CN101636504B - 利用分泌性荧光素酶的生物发光测定 - Google Patents

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Abstract

本文公开的是用于确定一种或多种荧光素酶的量或活性的方法和用于测量样品中由一种或多种荧光素酶产生的发光信号的方法，所述方法包括用待分析的荧光素酶的反应性底物和还原剂孵化所述样品以灭活第一荧光素酶，其中所述第一荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶。

Description

利用分泌性荧光素酶的生物发光测定
发明领域
本发明一般涉及用于荧光素酶催化的反应中的、且特别是用于基于荧光素酶的报道基因测定中的试剂和组合物。本发明还提供了尤其用于增加敏感性和/或改善荧光素酶催化反应的动力学的方法和组合物。
发明背景
报道基因测定(reporter gene assay)代表了基因表达研究中的重要手段，其允许理解何种因素在控制所感兴趣的基因的表达，这些因素诸如DNA序列、转录因子、RNA序列、RNA结合蛋白、信号转导途径和特定刺激。特别地，报道基因测定(reporter assay)可用于鉴定在基因调节中重要的核酸区域。这些区域可在人类疾病的治疗或预防中用作潜在的治疗介入靶。报道基因测定还可用于筛选具有修饰基因表达的能力的药物。
通常地，报道基因测定用于鉴定基因启动子区域或启动子内的特定元件，诸如转录因子结合位点或其他调控元件。可选择地，这些测定用来研究启动子或调控元件对各种刺激或试剂的反应。在一些应用中，测定中用到的报道基因构建体或转染细胞被引入到生物体中以研究体内启动子功能。进一步，报道基因测定可用于研究或测量特定启动子上游的信号转导途径。
举例来说，在经设计用来调查推定的启动子序列或其他转录调控元件的报道基因测定的情况中，待探询的核酸被定位克隆到报道基因质粒中以便对下游报道基因的转录进行调控，并由此表达报道基因所编码的报道蛋白(reporter protein)。报道蛋白应该可与存在于细胞中的内源性蛋白质区别开(在所述细胞中报道基因质粒被转染以便于检测)，且优选地报道蛋白的表达应可容易定量。报道蛋白在适宜的测定中被定量，并且通常相对于由普遍存在的启动子(如启动子SV40)驱使的对照报道基因的水平而被表达。对照报道基因必须可与测试报道基因区别开，并且通常被包含在独立载体上，所述独立载体与测试载体共转染并用于控制转染效率。这些测定以前提即细胞按比例吸收等量的两种载体为基础。
报道基因测定的多种不同应用包括测量基因表达随时间或在添加化合物、药物、配体、激素等之后的变化。这在药物筛选中具有特别的重要性。添加药物之后，当表达水平的变化通过mRNA传递到蛋白质时，检测可测量的报道蛋白水平的变化可被延缓并稀释。最近本申请人对这些应用所作出的显著改进是mRNA和蛋白质去稳定(destabilizing)元件在报道基因载体中的组合使用以改善响应的速度和量度，这在共同待决的第10/658,093号美国专利申请中描述，所述申请的公开内容通过引用并入本文。
利用不同的可检测报道蛋白，多种报道基因测定系统在商业上是可以获得的，其中最常用的报道蛋白是氯霉素转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、荧光蛋白和荧光素酶。
荧光素酶是最常用的体外测定系统的报道蛋白。荧光素酶是能生物发光且在多种生物体中天然存在的酶。在商业上可得的测定系统中，荧光素酶通常分为利用荧光素作为底物的那些荧光素酶和利用腔肠素(coelenterazine)作为底物的那些荧光素酶。前者应用最广泛的实例是一种细胞内酶——萤火虫荧光素酶。利用荧光素的荧光素酶的其他实例包括源自于鞘翅目(Coleoptera)如磕头虫(click beetle)和铁道蠕虫(railroad worm)以及双翅目(Diptera)(例如在WO 2007/019634中所公开)的那些荧光素酶。利用腔肠素的荧光素酶通常源自于海洋生物体如软珊瑚海肾(Renilla)或桡足类Gaussia。海肾荧光素酶是细胞内酶，而以其天然状态存在的Gaussia荧光素酶是分泌性酶。其他分泌性荧光素酶包括源自于Metridia longa、Vargulahilgendorfii、Oplophorus gracilirostris、Pleuromamma xiphias和长腹水蚤科(Metridinidae)的其他成员的那些荧光素酶。
基于荧光素酶的测定系统可使用多于一种的荧光素酶(通常具有不同的来源并且每一种荧光素酶利用不同的底物)，使测试报道基因和对照报道基因两者都在相同的测定中被测量。测量单个样品中多种荧光素酶发出的信号的能力提供了明显的好处，包括在单个实验中测量多个参数的能力。通常地，将两种不同的报道基因(编码的荧光素酶类型和控制每一种荧光素酶的表达的所感兴趣的调控元件两者不同)插入到单一的细胞系中。
举例来说，推定的启动子元件被克隆到萤火虫荧光素酶报道基因的上游以驱使其表达。这种质粒与含有受SV40启动子驱使的海肾荧光素酶基因的对照质粒一起被瞬时地转染到细胞系中。添加第一荧光素以活化萤火虫荧光素酶，测量这种报道基因的活性，然后添加“淬灭和活化”试剂。这种试剂包含“淬灭”荧光素信号的化合物并且还包含活化海肾荧光素酶的腔肠素，然后测量海肾荧光素酶的活性。Promega Dual-Glo荧光素酶测定是这种系统的一个实例。
萤火虫荧光素酶活性的水平不仅取决于启动子活性，而且还取决于转染效率。这变化很大，取决于DNA的量、DNA制备的质量和细胞的条件。共转染的对照质粒(受适宜的启动子如SV40启动子驱使的海肾荧光素酶)用于校正这些变量，以前提即海肾荧光素酶活性与被细胞吸收的萤火虫荧光素酶质粒的量成正比为基础。可选择地或此外，海肾荧光素酶可用于控制其他变量如细胞数目、细胞成活力和/或一般转录活性；或可用于确定应用至细胞的特定治疗或化合物是否影响两种启动子或者对两种启动子中的一种有特异性。
用于辨别单个样品中两种或更多种荧光素酶的信号的替代性方法由TOYO B-net的Multicolor-Luc测定来示例，所述测定利用三种不同的甲虫荧光素酶作用于相同的底物(荧光素)但是以不同的波长发光。然而，在这种情况下需要滤光器(filter)来分离不同的信号，并且这使得每一种荧光素酶可定量的信号减少。
期望使用双荧光素酶测定系统，所述双荧光素酶测定系统允许测试元件(例如启动子)与高敏感性荧光素酶系统连接，以使它在各种各样不同的应用中提供足够的信号强度，包括弱启动子的使用或转染细胞的困难。信号强度对于对照报道基因而言远非如此重要，因为：a)对照对于试验并非必不可少；和b)可有选择地选择强对照启动子诸如SV40、RSV、EF1α或CMV以确保产生足够信号。换句话说，仅产生弱信号的荧光素酶(每分子的荧光素酶蛋白或荧光素酶基因)可与强对照启动子有选择地组合以确保产生可检测的信号。就选择测试启动子而言，使用者不具有这种灵活性。
在此背景下，商业上可得的Dual-Glo荧光素酶测定(Promega)具有如下缺点：其对于对照报道基因利用敏感性较高的海肾荧光素酶而对于测试报道基因利用敏感性较低的萤火虫荧光素酶。进一步，所述系统需要首先测量萤火虫信号。
商业上可得的Multicolor-Luc测定系统(TOYO B-net)利用三种甲虫荧光素酶，它们具有比萤火虫荧光素酶甚至更低的敏感性。而且，不经使用滤光器测量单独的荧光素酶是不可能的，所述滤光器导致敏感性的进一步损耗。此外，最常用的发光计与需要辨别多波长的方案不相容。
基于荧光素酶的测定系统，特别是利用一种或多种细胞内荧光素酶的那些测定系统，通常使用两种缓冲液，即溶解缓冲液和测定缓冲液。首先将溶解缓冲液加至细胞以溶解细胞，并由此释放荧光素酶，促进随后的测量。然后加入含有荧光素酶底物和任何辅因子的测定缓冲液，之后，进行荧光素酶活性的测量。测量可在添加测定缓冲液的即刻(即几秒内)(所谓的“闪光(flash)”反应)，或在使用测定缓冲液中的“发光(glow)”试剂几分钟或几小时后(所谓的“发光”反应)进行，所述“发光”试剂保持光信号在一段延长的时间内稳定。闪光反应提供了最高的信号强度(光单位每秒)并由此具有提供最高敏感性的优点。发光反应在如下的应用中特别有利，例如使用者没有容易可得的适宜发光计(装备有注射器)，或者在一些高通量筛选应用中成批处理需要在注射与测量之间有一段延迟。鞘翅目荧光素酶的发光试剂可通过在试剂组合物中包含硫醇如CoA或DTT而制备(参见例如，US 5,650,289和US 5,641,641)。还表明DTT延长海肾荧光素酶的发光(US 6,171,809)。
有很多与用于荧光素酶报道基因测定的现有缓冲液和试剂有关的不足。
特别地，对试剂、反应组合物和试剂盒有需求，其中包括在荧光素酶反应中提供了改善的敏感性的多荧光素酶系统；即比用现有试剂可达到的强度更大的信号强度。当所测定的报道基因在感兴趣的细胞中仅提供了低水平的荧光素酶的时候(例如当正研究的启动子仅含有低活性时，和/或当所感兴趣的细胞难以用报道基因载体转染/转导(transduce)时)，这具有特定的关联性。增加的敏感性还将通过减少所需的最小细胞数来促进报道基因测定的微型化，从而获得能被可靠地测量的信号强度。
当利用包含去稳定元件的测定系统例如在共同待决的第10/658,093号美国专利申请中所述的那些测定系统时，稳态荧光素酶信号减少。因此，提供更高信号强度的试剂将对利用去稳定元件的报道基因测定系统特别有利。
同时在改善荧光素酶信号的信号强度或敏感性的背景下，具有减少的本底发光的测定试剂将通过增加信噪比来改善性能，假如(providing)本底的减少与真实的荧光素酶信号的减少无关。
用于在多孔板中定量生物发光的现有方法易遭受各孔之间漏光的问题的困扰。快速衰减的信号将使这种不需要的假象(artefact)降到最低，同时还能随后测量利用光发射或荧光作为读数的其他参数。用现有荧光素酶测定系统，一些光发射水平在测量后持续很长时间，甚至在使用所谓的‘闪光’试剂的情况下。这种信号没有用处，因为闪光反应的目的是测量注射测定缓冲液之后即时的光发射。此外，持续信号可妨碍发光或荧光的随后测量。在某些背景下，可加入淬灭试剂以终止荧光素酶信号。然而，不需要这种另外的移液步骤的自终止信号将提供更简单且更优选的系统。
现有荧光素酶测定的进一步局限性是可在单个样品中辨别且测量的不同荧光素酶的数目。如上所述，淬灭试剂和发射波长的差异已被用来分离由两种或三种不同的荧光素酶产生的信号。分离不同的荧光素酶信号的另外方法将使测定系统能测量四种或更多种不同的荧光素酶，因而能分析相同样品中四种或更多种不同的参数。为了能同时测量多种不同的荧光素酶，具有能支持不同荧光素酶的活性的试剂系统是有必要的。进一步，为了能连续活化和测定多种不同的荧光素酶，有必要拥有一套允许第一荧光素酶反应的终止而不妨碍随后的荧光素酶反应的试剂系统。
发明概述
本发明一般涉及用于确定样品中荧光素酶的量或活性的方法。本发明部分地基于发明人令人惊奇的发现，即硫醇和还原剂如DTT显著缩短以其天然形式分泌的荧光素酶产生的发光周期。此外，发明人已令人惊奇地确定这种天然分泌性荧光素酶被还原剂的灭活是时间依赖性的。灭活的延缓提供了用于在发光信号损耗前测量发光(例如在闪光反应中)的机会窗。因而，本发明的实施方案能对分泌性荧光素酶产生比现在使用的有效的荧光素酶测定方法和试剂组合物更高的敏感性(更强的闪光相和/或较低的本底信号)和更快的发光信号衰减率。
本发明因此还提供了在多荧光素酶(例如双荧光素酶和三荧光素酶)测定中测量发光的新方法。这些方法主要地应用于报道基因测定(genereporter assay)。然而，在其他领域中的应用也是清楚的。例如，荧光素酶可用于标记抗体(例如用于免疫细胞化学)或用于标记蛋白质(例如用于BRET测定)。实验地和选择性地开启和/或切断某些荧光素酶的能力能使多个不同的荧光素酶标记物用于单个样品中。在BRET测定的情况下，优选发射蓝光的荧光素酶，并且用它来激活非常接近的荧光蛋白的荧光。本发明提供了辨别或操纵由两种不同的发射蓝光的荧光素酶发光的方法，由此促进多BRET测定。
本发明的第一方面提供了用于测量样品中由一种或多种荧光素酶产生的发光信号的方法，所述方法包括用待分析的荧光素酶的反应性底物和还原剂孵化所述样品以灭活第一荧光素酶，其中所述第一荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶。
第一荧光素酶的灭活可包括抑制或消除荧光素酶的催化活性和/或将荧光素酶转化成无活性构象。
