WO2007061141A1 - 改変パラミクソウイルスおよびその作製方法 - Google Patents

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seq
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Yasufumi Kaneda
Katsuto Tamai
Kotaro Saga
Masako Kawachi
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Genomidea, Inc.
Osaka University
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    • C12N2810/859—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from immunoglobulins

Definitions

  • the present invention relates to a modified paramyxovirus having a reduced amount of receptor-binding protein, and a method for producing a modified paramyxovirus using a nucleic acid that suppresses expression of the receptor-binding protein.
  • the present invention relates to a modified HVJ in which the amount of HN protein is reduced, and a method for producing modified HVJ using siRNA.
  • the present invention also relates to a vector capable of site-specific delivery of a drug and a method for producing the same.
  • Viruses are thought to be capable of surviving by gradually changing their functions so that they can coexist with the host, even if the pathogen kills the host by repeating mutations. Therefore, it can be said that there are many mutants in nature even with a single virus, and their research has clarified the functions of viruses at the molecular level. This is not only valuable from a basic biological point of view, but also from a medical point of view, such as the development of antiviral vaccines. Have also been regarded as important. Isolation of naturally occurring virus mutants is not only time consuming, but the desired mutants can be obtained only by chance.
  • HVj Hemagglutinating Virus of Japan; Sendai virus
  • Sendai virus is a virus belonging to the Paramyxoviridae family that has a membrane and has hemadalchun and neuraminidase on its surface.
  • HVJ has (single-strand RNA) in the genome, and after infection of host cells, (+) RNA is replicated from (+) strand, and then virus protein is produced in large quantities to produce virus particles and budding. And new virus particles are created.
  • HVJ is attracting attention as a fusion of Erich tumor cells (Okada, Microken Journal, 1, p. 103-110, (1958)), and analysis of cell membrane fusion activity (hereinafter referred to as fusion activity) is underway.
  • HN hemagglutinating protein recognizing acetyl sialic acid on the cell surface, degrading its sugar chain by the activity of sialidase, and then F (fus ion) protein enters the lipid bilayer. Is done.
  • This HN protein has erythrocyte agglutinating activity and hemolytic activity, and when administered into blood, it causes a temporary decrease in blood coagulation ability.
  • This virus is also developed as a vector for gene transfer and drug delivery. Even if HVJ containing the target molecule is prepared, the presence of HN protein is expected to reduce its specificity.
  • HVJ Hemagglutinating virus of Japan; Sendai virus
  • Sendai virus is well known as a mouse parainfluenza virus that causes Itocyst fusion.
  • the recombinant Sendai Winores betater, HVJ envelope vector, HVJ _ribosome For example, gene transfer vectors and drug delivery systems have been developed.
  • the fusion is induced by HN (hemagglutinat ng) protein recognizing acetyl sialic acid on the cell surface, cleaving its sugar chain with the activity of sialidase, and then F (fus ion) protein entering the lipid bilayer.
  • HN hemagglutinat ng
  • F farus ion
  • a liposome was prepared by using a part of a lipid having an amino group, and an immunoliposome was prepared by binding a chemically modified antibody molecule to the amino group using a crosslinking agent.
  • Fomita N, et al., J. Gene Medicine ⁇ vol.4, p.527-535 (2002) was fused with inactivated HVJ to produce HVJ—immunoliposome ⁇ .
  • HV J-immunol iposome prepared using a monoclonal antibody that recognizes Thy-1 antigen in rat kidney mesangial cells is injected from peripheral blood vessels, it naturally collects in the reticuloendothelial system of the liver and spleen. Phosphores accumulated in the right and left kidney mesangium, making it possible to introduce fluorescent oligonucleic acid into 90% of the glomeruli. This means that even if an HN protein is present, if the target molecule is inserted and it is first recognized and bound to a specific cell, then fusion occurs and a specific introduction is possible. Is indicated.
  • the first object of the present invention is to provide a modified parameter that can be used as a highly safe vector. It is an object of the present invention to provide a method for easily obtaining a sovirus and the modified paramyxovirus.
  • the second object of the present invention is to provide a paramyxovirus vector capable of site-specific delivery of a drug and a novel method for producing the vector.
  • the present inventors have found that if the RNA of the HN protein of HVJ is knocked out with siRNA, the virus can be produced while its inhibitory effect is effective.
  • HN protein is deficient, and that such HN protein deficient viruses have reduced hemagglutination activity.
  • a fusion virus such as Sendai virus incorporates a surface protein derived from a viral gene expressed on the host cell membrane when virus particles are released outside the cell.
  • a surface protein derived from a viral gene having a targeting molecule in the extracellular domain is expressed on the cell membrane, and the cell is infected with the virus. Therefore, a chimeric gene containing a gene encoding the transmembrane domain of the Sendai virus fusion (F) protein and a gene of a single chain antibody fragment against the protein expressed in the basal layer of the epidermis was obtained.
  • F Sendai virus fusion
  • the present invention provides the following.
  • a modified paramyxovirus characterized in that the amount of receptor-binding protein contained is reduced compared to the wild type.
  • [3] containing a nucleic acid that suppresses expression of a receptor binding protein of paramyxovirus, Virus described in [I] or [2].
  • [4] A virus envelope vector prepared from the virus according to [1] or [2].
  • a method for producing a modified paramyxovirus comprising the following steps: (1) introducing a nucleic acid that suppresses the expression of a paramyxovirus receptor binding protein into an animal cell;
  • nucleic acid that suppresses the expression of a receptor-binding protein of paramyxovirus is si RNA for mRNA encoding the protein.
  • the nucleic acid that suppresses the expression of HV J HN protein is a si RNA against HV J H NmRNA, comprising a sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3, 4, and 5. The method according to [8].
  • [1 2] A si RNA against HV J HN mRNA, wherein the nucleic acid that suppresses the expression of a paramyxovirus receptor binding protein comprises a sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3, 4 and 5 The animal cell according to [1 1].
  • siRNA against HVJ HN mRNA comprising a sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3, 4, and 5.
  • a peptide capable of specifically binding to a desired cell surface molecule is directly or peptide-phosphorylated at the N-terminal side of the transmembrane domain of F protein derived from paramyxovirus.
  • a signal peptide selected from the group consisting of a signal peptide derived from F protein and a signal peptide that can function in mammalian cells is further added to the N-terminal side directly or via a linker peptide.
  • amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 25 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes one or a plurality of amino acid substitutions and deletions and Z or insertions and / or additions
  • amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 29 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes substitution and / or deletion and / or insertion and / or addition of one or more amino acids, and Amino acid sequence that functions as a signal peptide
  • SEQ ID NO: 11 Amino acid sequence represented by amino acid numbers 490 to 565 of the amino acid sequence shown in 1
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence represented by amino acid numbers 487 to 565 of the amino acid sequence includes substitution and no or deletion and / or insertion and no or addition of one or more amino acids, and Amino acid sequence that functions as a transmembrane domain
  • SEQ ID NO: 2 Protein consisting of the amino acid sequence shown in 1
  • SEQ ID NO: 2 In the amino acid sequence shown in 1, comprising one or more amino acid substitutions and / or deletions and Z or insertions and Z or additions, and the signal peptide portion is cleaved by processing and incorporated into virus particles A protein that is present on the particle surface and can bind to desmoglein 3
  • nucleic acid according to [24] comprising the following base sequence (1) or (2):
  • An animal cell comprising the nucleic acid according to [24] in an expressible form and capable of expressing on the cell surface a peptide capable of specifically binding to a desired cell surface molecule in a chimeric protein encoded by the nucleic acid.
  • a modified paramyxovirus that presents on the surface of a virus particle a peptide that can specifically bind to a desired cell surface molecule in the chimeric protein according to [14].
  • [3 1] A method for producing a tissue-targeting paramyxovirus, comprising the following steps (1) to (3):
  • a linker peptide consisting of 0 to 30 residues on the N-terminal side of the transmembrane domain of F protein derived from paramyxovirus, and a peptide that can specifically bind to the desired N-terminal cell surface molecule.
  • [3 2] The description according to [3 1], wherein the nucleic acid is placed under the control of a promoter that can function in animal cells, and a nucleic acid that encodes a signal peptide that can function in the cells is added. the method of.
  • the modified paramyxovirus of the present invention can be used as a highly safe vector because the amount of the receptor-binding protein is reduced and the adverse effects on the target cells caused by the receptor-binding protein can be reduced. Is. According to the method for producing a modified paramyxovirus of the present invention, such a modified paramyxovirus can be easily obtained. .
  • the paramyxovirus having the chimeric protein of the present invention has high specificity for specific tissues and cells, and is useful as a vector capable of site-specific delivery of a drug. It is also possible to obtain a virus vector with higher specificity by deleting the fusion-related protein of the virus, particularly the receptor binding protein. Furthermore, according to the method for producing a targeting paramyxovirus of the present invention, a paramyxovirus capable of targeting a desired tissue or cell easily and stably can be obtained.
  • Figure 1 shows the design of siRNA against HNmRNA.
  • Figure 2 shows the effect of siRNA on HNmRNA.
  • Figure 3 shows the time course of HN knockdown by siRNA.
  • Figure 4 shows the study of the optimal siRNA concentration.
  • FIG. 5 shows the HN mRNA specificity of HN-si RNA.
  • Figure 6 shows the effect of siRNA on viral protein expression.
  • Figure 7 shows a study of the number of budding virus particles.
  • Figure 8 shows a comparison of hemagglutination activity.
  • Figure 9 shows the hemagglutination activity per isoviral particle.
  • FIG. 10 shows the construction of a tissue-targeting F protein expression vector.
  • Figure 11 shows a study of subcellular localization of GFP fusion F protein (X 1800).
  • Figure 12 shows the expression of GFP fusion F protein detected by Western blotting (upper panel). The lower part shows a schematic diagram of each chimeric protein.
  • Figure 1 3 shows G F on D s g 3-s c F v-HV J by Western plot method.
  • FIG. 14 shows the construction of an s c F V fusion F protein expression vector.
  • FIG. 15 shows the detection of the expression of the s c F V fusion F protein in a stable transformant by immunostaining. From the left, the images were observed with a microscope at 960x, 1980x, and 2460x.
  • FIG. 16 shows detection of D s g 3 — s c F v — F on D s g 3 ⁇ s c F v _HV J produced using a stable transformant.
  • the left figure (Myc) shows the West blot with anti-Myc antibody
  • the middle figure (TMD) shows the results of Western blotting with the antibody that recognizes the transmembrane domain of F protein.
  • the right figure shows the result of observation with an electron microscope. The magnification is 42000 times for the lower left panel and 56000 times for the upper right panel.
  • FIG. 17 shows the result of E L I S A showing the binding activity to the desmoglein 3 of the D s g 3—sc F v—F chimeric protein.
  • Figure 18 shows mouse keratinocyte targeting by D s g 3 _ s c F v _ HV J.
  • the left column shows PAM cells expressing desmoglein (Dsg3 (+)), the middle and right columns both show NIH3T3 cells and LLC-MK2 cells that do not express desmoglein (Dsg3 (-)), wild This is the result of acting type HV J (upper) or D sg 3— sc F v— HV J (chimeric HVJ: lower). Only in PAM cells, the chimeric HVJ is present on the cell surface in a larger amount than the wild type.
  • Figure 19 shows immunostaining for F protein in epidermal cells. .7 Collagen knockout mouse abdominal blister skin fragment with wild type HV J (top) or This is the result of the action of D sg 3— sc F v— HVJ (chimera HVJ: bottom). It can be seen that the chimera HVJ is more abundant than the wild type.
  • Figure 20 shows immunostaining for F protein in skin tissue sections (cross section) (400X).
  • Figure 21 shows the construction of a chimeric F / Tf gene expression vector.
  • Figure 22 shows the production of HVJ that expresses F / Tf protein and lacks HN protein.
  • Fig. 23 shows the expression of HN protein and F / Tf protein detected by Western blotting.
  • the upper row shows HN protein and the lower row shows F / Tf protein.
  • W Wild type virus
  • C Chimeric virus
  • si siRNA treatment.
  • FIG. 24 shows the infection of HEK293 cells with HN-deficient HVJ or F / Tf_HN-deficient HVJ, using F protein expression as an index.
  • Fig. 25 shows the infection of Hela cells with HN-deficient HVJ or F / Tf-HN-deficient HVJ, using the expression of F protein as an index.
  • Fig. 26 is a graph showing infection of Hela cells with wild-type HVJ or F / Tf-HN-deficient HVJ using the number of F protein positive cells as an index.
  • the white column indicates wild-type HVJ, and the black column indicates F / Tf—HN-deficient HVJ.
  • Figure 27 shows the inhibition of F / Tf—HN-deficient HVJ virus infection of Hela cells by transferrin.
  • Tf ⁇ Lanceferin.
  • Fig. 28 is a graph showing F / .Tf_HN-deficient HVJ virus infection of Hela cells using the number of F protein positive cells as an index.
  • the white column indicates wild-type HVJ, and the black column indicates F / Tf-HN-deficient HVJ.
  • FIG. 29 is a graph showing cancer-specific targeting of F / Tf-HN-deficient HVJ-envelope.
  • W A virus envelope prepared from wild-type HVJ virus with Qdot enclosed.
  • C F / Tf— HN-deficient HVJ virus envelope with Qdot enclosed.
  • the present invention provides a modified paramyxovirus (hereinafter also referred to as the modified paramyxovirus I of the present invention), characterized in that the amount of the receptor binding protein contained is reduced compared to the wild type.
  • Paramyxoviruses that can be used in the present invention include paramyxoviruses belonging to the family Paramyxoviridae and having a receptor binding protein.
  • Paramyxoviruses that have receptor binding proteins include Sendai virus (HVJ), simian virus (SV), measles virus (MeV), respiratory syncytial virus (RSV), mumps cold virus (MuV), Newcastle disease virus and the like.
  • the paramyxovirus that can be used in the present invention is preferably Sendai virus (HVJ).
  • the receptor binding protein is a protein related to binding to a target cell, and includes H N (hemagglutininating) protein, H protein, G protein and the like depending on the type of paramyxovirus used.
  • the receptor binding protein whose amount is reduced in the present invention is preferably HN protein.
  • HN protein is known to have hemagglutination activity, hemolysis activity, and the like, and is thought to weaken the specificity of viruses.
  • the amount of receptor binding protein is reduced. Reducing the amount of receptor-binding protein means that the expression level of the receptor-binding protein of the modified paramyxovirus I of the present invention is at most about 0.6 times that of wild-type paramyxovirus (for example, 0.5 times, preferably 0.3 times, more preferably 0.2 times, most preferably 0.1 times). Preferably, in the modified paramyxovirus I of the present invention, no receptor binding protein is expressed.
  • the gene for the receptor-binding protein of the modified paramyxovirus I of the present invention may or may not be mutated as long as the expression level of the protein is reduced. If mutated, the mutation is accepted It is not involved in reducing the amount of body-bound protein.
  • the amount of the receptor-binding protein is reduced as compared with the wild type by containing a nucleic acid that suppresses the expression of the receptor-binding protein.
  • a nucleic acid that suppresses the expression of the receptor binding protein various nucleic acids that can be introduced in the method for producing the modified paramyxovirus I of the present invention described later are preferably exemplified.
  • the modified paramyxovirus I of the present invention since the amount of the receptor-binding protein is reduced, the adverse effects on the target cells caused by the receptor-binding protein are reduced. Examples of adverse effects on target cells caused by receptor binding protein include hemagglutination activity and hemolysis activity by HN protein. Therefore, the modified paramyxovirus I of the present invention can be used as a highly safe vector (such as a viral envelope vector).
  • a target molecule such as a polypeptide that specifically binds to a marker protein expressed on the surface of the target cell is used to enhance the ability to infect the target cell. You can add it to the virus.
  • the modified paramyxovirus I of the present invention may be produced by combining any known methods, but the following method is preferably exemplified.
  • the present invention also provides a method for producing a modified paramyxovirus I (hereinafter also referred to as the method of the present invention) comprising the following steps:
  • step (1) above a nucleic acid that suppresses the expression of a paramyxovirus receptor binding protein is prepared.
  • paramyxovirus examples include those described above, and preferably Sendai virus (HVJ).
  • HVJ Sendai virus
  • receptor binding protein the same thing is mentioned, Preferably it is HN protein.
  • nucleic acid that suppresses the expression of a paramyxovirus receptor binding protein is an antisense nucleic acid of the mRNA or early transcript of the paramyxovirus receptor binding protein.
  • An “antisense nucleic acid” is a nucleotide sequence that can hybridize to a target mRNA (initial transcript) under physiological conditions of a cell that expresses the target mRNA (primary transcript), and in a hybridized state.
  • the type of the antisense nucleic acid may be DNA or RNA, or may be DNAZRNA chimera.
  • the antisense nucleic acid of the present invention has a thiophosphate type ( It is also possible to synthesize by using a modified nucleotide such as 2 ′ —O-methyl type.
  • a modified nucleotide such as 2 ′ —O-methyl type.
  • Other important elements for the design of antisense nucleic acids include increased water solubility and cell membrane permeability, but these can also be achieved by devising dosage forms such as the use of liposomes. It can be overcome.
  • the length of the antisense nucleic acid used in the present invention is not particularly limited as long as it can specifically hybridize with the mRNA or initial transcript of the paramyxovirus receptor binding protein. It may be a long sequence containing a sequence complementary to the entire sequence of mRNA (early transcript). From the viewpoint of ease of synthesis, problems of antigenicity, etc., an oligonucleotide composed of about 15 to about 30 bases is preferably exemplified. When the antisense nucleic acid is about 25-mer oligo DNA, the base sequence that can hybridize with the mRNA of the receptor-binding protein of paramyxovirus under physiological conditions varies depending on the base composition of the target sequence. Any material having about 80% identity or more may be used.
  • the target sequence of the antisense nucleic acid of the present invention is a paramyxovirus receptor binding protein or its function by hybridization of the antisense nucleic acid.
  • a paramyxovirus receptor binding protein There is no particular limitation as long as it is a sequence that inhibits translation of the target fragment, and it may be the entire sequence or partial sequence of the mRNA of the paramyxovirus receptor binding protein, or the intron of the initial transcript. If an oligonucleotide is used as the antisense nucleic acid, the target sequence is from the 5 'end of the paramyxovirus receptor binding protein mRNA to the C-terminal coding site of the coding region. It is desirable to be located between.
  • Preferred is a region from the 5 ′ end to the N-terminal coding site of the coding region, and most preferred is a base sequence near the initiation codon.
  • nucleic acid that suppresses the expression of the paramyxovirus receptor binding protein is the paramyxovirus receptor binding protein mRNA or the initial transcript within the coding region (in the case of the initial transcript). It is a ribozyme that can be cleaved specifically with an intron. “Ribozyme” refers to RNA that has enzymatic activity to cleave nucleic acids. However, recently it has been clarified that oligo DNA having the base sequence of the enzyme active site also has nucleic acid cleaving activity. In the present invention, as long as it has a sequence-specific nucleic acid cleavage activity, it is used as a concept including DNA.
