KR101478373B1 - 분비성 루시페라아제를 이용하는 생물 발광 검사 - Google Patents

분비성 루시페라아제를 이용하는 생물 발광 검사 Download PDF

Info

Publication number
KR101478373B1
KR101478373B1 KR1020097015110A KR20097015110A KR101478373B1 KR 101478373 B1 KR101478373 B1 KR 101478373B1 KR 1020097015110 A KR1020097015110 A KR 1020097015110A KR 20097015110 A KR20097015110 A KR 20097015110A KR 101478373 B1 KR101478373 B1 KR 101478373B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
luciferase
sample
delete delete
reducing agent
signal
Prior art date
Application number
KR1020097015110A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090113831A (ko
Inventor
마르코 피터 레우
존 마이클 댈리
Original Assignee
진 스트림 피티와이 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 진 스트림 피티와이 리미티드 filed Critical 진 스트림 피티와이 리미티드
Publication of KR20090113831A publication Critical patent/KR20090113831A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101478373B1 publication Critical patent/KR101478373B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/18—Sulfur containing
    • Y10T436/182—Organic or sulfhydryl containing [e.g., mercaptan, hydrogen, sulfide, etc.]

Abstract

표본에서 하나 이상의 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법 및 하나 이상의 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 방법이 개시되며, 본 방법들은 상기 표본을 분석될 루시페라아제(들)의 반응 기질(들) 및 환원제와 함께 배양하여 제1 루시페라아제를 비활성화시키는 단계를 포함하고, 이때 상기 제1 루시페라아제는 자연형에서 분비성인 루시페라아제이다.
생물 발광, 루시페라아제, DTT, 환원제, 리포터 유전자 검사