第一荧光素酶可以是以其天然形式分泌的荧光素酶的非分泌性修饰形式。第一荧光素酶可利用腔肠素作为底物。第一荧光素酶可利用腔肠素作为底物并且具有海洋来源。海洋来源的荧光素酶可源自于Gaussia属(Gaussia spp.)、乳点水蚤属(Pleuromamma spp.)、长腹水蚤属(Metridia spp.)、海莹属(Cypridina spp.)或Oplophorus属(Oplophorus spp.)，或者是其变体或衍生物。
所述还原剂可包括硫醇基团。所述还原剂可选自二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、β-巯基乙醇、半胱胺、亚硫酸钠和三(2-羧乙基)膦(TCEP)组成的组。所述还原剂可以是DTT。
在一个实施方案中，由第一荧光素酶产生的发光信号被测量。在这些实施方案中，(i)第一荧光素酶的反应性底物可与还原剂同时加入，(ii)可将第一荧光素酶的反应性底物加入所述样品中并且在加入还原剂之前测量由第一荧光素酶产生的发光信号，或(iii)可在第一荧光素酶的反应性底物之前将还原剂加入所述样品中，并在第一荧光素酶被还原剂灭活之前测量由第一荧光素酶产生的发光信号。
在一个实施方案中，所述荧光素酶中的至少一种由重组报道基因表达。发光信号可作为报道基因测定的一部分被测量。
所述样品可包括至少一种细胞内荧光素酶。在一个实施方案中，细胞内荧光素酶可源自于鞘翅目种或双翅目种。
当样品包括至少一种细胞内荧光素酶时，可在加入细胞内荧光素酶的反应性底物之前将还原剂加入样品中以便在测量由细胞内荧光素酶产生的发光信号之前灭活第一荧光素酶。细胞内荧光素酶可被还原剂活化。细胞内荧光素酶的光发射周期可被还原剂延长。第一荧光素酶和第二荧光素酶可利用相同或不同的底物。例如，第一荧光素酶可利用腔肠素作为底物而细胞内荧光素酶可利用荧光素作为底物，或者第一荧光素酶和细胞内荧光素酶两者都可利用腔肠素作为底物。
样品可包括两种或更多种细胞内荧光素酶。由两种或更多种细胞内荧光素酶产生的发光信号可以不同波长产生。
本发明的第二方面提供了用于测量样品中由荧光素酶产生的发光信号的方法，其中所述荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，所述方法包括：
(a)将所述样品与所述荧光素酶的反应性底物接触；
(b)将所述样品与时间依赖性地灭活所述荧光素酶的还原剂接触；和
(c)在所述荧光素酶被所述还原剂灭活之前测量由所述荧光素酶产生的发光信号。
所述荧光素酶可以是以其天然形式分泌的荧光素酶的非分泌性修饰形式。
所述样品可在所述还原剂之前与所述反应性底物接触，或同时与所述反应性底物和所述还原剂接触。
本发明的第三方面提供了用于测量样品中由荧光素酶产生的发光信号的方法，其中所述荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，所述方法包括：
(a)将所述样品与所述荧光素酶的反应性底物接触；
(b)测量由所述荧光素酶产生的发光信号；和
(c)随后将所述样品与时间依赖性地灭活所述荧光素酶的还原剂接触。
本发明的第四方面提供了用于测量样品中由荧光素酶产生的发光信号的方法，其中所述荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，所述方法包括：
(a)将所述样品与时间依赖性地灭活所述荧光素酶的还原剂接触；
(b)将所述样品与所述荧光素酶的反应性底物接触；和
(c)在所述荧光素酶被还原剂灭活之前测量由所述荧光素酶产生的发光信号。
本发明的第五方面提供了用于测量样品中由第一荧光素酶和第二荧光素酶产生的发光信号的方法，其中所述第一荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，而第二荧光素酶为细胞内荧光素酶，所述方法包括：
(a)将所述样品与第一荧光素酶的反应性底物接触；
(b)测量由第一荧光素酶产生的发光信号；
(c)将所述样品与时间依赖性地灭活第一荧光素酶的还原剂接触；
(d)将所述样品与第二荧光素酶的反应性底物接触；和
(e)测量由第二荧光素酶产生的发光信号。
步骤(d)和(e)可位于步骤(a)至(c)之前以便在测量由所述第一荧光素酶产生的发光信号之前测量由所述第二荧光素酶产生的发光信号。
步骤(b)可在步骤(a)和(c)后进行，以便所述样品在测量由第一荧光素酶产生的发光信号之前与所述还原剂接触。
所述样品可在第一荧光素酶的反应性底物之前或同时与所述还原剂接触。
本发明的第六方面提供了用于测量包括第一荧光素酶和第二荧光素酶的样品中由第二荧光素酶产生的发光信号的方法，其中所述第一荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，而第二荧光素酶为细胞内荧光素酶，所述方法包括如下步骤：
(a)将所述样品与时间依赖性地灭活第一荧光素酶的还原剂接触；
(b)将所述样品与第二荧光素酶的反应性底物接触；和
(c)测量由第二荧光素酶产生的发光信号。
所述样品可进一步包括第三荧光素酶。所述第三荧光素酶可以是细胞内荧光素酶。由第二荧光素酶和第三荧光素酶产生的发光信号可以不同的波长产生。第二荧光素酶可源自于鞘翅目种而所述第三荧光素酶源自于双翅目种。
本发明的第七方面提供了用于灭活荧光素酶的方法，所述荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，所述方法包括将含有荧光素酶的样品与还原剂接触。
所述荧光素酶可以是以其天然形式分泌的荧光素酶的非分泌性修饰形式。
所述荧光素酶的灭活可包括抑制或消除所述荧光素酶的催化活性和/或将所述荧光素酶转化成无活性构象。
本发明的第八方面提供了用于增加由荧光素酶产生的发光信号的衰减率的方法，所述荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，所述方法包括将含有荧光素酶的样品与还原剂接触。
本发明的第九方面提供了用于测量样品中由一种或多种荧光素酶产生的发光信号的方法，所述方法包括用待分析的荧光素酶的反应性底物和提供适于促进第一荧光素酶转化成无活性构象的环境的试剂组合物孵化所述样品，其中所述第一荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶。
本发明的第十方面提供了用于确定样品中两种或更多种荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：
(a)向所述样品中加入时间依赖性地灭活第一荧光素酶的有效量的还原剂；
(b)测量所述样品中的发光信号；
(c)等待一段时间以允许第一荧光素酶的发光信号衰减；
(d)测量所述样品中的发光信号；和
(e)根据(b)与(d)的结果和每一种发光信号不同的衰减率，计算每一种荧光素酶的发光信号。
本发明的第十一方面提供了用于确定样品中第一荧光素酶和第二荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与第一荧光素酶和第二荧光素酶的反应性底物和时间依赖性地灭活第一荧光素酶但不灭活第二荧光素酶的还原剂接触；
(b)在第一荧光素酶被还原剂灭活之前测量发光信号；
(c)在第一荧光素酶被灭活之后测量发光信号；和
(d)利用在(b)和(c)中收集的数据来计算每一种荧光素酶相对于彼此或相对于其他样品的量或活性。
本发明的第十二方面提供了用于确定样品中第一荧光素酶和第二荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与第一荧光素酶的反应性底物和时间依赖性地灭活第一荧光素酶但不灭活第二荧光素酶的还原剂接触；
(b)在第一荧光素酶被灭活之前测量发光信号；
(c)将所述样品与第二荧光素酶的反应性底物接触；
(d)在第一荧光素酶被灭活之后测量发光信号；和
(e)利用在(b)和(c)中收集的数据来计算每一种荧光素酶相对于彼此或相对于其他样品的量或活性。
本发明的第十三方面提供了用于确定样品中一种或多种荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括用待分析的荧光素酶的反应性底物和还原剂孵化所述样品以灭活第一荧光素酶，其中所述第一荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶。
依照本发明的各个方面和实施方案，所述样品可在测量发光信号之前经受细胞溶解步骤。所述样品可在加入荧光素酶底物之前经受细胞溶解步骤。所述样品可在加入还原剂之前经受细胞溶解步骤。所述还原剂可存在于细胞溶解缓冲液中。
依照本发明的各个方面和实施方案，所述发光信号可使用已培养了表达荧光素酶的细胞的条件培养基来测量。
本文还公开了用于确定样品中荧光素酶的量或活性的试剂组合物，其中所述试剂组合物允许产生增强的发光信号和/或增加的荧光素酶发光信号衰减率。通常地，在所述荧光素酶的存在下，所述试剂组合物提供了适于促进所述荧光素酶转化成无活性构象的环境。这种转化通常在一段时间范围内发生以使所述发光信号可在所述转化之前测量。通常这种转化在发光信号启动后约1秒或更多秒、约5秒或更多秒或者约10秒或更多秒变得明显。通常这种转化随时间进行。
本文还公开了用于确定样品中荧光素酶的量和/或活性的试剂组合物，其中在所述荧光素酶的存在下，所述试剂组合物提供了适于促进所述荧光素酶转化成无活性构象的氧化还原(redox)环境。通常由试剂组合物提供的环境促进活性荧光素酶更快速转化成无活性构象，或者采用或维持较小活性的构象。可选择地或此外，所述环境可通过增加采用无活性构象的荧光素酶的比例而减少样品中荧光素酶的整体活性。通常地，所述试剂组合物包括至少一种适宜的还原剂。通常这些试剂使得荧光素酶被还原，因此促进所述荧光素酶以时间依赖性的方式采用无活性构象。因此，有所述试剂的存在下的信号强度与没有所述试剂的存在下的信号强度的比率(+试剂/-试剂)通常随时间降低。例如，将试剂组合物与荧光素酶接触10分钟后所述比率比接触1秒后更低。
本文还公开了用于测定一种或多种荧光素酶的量和/或活性的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种试剂组合物，其中所述试剂组合物提供了适于促进所述荧光素酶中的至少一种转化成无活性构象的环境。
本文还公开了用于测定一种或多种荧光素酶的量和/或活性的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种试剂组合物，其中所述试剂组合物提供了适于促进所述荧光素酶中的至少一种解折叠成无活性构象的氧化还原环境。
本文还公开了用于确定样品中荧光素酶的量或活性的试剂组合物，所述试剂组合物包括至少一种还原剂。
本文还公开了用于确定样品中荧光素酶的量或活性的试剂组合物，所述试剂组合物包括至少一种还原剂或氧化剂和还原剂的组合。通常这些试剂使得荧光素酶被还原，因此促进所述荧光素酶采用无活性构象。
依照上述，所述试剂组合物可进一步包括一种或多种另外组分。这些另外组分可选自，例如二价金属螯合剂、抗氧化剂、蛋白酶抑制剂、盐、洗涤剂或另外的缓冲组分。所述二价金属螯合剂可选自例如EDTA、CDTA和EGTA。在一个实施方案中，所述二价金属螯合剂为EDTA，以约1mM和约15mM之间的浓度存在。所述试剂组合物可以是用于测量荧光素酶活性的测定试剂或缓冲液的形式。因此，所述测定缓冲液可进一步包括另外组分，例如缓冲剂。所述缓冲剂可以是例如Tris、Hepes或磷酸盐缓冲液。所述试剂组合物可进一步包括荧光素酶底物。所述底物可以是例如荧光素或腔肠素。在一个具体的实施方案中，所述底物为腔肠素或其衍生物。举例来说，所述腔肠素或其衍生物可以以多于约2μM、多于约5μM、多于约10μM、多于约15μM、多于约20μM或多于约25μM的浓度存在。
通常由荧光素酶产生的生物发光信号是短暂的并且在加入底物后约15分钟内衰减至接近本底水平。更通常地，所述信号在加入底物后约15分钟内、在加入底物后约10分钟内或在加入底物后约5分钟内，衰减至小于起始信号的约1％。通常生物发光信号在加入底物后几秒内迅速衰减，在加入底物后约60分钟内、在加入底物后约30分钟内、在加入底物后约15分钟内、在加入底物后约10分钟内或在加入底物后约5分钟内，降至小于起始信号的约0.1％的水平。
本文还公开了用于确定样品中荧光素酶的量或活性的试剂组合物，其中所述试剂组合物包括DTT和腔肠素，其中所述荧光素酶利用腔肠素作为底物。
