CN104781401A - 人工生物发光酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以通过基于数据库中的来自桡脚类的荧光素酶序列的氨基酸相似性的比对而提取的人工的氨基酸序列为基础的一系列的人工荧光素酶的创立，提供一种发光特性为高亮度、且发光稳定性高、向长波长侧迁移的光谱。本发明中，将数据库中的来自桡脚类的荧光素酶序列基于氨基酸相似性进行比对，以对应序列上的每个位置上的频率高的氨基酸为中心进行提取，构建人工的氨基酸序列，创立一系列的人工的荧光素酶群(ALuc)。此时，存在于氨基酸序列中的前半部和后半部的酶活性区域也一并通过相似性进行比对，两者中的氨基酸的相似性也提高。评价所得到的荧光素酶(ALuc)群的各个酶的亮度和发光稳定性，将结果好的ALuc的氨基酸序列反馈并再构建氨基酸序列，由此来合成性能更高的荧光素酶(ALuc)群。这些ALuc类具有发光亮度的高亮度化、且发光稳定性的提高、或者发光光谱向长波长侧迁移等前所未有的优异的发光特性。并且，通过使用本发明的人工荧光素酶(ALuc)类，能够提供在提高了计量功能的生物发光探针、双杂交检测、发光胶囊等中前所未有的优异的生物鉴定体系。

Description

人工生物发光酶
技术领域
[相关申请的相互参照]
本申请主张基于2012年10月26日提出的日本国专利申请第2012－237043和2012年10月26日提出的日本国专利申请第2012－236872(它们公开的全部内容通过援引加入本说明书)的优先权。
本发明涉及以来自海洋动物的生物发光酶的共同的遗传信息为基础来开发以高亮度显示稳定的生物发光的人工生物发光酶的技术。并且，本发明涉及在进行利用生物发光的检测时所必需的最佳反应溶液。
背景技术
关于生物发光酶(荧光素酶)，最近报道了大量的新的生物发光酶的创立。例如，由Promega公司报道了来自深海龙虾的新的发光酶的创立(非专利文献1)。该酶与现有的来自海肾的发光酶(Renillaluciferase；RLuc)相比，以1/2的分子量(19kD)显示出100倍的发光亮度。并且，由茂里等人报道了11种来自浮游生物的生物发光酶(非专利文献20)。这些发光酶的一部分被评价为显示出与RLuc同样的亮度。
此外，以前就发现了属于Augaptiloidea superfamily的深海发光动物(非专利文献2)。此外还发现了来自属于Metridinidae family的Gaussia princeps的发光酶(GLuc)和来自Metridia longa的发光酶(MLuc)、来自Metridia pacifica的发光酶类(MpLuc1，MpLuc2)(非专利文献15、19、21)。
另一方面，用于提高这些发光酶的亮度和发光稳定性的研究也在进行中。Loening等人通过在RLuc中导入氨基酸变异的方法，创立了高亮度且稳定的的RLuc变异体(非专利文献14)。在该研究中，为了特定变异的导入部位，使用了“共有序列驱动突变的策略”(consensussequence-driven mutagenesis strategy)(非专利文献13)。并且，本研究者以亲水性氨基酸分布图为基础，通过假定酶活性部位并导入变异的方法，成功地实现了来自深海发光动物的发光酶GLuc、MpLuc1和MLuc的高亮度化、高发光稳定化(非专利文献11)。但是，在各种生物检测中利用尚不能令人满意，寻求进一步增加亮度等发光特性的改良。
本发明的发明人以前提出了通过将一个发光酶的序列分成两部分，将前和后的序列以相似氨基酸为中心进行比对，利用用于得到关于其发光特性的指针的探究(单序列比对，single sequence alignment：SSA)，制作热力学上稳定的发光酶序列的方案(非专利文献3)。该方法基于来自海洋动物的发光酶存在2个酶活性部位的前提。通过将这2个酶活性部位以相似氨基酸为中心进行比对，能够简便地比较前后酶活性部位的相似性。由于如上所述的氨基酸的频率与热力学稳定性相关的假说，希望通过提高该前后的序列间的相似性来制作热力学上稳定的的发光酶序列。
另一方面，还开发出了使用上述的生物发光酶作为“报告分子”(reporter)的各种各样的应用方法。Niu等人将这样的将生物发光酶作为“报告分子”的生物检测分为“basic(基础的)”、“inducible(可诱导的)”、“activatable(可活化的)”这三类(非专利文献16)。该分类是利用报告基因的特性的分类。首先，“basic”与“inducible”的差异是由于报告分子的表达由启动子控制、并且表达量是否存在差异所引起的差异。带有后面详细描述的生物发光酶的抗体相当于Basic，生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)法和双杂交检测属于“inducible”的分类。另一方面，属于“activatable”分类的报告基因探针具有报告分子本身能动性地感应配体刺激而发光的特征。后面详细描述的蛋白质互补检测(protein complentation assay，PCA)、蛋白质剪切检测(protein splicing assay，PSA)和单分子型生物发光探针、发光胶囊等属于“activatable”的分类。
对于将这些生物发光酶作为“报告分子”的生物检测(以下也简称为“报告分析法”)中的发光探针，以上述的新的发光酶为基础，活跃地进行着各种各样的发光探针的开发。一直以来，本发明的发明人就进行着设计利用独特的分子设计技术的生物发光成像的研究开发。具体而言，开发了利用蛋白质剪切法来测定转录因子的核内转移或细胞质内非染色体组的蛋白质－蛋白质间相互作用的方法(非专利文献7、8)，开发出将信号识别和生物发光所需要的所有的要素聚集在1个分子内的形态的单分子型生物发光探针(非专利文献4、6)。之后，将该探针多色化，使其发展为能够同时进行多个信号传递过程的成像(非专利文献12)。并且，作为用于提高生物发光探针本身的配体感受性的方法，开发了使用循环排列取代(非专利文献9)和使用低分子量的发光酶的分子设计技术(非专利文献12)。这些研究都作为高效地测量细胞、非细胞体系内的分子现象的手段使用。
在探索细胞内和细胞外的分子现象的主要的方法中，作为比发光成像更广泛地使用的方法，有荧光成像。但是，由于荧光蛋白为自发荧光(autoluminescence)，所以背景高，需要外部光源，需要荧光显微镜那样的大的装置和精密的滤光系统。并且，存在直至荧光显色团成熟最少也需要数小时到数天的问题。此外，在使用荧光显微镜时，由于一次能够观察的细胞数有限度，定量性存在问题(非专利文献8)。
相对于此，在使用生物发光酶的发光成像的情况下，尽管具有许多优点，但是它比荧光成像难以利用的最大的原因在于生物发光酶的亮度低。由于生物发光酶为低亮度，需要高灵敏度的测量装置，不适合单一细胞成像或小细胞器的探索等。
此外，对于荧光蛋白，多色荧光蛋白的研究充分地开展着，得到了大量的关于其显色原理的见解，利用这些研究成果，开发了大量的具有多种多样荧光特性的荧光蛋白，而对于生物发光酶，显示多种颜色的生物发光的酶本身的数量缺乏。尽管作为发光的多色化的优点，提出了(i)多信号的同时测量、(ii)长波长发光的生物体组织透过性的优点，但是，关于生物发光酶，迄今为止尚没有开展基于其发光原理的体系的多色化研究。
由此，强烈期望高性能生物发光酶的新的创立、高亮度化和发光强度的稳定化、耐热性、耐盐性。并且，用于同时使发光色向长波长侧迁移的体系的研究也是紧急的课题。
此外，生物检测中选择、使用适当的反应溶液是左右结果的重要条件。特别是作为重视反应溶液选择的生物检测，提出了(1)报告基因检测(reporter-gene assay)、(2)双杂交检测(two-hybrid assay)、(3)酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay)、(4)放射免疫检测(radioimmunoassay、RIA)等(非专利文献22、非专利文献23)。
此外，作为其他的生物检测，有使用所谓的“分子探针”的生物检测法，反应溶液的选择在很大程度上左右结果。例如，开发了使细胞内的蛋白质－蛋白质相互作用通过显色成像的方法，(1)利用荧光蛋白间荧光共振能量转移的FRET法(非专利文献24)；(2)以将荧光蛋白或发光蛋白质分成两部分、利用该蛋白质片段间的再结合的发光恢复为特征的双分子型蛋白质互补法(2-molecule-format proteincomplementation assay(PCA))等(非专利文献25)。本发明的发明人也开发了利用蛋白质剪接反应的检测法(蛋白质剪切检测，proteinsplicing assay(PSA))(非专利文献8)。
之后，本发明的发明人开发了(1)单分子型生物发光探针(integrated-molecule-format bioluminescent probe，或简称为single-chain probe)，能够检测单一融合分子内蛋白质－蛋白质间的相互作用(非专利文献6、专利文献4)，作为其派生方法，开发了(2)以使发光酶的基因序列为循环排列取代(circular permutation)为特征的生物发光探针(非专利文献8、专利文献3)。并且，本发明的发明人还开发了(3)以通过人为地使发光酶变形而引起的酶活性的差异为指标的分子变形传感器(molecular tension-indexed bioluminescentprobe)(非专利文献26、专利文献5)。
最近，本发明的发明人开发了将报告基因检测与单分子型生物发光探针组合的多重识别型生物发光探针(multiple recognition-typebioluminescent probe)(非专利文献27)。该探针以对一个检测物质进行2次感应为特征。还通过组合2色的单分子型生物发光探针，开发了多色生物发光成像探针试剂盒(专利文献25)。该探针以能够实现待检体的多方面的生理活性的多色成像为特征。
生物检测必须需要反应溶液，根据其发光信号的种类，大致分成(1)利用荧光蛋白的方法、和(2)使用生物发光酶(荧光素酶)的方法。在利用荧光蛋白的情况下，除了由于自发荧光使得背景非常高，还需要外部光源。存在为了测定荧光需要安装有精密的分光滤波器的比较大型的发光检测器(例如荧光显微镜)的问题(非专利文献8)。另一方面，在生物发光的方法的情况下，虽然不会出现上述问题，但是光比荧光弱，存在必须需要基质的问题。并且，由于依赖于发光酶，所以存在发光量容易因盐浓度、温度、pH、重金属离子的浓度等而发生变动的问题。以荧光为基础的方法存在同样的问题。因此，为了固定pH使发光反应条件最优化，在荧光法、发光法均使用宽范围的反应溶液。
根据这样的背景，在现有的基于荧光或生物发光的各种检测方法中确定最佳的缓冲条件是左右检测方法能否成功的重要的决定因素。此外，根据生物检测的特征，强烈需求反应溶液和添加物的最优化，以得到充分的检测灵敏度、选择性、信号稳定性。
在反应溶液(检测缓冲液)中，为了提高检测效果，使用着各种各样的添加物。作为添加物所要求的功能，要求：(1)阻碍由于蛋白酶引起的蛋白质的分解，(2)抑制干扰物质的影响，(3)通过作为缓冲溶液发挥作用，支持稳定的的信号发送，(4)平稳地破坏细胞膜等，准备同质(homogenous)的检测条件，(5)使蛋白质稳定化，(6)不阻碍作为发光反应的核心的探针的性能。
在反应溶液中的主要的添加物中，作为盐类，添加NaCl、KCl、(NH4)2SO4等；作为SH试剂，添加巯基乙醇、DTT等；作为多元醇，添加甘油或蔗糖等；作为螯合试剂，添加EGTA、EDTA等。
作为表面活性剂，添加聚氧乙烯(10)辛基苯基醚(polyoxyethylene(10)octylphenyl ether，TritonX-100，TX100)、Nonidet P-40(NP40)、聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(polyoxyethylene sorbitanmonolaurate，Tween20，TW20)、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monooleate，Tween80，TW80)、聚氧乙烯(20)十六烷基醚(polyoxyethylene(20)cetyl ether，Brij58)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)等。在选择表面活性剂时，考虑亲水度的程度时为TW20＞Brij58＞TW80＞TX100＞NP40的顺序、考虑表面活性度的程度时为NP40＞TX100＞Brij58＞TW20＞TW80的顺序，适当选择。
作为为了阻止蛋白质分解而使用的蛋白酶抑制剂(ProteaseInhibitor)，使用抑蛋白酶肽(分子量6.5kD)、亮抑酶肽(leupeptin，分子量：427)、胃蛋白酶抑制剂A(pepstatin，分子量：686)、苯甲基磺酰氯(phenylmetylsulfonyl Fluoride，PMSF，分子量：174)、抗蛋白酶(Antipain，分子量：605)、胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymostatin，分子量：608)等。此外，以Pefabloc SC(AEBSF，240Da)、DFP(184Da)、p-APMSF(216Da)、STI(20，100Da)、亮抑酶肽(Leupeptin，460Da)、N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(N-Tosyl-L-phenylalaninechloromethylketone)、3,4-二氯异香豆素(3,4-dichloroisocoumarin，215Da)、EDTA-Na2(372Da)、EGTA(380Da)、1,10-邻菲咯啉(1,10-phenanthroline，198Da)、磷酰二肽(phosphoramidon，580Da)、二硫代双(2-氨基-4-甲基戊烷)(Dithiobis(2-amino-4-methylpentane))、E-64(357Da)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)、丁苯抑制素(bestatin)、表苯丁抑制素盐酸盐(Epibestatin hydrochloride)、抑蛋白酶肽(aprotinin)、二甲胺四环素(minocycline)、ALLN(384Da)等的蛋白质分解抑制剂的方式利用。
并且，有时也添加以下的功能性化学物质。通过添加钼酸钠，能够获得使受体稳定化、防止分解的作用。甘油可以作为蛋白质的封闭剂等使用，二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)作为还原剂使用。
另外，作为缓冲剂，可以使用对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、邻苯二甲酸盐、甘氨酸、反式乌头酸、甲酸、3,3-二甲基戊二酸、苯乙酸、乙酸钠、琥珀酸、二甲胂酸钠、马来酸氢钠、马来酸、磷酸钠、KH2PO4、咪唑、2,4,6-三甲基吡啶、三乙醇胺盐酸盐、巴比妥钠(sodium5,5-diethylbarbiturate)、N-乙基吗啉、焦磷酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷、N,N-二羟乙基甘氨酸(bicine)、2-氨基-2-甲基丙烷-1,3-二醇、二乙醇胺、对苯酚磺酸钾、硼酸、硼酸钠、氨、甘氨酸、Na2CO3/NaHCO3、硼酸钠、或者它们的组合。
基于这样的背景，在反应溶液中添加的添加物的选择是极为重要的，为了完成目前的生物检测，强烈谋求适当选择添加物以及反应溶液的最优化。
另一方面，为了进行现有的生物检测，还存在必须使用几种反应缓冲液的问题，成为方法繁琐和成本增加的原因。并且，也是使用者操作工序繁琐的原因。
例如，在报告基因检测的情况下，首先，在微孔板上的培养细胞中导入包含报告基因的质粒。之后，进行12小时左右的配体刺激，在弃去培养基后，利用磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲(第一次必需的缓冲)对细胞进行一次清洗。接着，利用细胞裂解缓冲液(第二次必需的缓冲)将微孔板上的细胞裂解20分钟。将该细胞裂解缓冲液与加入了基质的检测缓冲液(第三次必需的缓冲)以一定比例混合，之后立即测定发光值。即，需要至少三次缓冲和长的测定工序。
此外，在使用“单分子型生物发光探针”的情况下，也必须经历同样的测定工序。首先，在微孔板上经过培养的真核细胞中导入“单分子型生物发光探针”的表达载体，再培养16小时。对该细胞进行20～30分钟的配体刺激，最后弃去培养基，利用PBS缓冲(第一次必需的缓冲)清洗1～2次。利用裂解缓冲液(第二次必需的缓冲)对余下的细胞进行20分钟处理。之后，在裂解液中与加入了基质的检测缓冲液(第三次必需的缓冲)以相应的比例混合，引发发光反应。立即利用光度计测定发光值(非专利文献26、非专利文献27)。
在上述任意一种现有方法中，都需要使用多种反应缓冲液，需要繁琐的测定工序和长时间，因而，强烈谋求进行改善以节省测定工序并缩短时间。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第8124424号说明书
专利文献2：美国专利第8043827号说明书
专利文献3：美国公开号US-2009-0269781(A1)
专利文献4：国际公开WO2008/084869(国际申请号PCT/JP2008/050370)
专利文献5：日本特开2011－067190号公报
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非专利文献
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发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的主要目的在于，通过基于大量生物发光酶的氨基酸序列的氨基酸相似性的比对和频率高的氨基酸序列的提取，提供一种高亮度、稳定且能够实现长波长发光的新的人工生物发光酶(ALuc)。其目的还在于确立使用该ALuc的各种报告分析法。
并且，本发明意在提供使用于生物检测的反应条件最优化的反应溶液及其添加物，通过该反应溶液的最优化，无需现有技术中的使用多种反应溶液(细胞裂解缓冲液(Lysis buffer)和检测缓冲液(assaybuffer)等)的繁琐的程序，能够迅速且简便地进行检测，能够实现测定工序的缩减，能够实现高灵敏度且稳定的发光测定。
即，本发明的目的还在于，提供一种省略了特别是现有技术中将利用生物发光的生物检测应用于活细胞时所必须的细胞裂解工序，即使基于配体刺激而直接进行发光测定、也能够实现高灵敏度的生物检测的生物发光用反应缓冲液。
用于解决技术问题的手段
本发明的发明人为了提供新的人工生物发光酶(ALuc)，着眼于来自海洋动物的生物发光酶。
在全部生物发光酶中，只要是来自海洋动物的生物发光酶，序列的相似性较高，具有在相同或类似基质(coelenterazine，腔肠素)中发光的共同点。本研究人员以前发现了通过亲水性区域检索(hydrophilicity search)而特定变异部位(mutation region)的方法(非专利文献11)，但是，该方法(1)仅仅是推定粗略的变异部位的方法，不适合特定高精度的变异位置。并且，(2)通过亲水性区域检索，可以看到多个亲水性区域，未表明关于究竟哪个区域是应该导入变异的区域的看法。并且，(3)基于该研究，应用点变异法(point mutation)，开发出了高亮度的新的发光酶，但是这些新酶存在基质的消耗(也称为更新率，turn-over rate)剧烈的缺点。在应用于发光探针等的情况下，在亮度方面，仅仅是2至5倍左右的改善，仍然没有解决应用于生物检测的亮度问题。(4)此外，还存在根据反应缓冲液的成分，发光特性有大幅度改变的问题。例如，在Promega制的反应缓冲液中看到亮度的增加，而在纽英伦生物技术公司(New England Biolabs，NEB)制的反应缓冲液和培养基等中却没有看到那种程度的亮度和稳定性的增加。
并且，上述的开发新酶时作为主要的改变手段使用的点变异法(point mutation)是极其耗费时间和劳动力的手法。例如，在由200个氨基酸(amino acid；AA)序列构成的发光酶的情况下，命中1个变异的概率仅为1/4000(200个AA×20种AA)。也谋求用于解决这种低效性的特殊的构想的转换。
因此，本发明的发明人不拘泥于上述研究背景，仔细研究各海洋动物发光酶的现有的技术，想到能够树立全新的人工生物发光酶。该方法能够概括为以下4点：
(1)首先，关于公用数据库(NCBI)上的多年来积累的海洋生物发光酶的氨基酸序列，是在长年进化过程中胜利留下来的结果，基于这样的想法，进行了如下工作。首先，对于NCBI上的海洋生物发光酶序列，以类似的氨基酸中心进行比对，基于该比对，以独特的思想提取了频率高的氨基酸。由此，完成了大量现有技术中完全不存在的新的人工生物发光酶(ALuc)序列。在现有技术中虽然存在大量进行氨基酸比对的报道，但是，这种现有的氨基酸比对的目的在于探索变异位置。因此，该方法被称为共有序列驱动突变的方法(consensussequence-driven mutagenesis strategy)(非专利文献13)。而本发明的发明人独立地解释该氨基酸序列的比对，并进行了详细的研究。其结果，想到了难道不能通过氨基酸序列的比对来创立前所未有的人工发光酶的氨基酸序列群的技术构思。
