CN107794312A - 用于检测非洲猪瘟病毒的引物对和探针的组合产品、组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents

用于检测非洲猪瘟病毒的引物对和探针的组合产品、组合物、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病原体检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物对和探针的组合产品、组合物、试剂盒及其应用。本发明所提供的试剂盒能检测非洲猪瘟病毒，并能够为非洲猪瘟病毒的临床治疗提供指导，为非洲猪瘟疫情的监测、防控提供强有力的技术支持。更为重要的是，由于本发明所提供的试剂盒具有优秀的特异性和灵敏度，因而可免除核酸提取过程；待检样本经过裂解液和中和液处理后可以取代核酸提取过程，使得操作更简单，有很好的应用前景。

Description

用于检测非洲猪瘟病毒的引物对和探针的组合产品、组合物、 试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及病原体检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物对和探针的组合产品、组合物、试剂盒及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine fever，East African Swine fever，ASF)，是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100％，临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾，胃肠粘膜明显出血。世界卫生组织(OIE)将其列为必须通报疾病。
非洲猪瘟的检测技术有酶联免疫(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR) 等，目前比较主流的是酶联免疫(ELISA)检测技术。但是酶联免疫(ELISA) 只能用于检测动物体内是否有非洲猪瘟病毒的抗体，确切的说只能检测已经感染或者接种过疫苗的猪群，而对非洲猪瘟的疫情监测起不到很好的效果，因此迫切需要PCR检测技术。PCR检测技术针对的是样本中的病毒，只有一定数目的病毒，就能通过PCR检测技术检测出来，达到对非洲猪瘟的监控效果。
PCR检测技术又分为荧光定量PCR与普通PCR，荧光定量PCR与普通PCR相比，无需电泳过程，有特异性更强，有效解决PCR污染问题，避免了有机溶剂给实验人员带来的危害，更加适合疫病的监控，是未来的疫病检测方向。
一般的荧光定量检测前需要提取样本中的核酸，提取核酸需要一定的时间和成本，降低了检测效率。因此建立一种免核酸提取的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测技术，具有重要的现实意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明人经过创造性的劳动和大量的试验，得到了能够用于检测非洲猪瘟病毒的引物对和探针，所述引物对和探针特异性强、灵敏度高，将其用于非洲猪瘟病毒检测时不需要提取核酸，简化的操作流程。由此提供了下述发明。
本发明的一个方面涉及一种引物对和探针的组合产品，包括：
核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2所示的上下游引物，以及核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示的探针。
所述引物对和探针的组合产品能够用于检测非洲猪瘟病毒，灵敏度高，特异性好。
本发明的另一方面还涉及一种组合物，其含有如上所述的引物对和探针的组合产品。
本发明的另一方面还涉及一种试剂盒，其包含权利要求如上所述的引物对和探针的组合产品，优选还包括荧光定量PCR反应缓冲液、样品处理液、无核酸水、DNA聚合酶、阴性对照以及阳性对照中的一种或多种。
根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的引物对和探针的组合产品、如上所述的组合物或如上所述的试剂盒在制备用于检测非洲猪瘟病毒的试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所提供的引物对和探针组合产品具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、检测成本低、时间短、检测效率高、准确性高、假阳性低等优点。本发明试剂盒能检测非洲猪瘟病毒，并能够为非洲猪瘟病毒的临床治疗提供指导，为非洲猪瘟疫情的监测、防控提供强有力的技术支持。更为重要的是，由于本发明所提供的试剂盒具有优秀的特异性和灵敏度，因而可免除核酸提取过程；待检样本经过裂解液和中和液处理后可以取代核酸提取过程，使得操作更简单，有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的免核酸提取法检测非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR 试剂盒的结构示意图。
具体实施方式
本发明的一个方面涉及一种引物对和探针的组合产品，包括：
核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2所示的上下游引物，以及核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示的探针。
所述引物和探针可以根据本领域的现有技术合成，也可以委托专业的公司制备。
该组合产品可以将SEQ ID NO：1-3所示的核苷酸分别储存于不同的容器，例如EP管中，也可以混合存放。
具体地，所述探针带有可检测的标记。
优选的，根据本发明任一项所述的引物对和探针的组合产品，所述探针均为自身淬灭探针。
优选的，根据本发明任一项所述的引物对和探针的组合产品，所述自身淬灭探针的5′端标记荧光发射基团，3′端标记淬灭基团。
优选的，根据本发明任一项所述的引物对和探针的组合产品，所述荧光发射基团选自FAM、HEX、VIC或JOE中的任一种，更优选为FAM。
优选的，根据本发明任一项所述的引物对和探针的组合产品，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ或MGB中的任一种，更优选为BHQ，更优选为BHQ1。
本发明的另一方面还涉及一种组合物，其含有如上所述的引物对和探针的组合产品。
所述组合物可以以溶液的形式存在，溶剂优选为水；所述组合物中还可以包括pH缓冲试剂及酶等。
所述组合物能够用于检测非洲猪瘟病毒。