本文还公开了用于确定样品中荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：(a)根据第一、第二、第五、第六或第七方面，向所述样品加入有效量的试剂组合物；和(b)检测所述样品的生物发光。
本文还公开了用于减少本底信号或增加荧光素酶反应的信噪比的方法，所述方法包括将所述荧光素酶与有效量的试剂组合物接触，其中所述试剂组合物包括荧光素酶的底物和适宜的氧化还原环境。通常地，所述试剂组合物包括至少一种还原剂或氧化剂和还原剂的组合。
本文还公开了增加由荧光素酶产生的生物发光信号的衰减率的方法，所述方法包括将所述荧光素酶与有效量的试剂组合物接触，其中所述试剂组合物提供了适于促进所述荧光素酶转化成无活性构象的氧化还原环境。
本文还公开了用于确定样品中荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：(a)提供表达荧光素酶的细胞；(b)加入试剂组合物，所述试剂组合物包括荧光素酶的底物且适于促进所述荧光素酶转化成无活性状态或构象；和(c)检测由所述活性荧光素酶产生的生物发光信号。
本文还公开了用于确定样品中两种荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：
(a)根据第八或第十方面确定第一荧光素酶的量或活性；(b)等待一段时间以允许第一荧光素酶的发光信号明显衰减；(c)加入第二荧光素酶的第二底物；和(d)测量由第二荧光素酶产生的发光信号。
上述方法还用于确定样品中多于两种荧光素酶的量或活性，所述方法对于每种另外荧光素酶包括步骤(c)和(d)或单独的步骤(d)的重复。
本文还公开了用于确定样品中两种荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：(a)向所述样品加入有效量的试剂组合物，所述组合物适于产生两种荧光素酶的发光信号但是每一种荧光素酶的发光信号的衰减率不同；(b)测量样品中的发光信号；(c)等待一段时间以允许第一荧光素酶的发光信号衰减；(d)测量样品中的发光信号；和(e)根据(b)与(d)的结果和每一种发光信号不同的衰减率，计算每一种荧光素酶的发光信号。
本文还公开了用于确定样品中荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括(a)将所述样品与试剂组合物接触，所述试剂组合物包括所述荧光素酶的反应性底物和时间依赖性地减少或灭活所述荧光素酶的催化活性的试剂；和(b)在所述荧光素酶的催化活性被所述试剂减少或灭活之前测量发光信号。
本文还公开了用于确定样品中第一荧光素酶和第二荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括(a)将所述样品与第一试剂组合物接触，所述第一试剂组合物包括第一荧光素酶和第二荧光素酶的底物和时间依赖性地减少或灭活第一荧光素酶的催化活性但不减少或灭活第二荧光素酶的催化活性的试剂；(b)在第一荧光素酶的催化活性被所述试剂减少或灭活之前测量发光信号；(c)在第一荧光素酶的催化活性被所述试剂减少或灭活之后测量发光信号；和(d)利用在(b)和(c)中收集的数据来计算每一种荧光素酶相对于彼此或相对于其他样品的量或活性。
本文还公开了用于确定样品中第一荧光素酶和第二荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括(a)将所述样品与第一试剂组合物接触，所述第一试剂组合物包括第一荧光素酶的底物和时间依赖性地减少或灭活第一荧光素酶的催化活性但不减少或灭活第二荧光素酶的催化活性的试剂；(b)在第一荧光素酶的催化活性被所述试剂减少或灭活之前测量发光信号；(c)将所述样品与第二试剂组合物接触，所述第二试剂组合物包括第二荧光素酶的底物；(d)在第一荧光素酶的催化活性被所述试剂减少或灭活之后测量发光信号；和(e)利用在(b)和(c)中收集的数据来计算每一种荧光素酶相对于彼此或相对于其他样品的量或活性。
附图简述
仅举例来说，现在参考附图来描述本发明的实施方案。
图1显示了在存在不同浓度的三种不同还原剂下，非分泌性Gaussia荧光素酶随时间的以相对光单位(RLU)表示的生物发光动力学。
图2显示了在存在不同浓度的DTT下，非分泌性Gaussia荧光素酶随时间的以相对光单位(RLU)表示的生物发光动力学。提供两个时间过程内的数据，即一直到180秒(A)和一直到33分钟(B)。
图3显示了DTT(50mM)对分泌性和非分泌性Gaussia荧光素酶的生物发光信号的作用。
图4显示了在存在50mM DTT下，海肾荧光素酶随时间的以相对光单位(RLU)表示的生物发光动力学。
图5显示了在存在不同浓度的DTT下，(A)非分泌性Gaussia荧光素酶、(B)分泌性Gaussia荧光素酶、(C)非分泌性长腹水蚤荧光素酶和(D)分泌性长腹水蚤荧光素酶随时间的以每秒计数(CPS)表示的光发射。数据一直提供到120分钟。
图6显示了在存在不同浓度的还原剂下，(A至C)非分泌性长腹水蚤荧光素酶和(D至G)非分泌性Gaussia荧光素酶随时间的以每秒计数(CPS)表示的光发射：(A和D)用二硫赤藓糖醇(DTE)；(B)用亚硫酸钠；(C和E)用半胱胺；(F)用TCEP；和(G)用β-巯基乙醇。数据一直提供到120分钟(A至C)和一直提供到50分钟(D至G)。
图7显示了当在先前启动的反应的发光阶段中加入DTT时，DTT对非分泌性Gaussia荧光素酶的生物发光信号的作用。
图8显示了双荧光素酶测定在表达非分泌性Gaussia荧光素酶和萤火虫荧光素酶的细胞中的生物发光(RLU)。LB＝在加入Gaussia荧光素酶测定缓冲液前立即测量的信号；Ga＝在加入Gaussia荧光素酶测定缓冲液后立即测量的信号；15’＝在加入Gaussia荧光素酶测定缓冲液后15分钟测量的信号(恰好在加入萤火虫测定缓冲液之前)；FF＝在加入萤火虫荧光素酶测定缓冲液后1秒测量的信号。
图9显示了在存在肿瘤坏死因子(TNF)或毛喉素(forskolin)下，细胞的荧光素酶活性(RLU)，所述细胞或者表达由环AMP反应性元件(CRE-FF)控制的去稳定的萤火虫荧光素酶，或者表达受多个串联NFkB-结合位点(NFkB-Ga)驱使的去稳定的细胞内Gaussia荧光素酶，又或者两者都表达。(A)：在存在Gaussia测定缓冲液下的荧光素酶活性。(B)：在存在萤火虫测定缓冲液下的荧光素酶活性。
图10A显示了包含非分泌性Gaussia荧光素酶(Ga)、海肾荧光素酶(Rn)或于混合型溶解产物中的两种荧光素酶(Ga&Rn)的细胞溶解产物在0秒(t＝0)和1200秒(t＝1200)的荧光素酶活性(RLU)。图10B显示了如实施例10中所述确定的，来自图10A的非分泌性Gaussia荧光素酶的测量(计算的)活性和预期活性的比较。
图11显示了条件培养基中的和表达CMV驱使的Gaussia荧光素酶(Ga或CMV-Gaussia)和TRE驱使的非分泌性海肾荧光素酶(Rn或TRE-海肾)的细胞的细胞溶解产物中的荧光素酶活性(RLU)。(A和C)使用不含DTT的溶解缓冲液，(B和D)使用含有DTT的溶解缓冲液。图11A和11B显示了不经多西环素处理的单个时间点的数据，而图11C和11D显示了所有时间点的数据，所述时间点的数据被表示为相对于-多西环素的+多西环素。
图12显示了不同浓度的DTT对本底发光信号(A)和(B)和非分泌性Gaussia荧光素酶的闪光强度(C)的作用。
图13显示了在存在或缺少还原剂DTT、TCEP或β-巯基乙醇(b-ME)下，由非分泌性Gaussia荧光素酶在制备了22小时的测定缓冲液中产生的生物发光信号强度(RLU)，相对于其在新鲜的测定缓冲液中的信号强度的百分比。
图14显示了在存在不同比率的氧化型对还原型谷胱甘肽下，非分泌性Gaussia荧光素酶在新鲜的测定缓冲液(AB)和使用前贮存了4小时的测定缓冲液(4小时AB)中的细胞溶解产物的发光(RLU)。
图15显示了在存在不同浓度的比率为3∶2的还原型对氧化型谷胱甘肽下，在新鲜测定缓冲液、使用前在室温(RT)贮存7小时的测定缓冲液或使用前在4℃贮存22小时的测定缓冲液中的非分泌性Gaussia荧光素酶的细胞溶解产物的活性(RLU)。
发明详述
遍及本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有需要，应理解词语“包括(comprise)”及其变化如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”表示包含所述整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。
冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文是用来指一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。举例来说，“一个元件”表示一个元件或多于一个元件。
如本文所用，在使荧光素酶从一种构象转化成另一种构象的情况下，术语“促进”表示试剂实现、产生、允许或加速这种转化。因而，促进荧光素酶转化成无活性构象可以是被动的或主动的，和直接的或间接的。例如，所述试剂可提供其中可以发生荧光素酶向无活性构象转化的适宜环境。可选择地，所述试剂可直接或间接促进或者以其他方式生成或产生这种转化。“促进”荧光素酶转化的试剂通常是这样一种试剂，它提供了相比于在缺少此试剂下观察到的转化更有效的转化。
如本文所用，术语“转化”是指荧光素酶在实现活性/无活性状态或构象中的折叠/解折叠或其他修饰。进一步提及的将荧光素酶转化成无活性构象表示从活性状态或构象至无活性状态或构象的转化，或者从部分活性或更多活性状态或构象至更少活性状态或构象的转化。关于这点，术语“构象”在其范围内包括所述酶采用的结构(例如三级或四级)，且所述结构与所述酶催化反应因而在加入底物后产生生物发光信号的能力相关。
在荧光素酶的生物发光信号强度的情况下，如本文所用的术语“增强的”表示相对于在缺少试剂或试剂组合物下和/或在存在现有技术的组合物下所实现的而言，定性地或定量地增强的或增加的信号强度或信噪比。同样地，术语“增加的衰减率”用来表示相对于在缺少试剂或试剂组合物下和/或在存在现有技术的组合物下所实现的而言，增加的生物发光信号的衰减率。
如本文所用，术语“有效量”在其含义内包括提供了预期效应的试剂组合物的足够量。所需精确量将根据因素诸如待分析的样品的性质、所用的荧光素酶以及所述荧光素酶是细胞内的还是分泌性的、所用的试剂或组合物的组成，从一例至一例变化。因而，规定精确的“有效量”是不可能的。然而，对于任何给定的例子，适宜的“有效量”可通过本领域普通技术人员仅使用常规的实验来确定。
如本文所用，术语“非分泌性荧光素酶”表示不从细胞输出或分泌至细胞外环境的荧光素酶。因而，“非分泌性”包括在细胞中以任何形式保留的荧光素酶，因而荧光素酶可以是细胞质的或膜相关的。通常地，尽管并非完全，当荧光素酶在本文被称为以其天然形式分泌的荧光素酶的“非分泌性”形式时，这种分泌和分泌的缺乏是指真核细胞。
如本文所用，术语“分泌性荧光素酶”是指以其天然形式存在的由细胞分泌的荧光素酶，它在所述细胞中被正常表达进入细胞外位置。所述细胞外位置对于生物体来说可以是内部或外部的，这取决于生物体的身份。细胞外位置在其范围内包括正在体外培养表达所述荧光素酶的细胞的培养基。它还可包括表达所述荧光素酶的生物体通常所居留的水生或海洋环境。还应注意到，术语“分泌性荧光素酶”包括如本文所述的其各种修饰形式和重组形式，其中这些重组形式或修饰形式可以分泌也可以不分泌。因而，术语“分泌性荧光素酶”在其范围内包括分泌性荧光素酶的“非分泌性”形式。
如本文所用，术语“细胞内荧光素酶”是指在表达后且以其天然形式存在的荧光素酶保留在细胞或细胞膜内，而不是分泌到细胞外的培养基中。应注意到，术语“细胞内荧光素酶”包括如本文所述的其各种修饰形式和重组形式，其中这些重组形式或修饰形式可以保持也可以不保持在细胞内。因而，术语“细胞内荧光素酶”在其范围内包括细胞内荧光素酶的输出或分泌的形式。
因而，如本文所用，术语“非分泌性”和“细胞内”具有不同的含义。“非分泌性”荧光素酶可以是以其天然形式分泌的荧光素酶的修饰形式，而“细胞内”荧光素酶是以其天然形式存在于细胞内(非分泌的)的荧光素酶。
