JP5701505B2 - 分泌型ルシフェラーゼを用いた生物発光アッセイ - Google Patents
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Description
(a)前記ルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(b)前記ルシフェラーゼを時間依存的に不活性化する還元剤と前記試料を接触させるステップと;
(c)前記ルシフェラーゼが前記還元剤によって不活性化される前に、前記ルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
を含んでいる。
(a)前記ルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(b)前記ルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
(c)次いで、前記ルシフェラーゼを時間依存的に不活性化する還元剤と前記試料を接触させるステップと;
を含んでいる。
(a)前記ルシフェラーゼを時間依存的に不活性化する還元剤と前記試料を接触させるステップと;
(b)前記ルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(c)前記ルシフェラーゼが前記還元剤によって不活性化される前に、前記ルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
を含んでいる。
(a)前記第1のルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(b)前記第1のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
(c)前記第1のルシフェラーゼを時間依存的に不活性化する還元剤と前記試料を接触させるステップと;
(d)前記第2のルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(e)前記第2のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
を含んでいる。
(a)前記第1のルシフェラーゼを時間依存的に不活性化する還元剤と前記試料を接触させるステップと;
(b)前記第2のルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(c)前記第2のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
を含んでいる。
(a)第1のルシフェラーゼを時間依存的に不活性化する、有効量の還元剤を前記試料に添加するステップと;
(b)前記試料中の発光シグナルを測定するステップと;
(c)前記第1のルシフェラーゼの前記発光シグナルを減衰可能にするために、ある期間待機するステップと;
(d)前記試料中の前記発光シグナルを測定するステップと;
(e)ステップ(b)及び(d)の結果と、各発光シグナルにおける異なる減衰率とに基づいて、各ルシフェラーゼについて前記発光シグナルを計算するステップと;
を含んでいる。
(a)前記第1及び第2のルシフェラーゼ用の反応基質、及び前記第1のルシフェラーゼを時間依存的に不活性化するが前記第2のルシフェラーゼを不活性化しない還元剤と、前記試料を接触させるステップと;
(b)前記第1のルシフェラーゼが前記還元剤によって不活性化される前に前記発光シグナルを測定するステップと;
(c)前記第1のルシフェラーゼが不活性化された後に前記発光シグナルを測定するステップと;
(d)相互に比較した、又は他の試料と比較した各ルシフェラーゼの量又は活性を計算するために、ステップ(b)及び(c)で収集されたデータを用いるステップと;
を含んでいる。
(a)前記第1のルシフェラーゼ用の反応基質及び前記第1のルシフェラーゼを時間依存的に不活性化するが前記第2のルシフェラーゼを不活性化しない還元剤と、前記試料を接触させるステップと;
(b)前記第1のルシフェラーゼが不活性化される前に前記発光シグナルを測定するステップと;
(c)前記第2のルシフェラーゼ用の反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(d)前記第1のルシフェラーゼが不活性化された後に前記発光シグナルを測定するステップと;
(e)相互に比較した、又は他の試料と比較した各ルシフェラーゼの量又は活性を計算するために、ステップ(b)及び(c)で収集されたデータを用いるステップと;
を含んでいる。
又は単純に、過去に測定されたウェルから現在測定されているウェルに生じている発光漏出の低減を含んでいる。
R−S−S−R1+2H++2e−→R−SH+R1−SH 1.0
好適な還元剤の例は限定されないが、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、チオグリコール酸塩、チオグリコール酸ナトリウム、ピルビン酸塩、システイン、硫化ナトリウム、硫化水素、ジチオン酸塩、水素及び白金触媒、β−メルカプトエタノール;β−メルカプトエチルアミン、メルカプト酢酸、二酸化チオ尿素、N−エチルマレイミド、及びアスコルビン酸塩を含んでいる。いくつかの実施例においては、還元試薬はポリマ担体のような固体担体に固定化してもよい。固定化された還元試薬の一例は、固定化されたTCEPジスルフィド還元ゲルである。TCEPは還元剤の一例であるが、チオール誘導体ではない[Willis,M.,S.,Protein Science,2005,14,1818−826]。
(a)第1のルシフェラーゼが標準的に触媒活性を起こす天然の微少環境の酸化還元ポテンシャルが第2のルシフェラーゼが標準的に触媒活性を起こす天然の微少環境の酸化還元ポテンシャルよりも一般的により還元的でありほとんど酸化的ではなく、及び/又は
(b)第1のルシフェラーゼが標準的に触媒活性を起こす天然の微少環境が一般的に細胞外である一方、第2のルシフェラーゼが標準的に触媒活性を起こす天然の微少環境が細胞内であり、及び/又は、
(c)天然形態においては、第1のルシフェラーゼが分泌される一方、第2のルシフェラーゼが分泌されず、及び/又は、