  • ribozymes are self-splicing RNAs found in infectious RNAs such as widgets, such as hammerhead and hairpin types.
  • the hammerhead type exerts enzyme activity at about 40 bases, and complements several bases at both ends adjacent to the part of the hammerhead structure (about 10 bases in total) with the desired mRNA cleavage site.
  • This type of ribozyme has the additional advantage of not attacking genomic DNA because it uses only RNA as a substrate.
  • RNA of the paramyxovirus receptor binding protein itself has a double-stranded structure
  • a hybrid ribozyme linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to an RNA helicase is used.
  • the target sequence can be single-stranded [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10): 5572-5577 (2001)].
  • the ribozyme is used in the form of an expression vector that contains the DNA that encodes it, a hybrid that is further linked to a tRNA-modified cocoon string to facilitate translocation to the cytoplasm. It can also be a dribozyme [Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)].
  • RNA interference in which a short double-stranded RNA is introduced into a cell and its complementary mRNA is degraded, has been known in nematodes, insects, plants, etc. However, since it was recently confirmed that this phenomenon occurs in animal cells [Nature, 411 (6836) .: 494-498 (2001)], it has been widely used as an alternative to ribozyme.
  • si RNA can be designed as appropriate using commercially available software (eg, RNAi Designer; Invitrogen) based on the base sequence information of the target mRNA.
  • siRNA one synthesized by itself as described below can be used, but a commercially available one may be used.
  • the antisense oligonucleotide and ribozyme used in the present invention determine the target sequence of mRNA or early transcript based on the DNA sequence or genomic DN A sequence of the paramyxovirus receptor binding protein, and are commercially available DN A / RNA It can be prepared by synthesizing a complementary sequence using an automatic synthesizer (Applied Biosystems, Beckman, etc.). For siRNA, the sense strand and antisense strand are synthesized with a DNA / RNA automatic synthesizer, denatured in an appropriate annealing buffer at about 90 to about 95 ° C for about 1 minute, and then about 30 Annealing at about 70 ° C for about 1 to about 8 hours.
  • an automatic synthesizer Applied Biosystems, Beckman, etc.
  • siRNA is synthesized as RNA in which a sense strand and an antisense strand are linked via a linker having an appropriate length (for example, about 3 to about 10 bases) and introduced into a dicer in an animal cell to be introduced. It can also be designed to be processed by (dicer) etc.
  • DNA encoding the sense strand and antisense strand was placed under the control of separate Po 1 III-type promoters such as U 6 and H 1.
  • Expression vectors or the above sense strand and antisense strand DNA encoding the RNA strand linked via a linker may be prepared as an expression vector placed under the control of the Po 1 III promoter and expressed in animal cells to form siRNA .
  • the nuclear acid that suppresses the expression of a paramyxovirus receptor binding protein is siRNA for the paramyxovirus receptor binding protein mRNA.
  • the nucleic acid is an siRNA against the mRNA of the HN protein of HVJ.
  • siRNA includes the sequences shown by HN-889 (SEQ ID NO: 3), HN-1 142 (SEQ ID NO: 4) and HN-1427 (SEQ ID NO: 5). preferable.
  • the animal cell into which the nucleic acid is introduced is preferably a cell derived from a 1S mammal, which can be a cell derived from any animal, as long as it is infected with paramyxovirus and reconstitutes paramyxovirus particles within the cell.
  • “mammals” include, for example, primates, laboratory animals, domestic animals, pets, etc., but are not particularly limited. These include humans, monkeys, rats, mice, guinea pigs, usagis, horses, sushi, goats, hidges, inu, cats. Specific examples include cultured cells such as monkey kidney-derived CV_1 cells, LLC and MK2 cells, and hamster kidney-derived BHK cells.
  • the method for introducing a nucleic acid into an animal cell can be appropriately selected depending on the cell type. Examples thereof include a ribofesion method, a microinjection method, a calcium phosphate coprecipitation method, a PEG method, and an electo-poration method.
  • the paramyxovirus is infected with an animal cell into which a nucleic acid that suppresses the expression of a paramyxovirus receptor binding protein is introduced.
  • the paramyxovirus to be infected is not particularly limited as long as it has the ability to reconstitute, and may be a wild-type paramyxovirus or a modified paramyxovirus. In the case of a modified paramyxovirus, the modification is not involved in reducing the amount of receptor binding protein.
  • Infected paramyxoviruses reconstitute as paramyxoviruses with reduced expression of receptor binding proteins in animal cells.
  • Isolation of the replicated paramyxovirus particles is performed by a method known per se. For example, the cell culture supernatant is collected and centrifuged. ⁇
  • the modified paramyxovirus produced in this way has reduced expression of receptor binding protein.
  • the reduction in the amount of receptor-binding protein means that the expression level of the receptor-binding protein of the modified paramyxovirus obtained by the method of the present invention is at most about 0 compared to that of the wild-type paramyxovirus. Mean 6 times (for example, 0.5 times, preferably 0.3 times, more preferably 0.2 times, particularly preferably 0.1 times).
  • the modified paramyxovirus obtained by the method of the present invention does not express a receptor binding protein.
  • the modified paramyxovirus obtained by the method of the present invention since the amount of the receptor binding protein is reduced, the adverse effect on the target cell caused by the receptor binding protein is reduced.
  • the modified paramyxovirus of the present invention has reduced hemagglutination activity, hemagglutination is less likely to occur when administered in vivo than when wild-type paramyxovirus is administered. .
  • the modified paramyxovirus I of the present invention can be used as a highly safe vector (such as a viral envelope vector).
  • the chimeric protein used in the present invention is a surface protein derived from paramyxovirus A chimeric protein comprising a transmembrane domain of a protein and a peptide capable of specifically binding to a desired cell surface molecule.
  • Paramyxovirus-derived surface proteins include paramyxovirus-derived receptor binding proteins and fusion (F) proteins (hereinafter, these may be collectively referred to as fusion-related proteins), and more preferably.
  • Is F protein particularly preferably Sendai virus (HVJ) F protein.
  • the transmembrane domain of F protein derived from HVJ is represented by the amino acid sequence represented by amino acid numbers 49.0 to 5 65 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 and amino acid numbers 4 8 7 to 5 6 5
  • the amino acid sequence is a transmembrane site indicated by amino acid numbers 5 01-1 5 2 1 (see UniProtKB / Swiss-Prot entry, Primary accession number: P04855) 3 ⁇ 4 ⁇ That partial sequence.
  • the term “transmembrane domain” includes a transmembrane region and is necessary for interacting with a paramyxovirus lining protein and being incorporated into the surface of the virus particle—in the vicinity of the site.
  • the transmembrane site the chimeric protein expressed in the animal cell and transported to the cell membrane is exposed to the extra-membrane region of the membrane protein (in this specification, exposed outside the virus particle of the virus surface protein).
  • the region is referred to as the extra-membrane region) and remains on the cell membrane in a state of being presented outside the cell.
  • Preferred examples of the transmembrane domain used in the present invention include the sequence shown in amino acid numbers 490 to 565 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, which is a transmembrane domain of HVJ-derived F protein, and this Peptides having substantially the same sequence are mentioned.
  • transmembrane domain used in the present invention is a transmembrane domain of HVJ-derived F protein, amino acid number 4 8 7 to 5 6 5 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 And a peptide consisting of a sequence substantially identical to this sequence.
  • substantially identical sequence has the same meaning as described below for the full length HVJ-derived F protein.
  • amino acid sequence represented by amino acid number 4 90 to 5 6 5 or amino acid number 4 8 7 to 5 6 5 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Containing multiple (eg 1-10, preferably 1-5, 4, 3 or 2) amino acid substitutions and / or deletions and / or insertions and / or additions and interacting with the paramyxovirus lining protein Peptides that act and retain the ability to be incorporated into the surface of the virus particle are also included in the transmembrane domain of the HVJ-derived F protein.
  • the chimeric protein used in the present invention includes, as a part thereof, a peptide that can specifically bind to a desired cell surface molecule.
  • the “desired cell surface molecule” means a molecule present on the cell surface where the modified paramyxovirus of the present invention to be described later is targeted.
  • the cell surface molecule is not particularly limited as long as it is expressed on the surface of the target cell of the modified paramyxovirus of the present invention, and includes any known cell surface protein, sugar chain, lipid and the like.
  • the cell surface molecule is a cell surface protein that is specifically expressed in a particular cell type.
  • Preferred cell surface molecules include, for example, desmoglein 3 (expressed in epidermal basal cells),] 32 intedarin (expressed in neutrophils and macrophages), ⁇ 4 integrin (expressed in lymphocytes and fibroblasts), lib ] 33 integrin (expressed in platelets and megakaryocytes), folate receptor (expressed in cancer cells), transferrin receptor (expressed in cancer cells), HER 2 (expressed in metastatic breast cancer cells), EGFR (non-small cell lung cancer) Expressed in cells), LDLR (expressed in hepatocytes), CD 20 (expressed in malignant lymphoma), CEA (expressed in spleen cancer), G pl OO (expressed in melanoma), P SMA (expressed in prostate cancer) , AFP (expressed in primary liver cancer, yolk sac tumor) and the like.
  • Preferred is desmoglein 3 or transferrin receptor.
  • Peptides that can specifically bind to cell surface molecules include, for example, ligands for various cell surface receptors, such as peptides having an RGD sequence for integrins (eg, echistatin, fibronectin, etc.), transferrin for transferrin receptors, etc.
  • ligands for various cell surface receptors such as peptides having an RGD sequence for integrins (eg, echistatin, fibronectin, etc.), transferrin for transferrin receptors, etc.
  • antibodies against various cell surface molecules for example, antibody molecules that can be encoded by a single nucleic acid such as a single chain antibody are preferred
  • the cell surface molecule is desmoglein 3
  • Examples of peptides that can bind differently include a single-chain antibody (scFv) that recognizes desmoglein 3.
  • a peptide capable of specifically binding to a cell surface molecule is added to the N-terminus of the transmembrane domain of the surface protein.
  • the peptide may be added to the N-terminus of the transmembrane domain via a peptide linker.
  • a peptide linker may be a peptide of any length consisting of any amino acid residue, and includes an amino acid sequence naturally present on the N-terminal side of the transmembrane domain of the surface protein used. Or it may consist of this.
  • 1 to 30 residues more preferably 1 to 25, 1 to 20, 1 to: I 5 or 1 to; L 0 residues, or even 1 to 5 residues in length Is most preferred.
  • This linker is inserted by a person skilled in the art to link them in-frame by the base sequence of the gene encoding the transmembrane domain and the gene encoding a peptide capable of specifically binding to a cell surface molecule. In some cases.
  • the chimeric protein used in the present invention can be transported to the cell membrane of a predetermined animal cell that can be used as a host cell for virus replication for the production of a modified paramyxovirus that presents the chimeric protein on the surface of the virus particle. It is desirable to express it in such a form.
  • the chimeric protein preferably contains a signal peptide derived from the virus surface protein constituting the chimeric protein, preferably a signal peptide derived from the F protein, at the N-terminus thereof, or the predetermined mammalian cell. To which other signal peptides that can function are added. If necessary, the signal peptide can contain the same peptide linker as described above, preferably at the C-terminus thereof.
  • Such a peptide linker may be a peptide of any length consisting of any amino acid residue, and is an amino acid sequence naturally present on the C-terminal side of the native peptide of the F protein, ie, mature F It may contain or consist of the sequence of the N-terminal part of the protein. Preferably, :! ⁇ 30 residues, more preferably:! ⁇ 25, 1-20, 1-: 15 or 1-10 residues, more preferably 1-5 residues in length.
  • Known surface pattern Protein signal peptides are published on various protein data bases, and can be easily predicted based on the amino acid sequence of the protein, for example, based on the Kyte & Dool ittle method. (Many such analysis software is commercially available and generally available on the website).
  • the signal peptide of HVJ-derived F protein is a region represented by amino acid numbers 1 to 25 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (see UniProtKB / Swiss-Prot entry, Primary accession number: P04855).
  • the chimeric protein of the invention preferably contains at least the region, and the amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is 1 to 25, 1 to 26,! ⁇ 2 7, 1-2 8! And those containing the region represented by any one of ⁇ 29, 1 to 30 or 1 to 35 on the N-terminal side.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence 1-25 or amino acid number 1-29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 1 or more (for example, '1 to 1.0, preferably 1 5, 4, 3 or 2) amino acid substitutions and Z or deletions and / or insertions and / or additions, and consisting of an amino acid sequence capable of functioning as a signal peptide in a given mammalian cell Is also included in the signal peptide of HVJ-derived F protein.
  • the chimeric protein of the present invention may contain an amino acid sequence of a tag for facilitating protein detection and purification.
  • Tags include Flag tag, His X 6 tag, C-Myc tag, HA tag, AU1 tag, GST tag, MBP tag, fluorescent protein tag (eg GFP, YFP, RFP, CFP, BFP, etc.), immunoglobulin Fc You can list tags.
  • the position of the tag is not particularly limited as long as the chimeric protein of the present invention has a function as a transmembrane domain and can specifically bind to a desired cell surface molecule.
  • the chimeric protein used in the present invention comprises a transmembrane domain of a fusion-related protein derived from a fusion virus such as paramyxovirus.
  • a fusion-related protein is not particularly limited as long as it is a protein expressed on the surface of the fusion virus and related to the fusion of the virus and the target cell. 1
  • F protein and receptor binding protein HN protein, H Protein, G protein, etc.
  • the present invention provides that a peptide capable of specifically binding to a desired cell surface molecule is directly or directly bound to a peptide linker at the N-terminal side of the transmembrane domain of a paramyxovirus-derived F protein.
  • a chimeric protein linked via The paramyxovirus is not particularly limited as long as it is a virus belonging to the Paramyxoviridae family that infects the cell through fusion with a host cell.
  • Sendai virus HV J
  • measles virus MV
  • Epidemic parotitis virus Mo V.
  • Parainfluenza virus 1 PIV 2
  • PIV 3 Simian virus 5
  • NDV Newcastle virus
  • R SV RS virus
  • paramyxovirus-derived fusion-related protein derived from HV J
  • the HVJ-derived F protein is a protein consisting of an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • a protein consisting of an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 means about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 Is a protein having an amino acid sequence having a homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more, and having an activity of mediating fusion between a virus and a cell.
  • F protein derived from HV J examples include: (i) 1 to 20 (preferably 1 to 15 and more preferably 1 to 5) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 More preferably, 1 to 3 amino acid deleted amino acid sequences, (ii) 1 to 20 amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 (preferably 1 to 15 amino acids, Preferably, an amino acid sequence to which 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are added.
  • amino acids preferably, 1 to 15 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids, more preferably 1 to 3 amino acids, and (iv) 1 to 5 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 20 preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 20 preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids
  • amino acids also includes amino acid-substituted amino acid sequence or (V) a protein that have a their deletion 'amino acid sequence which is a combination of addition and insertion and substitution.
  • the position of the deletion, addition, insertion or substitution is not particularly limited.
  • known variants include, but are not limited to, those that are excluded from UniProtKB / Swiss-Prot entry, Primary accession number: P04855.
  • the transmembrane domain of F protein derived from HV J includes its transmembrane region (region represented by amino acid numbers 5 0 1 to 5 2 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11) and HV J It may be anything as long as it contains the neighboring sequences necessary for interacting with the underlying protein and being incorporated into the surface of the virus particle. Since the modified paramyxovirus of the present invention described later expresses an intact F protein derived from the viral genome on the surface of the virus particle, the chimeric F protein of the present invention is a fusion peptide (the amino acid represented by SEQ ID NO: 11). It is not necessary to include the region represented by amino acid numbers 1 17 to 14 1 in the sequence.
  • the transmembrane domain of the HV J-derived F protein used for the chimeric F protein of the present invention is SEQ ID NO: 11 It consists of an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by amino acid numbers 4 90 to 5 65 or amino acid numbers 4 8 7 to 5 65 in the amino acid sequence represented by 1.
  • substantially the same has the same meaning as above.
  • the peptide that can specifically bind to the cell surface molecule contained in the chimeric F protein of the present invention is not particularly limited, and those described above can be used.
  • the present invention The chimeric F protein comprises an anti-desmograin 3 single chain antibody.
  • the antibody is a chimeric antibody, more preferably a humanized antibody, most preferably a complete human antibody. An antibody is desirable.
  • the antibody polypeptide can be linked to the transmembrane domain of the HVJ-derived F protein.
  • the anti-Desmogleis 3 single-chain antibody polypeptide comprises the F2 and F1 regions of the HVJ-derived F protein, more specifically, the amino acid number in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11. It is substituted with the amino acid sequence shown by 3 0-4 8 9 and inserted between the signal peptide and transmembrane domain of F protein.
  • the chimeric F protein of the present invention contains transferrin.
  • the antibody is preferably used as a vector for gene transfer into the modified paramyxovirus I I force of the present invention, it is desirable to use human transferrin.
  • Transferrin can be linked to the transmembrane domain of the HVJ-derived F protein.
  • the transferrin is represented by F2 and F1 regions of the HVJ-derived F protein, more specifically, amino acid numbers 30 to 4 86 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 Is inserted between the signal peptide and the transmembrane domain of the F protein.
  • chimeric protein of the present invention examples include a protein comprising a sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, which is a chimeric protein containing an F protein fragment derived from HVJ. Where "substantially the same The term “one” is synonymous with the above, but a protein having substantially the same sequence retains the ability to specifically recognize and bind to desmoglein 3 in addition to being able to be incorporated into the surface of the HVJ particle. There is a need.
  • This protein contains a single-chain antibody variable region fragment (scFv) that recognizes desmoglein 3 in the extra-membrane region, and viruses with such proteins are present in cells that display desmoglein 3 on the cell surface. It is possible to perform specific tagging. Since desmoglein 3 is selectively expressed in cells of the epidermal base layer, the virus specifically targets the basal layer of the epidermis.
  • scFv single-chain antibody variable region fragment
  • chimeric protein of the present invention is a chimeric protein comprising an F protein fragment derived from HVJ, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 or the amino acid numbers 40 to 7 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25
  • a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as shown in 97 is a protein consisting of substantially the same sequence. Need to retain the ability to join.
  • This protein contains transferrin in the extra-membrane region, and a virus having such a protein can specifically target cells presenting a transferrin receptor on the cell surface.
  • the virus specifically targets cancer cells.
  • the chimeric protein used in the present invention must be expressed on the cell membrane of animal cells that can be infected by paramyxovirus and replicate the virus. Therefore, preferably, the chimeric protein is produced by introducing a nucleic acid encoding the chimeric protein into the animal cell in a form capable of being expressed. Therefore, the present invention also provides a nucleic acid encoding a chimeric protein used in the present invention (hereinafter also simply referred to as “chimeric nucleic acid of the present invention”).