如本文所用，术语“灭活(inactivate)”、“灭活(inactivation)”及如本文所用的其变化表示在荧光素酶被还原剂灭活的情况下，减少或消除由所产生的发光信号的量所确定的荧光素酶的催化活性。因而，由于可产生活性的100％减少，灭活可以是完全的，但是情况不必总是如此。部分灭活以致某些残留活性被保留也是可以预期的。
如本文所用，关于荧光素酶，术语“底物”表示荧光素酶作用于的反应性底物分子，所述反应性底物分子不包括对荧光素酶与底物的结合和/或催化有益的或者必需的任何其他辅因子。例如，荧光素酶催化的反应可需要或受益于辅因子，诸如镁、CoA和ATP，然而在本发明的情况下，认为这些辅因子不包括在术语“底物”的范围内。荧光素酶“底物”包括例如D-荧光素和腔肠素。对于本申请的目的，术语“荧光素”是指底物D-荧光素及其类似物，其分子是源自于例如鞘翅目如萤火虫、磕头虫和铁道蠕虫的荧光素酶的底物。在本发明的情况下，术语荧光素不包括腔肠素，它代表被不同的荧光素酶种类(例如，诸如源自于海肾、Gaussia和长腹水蚤的那些)利用的不同荧光素酶底物。
如本文所用，术语“样品”表示任何样品，包括但不限于细胞、生物体、溶解的细胞、细胞或生物体的提取液或组分、细胞外液和培养细胞的培养基，其中所述样品包含荧光素酶或疑似包含荧光素酶。
如本文所公开，本发明人首次描述了还原剂对以其天然形式分泌的荧光素酶的活性的影响。确实，与对细胞内荧光素酶诸如海肾源和鞘翅目源荧光素酶(其中发光反应在DTT的存在下延长)观察到的影响相反，本发明人已令人惊奇地确定，还原剂如DTT对以其天然形式分泌的荧光素酶有相反的影响。也就是说，还原剂显著缩短了以其天然状态分泌的荧光素酶产生的发光周期。此外，本发明人已令人惊奇地确定，天然分泌性荧光素酶被还原剂灭活不立即发生，而是时间依赖性的。
不希望受理论的限制，本文假定，尽管细胞内荧光素酶非常适于还原性的环境并且就发光的持续时间而言受益于还原剂，但是天然分泌性荧光素酶适于更氧化性的环境并且被还原剂灭活，这些还原剂改变蛋白质构象和/或断裂关键的二硫键因而还原或消除催化活性。重要的是，这种转化不在试剂与荧光素酶结合之后立即开始，以致于不阻碍闪光测量。构象的变化可包括蛋白质折叠的变化和/或荧光素酶的氧化还原状态的变化。进一步，构象变化可包括荧光素酶蛋白中一个或多个二硫桥的破坏。在许多环境中可期望或需要荧光素酶的状态或构象的变化。这些环境包括，例如多荧光素酶测定的使用，在测量后持续存在的以致于样品可用于利用发光或荧光作为读数的其它(非荧光素酶)测定的不必要信号的去除，或者只是从先前测量孔到当前测量孔发生的漏光的减少。
本发明的实施方案发现任何基于荧光素酶的反应中的应用，其中确定或定量荧光素酶的量和/或活性是令人期望的。例如，本发明的实施方案特别但不限于应用于利用去稳定元件的报道基因测定系统，以致于提供除高信号强度之外的快速反应。虽然在本发明的实施方案中，可能已知待分析的样品表达给定的荧光素酶，诸如以其天然形式存在的为分泌性荧光素酶的荧光素酶，但情况不必总是如此。例如，本领域技术人员将理解，可能不知道给定的样品包含提及的荧光素酶。例如，可能已知细胞具有包括编码荧光素酶的多核苷酸的表达构建体(并且可能已被所述表达构建体转化)，可选择地与启动子、增强子或其他调节序列可操作地连接，但是荧光素酶被表达可能是不被知道的。因此在本发明的范围内包括待分析的样品疑似表达特定的荧光素酶的实施方案。
除本文所述的报道基因表达测定之外，本发明的实施方案还发现了在其它测定系统中的应用，其中一种或多种荧光素酶的量和/或活性将被确定。例如，荧光素酶可用作免疫测定的报道基因或用作杂交测定的标记物，因而可与例如抗体或核酸探针相连。因而荧光素酶可用作报道基因或可检测的标记物。
如本文所公开，已发现在还原剂的存在下，在加入底物之后前几秒内，由天然分泌性荧光素酶产生的非常高的生物发光信号强度可与生物发光信号的非常快速衰减联系起来。所述还原剂可单独加入或者可以是试剂组合物的组分，所述试剂组合物例如如下所述的测定缓冲液(例如与荧光素酶底物一起)或细胞溶解缓冲液。
因此，依照本发明的实施方案使用的试剂组合物可包括至少一种还原剂，通常是基于硫醇的还原剂。
从广义上说，氧化-还原(氧化还原)反应的特征在于氧化数的变化，通常通过电子的转移而实现。术语“氧化”通常是指氧化态或氧化数的增加(失去电子)。而术语“还原”是指氧化态或氧化数的减少(得到电子)。“氧化剂”有时被称为电子受体，而“还原剂”有时被称为电子供体。还原可用许多方法来表征。除“氧化数的减少”或“得到电子”之外，还原通常还可被认为是“氢的增加”。例如，双键当被还原时，得到两个氢；酮或醛在分别被还原成伯醇或仲醇时，得到一个氢；二硫键在被还原成两个硫醇时，得到两个氢。具有氧化其他物质的能力的物质据说是“氧化性的”并且被称作“氧化剂(oxidising agent)”、“氧化剂(oxidant)”或“氧化剂(oxidiser)”。具有还原其他物质的能力的物质据说是“还原性的”并且被称作“还原剂(reducing agent)”、“还原剂(reductant)”或“还原剂(reducer)”。通常在氧化还原过程中，还原剂(reductant)或还原剂(reducing agent)失去电子并被氧化，而氧化剂(oxidant)或氧化剂(oxidising agent)得到电子并被还原。一种或多种还原剂可存在于试剂组合物中或在使用试剂的相应的反应混合物中，以便于在所述试剂或反应混合物中提供全面的“还原”或“还原性”环境。
所述还原剂可加速荧光素酶的还原，因而加速或者以其他方式促进荧光素酶从更多活性的构象或形式向更少活性的构象或形式的转换。
本领域技术人员将理解，多种还原剂适于本发明的目的，并且包含于本文中。例如，所述还原剂可以是有助于在试剂组合物中产生电化学电势以致于将二硫键还原成硫醇，并由此使荧光素酶蛋白变性的二硫键转化剂。举例来说，所述还原剂可以是能直接或间接还原荧光素酶蛋白中的二硫键的试剂。例如，已知作为氧化还原缓冲液的还原组分的硫醇影响与蛋白质折叠和变性有关的硫醇-二硫化物互换反应的速率。
描述硫醇还原的一般反应式在反应式1.0中示出：
R-S-S-R1+2H++2e-→R-SH+R1-SH    1.0
适宜的还原剂实例包括但不限于：二硫苏糖醇(DTT)；二硫赤藓糖醇(DTE)；三(2-羧乙基)膦(TCEP)；硫基乙醇酸盐；硫基乙醇酸钠；丙酮酸盐；半胱氨酸；硫化钠；硫化氢；连二硫酸盐；氢+铂催化剂；β-巯基乙醇；β-巯基乙胺；巯基乙酸；二氧化硫脲；N-乙基马来酰亚胺；和抗坏血酸盐。在一些实施方案中，所述还原剂可被固定在固体载体上，例如聚合物载体。固定性还原试剂的一个实例为固定性TCEP二硫化物还原凝胶。TCEP为非硫醇衍生物还原剂的一个实例[Willis，M.，S.，Protein Science，2005，14，1818-1826]。
所述还原剂通常以至少约500μM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、50mM、75mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、400mM或500mM的浓度存在。
依照本发明使用的试剂组合物还可包括本领域技术人员将容易理解并确定的很多的另外组分。这些另外组分的身份将主要依赖于在测定中所用的荧光素酶和测定的环境与目的。本发明试剂组合物中的这种典型的另外组分之一是荧光素酶的底物。仅举例来说，试剂组合物可进一步包括适于或有益于荧光素酶催化的反应和/或表达荧光素酶的细胞的溶解的组分。例如，所述组合物可包括一种或多种二价金属螯合剂(诸如EDTA、CDTA或EGTA)、抗氧化剂(诸如抗坏血酸)、蛋白酶抑制剂(诸如草酸)、盐、洗涤剂(通常是非离子型的)或另外常用的缓冲液组分如HEPES、Tris、BSA和/或甘油。此外，本发明的试剂组合物可具有至少约7、通常约7和约9之间的pH。就待加入的另外组分而言，确定在任何具体环境中即将使用的试剂组合物的精确组分是在本领域技术人员的能力之内的。
如本文示例，各种修饰的荧光素酶测定缓冲液组合物(例如包括还原剂)在与修饰的细胞内Gaussia荧光素酶或标准分泌性Gaussia荧光素酶一起使用时，提供了非常高的起始信号强度，随后是发光向本底水平的非常快速的衰减。鉴于与所报道的DTT对细胞内荧光素酶如萤火虫和海肾荧光素酶的影响相矛盾(的确相反)，还原剂的引入缩短分泌性荧光素酶的发光周期的事实尤其令人惊奇。
本文所公开的是利用还原剂对分泌性荧光素酶的这种意外作用的方法，并且真正地是利用这些试剂对不同优势荧光素酶的差别作用的方法。特别地，本发明人的发现已导致进行多荧光素酶测定的新方法的开发。根据现有技术，由不同荧光素酶产生的信号已通过使用淬灭试剂或根据发射波长的差异被辨别。本发明首次描述了荧光素酶信号还可在时间基础上即基于它们光发射的动力学的差别来辨别。不希望受理论的限制，在本文示例的数据指出，不同于细胞质荧光素酶，分泌性荧光素酶需要折叠以便于采用它们的活性构象。虽然暴露于还原剂如DTT减少或消除了分泌性荧光素酶的活性，但是灭活过程需要超过几秒钟，而且这在它开始失活之前产生用于测量荧光素酶的活性的机会窗。令人惊讶的是，如本文示例，包含至多50mM的DTT不会引起起始信号强度的任何减少，尽管它能在约5至15分钟内显著地或完全灭活荧光素酶。
由本发明试剂组合物提供的另外优势包括本底发光的减少(实际上更高的信噪比)和延长的测定试剂有效期(shelf life)。(现有技术的测定缓冲液在加入底物后具有有限的有效期，大概是由于自氧化。)
因而，本发明的方法提供了连同短的信号持续时间的更高的检测灵敏度。这表明了以其野生型状态分泌的荧光素酶的情况，无论它们以野生型分泌性形式利用或被修饰成非分泌性。相同的试剂(还原剂)提供了细胞内荧光素酶(如海肾荧光素酶)的更长的信号持续时间，这呈现了根据它们光发射动力学的差别而使用这些试剂来更好地辨别荧光素酶信号的机会。
依照本发明使用的试剂组合物可进一步包括一种或多种螯合剂。适宜的螯合剂包括但不限于二价金属螯合剂，诸如例如EDTA、CDTA和EGTA。所述螯合剂可以以约1mM和约15mM之间的浓度存在。
本领域技术人员将理解，当示例性范围或组分在本文提供时，这些不是详尽的而是仅仅说明性的范围和组分，所述范围和组分可包括在本发明组合物中以实现荧光素酶蛋白的解折叠、增强的生物发光信号强度、减少的本底信号、延长的试剂有效期和/或生物发光信号的缩短。
使用本发明的方法，由荧光素酶产生的生物发光信号可限于在加入荧光素酶底物后约一秒内开始的短时期。例如，所述生物发光信号可限于在加入底物后少于约30分钟或少于约15分钟。进一步，仅举例来说，由荧光素酶产生的生物发光信号可以是在荧光素酶催化的反应的启动后5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟或30分钟的生物发光信号，所述生物发光信号在少于起始信号的约1％和少于起始信号的0.1％之间。
荧光素酶底物和还原剂可以是相同试剂组合物的组分，或可以是单独的(包括单独试剂组合物的组分)以便它们可以被独立地加入。当荧光素酶底物和还原剂不是相同试剂组合物的组分时，可在加入还原剂之前、之后或同时将底物加入到包含荧光素酶的样品中。在一个实施方案中，所述底物为腔肠素或其衍生物。举例来说，所述腔肠素或其衍生物可以以多于约5μM、多于约10μM、多于约15μM、多于约20μM或多于约25μM的浓度存在。适宜的腔肠素衍生物对本领域技术人员来说是众所周知的，并且包括但不限于m-、v-、e-和f-腔肠素。
通常基于荧光素酶的报道基因测定系统使用两种缓冲液：溶解缓冲液和测定缓冲液(在本文共同地被称为“测定试剂”)。溶解缓冲液通常包括用于溶解包含待测定的荧光素酶的细胞的组分，而测定缓冲液通常尤其包含荧光素酶反应的底物和任何所需辅因子。
依照本发明的方法使用的还原剂可以是荧光素酶测定缓冲液的组分。有利地，依照本发明，当与以野生型或天然状态分泌的荧光素酶结合使用时，测定缓冲液有效地提供了更短的光发射周期。可选择地，依照本发明的方法使用的还原剂可以是细胞溶解缓冲液的组分。举例来说，将还原剂并入到细胞溶解缓冲液中可能是有利的，其中方法包括测量由细胞表达的两种或更多种荧光素酶，其中一种荧光素酶为分泌性的而另一种为细胞内的。分泌性荧光素酶活性可在条件培养基的样品中正常测量，那些细胞随后溶解于包括还原剂的试剂中，然后测量细胞内荧光素酶的活性。本发明人已发现大部分的分泌性荧光素酶可在任何给定的时间点是在细胞内的(在迁移至细胞膜以便于分泌之前，可能在内质网中)。这妨碍了真实的细胞内荧光素酶的测量，因为细胞溶解产物包含分泌性和非分泌性荧光素酶的混合物。通过使用含有还原剂的溶解缓冲液，位于细胞内的分泌性荧光素酶被灭活以致于随后测量的所有光发射被认为是仅源自于真实的细胞内荧光素酶。
