修饰的底物多肽。该方法具有稳定性好，操作简便，成本低、检测信号强度高、灵敏度高等优点。本发明提供的方法解决了现有OGT酶活性检测方法易受样品干扰、工艺复杂、成本高等问题，既可以实现对纯化的OGT酶活性的检测也可以对粗酶活性进行检测，可用于 OGT抑制剂类药物活性的评价也可用于肿瘤组织样本OGT酶活性的检测，为基于OGT酶的肿瘤精准诊断和治疗提供了可靠有效的技术支撑。本发明公开的 OGT酶活性检测方法，操作简单、成本低、转化效率高、绿色环保、无有毒有害物质排放。

附图说明

图1为本发明技术路线示意图。

图2为OGT多肽底物ZO3-S371A经半制备HPLC纯化后的HPLC纯度分析图谱。

图3为OGT多肽底物ZO3-S371A的质谱图。

图4为通过WGA-HRP检测糖肽，并比较其区分糖基化底物多肽和非糖基化底物多肽的选择性。ZO3-S371A为本发明制备的OGT底物多肽， ZO3-S371A-O-GlcNAc为糖基化的OGT底物多肽。

图5为通过WGA-FITC检测糖肽的关键数据。

图6为关于抗体标记显色法检测OGT糖基化的多肽的关键数据。

具体实施方式

本发明公开了一种用于体外检测OGT酶活性的方法，具体涉及一种基于固定化的OGT高活性底物多肽结合WGA-FITC发光或WGA-HRP显色或基于抗体标记发光法的OGT酶活性检测方法，如图1所示，以OGT底物多肽ZO3-S371A 为例，该方法的制备及其应用包括步骤：

1、氨基末端含有半胱氨酸的OGT高活性底物多肽制备。

2、将步骤1制备的OGT高活性底物多肽通过半胱氨酸巯基和96-孔板的马来酰亚胺基团反应进行固定。

3、将步骤2中的96-孔板与半胱氨酸进行孵育封闭未被使用的马来酰亚胺基团。

4、配置OGT酶样品反应体系：包括OGT酶反应缓冲液，OGT的酶反应供体底物UDP-GlcNAc，含有OGT酶的待测样品。

5、步骤4中的反应体系与步骤3中的96孔板进行孵育，酶反应结束后被 OGT催化的底物多肽含有O-GlcNAc底物多肽。

6、在5步骤反应结束后，加入WGA-FITC或者WGA-HRP对含有O-GlcNAc 修饰的底物多肽进行标记。WGA-HRP检测时，进一步加入HRP的底物进行发光反应。

7、通过酶标仪对96孔板的FITC荧光值或者HRP产生的化学发光进行读取数据。数值越高表示被OGT修饰的底物多肽越多，表明酶活力越强，数值与酶活性呈现正相关。

其中，步骤2中，OGT高活性底物多肽通过半胱氨酸巯基和96-孔板的马来酰亚胺基团反应进行固定，步骤如下：

1.1)将所述的底物多肽溶解于固定缓冲液，该缓冲液含有0.05-0.50mM Na₃PO₄，0.05-0.5mM NaCl，1-100mM EDTA，pH 7.0-7.5，底物多肽的浓度为 10-100ug/ml。

1.2)将步骤1中的底物多肽与含有马来酰亚胺的96孔板进行孵育，时间0.5 -4h，温度为4-37℃；

1.3)将步骤1.2)完成后96-孔板用洗涤缓冲液漂洗，该缓冲液含有0.05-0.50 mMNa₃PO₄，0.05-0.5mM NaCl，0.01-0.1％tween-20，pH 7.0-7.5；

1.4)加入5-50ug/ml的半胱氨酸封闭液，对上述步骤96-孔板进行孵育封闭，时间0.5-2h，温度为4-37℃。

本发明所提供的方法，可以实现对纯化的OGT酶活性的检测，也可以实现对含有OGT的粗酶活性进行检测，可以应用于OGT在病人组织样本中活性的检测，也可以用于OGT抑制剂类药的活性评价。所述的OGT活性检测方法比用比现有的方法灵敏度高、专一性好、制备成本较低、容易操作。

下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。但应当理解这些实施例并非限制本发明的范围。根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1高活性OGT底物多肽ZO3-S371A的设计与制备