  • the chimeric nucleic acid of the present invention may be either DNA or RNA or a chimera of both. Good.
  • the chimeric nucleic acid may be single-stranded or double-stranded.
  • the chimeric nucleic acid may be double-stranded DNA or double-stranded RNA, or may be a DNAZRNA hybrid.
  • the chimeric nucleic acid of the present invention has a natural nucleotide sequence encoding a peptide moiety derived from a surface protein and a peptide moiety capable of specifically binding to a cell surface molecule, or one encoded by a different codon as arranged.
  • Examples of the base sequence that is hybridized under highly stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and particularly preferably about the linked sequence.
  • a nucleotide sequence having a homology of 5% or more is used.
  • the conditions for the above hyperpridation can be set with reference to the previously reported conditions (Current Protocols in Molecular Biology, jonn Wiley & sons, 6.3.1-0.3.6, 1999).
  • 6XSSC sodium chloride / sodium citrate
  • 45 is a hybridization condition under high stringency conditions. After C, one or more washes at 0.2 X SSC / 0 ... 1% SDS / 50-65 ° C may be mentioned.
  • conditions for hybridization under moderate stringency conditions for example, 2XSSC / After 30 ° C., one or more washes at 1 ⁇ SSCZ0.1% SDS / 30-50 ° C. may be mentioned.
  • a particularly preferred example of the chimeric nucleic acid of the present invention is a nucleic acid that codes for a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 21 described above. More preferably, the chimeric nucleic acid comprises a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 or a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a complementary strand sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 And a nucleic acid encoding a protein that can be incorporated into the surface of HVJ particles and retains the ability to specifically recognize and bind to desmoglein 3.
  • the stringent conditions have the same meaning as described above.
  • chimeric nucleic acid of the present invention is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or the amino acid represented by amino acid numbers 40 to 797 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 described above.
  • Examples include a nucleic acid encoding a protein consisting of the same or substantially the same sequence.
  • the chimeric nucleic acid comprises a nucleic acid comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24 or the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 1 8 to 2 3 91 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24, or It can hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 or the complementary strand sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 within the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24. It is a nucleic acid that encodes a protein that contains a base sequence, can be incorporated into the surface of HVJ particles, and has the ability to specifically recognize and bind to a transferrin receptor.
  • the highly stringent condition has the same meaning as described above.
  • a method for preparing a chimeric nucleic acid encoding a chimeric protein of a single chain antibody and a surface protein or a fragment thereof, which is a preferred embodiment of the present invention will be described.
  • Nucleic acids encoding other chimeric proteins can be easily produced by appropriately combining conventional techniques well known in the art.
  • a nucleic acid encoding the transmembrane domain of the surface protein is cloned according to a conventional method.
  • the nucleic acid can be amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the base sequence encoding the transmembrane domain of the surface protein, or the nucleic acid incorporated into an appropriate expression vector can be
  • Cloning can be carried out by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of the protein or a labeled synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning, Second Edition (described above). When a commercially available library is used, hybridization can be performed according to the method described in the instruction manual attached to the library. '
  • the resulting nucleic acid encoding the transmembrane domain of the surface protein can be used with appropriate restriction enzymes using linkers or site-directed mutagenesis as necessary to facilitate the subsequent production of chimeric nucleic acids. Sites can be introduced.
  • a method of obtaining a nucleic acid encoding a single chain antibody e.g., a desired cell surface molecule or a flag. Placements by a conventional method to prepare a monoclonal antibody-producing high pre dormer as anti thickness (KM mice TM herein as immune animals If a human antibody-producing mouse such as the above is used, a human antibody-producing hybridoma can be easily obtained), and RNA can be extracted from the hybridoma to change the heavy and light chain of the human antibody.
  • the method includes, for example, a method in which a variable region gene is cloned by RT_PCR using a region-specific primer and then a heavy chain and a light chain are linked via an appropriate linker.
  • a restriction enzyme site suitable for ligation with a nucleic acid encoding a surface protein or signal peptide can be introduced at the end of the nucleic acid encoding the single-chain antibody.
  • the nucleic acid encoding the obtained surface protein and the nucleic acid encoding the single chain antibody can be linked using an appropriate restriction enzyme, ligase or the like.
  • the chimeric nucleic acid of the present invention preferably has any one of the signals described above at its 5 ′ end so that the chimeric protein encoded by the chimeric nucleic acid can be transported onto the cell membrane via a secretory pathway in a predetermined animal cell.
  • Nucleic acids that code for peptides are linked It is preferable.
  • the nucleic acid encoding such a signal peptide can be cloned by PC Fi using a genomic nucleic acid or cDNA extracted from a cell (including a virus) that expresses the protein containing the signal peptide as a cage. Can also be chemically synthesized based on known base sequence information.
  • the obtained nucleic acid encoding a signal peptide can be linked to a nucleic acid encoding a single chain antibody or a nucleic acid encoding a surface protein using an appropriate restriction enzyme, ligase or the like.
  • an animal cell 3- expressing the chimeric protein of the present invention on its cell membrane can be obtained.
  • a modified paramyxovirus expressing the chimeric protein of the present invention on the surface of the virus particle can also be obtained.
  • the modified paramyxovirus I I of the present invention expresses a chimeric protein having a viral surface protein linked to a peptide that specifically binds to a cell surface molecule of a target cell. Therefore, the modified paramyxovirus has high specificity for target tissues and cells, and can be used as a paramyxovirus vector (virus envelope vector or the like) capable of delivering a drug or the like in a site-specific manner. Furthermore, in the modified paramyxovirus I I, by adding the same modification as the modified paramyxovirus I of the present invention,
  • a peptide capable of specifically binding to a desired cell surface molecule is linked to the N-terminal side of the transmembrane domain of F protein derived from paramyxovirus, either directly or via a peptiderin force. Presenting the chimeric protein on the surface of the virus particle, and
  • a modified paramyxovirus can be obtained.
  • “a peptide capable of specifically binding to a cell surface molecule” is different from “receptor binding protein”.
  • the virus since the adverse effect on the target cell caused by the receptor-binding protein is reduced, high stability is achieved and high specificity for a specific tissue cell is achieved. 3. Preparation of targeting paramyxovirus
  • the present invention provides a method for producing a targeting paramyxovirus (hereinafter also referred to as the method of the present invention) comprising the following steps:
  • a linker peptide consisting of 0 to 30 residues on the N-terminal side of the transmembrane domain of F protein derived from paramyxovirus, and can bind specifically to the surface molecule of the desired cell at the N-terminal.
  • step (1) the above-described chimeric nucleic acid of the present invention is prepared and introduced into a form that can be expressed in animal cells. Specifically, the chimeric nucleic acid of the present invention prepared as described above is incorporated into an appropriate expression vector.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it can produce the chimeric protein of the present invention in animal cells.
  • a plasmid vector, a virus vector (for example, adenovirus, retrovirus) and the like can be mentioned.
  • the expression vector preferably contains at least a promoter, a start codon, the chimeric nucleic acid of the present invention, and a stop codon. Further, it may contain an enhancer sequence, a 5-side and 3-side untranslated region of the nucleic acid of the present invention, a splicing junction, a polyadenylation site, a selectable marker region or a replicable unit.
  • the gene amplification gene (marker) normally used according to the objective may be included.
  • promoters examples include SV40-derived promoters, retrowinores promoters, and heat shock promoters.
  • terminator region replicable unit, enhancer sequence, polyadenylation site, and splicing junction site, those known per se can be used.
  • selection marker those known per se can be used. Examples include antibiotic resistance genes such as tetracycline, ampicillin, or kanamycin.
  • the gene amplification genes include dihydrofolate reductase (DHFR) gene, thymidine kinase gene, neomycin resistance gene, glutamate synthase gene, adenosine deminase gene, ornitine decarboxylase gene, hygromycin I B-phospho Examples thereof include a transferase gene and an aspartate transcarbamylase gene.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the nucleic acid of the present invention is prepared into a form that can be expressed in an animal cell by ligating downstream of the template in an appropriate expression vector using a normal genetic engineering technique.
  • the animal cell is not particularly limited as long as it expresses the above-described nucleic acid and paramyxovirus is reconstituted in the cell.
  • Examples thereof include cultured cells such as monkey kidney-derived CV-1 cells, L L C-MK 2 cells, and hamster kidney-derived B HK cells.
  • the method for introducing a nucleic acid into an animal cell is not particularly limited as long as the nucleic acid is expressed in the animal cell, and can be appropriately selected depending on the type of animal cell. Examples thereof include a lipofection method, a microphone mouth injection method, a calcium phosphate coprecipitation method, a PEG method, and an elect mouth poration method.
  • examples of the medium include MEM medium (Science, Vol. 122, 501 (1952)) containing about 5 to 20% fetal calf serum, DMEM medium (Virology, Vol. 8, 396 (1959) )), RPMI 16 40 medium (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), 1 9 9 ⁇ 3 ⁇ 4 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 ⁇ , 1 (1950) ) Etc. are used.
  • ⁇ is preferably about 6-8.
  • Incubation is usually performed at about 30-40 ° C for about 15-60 hours. Add aeration and agitation as needed.
  • the chimeric protein of the present invention is expressed in animal cells and is transported onto the cell membrane of the animal cells by riding on the secretory pathway by the action of the signal peptide in the chimeric protein.
  • step (2) above paramyxovirus is infected with animal cells expressing the chimeric protein of the present invention.
  • the paramyxovirus to be infected is not particularly limited as long as it has a reconstitution ability, and may be a wild-type paramyxovirus or a modified paramyxovirus.
  • the chimeric protein of the present invention itself does not have a fusion activity with cells, it is desirable that the modified paramyxovirus retains at least the F protein fusion activity.
  • Infected paramyxoviruses are reconstituted in animal cells, transported to the cell membrane, and released to the outside in an ectitocytosis-like manner by taking up part of the cell membrane. Therefore, the paramyxovirus released to the outside of the cell is a modified paramyxovirus in which the chimeric protein of the present invention expressed on the cell membrane is displayed on the surface of the virus particle.
  • the chimeric protein of the present invention is embedded in liposomes composed of appropriate lipids (complexes) without being expressed in animal cells.
  • the proteoribosome is prepared and fused with animal cells, so that the chimeric protein is presented on the cell membrane of the animal cell, and then infected with paramyxovirus to replicate and reconstitute the virus in the same manner. It is understood that this is also possible.
  • the targeting protein used in the present invention is a non-peptide component that can specifically bind to a cell surface molecule (in this specification, a nucleic acid sequence ( Peptide substances containing amino acids other than 20 amino acids encoded by (codon) are also defined here as being included in non-peptide components) together with viral surface proteins.
  • a nucleic acid sequence Peptide substances containing amino acids other than 20 amino acids encoded by (codon) are also defined here as being included in non-peptide components
  • folic acid is a molecule that specifically binds to the folate receptor, but amide bonds between the folate molecule and the amino group at the amino terminal or side chain of the virus surface protein or fragment thereof and the carboxyl group of folic acid.
  • It is a paramyxovirus and can be used to target cells that express the folate receptor.
  • non-peptide components that can specifically bind to cell surface molecules, if the structure is not capable of covalently binding to a functional group on the N-terminal amino acid side chain of the virus surface protein, for example, an immunoconjugate It is also possible to bond via a known linker, which is usually used in gate fabrication.
  • modified paramyxovirus particles are isolated.
  • the virus particles are isolated by a method known per se, for example, by recovering and centrifuging the cell culture supernatant.
  • the modified paramyxovirus obtained by the method of the present invention presents a chimeric protein in which a virus surface protein is linked to a peptide that specifically binds to a cell surface molecule of a target cell. Therefore, the modified paramyxovirus has high specificity for target tissues and cells.
  • the modified paramyxovirus can also be used as a paramyxovirus vector (such as a viral envelope vector) that can deliver a drug or the like in a site-specific manner.
  • the virus envelope vector is one in which the virus replication ability is lost by inactivating the virus genome by various methods such as UV irradiation, ultrasonic treatment, and surfactant treatment.
  • the virus envelope vector is It includes a membrane structure based on a bellows, ie, a lipid bilayer surrounding a nucleocapsid present in a virus.
  • a viral envelope vector maintains the protein present on the surface of the virus particle, so that it can be adsorbed to the cell, and the substance (eg, protein, nucleic acid, low molecular weight compound) encapsulated in the virus particle can be adsorbed to the cell. It can be used as a vector to be delivered into.
  • an envelope vector that has a fusion protein with transferrin fused to the N-terminal side of the transmembrane domain of F protein on the particle surface can be used as a cancer cell-specific targeting vector due to the ability of transferrin to bind to cancer cells.
  • the substance can be delivered only to cancer cells.
  • envelope vector having a fusion protein membrane you recognize desmoglein 3 in the N-terminal side of transmembrane domain single chain antibody variable region fragments (S c FV) fusion of F protein particles table surface epidermis of the fragments Basal layer-specific binding allows delivery of substances only to the epidermal basal layer as an epidermal basal layer-specific targeting vector.
  • the virus envelope vector in which the substance is encapsulated in the virus particle is used alone or with the vector, a stabilizing compound, a diluent, It is used as a pharmaceutical composition comprising a combination with a carrier.
  • the pharmaceutical composition comprises an amount of the vector effective to achieve the purpose for which the viral envelope vector is intended.
  • “Therapeutically effective amount” or “pharmacologically effective amount” is a term well recognized by those skilled in the art and refers to the amount of an agent effective to produce the intended pharmacological result.
  • a therapeutically effective amount is an amount sufficient to reduce the symptoms of the disease to be treated.
  • One useful approach to ascertain an effective amount (eg, a therapeutically effective amount) for a given application is to measure the extent of recovery of the target disease Is Rukoto.
  • the amount actually administered will depend on the individual to whom the treatment is to be applied, and is preferably an amount optimized to achieve the desired effect without significant side effects. Determination of a therapeutically effective dose is well within the ability of those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition may be used in such a form that the viral envelope is taken into the cells of the affected area or the cells of the target tissue.
  • the pharmaceutical composition can be administered in any sterile biocompatible pharmaceutical carrier, including but not limited to saline, buffered physiology. Saline, dextrose, and water. Any of these molecules can be administered to a patient alone or in combination with other agents in a pharmaceutical composition mixed with suitable excipients and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be pharmaceutically inert.
  • Parenteral delivery methods include topical, intra-arterial (eg, via the carotid artery), intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, or intranasal. Can be mentioned.
  • the present invention may be any route as long as it reaches the treatment site.
  • the dosage of the viral envelope vector is appropriately selected depending on the age and other conditions of the administration subject, the purpose of administration, the type of vector used, and the like.
  • the virus of the present invention When the virus of the present invention is administered to humans as a virus envelope vector, it is usually equivalent to 400 to 400, 0 to 0 HAU, preferably 1,200 to 120, equivalent to OO OHAU, per subject.
  • a viral envelope vector corresponding to 4,000 to 40,000 HAU can be administered.
  • HAUj refers to the activity of a virus capable of aggregating 0.5% of chicken erythrocytes.
  • 1 HAU corresponds to approximately 24 million virus particles (O kada, Y .. et al., Biken J ourna 1 4 209- 2 1 3, 1 96 1)
  • the above dose can be administered, for example, once to several times a day.
  • a long acting pharmaceutical composition may be administered every 3-4 days, weekly, or once every two weeks.
  • the five siRNAs (HN-223, HN—342, HN—899, HN—1 1 42, HN-1 427) are GCAUUGAACAU GAGCAGCA (223-241: SEQ ID NO: 1), GAACAAAAACAGC AGGGAU (342-360: SEQ ID NO: 2), GAACUAAGUCUCACC GGU A (8 9 9-9 1 7: SEQ ID NO: 3), GCGUGAUCAUCCAGGUC AA (1 14 2-1 1 60: SEQ ID NO: 4), GCGUAUACACUGAUGCU UA (1 427-1445: SEQ ID NO: 5) is targeted.
  • scramb1esiRNA used as a control consists of a random sequence (GCCG CCUUUGUAGGAUUCG: SEQ ID NO: 6).
  • RNA was introduced into LL CMK 2 cells at various concentrations according to each protocol using Lipofectamin Reagent (Invitrogen TM, California, USA) and Plus Reagent (Invitrogen TM).
  • RNA was fractionated by electrophoresis with 1% agarose Genore (Cambrex Bio Science Rockland Inc, Rockland: USA), then Hybond-N + nylon transfer membrane (Amersham Biosciences UK Ltd. Buckinghamshire, England).
  • siRNA concentration of HN-8 9 9 from 50 to 3 20 pm o 1 / m 1
  • HVJ infection and RNA recovery were performed as described above, and the concentration-dependent effects of siRNA were examined. As shown in FIG. 4, 50 p mo 1 / m 1 showed a sufficient effect.
  • the recovered RNA was analyzed for HN protein mRNA, F protein mRNA and M protein mRNA by Northern blotting. -8 9 9 siRNA repressed transcription specifically for HN protein.
  • anti-mouse IgG antibody was diluted with 2,000-fold 5% skim milk for 1 hour at room temperature for 1 hour.
  • the membrane was washed with a washing buffer, Detection was performed with ECL Western Blotting Detection Reagent (Amersham Biosciences; The result is shown in Fig. 6.
  • HV J recovered from cells into which HN-8 9 9 had been introduced HN was hardly expressed.
  • F protein and M protein were higher than HV J recovered from scrambled siRNA-introduced cells.
  • Dilution ratio the dilution ratio when the original sample was diluted Next, the hemagglutination activity per virus particle number was measured. As shown in FIG. 9, the virus obtained from HN-8 99 siRNA-introduced cells also had reduced erythrocyte aggregation activity.
  • a vector for expressing the chimeric EGF P-F protein shown in (i) to (iv) of FIG. 10 was prepared.
  • PCR primers used here are as follows:
  • GFP-Bgl I If: 5'-CATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3 '(SEQ ID NO: 1 2)
  • GFP-BglII-r 5 '-TTCTAGATCCGGTGGATCCG-3' (SEQ ID NO: 1 3)
  • GFP-Agel-f 5'-TATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • GFP-Eco47III-r 5, -GCTCTAGATCCGGTGGATCCCG-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • GFP-EcoNI_r 5,-ATCTAGATCCGGTGGATCCCG-3' (SEQ ID NO: 16).
  • the cDNA sequence of F protein is shown in SEQ ID NO: 10.
  • a PCR product fragment is inserted between positions 345 and 346, and in (ii) above, positions 87 to 345 are located above (iii) ) In positions 8 7-455, and in (iv) above, positions 8 7-: I 46 5 are replaced with corresponding PCR product fragments.