可选择地，还原剂可以是混合的溶解和测定缓冲液的组分以使得只需要单一缓冲液组合物来溶解细胞(可能正好在培养细胞的培养基中)，并且启动荧光素酶催化的反应。本领域技术人员还应理解，当使用分泌性荧光素酶时，溶解表达荧光素酶的细胞可能是不必要的。相反，包含还原剂的测定缓冲液可被直接加入到培养细胞的培养基中，以便启动荧光素酶催化的反应。
依照本发明使用的试剂组合物可通常是水溶液，或可选择地可以是固体或干的形式如冻干的。不论含水还是冻干的，本发明的试剂组合物可以被提供，或者是包括所有预混合的组分，或者作为使用之前混合的组分的组合。所述试剂组合物可直接用于确定荧光素酶的量和/或活性的测定系统，或可被重建、溶解、稀释或另外用化学或物理方法处理以使所述组合物能执行所需的功能。
依照本发明使用的本发明的方法和试剂组合物适用于确定样品中任何荧光素酶的量和/或活性。所述荧光素酶可以是天然存在的酶或修饰的或重组的酶。天然存在的荧光素酶可源自于许多生物发光生物体的任何一种，通常源自于其发光器官。这些生物体包括但不限于生物发光细菌、原生动物、腔肠动物、软体动物、鱼、蝇(fly)、甲壳动物和甲虫。照惯例，荧光素酶可根据酶所利用的底物来分类。一组荧光素酶(如萤火虫和磕头虫的那些)利用荧光素。第二组荧光素酶(诸如海洋生物体海肾、Gaussia和乳点水蚤的那些)利用腔肠素。Vargula荧光素酶利用不同的底物。本发明的试剂组合物适于与使用荧光素或腔肠素作为底物的荧光素酶一起使用。
所述方法和试剂组合物同样地适于与细胞内或分泌性荧光素酶一起使用。萤火虫和海肾荧光素酶是以其天然状态存在于细胞内的，而Gaussia荧光素酶以其野生型状态分泌。Gaussia荧光素酶受到特别的关注，原因是已经显示它产生的生物发光信号强度比用海肾荧光素酶可获得的更高，并且它为最小的已知荧光素酶。还已显示其他分泌性荧光素酶产生强信号强度，例如Metridia longa荧光素酶。通常地，本发明的试剂组合物与至少一种分泌性荧光素酶结合使用。在一些实施方案中，本发明的试剂组合物与至少一种分泌性荧光素酶和至少一种非分泌性荧光素酶结合使用。
适宜的荧光素酶可被本领域技术人员使用已知技术容易地获得。荧光素酶可直接地从生物发光生物体的光器官中获得。可选择地，荧光素酶可从培养细胞中得到，例如细菌、酵母、昆虫细胞或已用编码荧光素酶的核酸转化的哺乳动物细胞。
荧光素酶可以是重组酶，诸如天然存在的荧光素酶的变体或衍生物。举例来说，可使用标准分子生物学技术来修饰天然分泌性荧光素酶，所述技术通过去除信号序列和/或与细胞内多肽融合使所述酶不再被分泌而是保持在细胞内。可选择地或此外，可作出本领域技术人员所众所周知的许多其他修饰，例如，改变荧光素酶多肽序列中的一种或多种氨基酸以调控酶在所选的细胞培养系统中的表达和/或溶解度。这些调控可以是表达和/或溶解度的增加或减少，取决于将使用荧光素酶和本发明的试剂组合物的特定应用的需要。例如，通过引入一种或多种去稳定的元件使蛋白质去稳定而修饰荧光素酶可以是令人期望的。包含去稳定元件的荧光素酶具有缩短的半衰期，并以比不含这些元件的荧光素酶更低的稳态水平表达。适宜的蛋白质去稳定元件包括PEST序列(富含氨基酸脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的氨基酸序列)、编码细胞内蛋白降解信号或降解决定子的序列以及泛素。用本发明实施方案获得的增强的敏感性特别有利于与去稳定的荧光素酶一起使用，在这些荧光素酶具有较低的稳态表达水平的情况下。本文涵盖使蛋白质去稳定的任何适宜方法。适宜方法在例如共同待决的第US 10/658,093号美国专利申请中描述(其公开内容以其整体通过引用并入本文)。例如，也可通过加入序列如聚腺苷酸尾、转录的或翻译的增强子和/或在编码特定表达系统的多核苷酸序列中改造(adapting)密码子使用，来修饰荧光素酶的表达。例如，为了优化荧光素酶在昆虫细胞或人类细胞中的表达，可分别优化对于昆虫或人类细胞的荧光素酶多核苷酸的密码子使用。密码子使用改造(adaptation)的方法和针对不同种的优化对本领域技术人员来说是众所周知的。
可对荧光素酶多肽或多核苷酸序列作出的进一步修饰对本领域技术人员来说也是众所周知的。例如，限制酶切割位点可引入到多核苷酸中，或者荧光素酶多肽可与不同功能的第二多肽如可选标志物(例如抗生素抗性)融合或缀合。
使用众所周知的技术如计算机建模，本领域技术人员可容易预测依照本发明特别易于使用的那些荧光素酶，还可以预测可对分泌性荧光素酶作出的使其转化为非分泌性的修饰。例如，以其天然形式分泌的荧光素酶通常包括在蛋白质的成熟活性构象中形成二硫桥的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基可以在氨基酸序列中以重复的间隔模式排列，使得可预测它们形成分子内的二硫键。这些荧光素酶在细胞内表达时，通常显示减少的活性。因而，本领域技术人员将理解，共享天然分泌性荧光素酶的这些特征中的一种或多种的同源荧光素酶特别适于依照本发明使用。
当在体外报道基因测定中使用分泌性荧光素酶时，通常取细胞培养基的样品而不是细胞溶解产物用于测量荧光素酶活性。在有利于某些应用(例如相同细胞的重复测量)的同时，分泌性荧光素酶并不适于其他应用。特别地，分泌性荧光素酶可在细胞培养基中蓄积以致于不可精确地监控基因表达的快速变化。突变体、这些荧光素酶的非分泌性形式(优选含有去稳定的元件)克服了这种局限性。本文所述的一种具体的修饰的荧光素酶是修饰的Gaussia荧光素酶，在所述Gaussia荧光素酶中14个氨基酸N-末端信号肽被删除，因而产生非分泌性荧光素酶。本文所述的第二种修饰的荧光素酶为修饰的长腹水蚤荧光素酶，在所述长腹水蚤荧光素酶中17个氨基酸N-末端信号肽被删除，因而产生非分泌性荧光素酶。同样地，可使用本领域技术人员所众所周知的多种方法，修饰其他分泌性荧光素酶以用于在细胞内特别是在真核生物中的表达。
依照本发明，荧光素酶活性可通过本领域技术人员所众所周知的许多方法中的任何一种来检测并测量，所述方法包括但不限于使用发光计、闪烁计数器、光度计如光电倍增管光度计或照相乳胶薄膜(photoemulsionfilm)。
双荧光素酶和多荧光素酶报道基因测定
特别是由于在分泌性荧光素酶的情况下产生了比使用现有可用系统可获得的更高的敏感性(更强的闪光相和更低的本底信号)和更快的发光信号衰减率，本发明的方法和组合物发现了双荧光素酶和多荧光素酶报道基因测定的具体应用。分泌性荧光素酶(如Gaussia荧光素酶)提供了比正常非分泌性细胞内荧光素酶更高的生物发光信号强度。然而，以前还未描述过利用Gaussia荧光素酶或确实任何其他分泌性荧光素酶的双荧光素酶或多荧光素酶测定。
在很多应用中，诸如可包括筛选数百万化合物的文库的高通量药物筛选，双荧光素酶测定与分别进行两个实验相比，可大量节约成本和时间。另一方面，单一报道基因测定比双荧光素酶测定常常进行得更廉价和/或更简单，以致于使用者可选择进行单一荧光素酶测定，即使当所用的细胞系表达多种荧光素酶时。例如，确实在重复过程如高通量药物筛选中，可令人期望的是，最初在测试启动子的大量初步筛选中进行单一荧光素酶测定，以便选择候选化合物的短名单。然后可对较小数量的样品进行包括对照报道基因的双荧光素酶测定。因而，优选具有这样的双荧光素酶测定系统，它允许使用者选择是只测量测试报道基因还是测试报道基因与对照报道基因两个都测。
在本发明的一个实施方案中，依照本发明的双荧光素酶或多荧光素酶测定的荧光素酶中的至少一种(第一荧光素酶)是为非细胞质的以其“野生型状态”(下文称为“天然形式”)存在的荧光素酶。在这种情况下的天然形式表示在荧光素酶所源自于的未修饰的生物体中。换句话说，术语“天然形式”提及成熟野生型荧光素酶天然地发生其催化反应的正常位点或位置。这种类型的适宜荧光素酶将通常在非还原性的或比细胞质具有至少更少还原性(更多氧化性)的环境或微环境中工作(进行光发射反应)。在内质网中的细胞区室是一种如此的微环境。另一种是质膜，只要荧光素酶的催化结构域可位于质膜的细胞外侧上。
虽然，通常以其活性天然形式的荧光素酶是细胞外的，但更通常地它是分泌性的。它可被分泌到细胞外或生物体中的其他环境，假设它所分泌进入的或它正常经历其催化活性的环境相比于真核细胞(如哺乳动物细胞)的细胞质不是还原性环境。更通常地，以其天然形式存在的荧光素酶被分泌到外界环境中。甚至更通常地，荧光素酶源自于将荧光素酶分泌到其水环境中的水生生物体。最通常地，荧光素酶源自于将荧光素酶分泌到海水中的海洋生物体。这些荧光素酶通常利用腔肠素作为底物。第一荧光素酶的上述特征应用于以其天然形式存在的荧光素酶。适当地，荧光素酶可被修饰以去除这些特征中的一个或多个。如本文所述，这种荧光素酶在本领域中是众所周知的。
第二荧光素酶通常为以其天然形式存在的荧光素酶，它将在还原性的或在至少比第一荧光素酶具有更多还原性(更少氧化性)的环境或微环境中正常地操作(进行光发射反应)。通常地，以其天然形式存在的荧光素酶是在细胞质的。适宜的荧光素酶对本领域技术人员来说是众所周知的。它可源自于水生生物体或陆生生物体。它可使用与第一荧光素酶相同的底物或不同的底物。它可发射与第一荧光素酶相同波长的光或不同波长的光。
依照本发明的实施方案，可区分上文定义的第一荧光素酶与第二荧光素酶的示例性特征如下：
(a)第一荧光素酶正常地经历其催化活性的天然微环境的氧化还原势通常比第二荧光素酶经历其催化活性的天然微环境具有更多的还原性和更少的氧化性，和/或；
(b)第一荧光素酶正常地经历其催化活性的天然微环境通常为细胞外的，而第二荧光素酶经历其催化活性的天然微环境为细胞内的，和/或；
(c)第一荧光素酶以其天然形式分泌，而第二荧光素酶不是分泌性的，和/或；
(d)还原剂或还原性的氧化还原环境对第一荧光素酶的作用为灭活，至少比关于第二荧光素酶具有更大的程度，和/或；
(e)第一荧光素酶的活性取决于分子内二硫桥的生成而第二荧光素酶的活性不取决于此，和/或；
(f)第一荧光素酶包含对生成其二级/三级结构是关键性的半胱氨酸残基，和/或；
(g)适当折叠的第一荧光素酶的预测结构包括半胱氨酸残基之间的多个二硫桥，而第二荧光素酶的预测结构不包括，或者至少不在催化结构域的区域内。
在一些实施方案中，还利用另外的荧光素酶以便在单一样品中测量三种、四种、五种或更多种不同的荧光素酶。通常在这些实施方案中，至少第三种和此后的荧光素酶具有对第二荧光素酶所述的类型，即耐受还原性环境。多种荧光素酶可以以不同波长发光和/或可源自于不同的生物体。仅举例来说，在三重荧光素酶测定中，第二荧光素酶可源自于鞘翅目而第三荧光素酶可源自于双翅目。
本发明包括的多荧光素酶测定的实例如下所述。
(i)使用两种不同的底物和一种或两种不同的测定缓冲液的双荧光素酶测定
在一个实施方案中，第一荧光素酶为利用腔肠素作为底物的分泌性海洋荧光素酶(例如Gaussia荧光素酶)，而第二荧光素酶为利用荧光素作为底物的陆生荧光素酶(例如萤火虫、磕头虫或双翅目荧光素酶)。如依照本发明描述并示例，向含有两种荧光素酶的样品中首先加入含有腔肠素和还原剂的测定缓冲液。立即测量光发射，然后将样品静置或贮藏约5分钟或更长以使Gaussia信号衰减，优选衰减至接近零。然后加入含有荧光素的测定缓冲液(其还可包括Mg、CoA和ATP)并再次测量光发射。首次读数是Gaussia荧光素酶活性的量度而第二读数是萤火虫或磕头虫活性的量度。
依照上述，本发明提供了用于确定样品中第一荧光素酶和第二荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与第一荧光素酶和第二荧光素酶的反应性底物以及时间依赖性地灭活第一荧光素酶但不灭活第二荧光素酶的还原剂接触；
(b)在所述第一荧光素酶被还原剂灭活之前测量发光信号；
(c)在所述第一荧光素酶被灭活之后测量发光信号；和
(d)利用在(b)和(c)中收集的数据来计算每一种荧光素酶相对于彼此或相对于其他样品的量或活性。
还包括用于确定样品中第一荧光素酶和第二荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与第一荧光素酶的反应性底物和时间依赖性地灭活第一荧光素酶但不灭活第二荧光素酶的还原剂接触；
(b)在所述第一荧光素酶被灭活之前测量发光信号；
(c)将所述样品与所述第二荧光素酶的反应性底物接触；