Description

분비성 루시페라아제를 이용하는 생물 발광 검사{BIOLUMINESCENT ASSAYS UTILISING SECRETED LUCIFERASES}
본 발명은 일반적으로 루시페라아제 효소에 의한 촉매 반응에 사용되기 위한 시약 및 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 루시페라아제계 리포터(reporter) 유전자 검사에 사용되기 위한 시약 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 특히, 루시페라아제 촉매 반응의 감도를 향상시키고 동적 특성(kinetics)을 개선하는 방법 및 조성물도 제공한다.
리포터 유전자 검사는 예컨대 DNA 서열, 전사 인자, RNA 서열, RNA-결합 단백질, 신호 전달 통로(signal transduction pathways) 및 특정 자극과 같은 관심 유전자(gene of interest) 발현을 무엇이 조절하는 지에 대해 해석하여 유전자 발현 연구에 있어 중요한 도구를 나타낸다. 특히, 리포터 검사는 유전자 조절에서 중요한 핵산 영역들을 식별하는 데에 사용될 수 있다. 그러한 영역들은 인간 질병의 치료나 예방에 있어 치료적 개입(therapeutic intervention)을 위한 잠재적 타겟으로서 역할할 수 있다. 리포터 검사는 약품을 선별하여 상기 약품의 효력이 유전자 발현을 변형하도록 하는 데에 사용될 수 있다.
일반적으로, 리포터 검사는 유전자 촉진자 영역(gene promoter region) 또 는, 영역들을 결합하는 전사 인자나 다른 조절 요소와 같은 촉진자 내의 특이 요소를 식별하는 데에 사용된다. 또는, 그러한 검사는 다양한 자극이나 제재(agents)에 대한 촉진자 또는 조절 요소의 감응을 연구하는 데에 사용된다. 표준 출원에서, 검사에 사용된 리포터 구조체 또는 트랜스팩션된 세포(transfected cells)는 생체내 촉진자 기능을 연구하기 위해 유기체에 삽입된다. 더욱이, 리포터 검사는 특이 촉진자의 상류(upstream)에서 신호 전달 통로들을 측정하거나 연구하는 데에 사용될 수 있다.
예컨대, 추정적 촉진자 서열 또는 다른 전사 조절 요소를 조사하도록 설계된 리포터 검사의 경우, 하류 리포터 유전자의 전사 조절 및 리포터 유전자에 의해 인코딩되는 리포터 단백질의 발현을 허용하기 위해, 조사할 핵산은 제 위치에서 리포터 플라스미드로 복제된다. 리포터 단백질은, 용이한 검출을 위해 리포터 플라스미드가 트랜스팩션되는 세포에 존재하는 내생적(endogenous) 단백질로부터 구별될 수 있어야 하고, 바람직하게는, 리포터 단백질의 발현은 쉽게 정량될 수 있어야 한다. 리포터 단백질은 적합한 검사에서 정량되고, 종종, 예컨대 촉진자 SV40과 같은 유비쿼터스 촉진자(ubiquitous promoter)에 의해 동작하는 대조군 리포터의 수준에 비례하여 발현된다. 대조군 리포터는 실험군 리포터로부터 구별될 수 있어야 하고, 일반적으로 실험 벡터와 동시 트랜스팩션되는(co-transfected) 별도 벡터상에 포함되며, 트랜스팩션 효율을 대조하기 위해 사용된다. 그러한 검사는, 세포들이 두 개의 벡터양을 비율적으로 동일하게 선택한다는 전제를 기초로 한다.
유전자 리포터 검사를 위한 많은 다양한 출원들은 화합물, 약품, 리간드, 호 르몬 등을 첨가한 이후 또는 적정 시간이 경과된 이후(over time) 유전자 발현의 변화를 측정하는 단계를 포함한다. 이는 약품 선별 시 매우 중요하다. 약품을 첨가한 후, 리포터 단백질의 수준에서 측정 가능한 변화를 검출하는 것은, 발현 수준의 변화가 mRNA를 통해 단백질로 전달되기 때문에 지연되고 희석될 수 있다. 최근의 그러한 출원에 비해 본 출원의 현저한 발전은, 리포터 벡터에서 mRNA- 및 단백질-불안정 원소를 조합 사용하여 감응의 속도 및 등급을 개선한다는 것이며, 이는 동시 계속 출원중인 미국 특허 출원 제10/658,093호에 기재된 바와 같고, 이의 개시 내용은 본 명세서에서 참고로 통합된다.
다양한 리포터 유전자 검사 시스템은 검출이 가능한 서로 다른 리포터 단백질들을 활용하는 것으로 시판중이며, 가장 일반적인 것으로는, 클로람페니콜 트랜스페라아제(chloramphenicol transferase, CAT), β 갈락토시다아제(β-gal), 형광 단백질들 및 루시페라아제들이 있다.
루시페라아제는 생체 외 검사 시스템에서 가장 일반적으로 사용되는 리포터 단백질이다. 루시페라아제는 생물 발광을 할 수 있는 효소이며 유기체의 범위에서 자연스럽게 발견된다. 시판중인 검사 시스템에서, 일반적으로, 루시페라아제는 기질로서 루시페린을 사용하는 것과 기질로서 코엘렌테라진(coelenterazine)을 사용하는 것으로 나누어진다. 전자의 가장 널리 사용되는 예는 반딧불이 루시페라아제 즉 세포내 효소이다. 루시페린을 사용하는 루시페라아제의 다른 예는 방아벌레나 철도 벌레(railroad worms)와 같은 갑충목의 다른 종류로부터의 유도된(derived) 것을 포함한다(예컨대 WO 2007/019634에 개시됨). 일반적으로, 코엘렌테라진을 사 용하는 루시페라아제는 연산호류 레닐라(soft coral Renilla) 또는 요각류 가우시아(copepod Gaussia)와 같은 해양성 유기체로부터 유도된다. 레닐라 루시페라아제는 세포내에 있는 반면, 가우시아 루시페라아제는 자연 상태에서 분비성 효소이다. 다른 분비성 루시페라아제는 메트리디아 롱가(Metridia longa), 바르굴라 힐겐도르피아이(Vargula hilgendorfii), 오플로포루스 그라실리로스트리스(Oplophorus gracilirostris), 플류로맘마 시피아스(Pleuromamma xiphias) 및 메트리딘 과(Metridinidae)의 다른 종류로부터의 루시페라아제들을 포함한다.
루시페라아제계 검사 시스템은, 일반적으로 서로 다른 기원이면서 각각 서로 다른 기질을 사용하는 하나 이상의 루시페라아제를 사용할 수 있고, 상기 루시페라아제는 실험군 리포터와 대조군 리포터 둘 모두 동일한 검사로 측정될 수 있다. 단일 표본에서 복수 개의 루시페라아제들에 의해 방출되는 신호들을 측정할 수 있는 것은, 단일 실험에서 다중 파라미터들을 측정할 수 있는 것과 함께 우수한 장점을 제공한다. 일반적으로, 인코딩된 루시페라아제 유형 및 각각의 루시페라아제의 발현을 제어하는 관심 조절 요소면에서 구분되는 2개의 서로 다른 리포터 유전자들은 단일 세포계(cell line)에 삽입된다.
예컨대, 추정 촉진자 원소는 반딧불이 루시페라아제 리포터 유전자의 상류에서 복제되어, 루시페라아제 유전자가 발현하도록 한다. 이러한 플라스미드는, SV40 촉진자에 의해 동작하는 레닐라 루시페라아제 유전자를 포함한 대조군 플라스미드와 함께, 일시적으로 세포계로 트랜스팩션된다. 제1 루시페린이 첨가되어 반딧불이 루시페라아제가 활성화되며, 이러한 리포터의 활성이 측정되고, 이후 "소멸 및 활 성화(quench and activate)" 시약이 첨가된다. 이러한 시약은 루시페린 신호를 "소멸시키는" 화합물 및 레닐라 루시페라아제를 활성화시키는 코엘렌테라진을 포함하고, 이후, 상기 레닐라 루시페라아제의 활성이 측정된다. 이러한 시스템의 일 예시로서 Promega사의 Dual-Glo 루시페라아제 검사법이 있다.
반딧불이 루시페라아제 활성의 수준은 촉진자 활성뿐만 아니라 트랜스펙션 효율에도 의존한다. 이러한 점은, DNA의 양, DNA 정제의 품질 및 세포들의 조건에 따라 크게 달라진다. 동시 트랜스팩션되는 대조군 플라스미드(SV40 촉진자와 같은 적합한 촉진자에 의해 동작하는 레닐라 루시페라아제)는, 레닐라 루시페라아제 활성이 세포들에 의해 선택된 반딧불이 루시페라아제 플라스미드의 양에 비례한다는 전제를 기초로 하여, 이러한 변수들을 보정하는 데에 사용된다. 다르게는 또는 추가적으로, 레닐라 루시페라아제는 세포수, 세포 생존력 및/또는 일반적 전사 활성과 같은 다른 변수들을 대조하기 위해 사용될 수 있다; 또는, 세포에 적용되는 특정한 처리나 화합물이 2개의 촉진자들에게 모두 영향을 미치는지, 아니면 상기 촉진자들 중 하나의 촉진자에 대해서만 특이적인지의 여부를 결정하는 데에 사용될 수 있다.
단일 표본에서 2개 이상의 루시페라아제의 신호를 구별하기 위한 다르게는 방법으로, 예컨대 TOYO B-net사의 Multicolor-Luc 검사법이 있는데, 상기 방법은, 동일한 기질(루시페린)에 작용하나 서로 다른 파장에서 광을 방출하는 3개의 서로 다른 딱정벌레 루시페라아제를 사용한다. 그러나, 이 경우, 서로 다른 신호들을 분리하기 위해 광학 필터들이 필요하며, 이러한 점으로 인해 루시페라아제마다 정량 될 수 있는 신호가 감소된다.
실험군 요소(예컨대, 촉진자)가 고감도 루시페라아제 시스템에 연결되도록 하는 이중 루시페라아제 검사 시스템을 사용하여, 약한 촉진자 또는 세포들을 트랜스팩션시키기 어려운 촉진자들을 사용하는 광범위한 다양한 응용들에 걸쳐 상기 검사 시스템이 충분한 신호 세기를 제공하도록 하는 것이 필요하다. 대조군 리포터에 있어 신호 강도는 별로 중요하지 않은데, 그 이유는, a) 대조군은 실험에 필수적이지 않고, b) SV40, RSV, EF1alpha 또는 CMV와 같은 강한 대조군 촉진자는 충분한 신호가 발생되도록 하기 위해 택일적으로 선택될 수 있기 때문이다. 바꾸어 말하면, (루시페라아제 단백질 또는 루시페라아제 유전자의 분자 마다) 약한 신호만을 발생하는 루시페라아제는, 검출 가능한 신호가 발생되게 하는 강한 대조군 촉진자와 선택적으로 조합될 수 있다. 이러한 가용성은 실험군 촉진자를 선택하는 것에는 해당되지 않는다.
이러한 맥락에서, 시판용 Dual-Glo 루시페라아제 검사(Promega)는 대조군 리포터를 위해서는 더욱 민감한 레닐라 루시페라아제를 사용하고, 실험군 리포터를 위해서는 덜 민감한 반딧불이 루시페라아제를 사용한다는 단점을 가진다. 또한, 상시 시스템은 반딧불이 신호를 1차로 측정할 필요가 있다.
시판용 Mulicolor-Luc 검사 시스템(TOYO B-net)는 반딧불이 루시페라아제보다 훨씬 낮은 감도를 가진 3개의 딱정벌레 루시페라아제들을 사용한다. 더욱이, 필터를 사용하지 않고는 개별 루시페라아제를 측정할 수 없는데, 이러한 점은 감도를 더 손실시킨다. 또한, 가장 일반적으로 사용되는 발광계는 다중 파장의 판별이 필 요한 프로토콜과 함께 사용될 수 없다.
일반적으로, 루시페라아제계 검사 시스템, 특히 하나 이상의 세포내 루시페라아제를 활용하는 검사 시스템은 용해 버퍼 및 검사 버퍼라는 2개 버퍼들을 사용한다. 용해 버퍼가 세포들에 첨가되어 우선 세포들이 용해되고, 이후 루시페라아제를 방출하여, 그 이후의 측정이 용이해진다. 이후, 루시페라아제 기질 및 임의의 공동 인자(cofactor)를 포함하는 검사 버퍼가 첨가되고, 그 후 루시페라아제 활성이 측정된다. 상기 측정은 검사 버퍼를 첨가한 직후(즉 수 초내에)(소위 "플래시(falsh)" 반응), 또는 검사 버퍼에서 연장된 시간 주기 동안 광 신호를 안정적으로 유지시키는 "글로우(glow)" 시약들을 사용하여 수 분이나 수 시간 후(소위 "글로우" 반응) 수행될 수 있다. 플래시 반응은 가장 강한 신호 강도(광 단위/초)를 제공하고, 그 결과 가장 높은 감도를 제공한다는 이점이 있다. 특히, 글로우 반응은, 예컨대 사용자가 쉽게 이용할 수 있는 적합한 발광계(luminometer)(주입기를 구비함)를 가지지 못한 경우, 또는 배치 공정(batch-processing)이 주입과 측정 사이의 지연을 필요로 하는 표준 고처리량(high throughput) 선별 응용 시 유리하다. 갑충목 루시페라아제를 위한 글로우 시약은 CoA 또는 DTT와 같은 티올기를 상기 시약 조성물에 포함함으로서 제조될 수 있다(예컨대 미국 특허 제5,650,289호 및 미국 특허 제5,641,641호 참조). DTT는 레닐라 루시페라아제의 글로우를 연장시키는 것으로 확인되었다(미국 특허 제6,171,809호).
루시페라아제 리포터 검사를 위한 종래의 버퍼들 및 시약들과 관련하여 많은 단점들이 있다.
특히, 루시페라아제 반응에서 개선된 감도, 즉 종래 시약으로 얻을 수 있는 것보다 큰 신호 강도를 제공하는 다중 루시페라아제 시스템을 포함하는 시약, 반응 조성물 및 키트가 필요하다. 이러한 점은, 검사할 리포터 유전자가 관심 세포들에서 낮은 수준의 루시페라아제만 제공하는 경우, 예컨대 연구할 촉진자가 낮은 활성만 가지는 경우 및/또는 상기 관심 세포들이 리포터 벡터와 트랜스팩션/변환되기 어려운 경우에, 특히 중요하다. 감도가 증가되면, 신뢰할만하게 측정될 수 있는 신호 강도를 산출해야 하는 세포의 최소 수가 줄어들어 리포터 검사의 최소화가 용이해질 것이다.
동시 계속 출원중인 미국 특허 출원 제10/658,093호에 기재된 바와 같은 불안정 원소를 포함하는 검사 시스템을 사용하는 경우, 안정 상태의 루시페라아제 신호가 감소한다. 따라서, 더 높은 신호 강도를 제공하는 시약은, 불안정 원소를 사용하는 리포터 검사 시스템을 위해 특히 유리할 것이다.
또한, 루시페라아제 신호의 신호 강도 또는 감도의 개선과 관련하여, 배경의 감소가 실제 루시페라아제 신호의 감소와 관련되지 않는다면, 배경 발광이 감소된 검사 시약은 신호대 잡음비 증가에 의해 성능을 개선할 것이다.
다중 웰 판에서 생물 발광을 정량하는 종래 방법은 웰들 사이에서 빛샘(light leakage)의 문제가 있을 수 있다. 빠르게 감쇄하는 신호는 이러한 예기치 않은 인공 음영(artefact)을 최소화하는 한편, 이후, 판독물로서 광 방출 또는 형광을 활용하는 추가적 파라미터들을 측정할 수 있도록 한다. 현재의 루시페라아제 검사 시스템을 이용하면, 소위 '플래시(flash)' 시약을 사용하더라도, 표준 수준의 광 방출이 측정 이후 오랫동안 지속된다. 플래시 반응의 목적은 검사 버퍼 주입 직후 광 방출을 측정하는 것이므로, 상기 신호는 유용하지 않다. 더욱이, 상기 지속되는 신호는 그 이후의 발광 또는 형광 측정을 방해할 수 있다. 표준 문맥에서 소멸 시약은 루시페라아제 신호를 종료시키기 위해 첨가될 수 있다. 그러나 이러한 추가적 피펫팅(pippetting) 단계가 필요없는 자가 종료 신호는 더욱 단순하고 바람직한 시스템을 제공할 것이다.
현재 루시페라아제 검사의 다른 한계는, 단일 표본에서 구별되고 측정될 수 있는 서로 다른 루시페라아제들의 수이다. 상기 기술된 바와 같이, 소멸 시약 및 방출 파장의 차는 2개 또는 3개의 서로 다른 루시페라아제들에 의해 발생되는 신호들을 분리하기 위해 사용되었다. 서로 다른 루시페라아제들로부터의 신호를 분리하는 추가적 수단은, 4개 이상의 서로 다른 루시페라아제들을 측정할 수 있는 검사 시스템을 구현하고, 따라서, 단일 표본에서 4개 이상의 서로 다른 파라미터들을 분석할 수 있을 것이다. 서로 다른 다중 루시페라아제들을 동시에 측정하기 위해, 서로 다른 루시페라아제들의 활성을 지지할 수 있는 시약 시스템이 필요하다. 또한, 복수 개의 서로 다른 루시페라아제들의 순차적 활성 및 측정을 가능하게 하기 위해, 제1 루시페라아제 반응을 종료시키면서 그 이후의 루시페라아제 반응을 방해하지 않는 시약 시스템이 필요하다.
본 발명은 일반적으로 표본에서 루시페라아제 효소의 양 또는 활성을 결정하는 데에 사용되는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 부분적으로, DTT와 같은 환원제 및 티올이 자연형에서 분비되는 루시페라아제로부터 발생된 발광의 주기를 현저히 단축시킨다는 본 발명자의 대단한 발견에 근거한다. 또한, 본 발명자는 자연적으로 분비되는 그러한 루시페라아제들이 환원제에 의해 비활성화되는 것은 시간에 의존한다는 것을 대단히 확신하였다. 비활성화의 지연은, 발광 신호가 손실되기 전에 (예컨대 플래시 반응에서) 발광을 측정할 수 있는 좋은 기회를 제공한다. 따라서, 본 발명의 실시예는 더 높은 감도 (더 강한 플래시상 및/또는 더 낮은 배경 신호)를 발생할 수 있고, 현재 이용 가능한 루시페라아제 검사 방법들 및 시약 조성물을 이용하여 얻을 수 있는 것보다 빠른 분비성 루시페라아제 발광 신호 감쇄율을 구현한다.
따라서, 본 발명은 다중 루시페라아제(즉 2중 및 3중 루시페라아제) 검사에서 발광을 측정하는 신규한 접근법도 제공한다. 이러한 방법은 이미 유전자 리포터 검사에서 응용되었다. 그러나 다른 분야에서도 상기 방법의 유용성은 명백하다. 예컨대, 루시페라아제는 항체들을 표지(label)(예컨대 면역 세포 화학의 경우)하거나, 단백질들을 표지(예컨대 BRET 검사의 경우)하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 루시페라아제를 실험에 따라 그리고 선택적으로 스위치 온 및/또는 스위치 오프할 수 있는 경우, 단일 표본에서 서로 다른 다중 루시페라아제 표지들이 사용될 수 있다. BRET 검사의 경우, 밀접한 형광 단백질로부터의 형광을 활성화하기 위해 청색 광을 방출하는 루시페라아제들이 선호되고 사용된다. 본 발명은 청색 광을 방출하는 2개의 서로 다른 루시페라아제들로부터의 발광을 구별하거나 조작하는 수단을 제공하여 다중 BRET 검사를 용이하게 한다.
본 발명의 제1 양태는 표본에서 하나 이상의 루시페라아제들에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 표본을 분석될 루시페라아제(들)의 반응 기질(들) 및 환원제와 배양하여 제1 루시페라아제를 비활성화시키는 단계를 포함하며, 이 때 제1 루시페라아제는 자연형에서 분비성 루시페라아제이다.
제1 루시페라아제의 비활성화는 루시페라아제의 촉매 활성을 억제하거나 제거하는 단계 및/또는 상기 루시페라아제를 비활성 형태(conformation)로 변환하는 단계를 포함할 수 있다.
제1 루시페라아제는 자연형에서 분비되는 루시페라아제의 비분비성 개질형일 수 있다. 제1 루시페라아제는 기질로서 코엘렌테라진을 사용할 수 있다. 제1 루시페라아제는 기질로서 코엘렌테라진을 사용하고 해양성 기원일 수 있다. 해양성 기원의 루시페라아제는 가우시아 속, 플류로맘마 속, 메트리디아 속, 키프리디나 속 또는 오플로포루스 속으로부터 유도될 수 있거나, 이들의 변이체(variant) 또는 유도체(derivative)이다.
환원제는 티올기를 포함할 수 있다. 환원제는 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT), 디티오에리트레이톨(dithioerythreitol, DTE), β-메르캅토에탄올, 시스테아민, 아황산나트륨(sodium sulphite) 및 트리스(2-카르복실에틸)포스핀(TCEP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 환원제는 DTT일 수 있다.
일 실시예에서, 제1 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호가 측정된다. 이러한 실시예에서, (i) 제1 루시페라아제의 반응 기질이 환원제와 함께 동시에 첨가될 수 있거나, (ⅱ) 제1 루시페라아제의 반응 기질이 표본에 첨가될 수 있고, 제1 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호가 환원제의 첨가 이전에 측정되거나, (ⅲ) 상기 제1 루시페라아제의 반응 기질보다 먼저 환원제가 표본에 첨가될 수 있고, 제1 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호가 상기 제1 루시페라아제가 환원제에 의해 비활성화되기 전에 측정된다.
일 실시예에서, 하나 이상의 루시페라아제는 재조합형 리포터 유전자로부터 발현된다. 발광 신호는 리포터 유전자 검사의 일부분으로서 측정될 수 있다.
표본은 하나 이상의 세포내 루시페라아제를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 세포내 루시페라아제는 갑충목 또는 쌍시류 종들로부터 유도될 수 있다.
표본이 하나 이상의 세포내 루시페라아제를 포함하는 경우, 환원제는 세포내 루시페라아제의 반응 기질이 첨가되기 전에 표본에 첨가될 수 있어서, 세포내 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호가 측정되기 전에 제1 루시페라아제가 비활성화된다. 세포내 루시페라아제는 환원제에 의해 활성화될 수 있다. 세포내 루시페라아제로부터의 광 방출 주기는 환원제에 의해 연장될 수 있다. 제1 및 제2 루시페라아제는 서로 동일하거나 다른 기질을 사용할 수 있다. 예컨대, 제1 루시페라아제는 기질로서 코엘렌테라진을 사용할 수 있고, 세포내 루시페라아제는 기질로서 루시페린을 사용할 수 있거나, 또는 제1 루시페라아제 및 세포내 루시페라아제 둘 모두 기질로서 코엘렌테라진을 사용할 수 있다.
표본은 2개 이상의 세포내 루시페라아제들을 포함할 수 있다. 2개 이상의 세포내 루시페라아제들에 의해 발생되는 발광 신호는 서로 다른 파장으로 생성될 수 있다.
본 발명의 제2 양태는, 표본에서 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 방법을 제공하며, 이 때 루시페라아제는 자연형에서 분비성 루시페라아제이며, 본 방법은:
(a) 상기 표본을 루시페라아제의 반응 기질과 접촉시키는 단계;
(b) 시간에 따라 상기 루시페라아제를 비활성화시키는 환원제와 상기 표본을 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 루시페라아제가 상기 환원제에 의해 비활성화되기 전에 상기 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
루시페라아제는 자연형에서 분비되는 루시페라아제의 비분비성 개질형일 수 있다.
표본은 환원제보다 먼저 반응 기질과 접촉되거나, 반응 기질 및 환원제와 동시에 접촉될 수 있다.
본 발명의 제3 양태는, 표본에서 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호를 측정하는 방법을 제공하고, 이 때 상기 루시페라아제는 자연형에서 분비성 루시페라아제이며, 본 방법은:
(a) 상기 표본을 루시페라아제의 반응 기질과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호를 측정하는 단계; 및
(c) 이후, 시간에 따라 상기 루시페라아제를 비활성화시키는 환원제와 상기 표본을 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제4 양태는, 표본에서 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호를 측정하는 방법을 제공하며, 이 때 루시페라아제는 자연형에서 분비성 루시페라아제이고, 본 방법은:
(a) 시간에 따라 상기 루시페라아제를 비활성화시키는 환원제와 상기 표본을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 표본을 상기 루시페라아제의 반응 기질과 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 환원제에 의해 상기 루시페라아제가 비활성화되기 전에 상기 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제5 양태는, 표본에서 제1 및 제2 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호를 측정하는 방법을 제공하며, 이 때 제1 루시페라아제는 자연형에서 분비성 루시페라아제이고, 제2 루시페라아제는 세포내 루시페라아제이며, 본 방법은:
(a) 상기 표본을 제1 루시페라아제의 반응 기질과 접촉시키는 단계;
(b) 제1 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호를 측정하는 단계;
(c) 시간에 따라 상기 제1 루시페라아제를 비활성화시키는 환원제와 상기 표본을 접촉시키는 단계;
(d) 상기 표본을 상기 제2 루시페라아제의 반응 기질과 접촉시키는 단계; 및
(e) 상기 제2 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
(d) 및 (e) 단계는 (a) 내지 (c) 단계보다 선행할 수 있어서, 제1 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하기 전에 제2 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호가 측정된다.
(b) 단계는 (a) 및 (c) 단계 이후 수행될 수 있어서, 제1 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하기 전에 상기 표본은 상기 환원제와 접촉된다.
표본은 제1 루시페라아제보다 먼저 환원제와 접촉되거나 동시에 접촉될 수 있다.
본 발명의 제6 양태는, 제1 및 제2 루시페라아제를 포함하는 표본에서 제2 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호를 측정하는 방법을 제공하며, 이 때 제1 루시페라아제는 자연형에서 분비성 루시페라아제이고, 제2 루시페라아제는 세포내 루시페라아제이며, 본 방법은:
(a) 시간에 따라 제1 루시페라아제를 비활성화시키는 환원제와 상기 표본을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 표본을 제2 루시페라아제의 반응 기질과 접촉시키는 단계; 및