  • Fixation was performed with 4% paraformaldehyde at 4 ° C for 15 minutes, and a part was incubated with 0.1% Triton-X for 2 minutes and then blocked with 5% skim milk / PBS for 1 hour.
  • GFP Primary antibody Anti- Green Fluorescent Protein
  • MB Primary antibody Anti- Green Fluorescent Protein
  • H + L secondary antibody Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG
  • Figure 11 shows the results.
  • the upper panel shows the results when 0.1% Triton-X was not incubated, and the lower panel shows the results when 0.1% Triton-X was incubated.
  • EGFP is stained red and the nucleus is stained blue by Hoechst33258.
  • the chimeric proteins (i) to (iV) above were all expressed in cells (bottom of Fig. 11), but they were stained with EGFP unless they were permeabilized with Triton-X. It can be seen that only (iV) is present, and only the chimeric protein of (iV) is localized on the cell surface.
  • the expression of the chimera protein as intended was confirmed by a Western plot using an anti-GFP antibody (Fig. 12).
  • the Western blot method is as follows.
  • each band was detected at the molecular weight position of the intended chimeric protein.
  • 1 3 is from the left, the chimeric GF PF protein expression vector-introduced cell (F-GF P (cell)) not infected with HV J, and the culture supernatant of the introduced cell (F-0FP (culture Supernatant)), the virus recovered from the supernatant after infecting the introduced cells with wild-type HV J (F_GFP + HV J), and wild-type L LC-MK 2 cells without gene transfer Virus recovered from the culture supernatant infected with HV J (HV J (produced by LLC-MK 2 cells)), and HV J produced and purified from eggs as a control. From FIG.
  • GFP was detected in the virus recovered from the supernatant after infecting the introduced cells with wild-type HVJ. Furthermore, when Western blotting was performed with an antibody that recognizes the extracellular domain of the F protein, the protein was detected even with the above virus, and the antibody did not recognize the chimeric GF PF protein. And the chimeric F protein was found to be expressed. In addition, HN protein was also expressed.
  • Dsg3-scFv-AgeI-f 5'-TATGGCGGACTACAAAGATATTGTGTTAAC-3 '(SEQ ID NO: 1 8) and It was obtained by amplification with PCR using a primer pair of Dsg3-scFv-EcoNI-r: 5′-AGGAGACTGTGAGAGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 19).
  • the chimeric Dsg3-scF-F protein was localized on the cell membrane (Fig. 15). In addition, a band was confirmed at the position of the size of the chimeric protein by Western blotting.
  • the resulting virus was subjected to Western blotting with anti-Myc-tag antibody (Fig. 16 left: Myc) and Western blot with antibody recognizing the transmembrane domain of F protein (Diagram in Fig. 16: TMD). As a result, a band was detected at a predetermined size, and a chimeric protein was confirmed.
  • the virus stained with anti-Myc antibody was observed with an electron microscope.
  • 100HAU HV J was suspended in 4 / xL MilliQ and dropped onto an electron microscope grid to dry. The mixture was fixed with 3.7% formaldehyde at 4 ° C for 15 minutes, washed 3 times with PBS, incubated for 3 minutes with 0.5% Triton-X, and then again washed 3 times with PBS.
  • Primary antibody; Anti-Myc-tag (MBL) 1 100, incubated at room temperature for 1 hour.
  • MESACUP desmoglein test prepared with MBIJ containing each concentration of HVJ virus sample and applied to a 96-well plate (provided by Prof. Amaya, Department of Dermatology, Keio University). Incubate for 1 hour at room temperature, then wash 4 times with wash buffer (MESACUP desmogleintest: MBL), and incubate for 1 hour at room temperature with 1:23 diluted f 2 36.
  • Figure 1.8 shows the results. Of the 3 types of cells tested, only mouse keratinocyte-derived PAM cells expressed more chimeric F protein than wild-type. (9) Chimera HV J infection experiment in organ culture
  • mice infection of mouse epidermal tissues was tested.
  • 7 type collagen knockout mice were used because it was easy to separate epidermal tissues.
  • the epidermis and dermis are easily separated because of the water bubbles in the abdominal skin.
  • the blister skin of a type 7 collagen knockout mouse immediately after birth was excised and cultured on a 10 cm dish filled with D-MEM. Trypsin-treated virus sample (see (8)) was prepared to 5X 10 5 particles / 100; u L Opti-MEM and injected into blisters. After infection at 37 ° C for 5 minutes, the epidermis and dermis were peeled off, washed with PBS, and cultured in D-MEM. After 24 hours, the cells were washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde, and then immunostained with f236 from the viral genome-derived F protein.
  • the gene encoding HVJ F protein is modified and expressed. It was inserted into plasmid pCY4B. Recombinant pCY4B was constructed so as to express a fusion protein of TMD and pitotransferrin in which human transferrin was linked to the N-terminal side of the transmembrane domain (TMD) of F protein.
  • TMD transmembrane domain
  • the cDNA of human transferrin is shown in SEQ ID NO: 22.
  • the insertion site was designed so that the myc tag was attached to the N-terminus of the fusion protein for convenient subsequent analysis.
  • the sequence of the fusion protein inserted here is shown in SEQ ID NO: 25.
  • amino acid numbers 1 to 29 are the signal sequence of the HVJ-derived F protein
  • amino acid numbers 30 to 39 are the myc tag
  • amino acid numbers 40 to 7 18 are 7 Amino acid Nos. 719 to 797 in the amino acid sequence of transferrin correspond to the amino acid sequence of the transmembrane domain of HVJ-derived F protein, respectively.
  • This myc-tagged F protein TMD and human transferrin fusion protein (F / Tf) expression pCY4B were introduced into LLCMK2 cells, and constitutively transformed cells that constitutively produce F / Tf protein were isolated.
  • the HVJ virus particles produced from the cells and released to the outside of the cell have F / Tf in addition to the native F protein. (F / Tf chimeric virus), and the transferrin part is presented outside the particle (Fig. 22).
  • the expression of the HN gene was suppressed by the siRNA method in the same manner as in the method shown in Example 1. In this way, the produced virus is presented with transferrin on the surface of the virus particle, and the expression of HN protein is significantly reduced or completely deleted.
  • HVJ virus produced in LLCMK2 cells transformed with F / Tf-expressing pCY4B has F / Tf protein.
  • HVJ deficient in HN protein HN deficient HVJ
  • HVJ deficient in HN protein and having F / Tf F / Tf-HN deficient HVJ
  • F protein expression was detected with anti-F protein antibody.
  • F protein-positive cells were observed in only a very small number of cells even when any HVJ was infected (Fig. 24).
  • F / Tf—HN-deficient HVJ genome-inactivated F / Tf—HN-deficient HVJ envelopes were used to test cancer cell-specific targeting in vivo.
  • the F / Tf—HN-deficient HVJ was inactivated by UV irradiation to prepare an F / Tf—HN-deficient HVJ envelope. This was suspended in 1000 HAU / 200 / z 1-PBS, Qdot (registered trademark) 605ITK (registered trademark) Carboxyl Quantum Dot was added to a final concentration of ⁇ ⁇ , and electroporation (250 V, 950 ⁇ F Qdot (registered trademark) fluorescent particles were enclosed in an envelope.
  • Figure 29 shows the results of observing cancer tissue with a fluorescence microscope and counting Qdot-positive cells in one field of view.
  • F / Tf compared to when Qdot alone was injected without HVJ-E (Q only) and when Qdot-encapsulated HN-deficient HVJ-envelope without F / Tf protein was used (Wl-3) — About 30 times more when HN-deficient HVJ-envelope is used Qdot positive cells were observed.
  • the modified paramyxovirus of the present invention can be used as a highly safe vector because the amount of receptor-bound protein is reduced and the adverse effects on the target cells caused by the receptor-bound protein can be reduced. Is possible.
  • a target molecule such as a polypeptide that specifically binds to the protein expressed on the target cell surface
  • the method for producing a modified paramyxovirus of the present invention can obtain a modified paramyxovirus simply and stably. Moreover, by applying this method, a mutant virus in which a specific virus function is knocked out can be easily obtained.
  • the paramyxovirus having the chimeric protein or protein conjugate of the present invention has high tissue / cell specificity and is useful as a vector for delivering a drug site-specifically.
  • tissue / cell specificity is useful as a vector for delivering a drug site-specifically.
  • by deleting other fusion proteins it is possible to obtain a more specific viral vector, which is expected to be applied to disease treatment.
  • the targeting paramyxovirus can be obtained easily and stably.

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Description

明細書
改変パラミクソウィルスおよびその作製方法
技術分野.
本発明は、 受容体結合タンパク質の量が低減した改変パラミクソウィルス、 お よび受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を用いる改変パラミクソウィル スの作製方法に関する。具体的には、 H Nタンパク質の量が低減した改変 H V J、 および s i R N Aを用いる改変 H V Jの作製方法に関する。
また、 本発明は、 薬剤を部位特異的に送達しうるベクターおよびその作製方法 、 に関する。 背景技術
遺伝子機能解析や遺伝子治療のために、 培養細胞や生体組織に遺伝子を導入す る目的で、多くのウイルス法、非ウイルス法が開発されてきた（Mul 1 igan、 Sci ence, vol. 260、 p. 926 - 932、 （1993) ； Ledley, Human Gene Therapy, vol. 6、 p. 1 129-1 144 ( 1995) )。一般に細胞へ遺伝子を導入するためには、ウィルス法が効果的である。 しかし、 ウィルスベクターを用いる方法は、 親ウィルス由来の遺伝子導入とその 発現の可能性、 免疫原性、 および宿主ゲノム構造の改変の可能性があり、 安全性 の面で問題がある。 一方、 リボソーム等を用いる非ウィルス法の多くは、 細胞傷 ' 害性および免疫原性はウィルス法より低いが、 培養細胞や生体組織内への遺伝子 導入効率においてはウィルスベクターに比べて劣る傾向にある。
ウィルスは変異を繰り返すことにより、 最初は宿主を死滅させる病原体であつ ても、 次第に宿主と共存をはかれるように機能を変え、 それによつて生き延びる ことが出来ていると考えられる。 したがって 1つのウィルスに限っても自然界に は多くの変異体が存在し、 それらの研究によって、 ウィルスの持つ機能の分子レ ベルでの解明がなされてきたと言えるであろう。 このことは基礎生物学的な観点 から価値があるばかりでなく、 抗ウィルスワクチンの開発などの医学的な見地か らも重要視されてきた。 自然発生的なウィルス変異株の分離は、 時間がかかるば かりでなく、 全くの偶然によってしか望みの変異株を得ることができない。
H V j (hemagglut mating virus of Japan ; Sendai v irus)は、 ェンベローァを 有し、 その表面にはへマダルチュンおよびノィラミニダーゼを有する、 パラミク ソウィルス科に属するウィルスである。 H V Jは（一）鎖の R N Aをゲノムにもち、 宿主細胞に感染後、 （一）鎖から（+ )鎖 R N Aが複製され、 それからウィルスタン パク質が大量に生産されウィルス粒子が作られて出芽し、 新たなウィルス粒子が できあがる。 H V Jはエーリ ッヒ腫瘍細胞を融合させるとして注目され （岡田、 微研ジャーナル、 1、 p. 103— 1 10、 （1958) )、 細胞膜融合活性 （以下融合活性とす る） の解析が進められるとともに遺伝子導入ベクターと しての利用が検討されて きた。 融合はまず H N (hemagglutinat ing)タンパク質が細胞表面のァセチル型シ アル酸を認識し、 シァリダーゼの活性でその糖鎖を分解し、 次いで F (fus ion)タ ンパク質が脂質二重層に入り込んで誘発される。 この H Nタンパク質は赤血球凝 集活性、 溶血活性を有し、 血液中に投与されたときは一時的に血液凝固能の低下 を引き起こす。 またこのウィルスは遺伝子導入やドラッグデリバリーのベクター としても開発されている力 標的分子を挿入した H V Jを作製しても H Nタンパ ク質が存在すると、 特異性が減弱されることも予想される。
従って、 このような H Nタンパク質等の受容体タンパク質による毒性が改善さ れた、 安全性の高いウィルスベクターの開発が望まれている。