(d)第1のルシフェラーゼでの還元剤及び還元される酸化還元環境の効果が、第2のルシフェラーゼに関するよりも少なくとも大きな度合いで不活性化し、及び/又は、
(e)第1のルシフェラーゼの活性化が分子内のジスルフィドブリッジの構成体に依存する一方、第1のルシフェラーゼの活性化は依存せず、及び/又は、
(f)第1のルシフェラーゼが第2次/第3次構造の構成体について重要なシステイン残基を含み、及び/又は、
(g)適宜フォールディングされた第1のルシフェラーゼの予測される構造がシステイン残基間の複数のジスルフィドブリッジを含む一方、第2のルシフェラーゼの予測される構造は含まない又は触媒領域の領域内には少なくとも含まれない。
(a)第1及び第2のルシフェラーゼ用の反応基質、及び第1のルシフェラーゼを時間依存的に不活性化するが第2のルシフェラーゼを不活性化しない還元剤と、試料を接触させるステップと;
(b)第1のルシフェラーゼが還元剤によって不活性化される前に発光シグナルを測定するステップと;
(c)第1のルシフェラーゼが不活性化された後に発光シグナルを測定するステップと;
(d)相互に比較した、又は他の試料と比較した各ルシフェラーゼの量又は活性を計算するために、ステップ(b)及び(c)で収集されたデータを用いるステップと;
を含んでいる。
(a)第1のルシフェラーゼ用の反応基質及び第1のルシフェラーゼを時間依存的に不活性化するが第2のルシフェラーゼを不活性化しない還元剤と、試料を接触させるステップと;
(b)第1のルシフェラーゼが不活性化される前に発光シグナルを測定するステップと;
(c)第2のルシフェラーゼ用の反応基質と試料を接触させるステップと;
(d)第1のルシフェラーゼが不活性化された後に発光シグナルを測定するステップと;
(e)相互に比較した、又は他の試料と比較した各ルシフェラーゼの量又は活性を計算するために、ステップ(b)及び(c)で収集されたデータを用いるステップと;
を含んでいる。
a)上のvi)によって用いるために還元剤を溶解バッファに添加するステップで、更なる有用性の例として、ユーザは他のルシフェラーゼと組み合わせて、非分泌型ガウシアルシフェラーゼを発現する安定した株化細胞とともに作業するユーザは、ガウシアルシフェラーゼを測定するか、ガウシアルシフェラーゼを測定しないかを選択でき、後者の場合、ユーザは還元剤と共に溶解バッファを用いて、他のルシフェラーゼを測定する前にガウシアルシフェラーゼを不活性化できるステップ
b)上のi)によって用いるために還元剤をアッセイバッファに添加するステップ
c)還元剤なしで試料にアッセイバッファをまず添加し、発光を測定し、次いで還元剤を添加して少なくとも1のルシフェラーゼを不活性化するステップ
d)還元剤なしで試料にアッセイバッファをまず添加し、グロー段階が得られるまで待機し、還元剤又は還元剤を含むアッセイバッファを添加し、ルシフェラーゼが不活性化される前に発光を測定するステップ
パートI:天然状態において分泌されたルシフェラーゼからの発光の動態を短縮させる還元剤
Claims (52)
- 試料中の1又はそれ以上のルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するための方法であって、当該方法が、分析すべき前記1又はそれ以上のルシフェラーゼの1又はそれ以上の反応基質と、第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮するための還元剤とを用いて、前記試料をインキュベートするステップを含み、天然形態における前記第1のルシフェラーゼが成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであり、前記還元剤がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記還元剤が前記ルシフェラーゼの不活性なコンフォメーションへの変換を促進することを特徴とする方法。
- 請求項1又は2に記載の方法において、前記第1のルシフェラーゼが、天然形態では分泌されるルシフェラーゼについて、非分泌型に変更された形態になることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法において、前記第1のルシフェラーゼが基質としてセレンテラジンを用いることを特徴とする方法。
- 請求項4に記載の方法において、前記第1のルシフェラーゼが、基質としてセレンテラジンを用い、海洋起源であることを特徴とする方法。
- 請求項5に記載の方法において、前記海洋起源のルシフェラーゼがガウシア属の種、プレウロマンマ属の種、メトリディア属の種、シプリディナ属の種、又はオプロフォラス属の種に由来するものであるか、あるいは、その変異体又は誘導体であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記還元剤がDTTであることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法において、前記第1のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルが測定されることを特徴とする方法。
- 請求項8に記載の方法において、前記第1のルシフェラーゼの反応基質が前記還元剤と同時に添加されることを特徴とする方法。
- 請求項8に記載の方法において、前記第1のルシフェラーゼの反応基質が前記試料に添
加され、前記第1のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルが、前記還元剤の添加前に測定されることを特徴とする方法。 - 請求項8に記載の方法において、前記還元剤が前記第1のルシフェラーゼの反応基質より前に前記試料に添加され、前記第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間が前記還元剤によって短縮される前に、前記第1のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルが測定されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至11のいずれか1項に記載の方法において、前記ルシフェラーゼの少なくとも1つが組換えレポータ遺伝子から発現されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至12のいずれか1項に記載の方法において、前記発光シグナルがレポータ遺伝子アッセイの一部として測定されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至13のいずれか1項に記載の方法において、前記試料が少なくとも1の細胞内ルシフェラーゼを含むことを特徴とする方法。