(c) 제2 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
표본은 제3 루시페라아제를 더 포함할 수 있다. 제3 루시페라아제는 세포내 루시페라아제일 수 있다. 제2 및 제3 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호는 서로 다른 파장으로 생성될 수 있다. 제2 루시페라아제는 갑충목종(Coleoptera species)으로부터, 제3 루시페라아제는 쌍시류종(Diptera species)으로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 제7 양태는, 자연형에서 분비성인 루시페라아제를 비활성화시키기 위한 방법을 제공하고, 본 방법은 상기 루시페라아제를 포함하는 표본을 환원제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
루시페라아제는 자연형에서 분비되는 루시페라아제의 비분비성 개질형일 수 있다.
루시페라아제의 비활성화는 루시페라아제의 촉매 활성을 억제하거나 제거하는 단계 및/또는 루시페라아제를 비활성 형태로 변환하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 제8 양태는, 자연형에서 분비성인 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호의 감쇄율을 증가시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 상기 루시페라아제를 포함하는 표본을 환원제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제9 양태는, 표본에서 하나 이상의 루시페라아제들에 의해 발생되는 발광 신호를 측정하는 방법을 제공하고, 본 방법은 분석될 루시페라아제(들)의 반응 기질(들) 및 시약 조성물과 함께 상기 표본을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 시약 조성물은 제1 루시페라아제를 비활성 형태로 용이하게 변환하는 데에 적합한 환경을 제공하며, 이때 제1 루시페라아제는 자연형에서 분비성 루시페라아제이다.
본 발명의 제10 양태는 표본에서 2개 이상의 루시페라아제들의 양 또는 활성을 결정하는 방법을 제공하고, 본 방법은:
(a) 시간에 따라 제1 루시페라아제를 비활성화시키는 환원제의 유효량을 상기 표본에 첨가하는 단계;
(b) 표본에서 발광 신호를 측정하는 단계;
(c) 제1 루시페라아제의 발광 신호가 감소하는 시간 주기를 기다리는 단계;
(d) 표본에서 발광 신호를 측정하는 단계; 및
(e) 상기 (b) 및 (d) 단계의 결과에 근거한 각각의 루시페라아제의 발광 신호 및 각각의 발광 신호의 서로 다른 감쇄율을 산출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제11 양태는 표본에서 제1 및 제2 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법을 제공하며, 본 방법은
(a) 시간에 따라 제1 루시페라아제를 비활성화시키면서 제2 루시페라아제를 비활성화시키지 않는 환원제, 및 상기 제1과 제2 루시페라아제를 위한 반응 기질을 상기 표본과 접촉시키는 단계;
(b) 제1 루시페라아제가 환원제에 의해 비활성화되기 전에 발광 신호를 측정하는 단계;
(c) 제1 루시페라아제가 비활성화된 이후 발광 신호를 측정하는 단계; 및
(d) 상기 (b) 및 (c) 단계에서 수집된 데이터를 이용하여 각각의 루시페라아제의 양 또는 활성을 서로에 대해 또는 다른 표본에 대해 산출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제12 양태는 표본에서 제1 및 제2 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법을 제공하고, 본 방법은
(a) 시간에 따라 제1 루시페라아제를 비활성화시키면서 제2 루시페라아제를 비활성화시키지 않는 환원제 및 제1 루시페라아제를 위한 반응 기질을 상기 표본과 접촉시키는 단계;
(b) 제1 루시페라아제가 비활성화되기 전에 발광 신호를 측정하는 단계;
(c) 제2 루시페라아제를 위한 반응 기질과 상기 표본을 접촉시키는 단계;
(d) 제1 루시페라아제가 비활성화된 이후 발광 신호를 측정하는 단계; 및
(e) 상기 (b) 및 (c) 단계에서 수집된 데이터를 이용하여 각각의 루시페라아제의 양 또는 활성을 서로에 대해 또는 다른 표본에 대해 산출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제13 양태는 표본에서 하나 이상의 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법을 제공하고, 본 방법은 분석될 루시페라아제(들)의 반응 기질(들) 및 환원제와 함께 상기 표본을 배양하여 제1 루시페라아제를 비활성화하고, 이 때 제1 루시페라아제는 자연형에서 분비성 루시페라아제이다.
본 발명의 양태 및 실시예들에 따르면, 발광 신호의 측정 전에 표본에는 세포 용해 단계가 수행될 수 있다. 표본에는 루시페라아제 기질(들)의 첨가 전에 세포 용해 단계가 수행될 수 있다. 표본에는 환원제의 첨가 전에 세포 용해 단계가 수행될 수 있다. 환원제는 세포 용해 버퍼에서 존재할 수 있다.
본 발명의 양태 및 실시예들에 따르면, 발광 신호는 루시페라아제(들)을 발현하는 세포들이 배양된 조건 배지(conditioned medium)를 이용하여 측정될 수 있다.
본 명세서에는 표본에서 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 데에 사용되기 위한 시약 조성물도 개시되며, 시약 조성물은 루시페라아제로부터의 발광 신호를 향상시키고 및/또는 발광 신호 감쇄율을 증가시킨다. 일반적으로, 루시페라아제가 있는 경우, 시약 조성물은 루시페라아제를 비활성 형태로 용이하게 변환하기에 적합한 환경을 제공한다. 일반적으로, 변환은, 상기 변환 전에 발광 신호가 측정될 수 있을 만큼의 시간프레임(timeframe)에서 일어난다. 일반적으로, 변환은, 발광 신호가 시작된 후, 약 1초 이상 후, 약 5초 이상 후 또는 약 10초 이상 후에 뚜렷할 수 있다. 일반적으로, 변환은 적정 시간 경과 후(over time)에도 진행된다.
또한 본 명세서에는, 표본에서 루시페라아제의 양 및/또는 활성을 결정하는 데에 사용되기 위한 시약 조성물도 개시되며, 루시페라아제가 있을 때, 시약 조성물은 상기 루시페라아제를 비활성 형태로 용이하게 변환하는 데에 적합한 산화 환원 환경을 제공한다. 일반적으로, 시약 조성물에 의해 제공되는 환경은 활성 루시페라아제가 비활성 형태로의 더 빠른 변환 또는 덜 활성인 형태의 사용 또는 유지를 용이하게 한다. 다르게는 또는 추가적으로, 이러한 환경은 비활성 형태를 사용하는 루시페라아제의 비율이 증가함에 따라, 표본에서 루시페라아제의 전체 활성을 감소시킬 수 있다. 일반적으로, 시약 조성물은 하나 이상의 적합한 환원제를 포함한다. 일반적으로, 환원제는 루시페라아제를 환원시켜 시간 의존적 방식으로 루시페라아제가 비활성 형태를 사용하는 것을 용이하게 한다. 따라서, 상기 제재가 없는 경우에 대한 상기 제재가 있는 경우의(+제재/-제재) 신호 세기 비율은 적정 시간 경과 후 감소하는 것이 일반적이다. 예컨대, 상기 비율은 시약 조성물과 루시페라아제를 접촉시킨 이후 1초 후보다 10분후일 때 더 낮다.
또한 본 명세서에는, 하나 이상의 루시페라아제의 양 및/또는 활성을 검사하는 데에 사용되기 위한 키트도 개시되며, 본 키트는 하나 이상의 시약 조성물을 포함하고, 상기 시약 조성물은 하나 이상의 루시페라아제가 비활성 형태로 용이하게 변환되기에 적합한 환경을 제공한다.
또한 본 명세서에는 하나 이상의 루시페라아제의 양 및/또는 활성을 검사하는 데에 사용되기 위한 키트도 개시되며, 본 키트는 하나 이상의 시약 조성물을 포함하고, 상기 시약 조성물은 하나 이상의 루시페라아제가 비활성 형태로 펴지는 것(unfolding)을 촉진하기에 적합한 산화 환원 환경을 제공한다.
또한 본 명세서에는 표본에서 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 데에 사용되기 위한 시약 조성물도 개시되며, 본 시약 조성물은 하나 이상의 환원제를 포함한다.
또한 본 명세서에는 표본에서 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 데에 사용되기 위한 시약 조성물도 개시되며, 본 시약 조성물은 하나 이상의 환원제 또는 산화제와 환원제의 혼합물을 포함한다. 일반적으로, 상기 제재들은 루시페라아제를 환원시켜, 루시페라아제에 의한 비활성 형태의 사용을 용이하게 한다.
상기에 따르면, 시약 조성물은 하나 이상의 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 그러한 추가 성분은 예컨대 2가 금속 킬레이터(divalent metal chelators), 항산화제, 프로테아제 억제제, 염, 세제 또는 추가 버퍼 성분들로부터 선택될 수 있다. 2가 금속 킬레이터는 예컨대 EDTA, CDTA 및 EGTA로부터 선택될 수 있다. 일 실시예에서, 2가 금속 킬레이터는 EDDTA이며, 약 1 mM 과 약 15 mM 사이의 농도로 존재한다. 시약 조성물은 루시페라아제의 활성을 측정하는 데에 사용되는 검사 시약 또는 버퍼 형태일 수 있다. 따라서, 검사 버퍼는 완충제와 같은 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 완충제는 예컨대 트리스(Tris), 헤페스(Hepes) 또는 인산 버퍼일 수 있다. 시약 조성물은 루시페라아제 기질을 더 포함할 수 있다. 이러한 기질은 예컨대 루시페린 또는 코엘렌테라진일 수 있다. 특정한 실시예에서, 기질은 코엘렌테라진 또는 상기 코엘렌테라진의 유도체이다. 예컨대, 코엘렌테라진 또는 상기 코엘렌테라진의 유도체는 약 2 uM 초과, 약 5 uM 초과, 약 10 uM 초과, 약 15 uM 초과, 약 20 uM 초과 또는 약 25 uM 초과의 농도로 존재할 수 있다.
일반적으로, 루시페라아제에 의해 발생되는 생물 발광 신호는 일시적(short-lived)이며 기질의 첨가 이후 약 15분 내에 거의 배경 수준로 감소한다. 더욱 일반적으로, 신호는 기질의 첨가 이후 약 15분내에, 기질의 첨가 이후 약 10분내에, 또는 기질의 첨가 이후 약 5분내에 초기 신호의 약 1%보다 더 적도록 감소한다. 일반적으로, 생물 발광 신호는 기질 첨가 이후 수초내에부터, 기질 첨가 이후 약 60분내에, 기질 첨가 이후 약 30분내에, 기질 첨가 이후 약 15분내에, 기질 첨가 이후 약 10분내에 또는 기질 첨가 이후 약 5분내에 초기 신호의 약 0.1%보다 더 적은 수준으로 감소한다.
또한, 본 명세서에는 표본에서 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 데에 사용되기 위한 시약 조성물도 개시되며, 본 시약 조성물은 DTT 및 코엘렌테라진을 포함하고, 이 때 루시페라아제는 기질로서 코엘렌테라진을 사용한다.
또한 본 명세서에는 표본에서 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법도 개시되며, 본 방법은: (a) 제1, 제2, 제5, 제6 또는 제7 양태 중 어느 하나의 양태에 따른 시약 조성물의 유효량을 상기 표본에 첨가하는 단계; 및 (b) 표본에서 생물 발광을 검출하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에는 루시페라아제 반응의 배경 신호를 감소시키거나 신호대 잡음비를 증가시키기 위한 방법도 개시되며, 본 방법은 적합한 산화 환경뿐만 아니라 루시페라아제를 위한 기질도 포함하는 시약 조성물의 유효량과 상기 루시페라아제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 시약 조성물은 하나 이상의 환원제 또는 산화제와 환원제의 혼합물을 포함한다.
또한 본 명세서에는 루시페라아제 효소에 의해 발생되는 생물 발광 신호의 감쇄율을 증가시키는 방법도 개시되며, 본 방법은 시약 조성물의 유효량과 루시페라아제를 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때 시약 조성물은 상기 루시페라아제가 비활성 형태로 용이하게 변환하기에 적합한 산화 환원 환경을 제공한다.
또한 본 명세서에는 표본에서 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법도 개시되며, 본 방법은 (a) 루시페라아제를 발현하는 세포들을 제공하는 단계; (b) 루시페라아제 효소의 기질을 포함하고, 상기 루시페라아제를 비활성 상태 또는 형태로 용이하게 변환하기에 적합한 시약 조성물을 첨가하는 단계; 및 (c) 활성 루시페라아제에 의해 발생된 생물 발광 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에는 표본에서 2개의 루시페라아제들의 양 또는 활성을 결정하는 방법도 개시되며, 본 방법은:
(a) 제8 또는 제10 양태에 따른 제1 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 단계; (b) 제1 루시페라아제의 발광 신호가 실질적으로 감소하도록 하는 시간 주기를 기다리는 단계; (c) 제2 루시페라아제를 위한 제2 기질을 첨가하는 단계; 및 (d) 제2 루시페라아제에 의해 발생되는 생물 발광 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 표본에서 2개 이상의 루시페라아제들의 양 또는 활성을 결정하기 위해서도 응용될 수 있으며, 이러한 방법은 각각의 추가적 루시페라아제를 위해 (c) 및 (d) 단계를 반복하는 단계 또는 (d) 단계만을 반복하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에는 표본에서 2개의 루시페라아제들의 양 또는 활성을 결정하는 방법도 개시되며, 본 방법은: (a) 각각의 루시페라아제를 위한 생물 발광 신호의 감쇄율이 서로 다른 상기 2개의 루시페라아제들로부터 생물 발광 신호를 발생하기 위해 적합한 시약 조성물의 유효량을 상기 표본에 첨가하는 단계; (b) 표본에서 발광 신호를 측정하는 단계; (c) 제1 루시페라아제의 발광 신호가 감소하도록 하는 시간 주기를 기다리는 단계; (d) 표본에서 발광 신호를 측정하는 단계; 그리고 (e) 상기 (b) 및 (d) 단계의 결과에 근거를 둔 각각의 루시페라아제의 발광 신호 및 각각의 발광 신호의 서로 다른 감쇄율을 산출하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에는 표본에서 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법도 개시되며, 본 방법은 루시페라아제의 반응 기질 및 상기 루시페라아제의 촉매 활성을 시간에 따라 감소시키거나 비활성화시키는 제재를 포함하는 시약 조성물과 상기 표본을 접촉시키는 단계; 및 (b) 루시페라아제의 촉매 활성이 상기 제재에 의해 감소되거나 비활성화되기 전에 발광 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에는 표본에서 제1과 제2 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법도 개시되며, 본 방법은 상기 제1과 제2 루시페라아제를 위한 기질뿐만 아니라, 상기 제1 루시페라아제의 촉매 활성을 시간에 따라 감소시키거나 비활성화하면서 제2 루시페라아제의 촉매 활성은 감소시키거나 비활성화하지 않는 제재도 포함하는 제1 시약 조성물과 상기 표본을 접촉시키는 단계; (b) 제1 루시페라아제의 촉매 활성이 상기 제재에 의해 감소되거나 비활성화되기 전에 발광 신호를 측정하는 단계; (c) 제1 루시페라아제의 촉매 활성이 상기 제재에 의해 감소되거나 비활성화된 이후 발광 신호를 측정하는 단계; 그리고 (d) 상기 (b) 및 (c) 단계에서 수집된 데이터를 이용하여 각각의 루시페라아제의 양 또는 활성을 서로에 대해 또는 다른 표본에 대해 산출하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에는 표본에서 제1 및 제2 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법도 개시되며, 본 방법은 (a) 제1 루시페라아제를 위한 기질, 및 상기 제1 루시페라아제의 촉매 활성은 시간에 따라 감소시키거나 비활성화하면서 제2 루시페라아제의 촉매 활성은 감소시키거나 비활성화하지 않는 제재를 포함하는 제1 시약 조성물과 상기 표본을 접촉시키는 단계; (b) 제1 루시페라아제의 촉매 활성이 제재에 의해 감소되거나 비활성화되기 전에 발광 신호를 측정하는 단계; (c) 제2 루시페라아제를 위한 기질을 포함하는 제2 시약 조성물과 상기 표본을 접촉시키는 단계; (d) 제1 루시페라아제의 촉매 활성이 상기 제재에 의해 감소되거나 비활성화된 이후 발광 신호를 측정하는 단계; 그리고 (e) 상기 (b) 및 (c) 단계에서 수집된 데이터를 이용하여 각각의 루시페라아제의 양 또는 활성을 서로에 대해 또는 다른 표본에 대해 산출하는 단계를 포함한다.
이제, 본 발명의 실시예들은 수반되는 도면들을 참조하여 예시적으로만 설명될 것이다.
도 1은 3개의 서로 다른 환원제가 다양한 농도로 존재할 때 비분비성 가우시아 루시페라아제의 경우, 적정 시간 경과 후에 상대적 광 단위(RLU)로 생물 발광의 동적 특성을 도시한다.
도 2는 다양한 농도로 DTT가 있을 때 비분비성 가우시아 루시페라아제의 경우, 적정 시간 경과 후에 상대적 광 단위(RLU)로 생물 발광의 동적 특성을 도시한다. 데이터는 2개의 진행 시간 즉 180초까지(A) 및 33분까지(B)의 진행 시간에 걸쳐 제공된다.
도 3은 분비성 및 비분비성 가우시아 루시페라아제로부터의 생물 발광 신호에 미치는 DTT (50 mM)의 효과를 도시한다.
도 4는 50 mM의 DTT가 있을 때 레닐라 루시페라아제의 경우 적정 시간 경과 후에 상대적 광 단위(RLU)로 생물 발광의 동적 특성을 도시한다.
도 5는 다양한 농도의 DTT가 있을 때 비분비성 가우시아 루시페라아제(A), 분비성 가우시아 루시페라아제(B), 비분비성 메트리디아 루시페라아제(C) 및 분비성 메트리디아 루시페라아제(D)의 경우에 적정 시간 경과 후 초당 계수(count per second:CPS)로 광 방출을 도시한다. 데이터는 120분까지 제공된다.
도 6은 다양한 농도의 환원제들이 있을 때 비분비성 메트리디아 루시페라아제(A 내지 C) 및 비분비성 가우시아 루시페라아제(D 내지 G)의 경우 적정 시간 경 과 후 초당 계수(CPS)로 광 방출을 도시하며, 환원제로는 디티오에리트리톨(DTE)(A 및 D); 아황산나트륨(sodium sulfite)(B); 시스테아민(C 및 E); TCEP (F); 및 β-메르캅토에탄올(G)이 사용된다. 데이터는 120분까지(A 내지 C), 그리고 50 분까지(D 내지 G)로 제공된다.
도 7은 먼저 시작된 반응의 글로우 상 동안 DTT가 첨가되는 경우 비분비성 가우시아 루시페라아제로부터의 생물 발광 신호에 미치는 DTT의 효과를 도시한다.
도 8은 비분비성 가우시아 루시페라아제 및 반딧불이 루시페라아제를 발현하는 세포들에서 2중 루시페라아제 검사로부터 얻은 생물 발광(RLU)을 도시하며, LB는 가우시아 루시페라아제 검사 버퍼 첨가 직전에 측정된 신호; Ga는 가우시아 루시페라아제 검사 버퍼의 첨가 직후 측정된 신호; 15'는 가우시아 루시페라아제 검사 버퍼의 첨가 후 15분 후에(반딧불이 검사 버퍼의 첨가 직전) 측정된 신호; FF는 반딧불이 루시페라아제 검사 버퍼의 첨가 후 1초 후에 측정된 신호를 나타낸다.
도 9는 종양 괴사 인자(TNF) 또는 포르스콜린(forskolin)이 있는 경우 환식(cyclic) AMP 감응 요소 조절하의 불안정 반딧불이 루시페라아제(CRE-FF) 또는 다중 탄뎀(tandem) NFkB-결합 영역에 의해 동작하는 불안정 세포내 가우시아 루시페라아제(NFkB-Ga) 또는 이들 둘 모두를 발현하는 세포들로부터의 루시페라아제 활성(RLU)을 도시한다.
도 10A는 비분비성 가우시아 루시페라아제(Ga)를 포함하거나, 레닐라 루시페라아제(Rn)를 포함하는 세포 용해물, 또는 두 개의 루시페라아제들이 혼합된 용해물(lysate)(Ga&Rn)에서 0초(t=0) 및 1200초(t=1200)의 경우 루시페라아제 활 성(RLU)을 도시한다. 도 10B는 예 10에 기술된 바와 같이 정의된, 도 10A의 비분비성 가우시아 루시페라아제를 위한 예상 활성 및 측정된(산출된) 활성을 비교한다.
도 11은 CMV-동작 가우시아 루시페라아제(Ga 또는 CMV-가우시아) 및 TRE-동작 비분비성 레닐라 루시페라아제(Rn 또는 TRE-레닐라)를 발현하는 세포들로 이루어진 조건 배지 및 세포 용해물에서 루시페라아제 활성(RLU)을 도시한다. 도 11A 및 11C는 DTT를 포함하지 않은 용해 버퍼를 이용하고, 도 11B 및 11D는 DTT를 포함하는 용해 버퍼를 이용한다. 도 11A 및 11B는 독시사이클린(doxycycline) 처리를 포함하지 않는 단일 시점으로부터의 데이터를 나타내고, 도 11C 및 11D는 -독시사이클린에 대한 +독시사이클린으로 표현되는 모든 시점으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 12는 다양한 농도의 DTT가 비분비성 가우시아 루시페라아제로부터의 배경 발광 신호(도 12A, 12B) 및 플래시 세기(도 12C)에 미치는 효과를 도시한다.
도 13은 DTT, TCEP 또는 β-메르캅토에탄올(b-ME)라는 환원제가 있는 경우와 없는 경우에, 22시간 숙성한 검사 버퍼에서 비분비성 가우시아 루시페라아제로부터 발생된 생물 발광 신호 세기(RLU)를 새로운 검사 버퍼에서의 신호 세기의 백분율로서 도시한다.
도 14는 다양한 비율의 산화:환원 글루타티온이 있는 경우에, 사용전 4시간 동안 보관된 검사 버퍼(4h AB)와 새로운 검사 버퍼(AB)에서 비분비성 가우시아 루시페라아제의 세포 용해물에서의 발광(RLU)을 도시한다.
도 15는 3:2 비율의 환원:산화 글루타티온이 다양한 농도로 있는 경우, 사용 전 22시간 동안 4℃에서 보관된 검사 버퍼, 사용전 7시간 동안 실온(RT)에서 보관된 검사 버퍼 또는 새로운 검사 버퍼에서 비분비성 가우시아 루시페라아제의 세포 용해물에서의 활성(RLU)을 도시한다.
본 명세서 및 이하 청구 범위를 통틀어, 문맥이 별도로 요구하지 않는 한, "포함하다(comprise)" 라는 단어 및 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 활용 표현은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들이나 단계들로 이루어진 군을 포함한다는 것으로 해석되나, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수들이나 단계들로 이루어진 그룹을 배제하는 것으로 해석되지는 않을 것이다.
본 명세서에서, 관사 "하나" 및 "한"은 상기 관사의 하나 또는 하나 이상인(즉 적어도 하나의) 문법적 대상을 지시하는 데에 사용된다. 예컨대, "한 요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본 명세서에서 하나의 형태로부터 다른 형태로 루시페라아제 효소를 변환하는 문맥에서 사용된 바와 같이, "용이하게 하다"라는 용어는 제재가 그러한 변환을 가능하게 하고, 생성하고, 허용하거나 촉진한다는 의미이다. 따라서, 루시페라아제의 비활성 형태로의 변환을 용이하게 한다는 것은, 수동적 또는 능동적일 수 있고, 직접적 또는 간접적일 수 있다. 예컨대, 제재는 비활성 형태로의 루시페라아제 변환이 수행될 수 있는 적합한 환경을 제공할 수 있다. 또는, 제재는 그러한 변환을 직접적 또는 간접적으로 촉진하거나, 그렇지 않으면 그러한 변환을 생성하거나 발생시킬 수 있다. 일반적으로, 루시페라아제 효소의 변환을 "용이하게 하는" 제재 는, 상기 제재가 결핍된 상태에서 관찰되는 것보다 더욱 효율적인 변환을 제공하는 것을 말한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "변환"이란 용어는 활성/비활성 상태 또는 형태를 얻을 때 루시페라아제 효소의 접힘/펴짐 또는 다른 변형을 가리킨다. 또한, 비활성 형태로의 루시페라아제의 변환은, 활성 상태 또는 형태로부터 비활성인 상태 또는 형태로의 변환, 또는 부분적으로 활성이거나 더욱 활성인 상태 또는 형태로부터 덜 활성인 상태 또는 형태로의 변환을 의미할 때 참조된다. 이러한 문맥에서 "형태"란 용어는 상기 용어의 범위내에서, 효소에 의해 사용된 구조(예컨대 3차 또는 4차 구조)를 가리키며, 반응에 촉매 역할을 하여 기질의 첨가하에 생물 발광 신호를 발생하는 효소의 능력과 연관된다.