(2)进一步进行了下述研究。首先，本发明的发明人以前表明了1个生物发光酶存在2个酶活性部位的观点，作为其证据，将2个结构域重叠进行了比对(非专利文献3)。本发明的发明人进一步扩展该想法，不仅是将1个氨基酸序列分成2个单纯地进行比对，而是以在创立新的人工发光酶的氨基酸序列时利用为方向，进行了构思的转换。首先，将由NCBI获得的来自发光桡脚类的全部的生物发光酶的氨基酸序列在任意的位置分成2个。将前和后的结构域重叠进行比对，之后，比较氨基酸序列中相互对应的氨基酸，以提高相似性为方向确定氨基酸序列。利用该方法，确定了能够成为新的人工发光酶的大量的氨基酸序列。
(3)并且，进行研究，使得在确定上述人工发光酶的氨基酸序列时，为了在序列的一定间隔导入限制酶部位，有意图地加入不符合序列间相似性的原则的氨基酸，以使得今后的基因重组更为容易。
(4)通过利用PSORTII研究而人工制作的N末端侧的序列特性，能够通过计算机模拟(in silico)进行定位预测。通过利用预测这种序列的行为的公用的软件，能够提高序列有效工作的概率。
通过这种人工生物发光酶的新的合成，目的在于创立前所未有的具有高亮度、向长波长侧迁移和发光稳定性、耐热性、耐盐性的新物种。
具体而言，基于氨基酸相似性，对NCBI或文献等公布的来自浮游生物的发光酶的氨基酸序列进行比对，以共同的氨基酸为中心确定一系列的新的氨基酸序列(实施例1－1)。基于该序列，为了使遗传密码子在来自小鼠的动物培养细胞中表达，应用在小鼠基因常见的密码子进行人工基因的合成，将该人工基因插入哺乳动物细胞表达载体(pcDNA3.1(+))，合成一系列新的表达载体。将该一系列的载体分别导入来自非洲绿猴肾脏的COS-7细胞，研究其亮度、发光稳定性、长波长侧迁移度，结果确认了：利用部分的人工合成基因，能够合成极高亮度、稳定、且具备耐热性、显示出长波长侧迁移的发光光谱的发光酶。
利用市面上销售的基质试剂盒确认合成的一系列的人工生物发光酶(ALuc)的相对的亮度(实施例1－2)，对于亮度高的ALuc类的发光稳定性，以发光强度的随时间的变化为指标进行确认(实施例1－3)。并且，研究亮度和发光稳定性好的ALuc类的耐热性和细胞外分泌能力(实施例1－4)，对于特别有希望的ALuc类测定其发光光谱，明确长波长侧迁移的程度(实施例1－5)。比较本发明中提供的ALuc类与现有的发光酶的相似性，结果可以确认，与任意现有的发光酶相比，同一性最多也仅为83％，是完全不同的新的人工生物发光酶(实施例1－6)。
并且，对将上述发光验证过程中获得的一系列的高性能人工生物发光酶(ALuc)作为报告蛋白的各种“报告分析法”进行研究，在该过程中，开发出了“发光胶囊”这样的新概念的生物发光可视化探针。该探针通常定位于细胞膜的内侧，基质和氧的供给顺利，因而与其他的定位于任意的小细胞器的探针相比，能够实现高亮度发光成像。并且，由于定位于细胞膜，能够迅速响应外部的毒性物质而使发光值发生变化(实施例1－7和实施例1－8)。作为该探针成功工作的理由，是因为有效地灵活运用了ALuc本身所固有的性质(经由内质网向细胞膜转移的分泌信号(secretion peptide，SP))。并且，该探针能够在其内部插入作为载入物的蛋白质(肽)，因而能够将任何蛋白质(肽)运送到细胞膜。为了进一步利用导入了该发光胶囊基因的转化细胞进行化学物质毒性评价，尝试制作了新的发光器件(实施例1－11)。该器件具备分光滤光片、微型载物台(Micro Slide Holder)、透镜帽(mirrorcap)、光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)等，通过将导入了新的合成基因(ALuc)的转化细胞暴露在化学物质中，利用该器件测定此时发出的光，由此能够高效地进行毒性评价(实施例1－11、实施例1－12、实施例1－13)。
接着，将上述新的合成发光酶(ALuc)作为报告蛋白，搭载于真核细胞双杂交检测(哺乳动物双杂交检测，mammalian two-hybrid assay)体系中，由此，能够构建比现有技术更高亮度且更高稳定性的新的生物鉴定体系(实施例1－9)。
并且，在将上述人工生物发光酶(ALuc)作为报告蛋白的“报告分析法”中，应用于“单分子型生物发光探针”。利用该探针，按照(非专利文献9)的方法，将ALuc基因分成2部分，通过循环序列取代使N末端与C末段片段连续，在其外侧连接应激激素受体和LXXLL模体。该探针在有无应激激素(皮质醇，cortisol)的条件下显示出高信噪(S/N)比(实施例1－10)。并且，在由该探针测定应激激素时，通过与上述发光器件并用，能够获得亮度增加、标准误差率减少等的效果(实施例1－14)。
这样验证了本发明的ALuc在各种“报告分析法”法作为高亮度且稳定的报告蛋白极其优异。
通过获得了以上的见解，完成了本发明。
即，本发明具体包括以下方式。
〔1〕一种多肽，其包含下述(i)或(ii)所记载的氨基酸序列，并且具有桡脚类荧光素酶活性，
(i)序列号38所示的氨基酸序列，
(ii)序列号38所示的氨基酸序列中，1-31位或217-221位的至少任意区域中1个以上的氨基酸缺损的氨基酸序列。
〔1－1〕一种多肽，其包含下述(i)或(ii)所记载的氨基酸序列，并且具有桡脚类荧光素酶活性，
(i)序列号37所示的氨基酸序列，
(ii)序列号37所示的氨基酸序列中，1-29位或217-221位的至少任意区域中1个以上的氨基酸缺损的氨基酸序列。
〔2〕如上述〔1〕或〔1－1〕所述的多肽，其包含下述的(iii)～(v)的任一项所记载的氨基酸序列，
(iii)序列号11～17或24～36的任一项所示的氨基酸序列，
(iv)序列号11～17或24～36的任一项所示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，
其中，这里的多个表示1～20个、优选1～10个、更优选1～5个，
(v)与序列号11～17或24～36的任一项所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
〔3〕如上述〔1〕或〔1－1〕所述的多肽，其包含下述的(vi)或(vii)所记载的氨基酸序列，
(vi)序列号22所示的氨基酸序列，
(vii)序列号22所示的氨基酸序列中，1-29位或211-215位的至少任意区域中1个以上的氨基酸缺损的氨基酸序列。
〔4〕如上述〔1〕所述的多肽，其中，序列号38所示的氨基酸序列中1-71位的区域是序列号39所示的氨基酸序列。
〔4－1〕如上述〔1－1〕所述的多肽，其中，序列号37所示的氨基酸序列中1-69位的区域是序列号39所示的氨基酸序列。
〔5〕如上述〔1〕所述的多肽，其中，序列号38所示的氨基酸序列中1-157位的区域是序列号40所示的氨基酸序列。
〔5－1〕如上述〔1－1〕所述的多肽，其中，序列号37所示的氨基酸序列中1-155位的区域是序列号40所示的氨基酸序列。
〔6〕如上述〔1〕所述的多肽，其中，序列号38所示的氨基酸序列中20-31位的区域是抗体识别部位。
〔6－1〕如上述〔1－1〕所述的多肽，其中，序列号37所示的氨基酸序列中20-29位的区域是抗体识别部位。
〔7〕一种编码上述〔1〕～〔6－1〕中任一项所述的多肽的核酸。
〔8〕一种以能够表达的方式插入了上述〔7〕所述的核酸的表达载体。
〔9〕一种以能够表达的方式导入了上述〔7〕所述的核酸的转化细胞。
〔10〕一种用于报告分析法的报告蛋白，其包括上述〔1〕～〔6－1〕中任一项所述的多肽。
〔11〕一种发光性融合蛋白，其含有上述上述〔10〕所述的报告蛋白，并且含有靶蛋白或识别靶蛋白的肽。
〔12〕如上述〔11〕所述的发光性融合蛋白，其在报告蛋白的C末端侧结合有膜定位信号(MLS)，靶多肽作为载入物插入两者之间。
〔13〕如上述〔12〕所述的发光性融合蛋白，其中，上述被插入的靶多肽是荧光蛋白或荧光素酶。
〔14〕如上述〔12〕所述的发光性融合蛋白，其中，上述被插入的靶多肽是使细胞膜形态变化的多肽或含有该多肽识别的氨基酸序列的多肽。
〔15〕一种表达载体，其包含编码上述〔11〕～〔14〕中任一项所述的发光性融合蛋白的报告基因。
〔16〕一种导入了上述〔15〕所述的表达载体的转化细胞。
〔17〕一种报告分析法，用于分析对应于外部刺激的细胞内的靶基因的表达位置、表达时期或表达量，其中，上述报告分析法使用上述〔16〕所述的转化细胞。
〔18〕如上述〔17〕所述的分析法，其中，上述分析法是报告基因检测法或双杂交检测法。
〔19〕一种生物发光探针，用于测定配体结合性蛋白的配体活性，上述生物发光探针由融合蛋白构成，该融合蛋白含有被分为N末端侧和C末端侧两部分的上述〔10〕所述的报告蛋白，并且含有配体结合性的靶蛋白和识别配体与靶蛋白结合时的立体结构变化的多肽。
〔20〕一种表达载体，其为用于测定配体结合性蛋白的配体活性的表达载体，编码上述〔19〕所述的生物发光探针的核酸处于能够在细胞内表达该核酸的控制序列的控制之下。
〔21〕一种导入了上述〔20〕所述的表达载体的转化细胞。
〔22〕如上述〔16〕所述的转化细胞，其中，上述转化细胞为干细胞。
〔23〕一种被检细胞内的配体结合性蛋白的配体活性的检测方法，其使用上述〔20〕所述的表达载体。
〔24〕一种生物发光成像法，其使用上述〔20〕所述的表达载体，观察被检细胞内的配体结合性蛋白的配体活性。
并且，在本发明中，为了提供一种即使由配体刺激直接进行发光测定也能够实现高灵敏度的生物检测的生物发光用反应缓冲液，对于细胞裂解所使用的细胞裂解液与发光测定时所使用的反应溶液的组合进行了研究。研究的结果，通过使用含有Tris-缓冲液和HBSS缓冲液作为基本缓冲液、含有NP-40和TW80作为表面活性剂的生物发光用反应缓冲液，能够实现不经过细胞裂解工序、由配体刺激直接进行发光测定的生物发光生物检测。通过进一步添加PEG等的高分子、金属离子、糖成分、卤离子等，能够实现更高灵敏度的生物检测。
本发明中，首先，根据一直以来使用的生物检测用反应溶液类的组成研究各添加剂(重金属离子、卤离子、高分子添加剂、多元醇、二元醇类等)的参与度。并且，还研究细胞裂解剂(SDS、NP-40、TW80、Triton等)的性能。根据该研究，能够确认有助于提高生物检测性能的添加物及其有效浓度例。另外，根据现有技术中细胞裂解步骤(Step1)和检测步骤(Step2)的各工序中使用的细胞裂解液与发光测定用反应溶液的组合的研究，通过使用含有Tris-缓冲液和HBSS缓冲液作为基本缓冲液、含有NP-40和TW80作为表面活性剂的生物发光用反应缓冲液，能够提供一种能够省略细胞裂解工序、能够由配体刺激直接进行发光测定的生物发光生物检测用反应缓冲液。
如上所述，综合生物检测用添加剂的研究结果，完成了生物发光生物检测用反应缓冲液和使用该缓冲液的生物发光生物检测法的本发明。
下面具体说明完成本发明的经过。
一直以来，生物检测分为“细胞裂解缓冲液(Lysis Buffer)”、“清洗缓冲液(Wash Buffer)”、“检测缓冲液(Assay Buffer)”进行检测。考虑到这种情况，在最初的实施例中研究最适宜的细胞裂解缓冲液与检测缓冲液之间的适应性(实施例2－1)。比较观察到的发光的亮度和稳定性，结果确认了：除了Promega制的制剂以外，C3的细胞裂解缓冲液提供了适合于人工生物发光酶(ALuc)的缓冲条件。C3以Tris-HCl缓冲液为基础，配合了NP-40、叠氮化钠、MgCl2和NaCl。并且，确认了作为与C3组合的检测缓冲液，HBSS和TE缓冲(添加聚乙二醇，分子量400(PEG400))是适合的(图23A、B)。以下，选择C3作为基本的缓冲液，研究与其他缓冲成分的组合。此时，考虑HBSS和TE-PEG缓冲液的组合是适合的。
此外，在本发明中以全部的发光酶为对象，但是在用于研究缓冲成分的最佳组合的实施例中，主要使用上述的高亮度且能够持续观察的人工发光酶(ALuc)。
首先，使用人工发光酶(ALuc)，研究与C3的细胞裂解缓冲液的组合适宜的一系列的检测缓冲液(实施例2－2)。比较观察到的发光的亮度和稳定性，结果确认了，与C3具有良好适应性的检测缓冲液是PBS缓冲液、HBSS缓冲液、TE-PEG缓冲液(图24)。
接着，利用效果最好的C3细胞裂解液与HBSS检测缓冲液的组合的体系，进行更进一步的关于缓冲添加剂的研究(实施例2－3)。对于通过添加重金属所带来的发光效果而言，确认了在检测缓冲液中铝离子、铜离子、铁离子、Mo离子、锌离子等是有效的添加剂(图25)。
进一步将组合了C3细胞裂解液和HBSS检测缓冲液的体系应用于本发明的发明人新开发出的使用单分子型生物发光探针(ALuc)的实际的检测实验(男性荷尔蒙)，研究添加聚乙二醇(PEG)的效果(实施例2－4)。结果确认了添加PEG是有效的，特别是EG400和PEG620具有显著的效果，其添加比例优选为1％左右(图26)。利用该应用于单分子型生物发光探针(ALuc)的同样的体系，进一步研究在检测缓冲液中添加卤离子的效果(实施例2－5)，可知添加卤离子具有一定程度的有效的结果。在卤离子中，KI的整体上的效果比KBr好，最终浓度为50mM左右特别好。在KBr的情况下，最终浓度为100mM左右时效果好(图27)。利用同样的体系，研究在检测缓冲液中添加糖类的效果(实施例2－6)，在添加部分糖类时确认了一定程度的有效的结果。通过添加蔗糖或葡萄糖，整体上的效果好。非糖类的甘氨酸也获得了优异的效果。添加浓度为2mg/mL(最终浓度)时在整体上能够获得好的结果(图28)。
对如上所述的关于细胞裂解缓冲液、反应缓冲液和添加剂的基础研究进行积累，结果，开发出不需要细胞裂解(lysis)时间的一次(一次)反应溶液的可能性提高。
为了避免现有技术的分为细胞裂解缓冲液和检测缓冲液的繁琐的生物检测中的繁琐的程序，组合出了反映了本发明发现的添加物的形态的新的缓冲液。
具体而言，如C14至C22的组成以及图29和图30所示，进行将本发明的上述实施例中发现的细胞裂解液和检测用的缓冲液结合的验证。特别是由C19－C22的结果(图29)可知，混合使用2种以上的表面活性剂的手法是极为有效的，并且，由C23－C26的结果(图30)可知，根据缓冲液的混合比(表面活性剂的混合比也同样)，有时更为有效。根据这样的研究，完成了无损于发光反应、能够从活细胞瞬时测定发光的、新的发光反应溶液(称为一次(one-shot)缓冲液)。
本发明的缓冲液的特征在于，充分运用表面活性剂的特征，以弥补各自的缺点的形态来形成反应溶液的组成。
更具体而言，进行如下说明。首先，考虑到表面活性剂的“亲水度的程度”为TW20＞Brij58＞TW80＞TX100＞NP40的顺序、“表面活性度”为NP40＞TX100＞Brij58＞TW20＞TW80的顺序，除了混合少量的SDS之外，通过混合界面活性度位于两端的NP40和TW80，想办法使其具备强大的裂解力、并且相互弥补各表面活性剂所具有的缺点。其结果，完成了无损于发光反应、能够在短时间内将细胞裂解并且同时进行发光测定的一次(one-shot)反应溶液。
该一次反应溶液的效果具体由实施例2－9和2－10表示。对表达响应男性荷尔蒙的单分子型探针的真核细胞进行类固醇激素或化学物质刺激，添加本发明的一次缓冲液后，立即进行发光测定(实施例2－9、2－10)。其结果，在包含男性荷尔蒙受体的单分子型探针的情况下，与男性荷尔蒙最为剧烈地发生反应(图31)。此外，包含女性荷尔蒙受体的单分子型探针与女性荷尔蒙抗癌剂(OHT)剧烈地发生反应(图32)。这些结果是严格地表现出能够将细胞瞬间裂解并能够进行发光测定的该一次缓冲的优点的结果。
通过这些见解，完成了本发明。
即，本发明也包括以下方式。
〔2－1〕一种生物发光用反应缓冲液，用于无需经过对活细胞的细胞裂解工序而进行利用生物发光的生物检测，该生物发光用反应缓冲液包含下述(1)和(2)，
(1)含有Tris-缓冲液和HBSS缓冲液的基本缓冲液，
(2)含有NP-40和TW80的表面活性剂。
〔2－2〕如上述〔2－1〕所述的生物发光用反应缓冲液，其中，上述(2)的表面活性剂还含有SDS。
〔2－3〕如上述〔2－1〕或〔2－2〕所述的生物发光用反应缓冲液，其中，进一步配合下述(3)～(6)中至少任一种的添加剂，
(3)选自PEG和PPG中的至少一种的高分子化合物，
(4)选自Mg(II)、Fe(III)、Cu(II)、Mo(VI)和Zn(II)中的至少一种的多价离子，
(5)选自Br－和I－中的至少一种的卤离子，
(6)选自蔗糖、葡萄糖和甘氨酸的多元醇类。
〔2－4〕如上述〔2－1〕～〔2－3〕中任一项所述的生物发光用反应缓冲液，其特征在于，上述(1)的基本缓冲液中的Tris-缓冲液和HBSS缓冲液的配合比以容量(v/v)％计为20～50︰50～20，并且，上述(2)的表面活性剂中的NP-40和TW80的配合比以容量(v/v)％计为1︰1～10。
〔2－5〕如上述〔2－1〕～〔2－4〕中任一项所述的生物发光用反应缓冲液，其特征在于，利用生物发光的生物检测是使用响应选自男性荷尔蒙、女性荷尔蒙或应激激素中的类固醇激素的生物发光探针的生物检测。
〔2－6〕一种利用生物发光的生物检测法，其特征在于，无需细胞裂解工序，使活细胞悬浮在生物发光用反应缓冲液中，测定所得到的悬浊液中的生物发光强度，该生物检测法包括下述(1)和(2)，
(1)含有Tris-缓冲液和HBSS缓冲液的基本缓冲液，
(2)含有NP-40和TW80的表面活性剂。
〔2－7〕如上述〔2－6〕所述的生物检测法，其特征在于，生物检测法是使用响应选自男性荷尔蒙、女性荷尔蒙或应激激素的类固醇激素的生物发光探针的生物检测法。
〔2－8〕一种生物检测用试剂盒，其含有上述〔2－1〕～〔2－4〕中任一项所述的生物发光用反应缓冲液。
发明效果
在本发明中，通过由广为人知的来自海洋动物的大量的发光酶序列提取新的人工生物发光酶序列的方法，创立一系列的新的人工生物发光酶(ALuc)群。其中，部分酶群为超高亮度、且向长波长侧迁移、并且耐热性优异、稳定地发光的酶。
进一步使用本发明的人工生物发光酶(ALuc)构建用于各种“报告分析法”的生物鉴定体系，结果，在应用与膜定位信号肽融合的发光融合蛋白(发光胶囊)或生物发光酶探针等的情况下，能够以前所未有的高灵敏度显示出对化学物质或荷尔蒙等的高的感应能。并且，通过作为一直以来广泛采用的报告基因检测(reporter gene assay)、酵母双杂交检测(Yeast Two-hybrid assay)、哺乳动物双杂交检测(Mammalian Two-hybrid assay)、蛋白质剪切检测(protein splicingassay，PSA)、蛋白质互补检测(protein complementation assay，PCA)、循环排列检测(circular permutation assay)、生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)检测中的现有型发光酶的要素使用，能够制作高亮度且稳定性高的发光探针，因而能够使检测的测量性能飞跃提高。
并且，通过本发明，还能够提供一种不需要细胞裂解(lysis)时间的生物检测用的一次反应溶液，该反应溶液稳定、且灵敏度也优异，是最优化的反应溶液。
通过生物检测用反应溶液的最优化，能够抑制检测时的背景光，因此有望实现信号强度的增加、亮度的增加。并且，由于能够简化、省略实验步骤，能够节约时间和劳力。其结果，关系到生物检测中的S/N比的改善、重现性的提高和成本的降低。
附图说明
[图1A]将由公用数据库(NCBI)获得的生物发光酶的氨基酸序列分成前端部、前半部、后半部，基于氨基酸相似性对前半部和后半部进行比对，由此，以提高相似性为方向确定新的人工生物发光酶氨基酸序列。虚线框表示该新的人工生物发光酶的模型。在下部酶活性部位重复2次。箭头表示按照提高相同性的方向选择氨基酸。
[图1B(1)]确定本人工生物发光酶的N末端(前端部)。以公用氨基酸测序软件(SORTII)和现有发光酶的序列为基础，选择构成新的序列的氨基酸候补。
[图1B(2)]确定本人工生物发光酶的C末端(前端部)。
[图1C]本发明的人工生物发光酶的序列的一例。图中，“x”意味着任何氨基酸均可。角标“y”表示为疏水性氨基酸。“z”表示为亲水性氨基酸。
[图1D]本发明的人工生物发光酶的序列的一例。“ALucCM”表示序列号37所示的氨基酸序列。图中，“x”意味着任何氨基酸均可(空白(空栏)也可)。“o”表示为疏水性的氨基酸、“j”表示为亲水性的氨基酸、“.”表示为低分子量脂肪族的氨基酸、“”表示为高分子量脂肪族氨基酸、“+”表示为具有正电荷的氨基酸、“－”表示为具有负电荷的氨基酸。
[图1E]本发明的人工生物发光酶的序列的一例。“ALucCM”表示序列号38所示的氨基酸序列。图中，“x”意味着任何氨基酸均可(空白(空栏)也可)。“o”表示为疏水性的氨基酸、“j”表示为亲水性的氨基酸、“.”表示为低分子量脂肪族的氨基酸、“”表示为高分子量脂肪族氨基酸、“+”表示为具有正电荷的氨基酸、“－”表示为具有负电荷的氨基酸。
[图2]人工生物发光酶(ALuc)的发光亮度的比较。利用现有的图像分析器(LAS-4000，FujiFilm)测定96孔板上的发光亮度。利用从红(高亮度)到蓝(低亮度)的模拟色表示发光亮度。黄色表示其中间亮度。GLuc、MpLuc4、RLuc8.6-535均是在现有技术中被评价为最高亮度生物发光的发光酶。
[图3]本人工生物发光酶(ALuc)的发光稳定性的比较。(A)导入基质后，发光亮度随时间的变化。在ALuc15和ALuc16的情况下，在导入基质后经过25分钟的时刻，也维持了初始状态6成的发光亮度。右侧的插入图表示其发光图像。(B)各人工生物发光酶(ALuc)在导入基质后0分钟(黑色棒)和6分钟(灰色棒)时的发光亮度的比较。ALuc24的发光稳定性优异，但是发光亮度稍差。在ALuc22的情况下，在6分钟后显示初始状态的大约一半的发光亮度。(C)各人工生物发光酶(ALuc)在导入基质后0分钟(黑色棒)和20分钟(灰色棒)时的发光亮度的比较。
[图4]本人工生物发光酶(ALuc)的耐热性和细胞外分泌度的比较。(A)以80度加热10分钟后的生物发光酶的亮度比较。可见ALuc22出现明显的亮度降低。右的插入图表示加热前后的发光图像。(B)分泌到培养基的发光酶量的比较。ALuc16比其他的人工生物发光酶的细胞外分泌量多。(C)分泌到培养基的发光酶量的比较。ALuc16和ALuc23比其他的人工生物发光酶的细胞外分泌量多。