また、 H V J (Hemagglut inat ing virus of Japan ; Sendai virus)は糸田胞融合を. おこすマウスパラインフルエンザウイルスとして有名であり、 その機能を利用し て組み換えセンダイウイノレスベタターや H V J エンベロープベクタ一、 H V J _ リボソームなどの遺伝子導入べクタ一やドラッグデリバリーシステムが開発され てきた。 その融合は H N (hemagglut inat i ng)タンパク質が細胞表面のァセチル型 シアル酸を認識し、 シァリダーゼの活性でその糖鎖を分解し、 次いで F (fus ion) タンパク質が脂質二重層に入り込んで誘発される。 したがってシアル酸をもつほ とんど全ての紬胞が融合の対象となる。 ベクターとしては普遍性に富むが、 一方 では特異性がなく細胞毒性のある分子の導入には適さない。 ベクター改良の大き な課題の 1つは特異性の増強であり、 具体的には標的導入を可能にすることであ る。 すでに本発明者らのグループではアミノ基をもつ脂質を一部用いてリポソ一 ムを作製し、 そのアミノ基に化学修飾した抗体分子を架橋剤を用いて結合させた immunol iposome を作製 し、 これを不活性化 H V J と融合 して H V J — immunoliposome ^ 発す ことに成 した 、fomita, Nら、. J. Gene Medicine^ vol.4、 p.527-535 (2002))。 ラット腎臓のメサンジゥム細胞の Thy- 1抗原を認識 するモノク口一ナル抗体を用いて作製した HV J -immunol iposome を末梢血管か ら注入すると、 本来肝臓や脾臓の網内系に集まる HV'J- liposome が左右の腎臓 のメサンジゥムに集積し、 9 0%の糸球体に蛍光オリゴ核酸の導入が可能になつ た。 このことはたとえ HNタンパク質が存在していても、 標的分子を挿入し、 そ れが最初に認識されて特異的な細胞に結合すれば、 そこで融合がおこり、 特異的 な導入が可能であることを示睃している。—しかしこの抗体の上うなタンパク質を リボソームに結合させる方法は複雑で、安定な結果を得るためには熟練を要する。 従って、 組織 ·細胞特異性が高いウィルスベクター、 および簡便かつ安定して 該ウィルスベクターを得る方法の開発が望まれている。 例えば、 Hallakら、 Cane er Res、 vol.65 (12)、 p.5292-5300 (2005)には、 麻疹ウィルスの Hタンパク質の C末端にィンテグリン α V ]3.3に結合する Μ 2 8 Lェチスタチン分子を融合させ るべくウィルスゲノムを改変し、 ィンテグリンひ V ]3 3を有する癌細胞をターゲ ティングするウィルスを作製したことが報告されている。 さらにまた、 種々のゥ ィルスベクターを改変してターゲティングウィルスベクターを作製する試みがな されている （特表 2 0 0 1— 5 1 5 4 9 3号公報、 特開 2 00 2— 3 2 04 7 5 号公報、 特表 2 00 5— 5 3 2 0 7 5号公報、 特開 2 00 2— 3 3 0 7 7 4号公 報)。 発明の開示
本発明の第 1の目的は、 安全性の高いベクターとして利用可能な改変パラミク ソウィルス及ぴ該改変パラミクソウィルスを簡便に得る方法を提供することであ る。
本発明の第 2の目的は、 薬剤を部位特異的に送達しうるパラミクソウィルスべ クタ一およびその新規作製方法を提供することである。
本発明者らは、 上述の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 H V Jの H Nタンパク質の R N Aを s i R N Aでノックアウ トすれば、 その抑制効果が有 効である間に作られるウィルスには H Nタンパク質が欠損しており、 さらにこの ような H Nタンパク質の欠損したウィルスは赤血球凝集活性が低減していること を見出した。
更に、 本発明者らは、 センダイウィルスのような融合ウィルス.は細胞外にウイ ルス粒子が放出される際、 宿主細胞膜上に発現しているウィルス遺伝子由来の表 面タンパク質を取り込むことに着目し、 ウィルスゲノムではなく宿主細胞を改変 して、 タ^ "ゲティング分子を細胞外ドメインにもつウィルス遺伝子由来の表面タ ンパク質をその細胞膜上に発現させ、 該細胞にウィルスを感染させてウィルス粒 子を回収することを発想した。 そこで、 センダイウィルスの融合 （F ) タンパク 質の膜貫通ドメインをコードする遺伝子と、 表皮基底層に発現するタンパク質に 対する単鎖抗体フラグメントの遺伝子とを含むキメラ遺伝子を導入した細胞を作 製し、 該細胞に野生型のセンダイウィルスを感染させると、 該抗体フラグメント の抗原結合能を有するキメラ Fタンパク質をウイルス表面上に提示したセンダイ ウィルスが得られることを見出した。
以上のような知見に基づき、 本発明者らは本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は、 以下のものを提供する。
[ 1 ] 野生型に比べて、 含有する受容体結合タンパク質の量が低減していること を特徴とする、 改変パラミクソウィルス。
[ 2 ] 受容体結合タンパク質が H Nタンパク質であり、 パラミクソウィルスが H V. Jである、 [ 1 ] 記載のウィルス。
[ 3 ]パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含む、 [I] または [2] 記載のウィルス。
[4] [1] または [2] 記載のウィルスから調製される、 ウィルスエンベロープ ベクター。
[5] 改変パラミクソウィルスを作製する方法であって、 以下のステップ： ( 1) パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を動物 細胞に導入するステップ、
(2) パラミクソウィルスを該細胞に感染させるステップ、 および
(3) 該細胞で複製されるパラミクソウィルス粒子を単離するステップ、 を含む、 上記方法。
[6] パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が、 該 タンパク質をコードする mRNAに対する s i RNAである、 [5] 記載の方法。
[7] パラミクソウィルスが HV Jである、 [5] 記載の方法。
[8] 受容体結合タンパク質が HNタンパク質である、 [7] 記載の方法。
[9] HV Jの HNタンパク質の発現を抑制する核酸が、 配列番号 3、 4および 5に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなる、 HV Jの H NmRNAに対す s i RNAである、 [8] に記載の方法。
[1 0] [5] 記載の方法により得られた、 改変 HV J。
[I I ] パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含 む動物細胞。
[1 2] パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が、 - 配列番号 3、 4および 5に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列 からなる、 HV Jの HNmRNAに対する s i RNAである、 [ 1 1 ]記載の動物 細胞。
[1 3] 配列番号 3、 4および 5に示すヌクレオチド配列からなる群より選択さ れる配列からなる、 HV Jの HNmRNAに対する s i RNA。
[1 4]パラミクソウィルス由来の Fタンパク質の膜貫通ドメインの N末端側に、 所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが、 直接またはペプチドリン カーを介して連結されている、 キメラタンパク質。
[1 5] Fタンパク質由来のシグナルペプチド、 および哺乳動物細胞で機能し得 るシグナルぺプチドからなる群より選択されるシグナルぺプチドが N末端側に、 直接またはリンカ一ペプチドを介して、 さらに付加されたものである、 [14]記 載のキメラタンパク質。
[1 6] Fタンパク質由来のシグナルペプチドを含む [1 5] 記載のキメラタン パク質であって、 該シグナルペプチドが、 以下の （ 1) 〜 （4) のいずれかのァ ミノ酸配列からなる、 キメラタンパク質。
(1) 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中ァミノ.'酸番号 1〜25で示される アミノ酸配列
(2) 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜25で示される アミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ酸の置換およびノまたは欠失およ び Zまたは挿入および または付加を含み、 かつ、 シグナルペプチドとしての機 能を有するアミノ酸配列
(3) 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜29で示される ァミノ酸配列
(4) 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜29で示される ァミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ酸の置換および または欠失およ び または挿入および または付加を含み、 かつ、 シグナルペプチドとしての機 能を有するアミノ酸配列
[1 7] パラミクソウィルスが HV Jである [14] 記載のキメラタンパク質。
[1 8] HV J由来 Fタンパク質の膜貫通ドメインが、 以下の （ 1) 〜 （4) の いずれかのアミノ酸配列からなる、 [ 1 7] 記載のキメラタンパク質。
( 1 ) 配列番号 1 1に示すァミノ酸配列のァミノ酸番号 490〜 565で示され るァミノ酸配列
(2) 配列番号 1 1に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 4 90〜 56 5で示され るアミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ酸の置換および または欠失お よび zまたは挿入および zまたは付加を含み、 かつ、 膜貫通ドメインとしての機 能を有するアミノ酸配列
(3) 配列番号 1 1に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 487-565で示され るァミノ酸配列
(4) 配列番号 1 1に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 487〜 565で示され るアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸の置換およびノまたは欠失お よび/または挿入およびノまたは付加を含み、 かつ、 膜貫通ドメインとしての機 能を有するアミノ酸配列
[1 9] 細胞表面分子に特異的に結合するペプチドが該分子に対する単鎖抗体で ある、 [ 14] 記載のキメラタンパク質。
[20]単鎖抗体がデスモグレイン 3に対する抗体である、 [1 9] 記載のキメラ タンパク質。
[2 1] 以下の （1) または （2) の、 [20] 記載のキメラタンパク質。
(1) 配列番号.2 1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(2) 配列番号 2 1に示すアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸の 置換および または欠失および Zまたは挿入および Zまたは付加を含み、 かつ、 シグナルペプチド部分がプロセシングにより切断されてウィルス粒子に取り込ま れた場合、 その粒子表面に存在してデスモグレイン 3に結合することができる、 タンパク質
[22] 細胞表面分子に特異的に結合するペプチドがトランスフユリンである、 [ 1 4] 記載のキメラタンパク質。
[23] 以下の （ 1) または （2) のアミノ酸配列を含む、 [2 2]-記載のキメラ タンパク質。
(1) 配列番号 25に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号 40〜7 9 7で示される ァミノ酸配列
(2) 配列番号 25に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号 40〜7 97で示される ァミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ酸の置換および または欠失およ び または挿入および/または付加を含み、 かつ、 ウィルス粒子に取り込まれた 場合、 その粒子表面に存在して細胞膜上に発現ざれてトランスフェリン受容体と 結合する機能を有するアミノ酸配列
[24] [1 4：) 〜 [23] のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする核 酸。
[25] 以下の （1) または （2) の塩基配列からなる、 [24] 記載の核酸。
( 1 ) 配列番号 20に示す塩基配列
(2) 配列番号 20に示す塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件 下でハイブリダィズすることができ、かつ、膜貫通ドメ.'インとしての機能を有し、 デスモグレイン 3に結合することができるタンパク質をコードする塩 S配列
[26] [24]記載の核酸を発現可能な形態で含み、 該核酸がコードするキメラ タンパク質中の所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るぺプチドを細胞表面に 発現し得る動物細胞。
[27] [ 14]記載のキメラタンパク質中の所望の細胞表面分子に特異的に結合 し得るぺプチドをウィルス粒子表面に提示する改変パラミクソウィルス。
[28] HV Jである、 [2 7] 記載の改変パラミクソウィルス。
[29] 野生型に比べて HNタンパク質が低減または欠損されていることをさら なる特徴とする、 [28] 記載の改変パラミクソウィルス。
[30] [27；！ 〜 [29] のいずれか記載のウィルスから調製ざれる、 ウィルス エンベロープベクター。
[3 1] 組織ターグティングパラミクソウィルスを作製する方法であって、 以下 の （1) 〜 （3) のステップを含む方法。
( 1 ) パラミクソウィルス由来の Fタンパク質の膜貫通ドメインの N末端側に、 0〜 30残基からなるリンカーべプチド、 さらにその N末端に所望の細胞表面分 子に特異的に結合し得るペプチドが連結されている、 キメラタンパク質をコード する核酸を、 所定の動物細胞の細胞膜上に該キメラタンパク質を発現させ得る形 態で該細胞に導入すること (2) パラミクソウィルスを該細胞に感染させること
(3) 該細胞で複製されるパラミクソウィルス粒子を単離すること
[3 2] 核酸が動物細胞で機能し得るプロモーターの制御下に置かれ、 且つ該細 胞で機能し得るシグナルべプチドをコ一ドする核酸が付加された形態である、 [3 1 ] 記載の方法。
[3 3] ウィルスが HV Jである [3 1] 記載の方法。
本発明の改変パラミクソウィルスは、 受容体結合タンパク質の量が低減してお り、 受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響などを軽減することが できるので、 安全性の高いベクターとして利用可能で'ある。 本発明の改変パラミ クソウィルスの作製方法によれば、 このような改変パラミクソウィルスを簡便に 得ることができる。 .
本発明のキメラタンパク質を有するパラミクソウィルスは、 特定の組織 ·細胞 に対する特異性が高く、 薬剤を部位特異的に送達しうるベクターとして有用であ る。 また、 該ウィルスの融合関連タンパク質、 特に受容体結合タンパク質を欠損 させることにより、 さらに特異性の高いウィルスベクターとすることも可能であ る。 また、 本発明 ターグティングパラミクソウィルスの作製方法によれば、 簡 便かつ安定して、 所望の組織または細胞をターグティング可能なパラミクソウイ ルスを得ることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 HNmRN Aに対する s i RNAの設計を示す。
図 2は、 HNmRN Aに対する s i RNAの効果を示す。
図 3は、 s i RN Aによる HNノックダウンの経時変化を示す。
図 4は、 s i RNA最適濃度の検討を示す。
図 5は、 HN— s i RNAの HNmRNA特異性を示す。
図 6は、 s i RNAのウィルスタンパク質発現への影響を示す。
図 7は、 出芽ウィルス粒子数の検討を示す。 図 8は、 赤血球凝集活性の比較を示す。
図 9は、 等ウィルス粒子あたりの赤血球凝集活性を示す。
図 1 0は、 組織ターグティング Fタンパク質発現ベクターの作製を示す。
図 1 1は、 GF P融合 Fタンパク質細胞内局在検討を示す（X 1800)。
図 1 2は、 GF P融合 Fタンパク質の発現をウェスタンブロッ ト法により検出 した図である（上段)。 下段には、 それぞれのキメラタンパク質の模式図を示す。 図 1 3は、 ウェスタンプロッ ト法による D s g 3 - s c F v-HV J上の G F
P— Fの検出を示す。
図 14は、 s c F V融合 Fタンパク質発現べクタ の作製を示す。
図 1 5は、 s c F V融合 Fタンパク質の stable transformantでの発現を免疫 染色により検出した図である。 左から順に 960倍、 1980倍および 2460倍で顕微 鏡で観察した。
図 1 6は、 stable transformant を用いて産生した D s g 3 - s c F v _HV J上の D s g 3— s c F v— Fの検出を示す。左図（Myc)は、抗 Myc抗体によるゥ エスタンプロッ ト、中図（TMD)は Fタンパク質の膜貫通ドメインを認識する抗体に よるウェスタンプロッ 卜の結果を示す。右図は電子顕微鏡による観察結果であり、 倍率は、 左下のパネルは 42000倍、 および右上のパネルは 56000倍である。
図 1 7は、 D s g 3— s c F v— Fキメラタンパク質のデスモグレイン 3に対 する結合活性を示す E L I S Aの結果を示す。
図 1 8は、 D s g 3 _ s c F v _ HV J によるマウスケラチノサイ ト targetingを示す。左列はデスモグレインを発現（Dsg3 (+) )している PAM細胞、 中列および右列は、 ともにデスモグレインを発現 （Dsg3(- )) していない NIH3T3 細胞および LLC-MK2細胞に、 野生型の HV J (上段）または D s g 3— s c F v— HV J (キメラ HVJ:下段）を作用させた結果である。 PAM細胞においてのみ、 野生 型に比してキメラ HVJの方が多量に細胞表面に存在していることがわかる。
図 1 9は、 表皮細胞における Fタンパク質の免疫染色を示す。.7 型コラーゲン ノックァゥトマウスの腹部水疱部分の皮膚断片に、 野生型の HV J (上段）または D s g 3— s c F v— H V J (キメラ HVJ:下段）を作用させた結果である。野生型 に比してキメラ HVJの方が多量に存在していることがわかる。
図 2 0は、 皮膚組織切片 （断面） における Fタンパク質の免疫染色を示す（400 倍)。
図 2 1は、 キメラ F/Tf遺伝子発現ベクターの作製を示す。
図 2 2は、 F/Tf タンパク質を発現し、 且つ HNタンパク質を欠損した H V Jの 作製を示す。
図 2 3は、 HNタンパク質及び F/Tf タンパク質の発現をウェスタンブロッ ト法 により検出した図である。 上段が HNタンパク質を、 下段が F/Tf タンパク質を、 それぞれ示す。 W :野生型ウィルス、 C : キメラウィルス、 si : siRNA処理。
図 2 4は、 HEK293細胞への HN欠損 HVJ又は F/Tf _HN欠損 HVJの感染を、 Fタ ンパク質の発現を指標に示した図である。
図 2 5は、 Hela細胞への HN欠損 HVJ又は F/Tf— HN欠損 HVJの感染を、 Fタン バグ質の発現を指標に示した図である。
図 2 6は、 Hela細胞への野生型 HVJ又は F/Tf— HN欠損 HVJの感染を、 Fタンパ ク質陽性細胞数を指標に示したグラフである。 白カラムは野生型 HVJを、 黒カラ ムは F/Tf— HN欠損 HVJを、 それぞれ示す。
図 2 7は、. Hela細胞への F/Tf— HN欠損 HVJ ウィルス感染のトランスフエリン による阻害を示す。 Tf : 卜ランスフェリン。
図 2 8は、 Hela細胞への F/.Tf_ HN欠損 HVJ ウィルス感染を、 Fタンパク質陽性 細胞数を指標に示したグラフである。 白カラムは野生型 HVJを、 黒カラムは F/Tf 一 HN欠損 HVJを、 それぞれ示す。
図 2 9は、 F/Tf—HN欠損 HVJ-エンベロープの癌特異的なターゲティングを示す グラフである。 W：野生型 HVJウィルスより作製したウィルスエンベロープに Qdo tを封入したもの。 C： F/Tf— HN欠損 HVJウィルスエンベロープに Qdotを封入し だもの。 3回の独立した実験を行った。 発明を実施するための最良の形態
1 . 改変パラミクソウィルス及びその作製方法
本発明は、 野生型に比べて、 含有する受容体結合タンパク質の量が低減してい ることを特徴とする、 改変パラミクソウィルス （以下、 本発明の改変パラミクソ ウィルス I ともいう） を提供する。
本発明において用いることのできるパラミクソウィルスとしては、 パラミクソ ウィルス科に属し、 受容体結合タンパク質を有するパラミクソウィルスが挙げら れる。 受容体結合タンパク質を有するパラミクソウィルスとしては、 センダイゥ ィルス （H V J )、 シミアンウィルス （S V )、 麻疹ウィルス （M e V )、 呼吸器合 胞体ウィルス （R S V )、 おたふく風邪ウィルス （M u V )、 ニューカッスル病ゥ ィルス等が挙げられる。 特に限定されないが、 本発明において用いることのでき るパラミクソウィルスは、 好ましくはセンダイウィルス （H V J ) である。 受容体結合タンパク質とは、 標的細胞への結合に関するタンパク質であり、 使 用されるパラミクソウィルスの種類に応じて、 H N (hemagglutininating) タン パク質、 Hタンパク質、 Gタンパク質等が挙げられる。 本発明において量が低減 している受容体結合タンパク質は、 好ましくは H Nタンパク質である。 H Nタン パク質は、 赤血球凝集活性、 溶血活性等を有することが知られており、 また、 ゥ ィルスの特異性を减弱すると考えられている。
本発明の改変パラミクソウィルス Iにおいては、 受容体結合タンパク質の量が 低減している。 受容体結合タンパク質の量の低減とは、 本発明の改変パラミクソ ウィルス Iの受容体結合タンパク質の発現レベルが、 野生型のパラミクソウィル スのものと比し、 多く ともおよそ 0 . 6倍 （例えば、 0 . 5倍、 好ましくは 0 . 3倍、 より好ましくは 0 . 2倍、 最も好ましくは 0 . 1倍） 以下に低減している ことを意味する。 好ましくは、 本発明の改変パラミクソウィルス Iにおいては、 受容体結合タンパク質が発現していない。 本発明の改変パラミクソウィルス Iの 受容体結合タンパク質の遺伝子は、 該タンパク質の発現レベルが低減している限 り変異していても変異していなくてもよい。 変異している場合、 当該変異は受容 体結合タンパク質の量の低减に関与していない。
本発明の改変パラミクソウィルス Iにおいてば、 好ましくは、 受容体結合タン パク質の発現を抑制する核酸を含むことにより、 野生型に比べて受容体結合タン パク質の量が低減している。 受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸として は、 後述の本発明の改変パラミクソウィルス Iの作製方法において導入され得る 各種核酸が好ましく例示される。
本発明の改変パラミクソウィルス Iにおいては、 受容体結合タンパク質の量が 低減しているので、 受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響などが 軽减している。 受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響とは、 例え ば、 H Nタンパク質による赤血球凝集活性、 溶血活性等が挙げられる。 従って、 本発明の改変パラミクソウィルス Iは、 安全性の高いベクター （ウィルスェンべ ロープべクタ一等） として利用可能である。
本発明の改 パラミクソウィルス Iをベクターとして用いる場合、 標的細胞へ の感染能力を増強するため、 標的細胞表面に発現しているマーカータンパク質に 特異的に結合するポリべプチド等の標的分子が該ウィルスに付加していてもよレ、。 本発明の改変パラミクソウィルス Iは、 公知のいかなる手法を組み合わせて作 製してもよいが、 好ましくは以下の方法が例示される。
従って、 本発明はまた、 以下のステップを含む改変パラミクソウィルス Iを作 製する方法 （以下、 本発明の方法ともいう） を提供する ： .