(d)在所述第一荧光素酶被灭活之后测量发光信号；和
(e)利用在(b)和(c)中收集的数据来计算每一种荧光素酶相对于彼此或相对于其他样品的量或活性。
(ii)使用两种不同的底物和两种不同的测定缓冲液的三荧光素酶测定
在一个实施方案中，第一荧光素酶为利用腔肠素作为底物且发射蓝光的分泌性海洋荧光素酶(例如Gaussia荧光素酶)，而第二荧光素酶和第三荧光素酶为利用荧光素作为底物且分别发射绿光和红光的陆生荧光素酶，例如，红色和绿色竖毛甲属(Phrixothrix)荧光素酶和/或得自TOYO B-net(日本)的那些荧光素酶。如依照本发明描述并示例，向含有两种荧光素酶的样品中首先加入含有腔肠素和还原剂的测定缓冲液。立即测量光发射(不需滤光器)，然后将样品静置或贮藏约5分钟或更长时间以使Gaussia信号衰减，优选衰减至接近零。然后加入含有荧光素的测定缓冲液(其还可包括Mg、CoA和ATP)并再次测量光发射，使用了辨别红色和绿色信号的滤光器。用某些发光计同时测量红光和绿光是可能的，而其他的需要连续测量。
(iii)使用两种不同的底物和两种不同的测定缓冲液的四荧光素酶测定
在本发明的一个实施方案中，如在上面(ii)中所述的多荧光素酶测定可进一步包括第四荧光素酶，一种利用荧光素作为底物但发射橙光的荧光素酶，例如得自TOYO B-net的Rol荧光素酶。在第二测量过程中，适合的滤光器用来分离绿色、橙色和红色信号；例如对Multicolor-Luc测定系统(TOYO B-net)所述。
(iv)使用两种不同的底物和两种不同的测定缓冲液的五荧光素酶测定
在本发明的一个实施方案中，如在上面(iii)中所述的多荧光素酶测定进一步包括第五荧光素酶，一种发射蓝光的荧光素酶，但其天然形式为细胞质荧光素酶。大多数这些荧光素酶利用腔肠素作为底物且具有海洋来源，例如海肾荧光素酶。在第一测量过程中，Gaussia和海肾都发光，以致于这种测量为Gaussia和海肾信号的组合总量。恰好在加入第二测定试剂之前，进行另外的测量。此时Gaussia信号已衰退，以致于整个信号都来自于海肾荧光素酶。然后计算Gaussia和海肾信号(例如在本文实施例7中所述)。然后加入第二测定缓冲液(其包括荧光素并任选地包括Mg、CoA和ATP)并再次测量光发射，使用了辨别绿色、橙色和红色信号并将它们与任何剩余的蓝色信号分离的滤光器。可选择地，第二测定缓冲液可包含海肾荧光素酶的淬灭剂以便终止剩余的蓝色信号。
可选择地，在加入第二测定缓冲液后使用适合的滤光器从其他颜色中分离它的蓝色发射，从而测量海肾仅有的信号。在这种情况下，蓝色滤光器还可用于第一测量。
(v)使用在单一测定缓冲液中组合的两种不同底物的多荧光素酶测定
依照本发明的实施方案，测定可以如在上面(i)至(iv)中所述进行，除了将两种测定缓冲液组合到包含腔肠素、荧光素、还原剂、Mg和可选的ATP和CoA的单一缓冲液中。四个滤光器用来分离蓝色、绿色、橙色和红色信号。首先测量蓝色信号(使用蓝色滤光器来排除其他波长)并且优选在测量其他颜色之前加入约5分钟或更长时间的延迟，以便于使Gaussia信号的任何串扰(cross-talk)降至最小，所述Gaussia信号的串扰仅在初始阶段中非常强。
(vi)使用一种分泌性荧光素酶和一种非分泌性荧光素酶的双荧光素酶测定
在一个实施方案中，第一荧光素酶以其分泌性形式存在，为分泌性海洋荧光素酶(例如Gaussia)，而第二荧光素酶为细胞内海洋荧光素酶(例如海肾)。培养表达两种荧光素酶的细胞，并取出条件培养基的样品以测量分泌性(Gaussia)荧光素酶。将细胞溶解于包含还原剂的试剂中，随后测量细胞内(海肾)荧光素酶。用标准试剂，由细胞溶解产物发射的光将包括不能辨别的光组合，所述光组合源自于海肾荧光素酶和已经产生但还未分泌的Gaussia荧光素酶的亚型。通过在溶解缓冲液中引入还原剂，Gaussia荧光素酶被灭活，从而光发射为海肾荧光素酶水平的量度。
本发明还包括了用于确定样品中两种或更多种不同的荧光素酶的量或活性的进一步方法。在一个实施方案中，所述方法包括将所述样品与包括至少两种荧光素酶的反应性底物的试剂组合物接触，确定在两个或更多个不同的时间点发射的光的量，并且使用所收集的数据来计算每种荧光素酶相对于彼此或相对于其他样品的量或活性；其中这种计算在以时间依赖性的方式灭活至少一种荧光素酶的还原剂的存在下，取决于两种荧光素酶之间关于光发射动力学的差异。所述方法可进一步包括使用由荧光素酶产生的发光信号的光发射波长的差异，来辨别至少两种不同的荧光素酶的信号。
本发明的方法提供了荧光素酶反应中生物发光的改善的动力学，并且通过本意外发现提供了相对于现有技术更好的优势，所述意外发现即还原剂以时间依赖性的方式灭活以其天然形式分泌的荧光素酶。还原剂可根据本发明用于荧光素酶测定，用于制备根据本发明的测定试剂和检测试剂盒，并且用于根据本发明的测定与试剂盒的标准和对照。本发明提供了用于进行荧光素酶活性测定的试剂盒，这些试剂盒包含如本文所述的依照本发明使用的还原剂。在一种或多种物理容器中并通常以方便形式包装以便于在荧光素酶测定中使用的本发明试剂盒包括其用于进行荧光素酶测定的适宜量的试剂组合物或组分。荧光素酶底物和还原剂可在相同或不同的容器中，也可在相同或不同的试剂组合物中。通常地，荧光素酶底物以单独容器向测定试剂供应(不含(minus)底物)以便延长有效期，但是预期在使用之前与测定试剂混合。多种试剂组合物或试剂组合物的各种组分可在例如水溶液中组合，或在单个容器或在多个容器中冻干。本发明的试剂盒通常还包括对照和标准，以确保依照本发明进行的测定的可信度和精确度。适合的对照和标准将对本领域技术人员是已知的。
在一些实施方案中，依照本发明使用的试剂组合物作为改善的多种用途的试剂盒中的单独组分供应。例如，通过以单独组分的形式提供还原剂，使用者可在下列中选择：
a)依照上面vi)使用，将还原剂加入到溶解缓冲液。作为利用的进一步实例，用表达与其他荧光素酶组合的非分泌性Gaussia荧光素酶的稳定细胞系操作的使用者可选择测量Gaussia荧光素酶或不测量Gaussia荧光素酶。在后者的情况下，使用者可利用含有还原剂的溶解缓冲液在测量其他荧光素酶之前灭活Gaussia荧光素酶；
b)依照上面i)使用，将还原剂加入到测定缓冲液；
c)首先向样品中加入不含还原剂的测定缓冲液，测量发光，然后加入还原剂以灭活至少一种荧光素酶；和
d)首先向样品中加入不含还原剂的测定缓冲液，等待一直到完成发光阶段，加入还原剂或含有还原剂的测定缓冲液，并在灭活荧光素酶之前测量发光。
本说明书对任何现有出版物(或出自其中的信息)或任何已知物质的引用不是，也不应认为是对这样一种情况的确认或承认或者任何形式的建议，即该现有出版物(或出自其中的信息)或已知物质构成了本说明书竭力所涉及的领域的公知常识的一部分。
现在将参考下列特定的实施例来描述本发明，这些实施例不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
部分I：还原剂缩短以其天然状态分泌的荧光素酶的光发射动力学
实施例1
将稳定表达非分泌性且去稳定的Gaussia荧光素酶的HeLa细胞铺于96孔板上并孵化过夜。非分泌性荧光素酶为修饰的Gaussia荧光素酶，在所述Gaussia荧光素酶中14个氨基酸N末端信号肽已被删除。去稳定荧光素酶为含有去稳定元件的酶以致于它具有缩短的半衰期并以比在缺少去稳定元件下低的稳态水平表达。
过夜孵化后，去除培养基并将细胞溶解于包含25mM Tris pH 8.1、150mM NaBr、1mM EDTA、63.4μM草酸钠、0.1％NP40代用品、5％甘油(GSv3)的20μl溶解缓冲液。在注射包含25mM Tris pH 8.1、1mM EDTA、2mM抗坏血酸盐和26μM Cz(STD)的60μl测定缓冲液或者相同的但还包含还原剂的测定缓冲液后，在动力学测定中测量荧光素酶活性。使用不同浓度的三种还原剂：DTT(4mM、10mM、20mM或50mM)；β-巯基乙醇(10mM、20mM、50mM或100mM)；和TCEP(500μM或5mM)。两种独立实验的结果在图1A和1B中示出。可看出，每种还原剂引起发光信号随时间比在缺少还原剂下观察到的更快速的衰减(在所有测试浓度下)。在所给定的还原剂的较高浓度下作用最强。所用的荧光素酶底物的浓度比利用腔肠素的荧光素酶正常所用的浓度(约5μM)显著更高。本发明人已确定就由Gaussia荧光素酶产生的生物发光而言，这种较高的浓度产生有益作用。
实施例2
如实施例1中所述进行类似实验，但是在测定缓冲液中使用更宽的DTT浓度范围(50mM至500mM)。两种独立实验的结果在图2中显示，表示短时间过程(图2A)和更长的时间过程(图2B)。如在实施例1所述的实验中观察，发光信号的衰减率直接与DTT的浓度相关。一直到500mM的最大浓度都看到这种作用(图2A)。在更长的时间过程中(图2B)，信号在所有浓度的起始10分钟内降至约本底水平(～100RLU)。这代表光强度减少1,000至10,000倍。重要的是，观察到DTT缩短Gaussia荧光素酶的光发射周期的现象与对于细胞内荧光素酶(包括萤火虫和其他鞘翅目荧光素酶和海肾荧光素酶)所报道的相反。
实施例3
如实施例1中所述进行类似实验，除了也对野生型分泌性Gaussia荧光素酶研究DTT对发光时间过程的作用。这通过用编码野生型Gaussia荧光素酶蛋白的报道基因质粒瞬时转染HeLa细胞和24小时后收获条件培养基来实现。将测定缓冲液(含有50mM DTT或不含DTT)注射到含有20μl条件培养基的孔中。结果表示为剩余信号相比于时间零点时的百分比(参见图3)。数据证实，当测定缓冲液中包括DTT时，两种Gaussia荧光素酶形式(天然分泌性和修饰的非分泌性)产生非常快速的光发射衰减。
实施例4
进行与实施例1中所述的那些类似的试验，除了HeLa细胞瞬时表达细胞内海肾荧光素酶。在将测定缓冲液(含有50mM DTT或不含DTT)注射到含有20μl溶解产物的孔中后，进行动力学测定。如图4中所示，直接与DTT对Gaussia荧光素酶的光发射动力学的作用比较，DTT实际上延长了海肾荧光素酶的光发射。
实施例5
用编码以其天然分泌性形式或修饰的非分泌性形式的Gaussia或长腹水蚤荧光素酶的表达质粒，瞬时转染HeLa细胞。
分泌性长腹水蚤荧光素酶获自Clontech，而非分泌性长腹水蚤荧光素酶以与非分泌性Gaussia荧光素酶类似的方法产生。通过使用在ATG(分泌信号)和终止密码子后删除前16个氨基酸的引物的PCR，获得编码区域。将PCR产物连接到pRR23.1质粒(GeneStream，AU)中产生非分泌性的但去稳定的长腹水蚤荧光素酶。
如实施例1中所述，在转染后一天取出分泌性荧光素酶的条件培养基并将非分泌性荧光素酶溶解。在手动注射包括所示浓度DTT的25mM TrispH 7.75、1mM EDTA、2mM抗坏血酸和26μM腔肠素的测定缓冲液后，在动力学测定中测定条件培养基或溶解产物的等份试样(20μl)的荧光素酶活性。
图5A至5D显示了当测定缓冲液中包括DTT时，非分泌性和分泌性长腹水蚤荧光素酶与非分泌性和分泌性Gaussia荧光素酶以相同方式响应，即光发射衰减非常快速。此外，如图5A至5D中所示，在缩短所有四种荧光素酶的光发射周期中，DTT有浓度依赖性作用。
实施例6
对于非分泌性Gaussia和长腹水蚤荧光素酶，如实施例5中所述进行实验，除了所用的还原剂为：二硫赤藓糖醇(DTE)(图6A和6D)、亚硫酸钠(图6B)、半胱胺(图6C和6E)、TCEP(图6F)和β-巯基乙醇(图6G)。数据(图6A至6G)显示，与DTT一样，其他还原剂也提供了Gaussia和长腹水蚤荧光素酶的光发射的快速衰减。
实施例7
如实施例1中所述，制备包括非分泌性Gaussia荧光素酶的细胞溶解产物。将包括25mM Tris pH 7.75、1mM EDTA、2mM抗坏血酸和26μM腔肠素的60μl测定缓冲液加至溶解产物的20μl等份试样，并放置在室温孵化40分钟，以使反应进入其发光阶段。在40分钟后(时间零点)，加入另外的60μl测定缓冲液。这种测定缓冲液与初始测定缓冲液相同，除了它含有所示浓度的DTT且不含腔肠素。
在注射第二测定缓冲液后于时间过程中测量光发射，并表示为光单位在时间零点的百分比(图7)。
这数据显示，当在先前启动的反应的发光阶段中加入DTT时，观察到与在反应的启动点加入还原剂时相同的期望的光发射的快速衰减。这表明了非分泌性Gaussia荧光素酶活性可在标准反应如发光反应中测量，随后通过加入还原剂来终止。可选择地，在加入还原剂后可立即测量荧光素酶活性，即以与其闪光反应中的使用等同的方式。在注射还原剂后的前几秒内光发射没有任何显著衰减，这表明了这种方案将不会引起信号强度的任何减少。