[图5]本人工生物发光酶类的生物发光光谱的比较。(A)ALuc2至ALuc16的人工生物发光酶的发光光谱。(B)ALuc16至ALuc24的人工生物发光酶的发光光谱。与现有的生物发光酶相比，显示出极显著的向长波长侧迁移的发光光谱。
[图6]现有的来自发光生物的发光酶的氨基酸序列与新的人工生物发光酶(ALuc)的氨基酸序列的相同性、相似性的比较。(A)使用CLUSTALW 2.1的两者间的序列相同性的比较。(B)以NCBI Blast为基础的两者间的序列相似性的比较。在两种研究中，与MpLuc1均显示出83％和72％的最大相似性。此外，与MoLuc1显示出74％的相似性，占其次。
[图7]以本人工生物发光酶(ALuc)为骨架的“发光胶囊”探针的构建。(A)本发光胶囊的分子结构。由细胞外分泌信号(SP)、ALuc本体、适当的载入物蛋白质(肽)、膜定位信号构成。(B)一般化的发光胶囊的分子结构。以任何载入物蛋白质都能插入的方式设计。(C)本发光胶囊的发光稳定性的比较。(D)搭载有ALuc16的发光胶囊的发光反应速度的比较。在膜定位的情况下，表现出更高的反应速度。(E)有无STS刺激的条件下的发光胶囊的发光反应速度。(F)利用酶标仪(Microplate reader)进行的发光胶囊的发光稳定性的比较。
[图8]STS刺激前后的细胞映像的比较。(A)本发光胶囊的分子结构。(B)STS刺激前后的本发光胶囊的作用原理。(C)STS刺激前与STS刺激后的发光映像的比较。由于STS刺激后细胞质整体发光，表示发光胶囊发生了分解。
[图9]以本人工生物发光酶(ALuc)为发光报告分子的哺乳动物双杂交检测系统的构建。(A)构成上述双杂交检测系统的质粒的详细情况。(B)由各报告分子的差异所带来的发光亮度的比较。在搭载ALuc16作为报告分子时，在同一条件下显示出最高的亮度。
[图10]对使用本发明的发光测定器件进行测定的实施例1－10进行说明的图。使用单分子型生物发光探针和本发明的发光测定器件的应激激素活性的可视化成像。(A)本实施例中使用的生物发光探针的基因结构(上段)和作用原理(下段)。在存在应激激素(皮质醇，cortisol)的条件，分子结构发生折叠并发光。(B)人工生物发光酶(ALuc)的切断位置所带来的S/N比的比较。在cSimgr8的情况下，S/N比好但发光强度绝对值低。而在cSimgr13的情况下，S/N比稍差但发光强度绝对值高。
[图11]对使用本发明的发光测定器件进行测定的实施例1－11进行说明的图。(A)是将本发光器件安装于现有光度计的照片。下面的插入图表示本实验中使用的分子探针的结构。(B)是毒性评价的示意图。由毒性物质引发探针的分解，发光值暂时增加。(C)是利用本发光测定器件测得的化学物质的毒性评价。可以确认由于化学物质的“毒性”使得发光值增加。SP表示分泌信号(secretion peptide)。ALuc表示本发明人的人工生物发光基因(Artificial luciferase)。MLS意味着细胞膜定位信号(membrane localization signal)。(D)是为了本研究而制作的生物发光高精度测量器件。显微镜玻片(microslide)为中心，由透镜帽、光学滤光片、载物台等构成，以能够使发光信号有效集光的方式设计。
[图12]表示使用本发明的发光测定器件测定发光光谱的化学物质的有害性评价的实施例1－12的说明图。(A)将本测定器件安装于现有光谱仪的照片。下图表示本实验中使用的分子探针的结构。(B)表示实际的测定结果的谱图。
[图13]对使用本发明的发光测定器件进行测定的实施例1－13进行说明的图。(A)本发明的生物发光高精度测量器件的集光原理。(B)本细胞毒性检测探针的作用原理。由于毒性物质(例如STS)使得活细胞内caspase-3的活性升高，切断DEVD序列。右图是响应STS的发光成像。在存在STS的条件下，观察到比没有STS时更强的生物发光。
[图14]使用发光测定器件的应激激素的测定。(A)本实施例中使用的生物发光探针的基因结构(上段)和作用原理(下段)。在存在应激激素(皮质醇，cortisol)的条件下，分子结构发生折叠并发光。(B)有无透镜帽的条件下的发光集光能的比较。由于带有透镜帽时显示更强的发光值，表示透镜帽的优越性。(C)对于同一样品，比较有无发光器件时的标准偏差(SD)。即使对于同一样品，在具有发光器件时显示出1/3以下的小的标准偏差(SD)，表示由于发光器件能够使得精度增加。(D)本显微镜玻片的发光图像。在存在应激激素(右边3个通道)的情况下，更为强烈地发光。
[图15]带有ALuc16的scFv抗体(scFv-ALuc16)与带有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗小鼠抗体(GE Healthcare)的发光亮度的比较实验。(A)scFv-ALuc16的分子结构。(B)利用LAS-4000测得的发光强度的图像。(C)两者间的发光亮度随时间的变化。(D)标准化的两者间的发光亮度随时间的变化。
[图16]带有ALuc16的scFv抗体(scFv-ALuc16)与带有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗小鼠抗体(GE Healthcare)的发光光谱的比较实验。(A)scFv-ALuc16的分子结构。(B)利用LAS-4000测得的发光强度的图像。(C)两者发光光谱的绝对值的比较。(D)标准化的两者的发光光谱。
[图17]使用在胚胎干细胞(ES细胞)稳定表达的cSimgr13(单分子型生物发光探针，single-chain probe)的应激激素活性的可视化。与左侧2个通道相比，实施了应激激素刺激的右侧2个通道的生物发光强度更强。
[图18]功能性人工生物发光酶的创立。(A)新的生物发光酶(ALuc30)的分子结构。序列中存在His标记的序列(抗原识别部位)，分泌到培养基后，能够通过柱层析或抗体实现可视化。(B)上述功能性生物发光酶的作用机理。表示在ALuc作为报告分子表达时，被分泌，能够利用其他手法确认。(C)功能性人工生物发光酶的相对亮度的比较。ALuc25、ALuc30、ALuc31表现出相对较高的亮度。
[图18D]表示ALuc25至29的生物发光光谱。
[图18E]包含标记的人工生物发光酶的利用蛋白印迹法(蛋白印迹法)的表达的确认和利用柱层析的功能确认。各人工生物发光酶从细胞被分泌到各个培养基侧。用Ni-NTA亲和层析柱对各个培养基进行精制的情况下，可知含有His标记的ALuc30被选择性地提取。插入图是使用专用抗体的蛋白印迹法的结果。意味着各人工生物发光酶(ALuc30、ALuc33、ALuc34)被分泌到各个的培养基内，作为标记发挥作用。
[图19]人工生物发光酶(ALuc)活性的长时间稳定性。(A)分泌到细胞培养基的ALuc的发光活性稳定性。在25天后进行测定时，可知ALuc16的活性降低到初始状态的2成，ALuc30和ALuc25能够维持到初始状态的5～6成的活性。(B)长期保存(25天)后的ALuc活性随时间的变化。ALuc23和ALuc30在滴加腔肠素(coelenterazine)后的12分钟左右显示出最大发光值。ALuc24在6分钟后观察到剧烈的发光值的现象。
[图20]使用该人工生物发光酶的活细胞成像和发光图。(A)在显微镜玻片上培养的COS-7细胞的发光图像。只有表达ALuc(A16)的活细胞观察到了强的发光图像。(B)在显微镜玻片上培养的COS-7细胞的裂解产物的发光图像(左)和发光图(右)。
[图21]进一步的功能性人工生物发光酶(ALuc30-34)的创立。含有功能性氨基酸序列(抗原识别部位(epitope)或亲和层析柱识别序列)的一系列的人工生物发光酶的创立和相对发光亮度的比较。(A)溶入各功能性氨基酸序列的最佳位置的检索。(B)本研究中创立的发光酶的相对发光亮度。分别用Promega制检测试剂盒比较分泌后的发光亮度。
[图22]新的功能性人工生物发光酶的发光反应特性。比较上述实施例(图21)中创立的功能性人工生物发光酶的发光反应特性。结果可知，ALuc33和ALuc34等显示较强的发光亮度，并且，在导入基质后发光亮度逐渐增加，在6～12分钟期间达到最高亮度。
[图23]细胞裂解缓冲液与检测缓冲液的最佳组合的研究。(A)根据缓冲的组合所得到的发光值的比较图像。显示利用C3缓冲液的细胞裂解与利用HBSS或TE缓冲液的检测是最有效的组合。(B)根据缓冲液的组合所得到的发光值的比较图。
[图24]C3的细胞裂解缓冲液与一系列的检测缓冲液的组合的研究。(A)根据检测缓冲液所得到的发光亮度的比较图像。(B)根据检测缓冲液所得到的发光亮度的比较图。具有与C3的良好适应性的检测缓冲液是PBS缓冲液、HBSS缓冲液、TE-PEG缓冲液。棒图上显示的％数字是表示以初始发光强度为100％时8分钟后的残留发光强度的比例。
[图25]添加重金属离子作为缓冲添加剂所带来的发光效果的比较。(A)添加重金属添加的发光亮度的图像。(B)添加重金属的发光亮度的图。在检测缓冲液中铝离子、铜离子、铁离子、Mo离子、锌离子等是有效的添加剂。棒图上显示的％数字是表示初始发光强度为100％时8分钟后的残留发光强度的比例。
[图26]使用单分子型生物发光探针的发光反应中添加聚乙二醇(PEG)的效果的比较。(A)本实施例中使用的单分子型探针的分子结构和作用原理。(B)在添加了PEG类的缓冲条件下，荷尔蒙识别能的比较。添加1％PEG比其他情况显示出更高的S/N比。添加聚乙二醇(分子量400(PEG400))是特别有效的。棒图上的符号“－”和“+”分别表示在有无男性荷尔蒙(DHT)的条件下进行的测定。
[图27]使用单分子型生物发光探针的发光反应中添加卤离子的效果的比较。(A)本实施例中使用的单分子型探针的分子结构和作用原理。(B)添加卤离子添加的发光亮度的图。通过添加I-离子，得到了高S/N比。棒图上的符号“－”和“+”分别表示在有无男性荷尔蒙(DHT)的条件下进行的测定。
[图28]使用单分子型生物发光探针的发光反应中添加多糖类的效果的比较。(A)本实施例中使用的单分子型探针的分子结构和作用原理。(B)添加多糖类的发光亮度的图。添加葡萄糖、蔗糖、甘氨酸是有效的。棒图上的符号“－”和“+”分别表示在有无男性荷尔蒙(DHT)的条件下进行的测定。
[图29]一次缓冲性能的确认实验。(A)cSimgr8的探针的分子结构。ALuc表示自己创立的人工生物发光酶(artificial luciferase)。GR LBD表示应激激素受体。(B)在有无应激激素的条件下，对具有pcSimgr8载体的COS-7细胞进行20分钟刺激后，分别用一次缓冲液(C14－22)测定发光强度。RLU比(+/－)表示有刺激时的发光强度与无刺激时的发光强度比。棒图上的符号“－”和“+”分别表示在有无男性荷尔蒙(DHT)的条件下进行的测定。
[图30]一次缓冲液性能的确认实验。(A)cSimgr8的探针的分子结构。ALuc表示自己创立的人工生物发光酶(artificial luciferase)。GRLBD表示应激激素受体。(B)在有无应激激素的条件下，对具有pcSimgr8载体的COS-7细胞进行20分钟刺激后，分别用一次缓冲液(C23－26)测定发光强度。RLU比(+/－)表示有刺激时的发光强度与无刺激时的发光强度比。棒图上的符号“－”和“+”分别表示在有无男性荷尔蒙(DHT)的条件下进行的测定。
[图31]一次缓冲液性能的确认实验。(A)Leu-rich探针的分子结构。AR LBD表示男性荷尔蒙受体(雄性激素受体配体结合域，androgenreceptor ligand binding domain)。FLuc表示萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)。(B)用DHT、OHT、E2、DDT、PCB对具有pLeu-rich载体的细胞进行20分钟刺激，与对照(0.1％DMSO)刺激进行比较。结果，对男性荷尔蒙显示出高的发光响应。棒图上的符号“－”和“+”分别表示在有无男性荷尔蒙(DHT)的条件下进行的测定。
[图32]一次缓冲性能的确认实验。(A)Simer-r2探针的分子结构。ER LBD表示女性荷尔蒙受体(雌性激素受体配体结合域，estrogenreceptor ligand binding domain)。CB Red表示来自叩头虫的发光酶红。(B)用DHT、OHT、E2、DDT、PCB对具有pSimer-r2载体的细胞进行20分钟刺激，与对照(0.1％DMSO)刺激进行比较。结果，对乳癌抗癌剂(OHT)显示出高的发光响应。棒图上的符号“－”和“+”分别表示在有无男性荷尔蒙(DHT)的条件下进行的测定。
具体实施方式
[I]人工生物发光酶
1.关于本发明的人工荧光素酶(ALuc)群
(1－1)关于桡脚类荧光素酶：
作为发光性的海洋动物，已知来自Metridia okhotensis、腹突乳点水蚤(Pleuromamma abdominalis)、Lucicutia ovaliformis、Heterorhabdustanneri、Heterostylites major、Gaussia princeps、海肾(Renilla reniformis)、Metridia pacifica、Lucicutia grandis、Lucicutia bicormuta、剑乳点水蚤(Pleuromamma xiphias)、Pleuromamma scutullata、Haloptiluspseudooxycephalus、长突平头水蚤(Candacia longimana)、哥伦布平头水蚤(Candacia columbiae)、双刺平头水蚤(Candacia bipinnata)、Calanusjashnovi、冠新哲水蚤(Neocalanus cristatus)、Neocalanus flemingeri、羽新哲水蚤(Neocalanus plumchrus)、大舟哲水蚤(Scaphocalanusmagnus)、Spinocalanus spinipes、真刺水蚤(Euchaeta marina)、Undeuchaeta plumose、大波刺水蚤(Undeuchaeta major)、千岛黄水蚤(Xanthocalanus kurilensis)、Scaphocalanus magnus Gaidius variabilis、Euchirella amoena、海萤(Cypridina，CLuc)、螅蛋白(奥贝林，Obelin)、aqualine、Oplophorus的海洋生物产生生物发光酶(荧光素酶)。
本发明中，称为“桡脚类荧光素酶”时，意指作为这些“发光性的海洋动物”中的被称为桡脚类的发光性浮游生物生存的微小的甲壳类所产生的发光酶(荧光素酶)。具体而言，包括MoLuc1、MoLuc2、PaLuc1、PaLuc2、LoLuc、HtLuc1、HtLuc2、HmLuc1、HmLuc2、Gaussiaprinceps荧光素酶(GLuc)、海肾荧光素酶(RLuc)、桡脚荧光素酶(MLuc、MpLuc1、MpLuc2)、海萤荧光素酶(CLuc)等。作为“桡脚类荧光素酶”的基质特异性，特异性地使“腔肠素(coelenterazine)”氧化。通常，具有在深海环境、即、最适宜pH约为7.5～8、最适宜温度约为4～10℃引发发光反应的酶的特性，但是在该范围以外的条件下也能够广泛地引发发光。以下，在本发明中称为“桡脚类荧光素酶”时，是指具有与已知的来自桡脚类的荧光素酶相同的酶活性上以及结构上的特征的荧光素酶。具体而言，是具有最适宜pH约5～8、最适宜温度约4～25℃、具有以“腔肠素”基质引发发光反应的酶活性的荧光素酶，意味着在结构上具有2个酶活性结构域、N末端具有分泌信号、分子量为20kD左右(18kD－28kD)、与其他发光酶相比具有最小分子量的荧光素酶。“桡脚类荧光素酶”之间，氨基酸序列上的相同性也有约50％以上，亲水性－疏水性模式和酶活性区域的位置等氨基酸序列上的结构也类似，与其他的来自海洋生物的荧光素酶相比，可以说是发光强度高的荧光素酶。
本说明书中，“腔肠素”并非限定为天然型的腔肠素(Native CTZ)，也包括天然型的腔肠素的各种衍生物。即，“腔肠素”也可以称为“腔肠素类”。作为腔肠素的具体例，可以例示天然型的腔肠素(NativeCTZ)、腔肠素ip(CTZ ip)、腔肠素i(CTZ i)、腔肠素hcp(CTZ hcp)、腔肠素400A(CTZ 400A)、腔肠素fcp(CTZ fcp)、腔肠素cp(CTZ cp)、腔肠素f(CTZ f)、腔肠素h(CTZ h)、腔肠素n(CTZ n)等。
(1－2)关于本发明的人工荧光素酶(ALuc)群
本发明的新的人工荧光素酶(ALuc)是以这些“桡脚类荧光素酶”群的氨基酸序列为基础研制的，保持了上述基质特异性和最适宜pH等的“桡脚类荧光素酶”的基本的作为酶的特性，并且在发光强度、长波长的发光、发光的稳定性等发光特性中，获得了显著的优异的特性，是划时代的人工荧光素酶。
本发明中的典型的人工荧光素酶(ALuc)是ALuc10(序列号11)、ALuc15(序列号12)、ALuc16(序列号13)、ALuc17(序列号24)、ALuc18(序列号14)、ALuc19(序列号25)、ALuc21(序列号26)、ALuc22(序列号15)、ALuc23(序列号16)、Luc24(序列号27)、ALuc25(序列号17)、ALuc26(序列号28)、ALuc27(序列号29)、ALuc28(序列号30)、ALuc29(序列号31)、ALuc30(序列号32)、ALuc31(序列号33)、ALuc32(序列号34)、ALuc33(序列号35)和ALuc34(序列号36)。本发明的人工荧光素酶(ALuc)能够表示为包含以下的(i)～(iii)中任一项所述的氨基酸序列、具有桡脚荧光素酶活性的多肽。
(i)序列号11～17或24～36的任一项所示的氨基酸序列，
(ii)序列号11～17或24～36的任一项所示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，
其中，这里的多个表示1～20个、优选1～10个、更优选1～5个。
(iii)与序列号11～17或24～36的任一项所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，
在此，更优选具有例如95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上的同一性的氨基酸序列。
此外，本发明的人工荧光素酶(ALuc)的氨基酸序列均具有图1C、图1D、图1E所示的共通的基本骨架。只要具有这些基本骨架，即使其他位置的氨基酸为任意的氨基酸，也具有同等的高性能的桡脚荧光素酶活性。因此，本发明的人工荧光素酶(ALuc)还能够表示为包含以下的(iv)～或(vii)所记载的氨基酸序列、具有桡脚荧光素酶活性的多肽。
(iv)序列号37所示的氨基酸序列，或者
(v)序列号37所示的氨基酸序列中，1-29位或214-218位的至少任意区域中1个以上的氨基酸缺损的氨基酸序列。
(iv)序列号38所示氨基酸序列，或者
(v)序列号38所示的氨基酸序列中，1-31位或217-221位的至少任意区域中1个以上的氨基酸缺损的氨基酸序列。
(vi)序列号22所示的氨基酸序列，或者
(vii)序列号22所示的氨基酸序列中，1-29位或211-215位的至少任意区域中1个以上的氨基酸缺损的氨基酸序列。
在此，序列号22所示的氨基酸序列中，N末端侧的直至1-20位的氨基酸是分泌信号(secretion peptide，SP)，另外，C末端侧的211-215位的肽是富含甘氨酸的连接性的肽(通称为GS Linker)，因而，任意区域的部分或全部的氨基酸可以缺损。序列号37所示的氨基酸序列中N末端侧的1-20位和C末端侧的214-218位、以及序列号38所示的氨基酸序列中N末端侧的1-20位和C末端侧的217-221位也是一样的。关于分泌信号，已知：例如，在作为桡脚类发光酶的Metridia pacificaluciferase 1(MpLuc1)的情况下，对应于1-18位的氨基酸；在pleuromamma luciferase的情况下，对应于1-19位的氨基酸，任意氨基酸都可以缺损。
并且，如后述的实施例1－21等中所验证的那样，即使将序列号22所示的氨基酸序列中20-29位的区域(序列号37所示的氨基酸序列中，对应于20-29位；序列号38所示的氨基酸序列中，对应于20-31位的区域)取代为功能性氨基酸序列(例如抗原识别部位、亲和层析柱识别部位、定位信号等)，人工发光酶的功能也不会被明显抑制。因此，该区域的部分或全部的氨基酸可以缺损。
下面，对序列号22、序列号37和序列号38所示的氨基酸序列中Xaa所表示的氨基酸进行详细说明。
序列号37中的Xaa所表示的氨基酸中，3、20-27、29、30、33、35、62-64、67、74、75、83、84、87、88、127、137-145、147、156、158、185、188、199、203位的氨基酸可以为任意的氨基酸。其中，74-75、137-140位可以缺失。优选3位为E或G，20-27位为PTENKDDI序列(序列号41)、ATINEEDI序列(序列号42)、ATINENFE序列(序列号43)、HHHHHHHH序列(序列号44)、EKLISEE序列(序列号45)、MMYPYDVP序列(序列号46)或MMDYKDDD序列(序列号47)，29位为I、L、Y或K，30位为V、D或A，33位为E、G或A，35位为K、S或G，62-64位为ANS序列或DAN序列，67位为D或G，75-76位为GG序列或者为K(1残基缺失)或可以缺失，83-84位为LE、KA或KE序列，87-88位为KE序列、IE序列、LE序列或KI序列，127位为E、G或A，137-145为IGEA序列(4残基缺失、序列号48)、IVGA序列(4残基缺失、序列号49)、ITEEE序列(3残基缺失、序列号50)或IGGPIVD序列(序列号51)，147位为D或L，156位为D、E、N、F、Y或W，158位为E或L，185位为K、F、Y或W，188位为D、A、N、F、Y或W，199位为A或K，203位为S、D、N、F、Y或W。