( 1 ) パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を動物 細胞に導入するステップ、
( 2 ) パラミクソウィルスを該細胞に感染させるステップ、 および
( 3 ) 該細胞で複製されるパラミクソウィルス粒子を単離するステップ。
上記ステップ （ 1 ) では、 パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現 を抑制する核酸が用意される。
パラミクソウィルスとしては、 上記と同様のものが挙げられ、.好ましくはセン ダイウィルス （H V J ) である。 また、 受容体結合タンパク質としては、 上記と 同様のものが挙げられ、 好ましくは HNタンパク質である。
パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸の好ましい 一態様は、 パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の mRNAもしくは初期 転写産物のアンチセンス核酸である。「アンチセンス核酸」とは、標的 mRNA (初 期転写産物） を発現する細胞の生理的条件下で該標的 mRNA (初期転写産物） とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、 且つハイブリダイズした状態で該標 的 mRNA (初期転写産物） にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核 酸をいう。アンチセンス核酸の種類は DN Aであっても RN Aであってもよいし、 あるいは DNAZRN Aキメラであってもよい。 また、 天然型のアンチセンス核 酸は、 細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易 に分解されるので、 本発明のアンチセンス核酸は、 分解酵素に安定なチォリン酸 型 （リン酸結合の P = 0を P = Sに置換） や 2' —O—メチル型等の修飾ヌクレ ォチドを用いて合成することもできる。 アンチセンス核酸の設計に重要な他の要 素として、 水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、 これらはリ ポソームゃマイク口スフ: ァを使用するなどの剤形の工夫によっても克服するこ とができる。
本発明で用いられるアンチセンス核酸の長さは、 パラミクソウィルスの受容体 結合タンパク質の mRNAもしくは初期転写産物と特異的にハイブリダィズし得 る限り特に制限はなく、 短いもので約 1 5塩基程度、 長いもので mRNA (初期 転写産物） の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。 合成の容 易さや抗原性の問題等から、 好ましくは約 1 5〜約 30塩基からなるオリゴヌク レオチドが例示される。アンチセンス核酸が約 25 m e rのオリ ゴ DN Aの場合、 生理条件下でパラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の mRNAとハイブリ ダイズし得る塩基配列は、 標的配列の塩基組成によっても異なるが、 通常、 約 8 0 %以上の同一性を有するものであればよい。
本発明のアンチセンス核酸の標的配列は、 アンチセンス核酸がハイブリダイズ することにより、 パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質もしくはその機能 的断片の翻訳が阻害される配列であれば特に制限はなく、 パラミクソウィルスの 受容体結合タンパク質の mRN Aの全配列であっても部分配列であってもよいし、 あるいは初期転写産物のィントロン部分であってもよいが、 アンチセンス核酸と してオリゴヌクレオチドを使用する場合は、 標的配列はパラミクソウィルスの受 容体結合タンパク質の mRN Aの 5 ' 末端からコード領域の C末端コード部位ま での間に位置することが望ましい。 好ましくは 5 ' 末端からコード領域の N末端 コード部位までの領域であり、最も好ましくは開始コ ドン近傍の塩基配列である。 また、 標的配列は、 それに相補的なアンチセンス核酸がヘアピン構造等の二次構 造を形成しないようなものを選択することが好ましい。
パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸の別の好ま しい一態様は、 パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の mRNAもしくは 初期転写産物を、 コード領域の内部 （初期転写産物の場合はイントロン部分を含 む） で特異的に切断し得るリボザィムである。 「リボザィム」 とは核酸を切断する 酵素活性を有する R N Aをいうが、. 最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有す るオリゴ DNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、 本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限り DNAをも包含する概念とし て用いるものとする。 リボザィムとして最も汎用性の高いものとしては、 ウイ口 ィ ドゃウィル ィ ド等の感染性 RN Aに見られるセルフスプライシング RNAが あり、 ハンマーヘッ ド型やヘアピン型等が知られている。 ハンマ^ヘッ ド型は約 40塩基程度で酵素活性を発揮し、 ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両 端の数塩基ずつ （合わせて約 1 0塩基程度） を mRNAの所望の切断部位と相補 的な配列にすることにより、 標的 mRN Aのみを特異的に切断することが可能で ある。 このタイプのリボザィムは、 RN Aのみを基質とするので、 ゲノム DNA を攻撃することがないというさらなる利点を有する。 パラミクソウィルスの受容 体結合タンパク質の mRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、 RNAヘリ力 ーゼと特異的に結合し得るウィルス核酸由来の RN Aモチーフを連結したハイブ リ ッ ドリボザィムを用いることにより、 標的配列を一本鎖にすることができる [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)]。 さらに、 リボザィ ムを、 それをコードする DNAを含む発現べクターの形態で使用する場合には、 細胞質への移行を促進するために、 t R N Aを改変した酉さ列をさらに連結したハ イブリ ッ ドリ ボザィムとすることもできる [Nucleic Acids Res.， 29(13)： 2780- 2788 (2001)]。
パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する物質のさらに別 の一態様は、 パラミクソウィルスの ¾容体結合タンパク質の mRNAもしくは初 期転写産物のコード領域内の部分配列 （初期転写産物の場合はィントロ 部分を 含む） に相補的なオリゴ RNA、 いわゆる s i RNAである。 短い二本鎖 RNA を細胞内に導入するとその RNAに相補的な mRNAが分解される、 いわゆる R NA干渉 （RNA i ) と呼ばれる現象は、 以前から線虫、 昆虫、 植物等で知られ ていたが、最近、 この現象が動物細胞でも起こることが確認されて以来 [Nature, 411 (6836).： 494-498 (2001)]、 リボザィムの代替技術として汎用されている。 s i RNAは標的となる mRNAの塩基配列情報に基づいて、 市販のソフ トウエア (例： RNAi Designer; Invitrogen) を用いて適宜設計することができる。
s i RNAとしては、 後述の通り自ら合成したものを用いることができるが、 市販のものを用いてもよい。
本発明で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザィムは、 パラ ミクソウィルスの受容体結合タンパク質の DNA配列もしくはゲノミック DN A 配列に基づいて mRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、 市販の DN A/RNA自動合成機 （アプライ ド ·バイオシステムズ社、 ベックマン社等） を 用いて、 これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。 s i RNAは、 センス鎖及びアンチセンス鎖を DN A/RNA自動合成機でそれぞれ 合成し、 適当なアニーリング緩衝液中、 約 90〜約 9 5°Cで約 1分程度変性させ た後、 約 30〜約 70°Cで約 1〜約 8時間アニーリングさせる'ことにより調製す る,ことができる。 また、 相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップ するように合成して、 これらをァニーリングさせた後リガーゼでライゲーション することにより、 より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。 あ るいは、 s i RNAは、 センス鎖およびアンチセンス鎖を適当な長さ （例えば約 3〜約 1 0塩基） のリンカ一を介して連結した RNAとして合成し、 導入する動 物細胞内のダイサー （d i c e r) などによってプロセシングされるように設計 することもできる。 さらには、 センス鎖およびアンチセンス鎖をコードする DN Aがそれぞれ別個の U 6や H 1などの P o 1 III 系プロモーターの制御下にお かれた.発現ベクター、 あるいは上記センス鎖とアンチセンス鎖とをリンカーを介 して連結した RNA鎖をコードする DNAが P o 1 III 系プロモーターの制御 下におかれた発現ベクターとして調製し、 動物細胞内で発現させ、 s i RNAを 形成させてもよい。
好ましくは、 パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核 酸は、 パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の mRN Aに対する s i RN Aである。 より好ましくは、 該核酸は、 HV Jの HNタンパク質の mRNAに対 する s i RNAである。 具体的に、. s i RNAとしては、 HN— 89 9 (配列番 号 3 )、 H N— 1 142 (配列番号 4 ) および HN— 1 42 7 (配列番号 5 ) で示 される配列からなるものが好ましい。
核酸を導入する動物細胞としては、 パラミクソウィルスが感染し、 細胞内でパ ラミクソウィルス粒子を再構成する限り、 任意の動物に由来する細胞であり得る 1S 哺乳動物に由来する細胞が好ましい。 本明細書中で使甩される場合、 「哺乳動 物」 としては、 例えば、 霊長類、 実験用動物、 家畜、 ペット等が挙げられ特に限 定されるものではないが、 具体的には、 ヒ ト、 サル、 ラッ ト、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ゥマ、 ゥシ、 ャギ、 ヒッジ、 ィヌ、 ネコなどである。 具体的には、 サル腎由来の CV_ 1細胞や L L C一 MK 2細胞、 ハムスター腎由来の BHK細 胞などの培養細胞などが挙げられる。
核酸を動物細胞に導入する方法は、 細胞の種類により適宜選択することができ る。 例えば、 リボフェグシヨン法、 マイクロインジェクション法、 リン酸カルシ ゥム共沈殿法、 PEG法、 エレク ト口ポレーシヨン法等を挙げることができる。 上記ステップ （2 ) では、 パラミクソウィルスを、 パラミクソウィルスの受容 体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を導入した動物細胞に感染させる。
該感染させるパラミクソウィルスとしては、 再構成能を有する限り特に限定さ れず、 野生型パラミクソウィルスであっても改変パラミクソウィルスであっても 良い。 改変パラミクソウィルスの場合、 当該改変は受容体結合タンパク質の量の 低減に関与していない。
感染したパラミクソウィルスは、 動物細胞内で受容体結合タンパク質の発現の 低減したパラミクソウィルスとして再構成する。
複製されたパラミクソウィルス粒子の単離は自体公知の方法で行われ、 例えば 細胞培養上清を回収 ·遠心分離するなどの方法によりなされる。 ·
このようにして作製された改変パラミクソウィルスは、 受容体結合タンパク質 の発現が低減している。 受容体結合タンパク質の量の低減とは、 本発明の方法に より得られた改変パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現レベルが、 野生型のパラミクソウィルスのものと比し、 多くともおよそ 0 . 6倍 （例えば、 0 . 5倍、 好ましくは 0 . 3倍、 より好ましくは 0 . 2倍、 特に好ましくは 0 . 1倍） 以下に低減していることを意味する。 最も好ましくは、 本発明の方法によ り得られた改変パラミクソウィルスは、受容体結合タンパク質が発現していない。 本発明の方法により得られた改変パラミクソウィルスは、 受容体結合タンパク 質の量が低減しているので、 受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影 響などが軽減している。 特に、 本発明の改変パラミクソウィルスは、 赤血球凝集 活性が低減されていることから、 生体内に投与した際に、 野生型パラミクソウイ ルスを投与した場合に比べて、 赤血球凝集が起こりにくい。 .
したがって、本発明の改変パラミクソウィルス Iは、安全性の高いベクター（ゥ ィルスエンベロープベクター等） として利用可能である。
2 . キメラタンパク質およびそれをコードする核酸
本発明で用いられるキメラタンパク質は、 パラミグソウィルス由来の表面タン パク質の膜貫通ドメインと所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るぺプチドと を含むキメラタンパク質である。 パラミクソウィルス由来の表面タンパク質とし ては、 パラミクソウィルス由来受容体結合タンパク質および融合 （F ) タンパク 質 （以下、 これらを包括して融合関連タンパク質という場合がある） 等が挙げら れ、 より好ましくは Fタンパク質であり、 特に好ましくはセンダイウィルス （H V J ) 由来 Fタンパク質である。 例えば、 H V J由来 Fタンパク質の膜貫通ドメ インは、 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 9. 0〜 5 6 5で 示されるアミノ酸配列、 ァミノ酸番号 4 8 7〜 5 6 5示されるアミノ酸配列、 あ る レヽ は ア ミ ノ 酸番 号 5 0 1 〜 5 2 1 で示 さ れ る 膜貫 通 部位 (UniProtKB/Swi ss-Prot entry, Primary accession number : P04855参照) ¾Τ ' む、 その部分配列である。 本明細書において 「膜貫通ドメイン」 とは、 膜貫通部 位を含み、 かつ、 パラミクソウィルスの裏打ちタンパク質と相互作用して該ウイ ルス粒子表面に取り込まれるのに必要な、—該部位の近傍配列をさらに含む、 ウイ ルス表面タンパク質の機能的部分を意味する。 膜貫通部位を含むことにより、 動 物細胞内で発現し、 細胞膜に輸送された該キメラタンパク質は、 該膜タンパク質 の膜外領域 （本明細書においては、 ウィルス表面タンパク質のウィルス粒子外に 露出した領域を膜外領域と称する） を細胞外に提示した状態で細胞膜上にとどま る。 本発明に用いる膜貫通ドメインの好ましい例としては、 H V J由来 Fタンパ ク質の膜貫通ドメインである、 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸 番号 4 9 0〜 5 6 5に示す配列およびこれに実質的に同一な配列からなるぺプチ ドが挙げられる。 また、 本発明に用いる膜貫通ドメインとして好ましい別の例と しては、 H V J由来 Fタンパク質の膜貫通ドメインである、 配列番号 1 1に示さ れるアミノ酸配列中ァミノ酸番号 4 8 7〜 5 6 5に示す配列およびこれに実質的 に同一な配列からなるペプチドが挙げられる。 ここで 「実質的に同一な配列」 と は、 H V J由来 Fタンパク質全長について後述されるのと同様の意味である。 具 体的には、 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 9 0〜 5 6 5 又はアミノ酸番号 4 8 7〜 5 6 5で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは 複数 （例えば 1〜 10個、 好ましくは 1〜5、 4、 3または 2個） のアミノ酸の 置換および/または欠失および または挿入および/または付加を含み、 かつ、 パラミクソウィルスの裏打ちタンパク質と相互作用して該ウィルス粒子表面に取 り込まれる能力を保持するぺプチドも、 HV J由来 Fタンパク質の膜貫通ドメイ ンに包含される。
本発明で用いられるキメラタンパク質は、 所望の細胞表面分子に特異的に結合 し得るペプチドをその一部として含む。 ここで、 「所望の細胞表面分子」 とは、 後 述する本発明の改変パラミクソウィルスをターゲテイングしたい細胞表面に存在 する分子を意味する。 細胞表面分子は、 本発明の改変パラミクソウィルスが標的 とする細胞の表面に発現している限り、 特に限定されず、 公知のいかなる細胞表 面タンパク質、 糖鎖、 脂質等も全て含まれる。 好ましくは、 細胞表面分子は、 特 定の細胞種に特異的に発現している細胞表面タンパク質である。 好ましい細胞表 面分子としては、 例えば、 デスモグレイン 3 (表皮基底細胞に発現）、 ]32インテ ダリン （好中球、 マクロファージに発現）、 α4インテグリン （リンパ球、 線維芽 細胞に発現）、 ひ lib ]33インテグリン （血小板、 巨核球に発現）、 葉酸受容体 （癌 細胞に発現）、 トランスフェリン受容体 （癌細胞に発現）、 HER 2 (転移性乳癌 細胞に発現）、 EGFR (非小細胞性肺癌細胞に発現）、 LDLR (肝細胞に発現）、 CD 20 (悪性リンパ腫に発現）、 CEA (鸱臓癌に発現）、 G p l O O (メラノ 一マに発現）、 P SMA (前立腺癌に発現）、 AF P (原発性肝癌、 卵黄嚢腫瘍に 発現） 等が挙げられるが、 それらに限定されない。 好ましくはデスモグレイン 3 又はトランスフェリン受容体である。
細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドとしては、 例えば、 各種細胞表面 レセプターに対するリガンド、 例えば、 インテグリン類に対する RGD配列を有 するペプチド （例：ェチスタチン、 フイブロネクチン等）、 トランスフェリン受容 体に対する トランスフェリン等、 あるいは各種細胞表面分子に対する抗体 （例え ば、 単鎖抗体等の単一の核酸によりコードされ得る抗体分子が好ましい） 等が挙 げられる。 例えば、 細胞表面分子がデスモグレイン 3の場合、 細胞表面分子に特 異的に結合し得るペプチドとしては、 デスモグレイン 3を認識する単鎖抗体 （ s c F v ) が挙げられる。
細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドは、 上記表面タンパク質の膜貫通 ドメインの N末端に付加される。 該ペプチドは、 ペプチドリンカ一を介して膜貫 通ドメインの N末端に付加されてもよい。 かかるペプチドリンカ一は、 任意のァ ミノ酸残基からなる任意の長さのぺプチドであってよく、 用いられる表面タンパ ク質の膜貫通ドメインの N末端側に生来存在するアミノ酸配列を含む、 またはこ れからなるものであってもよい。 好ましくは、 1〜3 0残基、 より好ましくは、 1〜2 5、 1〜2 0、 1〜： I 5または 1〜； L 0残基、 さらには 1〜5残基の長さ のものが最も好ましい。 このリンカ一は、 当業者が、 膜貫通ドメインをコードす る遺伝子および細胞表面分子に特異的に結合し得るぺプチドをコードする遺伝子 の塩基配列によって、 これらをインフレームに連結するために挿入される場合も ある。
本発明で用いられるキメラタンパク質は、 該キメラタンパク質をウィルス粒子 表面に提示する改変パラミクソウィルスの作製のため、 該ウィルス複製の宿主細 胞として用いられ得る所定の動物細胞の細胞膜に輸送され得るような形態で、 発 現することが望ましい。 従って、 該キメラタンパク質は、 好ましくはその N末端 に、 該キメラタンパク質を構成するウィルス表面タンパク質由来のシグナルぺプ チド、 好ましくは Fタンパク質由来のシグナルペプチドを含むか、 あるいは該所 定の哺乳動物細胞で機能し得る他のシグナルぺプチドが付加されたものである。 必要に応じて、 該シグナルペプチドは、 上記と同様のペプチドリンカ一を、 好ま しくはその C末端に含むこともできる。 かかるペプチドリンカ一は、 任意のアミ ノ酸残基からなる任意の長さのぺプチドであってよく、 Fタンパク質の生来のシ ダナルぺプチドの C末端側に生来存在するアミノ酸配列、 すなわち成熟 Fタンパ ク質の N末端部分の配列を含む、 またはこれからなるものであってもよい。 好ま しくは、 ：！〜 3 0残基、 より好ましくは、 ：！〜 2 5、 1〜2 0、 1〜： 1 5または 1〜 1 0残基、 さらには 1〜 5残基の長さのものが最も好ましい。 公知の表面タ ンパク質のシグナルぺプチドは、 種々のタンパク質データべ一ス上で公開されて おり、 また、 該タンパク質のアミノ酸配列をもとに、 例えば Kyte & Dool ittle の方法などに基づいて容易に予測することができる （そのような解析ソフトウェ ァも多数市販されており、 ウェブサイ ト上で一般に利用可能である）。 例えば、 H V J由来 Fタンパク質のシグナルペプチドは配列番号 1 1に示されるアミノ酸配 列中アミノ酸番号 1〜 2 5で示される領域であり （UniProtKB/Swiss-Prot entry, Primary accession number : P04855 参照）、 本発明のキメラタンパク質は、 該領 域を少なくとも含んでいることが好ましく、 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配 列のアミノ酸番号 1〜 2 5、 1〜2 6、 ：！〜 2 7、 1〜2 8、 ：！〜 2 9、 1〜3 0または 1〜3 5のいずれかで示される領域を N末端側に含んでいるものなどが 挙げられる。 また、 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸審号 1〜2 5又はアミノ酸番号 1〜2 9で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数 (例えば' 1〜 1 .0個、 好ましくは 1〜5、 4、 3または 2個） のアミノ酸の置換 および Zまたは欠失および または挿入および/または付加を含み、 かつ、 所定 の哺乳動物細胞においてシグナルぺプチドとしての機能し得るアミノ酸配列から なるぺプチドも、 H V J由来 Fタンパク質のシグナルぺプチドに包含される。 所定の哺乳動物細胞で機能し得る他のシグナルぺプチドとしては、例えば、 α - アミラーゼシグナル配列、 サブチリシンシグナル配列、 MF αシグナル配列、 SUC2 シグナル配列、 ィンシュリンシグナル配列、 α -ィンタ一フエ口ンシグナル配列、 抗体分子シグナル配列などが用いられるが、 それらに限定されない。