루시페라아제의 생물 발광 신호 세기의 문맥에서 사용된 바와 같은 "향상"이란 용어는, 어떠한 제재 또는 시약 조성물이 없고 및/또는 종래의 조성물이 있는 경우 얻어지는 것에 비해 신호 세기 또는 신호대잡음비가 양적 또는 질적으로 향상되거나 증가하는 것을 의미한다. 이와 유사하게, "감쇄율 증가"란 용어는 상기 제재 또는 시약 조성물이 없고 및/또는 종래의 조성물이 있는 경우 얻어지는 것에 비해 증가한 생물 발광 신호 감쇄율을 가리키는 데에 사용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "유효량(effective amount)" 이란 용어는 상기 용어의 의미내에서 소기의 효과를 제공하기에 충분한 시약 조성물의 양을 의미한다. 정확한 필요량은 분석될 표본의 성질, 사용된 루시페라아제 효소 및 상기 루시페라아제가 세포내에 있는지 분비된 것인지의 여부, 그리고 사용된 시약 또는 조성물의 성분과 같은 인자들에 의존하여, 경우에 따라 달라질 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 명기할 수 없다. 그러나, 임의의 경우, 적합한 "유효량"은 정규 실험만을 이용하는 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "비분비성 루시페라아제"라는 용어는 세포로부터 세포외 환경으로 배출(exported) 또는 분비되지 않은 루시페라아제를 의미한다. 따라서, "비분비성"은 세포에서 임의의 형태로 존속하는 루시페라아제를 포함하므로, 루시페라아제는 세포질이거나 막-결합체(membrane-associated)일 수 있다. 비록 배타적이진 않으나 일반적으로, 본 명세서에서 루시페라아제가 자연형에서 분비되는 루시페라아제의 "비분비"형을 가리킬 때, 상기 분비 및 분비의 결핍은 진핵 생물 세포를 가리킨다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "분비성 루시페라아제"는, 상기 루시페라아제의 자연형에서, 세포외 영역으로 정상적으로 발현되는 세포들로부터 분비되는 루시페라아제를 가리킨다. 세포외 영역은 유기체의 아이덴티티(identity)에 따라 유기체 내부 또는 외부에 있을 수 있다. 세포외 영역은 그 범위 내에서 루시페라아제를 발현하는 세포들이 생체외에서 배양되는 배지를 포함한다. 세포외 영역은, 루시페라아제를 발현하는 유기체가 일반적으로 존재하는 수생 또는 해양성 환경을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, "분비성 루시페라아제"라는 용어는 상기 루시페라아제의 다양한 개질형 및 재조합형을 포함하며, 그러한 재조합형 또는 개질형은 분비성이거나 분비성이 아닐 수 있다는 것을 밝혀둔다. 따라서, "분비성 루시페라아제"란 용어는 상기 용어의 범위내에서 분비성 루시페라아제의 "비분 비"형을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "세포내 루시페라아제"란 용어는, 발현 중에 그리고 자연형에서, 세포외 배지로 분비되기 보단 세포 또는 세포막내에 유지되는 루시페라아제를 가리킨다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, "세포내 루시페라아제"란 상기 루시페라아제의 다양한 개질형 및 재조합형을 포함하며, 그러한 재조합형 또는 개질형은 세포내에 유지되거나 유지되지 않을 수 있다는 것을 밝혀둔다. 따라서, "세포내 루시페라아제"란 용어는 상기 용어의 범위내에서 세포내 루시페라아제의 배출형 또는 분비형을 포함한다.
따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "비분비성" 및 "세포내"는 서로 의미가 다르다. "비분비성" 루시페라아제는 자연형에서 분비되는 루시페라아제의 개질형일 수 있는 반면, "세포내" 루시페라아제는 자연형에서 세포내에 있는(분비되지 않는) 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "비활성화하다", "비활성화" 및 이 용어의 활용 표현은, 환원제에 의한 루시페라아제의 비활성화란 문맥에서, 발생된 발광 신호의 양에 의해 결정되는 루시페라아제의 촉매 활성이 감소되거나 제거되었음을 의미한다. 따라서, 비활성화는 활성이 100% 감소할 수 있도록 완전할 수 있으나, 항상 그렇지는 않다. 일부의 잔여 활성이 유지되는 부분적 비활성화도 고려된다.
본 명세서에서 루시페라아제 효소에 관하여 사용된 바와 같이, "기질"이란 용어는 루시페라아제가 기질에 결합하고 및/또는 촉매 작용시 도움이 되거나 이를 위해 필요할 수 있는 임의의 추가적 공동 인자를 제외하고, 상기 루시페라아제가 작용하는 반응 기질 분자를 의미한다. 예컨대, 루시페라아제 촉매 반응은 마그네슘, CoA 및 ATP와 같은 공동 인자를 필요로 하거나 그로부터 이득을 얻을 수 있으나, 본 발명의 문맥에서 그러한 공동 인자는 "기질"이란 용어의 범위내에 있는 것으로 고려되지 않는다. 루시페라아제 "기질"은 예컨대 D-루시페린 및 코엘렌테라진을 포함한다. 본 출원의 목적을 위해, "루시페린"이란 용어는 D-루시페린 기질 및 그것의 유사체(analogues)를 가리키며, 상기 기질의 분자들은 예컨대 반딧불이, 방아벌레 및 철도 벌레와 같은 갑충목으로부터 유도된 루시페라아제를 위한 기질이다. 본 발명의 문맥에서, 루시페린이란 용어는 코엘렌테라진을 포함하지는 않고, 루시페라아제의 다른 클래스(예컨대 레닐라, 가우시아 및 메트리디아로부터 유도된 것과 같은 것)에 의해 사용되는 서로 다른 루시페라아제 기질을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "표본"이란 용어는 세포, 유기체, 용해된 세포, 세포나 유기체의 추출물이나 성분, 세포외액, 및 세포들이 배양되어 있는 배지를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 표본을 의미하고, 상기 표본은 루시페라아제(들) 효소를 포함하거나 포함하는 것으로 추정된다.
본 명세서에서 개시된 바와 같이, 본 발명자는, 제1 시간동안, 자연형에서 분비되는 루시페라아제 효소의 활성에 미치는 환원제의 효과를 기술하였다. 실제로, 레닐라- 및 갑충목-유도 루시페라아제들과 같은 세포내 루시페라아제들에서 관찰된 효과와 달리(이때 DTT가 있는 경우 글로우 반응이 연장된다), DTT와 같은 환원제가 자연형에서 분비되는 루시페라아제들에 대해 반대의 효과를 가진다는 것을, 본 발명자는 대단히 확신하였다. 즉, 환원제는 자연 상태에서 분비되는 루시페라아 제로부터 발생된 발광의 주기를 현저하게 단축시킨다. 또한, 본 발명자는, 자연적으로 분비되는 루시페라아제가 환원제에 의해 비활성화되는 것이 즉각적으로 일어나지 않고, 시간에 의존한다는 것을, 대단히 확신하였다.
이론에 제한되지 않고, 본 명세서에서는, 발광의 지속과 관련하여 세포내 루시페라아제가 환원 환경에 양호하게 적응되고, 환원제로부터 이득을 얻는 반면, 자연적으로 분비되는 루시페라아제는 산화 환경에 더 적응되고, 환원제에 의해 비활성화되며, 이러한 환원제는 단백질 형태를 변경하고 및/또는 임계적 이황화물 결합을 파괴하여 촉매 활성을 감소시키거나 제거한다. 중요한 것은, 이러한 변환이 루시페라아제와 시약과의 혼합 직후 시작되지 않아서 플래시 측정이 방해받는다는 것이다. 형태 변화는 단백질 접힘의 변화 및/또는 루시페라아제의 산화 환원 상태의 변화를 포함할 수 있다. 또한, 형태 변화는 루시페라아제 단백질에서 하나 이상의 이황화물 브리지의 파괴를 포함할 수 있다. 루시페라아제 효소의 상태 또는 형태 변화는 여러 상황에서 요구되거나 필요할 수 있다. 그러한 상황은 예컨대 다중 루시페라아제 검사의 사용, 판독물로서 발광 또는 형광을 사용하는 다른 (비루시페라아제) 검사에 표본이 응용될 수 있도록 측정 이후 잔존한 예기치 않은 신호의 제거, 또는 단순히, 예비 측정한 웰로부터 현재 측정한 웰까지 발생할 수 있는 빛샘의 감소를 포함한다.
본 발명의 실시예는 루시페라아제 효소의 양 및/또는 활성을 결정하거나 정량하는 것이 필요한 임의의 루시페라아제계 반응에 적용된다. 예컨대, 본 발명의 실시예들은, 특히, 높은 신호 강도뿐만 아니라 빠른 감응을 제공하기 위해 불안정 원소를 사용하는 리포터 유전자 검사 시스템에 적용될 수 있으나, 이것에만 독점적으로 적용되지는 않는다. 본 발명의 실시예들에서 분석될 표본은 자연형에서 분비성인 루시페라아제와 같이 소정의 루시페라아제를 발현하는 것으로 볼 수 있으나, 항상 그럴 필요는 없다. 예컨대, 당업자라면, 소정의 표본이 당해의 루시페라아제 효소를 포함하지 않는 것으로 볼 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예컨대, 세포는, 루시페라아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며 선택적으로 촉진자, 증강제 또는 다른 조절 서열과 연동하는 발현 구조체를 가지는 것으로 (그리고 그와 함께 변형되는 것으로) 볼 수 있으나, 루시페라아제 효소가 발현된 것으로 볼 수는 없다. 따라서, 본 발명의 범위에는 분석될 표본이 특정한 루시페라아제를 발현하는 것으로 추정되는 실시예들이 포함된다.
본 명세서에서 기술한 바와 같은 리포터 발현 검사와 더불어, 본 발명의 실시예들은 하나 이상의 루시페라아제 효소의 양 및/또는 활성이 결정되어야 하는 다른 검사 시스템에도 적용된다. 예컨대, 루시페라아제는 면역 검사의 리포터로서, 또는 교잡 반응 검사(hyvridisation assay)의 표지로서 사용될 수 있고, 예컨대 항체 또는 핵산 프로브에 연결될 수 있다. 따라서, 루시페라아제는 리포터 또는 검출 가능한 표지로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 환원제가 있는 경우, 기질 첨가 이후 처음 수 초동안 자연적으로 분비되는 루시페라아제로부터 발생되는 매우 높은 생물 발광 신호 강도는, 빠른 속도로 감소하는 생물 발광 신호에 결부될 수 있다는 것이 확인되었다. 환원제는 단독으로 첨가될 수 있거나, 또는 이하에 기술될 세포 용해 버퍼 또는 검사 버퍼(예컨대 루시페라아제 기질(들)을 포함함)와 같은 시약 조성물의 성분일 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따라 사용되기 위한 시약 조성물은 하나 이상의 환원제를 포함할 수 있으며, 상기 환원제는 티올계 환원제인 것이 일반적이다.
일반적으로, 산화-환원(redox) 반응은, 대개, 전자 이송에 의한 산화수 변화로 특징지워진다. 일반적으로, "산화"라는 용어는 산화 상태 또는 산화수의 증가(전자 손실)를 가리킨다. 반면 "환원"이란 용어는 산화 상태 또는 산화수의 감소(전자 이득)를 가리킨다. 종종, "산화제"란 전자 수용체를 가리키고, "환원제"는 전자 공여체를 가리킨다. 환원은 여러 방법으로 특징될 수 있다. 환원은, "산화수 감소" 또는 "전자 이득" 외에, 종종, "수소 이득"으로 고려될 수 있다. 예컨대, 이중 결합은 환원될 때 2개의 수소를 얻고, 케톤(ketone) 또는 알데하이드는 1차 또는 2차 알콜로 각각 환원될 때 수소를 얻으며, 이황화물 결합은 2개의 티올들로 환원될 때 2개의 수소를 얻는다. 다른 물질을 산화시킬 수 있는 물질은 "산화적"이라고 하고 "산화제"("oxidising agents", "oxidants" 또는 "osidisers")를 나타낸다. 다른 물질을 환원시킬 수 있는 물질은 "환원적"이라고 하고 "환원제"("reducing agents", "reductants", 또는 "reducers")를 나타낸다. 일반적으로 산화 환원 공정 시, 환원제는 전자를 잃고 산화되며, 산화제는 전자를 얻고 환원된다. 시약 조성물 또는 시약이 사용되는 해당 반응 혼합물에는, 상기 시약 또는 반응 혼합물에서 전체적으로 "환원시키는" 또는 "환원적인" 환경을 제공하기 위해, 하나 이상의 환원제가 있을 수 있다.
환원제는 루시페라아제의 환원을 촉진할 수 있어서, 루시페라아제가 더욱 활성인 형태 또는 활성형으로부터 덜 활성인 형태 또는 형으로 변환되는 것을 촉진하거나, 이를 용이하게 한다.
당업자라면, 본 명세서에는 본 발명의 목적을 위해 적합한 다양한 환원제들이 고려되었음을 이해할 것이다. 예컨대, 환원제는 시약 조성물에서 전기 화학 전위를 발생하는 데에 기여하는 이황화물 결합 변환제일 수 있어서, 상기 이황화물 결합이 티올들로 환원되어 루시페라아제 단백질을 변성(denaturing)시킨다. 예컨대, 환원제는 루시페라아제 단백질에서 이황화물 결합체를 직접적 또는 간접적으로 환원시킬 수 있는 제재일 수 있다. 예컨대, 산화 환원 버퍼의 환원 성분으로서 티올은 단백질 접힘 및 변성에 포함되는 티올-이황화물 교환 반응의 비율에 영향을 주는 것으로 공지되어 있다.
티올의 환원을 설명하는 일반 반응식은 식(1.0)에 표시된다:
R-S-S-R1 + 2H+ + 2e- -> R-SH + R1-SH (1.0)
적합한 환원제의 예로는: 디티오트레이톨(DTT); 디티오에리트리톨(DTE); 트리스(e-카르복시에틸)포스핀(TCEP); 티오글리콜산; 티오글리콜산나트륨; 피루브산; 시스테인; 황산나트륨; 황화수소; 디티온산염; 수소 + 백금 촉매; β-메르캅토에탄올; β-메르캅토에틸아민; 메르캅토아세트산; 이산화티오요소(thiourea dioxide); N-에틸멜리미드(N-ethylmalemide); 및 아스코르브산염이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시예에서, 환원제는 예컨대 고분자 지지체와 같은 고체 지지체상에 고정될(immobilised) 수 있다. 고정된 환원제의 예로는 고정된 TCEP 이황화물 환원겔이 있다. TCEP는 티올 유도체가 아닌 환원제의 예시이다(문헌[Willis, M.,S., Protein Science, 2005, 14, 1818-1826]).
일반적으로, 환원제는 적어도 약 500 μM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 400 mM 또는 500 mM의 농도로 존재한다.
본 발명에 따라 사용되기 위한 시약 조성물은 다양한 추가 성분을 포함할 수 있으며, 이는 당업자에게 용이하게 이해되고 명백하다. 그러한 추가 성분의 독자성(identity)은 검사에 사용되는 루시페라아제 효소 및 검사의 상황과 목적에 크게 의존할 것이다. 본 발명의 시약 조성물을 위한 그러한 일반적 추가 성분은 루시페라아제를 위한 기질이다. 예컨대, 시약 조성물은 루시페라아제에 의한 촉매 반응 및/또는 루시페라아제를 발현하는 세포의 용해에 적합하거나 그에 도움을 주는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 조성물은 하나 이상의 2가 금속 킬레이터(EDTA, CDTA 또는 EGTA와 같은 것), 항산화제(아스코르브산과 같은 것), 프로테아제 억제제(옥살산과 같은 것), 염, 세제(일반적으로 비이온성임), 또는 헤페스, 트리스, BSA 및/또는 글리세롤과 같이 정기적으로 사용되는 추가적 버퍼 성분들을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 시약 조성물은 적어도 약 pH 7, 일반적으로 약 pH 7 내지 약 pH 9의 범위를 가질 수 있다. 첨가되는 추가 성분(들)과 관련하여, 임의의 특정한 상황에 사용될 시약 조성물의 정확한 성분을 결정하는 것은 당업자의 능력 범위내에 있다.
본 명세서에서 예시한 바와 같이, 예컨대 환원제를 포함하는 다양한 개질형 루시페라아제 검사 버퍼 조성물은 개질형 세포내 가우시아 루시페라아제 또는 표준 분비성 가우시아 루시페라아제와 함께 사용될 때 매우 높은 신호 강도를 제공하며, 이후, 발광 신호가 배경 수준으로 매우 빠르게 감소한다. 환원제를 포함하는 것이 분비성 루시페라아제로부터의 발광 주기를 단축시킨다는 것은, 반딧불이 및 레닐라 루시페라아제와 같은 세포내 루시페라아제에 미치는 DTT의 보고된 효과와 상반되고, 실제로 정반대라는 것을 감안할 때, 특히 대단하다.
본 명세서에는, 분비성 루시페라아제에 미치는 환원제의 예기치 않은 효과 및 서로 다른 루시페라아제들에 미치는 이러한 환원제들의 서로 다른 효과를 유리하게 이용하는 방법이 개시된다. 특히, 본 발명자의 발견은 다중 루시페라아제 검사를 수행하기 위한 신규 방법의 개발을 이끌었다. 종래 기술에 따르면, 서로 다른 루시페라아제에 의해 발생된 신호는, 소멸 시약을 사용하여 또는 방출 파장의 차에 근거하여 구별되었다. 본 발명은 제1 시간동안 루시페라아제 신호가 시간적 근거에 따라; 즉 광 방출의 동적 특성의 차이에 근거하여 구별될 수 있다고 기술한다. 이론에 구속될 필요 없이, 본 명세서에 예시된 데이터는, 세포질 루시페라아제와 달리, 분비성 루시페라아제는 활성 형태를 사용하기 위해 접힘이 필요하다는 것을 제안한다. DTT와 같은 환원제에 노출시키면 분비성 루시페라아제의 활성은 감소되거나 제거되는 반면, 비활성화 과정은 수초 이상 걸리고, 이는 루시페라아제가 비활성화되기 전에 상기 루시페라아제의 활성을 측정하기 위한 좋은 기회가 된다. 놀랍게도, 본 명세서에 예시된 바와 같이, 50 mM까지의 DTT를 포함하는 것은, 상기 DTT 가 약 5분 내지 15분내에 루시페라아제를 실질적으로 또는 완전히 비활성화할 수 있음에도 불구하고, 초기 신호 세기를 감소시키지 않는다.
본 발명의 시약 조성물로 얻어지는 추가적 이점은, 배경 발광의 감소(사실상 높은 신호대 잡음비) 및 검사 시약의 연장된 유효 수명이다(종래 기술의 검사 버퍼는 기질의 첨가 이후, 아마도 자동 산화에 의해 제한된 유효 수명을 가진다).
따라서, 본 발명의 방법은, 짧은 신호 지속 시간에도 높은 검출 감도를 제공한다. 이는, 야생 상태에서 분비되는 루시페라아제에서 항상 그럴 수 있다는 점을 시사하며, 이때 상기 루시페라아제가 야생에서 분비된 형태로 사용되는지 비분비성으로 개질되는 지의 여부는 상관없다. 동일한 제재(환원제)가 레닐라 루시페라아제와 같은 세포내 루시페라아제로부터의 긴 신호 지속 시간을 제공한다는 것은, 광 방출의 동적 특성의 차에 근거하여 루시페라아제 신호를 더욱 잘 구별하기 위해 상기 제재를 사용할 기회를 보여준다.
본 발명에 따라 사용되기 위한 시약 조성물은 하나 이상의 킬레이터를 더 포함할 수 있다. 적합한 킬레이터는 예컨대 EDTA, CDTA 및 EGTA와 같은 2가 금속 킬레이터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 킬레이터는 약 1 mM과 약 15 mM 사이의 농도로 존재할 수 있다.
당업자라면, 본 명세서에 제공된 예시적 범위 또는 성분이, 루시페라아제 단백질의 펴짐, 향상된 생물 발광 신호 세기, 감소된 배경 신호, 연장된 시약 유효 수명 및/또는 생물 발광 신호의 단축을 달성하기 위해, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 범위 및 성분들을 독점적이 아니라 예시적으로 나타낸 것임을, 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 방법을 이용하면, 루시페라아제에 의해 발생되는 생물 발광 신호는 루시페라아제 기질의 첨가 이후 약 1초내에 시작되는 짧은 상에 제한될 수 있다. 예컨대, 생물 발광 신호는 기질의 첨가 이후 약 30분 또는 약 15분보다 적게 제한될 수 있다. 또한, 예컨대, 루시페라아제에 의해 발생되는 생물 발광 신호는, 루시페라아제 촉매 반응의 시작 이후 5분, 10분, 15분, 20분, 25분 또는 30분으로부터, 초기 신호의 약 1%보다 적은 값과 초기 신호의 약 0.1%보다 적은 값 사이에 있을 수 있다.
루시페라아제 기질 및 환원제는 동일한 시약 조성물의 성분일 수 있거나, 각각 독립적으로 첨가될 수 있도록 개별적일(개별적 시약 조성물의 성분을 포함함)일 수 있다. 루시페라아제 기질 및 환원제가 동일한 시약 조성물의 성분이 아닌 경우, 기질은 환원제가 첨가되기 전, 후 또는 그와 동시에 루시페라아제를 포함한 표본에 첨가될 수 있다. 일 실시예에서, 기질은 코엘렌테라진 또는 상기 코엘렌테라진의 유도체이다. 예컨대, 코엘렌테라진 또는 상기 코엘렌테라진의 유도체는 약 5 μM 초과, 약 10 μM 초과, 약 15 μM 초과, 약 20 μM 초과 또는 약 25 μM 초과의 농도로 존재할 수 있다. 적합한 코엘렌테라진 유도체는 당업자에게 주지되어 있으며, m-, v-, e- 및 f-코엘렌테라진을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 루시페라아제계 리포터 검사 시스템은 용해 버퍼과 검사 버퍼라는 2개의 버퍼(본 명세서에서 이를 통틀어 "검사 시약"이라고 함)를 사용한다. 일반적으로, 용해 버퍼는 검사될 루시페라아제를 포함하는 세포를 용해시키기 위한 성분을 포함하고, 반면 검사 버퍼는, 특히, 기질과 함께, 루시페라아제 반응을 위해 필요한 임의의 공동 인자를 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 사용되기 위한 환원제는 루시페라아제 검사 버퍼의 성분일 수 있다. 유리하게는, 본 발명에 따른 검사 버퍼는 야생 상태 또는 자연 상태에서 분비되는 루시페라아제와 함께 사용되는 경우, 광 방출의 주기를 효율적으로 단축한다. 또는, 본 발명의 방법에 따라 사용되기 위한 환원제는 세포 용해 버퍼의 성분일 수 있다. 예컨대, 본 방법이 세포에 의해 발현되는 2개 이사의 루시페라아제를 측정하는 단계를 포함하는 경우, 세포 용해 버퍼에 환원제를 혼합하는 것이 유리할 수 있으며, 이때 일 루시페라아제는 분비성이고, 다른 루시페라아제는 세포내 루시페라아제이다. 일반적으로, 분비성 루시페라아제 활성은 조건 배지의 표본에서 측정될 수 있고, 이어서, 환원제를 포함하는 시약에서 세포들이 용해된 후, 세포내 루시페라아제 활성이 측정된다. 본 발명자는, 많은 비율의 분비성 루시페라아제가 소정의 시간점(가능하면 분비를 위한 세포막으로 이동하기 전에 소포제에서)에서 세포내에 있을 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 점은, 세포 용해물은 분비성 루시페라아제와 비분비성 루시페라아제의 혼합물을 포함하기 때문에, 실제로 세포내에 있는 루시페라아제의 측정을 방해한다. 환원제를 포함하는 용해 버퍼를 사용함으로써 세포내 위치한 분비성 루시페라아제가 비활성화되어, 그 이후 측정된 모든 광 방출이 실제로 세포내 루시페라아제로부터만 유도되는 것으로 보인다.
다르게는, 환원제는 용해 버퍼와 검사 버퍼의 혼합물의 성분일 수 있어서, 세포들이 배양된 배지내에서 아마도 직접적으로 세포를 용해시키는 데에 단일 버퍼 조성물만 필요하며, 상기 단일 버퍼 조성물은 루시페라아제 촉매 반응을 개시한다. 당업자라면, 분비성 루시페라아제가 사용된 경우, 루시페라아제를 발현하는 세포를 용해시킬 필요가 없을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 오히려 환원제를 포함하는 검사 버퍼가, 루시페라아제 촉매 반응을 개시하기 위해, 세포들이 배양되는 배지에 직접 첨가될 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따라 사용되기 위한 시약 조성물은 액상 용액일 수 있다. 또는 고체형이거나, 동결 건조된 건조형일 수 있다. 액상이건 동결 건조된 것이건, 본 발명의 시약 조성물은 예비 혼합된 모든 성분들을 포함하여 제공되거나, 사용전 혼합될 성분들의 조합일 수 있다. 시약 조성물은 루시페라아제 양 및/또는 활성을 결정하는 검사 시스템에서 직접 사용되거나, 재구성, 용해, 희석될 수 있으며, 달리 말하면, 상기 조성물이 원하는 기능을 수행할 수 있도록 화학적 또는 물리적으로 처리될 수 있다.
본 발명의 방법 및 본 발명에 따라 사용되기 위한 시약 조성물은 표본에서 임의의 루시페라아제의 양 및/또는 활성을 결정하기 위해 적용될 수 있다. 루시페라아제는 자연적으로 생성되는 효소 또는 개질형이나 재조합형 효소일 수 있다. 자연적으로 생성되는 루시페라아제는 다수의 생물 발광 유기체들 중 임의의 하나로부터 유도될 수 있으며, 일반적으로 상기 유기체들의 광 기관으로부터 유도될 수 있다. 그러한 유기체는 생물 발광 박테리아, 원생 동물, 강장 동물, 연체 동물, 어류, 조류, 갑각류 및 딱정벌레과를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 전통적으 로, 루시페라아제는 효소에 의해 사용되는 기질에 따라 범주화될 수 있다. 반딧불이 및 방아벌레의 루시페라아제와 같은 루시페라아제군은 루시페린을 사용한다. 해양성 유기체 레닐라, 가우시아 및 플류로맘마의 루시페라아제와 같은 제2 루시페라아제 군은 코엘렌테라진을 사용한다. 바르굴라 루시페라아제는 또 다른 기질을 사용한다. 본 발명의 시약 조성물은 기질로서 루시페린 또는 코엘렌테라진을 사용하는 루시페라아제와 함께 사용될 수 있다.
이와 유사하게, 본 방법 및 시약 조성물은 세포내 루시페라아제 또는 분비성 루시페라아제와 함께 사용될 수 있다. 반딧불이 및 레닐라 루시페라아제는 자연 상태에서 세포내에 있는 반면, 가우시아 루시페라아제는 야생 상태에서 분비된다. 가우시아 루시페라아제는, 레닐라 루시페라아제를 이용하여 얻을 수 있는 것보다 강한 생물 발광 신호 강도를 산출하고, 가장 작은 공지된 루시페라아제이므로, 특히 중요하다. 마찬가지로, 강한 신호 강도를 산출하는 것으로 나타난 다른 분비성 루시페라아제는 예컨대 메트리디아 롱가 루시페라아제이다. 일반적으로, 본 발명의 시약 조성물은 하나 이상의 분비성 루시페라아제와 함께 사용된다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 시약 조성물은 하나 이상의 분비성 루시페라아제 및 하나 이상의 비분비성 루시페라아제와 함께 사용된다.