- 請求項14に記載の方法において、前記細胞内ルシフェラーゼが鞘翅目の種に由来することを特徴とする方法。
- 請求項14に記載の方法において、前記細胞内ルシフェラーゼが双翅目の種に由来することを特徴とする方法。
- 請求項14乃至16のいずれか1項に記載の方法において、前記細胞内ルシフェラーゼによって生成された発光シグナルの測定前に、前記第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間が短縮されるように、前記還元剤が、前記細胞内ルシフェラーゼの反応基質の添加前に前記試料に添加されることを特徴とする方法。
- 請求項14乃至17のいずれか1項に記載の方法において、前記細胞内ルシフェラーゼが鞘翅目の種又は双翅目の種に由来し、前記還元剤によって活性化されることを特徴とする方法。
- 請求項14乃至18のいずれか1項に記載の方法において、前記細胞内ルシフェラーゼが鞘翅目の種又は双翅目の種に由来し、その発光時間が前記還元剤によって拡張されることを特徴とする方法。
- 請求項14乃至19のいずれか1項に記載の方法において、前記第1のルシフェラーゼが基質としてセレンテラジンを用い、前記細胞内ルシフェラーゼが基質としてルシフェリンを用いることを特徴とする方法。
- 請求項14乃至19のいずれか1項に記載の方法において、前記第1のルシフェラーゼ及び前記細胞内ルシフェラーゼが双方とも、基質としてセレンテラジンを用いることを特徴とする方法。
- 請求項14乃至21のいずれか1項に記載の方法において、前記試料が2又はそれ以上の細胞内ルシフェラーゼを含むことを特徴とする方法。
- 請求項22に記載の方法において、前記2又はそれ以上の細胞内ルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルが、異なる波長で生成されることを特徴とする方法。
- 試料中のルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するための方法であって、前記ルシフェラーゼが天然形態においては、成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであり、前記方法が、
(a) 前記ルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(b) 前記ルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮する還元剤と前記試料を接触させるステップと;
(c) 前記期間が前記還元剤によって短縮される前に、前記ルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
を含み、前記還元剤がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択されることを特徴とする方法
。 - 請求項24に記載の方法において、前記ルシフェラーゼが、天然形態においては分泌されるルシフェラーゼについて、非分泌型に変更された形態となることを特徴とする方法。
- 請求項24又は25に記載の方法において、前記試料が前記還元剤より前に前記反応基質と接触することを特徴とする方法。
- 請求項24又は25に記載の方法において、前記試料が前記反応基質及び前記還元剤と同時に接触することを特徴とする方法。
- 試料中のルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するための方法であって、前記ルシフェラーゼが天然形態においては、成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであり、前記方法が、
(a) 前記ルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(b) 前記ルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステ
ップと;
(c) 次いで、前記ルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮する還元剤と前記試料を接触させるステップと;
を含み、前記還元剤がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択されることを特徴とする方法。 - 試料中のルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するための方法であって、前記ルシフェラーゼが天然形態においては、成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであり、前記方法が、
(a) 前記ルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮する還元剤と前記試料を接触させるステップと;
(b) 前記ルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(c) 前記期間が前記還元剤によって短縮される前に、前記ルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
を含み、前記還元剤がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択されることを特徴とする方法
。 - 試料中の第1及び第2のルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するための方法であって、前記第1のルシフェラーゼが天然形態においては、成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであり、前記第2のルシフェラーゼが細胞内ルシフェラーゼであり、前記方法が、