本实施例中，高活性OGT底物多肽ZO3-S371A的氨基酸序列来源于NCBI 数据库中的ZO3蛋白质序列(NP_001254489.1，SEQ ID No.1)。选择SEQ ID No.1 中对应第357-371位的氨基酸序列，将该段序列的羧基末端氨基酸改变为丙氨酸，在其氨基末端通过添加一个甘氨酸和一个半胱氨酸得到本发明中具备偶联功能的高活性OGT底物多肽ZO3-S371A(SEQID No.2)。ZO3-S371A多肽的具体制备方法如下：

ZO3-S371A多肽的制备采用基于Fmoc保护策略的多肽固相合成原理，使用Symphony多肽固相合成仪进行合成。构成SEQ ID No.2多肽的所有氨基酸均为 Fmoc保护的标准氨基酸并用二甲基亚酰胺溶解，浓度均为0.2M，称取Rink amide Resin固相树脂50mM为固相载体。合成反应过程中Fmoc的脱保护试剂为溶解于二甲基亚酰胺的20％的哌啶溶液、缩合试剂为0.16M的TBTU，每个氨基酸的偶联缩合时间为1h。仪器合成结束后将含有多肽的树脂转入圆底烧瓶，加入10mL切割试剂，所用的切割试剂为TFA/H₂O/TIPS/DTT(9∶0.5∶0.25∶0.25， v/v/v)，充氮气保护，于室温磁力搅拌4小时。切割完成后通过过滤装置去除树脂，滤液用冰乙醚收集缓慢进行沉淀，5000rpm离心收集沉淀，于冷冻干燥仪器上干燥后得到粗品。将该粗肽样品溶解于纯水，使用100％的乙腈为流动相A， 100％的超纯水为流动相B，使用半制备高效液相色谱法HPLC及反向C18色谱柱进行制备纯化，收集组分并质谱确定目标产物，冻干称重。

称取1mg上述多肽纯品，溶解于1mL纯水，过滤后通过HPLC进行检测，通过峰面积归一法对所得多肽的纯度进行计算，纯度大于95％。同时采用质朴分析确定产物的分子量。

图2为经过纯化后的OGT高活性底物多肽ZO3-S371A的HPLC分析图，数据分析表明其纯度达到95％以上。

图3为纯化后的OGT高活性底物多肽ZO3-S371A的质谱分析图，分子量与预期值相符为1917Da。

对所获得的OGT底物多肽ZO3-S371A采用UDP-Glo方法进行活性测定，以广泛使用的OGT底物多肽RBL2为参照，两种多肽在100uM浓度下测定结果表明基于本发明底物多肽ZO3-S371A的实验组荧光值为74500RLU，而基于 RBL2多肽的对照组荧光值为14300RLU，因此本发明底物多肽的活性是对照底物多肽的5倍，说明本发明获得的底物多肽ZO3-S371A具有高活性的性质，有利于提高OGT酶活检测技术的灵敏度和准确度。

实施例2高活性OGT底物多肽ZO3-S371A的固定化及封闭

将所述的OGT底物多肽ZO3-S371A溶解于固定缓冲液，该缓冲液含有0.1 mMNa₃PO₄，0.15mM NaCl，10mM EDTA，pH 7.2，溶解后多肽底物的浓度为50 ug/ml。含有活化的马来酰亚胺基团的96孔板购自赛默飞(货号15150)，使用洗涤缓冲液200ul/孔洗涤孔板三次，弃去洗涤缓冲液。所述的洗涤缓冲液含有0.1 mM Na₃PO₄，0.15mM NaCl，0.05％tween-20，pH 7.2。将前述步骤中溶解的多肽底物与含有马来酰亚胺的96孔板进行孵育，时间2h，温度为25℃。孵育完成后，弃去上清，使用洗涤缓冲液200ul/孔洗涤孔板三次，弃去洗涤缓冲液。配置封闭液为10ug/ml的半胱氨酸水溶液，每孔加入200ul的封闭液，室温条件下孵育 1h。孵育完成后，使用洗涤缓冲液200ul/孔洗涤孔板三次，弃去洗涤缓冲液。 OGT的多肽底物固定完成。