部分II：还原剂可用来执行使用具有不同底物的不同荧光素酶的多报道基因测定
实施例8
将稳定表达非分泌性且去稳定的Gaussia荧光素酶与去稳定的萤火虫荧光素酶两者的HeLa细胞铺在96孔板上并孵化过夜。去除培养基并将细胞溶解于20μl如实施例1所述的溶解缓冲液。在如下时间用发光计测量光发射1秒钟：在加入测定缓冲液前立即(LB＝在缺少底物下的本底信号)；在加入包含25mM Tris pH 8.1、1mM EDTA、2mM抗坏血酸盐、23.6μMCz和50mM DTT的Gaussia测定缓冲液(Ga)后立即；在加入Ga测定缓冲液后15分钟(15分钟)；和接下来在加入包含25mM Tris pH 7.35、6mMMgSO4、36mM DTT、0.11mM EDTA、0.58mM ATP、0.3mM CoA、0.52mM荧光素、1mg/ml BSA的60μl萤火虫测定缓冲液(FF)后1秒。在图8中示出的这些结果说明了一个强的Gaussia荧光素酶生物发光信号，所述信号可在闪光反应中测量，但在没有干涉或需要加入淬灭试剂的情况下，在约15分钟内衰减至本底水平。随后萤火虫试剂的加入允许萤火虫信号的测量，因而完成双荧光素酶测定。
实施例9
用含有在多个串联CRE(CRE-FF)的控制下去稳定的萤火虫荧光素酶的质粒或含有受多个串联NFkB-结合位点(NFkB-Ga)驱使的去稳定的细胞内Gaussia荧光素酶的质粒中的任一个或两者，瞬时转染293T细胞。将转染细胞铺在96孔板上并孵化过夜。一式四份，用10μM(终浓度)毛喉素或10ng/ml TNF-α(TNF)处理孔或留下未作处理(对照)。四个小时后，去除培养基并使用实施例8中所述的方案测量每一种荧光素酶的发光。
图9A显示了在加入Gaussia测定缓冲液后的发光信号(参见实施例5)，图9B显示了在加入萤火虫测定缓冲液后的信号。从结果明显可见，萤火虫荧光素酶在Gaussia测定缓冲液中基本上不产生发光信号(参见图9A)，而Gaussia荧光素酶在萤火虫测定缓冲液中基本上不产生信号(参见图9B)。因而，双荧光素酶方法在分离两种信号中是极其有效的。
已知NFkB元件对TNF但不对毛喉素强烈响应，而CRE对毛喉素但不对TNF强烈响应。因此，不出所料，NFkB-Ga(单独)被TNF而不是毛喉素强烈诱导(图9A)，而CRE-FF(单独)被毛喉素而不是TNF强烈诱导(图9B)。重要的是，在用两种构建体共转染的细胞中看到相同的结果，这表明了双荧光素酶测定的成功与有效性。
部分III：还原剂可用来执行使用具有相同底物的不同的荧光素酶的多报道基因测定
实施例10
用编码非分泌性Gaussia荧光素酶或标准细胞内海肾荧光素酶中的任一个的表达质粒，瞬时转染几个培养瓶(Flasks)的HeLa细胞。24小时后，使用在实施例1中所述的溶解缓冲液，从每个培养瓶还有未被转染的HeLa细胞的对照培养瓶中制备分离的储存溶解产物。以10μl Gaussia荧光素酶加上10μl非转染的(Ga)、10μl海肾荧光素酶加上10μl非转染的(Rn)或10μl Gaussia荧光素酶加上10μl海肾荧光素酶(Ga&Rn)，将溶解产物装载在96孔板上，一式四份。在加入实施例8中所述的测定缓冲液后立即测量荧光素酶活性，然后在1200秒后再次测量。
图10A显示了原始数据，表示为相对光单位(RLU)。不出所料，Gaussia发光信号起初非常强但在第二读数之前衰减至本底水平，而所产生的海肾荧光素酶显示更低的起始信号，但其在两个读数之间的衰减少得多。混合的溶解产物(Ga&Rn)显示了中等水平的衰减。
由于Gaussia荧光素酶在第二读数时不再有助于可检测的相对光单位(RLU)，所以此读数是海肾荧光素酶的准确量度并可用来比较样品之间的海肾荧光素酶的水平。初始读数为Gaussia和海肾荧光素酶两者的信号组合。然而，由Gaussia荧光素酶产生的信号可通过从组合的在时间零点所测的信号减去初始海肾荧光素酶信号来确定。为了确定初始海肾荧光素酶信号，仅有海肾的(Rn)溶解产物被用作计算海肾荧光素酶光发射的衰减率的标准。特别地，计算衰减常数“k”，其中k＝(初始Rn信号)/(在1200秒的Rn信号)。然后将初始Rn信号计算为(在1200秒的Rn信号)×k，并通过从初始组合的(Ga&Rn)信号减去这个值来计算初始Gaussia荧光素酶信号。
图10B比较了组合样品的Gaussia荧光素酶活性的这些计算值(计算值)，与在含有相同量Gaussia荧光素酶但不含现有的任何海肾荧光素酶的样品中所测的Gaussia荧光素酶活性的实际值(预期值；即图10A的(Ga))。所测值(预期值)和计算值之间的差异非常小且没有统计显著性，这表明了进行包括单一测定缓冲液的双荧光素酶测定是有可能的，即使就底物类型或光发射的波长而言，荧光素酶之间没有差异。不同于先前所述的其他双荧光素酶测定(其依靠使用淬灭试剂或具有不同发射波长的荧光素酶)，本文所述的方法利用荧光素酶之间在光发射动力学方面的差异。根据发明人的知识，先前还没报道过使用光发射的短暂差异来辨别不同的荧光素酶信号。通过包括还原剂如DTT，在当前实施例中大大提高了两种信号的分离。这可能是基于如下令人惊奇的发现而产生的：鉴于DTT稳定了细胞内荧光素酶如海肾和萤火虫荧光素酶的信号，因此它显著地缩短了以其野生型状态正常地分泌的荧光素酶(如Gaussia荧光素酶)的光发射的持续时间。
实施例11
本发明人仔细考虑了基于使用一种分泌性荧光素酶和一种细胞内荧光素酶的双荧光素酶测定的可能性。表达两种荧光素酶的细胞可用作条件培养基(包括分泌性荧光素酶)和细胞溶解产物(包括细胞内荧光素酶)两者的来源。如此，两种荧光素酶通过它们的位置而不是底物特异性的差异来分离。然而，这种测定将需要溶解产物不含可检测的分泌性荧光素酶，并且这似乎不太可能认为分泌性荧光素酶在细胞内产生且必须在分泌之前穿过内质网(ER)。确实，预实验揭示了表达分泌性Gaussia荧光素酶的细胞包含大量的荧光素酶，即使在去除培养基并重复洗涤细胞之后。清楚地，所得的溶解产物信号的至少一部分源自于最近翻译的荧光素酶分子，所述荧光素酶分子还没穿越ER并被分泌。可能地，这种信号中的一些还可源自于旧的荧光素酶分子，所述旧的荧光素酶分子或已粘附在ER内侧，或已被分泌但已结合到细胞膜的胞外侧。不管这种干扰荧光素酶信号的来源，本发明人推论这可能通过在溶解缓冲液中包括还原剂而被消除。
为了测试这种假设，HeLa细胞用单独或组合的质粒TRE-Rn和CMV-Ga(野生型，分泌性)共转染。后者提供了分泌性Gaussia荧光素酶的组成型表达，同时前者提供了细胞内海肾荧光素酶的多西环素可抑制的表达。将细胞孵化过夜，去除培养基并在加入新鲜的含或不含2μg/ml多西环素的培养基的等份试样之前漂洗细胞一次。在2、6和24小时以后，取条件培养基的样品。在使用包含25mM Tris pH 8.1、150mM NaBr、1mMEDTA、63.4μM草酸钠、0.1％NP40代用品、5％甘油(含或不含50mM DTT)的溶解缓冲液溶解细胞之前，在新鲜的培养基中漂洗细胞。然后在加入包含25mM Tris pH 7.75、1mM EDTA、2mM抗坏血酸和26μM腔肠素的60μl测定缓冲液后，测定条件培养基和细胞溶解产物的20μl等份试样的荧光素酶活性。
图11A和11B显示了不含多西环素的样品在2小时时间点的数据。使用标准溶解缓冲液(图11A)，在仅表达分泌性Gaussia(Ga)荧光素酶的细胞的溶解产物中检测到强信号。确实，这种信号比仅表达非分泌性海肾(Rn)荧光素酶的细胞的溶解产物中的信号还要高。清楚地，分泌性Gaussia荧光素酶不限制于条件培养基中。相反，当溶解缓冲液中包括DTT时(图11B)，在仅表达Gaussia荧光素酶的细胞的溶解产物中未检测到信号。因此，用这种方案辨别分泌性Gaussia荧光素酶与非分泌性海肾荧光素酶是可能的，如海肾的只有溶解产物的信号和Gaussia的只有培养基的信号所证明。
为了进一步证明这种系统的功能性和实用性，所有时间点的数据表示为相对于-多西环素的+多西环素(图11C和11D)。应认识到，海肾荧光素酶与TRE启动子连接以使只有海肾荧光素酶将随时间减少。因而，正确辨别分泌性Gaussia(Ga)荧光素酶和非分泌性海肾(Rn)荧光素酶的系统应显示细胞溶解产物值而不是条件培养基值的下降。这种作用在图11D中确实是明显的，所述图表示了使用含有DTT的溶解缓冲液所获得的数据。相反，使用不含DTT的溶解缓冲液(图11C)则明显不可能分离两种荧光素酶的信号。
部分IV：还原剂提供了较低的本底信号
实施例12
按照下述，对非转染的HeLa细胞和表达非分泌性Gaussia荧光素酶的HeLa细胞进行荧光素酶测定。将细胞以相等的等份试样铺在96孔板上并孵化过夜。去除培养基并将细胞溶解于20μl实施例1中所述的溶解缓冲液。四十分钟后，在注射包含25mM Tris pH 8.1、23.6μM腔肠素、1mMEDTA、2mM抗坏血酸盐加上所示浓度的DTT的60μl测定缓冲液之前和之后，使用Wallac Victor 3发光计(Perkin Elmer)立即测量光发射(参见图8)。
图12A显示了在注射后表示为相对光单位(RLU)的原始数据。由于细胞溶解产物中不存在荧光素酶，所以这些数据表示了测定的本底信号。图12B显示了在减去预读数之后的数据(在加入测定缓冲液之前的测量值)。因而，这些数据表示了由测定缓冲液产生的本底信号。这些数据显示了，测定缓冲液中DTT的包含提供整个本底信号减少超过50％(图12A)，以及测定缓冲液产生的本底信号减少超过80％(图12B)。
图12C显示了50mM DTT不减少用含有非分泌性Gaussia荧光素酶的HeLa细胞溶解产物的闪光反应中所产生的真实荧光素酶信号。因而，测定缓冲液中50mM DTT的包含减少本底信号(图12A & 12B)，并显著缩短光发射动力学(参见其他实施例)但不损害Gaussia荧光素酶的真实闪光信号的强度。
部分V：还原剂阻止或限制测定缓冲液活性的下降
实施例13
通过用实施例1中所述的溶解缓冲液溶解一培养瓶的稳定表达非分泌性Gaussia荧光素酶的HeLa细胞，制备Gaussia荧光素酶的储存溶解产物。将20μl溶解产物装载到96孔板的每孔中，并在注射如实施例1中所述的标准测定缓冲液(STD)或进一步包括如图13中所示的量和类型的还原剂的相同测定缓冲液之后，于闪光反应中测量光发射。一式四份，使用新鲜制备的测定缓冲液测量每组样品。然后在4℃将测定缓冲液贮存于暗处22小时并重复本方案。
图13显示了使用这种不新鲜的测定缓冲液所得的信号强度作为得自新鲜的相同测定缓冲液的信号强度的百分比。在缺少还原剂下，在贮存期间测定缓冲液(STD)的活性下降超过60％。所有还原剂对减少这种下降是有效的，并且特别值得注意的是，50mM DTT的存在完全消除了测定缓冲液降解的所有迹象。
实施例14
将表达去稳定的非分泌性Gaussia荧光素酶的HeLa细胞以相等的等份试样铺到96孔板上并孵化过夜。对于所有样品使用相同的溶解缓冲液。使用包括图14中所示的量和比率的还原型和氧化型谷胱甘肽的新鲜测定缓冲液，测量荧光素酶活性。然后将测定缓冲液在室温贮存4小时再用于测量重复样品。图14显示在缺少谷胱甘肽下，测定缓冲液的活性下降了约32％。这种下降完全被5mM谷胱甘肽的存在阻断，所述谷胱甘肽包括单独的还原型谷胱甘肽、单独的氧化型谷胱甘肽和各种比率的二者组合。然而，新鲜缓冲液的基线活性显示了谷胱甘肽，尤其是氧化型谷胱甘肽，减少了测定缓冲液活性，尽管它具有提供稳定性的有利作用。
实施例15
将表达去稳定的非分泌性Gaussia荧光素酶的HeLa细胞以相等的等份试样铺在96孔板上并孵化过夜。对于所有样品使用相同的溶解缓冲液。使用包括图15中所示总量的谷胱甘肽(还原型∶氧化型的比率为3∶2)的新鲜测定缓冲液，测量荧光素酶活性。然后将测定缓冲液在室温贮存7小时或在4℃贮存22小时，并再用于测量重复样品。图15显示了在缺少谷胱甘肽下，测定缓冲液的活性下降约50％。这种下降完全被5mM谷胱甘肽的存在阻断，尽管初始活性在此缓冲液中减少。在同时保护以防活性随时间的损失和活性初始水平的减少方面，较低量的谷胱甘肽显示了中间效应。
本领域技术人员将理解，本文所述的发明容许除了明确描述的那些之外的变化和修饰。应理解，本发明包括所有这些变化和修饰。本发明还包括本说明书中独立或共同地提及或表示的所有这些步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两种或更多种的任何和所有组合。