并且，该13、16、36、148、171、215位的氨基酸为疏水性氨基酸(例如V、F、A、L)，优选13位为V或F，16位为V或A，36位为F或G，148位为I或G，168位为V或A，215位为A或L。
该5、65、73、99、117、211位为亲水性氨基酸(例如Q、K、D、R、H、E、T)，优选5位为Q或K，65位为D或R，73位为K、H、R或E，99位为T或H，117位为K、E或Q，211位为K或T。
该4、6、7、10、11、15、31、32、37-39、61、66、72、76、81、136、157、200位为脂肪族氨基酸。优选4、6、7、10、11、15、32、61、76、81、157位为高分子量脂肪族氨基酸(例如I、V、L、M)，更优选4位为I或V，6位为V或L，7位为L或I，10位为L或V，11位为I或L，15位为L或V，32位为I或V，61位为L或V，76位为L或M，81位为L或M，157位为L或M。并且，优选31、34、37-39、66、72、136、200位为低分子量脂肪族氨基酸(例如A、G、T、L)，更优选31位为G、L或A，34位为G或I，37位为G、A、S或F，38位为T或F，39位为T或A，66位为A或G，72位为G或可以缺失，136位为G或A、200位为T或G。
70、71、95、108位为具有正电荷的氨基酸(碱性氨基酸，例如K、R、H)，优选70位和71位为R或者可以缺失，95位为K或R，108位为H或K。
60位和208位为具有负电荷的氨基酸(酸性氨基酸，例如N、D、Q、E)，优选60位为N或D，208位为Q或E。
序列号38中的Xaa所表示的氨基酸中，3、20-29、31、32、35、37、64-66、69、76-77、85-86、89-90、129、140-144、148-151、159、161、188、191、202、206位的氨基酸可以是任意氨基酸。其中，22-23、39-40、76-77、140、148-151位可以缺失。优选3位为E或G，20-29位为PTENKDDI序列(2残基缺失、序列号52)、ATINEEDI序列(2残基缺失、序列号53)、ATINENFEDI序列(序列号54)、HHHHHHHH序列(2残基缺失、序列号55)、EKLISEE序列(2残基缺失、序列号56)、MMYPYDVP序列(2残基缺失、序列号57)或MMDYKDDD序列(2残基缺失、序列号58)，31位为I、L、Y或K，32位为V或A，35位为E或G，37位为K或S，64-66位为ANS序列或DAN序列，69位为D或G，76-77位为GG序列或K(1残基缺失)或者可以缺失，85-86位为LE、KA或KE序列，89-90位为KE序列、IE序列、LE序列或KI序列，129位为E、G或A，140-144位为TEEET序列(序列号59)、GEAI序列(1残基缺失、序列号60)或VGAI序列(1残基缺失、序列号61)，148-151位为GVLG序列(序列号62)或I(3残基缺失)或者可以全部缺失，159位为D、E、N、F、Y或W，161位为E或L，188位为K、F、Y或W，191位为D、A、N、F、Y或W，202位为A或K，206位为S、D、N、F、Y或W。
该13、16、174、218位的氨基酸为疏水性氨基酸(例如V、F、A、L)，优选13位为V或F，16位为V或A，174位为V或A，218位为A或L。
该5、67、75、101、119、214位为亲水性氨基酸(例如Q、K、D、R、H、E、T)，优选5位为Q或K，67位为D或R，75位为K、H、R或E，101位为T或H，119位为K、E或Q，211位为K或T。
该4、6、7、10、11、15、33、34、39-41、63、68、77、78、83、138、160、203位为脂肪族氨基酸。其中，39、40、70位可以缺失。优选4、6、7、10、11、15、34、63、78、83、160位为高分子量脂肪族氨基酸(例如I、V、L、M)，但有时也可以混入低频率的低分子量脂肪族氨基酸。更优选4位为I或V，6位为V或L，7位为L或I，10位为L或V，11位为I或L，15位为L或V，34位为I或V，63位为L或V，78位为L或M，83位为L或M，160位为L或M。并且，优选33、39-41、68、74、137、203位为低分子量脂肪族氨基酸(例如A、G、T)，但有时也可以混入低频率的高分子量脂肪族氨基酸。更优选33位为G、L或A，39位为G或A或者可以缺失、为S或F，40位为T或者可以缺失，41位为T或A，68位为A或G，74位为G或者可以缺失，137位为G或A，203位为T或G。
72、73、97、110位为具有正电荷的氨基酸(碱性氨基酸，例如K、R、H)。其中，72位和73位可以缺失。优选72位和73位为R或者可以缺失，97位为K或R，110位为H或K。
62位和211位为具有负电荷的氨基酸(酸性氨基酸，例如N、D、Q、E)，优选62位为N或D、211位为Q或E。
序列号22中的Xaa所表示的氨基酸中，3、22、26、27、30、33、35、37-39、62、63、67、71-75、87、127、138、140-142、155、185、197位的氨基酸可以为任意的氨基酸，其中71－75位、140-142位的氨基酸可以部分或全部缺失。在亲水性氨基酸中，优选3位、22位、27位、33位、127位、140位、141位、155位为E，26位、30位、62位、67位、185位为D，35位、87位为K，37位为S，38位、39位、138位、142位、197位为T，63位为N，71位为R，并且73位为D或H。在疏水性氨基酸中，优选3位、37位、67位、72位、74位、75位、138位、197位为G，22位、27位、141位为I，30位为V，33位、39位、62位、63位、127位、140位、155位、185位为A，87位为L，并且26位、38位为F。
并且，该4、6、7、10、11、13、15、16、20、31、34、36、61、66、81、168位的氨基酸为疏水性氨基酸，优选4位为I或V，6位为V或L，7位为I或L，10位为V或L，11位为I或L，13位为V或F，15位为V或L，16位为V或A，20位为A或P，31位为L或G，34位为I或G，36位为F或G，61位为V或L，66位为A或G，81位为L或M，并且168位为V或A。
该5、24、25、60、64、65、70、95、108、153、200、208位的氨基酸为亲水性氨基酸，优选5位为Q或K，24位为K或E，25位为D或N，60位为D或N，64位为N或S，65位为D或R，70位为K或R，95位为K或R，108位为K或H，153位为E或D，200位为D或S，并且208位为K、H或T。
作为序列号22所示的氨基酸序列的典型例，可以列举ALuc10、ALuc15、ALuc16、ALuc18、ALuc22、ALuc23和ALuc25。
在本发明的人工荧光素酶的一个方式中，作为序列号38所示的氨基酸序列中的1-71位的区域(也相当于序列号37所示的氨基酸序列中的1-69位的区域、以及序列号22所示的氨基酸序列中的1-69位的区域)，具有序列号39所示的氨基酸序列。作为典型例，可以列举ALuc15、ALuc16、ALuc17、ALuc18、ALuc24。
本发明的人工荧光素酶的另一个方式中，作为序列号38所示的氨基酸序列中的1-157位的区域(也相当于序列号37所示的氨基酸序列中的1-155位的区域、以及序列号22所示的氨基酸序列中1-152位的区域)，具有序列号40所示的氨基酸序列。作为典型例，可以列举ALuc22、ALuc25、ALuc26、ALuc27、ALuc28、ALuc29。
在本发明的人工荧光素酶的又一方式中，在内部具有抗体识别部位(epitope序列)。“抗体识别部位”或“epitope序列”也可以称为“抗原位点”。典型地，ALuc30、ALuc31、ALuc32和ALuc34符合。
具体而言，在内部具有抗体识别部位(epitope序列)的人工荧光素酶的序列号38中20-29位或序列号37中20-31位的区域包含抗体识别部位(epitope序列)。作为抗体识别部位(epitope序列)的优选例，可以列举His-tag(HHHHHH)(序列号5)、FLAG-tag(DYKDDDDK)(序列号6)、Myc-tag(EQKLISEEDL)(序列号7)、HA-tag(YPYDVPDYA)(序列号8)，但并不限定于这些。
在内部具有His-tag的人工荧光素酶的一例中，序列号38中20-29位或序列号37中20-31位的氨基酸全部为H(His x 8序列)。作为典型例，可以列举ALuc30和ALuc31。
在内部具有c-Myc-tag的人工荧光素酶的一例中，序列号38中20-29位或序列号37中20-31位的区域的序列为EQKLISEEDL(Myc-tag序列、序列号7)。作为典型例，可以列举ALuc32。
在内部具有HA-tag的人工荧光素酶的一例中，序列号38中20-29位或序列号37中20-31位的氨基酸为YPYDVPDYA(HA-tag序列、序列号8)。作为典型例，可以列举ALuc33。
在内部具有FLAG-tag的人工荧光素酶的一例中，序列号38中20-29位或序列号37中20-31位的氨基酸为DYKDDDDK(FLAG-tag序列、序列号6)。作为典型例，可以列举ALuc34。
2.关于本发明的新的人工荧光素酶(ALuc)的创立
(2－1)本发明的新的荧光素酶(ALuc)所要求的发光特性
作为桡脚类荧光素酶所要求的发光特性，具体可以举出高亮度发光强度、以及向长波长侧迁移的发光光谱、高发光稳定性、耐热性和耐盐性。通过使发光的光谱向长波长侧迁移，皮肤组织和脏器等中的发光的组织透过性增强，长波长发光光谱也是作为用于生物检测或诊断探针用发光酶的报告蛋白的重要的发光特性。并且，发光强度越强，越是可以期待在各种生物检测中即使以少量的发光分子也能够实现检测的效果。并且，如果维持随时间的发光稳定性，发光信号的可靠性就会提高，可以期待分子成像时退色性的缓和。并且，通过具有耐热性和耐盐性，具有在各种生物检测环境下均可以可靠地预期发光信号的优点。在本发明中，在对人工荧光素酶(ALuc)进行对比时，以是否具备这样的性质为中心进行比较，目标在于创立更好的人工荧光素酶(ALuc)。
(2－2)关于新的荧光素酶的创立法
现有技术中用于创立新的荧光素酶的方法之一是通过从各种桡脚类的体液直接提取mRNA，使用逆转录酶进行DNA化并插入表达载体(例如pcDNA3.1(+))，使其表达并进行评价，由此发现新的荧光素酶的方法。另一种方法是通过在已经创立的荧光素酶中导入变异从而产生新的性质进行强化的方法，作为新的变异体的创立方法一般采用。此时，碱基的变异方法能够适当采用部位突变法(也称为quick change法)等公知的方法(非专利文献18)。
但是，上述任一种方法都不是确保高性能的人工荧光素酶的创立方法。例如，迄今为止，虽然从发光动物创立了大量的新的种类的荧光素酶，但是具备能够立即产业化的优异性质的事例极为稀有，大多数情况下是还没有实用化就被遗忘。极少数情况下也有通过导入变异而改变了性质的事例，但是通常变异导入法的成功率低、带来好结果的变异导入例极少。即，在对具有200个氨基酸的蛋白质任意地导入一个变异的情况下，其命中的概率为1/4000(200AA×20AA(氨基酸种类))，随着2个、3个等氨基酸变异数目的增加，需要天文数字的变异导入，不能说是现实的方法。
因此，本发明的发明人以以下的着眼点为根据，创立了一系列的新的人工荧光素酶(ALuc)。
(2－3)用于创立本发明的人工荧光素酶的策略
着眼点1：首先，作为现有的蛋白质序列的理解法之一，提出了“共有序列驱动的诱变策略”(consensus sequence-driven mutagenesisstrategy)的方法(非专利文献13)。该方法是对现有数据库中的类似的氨基酸序列进行比对，以推定序列之间频率高的氨基酸是热力学稳定化效果最高的氨基酸为前提，对序列进行分析的方法。但是，该基于氨基酸相似性的比对方法，存在结果因人的偏见或数据库内的类似序列的数量而大幅度变动的缺点。本研究人员注意到这一点，进行了实施例1－1所示的氨基酸序列的相似性比对。
着眼点2：此外，以前提出了通过将1个荧光素酶的序列分成2个，对前后的序列进行比对，希望获得关于其发光特性的启发的探究(单序列比对，single sequence alignment，SSA)(非专利文献3)。该手法基于来自桡脚类发光动物的荧光素酶存在2个酶活性部位的前提。通过基于氨基酸相似性对这2个酶活性部位进行比对，能够简便地比较前后的酶活性部位的相似性。根据上述的氨基酸的频率与热力学稳定性相关的假说，希望通过该前后的序列间的相似性来制作热力学稳定的荧光素酶序列。
着眼点3：此外，判断出迄今为止发现的大量的来自桡脚类的荧光素酶中，中心部和C末端侧相类似，而N末端侧却是极其多样的。并且，已知在来自浮游生物的荧光素酶的情况下，N末端侧的约17个氨基酸是分泌信号。因此，为了高效地确定前所未有的N末端侧序列从而完成ALuc的整体，(1)基于氨基酸相似性，对上述的现有的数据库中的类似的氨基酸序列进行比对，从中提取频率高的氨基酸的方法；(2)并用通过研究由此提取的氨基酸序列的特质的公用软件(PSORTII)得到的序列分析，最终确定大量的一系列的候补N末端侧ALuc序列群。
例如，利用PSORTII调查人工制作的N末端侧的序列特性，结果显示了以下的定位预测(部分例)。
ALuc2的N末端侧
0％：细胞外(extracellular)
22.2％：胞质溶胶(cytosol)
33.3％：ER
ALuc3的N末端侧
67％：细胞外(extracellular)
11.1％：细胞(cyto)
11.1％：ER
SP1的情况
44.4％：内质网(endoplasmic reticulum)
33.3％：线粒体(mitochondrial)
11.1％：高尔基体(Golgi)
11.1％：细胞核(nuclear)
SP2的情况
33.3％：细胞外(extracellular)，包括细胞壁
22.2％：液泡(vacuolar)
22.2％：细胞质(cytoplasmic)
22.2％：内质网(endoplasmic reticulum)
SP4的情况
55.6％：细胞外(extracellular)，包括细胞壁
22.2％：内质网(endoplasmic reticulum)
11.1％：细胞质(cytoplasmic)
11.1％：液泡(vacuolar)
着眼点4：目前创立的来自桡脚类的荧光素酶的氨基酸序列的长度时各种各样的，分子量也为20-36kD是多种多样的，其多样性主要起因于富于变化的N末端侧的序列。因此，在本发明中，在确定N末端侧的序列时，在提取频率高的氨基酸的大原则下，分成N末端侧的氨基酸序列较短的群(ALuc5-7)和较长的群(ALuc2-3和ALuc8-25)来构建，确定人工荧光素酶(ALuc)群的氨基酸序列的整体图。
(2－4)本发明的人工荧光素酶(ALuc)群的合成
按照上述着眼点1～4的策略，进行确定氨基酸序列的操作，制作了大量的新的候补序列。为了使该氨基酸序列群用于实际的表达，基于遗传密码子(codon)表，应用与各氨基酸对应的遗传密码子。此时，为了能够顺利地在哺乳类动物细胞中表达，确定一系列的密码子使其能够在小鼠细胞中最为适当地表达。将作为其一个示例的碱基序列表示为序列号23。
在该一系列的基因序列中导入多个制限酶位点，委托基因合成的专业制造商(Operon公司)合成，使用以插入任意载体的形态获得的编码人工荧光素酶(ALuc)的合成基因群，制造在Invitrogen公司的pcDNA3.1(+)中插入的一系列的亚克隆(subclone)载体群。将该载体导入来自非洲绿猴肾脏的COS-7细胞中，利用各种分光器(例如光度计(Luminometer)(GloMax 20/20n，Promega)、分光光度计(Spectrophotometer)(AB-1850，ATTO)、图像分析仪(Image analyzer)(LAS-4000，FujiFilm)、全自动定量绘图酶标仪(Microplate reader)(Corona))测量所获得的人工荧光素酶(ALuc)群的发光特性，利用下述(3－1)的方法评价酶活性，反馈于氨基酸序列，从而创立本发明的新的人工荧光素酶(ALuc)群。
3.本发明的人工荧光素酶(ALuc)的酶活性
(3－1)酶活性的确认方法
ALuc的酶活性例如能够通过以下方法验证。
首先，使用公知的基因导入用脂质试剂，将编码ALuc的表达载体导入来自非洲猿的COS-7细胞，为了进行比较，也按照相同方法将不含变异的现有的具有GLuc的表达载体导入细胞中。在导入载体后经过一定时间(10～20小时，例如16小时)后，使用已知的细胞裂解试剂制作细胞裂解液。
之后，将细胞裂解液与含有腔肠素的已知的基质溶液混合，测定发色强度和发光随时间的稳定性等。
发光强度可以使用现有的发光分光光度计，采用在添加公知的基质后进行测定的方法，测定特定波长下的强度，通过每分钟进行测量，能够由发光随时间的变化评价其稳定性。为了测定向长波长侧的迁移，进行全波长扫描。
(3－2)本发明的人工荧光素酶(ALuc)的酶活性的特征
本发明的典型的人工荧光素酶(ALuc)为ALuc10(序列号11)、ALuc15(序列号12)、ALuc16(序列号13)、ALuc17(序列号24)、ALuc18(序列号14)、ALuc19(序列号25)、ALuc21(序列号26)、ALuc22(序列号15)、ALuc23(序列号16)、Luc24(序列号27)、ALuc25(序列号17)、ALuc26(序列号28)、ALuc27(序列号29)、ALuc28(序列号30)、ALuc29(序列号31)、ALuc30(序列号32)、ALuc31(序列号33)、ALuc32(序列号34)、ALuc33(序列号35)和ALuc34(序列号36)。
作为由现有的桡脚类荧光素酶观察到的共有的酶活性的特征，有：
(1)具有显示一时性的强光的特征，发光稳定性欠缺；
(2)N末端具有分泌信号；
(3)发光酶的大小比其他的发光酶小；
(4)普遍表现出蓝色(480nm)。
本发明的ALuc系列均原样地保持了(2)和(3)的特征，但关于(1)发光稳定性，与现有的桡脚类荧光素酶相比，却格外高。特别是ALuc15、ALuc16、ALuc17、ALuc18、ALuc19、ALuc20、ALuc21、ALuc22、ALuc23、，ALuc24、ALuc25、ALuc26、ALuc27、ALuc28、ALuc29、ALuc30、ALuc31、ALuc32、ALuc33、ALuc34显示了稳定性极高的发光信号。另外，关于(4)发光色，ALuc15、ALuc16、ALuc17、ALuc18、ALuc19、ALuc20、ALuc21、ALuc22、ALuc23、ALuc24、ALuc25、ALuc26、ALuc27、ALuc28、ALuc29、ALuc30、ALuc31、ALuc32、ALuc33、ALuc34均显示出长波长迁移的发光光谱(绿色或黄色)。
如上所述，根据本发明，保持了现有的桡脚类荧光素酶的优点，并且克服了共有的问题点，是极有前途的人工发光群。
4.本发明的人工荧光素酶(ALuc)的功能提高
关于本发明的人工荧光素酶(ALuc)的用途，典型地可以作为现有的生物发光探针中的发光酶的要素使用，除此之外，由于发出亮度极高的稳定的发光信号，还可以列举作为活体内的各种荧光成像用报告基因的代替品使用等用途。总之，主要的用途是在以人为代表的哺乳动物的活体内、或试管内的哺乳动物细胞中使用。
因此，作为其他的用于提高功能的变化，将对应于各氨基酸的密码子变更为适合于各宿主生物种的密码子而形成容易表达的密码子的变化、以及为了间接地提高功能而改善表达启动子的性能是有效的。并且，通过使本人工生物发光酶(ALuc)的N末端和/或C末端带有功能性肽，能够期待各种各样的附加功能。例如，通过使N末端和/或C末端带有细胞膜定位信号(membrane localization signal，MLS)，能够使ALuc本体定位于细胞膜。此时，是否存在来自ALuc的N末端侧的分泌信号(1-20位或其部分序列)均可，但是通过存在该分泌信号，由于经由内质网，因而即使对于含有ALuc的融合蛋白，有时也能够提高折叠效率。此外，在本发明中，在没有特别说明的情况下，在包含信号肽、结合2种以上的肽时，可以适当使用公知的接头调节其长度、可读框等。通过使ALuc定位于细胞膜，来自外部的基质和氧的供给顺利进行，在以ALuc为基础的发光探针(例如发光胶囊)时，具有能够迅速响应外部信号的优点(参考实施例1－8)。在本发明中可以根据需要适当采用。关于这种用于提高功能的变化策略，具体例示如下，但不限定于这些手法。
5.本发明荧光素酶(ALuc)在“报告分析法”中的应用
(5－1)关于本发明的“报告分析法”
本发明的ALuc及其基因适合作为各种“报告分析法”中的“报告蛋白”或“报告基因”使用。
本发明中称为“报告蛋白”或“报告基因”时，是指为了研究响应了外部刺激的细胞内的靶蛋白或靶基因的行为而使用的发光标识。此外，在本发明中称为“报告分析法”时，是指通过将本发明的ALuc及其基因用作“报告蛋白”或“报告基因”，将响应了外部刺激的细胞内的靶蛋白或靶基因的行为转换成由ALuc得到的发光的有无或发光量、发光时期或其发光位置进行观察的分析法，具体而言，也可以称为将靶基因的表达位置、表达时期或表达量作为报告蛋白的ALuc的发光位置、发光时期或发光量进行定性或定量测定的方法。
具体而言，将报告蛋白与靶蛋白的N末端和/或C末端融合作为融合蛋白使用的情况是典型的，也有时将分成N末端和C末端2部分的报告蛋白与靶蛋白直接融合或经由其他的肽序列融合。作为报告基因的典型的使用方法，可以用于通过制作在靶基因的5'或3'末端连接的嵌合基因来研究表达后的靶蛋白的行为。同样，也可以将报告基因分成2部分，分别插入靶基因的5'末端或3'末端使用，或者插入靶基因中使用。