(a) 前記第1のルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(b) 前記第1のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
(c) 前記第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮する還元剤と前記試料を接触させるステップと;
(d) 前記第2のルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(e) 前記第2のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
を含み、前記還元剤がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択されることを特徴とする方法。 - 請求項30に記載の方法において、前記第1のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルの測定前に、前記第2のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルが測定されるように、ステップ(d)及び(e)がステップ(a)乃至(c)に先行することを特徴とする方法。
- 請求項30又は31に記載の方法において、前記第1のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルの測定前に、前記試料が前記還元剤と接触するように、ステップ(b)がステップ(a)及び(c)の後に行われることを特徴とする方法。
- 請求項32に記載の方法において、前記試料が、前記第1のルシフェラーゼの反応基質より前に、又は同時に前記還元剤と接触することを特徴とする方法。
- 第1及び第2のルシフェラーゼを含む試料中の第2のルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するための方法であって、前記第1のルシフェラーゼが天然形態においては、成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであり、前記第2のルシフェラーゼが細胞内ルシフェラーゼであり、前記方法が、
(a) 前記第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮する還元剤と前記試料を接触させるステップと;
(b) 前記第2のルシフェラーゼの反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(c) 前記第2のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
を含み、前記還元剤がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択されることを特徴とする方法。 - 請求項30乃至34のいずれか1項に記載の方法において、前記試料が第3のルシフェラーゼを更に含むことを特徴とする方法。
- 請求項35に記載の方法において、前記第3のルシフェラーゼが細胞内ルシフェラーゼであることを特徴とする方法。
- 請求項35又は36に記載の方法において、前記第2及び第3のルシフェラーゼによって生成された前記発光シグナルが、異なる波長で生成されることを特徴とする方法。
- 請求項37に記載の方法において、前記第2のルシフェラーゼが鞘翅目の種に由来し、前記第3のルシフェラーゼが双翅目の種に由来することを特徴とする方法。
- 請求項1乃至38のいずれか1項に記載の方法において、発光シグナルの測定前に、前記試料が細胞溶解ステップに供されることを特徴とする方法。
- 請求項39に記載の方法において、前記1又はそれ以上のルシフェラーゼ基質の添加前に、前記試料が細胞溶解ステップに供されることを特徴とする方法。
- 請求項39に記載の方法において、前記還元剤の添加前に、前記試料が細胞溶解ステップに供されることを特徴とする方法。
- 請求項39又は40に記載の方法において、前記還元剤が細胞溶解バッファ中にあることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至42のいずれか1項に記載の方法において、1又はそれ以上のルシフェラーゼを発現する細胞が培養された条件培地を用いて、発光シグナルが測定されることを特徴とする方法。
- 天然形態においては、成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであるルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮するための方法であって、当該方法が、前記ルシフェラーゼを含む試料をジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択される還元剤と接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
- 請求項44に記載の方法において、前記ルシフェラーゼが、天然形態においては分泌されるルシフェラーゼについて、非分泌型に変更された形態となることを特徴とする方法。
- 請求項44又は45に記載の方法において、前記還元剤が前記ルシフェラーゼの不活性なコンフォメーションへの変換を促進することを特徴とする方法。
- 天然形態においては成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであるルシフェラーゼによって生成された発光シグナルの減衰率を増加させるための方法であって、当該方法が、前記ルシフェラーゼを含む試料をジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択される還元剤と接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