Claims (53)

1.一种用于测量样品中由一种或多种荧光素酶产生的发光信号的方法，所述方法包括用待分析的荧光素酶的反应性底物和还原剂孵化所述样品以灭活第一荧光素酶，其中所述第一荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一荧光素酶的灭活包括抑制或消除所述荧光素酶的催化活性和/或将所述荧光素酶转化成无活性构象。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一荧光素酶为以其天然形式分泌的荧光素酶的非分泌性修饰形式。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述第一荧光素酶利用腔肠素作为底物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一荧光素酶利用腔肠素作为底物并且具有海洋来源。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述海洋来源的荧光素酶源自于Gaussia属、乳点水蚤属、长腹水蚤属、海莹属或Oplophorus属，或者是其变体或衍生物。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述还原剂包括硫醇基团。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、β-巯基乙醇、半胱胺、亚硫酸钠和三(2-羧乙基)膦(TCEP)组成的组。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述还原剂为DTT。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中由所述第一荧光素酶产生的发光信号被测量。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一荧光素酶的反应性底物与所述还原剂同时加入。
12.根据权利要求10所述的方法，其中将所述第一荧光素酶的反应性底物加入所述样品中，并且在加入所述还原剂之前测量由所述第一荧光素酶产生的发光信号。
13.根据权利要求10所述的方法，其中在所述第一荧光素酶的反应性底物之前将所述还原剂加入所述样品中，并在所述第一荧光素酶被所述还原剂灭活之前测量由所述第一荧光素酶产生的发光信号。
14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中所述荧光素酶中的至少一种由重组报道基因表达。
15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其中所述发光信号作为报道基因测定的一部分被测量。
16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其中所述样品包括至少一种细胞内荧光素酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞内荧光素酶源自于鞘翅目种。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞内荧光素酶源自于双翅目种。
19.根据权利要求16至18任一项所述的方法，其中在加入所述细胞内荧光素酶的反应性底物之前将所述还原剂加入所述样品中以便在测量由所述细胞内荧光素酶产生的发光信号之前灭活所述第一荧光素酶。
20.根据权利要求16至19任一项所述的方法，其中所述细胞内荧光素酶被所述还原剂活化。
21.根据权利要求16至20任一项所述的方法，其中所述细胞内荧光素酶的光发射周期被所述还原剂延长。
22.根据权利要求16至21任一项所述的方法，其中所述第一荧光素酶利用腔肠素作为底物，而所述细胞内荧光素酶利用荧光素作为底物。
23.根据权利要求16至21任一项所述的方法，其中所述第一荧光素酶和所述细胞内荧光素酶都利用腔肠素作为底物。
24.根据权利要求16至23任一项所述的方法，其中所述样品包括两种或更多种细胞内荧光素酶。
25.根据权利要求24所述的方法，其中由所述两种或更多种细胞内荧光素酶产生的发光信号以不同波长产生。
26.一种用于测量样品中由荧光素酶产生的发光信号的方法，其中所述荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，所述方法包括：
(a)将所述样品与所述荧光素酶的反应性底物接触；
(b)将所述样品与时间依赖性地灭活所述荧光素酶的还原剂接触；和
(c)在所述荧光素酶被所述还原剂灭活之前测量由所述荧光素酶产生的发光信号。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述荧光素酶为以其天然形式分泌的荧光素酶的非分泌性修饰形式。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述样品在所述还原剂之前与所述反应性底物接触。
29.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述样品同时与所述反应性底物和所述还原剂接触。
30.一种用于测量样品中由荧光素酶产生的发光信号的方法，其中所述荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，所述方法包括：
(a)将所述样品与所述荧光素酶的反应性底物接触；
(b)测量由所述荧光素酶产生的发光信号；和
(c)随后将所述样品与时间依赖性地灭活所述荧光素酶的还原剂接触。
31.一种用于测量样品中由荧光素酶产生的发光信号的方法，其中所述荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，所述方法包括：
(a)将所述样品与时间依赖性地灭活所述荧光素酶的还原剂接触；
(b)将所述样品与所述荧光素酶的反应性底物接触；和
(c)在所述荧光素酶被所述还原剂灭活之前测量由所述荧光素酶产生的发光信号。
32.一种用于测量样品中由第一荧光素酶和第二荧光素酶产生的发光信号的方法，其中所述第一荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，而所述第二荧光素酶为细胞内荧光素酶，所述方法包括；
(a)将所述样品与所述第一荧光素酶的反应性底物接触；
(b)测量由所述第一荧光素酶产生的发光信号；
(c)将所述样品与时间依赖性地灭活所述第一荧光素酶的还原剂接触；
(d)将所述样品与所述第二荧光素酶的反应性底物接触；和
(e)测量由所述第二荧光素酶产生的发光信号。
33.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(d)和(e)位于步骤(a)至(c)之前以便在测量由所述第一荧光素酶产生的发光信号之前测量由所述第二荧光素酶产生的发光信号。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)和(c)后进行，以便所述样品在测量由所述第一荧光素酶产生的发光信号之前与所述还原剂接触。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述样品在所述第一荧光素酶的反应性底物之前或同时与所述还原剂接触。
36.一种用于测量包括第一荧光素酶和第二荧光素酶的样品中由第二荧光素酶产生的发光信号的方法，其中所述第一荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，而第二荧光素酶为细胞内荧光素酶，所述方法包括如下步骤：
(a)将所述样品与时间依赖性地灭活所述第一荧光素酶的还原剂接触；
(b)将所述样品与所述第二荧光素酶的反应性底物接触；和
(c)测量由所述第二荧光素酶产生的发光信号。
37.根据权利要求32至36任一项所述的方法，其中所述样品进一步包括第三荧光素酶。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述第三荧光素酶为细胞内荧光素酶。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中由所述第二荧光素酶和所述第三荧光素酶产生的发光信号以不同的波长产生。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述第二荧光素酶源自于鞘翅目种而所述第三荧光素酶源自于双翅目种。
41.根据权利要求1至40任一项所述的方法，其中所述样品在测量发光信号之前经受细胞溶解步骤。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述样品在加入所述荧光素酶底物之前经受细胞溶解步骤。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述样品在加入所述还原剂之前经受细胞溶解步骤。
44.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述还原剂存在于细胞溶解缓冲液中。
45.根据权利要求1至44任一项所述的方法，其中所述发光信号使用已培养了表达荧光素酶的细胞的条件培养基来测量。
46.一种用于灭活荧光素酶的方法，所述荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，所述方法包括将含有所述荧光素酶的样品与还原剂接触。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述荧光素酶是以其天然形式分泌的荧光素酶的非分泌性修饰形式。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述荧光素酶的灭活包括抑制或消除所述荧光素酶的催化活性和/或将所述荧光素酶转化成无活性构象。
49.一种用于增加由荧光素酶产生的发光信号的衰减率的方法，所述荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶，所述方法包括将含有所述荧光素酶的样品与还原剂接触。
50.一种用于确定样品中两种或更多种荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：
(a)向所述样品中加入时间依赖性地灭活第一荧光素酶的有效量的还原剂；
(b)测量所述样品中的发光信号；
(c)等待一段时间以允许所述第一荧光素酶的发光信号衰减；
(d)测量所述样品中的发光信号；和
(e)根据(b)与(d)的结果和每一种发光信号不同的衰减率，计算每一种荧光素酶的发光信号。
51.一种用于确定样品中第一荧光素酶和第二荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与所述第一荧光素酶和所述第二荧光素酶的反应性底物和时间依赖性地灭活所述第一荧光素酶但不灭活所述第二荧光素酶的还原剂接触；
(b)在所述第一荧光素酶被所述还原剂灭活之前测量发光信号；
(c)在所述第一荧光素酶被灭活之后测量发光信号；和
(d)利用在(b)和(c)中收集的数据来计算每一种荧光素酶相对于彼此或相对于其他样品的量或活性。
52.一种用于确定样品中第一荧光素酶和第二荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与所述第一荧光素酶的反应性底物和时间依赖性地灭活所述第一荧光素酶但不灭活所述第二荧光素酶的还原剂接触；
(b)在所述第一荧光素酶被灭活之前测量发光信号；
(c)将所述样品与所述第二荧光素酶的反应性底物接触；
(d)在所述第一荧光素酶被灭活之后测量发光信号；和
(e)利用在(b)和(c)中收集的数据来计算每一种荧光素酶相对于彼此或相对于其他样品的量或活性。
53.一种用于确定样品中一种或多种荧光素酶的量或活性的方法，所述方法包括用待分析的荧光素酶的反应性底物和还原剂孵化所述样品以灭活第一荧光素酶，其中所述第一荧光素酶以其天然形式存在，为分泌性荧光素酶。
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