实施例3 OGT对ZO3-S371A糖基化的酶促反应

OGT酶反应的缓冲液体系为50mM Tris-HCl，1mM DTT，12.5mM MgCl₂， pH 7.5。OGT酶的供体底物为UDP-GlcNAc。在上述的OGT酶反应体系中加入 OGT的供体底物UDP-GlcNAc，使其终浓度达到100um/L，进一步加入纯化的 OGT酶0.5ug或者粗酶5ug，充分混匀。将上述100ul/孔的酶反应混合液加入到固定有OGT底物多肽的96孔板，摇床转速200rpm，温度30℃，孵育3h。

实施例4以WGA-HRP检测糖基化的OGT底物多肽及其特异性和灵敏度

为了确定以WGA-HRP的酶促显色方式检测OGT糖基化多肽的灵敏度，本实施例中采用已经OGT糖基化的标准底物ZO3-S371A-O-GlcNAc，按照实施例2中所述的方法将不同浓度的ZO3-S371A-O-GlcNAc固定于96孔板，浓度从低到高依次为0、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50ug/ml。上述多肽固定结束后，每孔加入100ul且浓度为10ng/ml的WGA-HRP作为O-GlcNAc糖基化多肽的标记物，于室温条件下孵育1h。孵育结束后使用洗涤缓冲液200ul/孔洗涤孔板三次，弃去洗涤缓冲液。每孔加入100ul的HRP酶底物TMB，室温下孵育10分钟，随后每孔加入100ul浓度为2M的硫酸溶液作为HRP酶反应终止液，此时多孔板中的溶液呈现黄色。通过酶标仪检测多孔板中液体的吸光值，设定波长为450nM。

对比例1以WGA-HRP检测未经糖基化的OGT底物多肽及其特异性和灵敏度

本实施例中同实施例4，区别在于采用未经OGT糖基化的多肽底物 ZO3-S371A。

图4为实施例4及对比例1关于WGA-HRP检测OGT糖基化的多肽的关键数据。在不含有O-GlcNAc糖基化多肽的对照组对比例1中，随着多肽底物浓度增加，检测到的显色信号数值保持不变，而含有O-GlcNAc糖基化的实验组实施例4中，随着糖基化多肽底物浓度的增加(相当于OGT酶活性在增加)，检测到的显色信号数值增加，表明该方法对OGT糖基化多肽和非糖基化多肽的具有高选择性。在O-GlcNAc糖基化多肽浓度为3.125ug/ml的条件下即检测出显著的数值增加，因此基于WGA-FITC的检测方法，可以检测到至少310ng的被OGT糖基化的多肽，表明本发明提供的方法具有很高的灵敏度。

实施例5以WGA-FITC检测OGT糖基化的多肽及其灵敏度

为了确定以WGA-FITC的荧光方式检测OGT糖基化多肽的灵敏度，本实施例中采用已经OGT糖基化的标准底物ZO3-S371A-O-GlcNAc，按照实施例2中所述的方法将不同浓度的ZO3-S371A-O-GlcNAc固定于96孔板，浓度从低到高依次为0、0、0.5、1、2、3、4、5ug/ml。上述多肽固定结束后，每孔加入100ul 的浓度为10ng/ml的WGA-FITC作为O-GlcNAc糖基化多肽的检测物，于室温条件下孵育1h。孵育结束后使用洗涤缓冲液200ul/孔洗涤孔板三次，弃去洗涤缓冲液，每孔加入200ul的PBS缓冲液。酶标仪检测WGA-FITC荧光信号的检测，设定的激发波长为485-500nM，发射波长为510-520nm。

根据实施例4与对比例1的结果，已经反映出，对照组的未糖基化底物并不会被WGA所识别，因此可以类推如果采用本实施例中的WGA-FITC的荧光方式检测，未糖基化底物理应也是不会被WGA所识别的。

图5为实施例5关于WGA-FITC检测OGT糖基化的多肽的关键数据。该结果显示，在无O-GlcNAc糖基化多肽存在的条件下(相当于无OGT酶活性的条件下)，读取的荧光数据本底值较低，而当O-GlcNAc糖基化多肽浓度增加时(相当于OGT的酶活性在不断增加的条件下)，荧光值数据随之增加。在O-GlcNAc 糖基化多肽浓度为5ug/ml的条件下即检测出显著的数值增加，因此基于 WGA-FITC的检测方法，可以检测到至少500ng的被OGT糖基化的多肽，表明本发明提供的方法具有很高的灵敏度。