本発明のキメラタンパク質は、 タンパク質の検出や精製等を容易にならしめる ためのタグのアミノ酸配列を含んでいてもよい。 タグとしては、 Flag タグ、 His X 6タグ、 C- Mycタグ、 HAタグ、 AU1タグ、 GSTタグ、 MBPタグ、 蛍光タンパク質 タグ （例えば GFP、 YFP、 RFP、 CFP、 BFP等）、 ィムノグロブリン Fcタグ等を挙げ ることが出来る。 タグの位置は、 本発明のキメラタンパク質が膜貫通ドメインと しての機能を有し、 所望の細胞表面分子に特異的に結合することが出来る限り特 に限定されないが、 好ましくは、 キメラタンパク質の C末端又はシグナルぺプチ ドの C末端である。
好ましい一実施態様において、 本発明で用いられるキメラタンパク質は、 パラ ミクソウィルスのような融合ウィルス由来の融合関連タンパク質の膜貫通ドメイ ンを含む。 ここで 「融合関連タンパク質」 は、 融合ウィルスの表面に発現し、 ゥ ィルスと標的細胞との融合に関連するタンパク質であるかぎり特に制限されない 1 例えば、 Fタンパク質および受容体結合タンパク質 （HNタンパク質、 Hタ ンパク質、 Gタンパク質等） が挙げられる。
特に好ましい一実施態様において、 本発明は、 パラミクソウィルス由来 Fタン パク質の膜貫通ドメインの N末端側に、 所望の細胞表面分子に特異的に結合し得 るペプチドが、 直接またはペプチドリンカ一を介して連結されているキメラタン パク質を提供する。 パラミクソウィルスとしては、 宿主細胞との融合を介して該 細胞に感染する、 パラミクソウィルス科に属するウィルスであれば特に制限はな く、 例えば、 センダイウィルス （HV J)、 麻疹ウィルス （MV；)、 流行性耳下腺 炎ウィルス （M-u V.)、 パラインフルエンザウイルス 1 (P I V 1)、 P I V 2、 P I V 3、 シミアンウィルス 5 (SV 5)、 ニューカッスルウィルス （NDV)、 R Sウィルス （R SV) 等が挙げられるが、 これらに限定されない。
好ましくは、 パラミクソウィルス由来融合関連タンパク質として、 HV J由来
、
Fタンパク質が挙げられる。 HV J由来 Fタンパク質は、 配列番号 1 1に示され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質 である。「配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列か らなるタンパク質」とは、配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 さらに好ましくは約 9 5%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 且つウィルスと細胞との融合 を媒介する活性を有するタンパク質である。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム N C B I B LAST (N a .t i o n a 1 C e n t e r f o r B i o t e c h n o l o g y I n f o r ma t i o n B a s i c L o c a l A. l .i.g nme n t S e a r c h T o o l ) を用い、 以下の条件 （期待値 = 1 0 ； ギヤップを許す；マトリク ス=8し031；1^6 2 ； フィルタリング =O F F) にて計算することができる。 また、 HV J由来 Fタンパク質としては、 例えば、 （i) 配列番号 1 1に示され るアミノ酸配列中の 1〜 2 0個 （好ましくは、 1〜 1 5個、 さらに好ましくは、 1〜 5個、.より好ましくは、 1〜 3個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番号 1 1に示ざれるアミノ酸配列に 1〜2 0個 （好ましくは、 1〜 1 5個、 さらに好ましくは、 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が付加し たアミノ酸配列、 （iii) 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列に 1〜2 0個 （好 ましくは、 1〜 1 5個、 さらに好ましくは、 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号 1 1に示されるァミノ 酸配列中の 1〜 2 0個 （好ましくは、 1〜 1 5個、 さらに好ましくは、 1〜 5個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配 列、 または（V)それら欠失 '付加 ·挿入 ·置換を組み合わせたアミノ酸配列を有す るタンパク質も含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が欠失、 付加、 挿入または置換されている場合、 そ の欠失、 付加、 挿入または置換の位置は特に限定されない。 公知のバリアントと しては、 UniProtKB/Swiss-Prot entry, Primary accession number: P04855に不 されるものが挙げられるが、 それらに限定されない。
HV J由来 Fタンパク質の膜貫通ドメインどしては、 その膜貫逋部位 （配列番 号 1 1に示されるアミノ酸配列中ァミノ酸番号 5 0 1〜5 2 1で示される領域） 並びに HV Jの裏打ちタンパク質と相互作用して該ウィルス粒子表面に取り込ま れるのに必要なその近傍配列を含む限り、 いかなるものであってもよい。 後述す る本発明の改変パラミクソウィルスはウィルスゲノム由来のインタク トな Fタン パク質をウィルス粒子表面に発現するので、 本発明のキメラ Fタンパク質は融合 ぺプチド （配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1 1 7〜 1 4 1 で示される領域） を含んでいる必要はない。 特に好ましくは、 本発明のキメラ F タンパク質に用いられる HV J由来 Fタンパク質の膜貫通ドメインは、 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 9 0〜5 6 5又はアミノ酸番号 4 8 7〜5 6 5で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列からなる。 ここで 「実質的に同一」 とは上記と同義である。
本発明のキメラ Fタンパク質に含まれる、 細胞表面分子に特異的に結合し得る ペプチドは特に制限されず、 上述した通りのものを用いることができるが、 例え ば、 好ましい一実施態様において、 本発明のキメラ Fタンパク質は、 抗デスモグ レイン 3単鎖抗体を含む。 該抗体は、 本発明の改変パラミクソウィルス I Iがヒ トへの遺伝子導 用ベクターとして好ましく利用されることを考慮すれば、 キメ ラ抗体、 より好ましくはヒ ト化抗体、 最も好ましくは完全ヒ ト抗体であることが 望ましい。 該抗体ポリペプチドは、 H V J由来 Fタンパク質の膜貫通ドメインに 連結され得る。 特に好ましい一実施態様においては、 抗デスモグレイシ 3単鎖抗 体ポリペプチドは、 H V J由来 Fタンパク質の F 2および F 1領域、 より具体的 には、 配列番号. 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 3 0 - 4 8 9で示さ れるアミノ酸配列と.置換されて、 Fタンパク質のシグナルぺプチドと膜貫通ドメ インの間に挿入される。
また、 別の好ましい一実施態様において、 本発明のキメラ Fタンパク質は、 ト ランスフェリンを含む。 該抗体は、 本発明の改変パラミクソウィルス I I力 ヒ ト への遺伝子導入用ベクターとして好ましく利用されることを考慮すれば、 ヒ ト ト ランスフェリンであることが望ましい。 トランスフェリンは、 H V J由来 Fタン パク質の膜貫通ドメインに連結され得る。 特に好ましい一実施態様においては、 トランスフェリンは、 H V J由来 Fタンパク質の F 2および F 1領域、 より具体 的には、 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中ァミノ酸番号 3 0〜4 8 6で示 されるアミノ酸配列と置換されて、 Fタンパク質のシグナルぺプチドと膜貫通ド メインの間に挿入される。
本発明のキメラタンパク質の例としては、 H V J由来の Fタンパク質フラグメ ントを含むキメラタンパク質である、 配列番号 2 1に示すアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一の配列からなるタンパク質が挙げられる。 ここで 「実質的に同 一」 とは上記と同義であるが、 実質的に同一の配列からなるタンパク質は、 H V J粒子表面に取り込まれ得ることに加えて、 デスモグレイン 3を特異的に認識し て結合する能力を保持する必要がある。 このタンパク質は、 デスモグレイン 3を 認識する単鎖抗体可変部フラグメント （ s c F v ) を膜外領域に含んでおり、 か かるタンパク質を有するウィルスは、 細胞表面にデスモグレイン 3を提示してい る細胞に特異的にダーグティングすることが可能である。 デスモグレイン 3は表 皮基 層の細胞に選択的に発現しているため、 上記ウィルスは表皮基底層に特異 的にターゲティングする。
本発明のキメラタンパク質の別の例としては、 H V J由来の Fタンパク質フラ グメントを含むキメラタンパク質である、 配列番号 2 5に示すアミノ酸配列 又は配列番号 2 5に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 0〜 7 9 7で示されるァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一の配列からなるタンパク質が挙げられる。 ここで 「実質的に同一」 とは上記と同義であるが、 実質的に同一の配列からなる タンパク質は、 H V J粒子表面に取り込まれ得ることに加えて、 トランスフェリ ン受容体を特異的に認識して結合する能力を保持する必要がある。 このタンパク 質は、 トランスフ リンを膜外領域に含んでおり、 かかるタンパク質を有するゥ ィルスは、 細胞表面にトランスフェリン受容体を提示している細胞に特異的にタ ーゲティングすることが可能である。 トランスフェリン受容体は癌細胞に選択的 に発現しているため、 上記ウィルスは癌細胞に特異的にターゲティングする。 本発明で用いられるキメラタンパク質は、 本発明の改変パラミクソウィルスを 製造する目的においては、 パラミクソウィルスが感染し、 ウィルスを複製し得る 動物細胞の細胞膜上に発現することが必要である。 従って、 好ましくは、 該キメ ラタンパク質は、 該キメラタンパク質をコードする核酸を発現可能な形態で該動 物細胞に導入することにより製造される。 それゆえ、 本発明はまた、 本発明で用 いられるキメラタンパク質をコードする核酸（以下、 単に 「本発明のキメラ核酸」 ともいう） を提供する。
本発明のキメラ核酸は、 D N A又は R N Aあるいは両者のキメラのいずれでも よい。 また、 該キメラ核酸は 1本鎖であっても 2本鎖であってもよい。 2本鎖の 場合、 該キメラ核酸は二本鎖 DNAでも二本鎖 RNAでもよく、 DNAZRNA ハイブリ ッ ドであってもよい。
本発明のキメラ核酸は、 表面タンパク質に由来するぺプチド部分および細胞表 面分子に特異的に結合し得るペプチド部分をコードする天然の塩基配列、 または 異なるコ ドンによりコードされたものを配置通りに連結したもの、 あるいは該連 結した配列に相補的な塩基配列からなる核酸とハイス トリ ンジェント（high stringent)条件下でハイブリダィズする塩基配列を含み、 且つ該キメラタンパク 質と同質の活性 （即ち、 キメラ核酸が導入された動物細胞内で発現して細胞膜上 に輸送され、 且つ該細胞内で複製し、 再構成されたパラミクソウィルス粒子が細 胞外に放出される際に該ウィルス粒子表面に取り込まれ、 生成する改変パラミク ソウィルスを所望の細胞表面分子を発現する標的細胞にターグティングし得る活 性） を保持するタンパク質をコードするものである。
ハイス トリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列としては、 例え ば、 該連結した配列と約 7 0%以上、 好ましくは約 8 0%以上、 さらに好ましく は約 9 0%以上、 特に好ましくは約 9 5%以上の相同性を有する塩基配列などが 用いられる。 本明細書における塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST . ( National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 =10； ギャップを許す； フ ィルタリ ング =0N； マッチスコア =1 ; ミスマッチスコア =-3) にて計算することが できる。
上記ハイプリダイゼーションの条件は、 既報の条件を参考に設定することがで き (Current Protocols in Molecular Biology, jonn Wi ley & sons, 6.3.1-0.3.6,· 1999)。例えば、ハイス トリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件 としては、 6XSSC (sodium chloride/sodium citrate) ,45。Cの後、 0.2 X SSC/ 0...1%SDS/50〜65°Cでの一回以上の洗浄が挙げられる。 また、 中程度のス トリン ジェント条件下でのハイブリダィゼーシヨ ンの条件としては、 例えば、 2XSSC/ 30°Cの後、 1 X SSCZ0. 1 %SDS/30〜50°Cでの一回以上の洗浄が挙げられる。
本発明のキメラ核酸の特に好ましい一例としては、 上記した、 配列番号 2 1に 示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の配列からなるタンパク質をコ —ドする核酸が挙げられる。 より好ましくは、 該キメラ核酸は、 配列番号 2 0に 示される塩基配列からなる核酸、 あるいは、 配列番号 2 0に示される塩基配列の 相補鎖配列とス トリンジェントな条件下でハイブリダィズし得る塩基配列を含み、 かつ、 H V J粒子表面に取り込まれ得るとともに、 デスモグレイン 3を特異的に 認識して結合する能力を保持するタンパク質をコードする核酸である。 ここでハ イストリンジェントな条件とは、 上記と同義である。
本発明のキメラ核酸の特に好ましい別の一例としては、 上記した、 配列番号 2 5に示されるアミノ酸配列又は配列番号 2 5に示すァミノ酸配列中ァミノ酸番号 4 0〜7 9 7で示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の配列からなる タンパク質をコードする核酸が挙げられる。 より好ましくは、 該キメラ核酸は、 配列番号 2 4に示される塩基配^又は配列番号 2 4に示す塩基配列中塩基番号 1 1 8〜2 3 9 1で示きれる塩基配列を含む核酸、 あるいは、 配列番号 2 4に示さ れる塩基配列又は配列番号 2 4に示す塩基配列中塩基番号 1 1 8〜2 3 9 1で示 される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得 る塩基配列を含み、 かつ、 H V J粒子表面に取り込まれ得るとともに、 トランス フェリン受容体を特異的に認識して結合する能力を^持するタンパク質をコード する核酸である。 ここでハイストリンジェントな条件とは、 上記と同義である。 以下、 本発明の好ましい一実施態様である、 単鎖抗体と表面タンパク質もしく はそのフラグメントとのキメラタンパク質をコードするキメラ核酸について、 そ の調製方法を示すが、 当業者は、 以下の記載および当該技術分野で周知慣用の技 法を適宜組み合わせることにより、 容易に他のキメラタンパク質をコードする核 酸を製造することができる。
まず、 公知の表面タンパク質のコード核酸の配列情報に基づいて、 該表面タン パク質の膜貫通ドメィンをコードする核酸を、 常法に従ってクローニングする。 例えば、 該核酸は、 該表面タンパク質の膜貫通ドメインをコードする塩基配列の 一部分を有する合成 D N Aプライマーを用いて P C R法によって増幅する力、 ま たは適当な発現ベクターに組み込んだ核酸を、 該表面タンパク質の一部あるいは 全領域をコードする D N A断片もしくは合成 D N Aを標識したものとハイブリダ ィゼーシヨンさせることによってクローニングすることができる。 ハイブリダィ ゼーシヨンは、 例えば、 モレキュラー ' クローニング （Molecular Cloning) 第 2 版 （前述） に記載の方法などに従って行うことができる。 また、 市販のライブラ リーを使用する場合、 ハイブリダィゼーシヨンは、 該ライブラリ一に添付された 使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。 '
得られた表面タンパク質の膜貫通ドメインをコードする核酸は、 後のキメラ核 酸の作製を容易にするために、 必要に応じて、 リンカ一や部位特異的変異誘発等 を用いて適当な制限酵素サイ トを導入することができる。
単鎖抗体をコードする核酸を得る方法としては、 例えば、 所望の細胞表面分子 もしくはそのフラグ.メントを抗厚として常法によりモノクローナル抗体産生ハイ プリ ドーマを作製し （ここで免疫動物として KMマウス TMなどのヒ ト抗体産生マ ウスを用いると、 ヒ ト抗体産生ハイプリ ドーマを容易に得ることができる)、該ハ イブリ ドーマから R N Aを抽出して、 ヒ ト抗体の重鎖および軽鎖の各可変領域に 特異的なプライマーを用いて、 R T _ P C Rにより可変領域遺伝子をクローニン グした後、 適当なリンカーを介して重鎖と軽鎖を連結する方法などが挙げられる 力 これらに限定されない。 P C Rの過程で、 単鎖抗体をコードする核酸の末端 に、 表面タンパク質やシグナルぺプチドをコ一ドする核酸とのライゲーションに 適した制限酵素サイ トを導入することができる。
得られた表面タンパク質をコードする核酸と、 単鎖抗体をコ一ドする核酸は、 適当な制限酵素、 リガーゼ等を用いて連結することができる。
本発明のキメラ核酸は、 該キメラ核酸にコードされるキメラタンパク質が所定 の動物細胞内で分泌経路に乗って細胞膜上へ輸送されるべく、好ましくはその 5 ' 末端に、 上述のいずれかのシグナルぺプチドをコ一ドする核酸が連結されている ことが好ましい。 このようなシグナルペプチドをコードする核酸は、 例えば、 当 該シグナルペプチドを含むタンパク質を発現する細胞 （ウィルスを含む） から抽 出したゲノム核酸もしくは c D N Aを铸型として、 P C Fiによりクローユングす ることもできる力 公知の塩基配列情報に基づいて、化学合成することもできる。 得られたシグナルペプチドをコードする核酸は、 単鎖抗体をコードする核酸も しくは表面タンパク質をコードする核酸と、 適当な制限酵素、 リガーゼ等を用い て連結することができる。
本発明のキメラ核酸を動物細胞に導入することにより、 本発明のキメラタンパ ク質をその細胞膜上に発現する動物細胞 3-を得ることができる。
また、 上記動物細胞にパラミクソウィルスを感染させることにより、 本発明の キメラタンパク質をウィルス粒子表面に発現している改変パラミクソウィルス (本発明の改変パラミクソウィルス I I ) を得ることもできる。
本発明の改変パラミクソウィルス I Iは、 そのウィルス表面に、 標的細胞の細 胞表面分子に特異的に結合するぺプチドにウィルス表面タンパク質が連結したキ メラタンパク質を発現している。 従って、 該改変パラミクソウィルスは、 標的組 織 ·細胞に対する特異性が高く、 薬剤等を部位特異的に送達し得るパラミクソゥ ィルスベクター （ウィルスエンベロープベクター等） として利用可能である。 更に、 該改変パラミクソウィルス I Iにおいて、 上記本発明の改変パラミクソ ウィルス I と同様の改変を加えることにより、
( 1 ) パラミクソウィルス由来の Fタンパク質の膜貫通ドメインの N末端側に、 所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るぺプチドが、 直接またはべプチドリン 力一を介して連結されている、 キメラタンパク質をウィルス粒子表面に提示して おり、 且つ
( 2 ) 野生型に比べて、 含有する受容体結合タンパク質 （H Nタンパク質等） の 量が低減している、
改変パラミクソウィルスを得ることが出来る。 ここで、 「細胞表面分子に特異的に 結合し得るペプチド」 は 「受容体結合タンパク質」 とは異なる。 該ウィルスにお いては、 受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響が軽減されること により、 高い安定性が達成されているとともに、 特定の組織 '細胞に対する高い 特異性が達成されており、 極めて好ましい。 3 . ターグティングパラミクソウィルスの作製方法
本発明は、 下記のステップを含む、 ターゲテイングパラミクソウィルスを作製 する方法 （以下、 本発明の方法ともいう） を提供する ：
( 1 ) パラミクソウィルス由来の Fタンパク質の膜貫通ドメインの N末端側に、 0〜3 0残基からなるリンカ一ペプチド、 さらにその N末端に所望の細胞の表面 分子に特異的に結合し得るペプチドが連結されている、 キメラタンパク質をコー ドする核酸を、 所定の動物細胞の細胞膜上に該キメラタンパク質を発現させ得る 形態で該細胞に導入するステップ、
( 2 ) パラミクソウィルスを該細胞に感染させるステップ、 および
( 3 ) 該細胞で複製されるパラミクソウィルス粒子を単離するステップ。
ステップ （1 ) では、 上記の本発明のキメラ核酸が、 動物細胞内で発現しうる 形態に調製され、 導入される。 具体的には、 上記のように作製した本発明のキメ ラ核酸が、 適当な発現ベクター中に組み込まれる。