- 試料中の1又はそれ以上のルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するための方法であって、当該方法が、分析すべき前記1又はそれ以上のルシフェラーゼの1又はそれ以上の反応基質と、第1のルシフェラーゼの不活性なコンフォメーションへの変換を促進するのに好適な環境を提供する試薬組成物とを用いて、前記試料をインキュベートするステップと、前記ルシフェラーゼを含む試料を還元剤と接触させるステップとを含み、天然形態における前記第1のルシフェラーゼが成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであり、前記還元剤がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 試料中の2又はそれ以上のルシフェラーゼの量又は活性を測定するための方法であって、当該方法が、
(a) 前記ルシフェラーゼの反応基質と、天然形態において成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼである第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮する、有効量の還元剤とを前記試料に添加するステップと;
(b) 前記試料中の前記ルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するステップと;
(c) 前記第1のルシフェラーゼの前記発光シグナルを減衰可能にするために、ある期間待機するステップと;
(d) 前記試料中の前記ルシフェラーゼにより生成された前記発光シグナルを測定するステップと;
(e) ステップ(b)及び(d)の結果と、各発光シグナルにおける異なる減衰率とに基づいて、各ルシフェラーゼについて前記発光シグナルを計算するステップと;
を含み、前記還元剤がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択されることを特徴とする方法。 - 試料中の第1及び第2のルシフェラーゼの量又は活性を測定するための方法であって、
該第1のルシフェラーゼが天然形態において成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであり、前記方法が、
(a) 前記第1及び第2のルシフェラーゼ用の反応基質、及び前記第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮するが前記第2のルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮しない還元剤と、前記試料を接触させるステップと;
(b) 前記第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間が前記還元剤によって短縮される前に、前記第1のルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するステップと;
(c) 前記第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間が短縮された後に前記第2のルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するステップと;
(d) 相互に比較した、又は他の試料と比較した各ルシフェラーゼの量又は活性を計算するために、ステップ(b)及び(c)で収集されたデータを用いるステップと;
を含み、前記還元剤がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択されることを特徴とする方法。 - 試料中の第1及び第2のルシフェラーゼの量又は活性を測定するための方法であって、
該第1のルシフェラーゼが天然形態において成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであり、前記方法が、
(a) 前記第1のルシフェラーゼ用の反応基質及び前記第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮するが前記第2のルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮しない還元剤と、前記試料を接触させるステップと;
(b) 前記第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間が短縮される前に、
前記第1のルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するステップと;
(c) 前記第2のルシフェラーゼ用の反応基質と前記試料を接触させるステップと;
(d) 前記第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間が短縮された後に、前記第2のルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定するステップと;
(e) 相互に比較した、又は他の試料と比較した各ルシフェラーゼの量又は活性を計算するために、ステップ(b)及び(c)で収集されたデータを用いるステップと;
を含み、前記還元剤がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択されることを特徴とする方法。 - 試料中の1又はそれ以上のルシフェラーゼの量又は活性を測定するための方法であって、当該方法が、分析すべき前記1又はそれ以上のルシフェラーゼの1又はそれ以上の反応基質と、第1のルシフェラーゼから生成された発光の期間を短縮するための還元剤とを用いて、前記試料をインキュベートするステップを含み、前記第1のルシフェラーゼが天然形態においては、成熟活性コンホメーション中にジスルフィド架橋を含む分泌型ルシフェラーゼであり、前記還元剤がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、β−メルカプトエタノール、システアミン、亜硫酸ナトリウム、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)からなる群から選択されることを特徴とする方法。
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