实施例6以基于抗体标记发光法检测OGT糖基化的多肽及其灵敏度本发明提供的方法也可以通过抗体标记发光法进行检测。

为了确定以抗体标记发光法检测OGT糖基化多肽的灵敏度，本实施例中采用已经OGT糖基化的标准底物ZO3-S371A-O-GlcNAc，按照实施例2中所述的方法将不同浓度的ZO3-S371A-O-GlcNAc固定于96孔板，浓度从低到高依次为 0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5ug/ml。上述多肽固定结束后，每孔加入100ul且浓度为0.25ug/ml的小鼠单克隆抗体RL2作为O-GlcNAc糖基化多肽的标记物，于室温条件下孵育1h。孵育结束后使用洗涤缓冲液200ul/孔洗涤孔板三次，弃去洗涤缓冲液。每孔加入100ul且浓度为1ug/ml的HRP标记的山羊抗小鼠二级抗体，于室温条件下孵育1h。孵育结束后使用洗涤缓冲液 200ul/孔洗涤孔板三次，弃去洗涤缓冲液。每孔加入100ul的HRP酶底物TMB，室温下孵育10分钟，随后每孔加入100ul浓度为2M的硫酸溶液作为HRP酶反应终止液，此时多孔板中的溶液呈现黄色。通过酶标仪检测多孔板中液体的吸光值，设定波长为450nm。

图6为实施例6关于抗体标记显色法检测OGT糖基化的多肽的关键数据。该结果显示，在无O-GlcNAc糖基化多肽存在的条件下(相当于无OGT酶活性的条件下)，读取的显色吸光值数据本底值较低(OD450＝0.047)，而当O-GlcNAc 糖基化多肽浓度增加时(相当于OGT的酶活性在不断增加的条件下)，吸光值数据随之增加。在O-GlcNAc糖基化多肽浓度为0.3125ug/ml的条件下即检测出显著的数值增加，因此基于抗体标记显色法的检测方法，可以检测到至少31.25ng 的被OGT糖基化的多肽，表明本发明提供的方法具有很高的灵敏度。

以上实施例说明，本发明提供的体外检测OGT酶活性的方法，灵敏度高，特异性强，制备简单，成本低。该方法可在体外检测OGT酶活性中的应用。此外，还可以根据上述的方法，制成对应的体外检测OGT酶活性的装置，如装置包括检测板、检测盒及试纸条等。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 无锡麦迪科思生物科技有限公司

<120> 一种体外检测OGT酶活性的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 919

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Glu Glu Leu Thr Ile Trp Glu Gln His Thr Ala Thr Leu Ser Lys

1 5 10 15

Asp Pro Arg Arg Gly Phe Gly Ile Ala Ile Ser Gly Gly Arg Asp Arg

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Met Val Val Ser Asp Val Val Pro Gly Gly Pro Ala

35 40 45

Glu Gly Arg Leu Gln Thr Gly Asp His Ile Val Met Val Asn Gly Val

50 55 60

Ser Met Glu Asn Ala Thr Ser Ala Phe Ala Ile Gln Ile Leu Lys Thr

65 70 75 80

Cys Thr Lys Met Ala Asn Ile Thr Val Lys Arg Pro Arg Arg Ile His

85 90 95

Leu Pro Ala Thr Lys Ala Ser Pro Ser Ser Pro Gly Arg Gln Asp Ser

100 105 110

Asp Glu Asp Asp Gly Pro Gln Arg Val Glu Glu Val Asp Gln Gly Arg

115 120 125

Gly Tyr Asp Gly Asp Ser Ser Ser Gly Ser Gly Arg Ser Trp Asp Glu

130 135 140

Arg Ser Arg Arg Pro Arg Pro Gly Arg Arg Gly Arg Ala Gly Ser His

145 150 155 160

Gly Arg Arg Ser Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ala Asn Gly Leu Ala Leu