적합한 루시페라아제는 당업자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 얻을 수 있다. 루시페라아제는 생물 발광 유기체의 광 기관(들)로부터 직접 얻을 수 있다. 또는, 루시페라아제는 예컨대 박테리아, 이스트, 곤충 세포 또는 포유류 세포와 같은 배양 세포들로부터 얻을 수 있는데, 이러한 세포들은 루시페라아제를 인코딩하 는 핵산과 함께 변형된다.
상기 루시페라아제는 자연적으로 생성되는 루시페라아제의 변이체 또는 유도체와 같은 재조합형 효소일 수 있다. 예컨대, 자연적으로 분비되는 루시페라아제는, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 신호 서열의 제거 및/또는 세포내 폴리펩티드에 융합됨으로써, 상기 효소가 더 이상 분비되지 않고 세포 내에 잔류하도록 개질될 수 있다. 다르게는 또는 추가적으로, 루시페라아제 폴리펩티드 서열에서 하나 이사의 아미노산을 변경하여, 선택된 세포 배양 시스템에서 효소의 발현 및/또는 용해도를 변조시키기 위해 다수 개의 다른 변형이 만들어질 수 있음을, 당업자라면 이해할 것이다. 그러한 변조는 루시페라아제 및 본 발명의 시약 조성물이 사용되는 특정한 응용의 필요에 따라, 발현 및/또는 용해도를 증가시키거나 감소시키는 것일 수 있다. 예컨대, 단백질을 불안정화하기 위해 하나 이상의 불안정 원소들을 삽입하여 루시페라아제를 개질하는 일이 필요할 수 있다. 불안정 원소들을 포함하는 루시페라아제는 반감기를 단축시키고, 그러한 원소를 포함하지 않은 루시페라아제 보다 낮은 안정 상태 수준에서 발현된다. 적합한 단백질 불안정 원소는 PEST 서열(아미노산 프롤린(P), 글루타민산(E), 세린(S) 및 트레오닌(T)으로 농축된 아미노산 서열), 세포내 단백질 분해 신호 또는 데그론을 인코딩하는 서열 및 유비퀴틴(ubiquitin)을 포함한다. 본 발명의 실시예들을 이용하여 얻어지는 감도 향상은, 상기 루시페라아제의 낮은 안정 상태 발현 수준을 감안할 때 불안정 루시페라아제와 함께 사용되는 경우 특히 유리하다. 본 명세서에는, 단백질을 불안정하게 하는 임의의 적합한 방법도 고려된다. 예컨대, 적합한 방법은 동시 계속 출원중인 미국 특허 출원 제10/658,093호(상기 문헌의 개시 내용은 본 명세서에서 전체적으로 참고로 인용됨)에 기술되어 있다. 루시페라아제 발현은, 예컨대, 폴리(A) 꼬리, 전사적 또는 번역적 증강제와 같은 서열의 첨가, 및/또는 특정한 발현 시스템을 위해 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩할 때 코돈 선호도(codon usage)의 적응에 의해 개질될 수 있다. 예컨대, 곤충 세포 또는 인간 세포에서 루시페라아제 발현을 최적화하기 위해, 루시페라아제 폴리뉴클레오티드에서 코돈 선호도는 곤충 세포 또는 인간 세포 각각을 위해 최적화될 수 있다. 코돈 선호도 적응을 위한 접근 및 서로 다른 종(species)을 위한 최적화는 당업자에게 주지되어 있다.
루시페라아제 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 다른 변형도 만들어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 예컨대, 제한 효소 분할 영역이 폴리뉴클레오티드에 삽입되거나, 루시페라아제 폴리펩티드가 선택성 마커(예컨대 내항생제성)과 같은 또 다른 기능의 제2 폴리펩티드와 융합 또는 접합될 수 있다.
컴퓨터 모델링과 같은 주지 기술을 이용하여, 루시페라아제들이 본 발명에 따라 사용되기에 특히 적합할 수 있다는 것뿐만 아니라, 분비성 루시페라아제를 비분비성 루시페라아제가 되도록 하는 변형이 만들어질 수 있음을, 당업자는 쉽게 예측할 수 있을 것이다. 예컨대, 자연형에서 분비되는 루시페라아제는 일반적으로 시스테인 잔기를 포함하고, 상기 시스테인 잔기는 단백질의 성숙한 활성 형태에서 이황화물 브리지(disulphide)를 형성한다. 시스테인 잔기는 아미노산 서열내에서 반복되는 스페이싱 패턴(spacing pattern)으로 배열될 수 있어서, 세포내 이황화물 결합이 형성될 것임을 예측할 수 있다. 일반적으로, 그러한 루시페라아제는 세포내 에서 발현될 때 활성이 감소된다. 따라서, 당업자라면, 자연적으로 분비되는 루시페라아제의 하나 이상의 특징을 공유하는 상동 루시페라아제는 본 발명에 따라 사용되기에 특히 적합하다는 것을 이해할 것이다.
생체 외 리포터 검사에서 분비성 루시페라아제를 사용하는 경우, 루시페라아제 활성을 측정하기 위해서는, 세포 용해물보다 세포 배양 배지의 표본이 사용되는 것이 일반적이다. 분비성 루시페라아제는 일부 경우에서는(예컨대 동일한 세포로부터 반복 측정 시) 유리한 반면, 다른 경우를 위해서는 적합하지 않다. 특히, 분비성 루시페라아제는 세포 배양 배지에서 축적될 수 있어서, 유전자 발현의 빠른 변화가 정확하게 모니터링될 수 없다. 돌연변이, 즉 상기 루시페라아제의 비분비형(바람직하게는 불안정 원소들을 포함함)은 이러한 문제를 극복한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 특정하게 개질된 일 루시페라아제는 14 아미노산 N-말단 신호 펩티드가 제거되어 비분비성 루시페라아제가 발생되는 개질형 가우시아 루시페라아제이다. 본 명세서에 기술된 제2 개질형 루시페라아제는 17 아미노산 N-말단 신호 펩티드가 제거되어 비분비성 루시페라아제가 발생되는 개질형 메트리디아 루시페라아제이다. 다른 분비성 루시페라아제도 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법을 이용하여 특히 진핵 생물의 세포 내 발현을 위해 유사하게 개질될 수 있다.
본 발명에 따르면, 루시페라아제 활성은 당업자에게 주지된 방법들 중 임의의 것에 의해 검출 및 측정될 수 있으며, 상기 주지된 방법은 발광계, 신틸레이션 계수기(scintillation counter), 광전자 배증관 광도계나 광유제 필름과 같은 광도계의 이용을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
이중- 및 다중 루시페라아제 리포터 검사
본 발명의 방법 및 조성물은, 특히, 분비성 루시페라아제의 경우, 현재 유효한 시스템을 이용하여 얻을 수 있는 것보다 더 높은 감도(더 강한 플래시 상 및 더 낮은 배경 신호) 및 더 빠른 발광 신호 감쇄율을 제공하며, 이중- 및 다중 루시페라아제 리포터 검사에 적용된다. 가우시아 루시페라아제와 같은 분비성 루시페라아제는 정상적으로 비분비되는 세포내 루시페라아제보다 더 강한 생물 발광 신호 강도를 제공한다. 그러나, 가우시아 루시페라아제 또는 실제로 임의의 다른 분비성 루시페라아제를 사용하는 이중- 또는 다중 루시페라아제 검사는 종래에 기술되지 않았다.
수백만의 화합물 총합체의 선별을 포함하는 고처리량(high throughput) 약품 선별과 같은 많은 응용에서, 이중 루시페라아제 검사는 2개의 실험을 별도로 시행하는 것에 비해, 비용 및 시간을 상당히 절약할 수 있다. 다른 한편으로는, 단일 리포터 검사는 이중 루시페라아제 검사보다 항상 더 적은 비용이 들고 및/또는 간단하여, 사용자는, 사용된 세포계가 다중 루시페라아제를 발현하는 경우라도, 단일 루시페라아제 검사를 시행할 것을 선택할 수 있다. 실제로, 고처리량 약품 선별과 같은 반복 공정은, 예컨대, 후보 화합물의 최종 목록을 선택하기 위해, 실험군 촉진자의 광범위한 초기 선별 시, 우선 단일 루시페라아제 검사를 수행하는 것이 필요할 수 있다. 이후, 적은 수의 표본에 대해 수행되는 이중 루시페라아제 검사가 수반될 수 있으며, 상기 검사는 대조군 리포터를 포함한다. 따라서, 사용자가, 실험군 리포터만 측정하거나, 실험군 리포터와 대조군 리포터 모두 검사하는 것을 선 택할 수 있는 이중 루시페라아제 검사 시스템이 선호될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 이중- 또는 다중 루시페라아제 검사에서 하나 이상의 루시페라아제(제1 루시페라아제)는 "야생 상태"(이하 "자연형")에서 세포질이 아닌 루시페라아제이다. 상기 문맥에서 자연형은, 상기 루시페라아제가 개질되지 않은 유기체로부터 유도된다는 것을 의미한다. 다른 말로 하면, "자연형"이란 용어는, 사실상 성숙한 야생형 루시페라아제가 촉매 반응을 하는 정상 부위 또는 위치를 참조한다. 일반적으로, 이러한 유형의 적합한 루시페라아제는 환원적이지 않거나, 적어도 세포질보다 덜 환원적인(더욱 산화적인) 환경 또는 미환경(microenviroment)에서 (광 방출 반응을 하면서) 동작할 것이다. 이러한 미환경으로는 소포체내의 세포 공간이 있다. 다른 미환경은, 루시페라아제의 촉매 부위(들)(catalytic domain(s))이 세포막의 세포 외측에 위치할 수 있는 한, 세포막일 수 있다.
루시페라아제가 활성 자연형에서 세포외에 있는 것이 일반적이긴 하나, 분비되는 것이 더욱 일반적이다. 루시페라아제가 분비되거나 정상적으로 촉매활성을 하는 환경이 포유류 세포와 같은 진핵 세포의 세포질에 비해 환원적 환경이 아니라면, 상기 루시페라아제는 세포 외에 분비되거나 유기체내의 다른 환경에서 분비될 수 있다. 더욱 일반적으로, 자연형일 때의 루시페라아제는 외부 환경으로 분비된다. 훨씬 더욱 일반적으로, 루시페라아제는 수중 환경으로 루시페라아제를 분비하는 수생 유기체로부터 유도된다. 가장 일반적으로, 상기 루시페라아제는 해수로 루시페라아제를 분비하는 해양성 유기체로부터 유도된다. 이러한 루시페라아제는 기 질로서 코엘렌테라진을 이용하는 것이 일반적이다. 제1 루시페라아제에 대한 상기 특징은 자연형 루시페라아제에 적용된다. 루시페라아제는 이러한 특징들 중 하나 이상을 포함하지 않도록 개질될 수 있는 것이 적합하다. 그러한 루시페라아제는 본 명세서에 기술된 분야에 주지되어 있다.
일반적으로, 제2 루시페라아제는 자연형일 때 환원적이거나 적어도 제1 루시페라아제의 환경보다 더욱 환원적인(덜 산화적인) 환경 또는 미환경에서 (광 방출 반응을 하며) 정상적으로 동작할 것이다. 일반적으로, 루시페라아제는 자연형에서 세포질이다. 적합한 루시페라아제는 당업자에게 주지되어 있다. 이러한 루시페라아제는 수생 유기체 또는 육생 유기체로부터 유도될 수 있다. 제2 루시페라아제는 제1 루시페라아제와 동일하거나 다른 기질을 사용할 수 있다. 제2 루시페라아제는 제1 루시페라아제와 동일하거나 다른 파장으로 광을 방출할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기에 정의된 바와 같이 제2 루시페라아제로부터 제1 루시페라아제를 구별할 수 있는 예시적 특징은 다음과 같다:
(a) 제1 루시페라아제가 정상적으로 촉매 활성을 하게 되는 자연적 미환경의 산화 환원 전위는 제2 루시페라아제가 촉매 활성을 하게 되는 자연적 미환경에 비해 일반적으로 더 환원적이고 덜 산화적임, 및/또는;
(b) 제1 루시페라아제가 정상적으로 촉매 활성을 하게 되는 자연적 미환경은 세포 외인 것이 일반적인 반면, 제2 루시페라아제가 촉매 활성을 하게 되는 자연적 미환경은 세포 내임, 및/또는;
(c) 자연형에서 제1 루시페라아제는 분비되는 반면, 제2 루시페라아제는 분 비되지 않음, 및/또는;
(d) 제1 루시페라아제에 미치는 산화제 또는 환원적인 산화 환원 환경의 효과는, 제2 루시페라아제에 비해 적어도 훨씬 큰 정도의 비활성화임, 및/또는;
(e) 제1 루시페라아제의 활성은 분자내의 이황화물 브리지 형성에 의존하는 반면, 제2 루시페라아제의 활성은 그렇지 않음, 및/또는;
(f) 제1 루시페라아제의 활성은 상기 루시페라아제의 2차/3차 구조의 형성을 위해 임계적인 시스테인 잔기들을 포함함, 및/또는;
(g) 적합하게 접힌 제1 루시페라아제의 예측 구조는 시스테인 잔기들 사이에 다중 이황화물 브리지들을 포함하는 반면, 제2 루시페라아제의 예측 구조는 그렇지 않거나, 적어도 촉매 부위의 영역에 있지 않음.
일부 실시예들에서, 추가적인 루시페라아제들이 사용되어, 단일 표본에서 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 서로 다른 루시페라아제들이 측정된다. 이러한 실시예들에서 일반적으로, 적어도 제3 및 그 이후의 루시페라아제는 제2 루시페라아제에 대해 기술된 유형이며; 즉 환원적 환경을 허용한다. 다중 루시페라아제들은 서로 다른 파장으로 광을 방출할 수 있고 및/또는 서로 다른 유기체들로부터 유도될 수 있다. 예컨대, 3중 루시페라아제 검사에서, 제2 루시페라아제는 갑충목으로부터 유도되고, 제3 루시페라아제는 쌍시류로부터 유도될 수 있다.
이하, 본 발명에서 고려되는 다중 루시페라아제 검사의 예들이 기술된다.
(i) 2개의 서로 다른 기질 및 1개 또는 2개의 서로 다른 검사 버퍼를 사용하는 이중 루시페라아제 검사.
일 실시예에서, 제1 루시페라아제는 기질로서 코엘렌테라진을 사용하는 분비성 해양성 루시페라아제(예컨대 가우시아 루시페라아제)이고, 제2 루시페라아제는 기질로서 루시페린을 사용하는 육생 루시페라아제(예컨대, 반딧불이, 방아벌레 또는 쌍시류 루시페라아제)이다. 2개의 루시페라아제들을 포함하는 표본에, 본 발명에 따라 기술되고 예시된 환원제를 포함한 코엘렌테라진-함유 검사 버퍼를 1차로 첨가한다. 즉시, 광 방출을 측정하고, 이후, 가우시아 신호가 감쇄하도록, 바람직하게는 거의 0(zero)에 가깝도록 약 5분 이상 동안 상기 표본을 그대로 두거나 보관한다. 이후, 루시페린-함유 검사 버퍼(Mg, CoA 및 ATP를 포함할 수 있음)을 첨가하고, 다시 광 방출을 측정한다. 제1 판독은 가우시아 루시페라아제 활성의 수치이고, 제2 판독은 반딧불이 또는 방아 벌레 활성의 수치이다.
상기에 따르면, 본 발명은 표본에서 제1 및 제2 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법을 제공하며, 본 방법은:
(a) 제1 및 제2 루시페라아제를 위한 반응 기질, 및 상기 제1 루시페라아제는 시간 의존적으로 비활성화하면서 제2 루시페라아제는 비활성화하지 않는 환원제를 상기 표본과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 환원제에 의해 제1 루시페라아제가 비활성화되기 전에 발광 신호를 측정하는 단계;
(c) 제1 루시페라아제가 비활성화된 이후 발광 신호를 측정하는 단계; 및
(d) 상기 (b) 및 (c) 단계에서 수집한 데이터를 이용하여 각각의 루시페라아제의 양 또는 활성을 서로에 대해 또는 다른 표본에 대해 산출하는 단계;를 포함한 다.
또한, 표본에서 제1 및 제2 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법도 고려되며, 본 방법은:
(a) 제1 루시페라아제를 위한 반응 기질, 및 제1 루시페라아제는 시간에 따라 비활성화하면서 제2 루시페라아제는 비활성화하지 않는 환원제를 상기 표본과 접촉시키는 단계;
(b) 제1 루시페라아제가 비활성화되기 전에 발광 신호를 측정하는 단계;
(c) 제2 루시페라아제를 위한 반응 기질과 표본을 접촉시키는 단계;
(d) 제1 루시페라아제가 비활성화된 후 발광 신호를 측정하는 단계; 및
(e) 상기 (b) 및 (c) 단계에서 수집된 데이터를 이용하여 각각의 루시페라아제의 양 또는 활성을 서로에 대해 또는 다른 표본에 대해 산출하는 단계를 포함한다.
(ⅱ) 2개의 서로 다른 기질들 및 2개의 서로 다른 검사 버퍼들을 사용하는 3중 루시페라아제 검사.
일 실시예에서, 제1 루시페라아제는 청색 광을 방출하며 기질로서 코엘렌테라진을 사용하는 분비성 해양성 루시페라아제(예컨대, 가우시아 루시페라아제)이고, 제2 및 제3 루시페라아제는 각각 녹색 및 적색 광을 방출하며 기질로서 루시페린을 사용하는 육생 루시페라아제들이다; 예컨대, 적색 및 녹색의 프리속트리스속(Phrixothrix) 루시페라아제 및/또는 TOYO B-net(일본)사로부터 얻을 수 있는 루시페라아제가 있다. 상기 루시페라아제 모두를 포함하는 표본에, 본 발명에 따라 기술되고 예시된 바와 같은 환원제를 포함한 코엘렌테라진-함유 검사 버퍼를 1차로 첨가한다. 즉시, 광 방출을 측정하고(필터 필요 없음), 이후, 가우시아 신호가 감쇄하도록, 바람직하게는 거의 0에 가깝도록 약 5분이상 동안 상기 표본을 그대로 두거나 보관한다. 이후, 루시페린-함유 검사 버퍼(Mg, CoA 및 ATP을 포함할 수 있음)를 첨가하고, 적색 신호와 녹색 신호를 구별하기 위한 필터를 사용하여 다시 광 방출을 측정한다. 동일한 발광계를 사용하여 적색 광과 녹색 광의 동시 측정도 가능하나, 그 외에는 순차적 측정이 필요하다.
(ⅲ) 2개의 서로 다른 기질들 및 2개의 서로 다른 검사 버퍼들을 사용하는 4중 루시페라아제 검사.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 (ⅱ)에 기술된 바와 같은 다중 루시페라아제 검사는 기질로서 루시페린을 사용하나 오렌지색 광을 방출하는 제4 루시페린을 더 포함할 수 있다; 예컨대 TOYO B-net 사로부터 얻을 수 있는 Rol 루시페라아제가 있다. 제2 측정 동안, 필터들은 녹색, 오렌지색 및 적색 신호를 분리하는 데에 사용된다; 예컨대 Multicolor-Luc-검사 시스템(TOYO B-net)에 대해 기술된 바와 같음.
(ⅳ) 2개의 서로 다른 기질들 및 2개의 서로 다른 검사 버퍼들을 사용하는 5중 루시페라아제 검사.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 (ⅲ)에 기술된 바와 같은 다중 루시페라아제 검사는, 청색 광을 방출하며 자연형에서 세포질 루시페라아제인 제5 루시페라아제를 더 포함한다. 대부분의 이러한 루시페라아제는 기질로서 코엘렌테라진을 사용하고 해양성 기원이다; 예컨대 레닐라 루시페라아제가 있다. 제1 측정 동안, 가우시 아 및 레닐라 모두 광을 방출하여, 가우시아 및 레닐라 신호의 전체가 조합된 것이 측정된다. 제2 검사 시약을 첨가하기 직전, 추가 측정을 시행한다. 이때, 가우시아 신호는 감쇄하여 전체 신호는 레닐라 루시페라아제로부터의 신호이다. 이후, 가우시아 및 레닐라 신호가 산출된다(예컨대 본 명세서의 예 7에 기술된 바와 같음). 이후, 제2 검사 버퍼(루시페린을 포함하고, 선택적으로 Mg, CoA 및 ATP를 포함함)을 첨가하고, 녹색, 오렌지색 및 적색 신호를 구별하며 임의의 잔류한 청색 신호로부터 이들 신호들을 분리하기 위한 필터를 사용하여 광 방출을 다시 측정한다. 또는, 제2 검사 버퍼는 상기 잔류한 청색 신호를 종료시키기 위해, 레닐라 루시페라아제를 위한 소멸제를 포함할 수 있다.
다르게는, 제2 검사 버퍼 첨가 이후, 다른 색으로부터 청색 방출만 분리하는 적합한 필터를 사용하여 레닐라 신호만 측정할 수 있다. 이 경우, 청색 필터는 제1 측정에도 사용될 수 있다.
(v) 단일 검사 버퍼에서 조합된 2개의 서로 다른 기질들을 포함하는 다중 루시페라아제 검사.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 검사는, 코엘렌테라진, 루시페린, 환원제, Mg, 및 선택적으로 ATP와 CoA를 포함하는 단일 버퍼에서 2개의 검사 버퍼가 조합되었다는 점을 제외하곤, 상기 (i) 내지 (ⅳ) 에서 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 청색, 녹색, 오렌지색 및 적색 신호를 분리하기 위해 4개의 필터들을 사용하였다. 청색 신호를 처음으로 (다른 파장을 배제하는 청색 필터를 사용하여) 측정하고, 바람직하게는 다른 색을 측정하기 전에 약 5분 이상의 지연을 포함하는데, 이 는 시작 단계에서만 매우 강한 가우시아 신호로부터의 임의의 크로스토크(cross-talk)를 최소화하기 위함이다.
(ⅵ) 일 분비성 루시페라아제 및 일 비분비성 루시페라아제를 사용하는 이중 루시페라아제 검사.
일 실시예에서, 제1 루시페라아제는 분비된 형태에서 분비성 해양성 루시페라아제(예컨대, 가우시아)이고, 제2 루시페라아제는 세포내 해양성 루시페라아제(예컨대, 레닐라)이다. 두 개의 루시페라아제를 발현하는 세포를 배양하고, 분비성 (가우시아) 루시페라아제의 측정을 위해, 조건 배지의 표본을 제거한다. 환원제를 포함하는 시약에서 세포들을 용해시키고, 이후, 세포내 (레닐라) 루시페라아제를 위해 측정한다. 표준 시약을 이용하여, 세포 용해물로부터 방출되는 광은 레닐라 루시페라아제, 및 가우시아 루시페라아제의 부분 집합으로부터 유도된 광의 조합을 포함할 것이며, 이러한 조합은 구별이 불가능하다. 상기 가우시아 루시페라아제의 부분 집합은 발생은 되었으나 아직 분비되지 않은 상태이다. 용해 버퍼에 환원제를 포함함으로써, 가우시아 루시페라아제가 비활성화되어, 광 방출은 레닐라 루시페라아제 수준의 수치이다.
본 발명은 표본에서 2개 이상의 서로 다른 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법을 더 고려한다. 일 실시예에서, 본 방법은 2개 이상의 루시페라아제들을 위한 반응 기질을 포함하는 시약 조성물과 표본을 접촉시키는 단계, 2개 이상의 서로 다른 시간점에서 방출된 광의 양을 결정하는 단계, 및 수집된 데이터를 사용하여 각각의 루시페라아제의 양 또는 활성을 서로에 대해 또는 다른 표본에 대해 산출하는 단계를 포함하며, 이때 상기 산출은, 시간 의존 방식으로 하나 이상의 루시페라아제를 비활성화시키는 환원제가 있는 경우 광 방출의 동적 특성에 대하여 2개의 루시페라아제들 사이의 차에 의존한다. 본 방법은 루시페라아제에 의해 발생되는 발광 신호의 광 방출의 파장 차를 사용하여 2개 이상의 서로 다른 루시페라아제들의 신호를 구별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 방법은 루시페라아제 반응에서 생물 발광의 개선된 동적 특성을 제공하고, 환원제가, 자연형에서 분비되는 루시페라아제를 시간 의존 방식으로 비활성화한다는 예기치 않은 발견을 통해, 종래 기술보다 우수한 이점을 제공한다. 환원제는 본 발명에 따른 루시페라아제 검사에, 본 발명에 따른 검사 시약 및 실험 키트를 준비할 때, 그리고 본 발명에 따른 검사 및 키트를 위한 표준군 및 대조군에 사용될 수 있다. 본 발명은 루시페라아제 활성 검사를 수행하는 키트를 제공하고, 이러한 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같이 본 발명에 따라 사용되기 위한 환원제를 포함한다. 본 발명의 키트는 하나 이상의 물리적 용기에서, 일반적으로, 루시페라아제 검사에 사용되기에 용이한 편리한 형태로 포장되어, 루시페라아제 검사를 실행하기 위한 시약 조성물 또는 상기 시약 조성물의 성분의 적합한 양을 포함한다. 루시페라아제 기질 및 환원제는 동일하거나 서로 다른 용기에, 그리고 동일하거나 서로 다른 시약 조성물에 있을 수 있다. 일반적으로, 루시페라아제 기질은, 유효 수명은 연장하면서 사용 전 검사 시약과 혼합될 목적으로, 별도의 용기에 담겨 검사 시약(기질을 포함하지 않음)에 제공된다. 다중 시약 조성물, 또는 시약 조성물의 다양한 성분은 예컨대 수용액으로 또는 동결 건조되어 단일 용기 또는 다중 용기들에서 혼합될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 키트는 본 발명에 따라 시행되는 검사의 신뢰도 및 정확도를 보장하기 위해 대조군과 표준군을 포함한다. 적합한 대조군 및 표준군은 당업자에게 주지되어 있을 것이다.
일부 실시예들에서, 본 발명에 따라 사용될 시약 조성물은 사용 편이성을 개선하기 위해, 키트내에서 별도의 성분으로 제공된다. 예컨대, 별도의 성분으로 환원제가 제공됨으로써, 사용자는:
(a) 상기 ⅵ)에 따라 사용되기 위한 용해 버퍼에 환원제를 첨가하는 단계(사용의 또 다른 예로서, 다른 루시페라아제와 조합하여 비분비성 가우시아 루시페라아제를 발현하는 안정 세포계를 이용하여 작업하는 사용자는 가우시아 루시페라아제를 측정할 지, 측정하지 않을 지를 선택할 수 있고, 후자의 경우, 사용자는 다른 루시페라아제를 측정하기 전에 상기 가우시아 루시페라아제를 비활성화시키기 위해 환원제를 포함한 용해 버퍼를 사용할 수 있음);
(b) 상기 i) 단계에 따라 사용되기 위한 검사 버퍼에 환원제를 첨가하는 단계;
(c) 우선 환원제를 포함하지 않은 검사 버퍼를 표본에 첨가하고, 발광을 측정한 후, 하나 이상의 루시페라아제를 비활성화시키기 위해 환원제를 첨가하는 단계; 및
(d) 우선 환원제를 포함하지 않은 검사 버퍼를 표본에 첨가하고, 글로우 상을 얻을 때까지 기다리고, 환원제 또는 상기 환원제를 포함하는 검사 버퍼를 첨가한 후, 루시페라아제가 비활성화되기 전에 발광을 측정하는 단계; 중에 선택할 수 있다.
본 명세서에서 임의의 종래 공개 문헌(또는 상기 문헌으로부터 추론된 정보) 또는 공지된 임의의 사실에 대한 참조는, 상기 종래 공개 문헌(또는 상기 문헌으로부터 추론된 정보) 또는 공지된 사실이 본 명세서가 관련된 이용 분야에서 공공연한 지식의 일부를 형성한다는 인정 또는 용인 또는 임의적 형태의 제안이 아니며, 그러한 것으로서 받아들여져서도 안된다.
