JP5332178B2 - 多色ルシフェラーゼの検出方法 - Google Patents
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Description
Contag C. et al, Red Shifted luciferase, United Sates Patent 6,495,355 (2002) Wood K.V., Lam Y.A., Seliger H.H., and McElroy W.D. 1989, Science, 244, 700−702:Complementary DNA Coding Click Beetles Luciferases Can Elicit Bioluminescence of Different Colors Viviani V.R., Bechara E.J.H., Ohmiya Y. 1999, Biochemistry, 38, 8271−8279 Viviani V., Uchida A., Suenaga N., Ryufuku M., and Ohmiya Y. 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 280, 1286−1291
[項1]
イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される1ないし2以上のルシフェラーゼを発現する細胞培養液中のルシフェラーゼの発光量を測定するための試薬であって、D−ルシフェリン、アデノシン三リン酸、マグネシウム塩、及び界面活性剤として、ノニデット(登録商標)P40またはポリオキシエチレン(20)セチルエーテルを含む発光試薬。
[項2]
前記ポリオキシエチレン(20)セチルエーテルが、細胞培養液と混合後、0.025〜1.5%である、項1に記載の試薬。
[項3]
前記ノニデット(登録商標)P40が、細胞培養液と混合後、0.025〜0.25%である、項1に記載の試薬。
[項4]
イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される1ないし2以上のルシフェラーゼを発現する細胞培養液中のルシフェラーゼの発光量を測定するための試薬であって、細胞をD−ルシフェリン、アデノシン三リン酸、マグネシウム塩、及び界面活性剤として、ノニデット(登録商標)P40またはポリオキシエチレン(20)セチルエーテルを含む試薬。
本発明で検出するルシフェラーゼは、イリオモテボタルRhagophthalmidae Ohbai由来の緑色発光ルシフェラーゼ(非特許文献5)、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ(非特許文献4)、鉄道虫Phrixothrix hirtus由来の赤色発光ルシフェラーゼ(非特許文献3)などが挙げられる。これらルシフェラーゼは野生型の配列、あるいは1ないし2以上のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失があってもよい。これらは通常、発現可能な遺伝子構築物の形で細胞に導入されるが、ルシフェラーゼ遺伝子はcDNA由来などの天然の遺伝子を使用してもよいが、試験に使用される細胞種において翻訳効率が向上するように遺伝子工学的に改変された遺伝子を用いることがより好ましく、近江谷らのルシフェラーゼが例示される(マルチ遺伝子転写活性測定システム、特許文献1)。
Ohmiya Y.,Mina Y.,Viviani V.R.,Ohba N.2000,Sci.Rep.Yokosuka City Mus.47,31−38
なお、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテルの濃度の、さらに好ましい下限は0.05%である。また、さらに好ましい上限は0.5%、最も好ましくは0.25%である。
96ウェル白色不透明プレートにCHO細胞を播種し(3×105 cells/ウェル)、10%FCSを含むHam‘s F12培地(日水製薬)100μl/ウェル中で培養した。翌日、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの発現プラスミド(それぞれ、東洋紡績製、MultiReporter Assay System −Tripluc(登録商標)− SV40コントロールベクターの、pSLG−SV40 control、pSLO−SV40 control、pSLR−SV40 control)をGeneJuice Transfection Reagent(Novagen社)を用いて、トランスフェクションした。24時間培養後、60mM Tricine pH8.0、4mM MgSO4、3mM EDTA、0.3mM Coenzyme A、0.58mM D−luciferin、4mM DTT、1.5mM ATP、さらに界面活性剤として0.05〜1%ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル、0.01〜0.5%Triton X−100,0.01〜0.5%Nonidet(ノニデット)(登録商標)P−40のいずれかを含む発光試薬を調製し、培地100μlを含んだままの細胞に100μlの発光試薬を添加した(すなわち、各試薬成分濃度は反応液中では前記の1/2となる)。10分間インキュベートして細胞を溶解し、発光を測定し、さらにその15分後(試薬添加25分後)、30分後(試薬添加40分後)の発光を測定した。
96ウェル白色不透明プレートにCHO細胞を播種し(3×105 cells/ウェル)、10%FCSを含むHam‘s F12培地(日水製薬)100μl/ウェル中で培養した。翌日、pSLG−SV40 control、pSLO−SV40 control、pSLR−SV40 controlをGeneJuice Transfection Reagent(Novagen社)を用いて、トランスフェクションした。24時間培養後、60mM Tricine pH8.0、4mM MgSO4、3mM EDTA、0.3mM Coenzyme A、0.58mM D−luciferin、4mM DTT、1.5mM ATP、さらに界面活性剤として0.5〜3%ポリオキシエチレン(20)セチルエーテルを含む発光試薬を調製し、培地100μlを含んだままの細胞に100μlの発光試薬を添加した(すなわち、各試薬成分濃度は反応液中では前記の1/2となる)。10分間インキュベートして細胞を溶解し、発光を測定し、さらにその15分後(試薬添加25分後)、30分後(試薬添加40分後)の発光を測定した。
96ウェル白色不透明プレートに培養したCHO細胞に、表1に示すように様々な比率で混合した pSLG−SV40 control,pSLO−SV40 control,pSLR−SV40 controlプラスミドをGeneJuice Transfection Reagentを用いてトランスフェクションした(n=6)。
翌日、60mM Tricine pH8.0、4mM MgSO4、3mM EDTA、0.3mM Coenzyme A、0.58mM D−luciferin、4mM DTT、1.5mM ATP、0.1%ポリオキシエチレン(20)セチルエーテルからなる発光試薬を調製し、培地100μlを含んだままの細胞に100μlの発光試薬を添加した(すなわち、各試薬成分濃度は反応液中では前記の1/2となる)。10分間インキュベートした後、発光をプレートリーダーARVOMX (パーキンエルマー社)を用いて、[1]660±50nm、[2]595±30nm、[3]510±30nmの光学フィルター存在下で、それぞれ測定した。
別途あらかじめ各ルシフェラーゼを単独で発現する細胞を用いて、各ルシフェラーゼの各フィルター透過率(Tij;iはフィルターNo.、j=g,o,r)を設定し、この透過率と測定値(Fi)から特開2007−218774に開示された算出方法に基づいて、各ルシフェラーゼの活性(G,O,R)を算出した。
具体的には、測定値をMicrosoft(登録商標) Excelに入力し、MINVERSE関数、MMULT関数を用いて数1の関係式より各発光酵素のシグナル値を算出した。
Claims (2)
- イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される2以上のルシフェラーゼを発現する細胞培養液中のルシフェラーゼの発光量を測定するための方法であって、(a)細胞と、D−ルシフェリンと、アデノシン三リン酸と、マグネシウム塩と、及び界面活性剤として、細胞培養液と混合後、0.025〜0.25%のポリオキシエチレン(20)セチルエーテルとを混合する工程、(b)該混合液の発光を測定する工程、からなる方法。
- イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される2以上のルシフェラーゼを発現する細胞培養液中のルシフェラーゼの発光量を測定するための試薬であって、細胞と、D−ルシフェリンと、アデノシン三リン酸と、マグネシウム塩と、及び界面活性剤として、細胞培養液と混合後、0.025〜0.25%のポリオキシエチレン(20)セチルエーテルとを含む試薬。
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