本发明的另一方面还涉及一种试剂盒，其包含权利要求如上所述的引物对和探针的组合产品，优选还包括荧光定量PCR反应缓冲液、样品处理液、无核酸水、DNA聚合酶、阴性对照以及阳性对照中的一种或多种。
优选的，所述DNA聚合酶可加入所述荧光定量PCR反应缓冲液中，组成荧光定量PCR反应液进行整合包装。
更优选的，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、 Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、 Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种；
更优选地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
优选的，根据本发明任一项所述的试剂盒，所述样品处理液包括裂解液和/或中和液；
优选的，所述裂解液的主要成分为：13～17mM EDTA、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、NP-40 1.5～2.5v/v％、CHAPS 35～45g/L、2～3mM DTT、SDS 41～51g/L以及50～70mMNaCl；
更优选的，所述裂解液的主要成分为：15mM EDTA、Triton X-100 1 v/v％、NP-402v/v％、CHAPS 40g/L、2.5mM DTT、SDS 46g/L以及60mM NaCl；
优选的，所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、0.15～0.25mM PMSF、1.7～2.3mM DTT、pharmalyte 1.7～2.3 v/v％以及100～120mMNaCl；
更优选的，所述中和液的主要成分为：甘油10v/v％、Triton X-100 1.0 v/v％、0.2mM PMSF、2.0mM DTT、pharmalyte 2.0v/v％以及110mM NaCl；
更优选的，所述样品处理液所处理的样品包括猪的鼻腔拭子、血液、血清、血浆、组织液、淋巴液、精液、细胞或组织。
优选的，根据本发明任一项所述的试剂盒，其还包含阳性对照和/或阴性对照；
所述阳性对照选自非洲猪瘟病毒标准毒株或含有非洲猪瘟病毒标准毒株基因组的质粒；
所述阴性对照为无核酸水。
本发明提供的试剂盒能够用于检测非洲猪瘟病毒。
根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的引物对和探针的组合产品、如上所述的组合物或如上所述的试剂盒在制备用于检测非洲猪瘟病毒的试剂中的应用。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
本发明免核酸提取法检测非洲猪瘟病毒检测荧光定量PCR试剂盒可以用于猪的鼻腔拭子、血液、血清、血浆中的非洲猪瘟病毒检测，具体实施方法如下：
1、血液、血清、血浆样本：
1)将样本混匀，取20ul加入1.5ml离心管中，然后加入100ul裂解液，旋涡振荡1min。
2)加入100ul中和液，震荡混匀。
3)12000rpm离心2min，取上清100ul于新的离心管中待检。
2、鼻腔拭子
1)将样本混匀，离心取20ul上清加入1.5ml离心管中，然后加入100ul 裂解液，旋涡振荡1min。
2)加入100ul中和液，震荡混匀。
3)12000rpm离心2min，取上清100ul于新的离心管中待检。
3、组织
1)将组织用研磨器磨碎，加入1ml PBS溶液混匀，离心取20ul上清加入1.5ml离心管中，然后加入100ul裂解液，旋涡振荡1min。
2)加入100ul中和液，震荡混匀。
3)12000rpm离心2min，取上清100ul于新的离心管中待检。
其中，裂解液配方(10ml)：
药品名称 用量
0.05M EDTA(pH＝8.0) 0.3ml
0.1M Tris-HCL(pH＝8.0) 0.75ml
Triton X-100 0.1ml
NP-40 0.2ml
CHAPS 0.4g
100mM DTT 0.25ml
SDS 0.46g
PBS(pH＝7.4) 3.54ml
0.15M NaCl 4.0ml
中和液配方(10ml)
药品名称 用量
甘油 1.0ml
0.1M Tris－HCL(pH＝8.0) 0.75ml
Triton X-100 0.1ml
5mM PMSF 0.4ml
100mM DTT 0.2ml
pharmalyte 0.2ml 0.2ml
0.15M NaCl 7.35ml
本发明免核酸提取法检测非洲猪瘟病毒检测荧光定量PCR试剂盒的反应体系：阴性对照、阳性对照或样本14.5ul，反应液7.5ul，引物探针3ul，总体积是25ul。
本发明免核酸提取法检测非洲猪瘟病毒检测荧光定量PCR试剂盒的反应条件：
第一步：
95℃20S
第二步：95℃15S，60℃1min，40个循环，其中60℃设置采集荧光信号。
第三步：本发明免核酸提取法检测非洲猪瘟病毒检测荧光定量PCR试剂盒的结果判定：
1、阳性对照：CT值＜32并有明显的扩增曲线。
阴性对照：无CT值或者CT值>37，无明显扩增曲线。
以上要求需同时满足，否则本次实验无效，需要重新进行。
2、样本CT值<32并有明显的扩增曲线，则判为阳性
3、样本CT值>37并无扩增曲线，则判为阳性
4、样本CT值介于32和37之间则判为可疑，需重复检测。若第二次检测CT值仍为32-37并有明显扩增曲线则判定为阳性，否则为阴性。
本发明所用的PCR扩增仪为ABI 7500,扩增所用的反应体系液采购于 Themo品牌。
本试剂盒保存条件是-20度以下。
图1为本发明免核酸提取法检测新城疫病毒检测荧光定量PCR试剂盒的结构示意图。
图中1-5号是高密性发泡模具小孔，可以插入该产品中任意组成成分容器；6为盒体。但为了更好的区分放入的组成成分是否正确，减少出错几率，一般按照如下排序放入，同时不同组分的容器盖选取不同颜色。另有样本裂解液和中和液放在侧面空隙中。
其中，优选的：
孔1——引物探针，棕色瓶装；
孔2——反应液，黄盖瓶装；
孔3——无核酸水，无色瓶装；
孔4——阴性对照，绿盖瓶装；
孔5——阳性对照，红盖瓶色。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大有泰莱生物技术有限公司
<120> 用于检测非洲猪瘟病毒的引物对和探针的组合产品、组合物、试剂盒及其应
用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgctcatgg tatcaatctt atcga 25
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gataccacaa gatcrgccgt 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccacgggagg aataccaacc cagtg 25