本发明的报告蛋白使用上述ALuc的定义，能够记载如下。
一种由多肽构成的报告蛋白，该多肽包含下述(i)～(vii)的任一项所述的氨基酸序列，并且具有桡脚类荧光素酶活性，
(i)序列号11～17或24～36所示的氨基酸序列，
(ii)序列号11～17或24～36的任一项所述的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列。
其中，这里的多个表示1～20个、优选1～10个、更优选1～5个，
(iii)与序列号11～17或24～36的任一项所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，
(iv)序列号37所示的氨基酸序列，
(v)序列号37所示的氨基酸序列中，1-29位或214-218位的至少任意区域中1个以上的氨基酸缺损的氨基酸序列，
(vi)序列号38所示的氨基酸序列，
(vii)序列号38所示的氨基酸序列中，1-31位或217-221位的至少任意区域中1个以上的氨基酸缺损的氨基酸序列，
(viii)序列号22所示的氨基酸序列，或
(ix)序列号22所示的氨基酸序列中，1-29位或211-215位的至少任意区域中1个以上的氨基酸缺损的氨基酸序列。
本发明的报告蛋白，在活体内等in vivo条件下使用的情况下，将由编码上述(i)～(ix)所示的氨基酸序列的核酸构成的“报告基因”与靶基因连接，插入载体等中，导入作为靶的细胞内。
以下，将本发明的“报告分析法”分成Niu等人在非专利文献16中记载的3类“basic”、“inducible”和“activatable”这三类，对于本发明的ALuc在各分析法中应用进行说明。在此，“basic”法可以说是最简单的报告分析体系，是仅通过将ALuc与各种被检蛋白质连接进行标识的报告分析体系。作为典型例，可以列举与抗体连接的生物发光酶融合蛋白(即，生物发光酶标识抗体)。“inducible”法与“basic”法相比，在报告分子的表达由启动子控制这一点上是不同的。典型而言，可以列举生物发光共振能量转移(BRET)法、还可以列举所谓的报告基因检测或双杂交检测(依赖于刺激而表达报告分子)。此外，“activatable”法是利用报告本身能动性地响应配体刺激而进行发光的报告分析法，典型而言，可以列举单分子型生物发光探针、发光胶囊，此外，能够应用于蛋白质互补检测(protein complentation assay，PCA)、蛋白质剪切检测(protein splicing assay，PSA)等。
(5－2)关于“basic”法
在将本发明的ALuc作为报告蛋白应用于“basic法”时，制作简单地将ALuc与靶蛋白连接的融合蛋白即可。此时，利用非控制型启动子进行表达，这一点与其他报告分析法不同。
其中，在本说明书中，所谓“融合蛋白”包括：(i)由编码含有报告蛋白ALuc和靶蛋白或识别靶蛋白的肽的融合蛋白的基因作为整体表达的情况、(ii)使报告蛋白ALuc和靶蛋白或识别靶蛋白的肽分别表达、再通过化学反应将它们连接的情况等。在通过化学反应将分别表达的蛋白质等连接的方法，例如可以例示通过交联剂(crosslinker)的连接、利用抗生物素蛋白－生物素的结合能的连接、利用氨基酸残基的化学反应性的结合等。
对典型的与抗体结合的生物发光融合蛋白的情况进行说明，制作在抗体的单链可变区域片段(scFv)的cDNA的上游或下游连接了ALuc的基因的嵌合DNA，通过插入适当的表达载体中而完成。这种形式的报告分析法在本说明书的实施例1－15和1－16例示。
(5－3)关于“inducible”法
将生物发光酶作为报告蛋白应用于“inducible法”，一直以来用于通过重组DNA技术制作重组蛋白质时的基因表达的时期以及表达量的分析，特别是作为显示响应了外部刺激的表达時期和表达量变化的指标而被广泛应用。作为“inducible法”所包括的分析系统，有报告基因检测法(reporter gene assay)、酵母双杂交检测法(Yeast Two-hybridassay)、哺乳动物双杂交检测法(Mammalian Two-hybrid assay)、蛋白质剪切检测法(protein splicing assay，PSA)、蛋白质互补检测法(proteincomplementation assay，PCA)、循环排列检测法(circular permutationassay)、生物发光共振能量转移检测法(bioluminescence resonanceenergy transfer assay，BRET)等，通过使用本发明的ALuc作为这些分析系统所必须的报告基因，能够使检测的测量性能飞跃性地提高。这种形式的报告分析法在本说明书的实施例1－9中例示。
以下，对于作为典型的“inducible法”分析系统的报告基因检测法和双杂交检测法进行详细说明。
(i)报告基因检测法
报告基因检测法作为由外部刺激所引起的转录因子的活化和基因的表达调节的分析手段而被频繁使用，典型而言，可用于通过核内受体而扰乱信号传递的内分泌扰乱物质(环境荷尔蒙)的检测。与通过核内受体的信号传递相关的靶基因(例如荷尔蒙应答性基因)的表达，由于配体与受体的复合体与该基因的进行转录调节的cis区域(荷尔蒙应答序列，hormone response element)结合而引发。该检测法中，通过将在该各种荷尔蒙应答性基因的cis区域的下游插入了荧光素酶等的报告基因的质粒导入细胞内，利用生物发光量等检测能够作为配体的荷尔蒙分子或内分泌扰乱物质量。
作为此时的宿主细胞，优选使用通常的基因重组所使用的哺乳动物细胞的COS细胞、CHO-K1细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、NIH3T3细胞等，也可以使用酵母细胞、大肠菌等细菌细胞、昆虫细胞等。作为主要的用途，大多情况下在以人为代表的哺乳动物的活体内、或者在体外(in vitro)的哺乳动物细胞内使用。
在报告基因检测法中，在一直以来广泛使用的萤火虫荧光素酶的情况下存在如下缺点：[1]分子量大，直到表达，需要时间，所以宿主细胞承受大的负担，[2]发光强度低，因而直到蓄积足够的荧光素酶(报告分子)量通常在刺激后需要等待1～2天的时间。而通过选择本发明的ALuc作为报告蛋白能够解决这些问题。
如果使用本发明的ALuc作为报告蛋白，报告的发光强度极高，因而具有在刺激后能够在极短时间内测定的优点。因此，与现有的报告蛋白相比，能够大幅度缩短测量时间，并且随时间的发光稳定性也高，因此即使在基因导入效率差的细胞株中也能够进行发光测定。并且，由于向长波长侧迁移，因此通过细胞膜、皮肤的透过性高，因而背景值下降测定精度也高。
具体而言，在将本发明的ALuc应用于这些报告基因检测时，可以通过在上游搭载有特殊的启动子的现有的真核细胞表达载体上连接该发光酶，导入真核细胞中，经过一定时间后，在是否存在信号(刺激)的条件下进行测定(非专利文献20)。作为能够搭载该ALuc的、报告基因检测用的表达载体，可以利用公知的pTransLucent载体，使用已知的方法简单地使其搭载。
(ii)双杂交法
双杂交法(Two-hybrid法)是研究蛋白质间的相互作用的手法之一，1989年，最初构建了使用酵母(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)的酵母双杂交(Y2H)系统。利用作为转录活化因子的GAL4蛋白质的DNA结合结构域(GAL4DBD)与转录活化结构域能够分离的性质，使GAL4DBD和任意的蛋白质A(bait)作为融合蛋白表达，能够判断同时在细胞内表达的转录活化结构域(TA)与作为融合蛋白的蛋白质B(prey)是否发生相互作用。在上述蛋白质A与B结合的情况下，DBD与TA接近，DNA结合结构域(DBD)与“UASG”碱基序列结合，从而促进其下游连接的报告基因表达。在报告基因为荧光素酶时，如果在其特异性的基质的存在下监控生物发光，能够测定A、B两蛋白质的亲和性，能够进行与蛋白质A(bait)发生相互作用的蛋白质、肽的筛选。此时蛋白质B(prey)也能够通过表达文库来提供。
作为宿主细胞，不限于酵母细胞，也可以使用大肠菌等细菌类、或者哺乳动物细胞、昆虫细胞。此时，除了能够使用作为来自酵母的转录活化因子的GAL4DBD以外，还能够使用来自大肠菌的阻遏蛋白质的“LexA”等。将编码这些的DNA与编码配体应答性转录调节因子的配体结合区域等bait蛋白质(即，上述的任意的蛋白质A)的DNA连接，连接于能够在宿主细胞内实现功能的启动子的下游。另一方面，作为“转录活化因子的转录活化区域”，例如，能够使用GAL4的转录活化区域、来自大肠菌的B42酸性转录活化区域、单纯疱疹病毒VP16的转录活化区域等。将编码这些转录活化区域的DNA与编码prey蛋白质(即，上述的任意的蛋白质B)的DNA连接，连接于能够在宿主细胞内实现功能的启动子的下游。
具体而言，作为具有编码转录调节因子GAL4的DNA结合区域的DNA、能够在宿主细胞中利用出芽酵母的载体，能够列举质粒pGBT9(Clontech公司制)等。另外，作为具有编码GAL4的转录活化区域的DNA、能够在出芽酵母中利用的载体，能够列举质粒pGAD424(Clontech公司制)等。另外，作为具有编码GAL4的DNA结合区域的DNA、能够在哺乳类动物细胞中利用的载体，能够列举pM(Clontech公司制)、pBIND(Promega公司制)等。作为具有编码单纯疱疹病毒VP16的转录活化区域的DNA、能够在哺乳类动物细胞中利用的载体，能够列举pVP16(Clontech公司制)、pACT(Promega公司制)等。另外，作为具有编码LexA的DNA结合区域的DNA、能够在哺乳类动物细胞中利用的载体，能够列举pLexA(Clontech公司制)等，作为具有编码B42的DNA、能够在哺乳类动物细胞中利用的载体，能够列举pB42AD(Clontech公司制)等。
此时，例如可以构建将本发明的ALuc基因在GAL4结合的区域(“UASG”)等的下游作为报告基因插入的载体，如果为哺乳动物宿主，可以利用市面上销售的pG5Luc载体(Promega)或pFR-Luc载体(Stratagene)，代替该载体上搭载的萤火虫荧光素酶，利用公知方法简便地搭载本发明的荧光素酶(ALuc)来使用。另外，还可以代替市面上销售的pG5CAT载体(Clontech)的氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicol acetyltransferase，CAT)使用。
(5－4)关于“activatable”法
关于将生物发光酶作为“activatable”法的报告蛋白搭载的分析系统，以前，本发明的发明人作为“生物酶发光探针”技术进行了研究开发并使其发展。以下，作为典型的“activatable”法的例子，对本发明的ALuc在“生物酶发光探针”中的应用例、以及利用其的“细胞内成像法”进行说明。在这之前，先对本发明首次开发的“发光性融合蛋白(发光胶囊)”进行说明。此外，本发明的ALuc适合作为“activatable”法所包括的蛋白质互补检测(protein complentation assay，PCA)、蛋白质剪切检测(protein splicing assay，PSA)中的报告蛋白使用。
(i)发光性融合蛋白(发光胶囊)的制造
通过在本发明的ALuc的C末端侧结合膜定位信号(MLS)，使ALuc本体定位于细胞膜，这样进行定位于细胞膜的分子设计，从而使得基质和氧的供给顺利进行，能够以极高亮度实现稳定的生物发光可视化。此时，能够在编码ALuc本体和信号肽的核酸之间插入任意的多肽或蛋白质的基因作为载入物(称为cargo)。这样一来，能够将作为载入物的蛋白质有效地运送到细胞膜表面，并且能够使得所运到的部位发光。作为典型的例子，在各蛋白质的连接处插入响应细胞死亡的DEVD序列或IETD序列时，在细胞死亡时，能动性等将caspase-3或caspase-8的活性作为信号响应，作为可视化的系统工作。本发明的发明人将这种结构的发光性融合蛋白命名为“发光胶囊”。
该发光胶囊与现有的发光探针相比，显示出亮度极高且稳定的发光特性，具有对于不能通过细胞膜的检体也能够响应的优点。该发光胶囊以“发光酶本体的C末端”带有“膜定位信号(MLS)”的结构为基本骨架。在这种情况下或者将本发明的发光酶随机连接以增强发光量的情况下，也能够将引发细胞死亡的化合物等引起细胞表面形态改变的化合物的作用可视化为细胞膜表面的形态变化，观察变得容易。优选能够在发光酶本体的C末端与MLS之间插入引起细胞膜表面的形态改变的多肽或其部分识别序列，具体而言例如插入G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)或c-Src等的全长或部分识别序列。此外，通过在发光酶本体的C末端与MLS之间插入引发细胞死亡的多肽或者其识别序列作为载入物，能够实现细胞死亡的可视化。更具体而言，在将由各种半胱天冬酶(caspase)或蛋白酶(丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶等)、消化酶(胰蛋白酶、淀粉酶等)识别的肽序列(通常20氨基酸以下、优选10氨基酸以下)、例如实施例1－7所使用的包含“DEVD”或“IETD”的氨基酸序列作为载入物插入的情况下，能够实现由caspase-3活性所造成的细胞死亡可视化。并且，通过在发光酶本体与MLS之间连接荧光蛋白或其他发光酶作为载入物，与将本发明的发光酶随机连接的情况同样，细胞膜表面的光产生量增强，因而细胞膜的形态观察更为容易，对于不透过细胞膜的配体也能响应，因此能够实现对于宽范围的刺激物的筛选。
即，本发明的发光胶囊是在本发明的ALuc的C末端侧与膜定位信号(MLS)之间插入了希望在细胞膜表面表达的任意的蛋白质或多肽的发光性融合蛋白，典型地，
(a)在本发明的ALuc的C末端侧与膜定位信号(MLS)之间插入了荧光蛋白或荧光素酶的发光性融合蛋白。其中，作为荧光素酶，也可以是本发明的其他的ALuc。
(b)在本发明的ALuc的C末端侧与膜定位信号(MLS)之间插入了使细胞膜的形态改变的多肽或该多肽所识别的20氨基酸以下的、优选10氨基酸以下的多肽的发光性融合蛋白。在此，特别是作为使细胞膜的形态改变的多肽，优选引发细胞死亡的多肽，特别优选Caspase以及包含其识别序列“DEVD”或“IETD”的20氨基酸以下的多肽。
(ii)在发光探针中的应用
此外，通过将本发明的ALuc插入本发明的发明人已经申请的发明的单分子型发光探针(非专利文献4、6、9、10、专利文献1－4)或双分子型发光探针(非专利文献5、8)中，能够以高亮度观测配体的有无、配体的活性强度。作为该探针的构成要素，[1]在分成为2个的该发光酶(N和C末端侧片段)附近，将[2]响应靶配体的配体结合蛋白质与[3]识别配体结合蛋白质上结合有配体的识别蛋白质连接，以该形态构成高性能的发光探针。在该发光探针中，在上述识别蛋白质识别上述配体结合蛋白质上结合有配体时，被分成2个的上述酶片段相互补充地使酶活性改变。此外，由于该分割酶的高亮度和稳定性，能够实现检测极限的提高和可靠性高的测量。
在本发明中，称为“单分子型发光探针”时，是特征在于将用于进行可视化成像的全部构成要素聚集在单一融合分子内的一种公知的生物发光探针(专利文献1－2)。例如，为作为基本构成要素含有将本发明的ALuc分成2部分的N末端侧和C末端侧片段、配体结合蛋白质和配体结合蛋白质的识别蛋白质的融合蛋白。同样，称为“双分子型发光探针”时，是指本发明的ALuc的N末端侧片段和C末端侧片段分别存在于包含配体结合蛋白质的融合蛋白、以及包含识别蛋白质的融合蛋白内的类型的生物发光探针(参照本发明的实施例1－10)。
在这些生物发光探针中使用本发明的ALuc时，需要分成N末端侧片段和C末端侧片段2部分，其分割位置可以适用本发明的实施例1－10所示的分割位置或者与其相当的其他的ALuc酶的切断位置。
使用本发明的高亮度发光酶作为单分子型发光探针时的具体的手法可以按照专利文献1－4中详细记载的手法。具体而言，将本发明的荧光素酶(ALuc)分成2部分，设计编码发光探针的嵌合DNA，该发光探针在直线上结合有配体结合性的蛋白质和识别在该蛋白质上结合有配体时的立体结构变化的肽序列。通常，在适合于希望表达该嵌合DNA的细胞的载体内进行亚克隆，将该载体导入细胞内，使其在细胞内表达，也可以在嵌合DNA的上游连接控制序列而直接导入细胞内。在此，作为对象的细胞，优选来自包括人在内的哺乳动物的细胞，可以是存在于活体内的状态的细胞，也可以是维持了细胞本来的功能的状态的培养细胞。还可以是酵母细胞、昆虫细胞，此外还可以是大肠菌等的原核细胞。载体的具体的种类也没有特别限定，可以适当选择能够在用于表达的宿主中表达的载体。作为向细胞内的导入法，能够使用显微注射法或电穿孔法等公知的转染法。或者也能够采用利用脂质导入细胞内的方法(BioPORTER(Gene Therapy Systems社)、Chariot(Active Motif社)等)。
使用本发明的高亮度发光酶的生物发光探针作为嵌合DNA导入细胞内后，在细胞内作为融合蛋白表达，因而在对该转化细胞进行配体刺激后，测定来自该细胞的发光量的变化，由此能够评价配体的性质、活性的程度等。
在生物发光探针内构成本发明的高亮度荧光素酶(ALuc)时，作为能够与该ALuc一起搭载的“配体结合蛋白质”，是指在其配体结合部位结合配体的蛋白质。配体结合蛋白质，例如，通过结合配体而使得立体结构变化、或者引起磷酸化，能够促进蛋白质间的相互作用。作为这样的配体结合蛋白质，例如可以使用荷尔蒙、将化学物质或信号传递蛋白质作为配体的核内受体(NR)、细胞因子受体或者各种蛋白质激酶。配体结合蛋白质可以根据作为对象的配体适当选择。作为与配体结合蛋白质结合的配体，只要能够与配体结合蛋白质结合就没有特别限定，可以是从细胞外进入细胞内的细胞外配体，也可以是由于来自细胞外的刺激而在细胞内产生的细胞内配体。例如，可以是对于受体蛋白质(例如核内受体、G蛋白质结合型受体等)的兴奋剂或拮抗剂。此外，还可以是与参与细胞内的信息传递的蛋白质特异性地结合的细胞因子、趋化因子、胰岛素等的信号传递蛋白质、细胞内第二信使、脂质第二信使、磷酸化氨基酸残基、G蛋白质结合型受体配体等。
例如，在作为配体以细胞内第二信使、脂质第二信使等为对象的情况下，作为配体结合蛋白质，能够使用各第二信使的结合结构域。所谓第二信使是指通过荷尔蒙、神经传递物质等的细胞外信息传递物质与存在于细胞膜的受体结合，而在细胞内新生成的别的种类的细胞内信息传递物质。作为该第二信使，例如，可以列举cGMP、AMP、PIP、PIP2、PIP3、肌醇三磷酸(IP3：inositol triphosphate)、IP4、Ca2+、甘油二酯、花生四烯酸等。例如，对于第二信使的Ca2+，能够使用钙调蛋白(CaM)作为配体结合蛋白质。
(iii)细胞内成像
此外，通过使用编码该ALuc的基因，能够稳定地导入各种细胞株中。作为一例，能够在胚胎未分化细胞、ES细胞或新型万能细胞(iPS)中稳定地导入该ALuc。由于上述细胞本身不发光，因而探索在内部发生的分子现象、组织特异性是非常困难的。为了克服该困难，首先，在体细胞中导入含有该ALuc的分子探针，之后形成胚胎，使其分化为各种脏器组织。于是，能够以高灵敏度测量在各脏器中发生的特异的分子现象。
此时，按照山中等人的手法进行(非专利文献17)。
另外，通过在本ALuc上连接适当的信号肽，能够用于各小细胞器的高亮度成像。例如，通过使ALuc的N或C末带有来自GAP-43的“MLCCMRRTKQV序列”(序列号1)，能够定位于细胞膜。另外，为了定位于细胞质，可以带有“GRKKRRQRRR序列”(序列号2)。此外，为了定位于内质网(ER)和细胞核，能够通过分别连接“KDEL”(序列号3)和“DPKKKRKV序列”(序列号4)实现。此外，通过带有HIS-tag(HHHHHH)(序列号5)、FLAG-tag(DYKDDDDK)(序列号6)、Myc-tag(EQKLISEEDL)(序列号7)、HA-tag(YPYDVPDYA)(序列号8)、V5-tag(GKPIPNPLLGLDST)(序列号9)、T7-tag(MASMTGGQQMG)(序列号10)等的抗原位点，能够用于非细胞体系的免疫染色、分离精制。此时，适合采用公知的免疫染色法、免疫细胞化学(immunocytochemistry)等的手法。
[II]最适合生物检测的反应溶液的确定
1.生物检测用缓冲液
(1－1)裂解缓冲液(细胞裂解液)和检测缓冲液(反应液)
一直以来，生物检测中，分为裂解缓冲液(细胞裂解液)和检测缓冲(反应液)进行检测。可以认为，为了使细胞迅速裂解，高裂解力、对发光酶的低抑制性是必须的，另一方面，可以认为，在生物检测反应时，为了稳定的检测条件和降低背景，必须除去或研究引发自发光的成分。
一直以来，普洛麦格公司(Promega)分别以制品名Luciferase AssayBuffer(目录序号：E290A)和制品名Luciferase Lysis Buffer(目录序号：E291A)销售着裂解缓冲液和检测缓冲液，NEB公司也分别以制品名Luciferase Assay Buffer(目录序号：E3300S)和Luciferase LysisBuffer(目录序号：B3321)销售着裂解缓冲液和检测缓冲液。此外，普洛麦格公司(Promega)、NEB公司的市售品的成分组成并未公布，但均显示为分为检测缓冲液和裂解缓冲液的复杂的程序。
在本发明中，如上所述，为了消除上述的复杂的程序以及提高反应的稳定性和灵敏度，进行了下述的各缓冲成分的组成的研究。