이제, 본 발명은 이하 특정한 예들과 관련하여 기술될 것이며, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 임의의 방법으로서 해석되어서는 안된다.
예들
1부: 환원제들은 자연 상태에서 분비되는 루시페라아제로부터의 광 방출의 동적 특성을 단축시킴
예 1
비분비성이면서 불안정한 가우시아 루시페라아제를 안정적으로 발현하는 헬라 세포들(HeLa cells)을 96-웰판상에 놓고, 밤새 배양하였다. 상기 비분비성 루시페라아제는 14 아미노산 N-말단 신호 펩티드가 제거된 개질형 가우시아 루시페라아제이다. 불안정 루시페라아제는 불안정 원소를 포함하는 효소라서, 상기 불안정 효소가 없는 경우보다 낮은 안정 상태 수준에서 발현되며 단축된 반감기를 가진다.
밤새 배양한 이후, 배지를 제거하고, 25 mM Tris pH 8.1, 150 mM NaBr, 1 mM EDTA, 63.4 uM 옥살산나트륨, 0.1% NP40 치환물, 5% 글리세롤(GSv3)을 포함한 20 ul의 용해 버퍼에서 세포들을 용해시켰다. 25 mM Tris pH 8.1, 1 mM EDTA, 2 mM 아 스코르브산염 및 26 uM Cz(STD)를 포함하는 검사 버퍼 또는 이와 동일하되 환원제도 포함하는 검사 버퍼를 60 ul 주입한 이후, 동적 검사(kinetic assay)로 루시페라아제 활성을 측정하였다. 다양한 농도를 가진 3개의 환원제들을 사용하였다: DTT(4 mM, 10 mM, 20 mM 또는 50 mM); β-메르캅토에탄올(10 mM, 20 mM, 50 mM 또는 100 mM); 및 TCEP(500 uM 또는 5 mM). 2개의 독립 실험 결과는 도 1A 및 도 1B에 도시되어 있다. 환원제가 없는 경우 관찰되는 것에 비해, 각각의 환원제는 적정 시간 경과 후 발광 신호의 더욱 빠른 감쇄를 야기한다는 것을 확인할 수 있다. 소정의 환원제의 농도가 높으면 효과도 강했다. 사용한 루시페라아제 기질의 농도는 코엘렌테라진을 사용하는 루시페라아제를 위해 일반적으로 사용되는 것보다 현저히 높았다(약 5 μM). 본 발명자는, 가우시아 루시페라아제에 의해 발생된 생물 발광과 관련하여, 높은 농도가 유리한 효과를 발생시킨다는 것을 확신하였다.
예 2
검사 버퍼에서 광범위한 농도의 DTT(50 mM 내지 500 mM)를 사용한다는 것을 제외하고, 예 1에 기술된 것과 유사한 실험을 수행하였다. 2개의 독립 실험으로부터의 결과는 도 2에 도시되어 있으며, 짧은 시간 주기(도 2A) 및 긴 시간 주기(도 2B)로 도시되어 있다. 예 1에 기술된 실험에서 관찰된 바와 같이, 발광 신호의 감쇄율은 DTT의 농도에 직접 관련된다. 이러한 효과는 500 mM의 최대 농도까지 확인된다(도 2A). 긴 시간 주기에서(도 2B), 모든 농도에서 시작 후 10분 이내 거의 배경 수준(~100 RLU)으로 신호가 감소하였다. 이는, 1,000 내지 10,000배에 이르는 광 세기 감소를 나타낸다. 중요한 것은, 반딧불이와 다른 갑충목 루시페라아제 및 레닐라 루시페라아제를 포함하는 세포내 루시페라아제에 대해 보고된 것과 달리, 가우시아 루시페라아제로부터의 광 방출의 주기를 상기 DTT가 단축시킨다는 관찰 결과이다.
예 3
야생형 분비성 가우시아 루시페라아제를 위해 시간대별 발광에 미치는 DTT의 효과가 조사된다는 점을 제외하고, 예 1에 기술된 바와 유사한 실험을 수행하였다. 상기 실험은, 야생형 가우시아 루시페라아제 단백질을 인코딩하는 리포터 플라스미드와 헬라 세포들을 일시적으로 트랜스팩션하고, 24시간 후 조건 배지를 얻음으로써 달성된다. 20 ul의 조건 배지를 포함하는 웰에 검사 버퍼(50 mM DTT를 포함하거나 DTT를 포함하지 않음)를 주입하였다. 결과는 0의 시간에 비해 잔류한 신호를 백분율(%)로 표현하였다(도 3 참조). 데이터를 통해, DTT가 검사 버퍼에 포함된 경우, 두 가지 형태의 가우시아 루시페라아제들(자연적 분비성 및 개질된 비분비성)이 광 방출의 매우 빠른 감소를 나타낸다는 점을 확인하였다.
예 4
헬라 세포들이 세포내 레닐라 루시페라아제를 일시적으로 발현한다는 점을 제외하곤, 예 1에 기술된 바와 유사한 실험을 수행하였다. 20 ul의 용해물을 포함하는 웰에 검사 버퍼(50 mM DTT 를 포함하거나 DTT를 포함하지 않음)를 주입한 후, 동적 검사를 수행하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 가우시아 루시페라아제로부터의 광 방출의 동적 특성에 미치는 DTT의 효과와 정반대로, DTT는 레닐라 루시페라아제로부터의 광 방출을 사실상 연장시킨다.
예 5
자연적 분비성 또는 개질형 비분비성인 가우시아 또는 메트리디아 루시페라아제를 인코딩하는 발현 플라스미드들과 함께 헬라 세포들을 일시적으로 트랜스팩션하였다. 분비성 메트리디아 루시페라아제는 Clontech사로부터 얻었고, 비분비성 메트리디아 루시페라아제는 비분비성 가우시아 루시페라아제와 유사한 방법으로 만들었다. ATG(분비 신호) 및 스톱 코돈(stop codon) 이후 제1 16 아미노산을 제거하는 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 코딩 영역을 얻었다. PCR 발생물은 pRR23.1 플라스미드(GeneStream, Au)로 결찰되어, 비분비성이나 불안정한 메트리디아 루시페라아제를 발생한다.
트랜스팩션한 1일 후, 분비성 루시페라아제를 위해 조건 배지를 제거하고, 예 1에 기술된 바와 같이 비분비성 루시페라아제를 용해시켰다. 25 mM Tris pH 7.75, 1 mM EDTA, 2 mM 아스코르브산 및 26 uM 코엘렌테라진에 표시된 농도의 DTT를 포함하는 검사 버퍼를 수동 주입한 후, 루시페라아제 활성을 위해, 조건 배지 또는 용해물의 분취액(20 ul)을 동적 검사로 검사하였다.
도 5A 내지 5D는, 검사 버퍼에 DTT가 포함된 경우, 비분비성 및 분비성 메트리디아 루시페라아제와 비분비성 및 분비성 가우시아 루시페라아제가 광 방출의 매우 빠른 감소라는 동일한 방식으로 감응한다는 것을 나타낸다. 또한, 도 5A 내지 5D에 도시된 바와 같이, DTT는 농도에 따라, 모든 4개의 루시페라아제들에 있어 광 방출 주기를 단축시키는 데에 영향을 끼친다.
예 6
사용한 환원제를 제외하고, 비분비성 가우시아 및 메트리디아 루시페라아제를 위해, 예 5에 기술된 바와 같은 실험을 수행하였다. 사용된 환원제는 디티오에리트리톨(DTE)(도 6A 및 6D), 아황산나트륨(도 6B), 시스테아민(도 6C 및 6E), TCEP(도 6F), 및 β-메르캅토에탄올(도 6G)이다. 데이터(도 6A 내지 도 6G)는, DTT를 포함하는 것과 마찬가지로, 다른 환원제들 역시, 가우시아 및 메트리디아 루시페라아제로부터의 광 방출의 빠른 감소를 제공한다는 것을 보여준다.
예 7
예 1에 기술된 바와 같이, 비분비성 가우시아 루시페라아제를 포함하는 세포 용해물을 준비하였다. 25 mM Tris pH 7.75, 1 mM EDTA, 2 mM 아스코르브산 및 26 uM 코엘렌테라진을 포함하는 60 ul의 검사 버퍼를 20 ul의 용해물 분취액에 첨가하고, 실온에서 40분동안 배양되도록 두어, 반응이 글로우 상을 시작하도록 하였다. 40분 후(0의 시간) 60 ul의 검사 버퍼를 더 첨가하였다. 이때의 검사 버퍼는, 표시된 농도의 DTT만 포함하고 코엘렌테라진을 포함하지 않는다는 점을 제외하고, 초기의 검사 버퍼와 동일하였다.
제2 검사 버퍼를 주입한 후, 시간대별로 광 방출을 측정하고, 0의 시간에서 광 단위의 백분율로 표현하였다(도 7).
데이터는, 먼저 시작된 반응의 글로우 상 동안 DTT를 첨가한 경우에 있어, 요구되는 광 방출의 빠른 감소가 반응의 시작점에서 환원제를 첨가한 경우와 동일하게 관찰되었음을 나타낸다. 이는, 비분비성 가우시아 루시페라아제 활성이 글로우 반응과 같은 표준 반응에서 측정되고, 이후 환원제의 첨가에 의해 종료될 수 있 다는 것을 시사한다. 또는, 루시페라아제 활성이 환원제의 첨가 직후, 즉 플래시 반응에서 사용되는 바와 동일한 방식으로 측정될 수 있다. 환원제의 첨가 이후 처음 수 초동안 광 방출에서 임의의 현저한 감쇄가 나타나지 않는다는 것은, 그러한 프로토콜이 임의의 신호 강도 감소를 야기하지 않을 것이라는 점을 시사한다.
2부: 환원제는 서로 다른 기질을 포함한 서로 다른 루시페라아제를 사용하는 다중 리포터 검사를 수행하는 데에 사용될 수 있음.
예 8
비분비성 불안정 가우시아 루시페라아제 및 불안정 반딧불이 루시페라아제를 안정적으로 발현하는 헬라 세포들을 96-웰판상에 놓고, 밤새 배양하였다. 배지를 제거하고, 예 1에 기술된 20 ul의 용해 버퍼에서 세포들을 용해시켰다. 이하 시간에 발광계로 1초동안 광 방출을 측정하였다: 검사 버퍼의 첨가 직전(LB = 기질이 없는 경우의 배경 신호); 25 mM Tris pH 8.1, 1 mM EDTA, 2 mM 아스코르브산염, 23.6 uM Cz 및 50 mM DTT를 포함하는 가우시아 검사 버퍼(Ga)의 첨가 직후; Ga 검사 버퍼의 첨가 후 15분 후(15분); 그리고, 이후, 25 mM Tris pH 7.35, 6 mM MgSO4, 36 mM DTT, 0.11 mM EDTA, 0.58 ATP, 0.3 mM CoA, 0.52 mM 루시페린, 1 mg/ml BSA를 포함하는 60 ul의 반딧불이 검사 버퍼(FF)를 추가한 후 1초 후에 측정하였다. 도 8에 도시된 결과는, 가우시아 루시페라아제의 강한 생물 발광 신호는 플래시 반응에서 측정될 수 있으나, 소멸 시약의 개입 또는 첨가의 필요 없이, 약 15분 내에 배결 수준으로 감쇄한다는 것을 보여준다. 그 이후, 반딧불이 시약의 첨가로 반딧 불이 신호가 측정되고, 따라서, 이중 루시페라아제 검사를 완료한다.
예 9
다중 탄뎀 CRE의 조절하에 불안정 반딧불이 루시페라아제를 포함하는 플라스미드(CRE-FF) 및 다중 탄뎀 NFkB-결합 부위에 의해 동작하는 불안정 세포내 가우시아 루시페라아제를 포함하는 플라스미드(NFkB-Ga)와, 또는 둘 중 하나와 293T 세포들을 일시적으로 트랜스팩션하였다. 트랜스팩션한 세포들을 96-웰판상에 놓고 밤새 배양하였다. 4중 웰을 10 uM(최종 농도)의 포르스콜린 또는 10 ng/ml TNF-alpha(TNF)로 처리하거나, 처리하지 않은 채로 그대로 둔다(대조군). 4시간 후, 배지를 제거하고, 예 8에 기술된 바와 같은 프로토콜을 이용하여 각각의 루시페라아제로부터의 발광을 측정하였다.
도 9A는 가우시아 검사 버퍼의 첨가 이후 발광 신호를(예 5 참조), 도 9B는 반딧불이 검사 버퍼의 첨가 이후 신호를 도시한다. 결과에 따르면, 반딧불이 루시페라아제는 가우시아 검사 버퍼에서 실질적으로 발광 신호를 내지 않고(도 9A 참조), 가우시아 루시페라아제는 반딧불이 검사 버퍼에서 실질적으로 신호를 내지 않는다(도 9B 참조). 따라서, 이중 루시페라아제 방법은 2개의 신호를 구분할 때 특히 효과적이다.
NFkB 원소는 TNF에는 강하게 감응하나 포르스콜린에는 그렇지 않고, CRE는 포르스콜린에는 강하게 감응하나 TNF에는 그렇지 않는 것으로 공지되어 있다. 예측한 바와 같이, NFkB-Ga(단독)는 TNF에 의해 강하게 유발되나 포르스콜린에 의해서는 그렇지 않고(도 9A), 반면 CRE-FF(단독)는 포르스콜린에 의해 강하게 유발되나 TNF에 의해서는 그렇지 않다(도 9B). 중요한 것은, 두 개의 구조체와 동시 트랜스팩션된 세포에서 동일한 결과가 나타났다는 것이며, 이중 루시페라아제 검사의 성공 및 유효성을 시사한다.
3부: 환원제는 동일한 기질을 포함한 서로 다른 루시페라아제들을 사용하는 다중 리포터 검사를 실행하는 데에 사용될 수 있음.
예 10
플라스크들에 담긴 헬라 세포들을 비분비성 가우시아 루시페라아제 또는 표준 세포내 레닐라 루시페라아제를 인코딩하는 발현 플라스미드와 일시적으로 트랜스팩션하였다. 24시간 후, 예 1에 기술된 용해 버퍼를 사용하여, 별도의 모제 용해물은 각각의 플라스크 및 대조군 플라스크로부터 준비하였고, 상기 대조군 플라스크 트랜스팩션되지 않은 헬라 세포들이 담겨있다. 용해물을, 10 ul의 가우시아 루시페라아제에 10 ul의 트랜스팩션되지 않은 것을 더한 것(Ga), 10 ul의 레닐라 루시페라아제에 10 ul의 트랜스팩션되지 않은 것을 더한 것(Rn) 또는 10 ul의 가우시아 루시페라아제에 10 ul의 레닐라 루시페라아제를 더한 것(Ga&Rn)으로서, 4중으로 96-웰판상에 놓았다. 예 8에 기술된 바와 같은 검사 버퍼의 첨가 직후 루시페라아제 활성을 측정하고, 이후 1200초 후에 다시 측정하였다.
도 10A는 상대적 광 단위(RLU)로 표현된 1차 데이터(raw date)를 나타낸다. 예상한 바와 같이, 가우시아 발광 신호는 초기에 매우 강했다가, 제2 판독전에 배경 수준으로 감쇄한 반면, 발생된 레닐라 루시페라아제는 초기 낮은 신호를 보이다가, 두 개의 판독 사이에서 훨씬 적게 감쇄하였다. 혼합 용해물(Ga&Rn)은 중간 수 준의 감쇄를 보였다.
가우시아 루시페라아제는 제2 판독에서 검출 가능한 상대적 광 단위(RLU)에 더이상 기여하지 못하므로, 상기 판독은 레닐라 루시페라아제의 정확한 수치이며, 표본들 사이에서 레닐라 루시페라아제의 수준을 비교하는 데에 사용될 수 있다. 초기 판독은 가우시아와 레닐라 루시페라아제로부터의 신호를 조합한 것이다. 그러나 가우시아 루시페라아제에 의해 발생되는 신호는 0의 시간에서 측정되는 상기 조합 신호로부터 초기 레닐라 루시페라아제 신호를 감산함으로써 결정될 수 있다. 초기 레닐라 루시페라아제 신호를 결정하기 위해, 레닐라만 있는 용해물(Rn)을 레닐라 루시페라아제로부터의 광 방출에 대한 감쇄율을 산출하는 기준으로서 사용하였다. 특히, 감쇄 상수 "k"는 k=(초기 Rn 신호)/ (1200초일 때의 Rn 신호)로 산출하였다. 이후, 초기 Rn 신호는 (1200초일 때의 Rn 신호)×k 로 산출하고, 초기 가우시아 루시페라아제 신호는 초기의 조합된 (Ga&Rn) 신호로부터 상기 값을 감산함으로써 산출하였다.
도 10B는 동일한 양의 가우시아 루시페라아제는 포함하고 어떠한 레닐라 루시페라아제도 포함하지 않는 표본에서 측정되는 가우시아 루시페라아제 활성의 현재값(예상 수치; 즉 도 10A의 (Ga))에 대해, 상기 조합 표본에서 가우시아 루시페라아제의 산출된 값(산출 수치)을 비교하였다. 측정값(예상 수치)과 산출값 사이의 차는 매우 적고, 통계적으로 의미가 없으며, 이는 광 방출의 파장 또는 기질 유형의 관점에서 루시페라아제들 사이의 차가 없는 경우에도, 단일 검사 버퍼를 포함하는 2중 루시페라아제 검사를 수행할 수 있다는 것을 시사한다. 서로 다른 방출 파 장을 가진 루시페라아제 또는 소멸 시약의 사용에 의존하는 종래 기술된 다른 2중 루시페라아제 검사와 달리, 여기서 기재한 방법은 광 방출의 동적 특성의 관점에서 루시페라아제들 사이의 차를 이용한다. 서로 다른 루시페라아제 신호를 구별하기 위해 광 방출의 시간적 차를 이용하는 것은 본 발명자에게 선공지되지 않은 지식이다. 상기 예시에서, DTT와 같은 환원제를 포함함으로써 2개의 신호를 분리하는 것이 매우 향상되었다. 이는, DTT가 레닐라 및 반딧불이 루시페라아제와 같은 세포내 루시페라아제로부터의 신호를 안정시키는 한편, 가우시아 루시페라아제와 같이 야생 상태에서 정상적으로 분비되는 루시페라아제로부터의 광 방출의 지속 시간을 급격하게 단축시킨다는 대단한 발견에 근거하여 가능하였다.
예 11
본 발명자는, 일 분비성 루시페라아제 및 일 세포내 루시페라아제의 사용에 근거한 이중 루시페라아제 검사의 가능성을 고려하였다. 상기 두 개의 루시페라아제들을 모두 발현하는 세포들은 조건 배지(분비성 루시페라아제 포함) 및 세포 용해물(세포내 루시페라아제를 포함함)의 소스로서 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 2개의 루시페라아제들은 기질 특이도의 차이 보다는 상기 루시페라아제들의 위치에 의해 분리되었다. 그러나, 이러한 검사는, 용해물이 검출 가능한 분비성 루시페라아제를 포함하지 않는 것이 필요할 것이고, 분비성 루시페라아제가 세포내에서 생성되어 분비 전에 소포체(ER)를 통과하며 유동해야 한다는 것을 고려하지 않은 것으로 보일 것이다. 실제로 예비 실험에서는, 분비성 가우시아 루시페라아제를 발현하는 세포들이, 배양 배지를 제거하고, 상기 세포들을 반복 세척한 후에도 상당량의 루시페라아제를 포함하는 것으로 나타났다. 결과적으로 얻어진 용해물 신호의 적어도 일부분은, 아직 ER을 통과하지 않고 분비된 최근 번역된 루시페라아제 분자로부터 유도된 것임이 분명하다. 잠재적으로는, 이러한 신호의 일부는, ER의 내부에 고착되거나, 또는 분비되었으나 세포막의 세포외측에 결합된 오래된 루시페라아제 분자들로부터 유도될 수 있다. 이러한 간섭적 루시페라아제 신호의 소스와 상관없이, 본 발명자는 용해 버퍼에서 환원제를 포함함으로써 상기 신호를 제거할 수 있다고 추론하였다.
이러한 가설을 검증하기 위해, 플라스미드 TRE-Rn 및 CMV Ga(야생형, 분비성)를 각각 단독으로 또는 조합하여 헬라 세포들을 동시 트랜스팩션하였다. 후자의 경우, 분비성 가우시아 루시페라아제의 구성적 발현(constitutive expression)을 제공하는 반면, 전자의 경우 세포내 레닐라 루시페라아제의 독시사이클린-억제성 발현을 제공한다. 세포들을 밤새 배양하고, 배지를 제거하며, 2 ug/ml 독시사이클린을 포함하거나 포함하지 않은 배지의 새로운 분취액을 첨가하기 전에 세포들을 1회 세척하였다. 2시간, 6시간 및 24시간 후에, 조건 배지의 표본을 채취하였다. 25 mM Tris pH 8.1, 150 mM NaBr, 1 mM EDTA, 63.4 uM 옥살산나트륨, 0.1 % NP40 치환물, 5% 글리세롤을 포함하고; 그리고 50 mM DTT를 포함하거나 포함하지 않은 용해 버퍼를 사용하여 용해시키기 전에, 상기 세포들을 신선 배지에서 세척하였다. 이후, 25 mM Tris pH 7.75, 1 mM EDTA, 2 mM 아스코르브산 및 26 uM 코엘렌테라진을 포함하는 60 ul의 검사 버퍼를 첨가한 후, 루시페라아제 활성을 위해 조건 배지 및 세포 용해물의 20 ul 분취액들을 검사하였다.
도 11A 및 11B는 2시간이라는 시간점에서 독시사이클린을 포함하지 않은 표본들로부터의 데이터를 도시한다. 표준 용해 버퍼(도 11A)를 사용하여, 분비성 가우시아(Ga) 루시페라아제만 발현하는 세포들의 용해물에서 강한 신호가 검출되었다. 실제로, 상기 신호는 비분비성 레닐라(Rn) 루시페라아제만 발현하는 세포들의 용해물의 경우보다 훨씬 높았다. 분명한 것은, 분비성 가우시아 루시페라아제가 조건 배지에 구속(confined)되지는 않는다는 것이다. 그와 달리, DTT가 용해 버퍼에 포함된 경우(도 11B), 가우시아 루시페라아제만 발현하는 세포들의 용해물에서는 어떠한 신호도 검출되지 않았다. 레닐라에 의한 신호만 있는 용해물과 가우시아에 의한 신호만 있는 배지에 의해 증명되는 바와 같이, 이러한 프로토콜을 이용하여, 분비성 가우시아 루시페라아제로부터 비분비성 레닐라 루시페라아제를 구별할 수 있다.
본 시스템의 기능성 및 활용도를 더욱 나타내기 위해, 모든 시간점으로부터의 데이터를 -독시사이클린에 대한 +독시사이클린으로 표현하였다(도 11C, 11D). 레닐라 루시페라아제는 TRE 촉진자에 연결되어, 적정 시간 경과 후 레닐라 루시페라아제만 감소할 것임을 밝혀둔다. 따라서, 분비성 가우시아(Ga) 루시페라아제와 비분비성 레닐라(Rn) 루시페라아제를 정확히 구별하는 본 시스템은, 세포 용해물값은 감소하나, 조건 배지값은 감소하지 않음을 나타낼 것이다. DTT를 포함한 용해 버퍼를 사용하여 얻어진 데이터를 나타내는 도 11D에서 상기 효과가 실제적으로 증명된다. 이와 달리, DTT를 포함하지 않은 용해 버퍼를 사용하면(도 11C), 2개의 루시페라아제들의 신호를 분리할 수 없음이 명백하다.
4부: 환원제는 낮은 배경 신호를 제공함
예 12
트랜스팩션되지 않은 헬라 세포들 및 비분비성 가우시아 루시페라아제를 발현하는 헬라 세포들에 대해 다음과 같이 루시페라아제 검사를 시행하였다. 세포들을 96-웰판상에 동일한 분취액으로 놓고 밤새 배양하였다. 배지를 제거하고, 예 1에 기술된 바와 같은 20 ul의 용해 버퍼에서 세포들을 용해시켰다. 40분 후, Wallac Victor3 발광계(Perkin Elmer)를 이용하여, 60 ul의 검사 버퍼 주입 직전 및 직후에 광 방출을 측정하였다. 상기 검사 버퍼는 25 mM Tris pH 8.1, 23.6 uM 코엘렌테라진, 1 mM EDTA, 2 mM 아스코르브산염과 함께 표시된 농도의 DTT를 포함한다(도 8 참조).
도 12A는 주입 후 상대적 광 단위(RLU)로서 표현된 1차 데이터를 나타낸다. 세포 용해물에는 루시페라아제가 없으므로, 상기 데이터는 검사의 배경 신호를 나타낸다. 도 12B는 예비 판독(검사 버퍼 첨가 전 측정)의 감산 후 데이터를 나타낸다. 따라서, 이러한 데이터는 검사 버퍼에 의해 발생된 배경 신호를 나타낸다. 상기 데이터는, 검사 버퍼에 DTT를 포함하는 것이, 전체 배경 신호의 50%이상의 감소를(도 12A), 검사 버퍼에 의해 발생된 배경 신호의 80% 이상의 감소를 제공한다(도 12B)는 것을 나타낸다.
도 12C는, 50 mM DTT가 비분비성 가우시아 루시페라아제를 포함하는 헬라 세포 용해물과의 플래시 반응으로 발생되는 실제 루시페라아제 신호를 감소시키지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 검사 버퍼에서 50 mM DTT를 포함하는 것은 배경 신 호를 감소시키고(도 12A, 12B) 광 방출의 동적 특성을 현저히 단축시키나(다른 예들 참조), 가우시아 루시페라아제로부터의 실제 플래시 신호의 세기를 저하시키지 않는다.
5부: 환원제는 검사 버퍼 활성의 감소를 방지하거나 제한함
예 13
예 1에 기술된 바와 같은 용해 버퍼를 이용하여 비분비성 가우시아 루시페라아제를 안정적으로 발현하는 일 플라스크의 헬라 세포들을 용해시킴으로써, 가우시아 루시페라아제의 모제 용해물을 준비하였다. 20 ul의 용해물을 96 웰판의 각 웰에 놓고, 예 1에 기술된 바와 같은 표준 검사 버퍼(STD) 또는 그와 동일하되 도 13에 도시된 바와 같은 유형 및 양의 환원제를 더 포함하는 검사 버퍼를 주입한 후 플래시 반응에서 광 방출을 측정하였다. 새로 준비한 검사 버퍼를 사용하여 각각의 그룹을 위해 표본들을 4회 측정하였다. 이후 검사 버퍼는 22시간동안 4℃에서 암실에 보관하고, 상기 프로토콜을 반복하였다.
도 13은 이러한 숙성된 검사 버퍼를 사용한 신호 세기를, 신선했을 때의 동일한 검사 버퍼로부터 얻어지는 신호 세기의 백분율로서 나타낸다. 환원제가 없는 경우, 검사 버퍼(STD)의 활성은 저장 중에 60% 이상만큼 감소하였다. 모든 환원제는 이러한 감소를 줄일 때 효과적이었고, 특히, 50 mM DTT가 있는 경우 검사 버퍼 감소의 모든 증거를 완전히 제거한다는 것을 나타낸다.
예 14
불안정 비분비성 가우시아 루시페라아제를 발현하는 헬라 세포들을 96-웰판 상에 동일한 분취액으로 놓고 밤새 배양하였다. 모든 표본에는 동일한 용해 버퍼를 사용하였다. 도 14에 표시된 환원 산화 비율 및 양의 글루타티온을 포함하는 새로운 검사 버퍼를 사용하여 루시페라아제 활성을 측정하였다. 이후, 검사 버퍼는 4시간동안 실온에서 보관한 후 표본을 2회 다시 측정하였다. 도 14는, 글루타티온이 없는 경우 검사 버퍼의 활성이 약 32%만큼 감소하였다는 것을 보여준다. 이러한 감소는 5 mM 글루타티온이 있는 경우 완전히 차단되는데, 상기 글루타티온은 환원 글루타티온만 포함한 것, 산화 글루타티온만 포함한 것, 그리고 상기 2개의 글루타티온이 각각의 비율로 혼합된 것을 포함한다. 그러나 새로운 버퍼의 기선 활성은, 글루타티온 특히 산화된 글루타티온이 안정성을 제공한다는 유리한 효과를 가짐에도 불구하고 검사 버퍼 활성을 감소시킨다는 것을 보여주었다.
예 15
불안정 비분비성 가우시아 루시페라아제를 발현하는 헬라 세포들을 96-웰판상에 동일한 분취액으로 놓고 밤새 배양하였다. 모든 표본에는 동일한 용해 버퍼를 사용하였다. 도 15에 표시된 글루타티온(3:2의 환원:산화 비율)의 총량을 포함하는 새로운 검사 버퍼를 사용하여 루시페라아제 활성을 측정하였다. 이후, 검사 버퍼를 22시간동안 4℃에서 또는 7시간동안 실온에 보관하고, 다시 표본을 2회 측정하였다. 도 15는, 글루타티온이 없는 경우 검사 버퍼의 활성이 약 50%만큼 감소하였다는 것을 나타낸다. 비록 초기 활성이 상기 버퍼에서 감소하여도, 이러한 감소는, 5 mM 글루타티온이 있는 경우 완전히 차단된다. 소량의 글루타티온은, 적정 시간 경과 후 활성 손실 보호 및 초기의 활성 감소 수준의 관점에서 중간 효과를 나타낸 다.
당업자라면, 본 명세서에 기술된 발명이 특이하게 기술된 경우를 제외하고 변형 및 수정이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 모든 그러한 변형 및 수정을 포함하고 있음이 이해될 것이다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 개별적으로 또는 집합적으로 참조하거나 지시한 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 포함하고, 임의의 2개 이상의 상기 단계들 또는 특징들의 모든 조합을 포함한다.