Claims (10)

1.一种引物对和探针的组合产品，包括：
核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2所示的上下游引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的探针。
2.根据权利要求1所述的引物对和探针的组合产品，其特征在于，所述探针为自身淬灭探针。
3.根据权利要求2所述的引物对和探针的组合产品，其特征在于，所述自身淬灭探针的5′端标记荧光发射基团，3′端标记淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的引物对和探针的组合产品，其特征在于，所述荧光发射基团选自FAM、HEX、VIC或JOE中的任一种，优选为FAM。
5.根据权利要求3所述的引物对和探针的组合产品，其特征在于，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ或MGB中的任一种，优选为BHQ，更优选为BHQ1。
6.一种组合物，其含有权利要求1-5任一项所述的引物对和探针的组合产品。
7.一种试剂盒，其包含权利要求1-5任一项所述的引物对和探针的组合产品，优选还包括荧光定量PCR反应缓冲液、样品处理液、无核酸水、DNA聚合酶、阴性对照以及阳性对照中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述样品处理液包括裂解液和/或中和液；
优选的，所述裂解液的主要成分为：13～17mM EDTA、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、NP-40 1.5～2.5v/v％、CHAPS 35～45g/L、2～3mM DTT、SDS 41～51g/L以及50～70mMNaCl；
优选的，所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、0.15～0.25mM PMSF、1.7～2.3mM DTT、pharmalyte 1.7～2.3v/v％以及100～120mM NaCl；
更优选的，所述样品处理液所处理的样品包括猪的鼻腔拭子、血液、血清、血浆、组织液、淋巴液、精液、细胞或组织。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照选自非洲猪瘟病毒标准毒株或含有非洲猪瘟病毒标准毒株基因组的质粒；
和/或；
所述阴性对照为无核酸水。
10.权利要求1-5任一项所述的引物对和探针的组合产品、权利要求6所述的组合物或权利要求7-9任一项所述的试剂盒在制备用于检测非洲猪瘟病毒的试剂中的应用。
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