165 170 175

Val Ser Gly Phe Lys Arg Leu Pro Arg Gln Asp Val Gln Met Lys Pro

180 185 190

Val Lys Ser Val Leu Val Lys Arg Arg Asp Ser Glu Glu Phe Gly Val

195 200 205

Lys Leu Gly Ser Gln Ile Phe Ile Lys His Ile Thr Asp Ser Gly Leu

210 215 220

Ala Ala Arg His Arg Gly Leu Gln Glu Gly Asp Leu Ile Leu Gln Ile

225 230 235 240

Asn Gly Val Ser Ser Gln Asn Leu Ser Leu Asn Asp Thr Arg Arg Leu

245 250 255

Ile Glu Lys Ser Glu Gly Lys Leu Ser Leu Leu Val Leu Arg Asp Arg

260 265 270

Gly Gln Phe Leu Val Asn Ile Pro Pro Ala Val Ser Asp Ser Asp Ser

275 280 285

Ser Pro Leu Glu Asp Ile Ser Asp Leu Ala Ser Glu Leu Ser Gln Ala

290 295 300

Pro Pro Ser His Ile Pro Pro Pro Pro Arg His Ala Gln Arg Ser Pro

305 310 315 320

Glu Ala Ser Gln Thr Asp Ser Pro Val Glu Ser Pro Arg Leu Arg Arg

325 330 335

Glu Ser Ser Val Asp Ser Arg Thr Ile Ser Glu Pro Asp Glu Gln Arg

340 345 350

Ser Glu Leu Pro Arg Glu Ser Ser Tyr Asp Ile Tyr Arg Val Pro Ser

355 360 365

Ser Gln Ser Met Glu Asp Arg Gly Tyr Ser Pro Asp Thr Arg Val Val

370 375 380

Arg Phe Leu Lys Gly Lys Ser Ile Gly Leu Arg Leu Ala Gly Gly Asn

385 390 395 400

Asp Val Gly Ile Phe Val Ser Gly Val Gln Ala Gly Ser Pro Ala Asp

405 410 415

Gly Gln Gly Ile Gln Glu Gly Asp Gln Ile Leu Gln Val Asn Asp Val

420 425 430

Pro Phe Gln Asn Leu Thr Arg Glu Glu Ala Val Gln Phe Leu Leu Gly

435 440 445

Leu Pro Pro Gly Glu Glu Met Glu Leu Val Thr Gln Arg Lys Gln Asp

450 455 460

Ile Phe Trp Lys Met Val Gln Ser Arg Val Gly Asp Ser Phe Tyr Ile

465 470 475 480

Arg Thr His Phe Glu Leu Glu Pro Ser Pro Pro Ser Gly Leu Gly Phe

485 490 495

Thr Arg Gly Asp Val Phe His Val Leu Asp Thr Leu His Pro Gly Pro

500 505 510

Gly Gln Ser His Ala Arg Gly Gly His Trp Leu Ala Val Arg Met Gly

515 520 525

Arg Asp Leu Arg Glu Gln Glu Arg Gly Ile Ile Pro Asn Gln Ser Arg

530 535 540

Ala Glu Gln Leu Ala Ser Leu Glu Ala Ala Gln Arg Ala Val Gly Val

545 550 555 560

Gly Pro Gly Ser Ser Ala Gly Ser Asn Ala Arg Ala Glu Phe Trp Arg

565 570 575

Leu Arg Gly Leu Arg Arg Gly Ala Lys Lys Thr Thr Gln Arg Ser Arg

580 585 590

Glu Asp Leu Ser Ala Leu Thr Arg Gln Gly Arg Tyr Pro Pro Tyr Glu

595 600 605

Arg Val Val Leu Arg Glu Ala Ser Phe Lys Arg Pro Val Val Ile Leu

610 615 620

Gly Pro Val Ala Asp Ile Ala Met Gln Lys Leu Thr Ala Glu Met Pro

625 630 635 640

Asp Gln Phe Glu Ile Ala Glu Thr Val Ser Arg Thr Asp Ser Pro Ser

645 650 655

Lys Ile Ile Lys Leu Asp Thr Val Arg Val Ile Ala Glu Lys Asp Lys

660 665 670

His Ala Leu Leu Asp Val Thr Pro Ser Ala Ile Glu Arg Leu Asn Tyr

675 680 685

Val Gln Tyr Tyr Pro Ile Val Val Phe Phe Ile Pro Glu Ser Arg Pro

690 695 700

Ala Leu Lys Ala Leu Arg Gln Trp Leu Ala Pro Ala Ser Arg Arg Ser

705 710 715 720

Thr Arg Arg Leu Tyr Ala Gln Ala Gln Lys Leu Arg Lys His Ser Ser

725 730 735

His Leu Phe Thr Ala Thr Ile Pro Leu Asn Gly Thr Ser Asp Thr Trp

740 745 750

Tyr Gln Glu Leu Lys Ala Ile Ile Arg Glu Gln Gln Thr Arg Pro Ile

755 760 765

Trp Thr Ala Glu Asp Gln Leu Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asn Leu Asp