(a)表面活性剂：聚氧乙烯辛基苯基醚(polyoxyethyleneoctylphenyl ether，TritonX-100，TX100)、Nonidet P-40(NP40)、聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(polyoxyethylene sorbitan monolaurate，Tween20，TW20)、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(polyoxyethylenesorbitan monooleate，TW80)、聚氧乙烯十六烷基醚(polyoxyethylenecetyl ether，Brij58)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)等。
作为亲水度的程度，为TW20＞Brij58＞TW80＞TX100＞NP40的顺序；作为表面活性度的程度，为NP40＞TX100＞Brij58＞TW20＞TW80的顺序。
(b)盐类：NaCl、KCl、(NH4)2SO4等
(c)SH试剂：巯基乙醇、DTT等
(d)多元醇：甘油、葡萄糖、蔗糖等
(e)二元醇类：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)
(f)螯合剂：EGTA、EDTA等
(g)蛋白酶抑制剂：抑蛋白酶肽(分子量6.5kD)、亮抑酶肽(分子量：427)、胃蛋白酶抑制剂A(pepstatin，分子量：686)、苯甲基磺酰氟(phenylmetylsulfonyl Fluoride，PMSF、分子量：174)、抗蛋白酶(Antipain，分子量：605)、胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymostatin，分子量：608)、pefabloc SC(AEBSF，240Da)、DFP(184Da)、p-APMSF(216Da)、STI(20,100Da)、Leupeptin(460Da)、N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮、3,4-二氯异香豆素(215Da)、EDTA-Na2(372Da)、EGTA(380Da)、1,10-邻菲罗啉(198Da)、磷酰二肽(phosphoramidon，580Da)，二硫代双(2-氨基-4-甲基戊烷)、E-64(357Da)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、丁苯抑制素、表苯丁抑制素盐酸盐、抑蛋白酶肽(aprotinin)、二甲胺四环素、ALLN(384Da)等、
(g)缓冲剂：对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、邻苯二甲酸盐、甘氨酸、反式乌头酸、甲酸、3,3-二甲基戊二酸、苯乙酸、乙酸钠、琥珀酸、二甲胂酸钠、马来酸氢钠、马来酸、磷酸钠、KH2PO4、咪唑、2,4,6-三甲基吡啶、三乙醇胺盐酸盐、巴比妥钠、N-乙基吗啉、焦磷酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷、N,N-二羟乙基甘氨酸(bicine)、2-氨基-2-甲基丙烷-1,3-二醇、二乙醇胺、对苯酚磺酸钾、硼酸、硼酸钠、氨、甘氨酸(glycine)、Na2CO3/NaHCO3、硼酸钠或者它们的组合
(h)其他：钼酸钠(受体的稳定化)、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)(还原剂)。
(1－2)作为本发明的基础的缓冲液成分－1(HBSS缓冲液)
在本发明中，将HBSS缓冲液(Hanks'Balanced Salt Solution)作为基本组合物使用。其制备手法可以按照公知的程序(例如独立行政法人医药基础研究所的主页http://cellbank.nibio.go.jp/legacy/sheet/att00011.htm)，如下所述进行制备。
首先，预先制备以下4种溶液，将其混合利用。
－溶液1：1.4％NaHCO3溶液
－溶液2：NaCl 80.0g、KCl 4.0g、MgSO4·7H2O 2.0g、Na2HPO4·2H2O0.6g、葡萄糖10.0g、KH2PO40.6g溶于水800ml中得到的溶液。
－溶液3：CaCl21.4g溶解于水100ml中得到的溶液。
－溶液4：称量酚红0.4g，用少量水制成糊状，接着加水到150ml。
用氢氧化钠溶液(N/20)将pH调节为7.0，总量为200ml。
在使用时，使用在87.5ml的灭菌水中分别加入了2.5ml溶液1、8ml溶液2、1ml溶液3、1ml溶液4的混合物。在不使用酚红时，可以省略溶液4的混合。
(1－3)作为本发明的基础的缓冲液成分－2(Tris-缓冲液)
Tris-缓冲液本身是一直以来广泛使用的缓冲成分(这里所说的Tris是三羟甲基氨基甲烷的简称，一般的组成是在Tris盐10mM中用HCl调节得到pH的混合物，有时加入EDTA 1mM作为添加物)，由于其生物适应性高，在各种生物研究中使用。但是，关于Tris-缓冲液对于生物发光反应的影响的研究，目前尚不充分。
在本发明中，发现Tris-缓冲液是适合用于生物发光的缓冲液，是也可以用于细胞裂解(Lysis)用、检测用的基础缓冲成分。
(1－4)本发明中的缓冲液组成
组合使用上述基本的缓冲成分的HBSS缓冲液和Tris-缓冲液使用，此时两者的配合量以容量(v/v)％计，为20～50︰50～20、优选40～60︰60～40、最优选60︰40。
作为表面活性剂，可以组合NP-40和TW80、以及SDS使用，此时以容量(v/v)％计，NP-40︰TW80︰SDS以1︰0.1～1︰0～0.5、优选1～2︰0.5～2︰0.1～1、最优选1︰1︰0.1的比进行配合。
表面活性剂TW80与其他的表面活性剂组合含有，此时的浓度以1～10(v/v)％、优选5～10(v/v)％的范围配合。
作为多元醇，可以组合聚乙二醇(PEG)和糖成分(蔗糖、葡萄糖)，PEG400以0.01～10(v/v)％范围配合、糖成分(蔗糖、葡萄糖)以0～20mg/mL范围配合，优选PEG400以0.1～10(v/v)％范围配合、糖成分(蔗糖、葡萄糖)以2～10mg/mL范围配合。
作为重金属，可以单独或组合地含有Fe(III)、Cu(II)、Mo(VI)或Zn(II)，此时的浓度以0.01～1PPM范围、优选1PPM配合。
可以单独或组合含有卤离子(Br-或I)，此时的浓度以1～100mM、优选50～100mM的范围配合。
此外，为了提高发光稳定性，还可以适当配合维生素C等的还原剂。
在本实施例中，在设置细胞裂解工序后的生物发光测定工序中取得了优异成绩的缓冲液组成基本上是使用C3缓冲作为细胞裂解液的情况。在C3缓冲液中，以Tris-HCl缓冲液为基础，表面活性性优异的NP-40与生理适合性高的MgCl2的组合可以认为是结果好的原因。列举效果特别好的组合如下。
1.用C3缓冲进行细胞裂解后，使用C8或C10的检测缓冲液的情况。
2.用C3缓冲进行细胞裂解后，使用C6的检测缓冲液的情况。
3.用C3缓冲进行细胞裂解后，使用在HBSS缓冲液中添加有Al(III)、Ca(II)、Cu(II)、Fe(III)或Mg(II)的检测缓冲液的情况。
4.用C3缓冲进行细胞裂解后，使用在HBSS缓冲液中添加有1％的PEG或PPG的检测缓冲液的情况。
5.用C3缓冲液进行细胞裂解后，使用在HBSS缓冲液中添加有KI 50mM或KBr 100mM的检测缓冲液的情况。
6.用C3缓冲液进行细胞裂解后，使用在HBSS缓冲液中添加有2mg/mL的D(+)葡萄糖或甘氨酸的检测缓冲液的情况。
根据以上结果，如下所述考虑作为一次反应溶液的优选的缓冲液组成。
即，可知作为需要迅速的裂解性、并且要求高亮度下的观察性的、生物发光酶利用技术中的“一次反应溶液”时的基本的的组成，可以在C3缓冲液中作为基础的Tris-HCl缓冲液中组合HBSS缓冲液、表面活性剂NP-40或SDS、盐类Al(III)、Ca(II)、Cu(II)、Fe(III)或Mg(II)、PEG或PPG、卤离子类(I-、Br-)、D(+)葡萄糖或甘氨酸而构建。
基于上述构想，作为“一次反应溶液”，构建了以C3缓冲液和HBSS缓冲液的组合为基础的C14～C18缓冲液，但在应用于生物发光探针时没有获得令人满意的结果，确认了在使用组合了TW80代替HBSS缓冲液的C19～C22缓冲液的情况下，不加SDS、将TW80以1～10％范围与C3组合的“C19、C21、C22”是能够实现高速测定的一次缓冲液。此时，作为选择TW80的理由，由于在表面活性剂的亲水性、表面活性度方面，处于与NP-40取得平衡的位置，因而选择其作为追加添加剂。
此外，在使用本发明的发明人的另外的发光酶的实验中，可知作为Tris-HCl缓冲液中配合的表面活性剂，在同时配合NP-40和SDS时，发光强度增高(结果未图示)，因此，代替以Tris-HCl缓冲液和NP-40作为基础的C3缓冲液，使用在两者的组合中进一步配合有SDS的C4缓冲液进行以下的实验。即，在使用以C4缓冲液为基础、改变TW80与HBSS缓冲液的配合比的C23～C26缓冲液作为一次缓冲液的实验中，“C23、C24、C25”均获得了N/S比高的优异的高速测定结果。
这样，构建了在C4缓冲液中组合以HBSS为基础的C13缓冲液、使用TW80、加入了基质D-荧光素的生物发光酶用的一次反应缓冲液。(1－5)本发明的实施例中使用的缓冲溶液
本发明的实施例中使用的缓冲溶液的组成如下所示。
2.作为本发明的对象的生物检测
本发明涉及缓冲液组成，可以设想能够应用于以下的生物检测。在进行报告基因检测法(reporter-gene assay)、双杂交检测法(two-hybridassay)、蛋白质互补法(protein complementation assay)、通过内含肽的蛋白质剪切法(intein-mediated protein splicing assay)、单分子型生物发光探针法(single-chain probe-based assay)时，不经过“细胞裂解步骤”，由培养细胞直接进入测定。
例如，在进行报告基因检测时，对96孔板上的具有报告分子表达载体的细胞进行配体刺激。之后，在使细胞发光时，添加该反应溶液50μL立即进行测定即可。
此外，在使用单分子型生物发光探针时，对96孔板上的表达单分子型生物发光探针的细胞进行配体刺激，在刺激后添加该反应溶液50μL立即进行测定即可。
3.用于本发明的生物检测的发光酶
用于本发明的生物检测的发光酶以所有的发光酶为对象。例如，为来自昆虫和来自海洋动物的生物发光酶，典型地可以列举萤火虫荧光素酶(firefly luicferase)、叩头虫荧光素酶(click beetle luciferase)、海肾荧光素酶(Renilla luciferase)、桡脚类荧光素酶(Metridia longaluciferase、Metridia pacifica luciferase)等。
在本发明中，称为“桡脚类荧光素酶”时，是指与已知的来自桡脚类的荧光素酶具有共同的酶活性上和结构上的特征的荧光素酶。具体而言，是具有最适宜pH约5～8、最适宜温度约4～25℃、具有以“腔肠素”为基质诱发发光反应的酶活性的荧光素酶，在结构上，具有2个酶活性结构域，在N末端具有分泌信号，分子量为20kD左右(18kD－28kD)，与其他发光酶相比，是具有最小分子量的荧光素酶。
作为用于本发明的生物检测的发光酶的优选例，可以列举上述本发明的各种新的人工荧光素酶(ALuc)。
4.本发明中使用的测定方法、测定装置
配体活性的测定可以按照通常的生物发光检测实施，没有特别限制，能够应用现有的规程。
为了测定生物发光强度，通常利用光度计(例如MiniLumat LB9506(Berthold)，GloMax 20/20n(Promega))。通过对在板上培养的细胞加入裂解缓冲液来制备细胞裂解液，立即测定与基质混合后的发光值。
在以96孔板上培养的细胞作为对象测定配体活性时，能够使用已有的生物发光酶标仪(例如，Mithras LB 940(Berthold)，SH-9000(Corona))。在共存有配体的条件下，被表达的探针的生物发光，能够使用上述酶标仪所附带的自动基质溶液注射器瞬时导入基质、进行发光测定。
5.筛选方法的对象被检物质
作为这些筛选方法的对象的被检物质，例如，包括有机或无机的化合物(特别是低分子量的化合物)、具有生物活性的蛋白质、肽等。这些物质可以使用功能和结构已知的，也可以使用未知的。并且，“组合化学库”是作为用于高效地确定目的物质的被检物质群的有效的手段。组合化学库的准备和筛选在本技术领域中是公知的(例如参照美国专利第6,004,617号、5,985,365号)。另外，还可以使用市面上销售的文库(例如美国ComGenex公司制、俄罗斯Asinex公司制、美国Tripos,Inc.公司制、俄罗斯ChemStar,Ltd公司制、美国3D Pharmaceuticals公司制、Martek Biosciences公司制等的文库)。并且，通过将组合化学库应用于表达本探针的细胞的基团，能够实施所谓的“高通量筛选”。
6.试剂盒
本发明还提供含有上述生物发光用反应缓冲液的生物检测用试剂盒。本发明的试剂盒能够根据需要含有用于实施生物检测的各种成分。作为这样的成分，可以例示发光酶、包含编码发光酶的基因的载体、表达发光酶的细胞、发光基质、各种器具(96孔板或管等)、对照试样等，但不限定于这些。并且，可以包括记载了用于实施本发明的生物检测法的方法的说明书。
作为发光酶，可以列举来自昆虫和来自海洋动物的生物发光酶，典型地，作为优选例，可以列举萤火虫荧光素酶、叩头虫荧光素酶、海肾荧光素酶、桡脚类荧光素酶(Metridia longa luciferase、Metridiapacifica luciferase)等、上述的[I]部分所记载的人工荧光素酶(ALuc)。人工荧光素酶(ALuc)是特别优选的方式之一。
包含编码发光酶的基因的载体，可以根据意欲进行的生物检测(报告基因检测法(reporter-gene assay)、双杂交检测法(two-hybrid assay)、蛋白质互补法(protein complementation assay)、通过内含肽的蛋白质剪切法(intein-mediated protein splicing assay)、单分子型生物发光探针法(single-chain probe-based assay)等)，通过公知的手法制造。
例如在所使用的发光酶是桡脚类荧光素酶或本发明的人工荧光素酶(ALuc)的情况下，发光基质适合为腔肠素(也包括天然型的腔肠素(Native CTZ)、天然型的腔肠素的各种衍生物)。
作为对照试样，可以列举含有规定量的发光酶的阳性对照、不含发光酶的阴性对照等。
本发明的试剂盒能够通过按照公知的手法组合上述成分而制造。本发明的试剂盒能够用于实施上述的本发明的生物检测法。
[III]关于本发明中使用的术语、概念
本发明中的其他的术语和概念在发明的实施方式的说明和实施例中进行详细规定。其中，术语基本上依据IUPAC-IUB生物命名委员会(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)，或者基于本领域惯用的术语的意思。并且，为了实施发明而使用的各种技术，除了特别标明其出处的技术之外，本领域技术人员能够基于公知的文献等容易且切实地实施。例如，基因工程和分子生物学的技术按照J.Sambrook，E.F.Fritsch&T.Maniatis，"Molecular Cloning:A LaboratoryManual(2nd edition)"，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1989)；D.M.Glover et al.ed.，"DNA Cloning"，2nded.，Vol.1to 4，(The Practical Approach Series)，IRL Press，OxfordUniversity Press(1995)；Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y，1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座1、遺伝子研究法II」、東京化学同人(1986)；日本生化学会編、「新生化学実験講座2、核酸III(組換えDNA技術)」、東京化学同人(1992)；R.Wu ed.，"Methods inEnzymology"，Vol.68(Recombinant DNA)，Academic Press，New York(1980)；R.Wu et al.ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.100(Recombinant DNA，Part B)&101(Recombinant DNA，Part C)，Academic Press，New York(1983)；R.Wu et al.ed.，"Methods inEnzymology"，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(RecombinantDNA，Part E)&155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，New York(1987)等记载的方法、其引用的文献记载的方法或者实质上与它们相同的方法或变更法进行。此外，关于本发明中使用的各种蛋白质和肽、或者编码它们的DNA，可以由已有的数据库(URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等)获得。
实施例
下面，列举实施例对本发明进行更为详细且具体的说明，但本发明不限定于以下的示例。
本发明中的其他的术语和概念基于本领域惯用的术语的意思，为了实施本发明而使用的技术，除了特别标明其出处的技术之外，本领域技术人员能够基于公知的文献等容易且切实地实施。并且，各种分析等，援用所使用的分析仪器或试剂、试剂盒的操作说明书、目录等所记载的方法使用。
其中，本说明书中引用的技术文献、专利公报和专利申请说明书中的记载内容可以作为本发明的记载内容参照。
〔实施例1－1〕人工荧光素酶(ALuc)群的氨基酸序列的提取
通过基于氨基酸相似性，从公开的生物信息数据库(NCBI)等对桡脚类荧光素酶序列进行比对，以频率高的氨基酸为中心制作出新的人工荧光素酶(ALuc)的原型(图1A)。进一步将上述数据库中的荧光素酶序列分成前端部、前半部、后半部，根据前端部的序列的相似性比对提取频率高的氨基酸序列(图1B)。并且，通过将前半部与后半部重叠，不仅提取频率高的氨基酸，还提取序列的前半与后半之间的相同性高的氨基酸序列，进行制作约23个人工的的荧光素酶序列的操作。
以通过上述相似性比对获得的大量的人工荧光素酶(ALuc)序列为基础，适当选择应用最适合小鼠细胞的遗传密码子，构建相同数量的人工的基因序列。以该基因序列为基础，向进行人工基因合成的专业制造商(Operon公司)订购，获得实际的人工基因。
〔实施例1－2〕人工荧光素酶(ALuc)群的亮度、发光稳定性、长波 长侧迁移度的比较
将通过上述过程合成的人工荧光素酶(ALuc)基因群在哺乳细胞表达载体(pcDNA3.1(+))中进行亚克隆。将该各个表达载体转染到来自非洲绿猴肾脏的COS-7细胞，进行各人工荧光素酶(ALuc)的亮度、发光稳定性、长波长侧迁移度的比较(图2～图5)。
首先，比较各人工荧光素酶(ALuc)间的亮度(图2)。为此，对导入了编码各发光酶的载体的COS-7细胞进行过夜培养，之后，使用Promega制的细胞裂解溶液和基质混合的检测溶液、发光图像分析器(LAS-4000)测定其相对的发光强度。
其结果可知ALuc2、ALuc9、ALuc10、ALuc15、ALuc16、ALuc18、ALuc22、ALuc 23、ALuc25等显示较高的亮度。并且，通过利用发光图像分析器(analyzer)的亮度测定可以确认：它们的发光亮度比现有的来自Gaussia princeps的荧光素酶(GLuc)和来自海肾的荧光素酶(海肾荧光素酶，Renilla luciferase)、来自Metridia pacifica的荧光素酶(MpLuc4)的亮度高50倍左右。
〔实施例1－3〕人工荧光素酶(ALuc)群的发光稳定性的验证
从各种侧面来验证本发明的人工荧光素酶(ALuc)的发光稳定性(图3)。将导入了各荧光素酶的基因的COS-7细胞培养9小时，用Promega制的细胞裂解溶液处理20分钟，再添加Promega制的加入了基质的反应溶液，之后，每5分钟观察各个发光酶的亮度随时间的变化(图3A)。其结果，在现有的GLuc和ALuc2时，在导入基质后，看到剧烈的发光减少的现象，但是ALuc15和ALuc16在经过25分钟后，仍维持了初始状态的6成的发光亮度。
进一步将该实验扩大到ALuc16至ALuc25的人工荧光素酶(ALuc)(图3BC)。其结果可知，在最初的发光亮度下，ALuc16、ALuc22、ALuc23、ALuc25等是有利的。此外，确认了在ALuc24时虽然亮度较低，但是其发光持续性明显高于其他的人工荧光素酶(ALuc)。另一方面，现有的荧光素酶类(GLuc，RLuc8.6-535)的发光亮度均极弱、发光持续性也不好。
〔实施例1－4〕人工荧光素酶(ALuc)群的耐热性、细胞外分泌度
分别测定本发明的人工生物发光酶的耐热性、细胞外分泌度(图4)。首先，为了测定耐热性，将导入了各生物发光酶的COS-7细胞用Promega制的细胞裂解溶液制作细胞裂解产物(Lysate)，之后，对于同一样品，在直接室温放置的情况和以80℃加热10分钟的情况下，利用Promega制的反应溶液(加入了基质)比较发光强度的变化(图4A)。
其结果，确认了由于加热，ALuc22亮度降低了4成左右。另一方面，其他的发光酶(ALuc16、ALuc23、ALuc25)未观察到加热的影响和可见的明显的发光亮度的降低。