Claims (54)

  1. 제1 루시페라아제를 포함하는 표본 내에서 하나 이상의 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분석될 하나 이상의 루시페라아제의 하나 이상의 반응 기질 및 상기 제1 루시페라아제를 비활성화시키기위한 환원제를 상기 표본과 배양하는 단계를 포함하되, 상기 제1 루시페라아제는 자연형으로 분비된 루시페라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 루시페라아제의 비활성화는 상기 루시페라아제의 촉매 활성을 억제하거나 제거하는 것, 상기 루시페라아제를 비활성 형태로 변환하는 것, 또는 상기 루시페라아제의 촉매활성을 억제하거나 제거하고 상기 루시페라아제를 비활성 형태로 변환하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 루시페라아제는, 자연형으로 분비되는 루시페라아제가 비분비성으로 개질된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 제1 루시페라아제는 기질로서 코엘렌테라진을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 제1 루시페라아제는 기질로서 코엘렌테라진을 사용하고 해양성 기원인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 루시페라아제는 가우시아속, 플류로맘마속, 메트리디아속, 키프리디나속 또는 오플로포루스속으로부터 유도되거나 이들의 변이체 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 환원제는 티올기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 환원제는 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트레이톨(DTE), β-메르캅토에탄올, 시스테아민, 아황산나트륨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 환원제는 DTT인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 제1 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 표본 내에서 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 방법에 있어서, 상기 루시페라아제는 자연형으로 분비된 루시페라아제이며, 상기 방법은:
    (a) 상기 루시페라아제의 반응 기질과 상기 표본을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 루시페라아제를 시간에 따라 비활성화시키는 환원제를 상기 표본과 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 루시페라아제가 상기 환원제에 의해 비활성화되기 전에 상기 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 루시페라아제는, 자연형으로 분비되는 루시페라아제가 비분비성으로 개질된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 표본 내에서 제1 루시페라아제 및 제2 루시페라아제 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 방법에 있어서, 상기 제1 루시페라아제는 자연형으로 분비된 루시페라아제이고 상기 제2 루시페라아제는 세포 내 루시페라아제이며, 상기 방법은:
    (a) 상기 제1 루시페라아제의 반응 기질과 상기 표본을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 제1 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 단계;
    (c) 상기 제1 루시페라아제를 시간에 따라 비활성화시키는 환원제와 상기 표본을 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 제2 루시페라아제의 반응 기질과 상기 표본을 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 제2 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 제1 루시페라아제 및 제2 루시페라아제를 포함하는 표본 내에서 제2 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 방법에 있어서, 상기 제1 루시페라아제는 자연형으로 분비된 루시페라아제이고, 상기 제2 루시페라아제는 세포 내 루시페라아제이며, 상기 방법은:
    (a) 상기 제1 루시페라아제를 시간에 따라 비활성화시키는 환원제와 상기 표본을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 제2 루시페라아제의 반응 기질과 상기 표본을 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 제2 루시페라아제에 의해 발생된 발광 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 자연형으로 분비된 루시페라아제를 비활성화시키기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 루시페라아제를 함유하는 표본을 환원제와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서,
    싱기 루시페라아제는, 자연형으로 분비되는 루시페라아제가 비분비성으로 개질된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서,
    루시페라아제의 비활성화는 상기 루시페라아제의 촉매 활성을 억제하거나 제거하는 것, 상기 루시페라아제를 비활성 형태로 변환하는 것, 또는 상기 루시페라아제의 촉매 활성을 억제하거나 제거하고 상기 루시페라아제를 비활성 형태로 변환하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 표본에서 제1 및 제2 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (a) 상기 제1 루시페라아제를 시간에 따라 비활성화시키지만 상기 제2 루시페라아제를 비활성화시키지 않는 환원제 및 상기 제1 루시페라아제와 제2 루시페라아제에 대한 반응 기질을 상기 표본과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 환원제에 의해 상기 제1 루시페라아제가 비활성화되기 전에 발광 신호를 측정하는 단계;
    (c) 상기 제1 루시페라아제가 비활성화된 후 발광 신호를 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 (b) 및 (c) 단계에서 수집된 데이터를 이용하여 루시페라아제 각각의 양 또는 활성을 서로에 대해 또는 다른 표본에 대해서 산출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 표본에서 제1 및 제2 루시페라아제의 양 또는 활성을 결정하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (a) 상기 제1 루시페라아제를 시간에 따라 비활성화시키지만 상기 제2 루시페라아제를 비활성화시키지 않는 환원제 및 상기 제1 루시페라아제에 대한 반응 기질을 상기 표본과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 제1 루시페라아제가 비활성화되기 전 발광 신호를 측정하는 단계;
    (c) 상기 제2 루시페라아제를 위한 반응 기질과 상기 표본을 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 제1 루시페라아제가 비활성화된 이후 발광 신호를 측정하는 단계; 및
    (e) 상기 (b) 및 (c)에서 수집된 데이터를 이용하여 루시페라아제 각각의 양 또는 활성을 서로에 대해 또는 다른 표본에 대해서 산출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 삭제
KR1020097015110A 2006-12-21 2007-12-21 분비성 루시페라아제를 이용하는 생물 발광 검사 KR101478373B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87637006P 2006-12-21 2006-12-21
US60/876,370 2006-12-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090113831A KR20090113831A (ko) 2009-11-02
KR101478373B1 true KR101478373B1 (ko) 2014-12-31