770 775 780

Leu Pro His His Gly Leu Ala Asp Ser Ser Ala Asp Leu Ser Cys Asp

785 790 795 800

Ser Arg Val Asn Ser Asp Tyr Glu Thr Asp Gly Glu Gly Gly Ala Tyr

805 810 815

Thr Asp Gly Glu Gly Tyr Thr Asp Gly Glu Gly Gly Pro Tyr Thr Asp

820 825 830

Val Asp Asp Glu Pro Pro Ala Pro Ala Leu Ala Arg Ser Ser Glu Pro

835 840 845

Val Gln Ala Asp Glu Ser Gln Ser Pro Arg Asp Arg Gly Arg Ile Ser

850 855 860

Ala His Gln Gly Ala Gln Val Asp Ser Arg His Pro Gln Gly Gln Trp

865 870 875 880

Arg Gln Asp Ser Met Arg Thr Tyr Glu Arg Glu Ala Leu Lys Lys Lys

885 890 895

Phe Met Arg Val His Asp Ala Glu Ser Ser Asp Glu Asp Gly Tyr Asp

900 905 910

Trp Gly Pro Ala Thr Asp Leu

915

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Cys Gly Arg Glu Ser Ser Tyr Asp Ile Tyr Arg Val Ser Ser Gln Ala

1 5 10 15

Claims

1.一种体外检测OGT酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)OGT底物多肽的制备；

2)OGT底物多肽的偶联固定及非特异性位点的封闭；

4)通过生物化学发光检测法检测糖基化的OGT底物多肽，所述生物化学发光检测法包括凝集素标记发光法、基于抗体标记发光法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述OGT底物多肽为ZO3-S371A，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述OGT底物多肽的制备包括OGT底物多肽的固相合成及纯化。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述OGT底物多肽的氨基末端含有具有固定作用的第一功能基团，所述OGT底物多肽通过所述第一功能基团与吸附有第二功能基团的载体材料反应，进行固定、封闭，

所述载体材料包括96-孔板、磁珠、芯片；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的OGT底物多肽的固定、封闭方法，包括以下步骤：

2.1)所述OGT底物多肽溶解于固定缓冲液，所述固定缓冲液含有0.05-0.50mM Na₃PO₄，0.05-0.5mM NaCl，1-100mM EDTA，pH 7.0-7.5，所述OGT底物多肽的浓度为10-100ug/ml；

2.2)与含有马来酰亚胺的载体材料进行孵育，时间0.5-4h，温度为4-37℃；

2.3)孵育后的载体材料用洗涤缓冲液漂洗；

2.4)加入5-50ug/ml的半胱氨酸缓冲液，对所述载体材料进行孵育封闭，时间0.5-2h，温度为4-37℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述OGT酶样品反应体系包括OGT酶反应缓冲液、OGT酶供体底物及OGT酶样品，

所述OGT酶反应缓冲液为1-100mM Tris-HCl，0.1-100mM DTT，10-125mM MgCl₂，

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述糖基化修饰是指OGT酶样品与载体材料进行孵育，所述孵育的时间为1-12h，温度为12-37℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝集素标记发光法包括WGA-FITC荧光信号检测法或WGA-HRP酶促显色检测法；

所述WGA-FITC荧光信号检测法的检测限为5ug/ml，所述WGA-HRP酶促显色检测法的检测限为3.125ug/ml；

所述基于抗体标记发光法的的检测限为0.3125ug/ml。

9.根据权利要求1～8任一所述的方法在体外检测OGT酶活性中的应用。

10.一种体外检测OGT酶活性的装置，其特征在于，使用如权利要求1～8任一所述的方法，所述装置包括检测板、检测盒及试纸条。