并且，将各荧光素酶(ALuc)导入COS-7细胞，经过过夜培养后，以培养基的发光亮度为指标，测定由细胞分泌的荧光素酶(ALuc)的量(图4B)。其结果，确认了ALuc16和ALuc23的细胞外分泌量较多。另一方面，ALuc22和ALuc25等尽管发光强，但细胞外分泌量少、来自培养基的发光亮度也弱。
〔实施例1－5〕本发明的人工荧光素酶(ALuc)群的生物发光的长波 长侧迁移度
以本人工荧光素酶(ALuc)的发光光谱为指标，测定生物发光的长波长侧迁移度(图5)。首先，在COS-7细胞中导入各人工荧光素酶(ALuc)，进行过夜培养。之后，用Promega制的细胞裂解液处理20分钟，在5μL(图5A)和2μL(图5B)的细胞裂解产物(Lysate)中添加Promega制的加入了基质的反应溶液，立即用分光光度计(AB-1850，ATTO)测定光谱。其结果，本发明的人工荧光素酶(ALuc)类的大部分显示了向长波长侧迁移的发光光谱，其程度与现有的桡脚类荧光素酶的一般的的光谱顶点(470-480nm)相比，显示了向长波长侧迁移50-80nm的光谱(例如ALuc15、ALuc16、ALuc23等)。
其结果显示，在将本ALuc应用于活体成像时，显示出作为信号的生物发光极高的组织通过性。
〔实施例1－6〕本发明的人工荧光素酶(ALuc)类与现有的来自发光 生物的荧光素酶的相关性、相似性
以上述实施例1－1～1－5所示的新合成的人工荧光素酶(ALuc)类的氨基酸序列为基础，比较其与现有的来自发光生物的荧光素酶的氨基酸序列的相关性、相似性(图6)。
首先，用CLUSTALW2.1研究与其他的发光酶的相似性，近似性最高的是MpLuc1，此外，MoLuc1和MLuc具有此近似性。此外，根据利用NCBI Blast的蛋白质序列比较，在ALuc23的情况下，显示了与MpLuc1的83％的相似性，对于MoLuc1显示了74％的相似性。在同样的氨基酸相似性测定中，在ALuc25的情况下，相似性最高的是MpLuc1，其相同性达到72％。
〔实施例1－7〕以本发明的人工荧光素酶(ALuc)为骨架的“发光胶 囊”探针的构建
开发以本发明的人工荧光素酶(ALuc)为骨架的“发光胶囊”探针(图7)。本发光胶囊的基本的分子结构由细胞外分泌信号(SP)、ALuc本体、适当的载入物蛋白质(肽)、膜定位信号构成。该探针由于SP首先被运送到内质网、再从内质网被运送到细胞膜。该探针以通过MLS的工作最终定位于细胞膜的方式设计(图7AB)。
该发光胶囊具有将荧光蛋白(mPlum)或其他的荧光素酶(RLuc8.6-535)、肽(DEVD序列等)定位于细胞膜的能力。确认了在发光胶囊中插入了荧光蛋白的mPlum或肽的DEVD(caspase-3的基质)情况下，显示出优异的发光稳定性(图7C)。另一方面，在非发光胶囊结构的A16-KDEL的情况下(序列号18)，定位于内质网，尽管搭载了相同的ALuc16，发光亮度仍较弱。其结果，由于发光胶囊定位于细胞膜，基质和氧的供给顺利，这与上述发光稳定性和高亮度发光是相关的。关于导入基质后的发光反应速度，发光胶囊也比其他分子快(图7D)。并且，确认了在具有DEVD序列的发光胶囊的情况下(序列号19)，发光反应速度根据是否存在引发细胞死亡的化学物质(STS)而发生变化(图7E)。并且，利用发光测定用酶标仪也能够确认发光胶囊的发光稳定性(图7F)。
〔实施例1－8〕本发明的发光胶囊的作用
用荧光显微镜(Leica)测定上述实施例1－7所示的发光胶囊的作用(图8)。首先，将插入了现有的荧光蛋白mPlum的发光胶囊(序列号20)导入COS-7细胞，进行过夜培养。将进行了STS刺激的情况作为对照组，与未进行STS刺激时的细胞映像进行比较(图8C)。其结果确认了发光胶囊在STS刺激以前定位于细胞膜，在STS刺激后主要定位于细胞质。该结果意味着该发光胶囊能够以高灵敏度测量如细胞死亡那样的细胞内信号传递过程。
〔实施例1－9〕利用本发明的人工荧光素酶(ALuc)的双杂交检测
为了表现本发明的人工荧光素酶(ALuc)作为发光报告的优点，尝试使用ALuc作为现有的哺乳动物双杂交检测系统的报告分子。首先，利用已知的基因工程技术，构建在市面销售的报告分子表达载体(pG5)中插入了编码MpLuc4或ALuc16的基因的新的报告分子表达载体。并同时准备本研究人员以前的研究成果物质pG5-GLuc(图9A)。
将上述3种报告分子表达载体的任意一种、再加上表达成肌分化控制因子(MyoD)的载体(pACT-MyoD)和表达转录调节因子(ID)的载体(pBIND-ID)共转染到COS-7细胞中。在细胞培养基中培养过夜后，使用Promega提供的细胞裂解溶液和基质溶液引发发光反应，对于由于各个报告的不同所带来的发光强度的差异进行比较。其结果，仅限于在同一条件下比较，从导入了ALuc表达载体的细胞裂解液(lysate)观察到最强的生物发光(图9B)。
与该测定平行地也同时测定来自细胞培养时的上清(培养基)的发光值。其结果，在导入了ALuc16和GLuc的情况下，观察到稍强的生物发光。该结果意味着该荧光素酶的部分分泌到了细胞膜外。
〔实施例1－10〕以ALuc骨架的单分子型生物发光探针的开发
为了显示ALuc的优点，开发了以ALuc为骨架的一系列的单分子型生物发光探针(图10)。图10A表示其基因骨架。首先，将ALuc分成2部分并使其前后配置。并在其外侧分别连接应激激素受体(糖皮质激素受体的配体结合域，glucocorticoid receptor ligand bindingdomain，GR HLBD)和其结合肽(LXXLL模体)。该探针的作用原理如图10A的下段所示，在具有配体的条件下，分子发生折叠，发光亮度恢复。
在将该ALuc16分成2部分时，根据分成2部分的部位，将其名称命名为cSimgr8(序列号21)至cSimgr14。其各自对应的切断位置如下所示：cSimgr8(125/126)、cSimgr9(129/130)、cSimgr10(133/134)、cSimgr11(137/138)、cSimgr12(137/138，连接部存在变异)、cSimgr13(141/142)、cSimgr14(146/147)。
其结果可知，关于亮度的绝对值，cSimgr13、cSimgr14好；关于S/N比，cSingr8等好。
〔实施例1－11〕使用本发明的发光测定器件的细胞毒性物质(STS) 的毒性的测定
为了进行细胞毒性检测实验，开发了新的生物发光测定器件(图11D)。以下对其结构进行说明。
首先，用铝对显微镜玻片放置架进行加工，使其适合市面销售的细胞培养和显微镜观察用的显微镜玻片(6通道、ibidi公司制)。例如利用塑料材料制作平台以将该显微镜玻片放置架嵌入。该显微镜玻片放置架每隔一定间隔在载物台的侧面或下面以一定间隔制作槽，以防止平台滑动，以与该槽卡合的方式将卡合部件(例如弹簧球等)安装于平台。
通过在细胞培养用的显微镜玻片的上部覆盖蜂巢样的盖子，阻断显微镜玻片的各通道间的光干涉。将该盖子的表面进行表面加工形成镜状，使其能够发生光反射。其中，盖子只要是能够阻断显微镜玻片的各通道间的光干涉的形状即可，不限定于蜂巢的形状。
在平台的下部安装加入3个光学滤光片的滤光片架(例如金属制)，在与3个光学滤光片分别对应的位置进行加工以防止滑动。
在滤光片架之下设置例如金属制的支承台，使其能够耐受上部的重量。并且，其内部空出圆滑的孔，其表面进行镀层加工成为镜状。考虑到这样能够使得来自上部的光可以通过到下部的检测部而不会发生光损失。如果将本发明的发光测定器件的该支承台部分载置在光度计或分光光度计的培养皿载置位置，就能够使用现有的光度计或分光光度计简便地实现利用显微镜玻片的测定。
在(图11D)中，采用6通道的显微镜玻片，但在同样的概念下通过增加通道数能够进行更多的样品测定。
使用上述发光测定器件测定引发细胞死亡的化学物质(STS)的毒性(图11参照)。首先，在市面销售的细胞培养用的显微镜玻片(ibidi公司制)上移植来自猴肾脏的COS-7细胞，进行细胞培养直至显微镜玻片面积的9成被细胞掩埋。在该细胞中基因导入编码生物发光探针的质粒，再培养24小时。对于上述显微镜玻片上培养的细胞，在有无STS(最终浓度：1μM)的条件下进行10分钟刺激(图11B)。
发光测定按照以下顺序进行。将显微镜玻片用HBSS缓冲液清洗1次，将加入了基质的HBSS缓冲液100μL同时导入显微镜玻片的各通道，立即固定于上述发光测定器件。在该器件上盖上透镜帽之后，将该器件搭载于现有的光度计(GloMax 20/20n；Promega)。一边交换各通道和各滤光片，一边测定发光值(3秒集光、N＝3、参照图11C)。
由于上述被STS活化的Caspase-3，定位于膜的发光探针被分解，增强了发光强度(图11B)。其结果确认了发光强度增加7.5成左右，能够有效地区分蓝色、黄色、红色区域的光，并且显示非常小的误差棒(error bar)，因而该测量器件能够高速地以高精度测定STS的细胞毒性，且极为便利。
〔实施例1－12〕使用本发明的发光测定器件的利用发光光谱变化的引 发细胞死亡的化学物质(STS)的毒性的测定(测定例1)
使用本发明的发光测定器件，基于发光光谱的变化测定引发细胞死亡的化学物质(STS)的毒性(参照图12)。首先，在市面上销售的细胞培养用的显微镜玻片(ibidi公司制)上移植来自猴肾脏的COS-7细胞，进行细胞培养直至显微镜玻片面积的9成被细胞掩埋。在该细胞中基因导入编码生物发光探针的质粒，再培养24小时。对上述显微镜玻片上培养的细胞，在有无STS(最终浓度：1μM)的条件下进行10分钟刺激。
发光测定按照以下顺序进行。将显微镜玻片用HBSS缓冲液清洗1次之后，将加入了基质的HBSS缓冲液100μL同时导入玻片的各通道，安装于上述发光测定器件。在该器件上盖上透镜帽之后，进一步将该器件插入现有的光谱仪(AB-1850，ATTO)(图12A)。分别测定来自各通道的发光光谱(2分钟集光、N＝3、图12B)。
其结果确认了与没有1μM STS的情况下相比，在存在STS刺激的情况下，全波长时的发光强度增加。光谱的最高发光波长(λmax)为580nm。全光量的约26％是相当于所谓的“光学窗口”(Optical Window)的600nm以上的光。该结果意味着在使用该探针或装置进行动物成像时，有望获得优异的组织通过性。
〔实施例1－13〕使用以ALuc16为骨架制作的生物发光胶囊的细胞毒 性的测量(测定例2)
使用以ALuc16为骨架制作的生物发光胶囊(序列号19)，测定化学物质的细胞毒性(图13)。首先，在6-通道显微镜玻片上培养COS-7细胞，在细胞中导入编码上述“序列号19”的基因，再继续培养16小时。之后，在是否存在细胞毒性物质(STS)的条件下对细胞进行2分钟刺激，利用LAS-4000(FujiFilm)测定在加入了基质的溶液下显示生物发光亮度的差异的发光图像。
其结果，与左边2个通道相比，右边2个通道的发光强度达到2倍以上。该结果意味着利用本发光胶囊能够以高灵敏度测定细胞毒性。
〔实施例1－14〕应激激素的测定
使用本发明的发光测定器件，测定应激激素(参照图14)。首先，在6-通道的显微镜玻片(2.5×7.5cm，μ-Slide VI0.4，ibidi公司制)上播种来自非洲绿猴肾脏的COS-7细胞，进行培养直至覆盖90％的基底体积。使用基因导入用脂质试剂(TransIT-LT1)，在该玻片上的细胞中导入图14A所示的单分子型生物发光探针(cSimgr13等)，培养16小时。在该显微镜玻片上，分别用加入了对照溶液的培养基对左边3个通道进行刺激。另一方面，在右边3个通道中给予应激激素的标准溶液(10-5M)，进行20分钟孵育。之后，将显微镜玻片内的溶液全部除去，用HBSS缓冲液清洗1次。之后，用Promega公司提供的细胞裂解溶液制作细胞裂解液，添加该Promega公司提供的加入了nCTZ的检测溶液。将该玻片搭载于本发明的发光测定器件，该发光测定器件进一步载置于光度计(GloMax 20/20n，Promega公司制)，在是否存在透镜帽的条件下测定发光值。
其结果确认了即使对于同一样品，与没有透镜帽的条件相比，在存在透镜帽的情况下，发光值增加28％(有应激激素)至42％(没有应激激素)(图14B)。该结果意味着利用透镜帽能够实现有效的集光。
并且，根据图14C的结果分析确认了在对于同一发光样品测定应激激素时，有发光器件条件与没有发光器件直接测定发光值的情况相比，标准偏差(SD)更少。具体而言，对于同一样品安装发光器件进行测定时，能够以标准偏差(SD)为1/3以下的高精度(28％(有应激激素)至29％(没有应激激素))进行测定。图14D表示由LAS-4000拍摄的本显微镜玻片的发光图像。
〔实施例1－15〕连接了人工荧光素酶(ALuc)的新的单链抗体 (scFv-ALuc16)
为了显示本发明的人工生物发光酶(ALuc)作为发光色素的优点，尝试制作在GST标记抗体的可变区域片段连接有ALuc的新的单链抗体(single chain variable fragment，scFv)(图15)。
该尝试中，以基因工程的方式，通过GGGGS接头将GST标记抗体的可变区域片段与ALuc16连接，并插入到大肠菌表达载体中(图15A)。使其在大肠菌内表达后，使用所得到的带有ALuc16的scFv抗体(scFv-ALuc16)进行以下的发光亮度比较实验。
购买市面上销售的带有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗小鼠抗体(anti-mouse IgG，GE Healthcare)，制备为HRP的浓度为1μg/mL。制备与该带有HRP的抗小鼠抗体相同量的scFv-ALuc16，将各溶液10μL排列在96孔微孔板的各孔中。
对于用于带有HRP的抗小鼠抗体的基质溶液，准备市面上销售的ImmunoStar LD(Wako)。另一方面，对于用于scFv-ALuc16的基质溶液，准备Promega制的Renilla luciferase assay kit。使用8通道移液器，在加入了上述抗体的96孔微孔板上同时注入分别准备的基质溶液各90μL，用发光图像分析器(LAS-4000，FujiFilm)测定发光亮度及其随时间的变化。
其结果，带有HRP的抗小鼠抗体显示了强3成左右的发光亮度(图15B)。并且，scFv-ALuc16在导入基质后，在5分钟之前发光值的减少稍明显(图15CD)。确认了与该亮度的差异无关，本发明的scFv-ALuc16显示出以现有的HRP为基准的强的生物发光。
〔实施例1－16〕新的单链抗体(scFv-ALuc16)与现有的HRP的发光 光谱的比较
为了对scFv-ALuc16和现有的HRP的发光光谱进行比较，进行以下的光谱测定(图16)。首先，与实施例1－15所示的手法同样地制备0.1μg/mL的scFv-ALuc16和带有HRP的抗小鼠抗体。将该溶液25μL加入96孔微孔板的各孔中。并使用8通道移液器，在各孔中同时注入与实施例1－15所示同样制备的各基质溶液75μL，用发光专用的高灵敏度分光机(AB-1850，ATTO)测定发光光谱。
其结果，与带有HRP的抗小鼠抗体相比，scFv-ALuc16显示了更向长波长侧迁移的发光光谱(图16CD)：λmax分别等于504nm和526nm。600nm以上的波长区域中的发光的比例分别为6％和15％。该结果显示，虽然scFv-ALuc16的亮度稍差，但与HRP相比，发出更靠近红外线区域的光。即，该性质意味着将该抗体或ALuc16用于生体成像时，能够期待组织透过性高的发光信号。
〔实施例1－17〕基于本荧光素酶(ALuc)的发光探针在ES细胞中的 应用
创立表达实施例10所示的以ALuc为骨架的单分子型生物发光探针cSimgr13的新的ES细胞，使应激激素感受性可视化(图17)。首先，在10厘米的培养皿中培养无饲养层培养的胚胎干细胞(ES)EB3细胞，之后，将编码cSimgr13的pcDNA3.1(+)载体导入EB3细胞中，在存在G418的条件下，创立稳定表达cSimgr13的转化细胞。
将上述转化细胞在显微镜玻片传代1天后，利用对照(0.1％DMSO)或10-5M应激激素(皮质醇，cortisol)对各孔中的细胞进行20分钟刺激。之后，按照Promega制的发光检测试剂盒的规程，在细胞裂解后，利用加入了基质的检测缓冲液使其发光。利用LAS-4000测定其亮度。其结果，与对照相比，由应激激素刺激时显示更强的发光。其结果显示，基于本荧光素酶(ALuc)的发光探针也能够应用于胚胎干细胞(ES)，未丧失荷尔蒙识别能力。
〔实施例1－18〕更进一步的人工生物发光酶ALuc25～ALuc32的制作
基于上述研究开发结果，进行更进一步的功能性人工生物发光酶的开发。以ALuc25为基础，制作亲水性氨基酸的比例更多的序列和更少的序列，命名为ALuc26、ALuc27、ALuc28、ALuc29。并且，开发在序列中具有抗原识别部位(epitope，例如His标记、Myc标记等)的一系列的人工生物发光酶，分别命名为ALuc30(序列中含有His标记)、ALuc31(序列中含有His标记)、ALuc32(序列中含有Myc标记)(图18)。
将编码上述酶序列的基因插入哺乳动物表达载体(pcDNA3.1(+))后，将各质粒导入COS-7细胞。通过该细胞转化，各个发光酶表达，其一部分分泌到细胞外，部分留在细胞内。在导入上述质粒20小时后，对细胞的培养基取样，剩余的细胞用裂解缓冲液裂解(制作细胞裂解产物)。在分别准备的培养基5μL或细胞裂解产物5μL中同时添加检测溶液(加入了基质)50μL，之后立即用发光分析装置(LAS-4000，FujiFilm)测定发光值(n＝3)(图18(C))。
其结果，与现有的GLuc和MpLuc4相比，从ALuc25、ALuc30、ALuc31的细胞裂解产物(Lysate，细胞裂解液)观测到极高的发光值。并且，在细胞培养基的部分，由具有ALuc30和ALuc31的细胞的培养基观察到强的生物发光。该结果意味着如果希望在细胞裂解液或者培养基中均显示强的生物发光，ALuc30和ALuc31更好。并且，由于ALuc30和ALuc31在序列内部含有His标记(图18(A))，能够实现利用His标记柱的精制或者将His标记序列作为抗原识别部位的抗体的使用等，能够作为光标识在广泛的生物检测领域中利用(图18(B))。
将ALuc25至29的生物发光光谱示于图18(D)。
并且，利用现有的蛋白印迹法和亲和层析柱测定包含标记的该人工生物发光酶的表达后的特性(图18(E))。
首先，将ALuc30至34的发光酶的表达载体分别导入COS-7细胞。在诱导表达后一晩后，回收细胞培养基，分别利用亲和层析柱和蛋白印迹法(图18(E)插入图)确认有无分泌、所表达的发光酶的分子量。
其结果可知，在利用Ni-NTA亲和层析柱对各培养基进行精制时，含有His标记的ALuc30选择性地被提取。并且，使用专用的抗体(His标记抗体、HA标记抗体、Flag标记抗体)进行蛋白印迹法，结果，由带的位置(表示分子量)、带的浓度(表示表达量)确认了各人工生物发光酶(ALuc30、ALuc33、ALuc34)分泌到培养基内，各自的标记发挥作用。
〔实施例1－19〕人工生物发光酶的长时间稳定性
研究本发明中开发的人工生物发光酶(ALuc)活性的长时间稳定性。首先，在COS-7细胞中导入表达各人工生物发光酶(ALuc16、ALuc22、ALuc23、ALuc24、ALuc25、ALuc30)(图中分别表示为A16、A22、A23、A24、A25、A30)的质粒，之后，再继续培养24小时。通过该培养，人工生物发光酶分泌到培养基。提取分泌到该培养基中的人工生物发光酶，分别按照以下要点测定同一条件下酶活性的差异。首日(0day)在5μL的培养基中添加50μL的检测溶液(加入了天然腔肠素的Promega制品)，利用LAS-4000(FujiFilm)测定发光值(酶活性)。按照同样的要点，分别测定第8日、第16日、第25日的发光值，与首日的数值进行比较(图19(A))。其结果，在ALuc16和ALuc22的情况下，看到了酶活性的显著降低，但ALuc24、ALuc25、ALuc30等能够维持稳定的酶活性直到25天。可知特别是在ALuc30的情况下，能够长时间维持首日的6成左右的酶活性。
另外，对于自表达起经过25天的培养基样品，按照以下的要点观测添加基质后亮度随时间的变化(图19(B))。在自表达起经过25天的5μL培养基中添加50μL的检测溶液(加入了天然腔肠素的Promega制品)，利用LAS-4000(FujiFilm)测定发光值(酶活性)。其结果，在任何人工生物发光酶中都观察到了发光值缓慢增加的现象。特别是ALuc23和ALuc30，在12分钟后观察到了比添加时的发光亮度亮几倍的发光亮度。
这些结果意味着该人工生物发光酶即使冷藏保存25天也不会出现明显的失活现象，因而长期保存性优异。
〔实施例1－20〕使用本ALuc的活细胞成像
为了对本发明所创立的人工生物发光酶的活细胞成像能力进行研究，进行了以下的实验(图20)。
首先，在ibidi制的显微镜玻片上培养COS-7细胞，在生长到一定水平后，在位于各通道中的细胞内进行以下的基因导入：1通道群为具有编码来自海肾的发光酶(RLuc8.6-535)的基因的pcDNA3.1质粒、2通道群为具有编码A16-KDEL的基因的pcDNA3.1质粒、3通道群为具有编码基于ALuc16的发光胶囊(即A16-MLS)的基因的pcDNA3.1质粒。
在上述基因导入后，再进行16小时的培养。在即将进行成像之前，将培养基替换为具有基质的HBSS缓冲液，利用LAS－4000(FujiFilm)测定之后的发光图像。
其结果，在表达RLuc8.6-535的通道的情况下，大部分的发光图像均未被采集到，但在表达A16-KDEL或A16-MLS的通道中观测到了强的发光图像(图20A)。该结果意味着本发明的人工生物发光酶在活细胞成像方面优于现有的发光标识。作为其理由，可以认为是人工生物发光酶的亮度强。因此意味着即使少量的人工生物发光酶也有利于细胞成像。
同样地，在ibidi制的显微镜玻片上培养COS-7细胞，在生长到一定水平后，在位于各通道内的细胞中进行以下的基因导入：第1通道为具有编码萤火虫荧光素酶的基因的pcDNA3.1质粒、第2通道为具有编码A16-KDEL的基因的pcDNA3.1质粒、第3通道为具有编码基于A16的发光胶囊(即A16-MLS)的基因的pcDNA3.1质粒。