Family

ID=39535910

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097015110A KR101478373B1 (ko) 2006-12-21 2007-12-21 분비성 루시페라아제를 이용하는 생물 발광 검사

Country Status (7)

Country Link
US (5) US8399212B2 (ko)
EP (2) EP2104741B1 (ko)
JP (1) JP5701505B2 (ko)
KR (1) KR101478373B1 (ko)
CN (1) CN101636504B (ko)
AU (1) AU2007335194B2 (ko)
WO (1) WO2008074100A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011025980A1 (en) 2009-08-29 2011-03-03 Targeting Systems Modified luciferases and uses thereof
US10428317B2 (en) 2010-12-03 2019-10-01 Gene Stream Pty Ltd Light-emitting molecules
CN102721734B (zh) * 2012-06-27 2014-07-23 深圳翰宇药业股份有限公司 多肽内二硫键的定位方法
RU2571229C2 (ru) * 2013-10-31 2015-12-20 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский физико-технический институт (государственный университет) Биолюминесцентный способ определения антиоксидантной активности вещества
CN109957604B (zh) * 2017-12-25 2022-09-02 中国科学院深圳先进技术研究院 一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用
JP2019010115A (ja) * 2018-09-13 2019-01-24 国立大学法人横浜国立大学 ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害方法及びキット
US20220348984A1 (en) * 2019-06-21 2022-11-03 Technische Universiteit Eindhoven Ratiometric detection of luciferase assays using a calibrator luciferase
US20220291203A1 (en) * 2019-07-25 2022-09-15 Immunowake Inc. Methods of measuring cell-mediated killing by effectors
WO2024031306A1 (zh) * 2022-08-09 2024-02-15 深圳华大生命科学研究院 一种双荧光素酶报告基因检测系统及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003044223A2 (en) * 2001-11-16 2003-05-30 Pierce Biotechnology, Inc. Phosphine-containing formulations for chemiluminescent luciferase assays

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283179A (en) 1990-09-10 1994-02-01 Promega Corporation Luciferase assay method
US5744320A (en) * 1995-06-07 1998-04-28 Promega Corporation Quenching reagents and assays for enzyme-mediated luminescence
US6228604B1 (en) * 1996-04-10 2001-05-08 Loma Linda University Secreted renilla luciferase
EP0981633A2 (en) * 1997-02-13 2000-03-01 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Hybrid molecules for optically detecting changes in cellular microenvironments
US6171809B1 (en) * 1998-01-29 2001-01-09 Packard Instrument Company Method and compositions for detecting luciferase biological samples
NL1010224C2 (nl) 1998-09-30 2000-03-31 Packard Biosciene B V Werkwijze voor het detecteren van ATP.
DE02708018T1 (de) 2001-03-09 2004-09-30 Gene Stream Pty. Ltd. Neue expressionsvektoren
JP2004089117A (ja) * 2002-09-03 2004-03-25 Toyo B-Net Co Ltd ルシフェラーゼ検出試薬キット及び当該キットを使用したルシフェラーゼ検出方法
JP2006517413A (ja) * 2003-02-12 2006-07-27 プロメガ　コーポレイション 光を発光反応から消失させる二重酵素アッセイの方法及びキット
JP4546115B2 (ja) 2004-03-05 2010-09-15 三菱化学メディエンス株式会社 細胞中ａｔｐの定量法
ATE429507T1 (de) 2004-07-02 2009-05-15 Promega Corp Zusammensetzungen und verfahren zur extraktion und detektion von mikrobiellem atp
US7939286B2 (en) * 2005-03-07 2011-05-10 Targeting Systems Enhancing a luminescent signal
EP1724359A1 (en) * 2005-05-18 2006-11-22 PerkinElmer Life and Analytical Sciences B.V. Luciferase assay system
EP2778234B1 (en) 2005-05-31 2017-09-27 Promega Corporation Luminogenic and fluorogenic compounds and methods to detect molecules or conditions
AU2006281994B2 (en) 2005-08-19 2011-10-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Arachnocampa luciferases
US8232047B2 (en) 2006-10-24 2012-07-31 Gene Stream Pty Ltd. Luciferase signal enhancing compositions
JP2008113620A (ja) * 2006-11-07 2008-05-22 Toyobo Co Ltd ルシフェラーゼの発光方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003044223A2 (en) * 2001-11-16 2003-05-30 Pierce Biotechnology, Inc. Phosphine-containing formulations for chemiluminescent luciferase assays

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Biol. Chem., vol.279(5), pp.3212-3217(2004). *
J. Biol. Chem., vol.279(5), pp.3212-3217(2004).*

Also Published As

Publication number Publication date
US11078519B2 (en) 2021-08-03
CN101636504A (zh) 2010-01-27
WO2008074100A1 (en) 2008-06-26
US10364454B2 (en) 2019-07-30
US20130217593A1 (en) 2013-08-22
KR20090113831A (ko) 2009-11-02
EP2845909B1 (en) 2018-01-31
EP2845909A1 (en) 2015-03-11
US20150191769A1 (en) 2015-07-09
US20200024637A1 (en) 2020-01-23
JP5701505B2 (ja) 2015-04-15
CN101636504B (zh) 2012-10-31
AU2007335194A1 (en) 2008-06-26
EP2104741A4 (en) 2010-02-17
US20100092967A1 (en) 2010-04-15
JP2010512759A (ja) 2010-04-30
EP2104741A1 (en) 2009-09-30
US8399212B2 (en) 2013-03-19
US9012164B2 (en) 2015-04-21
US9567624B2 (en) 2017-02-14
EP2104741B1 (en) 2014-12-03
AU2007335194B2 (en) 2014-01-23
US20170211126A1 (en) 2017-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101478373B1 (ko) 분비성 루시페라아제를 이용하는 생물 발광 검사
JP6120335B2 (ja) ルシフェラーゼシグナルを増強する組成物
EP2694687B1 (en) An in vitro method for high throughput screening of genotoxic agents in eukaryotic cells
JP2012524523A (ja) 遺伝毒性試験
JP2008113620A (ja) ルシフェラーゼの発光方法
JP2009142188A (ja) 多色ルシフェラーゼの抽出方法
JP4849540B2 (ja) ２つの分泌ルシフェラーゼ
JP2009112199A (ja) 多色ルシフェラーゼの検出方法
JP2008113619A (ja) 発光持続性の高いルシフェラーゼを用いた破壊系細胞アッセイ法
WO2011036812A1 (ja) アリルハイドロカーボンレセプター転写活性化量を測定するための細胞、方法およびアッセイキット
JP2008148679A (ja) 新規アッセイ方法
JP2005192565A (ja) 発光性渦鞭毛藻由来青色発光酵素を用いた細胞内遺伝子転写活性測定法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171117

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181129

Year of fee payment: 5