在上述基因导入后，再进行16小时的培养。在成像20分钟前，加入Promega制的细胞裂解缓冲液40μL，放置20分钟。再在各通道中加入具有培养基和基质的Promega制的检测缓冲液，利用LAS－4000(FujiFilm)测定之后的发光图像。
其结果，仅在A16-KDEL和A16-MLS的通道中观测到了强的发光(图20B左)。该发光亮度的差异也可以由发光亮度图明确地确认(图20B右)。
〔实施例1－21〕具有抗原识别部位(epitope)的功能性人工生物发光 酶(ALuc30-34)的创立
使人工生物发光酶(ALuc)具备功能性(抗原识别能力、亲和柱层析能锂)是发光酶的通用所不可或缺的要素。为了实现该目的，创立在本发明创立的人工生物发光酶的部分序列含有现有的所谓“标记”的一系列的人工生物发光酶。该发光酶类的特征在于在其序列中的某些最适宜位置具有抗原识别部位(可以用于亲和柱层析)。
在本实施例中，首先，为了研究融合“标记”的最适宜位置，使用公知的氨基酸序列比对工具CLUSTALW(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)，研究在哪个位置融合标记能够不阻碍酶本身的发光活性、并且能够100％地发挥设想的标记的性能(图21(A))。其结果发现，在自人工生物发光酶的起点开始约20个氨基酸的位置融合标记是最适合的。以该结果为基础，创立在该位置具有His-tag、c-Myc-tag、HA-tag、Flag-tag的新的人工生物发光酶，分别命名为ALuc30、ALuc32、ALuc33、ALuc34。即，将具有His-tag的称为ALuc30、ALuc31(其类似物)。另外，将具有c-Myc-tag的命名为ALuc32。并且，将含有HA-tag的称为ALuc33、将含有Flag-tag的命名为ALuc34。
为了比较该新的发光酶类的亮度，在与实施例1－2同样的条件下进行比较实验(COS-7细胞、培养1天、使用Promega制检测试剂盒)(图21(B))。最后，使用Promega制检测试剂盒(含有天然腔肠素(nCTZ))，比较分泌到培养基中的各发光酶的亮度。其结果，ALuc30、ALuc33、ALuc34是非常有希望的人工生物发光酶，显示了较高的亮度。该结果可知，即使该人工生物发光酶中包含功能性氨基酸序列(抗原识别部位、亲和层析柱识别部位、定位信号)，也不会明显地抑制酶本身的性质、能够分泌到细胞外、发光活性也优异。
〔实施例1－22〕具有抗原识别部位(epitope)的功能性人工生物发光 酶的稳定性
研究上述实施例(1－21)中创立的新的功能性人工生物发光酶(具有抗体识别部位(epitope序列)等)的发光特性。
为了比较该发光酶类的相对的发光亮度进行以下实验。首先，将编码各生物发光酶的基因在作为真核细胞表达载体的pcDNA3.1(+)中亚克隆，将各个载体导入COS-7细胞中。在基因导入2天后，使用Promega制的发光试剂比较分泌到各个培养基中的发光酶的相对的亮度。
其结果，有趣的是在部分生物酶中确认到了在添加基质后亮度缓缓升高的现象(图22)。例如，有大量的在添加基质后经过约6分钟～12分钟的时刻显示最高亮度的发光酶。例如，ALuc33和ALuc34观察到了在添加基质后经过大约6分钟～12分钟的时刻显示最强的发光、之后亮度缓慢降低的趋势。另一方面，在ALuc32(含有c-Myc)的情况下，由于发光亮度较弱，可以预测ALuc32所含的c-Myc的部分序列抑制酶活性。
本实验结果显示，现在的含有抗体识别部位的生物发光酶类能够利用抗体识别部位在体系内作为发光标识发挥作用而不会出现酶活性丧失的现象。
(实施例2－1)～(实施例2－10)
下面，表示下述的(实施例2－1)～(实施例2－10)中使用的组成物质的化学结构例。
丙二醇(mw 76)
甘氨酸(mw75)
D(+)-半乳糖(mw 180.2)Wako 075-0035
D(+)-葡萄糖(mw 180)
蔗糖，小颗粒(mw 342.3)Wako 193.09545
(实施例2－1)裂解缓冲液和检测缓冲液的组合的研究
在本实施例中，进行现有技术中用于生物检测的裂解缓冲液和检测缓冲液的组合所引起的发光亮度的比较(图23)。首先，在96孔板上培养COS-7细胞，导入表达人工生物发光酶(ALuc)的载体，再培养8小时。之后，弃去培养基后，用PBS缓冲液对细胞进行1次清洗。如图23所示，用一系列的细胞裂解缓冲液(Promega公司制品，Luciferase Lysis Buffer(cat.E291A)、NEB制Lysis buffer(cat.B3321)、C1～C4)各50μL进行20分钟细胞裂解。在板上的各孔内同时滴加加入了基质的3种检测缓冲液(C8：HBSS缓冲液、C10：在Tris缓冲液添加了EDTA和PEG400的溶液(即TE PEG400)、C5：H2O)50μL，利用图像测定器(LAS-4000，FujiFilm)测定来自它们的发光强度。
根据其结果，Promega制的Luciferase Lysis Buffer(cat.E291A)和C3的细胞裂解液的体系中发光亮度极高。并且，确认了检测缓冲液中HBSS和TE PEG缓冲液是有效的。特别是在对于Promega制细胞裂解液(cat.E291A)使用HBSS或TE PEG缓冲液作为检测缓冲液的情况下，观察到了高的发光稳定性(89％～92％)(图23B)。该％的值表示与导入了检测缓冲液后的最初状态相比的5分钟后的发光值。此外，除了C3的裂解缓冲液之外，采用HBSS缓冲液作为检测缓冲液的情况下，得到了高的亮度和发光稳定性(71％)。
(实施例2－2)能够与C3组合的最适宜的检测缓冲液的探索
根据实施例2－1的结果，C3是有效的细胞裂解缓冲液，由此，进一步探索能够与C3组合的最适宜的检测缓冲液(图24)。首先，在96孔板上培养COS-7细胞，导入人工生物发光酶(ALuc)表达用质粒。用CO2孵育培养16小时后，在各孔中用50μL的C3溶液实施20分钟的细胞裂解。对于该细胞裂解产物，如图24所示，同时添加加入了基质的检测缓冲液50μL，立即利用LAS-4000(FujiFilm)测定相对的发光亮度。再导入加入了基质的检测缓冲液后，测定经过8分钟、16分钟后的发光值，验证发光稳定性。
其结果，由图24A可知，作为与C3的适应性好的检测缓冲液，优选PBS、HBSS、Tris-PEG缓冲液。在发光稳定性方面，如图24B所示可知，PBS、HBSS、Tris－MgCl2等较好。另一方面，可知在PBS缓冲液中添加有BSA的情况下，由于发光亮度和稳定性变差，牛血清蛋白(BSA)是不能在检测缓冲液中添加的添加物。
(实施例2－3)作为检测缓冲液的添加剂的重金属离子的效果的验证
根据上述实施例2－1和2－2的结果可知，C3是有效的细胞裂解缓冲液，PBS和HBSS是有希望的检测缓冲液。
在本实施例中，验证作为检测缓冲液的添加剂的重金属离子的效果(图25)。首先，在96孔板上培养COS-7细胞，导入人工生物发光酶(ALuc)表达用质粒。用CO2孵育培养16小时后，在各孔中用50μL的C3溶液实施20分钟的细胞裂解。对于该细胞裂解产物，同时加入图25所示的各重金属离子1PPM和加入了基质的HBSS缓冲液50μL，立即利用LAS-4000测定相对的发光亮度。再导入加入了基质的检测缓冲液后，测定经过8分钟、16分钟后的发光值，验证发光稳定性。
其结果，由图25A可知，作为适合于在C3和HBSS中添加的重金属添加剂，Al(III)、Ca(II)、Cu(II)、Fe(III)、Mg(II)等是适合的。另外在综合判断发光亮度和稳定性的情况下，可知Al(III)、Cu(II)、Fe(III)、Mo(VI)、Zn(II)等是令人满意的添加剂。并且可知Cd(II)、Co(II)、Ni(II)等会明显地损害发光亮度，是不能添加的重金属。
(实施例2－4)生物检测用反应溶液中添加二元醇类的效果
在本实施例中，实际地使用发光探针，研究生物检测用反应溶液中添加二元醇类的效果(图26)。
首先，按照本发明的发明人开发的单分子型生物发光探针的制造方法(非专利文献28)，开发新的单分子型生物发光探针。按照收集发光酶中大量的来自浮游生物的发光荧光素酶、并从其中提取热力学上稳定性高的序列的方法，将本发明的发明人新开发出的人工生物发光酶(ALuc)(与本申请同日申请)分成两部分，在其间插入男性荷尔蒙受体(AR LBD)(图26A)。以该探针在男性荷尔蒙共存下分子结构发生变化的方式设计，结果，分成两部分的酶片段再结合。
为了该实验，首先，在96孔板上培养COS-7细胞，导入编码上述单分子型生物发光探针的质粒。利用CO2孵育培养16小时后，在各孔中用50μL的C3溶液实施20分钟的细胞裂解。对于该细胞裂解产物，制备加入了图26B所示的分量的PPG或PEG和基质的HBSS缓冲液50μL，用多通道移液管同时加入，立即用现有的光度计(GloMax20/20n，Promega)测定发光值。
其结果可知，添加PPG或PEG看到了有效的结果。并且，作为添加量，优选为检测缓冲液的1％左右。
(实施例2－5)生物检测用反应溶液中添加卤离子的效果
本实施例中，研究生物检测用反应溶液中添加卤离子的效果(图27)。使用上述实施例2－4中制作的单分子型生物发光探针，研究在将该发光探针用于男性荷尔蒙识别时的反应溶液中添加卤离子(Br-或I-)添加作所带来的效果。
首先，将编码上述单分子型生物发光探针的质粒导入使用TransIT-LT1在96孔板上培养的COS-7细胞中。利用CO2孵育培养16小时后，在各孔中用50μL的C3溶液实施20分钟的细胞裂解。对于该细胞裂解产物，制备加入了图27B所示分量的KBr或KI和基质的HBSS缓冲液50μL，用多通道移液管同时加入，立即使用现有的光度计(GloMax 20/20n，Promega)测定发光值。
其结果可知，添加卤离子是有效的添加剂。具体而言，可知如果为KI，任意的添加量都好，特别是加入50mM左右非常好；如果为KBr，加入100mM左右适合。
(实施例2－6)生物检测用反应溶液中添加多糖类的效果
在本实施例中，研究生物检测用反应溶液中添加多糖类的效果(图28)。使用上述实施例2－4中制作的单分子型生物发光探针，研究在将该发光探针用于男性荷尔蒙识别时的反应溶液中添加多糖类的效果。
首先，将编码上述单分子型生物发光探针的质粒导入使用TransIT-LT1在96孔板上培养的COS-7细胞中。利用CO2孵育培养16小时后，在各孔中用50μL的C3溶液实施20分钟的细胞裂解。对于该细胞裂解产物，制备加入了图示分量的多糖类和基质的HBSS缓冲液50μL，利用多通道移液管同时加入，立即用现有的光度计(GloMax20/20n，Promega)测定发光值。
其结果可知，添加蔗糖或葡萄糖特别有效。并且可知即便不是多糖类，添加甘氨酸也是有效的。可知加入量优选为2mg/mL。
(实施例2－7)利用单分子型生物发光探针(cSimgr8)的应激激素检 测试验－1
为了证实本发明的一次缓冲液的优异的性能，将本发明的C14～C22的反应缓冲液应用于以应激激素受体(糖皮质激素受体的配体结合域，the ligand binding domain of glucocorticoid receptor，GR LBD)为骨架的单分子型生物发光探针(cSimgr8)，进行生物检测(图29)。其中，cSimgr8是如实施例2－4所示将独立开发的人工生物发光酶(ALuc)适当地分成两部分、进行循环序列取代后、在其外侧连接应激激素受体(糖皮质激素受体的配体结合域，the ligand binding domainof glucocorticoid receptor，GR LBD)和其特异的结合序列的形态的新的单分子型生物发光探针。
首先，在96孔板上培养COS-7细胞，导入cSimgr8。再培养16小时后，将板上的COS-7细胞分成两部分，对于其中一部分细胞用10-5M的应激激素(皮质醇，cortisol)进行20分钟刺激，对于另一部分细胞用对照(0.1％DMSO)进行20分钟刺激。之后，弃去板上的培养基仅留下细胞。作为一次缓冲液，准备具有C14～C22的组成的缓冲液。发光测定仪器使用Promega制的高灵敏度光度计(GloMax 20/20N，Promega)。
作为检测的顺序，首先，在除去了培养基的上述板的各孔中加入上述C14～C22的任意的溶液50μL，进行数次吸液(pipetting)后，将全部量移入1.6mL的Eppendorf管中，直接利用上述光度计测定3秒的光量。将各缓冲液的结果分别示于图29。
(实施例2－8)利用单分子型生物发光探针(cSimgr8)的应激激素检 测试验－2
应用本发明的C23～C26的反应缓冲液，进行利用与(实施例2－7)同样的单分子型生物发光探针(cSimgr8)的应激激素检测试验(图30)。
与(实施例2－7)同样，在96孔板上培养COS-7细胞，导入cSimgr8。再培养16小时后，将板上的COS-7细胞分成两部分，对其中的一部分细胞用10-5M的应激激素(皮质醇，cortisol)进行20分钟刺激，对另一部分细胞用对照(0.1％DMSO)进行20分钟刺激。之后，弃去板上的培养基仅留下细胞。作为一次缓冲液，准备具有C14～C22的组成的缓冲液。发光测定仪器使用Promega制的高灵敏度光度计(GloMax 20/20N，Promega)。
作为检测的顺序，首先，在除去了培养基的上述板的各孔中，加入上述C23～C26任意的溶液50μL，进行数次吸液后，将全部量移入1.6mL的Eppendorf管，直接利用上述光度计测定3秒的光量。将各缓冲液的结果分别示于图30。
(实施例2－9)利用单分子型生物发光探针(pLeu-rich)的男性荷尔 蒙检测试验
为了证实本发明的一次缓冲液的优异的性能，将本缓冲液应用于以男性荷尔蒙受体(雄性激素受体的配体结合域，the ligand bindingdomain of androgen receptor，AR LBD)为骨架的单分子型生物发光探针(pLeu-rich)。其中，pLeu-rich是本发明的发明人使用来自萤火虫的发光荧光素酶以前开发出的单分子型生物发光探针(非专利文献29)。
首先，在96孔板上培养COS-7细胞，导入pLeu-rich。再培养16小时后，将板上的COS-7细胞分成两部分，对于一部分细胞用10-5M的5α-二氢睾酮(5α-dihydrotestosterone，DHT)、4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen，OHT)，17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)、二氯二苯三氯乙烷(dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT)、多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，PCB)进行20分钟刺激。之后，弃去培养基，从而结束细胞方面的检测准备。另一方面，反应缓冲液使用在C29溶液中混合有D-荧光素的溶液。发光测定仪器使用Promega制的高灵敏度光度计(GloMax 20/20N，Promega)。
关于检测的顺序，首先，在除去了培养基的上述板上添加上述C16溶液50μL，进行数次吸液后，将全部量移入1.6mL的Eppendorf管，用上述光度计进行光量测定。
其结果，得到了图31所示的结果。首先可知对于DHT和E2显示出一定的检测能力(与背景相比约为3～5倍)。并且可知从细胞裂解直到测定的时间可在瞬间(数秒以内)完成。该结果将现有技术中耗费30分钟以上、非常繁琐的手续极度简化，从这一点来看，是显示了该反应缓冲液的优越性的结果。
(实施例2－10)利用单分子型生物发光探针(pSimer-r2)的女性荷尔 蒙检测试验
为了证实上述反应缓冲液(一次缓冲液)的性能，将本缓冲液应用于以女性荷尔蒙受体(雌性激素受体的配体结合域，the ligand bindingdomain of estrogen receptor，ER LBD)为骨架的单分子型生物发光探针(pSimer-r2)。其中，pSimer-r2是本发明的发明人使用来自叩头虫的发光荧光素酶(叩头虫荧光素酶，click beetle luciferase，CBLuc)以前开发的单分子型生物发光探针(非专利文献12)。
首先，在96孔板上培养COS-7细胞，导入pSimer-r2。再培养16小时后，将板上的COS-7细胞分成两部分，对一部分细胞用10-5M的5α-二氢睾丸酮(DHT)、4-羟基他莫昔芬(OHT)，17β-雌二醇(E2)、二氯二苯三氯乙烷(DDT)、多氯联苯(PCB)进行20分钟刺激。其余的细胞用作对照组(参照)。之后，弃去培养基，从而结束细胞方面的检测准备。另一方面，一次反应缓冲液使用C16。发光测定仪器使用Promega制的高灵敏度光度计(GloMax 20/20，Promega)。
关于检测的顺序，首先，在除去了培养基的上述板上，添加上述C16溶液50μL，进行数次吸液后，将全部量移入1.6mL的Eppendorf管，用上述光度计进行光量测定。
其结果，得到了图32所示的结果。首先可知，对4-羟基他莫昔芬(OHT)显示了一定的检测能力(与背景相比约为5倍)。并且可知从细胞裂解直到测定的时间可在瞬间(数秒以内)完成。该结果将现有技术中耗费30分钟以上、非常繁琐的手续极度简化，从这一点来看，是显示了该反应缓冲液的优越性的结果。
产业上的可利用性
通过代替一直以来广泛使用的报告基因检测法为基础的配体测量、或现有的生物发光探针等中的荧光素酶使用，能够使检测的测量性能飞跃性地提高，因此能够在基础生物学研究、医学、药学、分析化学中的诊断试剂开发等的广泛的用途中使用。

Claims (24)

1.一种多肽，其特征在于：
包含下述(i)或(ii)所记载的氨基酸序列，并且具有桡脚类荧光素酶活性，
(i)序列号38所示的氨基酸序列，
(ii)序列号38所示的氨基酸序列中，1-31位或217-221位的至少任意区域中1个以上的氨基酸缺损的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于：
包含下述(iii)～(v)的任一项所记载的氨基酸序列，
(iii)序列号11～17或24～36的任一项所示的氨基酸序列，
(iv)序列号11～17或24～36的任一项所示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，
(v)与序列号11～17或24～36的任一项所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于：
包含下述(vi)或(vii)所记载的氨基酸序列，
(vi)序列号22所示的氨基酸序列，
(vii)序列号22所示的氨基酸序列中，1-29位或211-215位的至少任意区域中1个以上的氨基酸缺损的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于：
序列号38所示的氨基酸序列中1-71位的区域是序列号39所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的多肽，其特征在于：
序列号38所示的氨基酸序列中1-157位的区域是序列号40所示的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的多肽，其特征在于：
序列号38所示的氨基酸序列中20-31位的区域是抗体识别部位。
7.一种编码权利要求1～6中任一项所述的多肽的核酸。
8.一种以能够表达的方式插入了权利要求7所述的核酸的表达载体。
9.一种以能够表达的方式导入了权利要求7所述的核酸的转化细胞。
10.一种报告蛋白，其用于报告分析法，所述报告蛋白的特征在于：
包括权利要求1～6中任一项所述的多肽。
11.一种发光性融合蛋白，其特征在于：
含有权利要求10所述的报告蛋白，并且含有靶蛋白或识别靶蛋白的肽。
12.如权利要求11所述的发光性融合蛋白，其特征在于：
在报告蛋白的C末端侧结合有膜定位信号(MLS)，靶多肽作为载入物插入两者之间。
13.如权利要求12所述的发光性融合蛋白，其特征在于：
所述被插入的靶多肽是荧光蛋白质或荧光素酶。
14.如权利要求12所述的发光性融合蛋白，其特征在于：
所述被插入的靶多肽是使细胞膜形态变化的多肽或含有该多肽识别的氨基酸序列的多肽。
15.一种表达载体，其特征在于：
包含编码权利要求11～14中任一项所述的发光性融合蛋白的报告基因。
16.一种导入了权利要求15所述的表达载体的转化细胞。
17.一种报告分析法，用于分析对应于外部刺激的细胞内的靶基因的表达位置、表达时期或表达量，所述报告分析法的特征在于：
使用权利要求16所述的转化细胞。
18.如权利要求17所述的分析法，其特征在于：
所述分析法是报告基因检测法或双杂交检测法。
19.一种生物发光探针，用于测定配体结合性蛋白的配体活性，所述生物发光探针的特征在于：
由融合蛋白构成，
所述融合蛋白含有被分为N末端侧和C末端侧两部分的权利要求10所述的报告蛋白，并且含有配体结合性的靶蛋白和识别配体与靶蛋白结合时的立体结构变化的多肽。
20.一种表达载体，其为用于测定配体结合性蛋白的配体活性的表达载体，所述表达载体的特征在于：
编码权利要求19所述的生物发光探针的核酸处于能够在细胞内表达该核酸的调控序列的调控之下。
21.一种导入了权利要求20所述的表达载体的转化细胞。
22.如权利要求16所述的转化细胞，其特征在于：
所述转化细胞为干细胞。
23.一种被检细胞内的配体结合性蛋白的配体活性的检测方法，其特征在于：使用权利要求20所述的表达载体。
24.一种生物发光成像法，其特征在于：
使用权利要求20所述的表达载体，观察被检细胞内的配体结合性蛋白的配体活性。
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