発現ベクターとしては、 動物細胞中で本発明のキメラタンパク質を産生できる ものであれば特に限定されない。 例えば、 プラスミ ドベクター、 ウィルスベクタ 一 （例えば、 アデノウイルス、 レトロウイルス） 等を挙げることができる。 発現 ベクターは、 少なくとも、 プロモーター、 開始コドン、 本発明のキメラ核酸、 終 止コドンを含んでいることが好ましい。 また、 ェンハンサー配列、 本発明の核酸 の 5， 側および 3， 側の非翻訳領域、 スプライシング接合部、 ポリアデニレーシ ヨン部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、 目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいてもよい。 また、 プロモーターとしては、 SV40由来のプロモーター、 レトロゥイノレスのプロ モーター、 ヒートショ ックプロモーターなどが挙げられる。 ターミネータ一領域、 複製可能単位、 ェンハンサー配列、 ポリアデニレーショ ン部位およびスプライシング接合部位については、 自体公知のものを用いること ができる。
選択マ一カーとしては、 自体公知のものを用いることができる。 例えばテトラ サイク リン、 アンピシリン、 またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例 示される。
遺伝子増幅遺伝子としては、 ジヒ ドロ葉酸レダクターゼ （DHFR) 遺伝子、 チミ ジンキナーゼ遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子、 グルタミン酸合成酵素遺伝子、 アデノシンデァミナ一ゼ遺伝子、 オル二チンデカルボキシラーゼ遺伝子、 ヒグロ マイシン一 B—ホスホ トランスフェラーゼ遺伝子、 ァスパルラ ト トランスカル バミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
本発明の核酸は、 通常の遺伝子工学的手法を用いて適当な発現ベクター中のプ 口モーダ一の下流に連結されることにより、 動物細胞内で発現しうる形態に調製 される。
動物細胞としては、 上述の核酸を発現し、 細胞内でパラミクソウィルスが再構 成する限り、 特に制限されない。 例えば、 サル腎由来の CV— 1細胞や L L C— MK 2細胞、 ハムスター腎由来の B HK細胞などの培養細胞などが挙げられる。 動物細胞に核酸を導入する方法は、 該動物細胞において核酸が発現する限り特 に限定されず、 動物細胞の種類などにより適宜選択することができる。 例えば、 リポフエクション法、マイク口インジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、 P EG法、 エレク ト口ポレーション法等を挙げることができる。
動物細胞を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜2 0%の胎児牛血清を 含む MEM培地（Science、 122巻、 501 (1952))、 D M E M培地（Virology、 8巻、 396(1959))、 R P M I 1 6 4 0培地（The Journal of the American Medical Association, 199巻、 519(1967))、 1 9 9 ί§¾ (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 卷、 1 (1950) )などが用いられる。 ^^ま約6〜8 であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0〜40°Cで約 1 5〜6 0時間行ない、 必 要に応じて通気や撹拌を加える。
このようにして、 本発明のキメラタンパク質は動物細胞内で発現し、 該キメラ タンパク質中のシグナルぺプチドの作用により分泌経路に乗って、 該動物細胞の 細胞膜上に輸送される。
上記ステップ （2 ) では、 パラミクソウィルスを、 本発明のキメラタンパク質 を発現する動物細胞に感染させる。
該感染させるパラミクソウィルスとしては、 再構成能を有する限り特に限定さ れず、 野生型パラミクソウィルスであっても改変パラミクソウィルスであっても よい。 伹し、 本発明のキメラタンパク質が自体、 細胞との融合活性を有しない場 合、 改変パラミクソウィルスは、 少なくとも Fタンパク質の融合活性を保持する ものであることが望ましい。
感染したパラミクソウィルスは、動物細胞内で再構成されて細胞膜へと運ばれ、 細胞膜の一部を取り込む形でェク トサイ トーシス様に細胞外へと放出される。 そ のため、 細胞外へ放出されたパラミクソウィルスは、 細胞膜上に発現した本発明 のキメラダンパク質をウィルス粒子表面上に提示した、 改変パラミクソウィルス である。
上記した本発明の改変パラミクソウィルスの形成手順を考慮すれば、 本発明の キメラタンパク質を動物細胞内で発現させることなく、 適当な脂質 （複合体） か らなるリポソームに該キメラタンパク質を包埋したプロテオリボソームとして調 製し、 これを動物細胞と融合させることにより、 該動物細胞の細胞膜上にキメラ タンパク質を提示させ、 これにパラミクソウィルスを感染させて同様にウィルス を複製、 再構成させることも可能であることが理解される。
さらに、 上記プロテオリボソームの利用を考慮すれば、 本発明で用いられるダ —ゲティング用のタンパク質は、 細胞表面分子に特異的に結合し得る非ぺプチド 性成分 （本明細書においては、 核酸配列 （コ ドン） によりコードされる 2 0アミ ノ酸以外のアミノ酸を含むぺプチド性物質も、 ここでいぅ非ぺプチド成分に包含 されるものと定義する） をウィルス表面タンパグ質とともに含むものであっても よい。 例えば、 葉酸受容体に特異的に結合する分子として葉酸が挙げられるが、 葉酸分子とウィルス表面タンパク質もしくはそのフラグメントのァミノ末端また は側鎖のァミノ基と葉酸のカルボキシル基との間でアミ ド結合を形成させること により、 あるいは側鎖のカルボキシル基と葉酸のァミノ基との間でアミ ド結合を 形^ ¾させることによりウィルス表面タンパク質と葉酸とが共有結合したタンパク 質コンジユゲートとすることができる。 かかるタンパク質コンジユゲートをプロ テオリボソームを利用して動物細胞の細胞膜上に提示させて、 該動物細胞をパラ ミクソウィルスで感染させれば、 複製し、 再構成されて細胞外へ放出されたパラ ミクソウィルスは、 該タンパク質コンジ 3-ユゲートをゥ 'ィルス表面に提示した改変
4
パラミクソウィルスであり、 葉酸受容体を発現する細胞をターゲテイングするの に用いることができる。
細胞表面分子に特異的に結合し得る他の非ぺプチド性成分において、 ウィルス 表面タンパク質の N末端ゃァミノ酸側鎖上の官能基と共有結合し得る構造でない 場合には、 例えば、 ィムノコンジュゲートの作製において通常用いられているよ うな、 公知のリンカ一を介して結合させることも可能である。
上記ステップ （3 ) では、 改変パラミクソウィルス粒子が単離される。 該ウイ ルス粒子の単離は、 自体公知の方法でなされ、 例えば、 細胞培養上清を回収 ·遠 心分離するなどの方法によりなされる。
本発明の方法により得られた改変パラミグソウィルスは、そのウィルス表面に、 標的細胞の細胞表面分子に特異的に結合するぺプチドにウィルス表面タンパク質 が連結したキメラタンパク質を提示している。 従って、 該改変パラミクソウィル スは、 標的組織 ·細胞に対する特異性が高い。 該改変パラミクソウィルスは、 ま た、 薬剤等を部位特異的に送達し得るパラミクソウィルスベクター （ウィルスェ ンべロープベクター等） として利用可能である。
本明細書において、 ウィルスエンベロープベクタ一とは、 ウィルスのゲノムを U V照射、 超音波処理、 界面活性剤処理など種々の方法により失活させて、 ウイ ルスの複製能を消失させたものをいう。 ウィルスエンベロープベクタ一は、 ェン ベロープ、 即ち、 ウィルスに存在するヌクレオキヤプシドの周囲を取り囲む脂質 二重層を基本とする膜構造を含む。 かかるウィルスエンベロープベクターは、 ゥ ィルス粒子表面に存在するタンパク質を維持しているため、 細胞に吸着可能であ り、 ウィルス粒子内に封入した物質 （たとえば、 タンパク質、 核酸、 低分子化合 物） を細胞内に送達するベクターとして利用できる。
ゥイノレスからゥイソレスエンベロープベクターを調製する方法、 およびウィルス エンベロープベクターに物質を封入する方法はいずれも既に公知であり、例えば、
Molecular Therapy, 2002 vol. 6 219-226などに記載されている。
例えば、 Fタンパク質の膜貫通ドメインの N末端側にトランスフェリンが融合 した融合タンパク質を粒子表面に有するエンベロープベクタ一は、 トランスフエ リンの癌細胞特異的な結合能により、 癌細胞特異的ターゲティングベクターとし て、 癌細胞にだけ物質を送達可能である。
また、 Fタンパク質の膜貫通ドメインの N末端側にデスモグレイン 3を認識す る単鎖抗体可変部フラグメント （ S c F V ) が融合した融合タンパク質を粒子表 面に有するエンベロープベクターは、 該フラグメントの表皮基底層特異的な結合 により、 表皮基底層特異的ターゲテイングベクターとして、 表皮基底層にだけ物 質を送達可能である。
上記ウィルスエンベロープベクターを用いて、 物質を所望の細胞に送達する場 合、ウイルス粒子内に物質が封入されたウイルスェンべロープべクタ一を単独で、 または該ベクターと、 安定化化合物、 希釈剤、 担体とを組み合わせて含む薬学的 組成物として用いられる。
該薬学的組成物は、 上記ウィルスエンベロープベクターが意図される目的を達 成するのに有効な量の該ベクターを含む。 「治療的有効量」 または「薬理学的有効 量」 は当業者に十分に認識される用語であり、 意図される薬理学的結果を生じる ために有効な薬剤の量をいう。 従って、 治療的有効量は、 処置されるべき疾患の 徴候を軽減するのに十分な量である。 所定の適用のための有効量 （例えば、 治療 的有効量） を確認する 1つの有用なアツセィは、 標的疾患の回復の程度を測定す ることである。 実際に投与される量は、 処置が適用されるべき個体に依存し、 好 ましくは、 所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適 化された量である。 治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
該薬学的組成物は、 ウィルスエンベロープが患部の細胞内または目的とする組 織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられ得る。
該薬学的組成物は、 任意の無菌生体適合性薬学的キャリア （生理食塩水、 緩衝 化生理.食塩水、 デキス トロース、 および水を含むが、 それらに限定されない） 中 で投与され得る。 これらの分子のいずれも、 適切な賦形剤、 およびノまたは薬学 的に受容可能なキャリアと混合する薬学的組成物中にて、 単独で、 あるいは他の 薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。 薬学的に受容可能なキャリアは薬学的 に不活性であり得る。
該薬学的組成物の投与は、 経口または非経口により達成される。 非経口送達の 方法としては、 局所、 動脈内 （例えば、 頸動脈を介する）、 筋肉内、 皮下、 髄内、 クモ膜下腔内、 脳室内、 静脈内、 腹腔内、 または鼻孔内の投与が挙げられる。 本 発明は、 処置部位に到達する経路であれば、 どのような経路でもよい。
ウィルスエンベロープベクターの投与量は、 年齢その他の投与対象の条件、 投 与の目的、 使用するベクターの種類等により適宜選択される。
本発明のウィルスを、 ウィルスエンベロープベクターとしてヒ トに投与する場 合、 1被験体あたり、通常 400〜400, 0ひ 0 HAU相当の、好ましくは 1， 200〜 1 20, O O OHAU相当の、 より好ましくは 4, 000〜40, 00 0 HAU相当のウィルスエンベロープベクターが投与され得る。 「HAUj とは、 ニヮ トリ赤血球 0. 5 %を凝集可能なウィルスの活性をいう。 1 HAUは、 ほぼ 2400万ウィルス粒子に相当する （O k a d a , Y.. ら、 B i k e n J o u r n a 1 4， 209— 2 1 3、 1 96 1)。 上記の量は、 例えば、 1 日 1回から数 回投与することができる。
正確な用量は、 ベクターに含まれる物質の種類や治療されるべき患者を考慮し て、 個々の臨床医によって選択される。 用量および投与は、 十分なレベルの活性 部分を提供するか、 または所望の効果を維持するように調整される。 考慮され得 るさらなる因子としては、 疾患状態の重症度；患者の年齢、 体重、 および性別 ； 投与の食餌制限時間、 および頻度、 薬物組合せ、 反応感受性、 および治療に対す る耐性/応答） が挙げられる。 特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応 じて、 持続作用性薬学的組成物は、 3〜4日毎に、 毎週、 または 2週間に 1回、 投与され得る。
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載 された内容は、 本明細書での引用により、 その全てが明示されたと同程度に本明 細書に組み込まれるものである。 '
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、 本発明は以下の実施例に限定され るものではなレ、。 実施例
実施例 1
(1) HNmRNAに対する s i RNAの作製
図 1に示す 5種類の HN m R N Aノ ックダウン用の s i R N Aは、 SMART si RNA technologyTM (Dharmacon Research 社） を用いてデザイン、 合成された。 その 5種類の s i RNA (HN-223 , HN— 34 2、 HN— 89 9、 HN— 1 1 42、 HN- 1 427) は、 それぞれ HN m R N A上の G C A U U G A A C A U GAGCAGCA (223 - 24 1 :配列番号 1)、 GAACAAAAACAGC AGGGAU (342-360 ：配列番号 2)、 GAACUAAGUCUCACC GGU A (8 9 9-9 1 7 :配列番号 3)、 GCGUGAUCAUCCAGGUC AA ( 1 14 2-1 1 60 :配列番号 4)、 GCGUAUACACUGAUGCU UA( 1 427-1445 ：配列番号 5 ) を標的としている。 また、 コントロール として使用している s c r a m b 1 e s i R N Aはランダムな配列 （ G C G C GCUUUGUAGGAUUCG ：配列番号 6 ) からなる。
(2) s i RNAの効果の検出 合成された s. i RNAは、 Lipofectamin Reagent (InvitrogenTM, California, USA) と Plus Reagent (InvitrogenTM) を利用して、 それぞれのプロ トコールに 従って種々の濃度で L L CMK 2細胞に導入した。
導入の 24時間後に、 培養細胞を Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (-) (P B S) (Nacalai Tesque Inc. Tokyo, Japan) で 洗净し、 multiplicity of infection (MO I ) 0. 0 2の濃度に調整した H V J を含む Opti- MEM I (GIBCOTM, Invitrogen) を加えて 3 7°C、 5 % C O2— 9 5 % air 条件下で 1時 間インキュベーションし、 HV Jを感染させた。 さらに 24時間後、 該培養細胞 から RNeasy (QIAGEN . K. Tokyo, Japan)を用いて全 R N Aを抽出した。 3 0 μ g全 RNAを 1 %ァガロースゲノレ (Cambrex Bio Science Rockland Inc, Rockland: USA) 電気泳動により分画した後、 Hybond - N+ nylon transfer membrane (Amersham Biosciences UK Ltd. Buckinghamshire, England) tこ 卜フンスファーした 0 H N 及び G 3 PDH c DNAを Random Primers DNA Labeling System (InvitrogenTM) を用いて32 P 標識し、 PerfectHy TM (T0Y0B0 Co Ltd, Osaka, Japan) の示す方 法に従つでハイプリダイゼーションした後、 KODAK BioMax MS Film (KODAK, Tokyo, Japan) に露光して解析した。
その結果を図 2に示す。 上記 s i RNAのうち、 HN- 2 2 3、 HN-34 2は ほとんど効果を示さず、 HN- 8 9 9、 HN- 1 1 4 2および HN- 1 4 2 7は、 H Nタンパク質の転写を有意に阻害した。
(3) s i RNAによる HNノックダウンの経時的変化
HN- 8 9 9を用いて、図 3下段に示すようなタイムスケジュールで、 HV Jを 感染させる時間を変えて、 s i RNAの効果を経時的に検出した。 その結果、 図 3にしめすように、 s i RN Aの導入から 24時間後に HV Jを感染させて、 そ の 2 4時間後に RNAを回収するというタイムスケジュールが、 最も HNタンパ ク質の転写が抑制されることがわかった。
(4) s i RNA最適濃度の検討
HN-8 9 9の s i RNAの濃度を、 5 0〜3 2 0 pm o 1 /m 1で変化させて 上記の通り導入後、 上記に従って HV J感染、 RNA回収を行い、 s i RNAの 濃度依存的な効果を検討した。 図 4に示すとおり、 5 0 p mo 1 /m 1で充分な効 果を示した。
(5) s i RNAの HNに対する特異性
図 5に示すように、 上記と同様の手法により、 回収した RNAについて、 HN タンパグ質 mRNA、 Fタンパク質 mR N Aおよび Mタンパク質 mRN Aについ て、 ノーザンブロッ トによりその mRN A量を検出したところ、 HN-8 9 9の s i RNAは、 HNタンパク質特異的に転写を抑制した。
(6) HV J感染細胞からの新規出芽ウィルス回収お'よびウェスタンプロッ ト H V Jウィルスを感染させた L L CMK 2細胞を Penicillin / Streptomycin 含有 MEMにて 3 7°C、 5 % CO2— 9 5% air 条件下で 4 8時間培養した。 培養上清から 1 00， 00 0 X g遠心によりウィルス粒子を回収し、 P B Sに懸 獨した。 ·
H V J を 2-Xサンプノレバッフ ァー （125 m Tris-HCl (pH6.8) I 10% 2-mercaptoethanol / 4% sodium dodeci lsulfate I 10% sucrose I 0.004% bromophenol blue) に溶解し、 ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミ ドゲ ノレ （ 1 2%) で泳動後、ホラィズプロッ ト （水平積層式電気泳動転写装置、 Atto，
Tokyo, Japan) を用レヽ " X 丄 mmobilon— P Transfer Membrane (Mi丄 lipore Co, Billerica, USA) に トランスファ一した。 次いで、 メンブレンを 5 %スキムミル ク （Nacalai Tesque Inc. ) 含有洗浄緩衝液 (684 mM NaCl / 4mM Tris I 0.1% Tween 20)により室温で 1時間ブロッキングした後、 一次抗体 （抗 HN抗体は 1 , 0 0 0 倍、抗 F抗体は 2 0 0倍、抗 M抗体は 2， 0 00倍に 5%スキムミルクで希釈） を 室温で 1時間反応させた。後に、洗浄緩衝液でメンブレンを洗浄し、二次抗体（H Nと Mの場合は抗家兎 I g G抗体を、 Fの場合は抗マウス I g G抗体を、 いずれ も 2， 0 00倍に 5 %スキムミルクで希釈） を室温で 1時間反応させた。 二次抗 体反応後、 洗浄緩衝液でメンブレンを洗浄して、 ECL Western Blotting Detection Reagent (Amersham Biosciences; で検出した。 その結果を図 6に示す。 HN- 8 9 9を導入した細胞から回収した HV Jでは、 HNはほとんど発現されていなかった。 その一方、 Fタンパク質、 Mタンパク質 はスクランブル s i RNA導入細胞から回収した HV Jより増大していた。
(7) ウィルス粒子数の比較
s i RNA導入下での HV J感染による HV J ウィルス粒子産生数を検討する ために、 ウィルス粒子数の比較のためのリアルタイム P C Rによるウィルスゲノ ム定量を行った。 HV Jゲノム検出用のオリゴヌクレオチドプライマー、 及び蛍 光ラベルプロ一プは Applied Biosystems 社の Primer Express (登録商標） Softwarel.5 によってデザインされた。 プライマ一の配列は G G C A T A G A A GGTTACTGCCAGAA(HV J-1 0 7 6 9 F：配列番号 7)、 TGTCA CGGCTATAGCTTGATTGT C (HV J - 1 0 8 9 7 R ：配列番号 8) で、 プローブの配列は 丁じ。八。じ丁八0。八0じ丁〇丁 （配列番号 9) であ る。 PURESCRIPI RNA Isolation Kit (Gentra Systems, Inc. Minnesota, USA) を 用いて回収 した細胞由来 H V J 力 ら R N Aゲノ ムを抽出 し、 更に SuperScript™III First Strand Synthesis System (Invitrogen™) を用いて c D N Aを合成した。 上記プライマ一とプローブ、 及び Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Co. , Ltd. California, USA) 用レヽて、 Applied Biosystems · 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems) でジァノレタイム P CRアツセィを行いゲノムの量を測定し、粒子数を算出した。結果を図 7に示す。 スクランブル （scramble) RNA導入、 HN- 8 9 9 s i RNA導入ともに、 R N Aを導入しない場合 （normal) に比べて、 ウィルス粒子は多量に産生されてい た。
(8) 赤血球凝集 （HA) 活性の測定
s i RNAの導入、 HV Jの感染後、 その等量の培養上清に存在する全てのゥ ィルス粒子を回収してニヮ トリ赤血球の凝集活性を測定したところ、 HN- 8 9 9 導 ^群では正常の？！ V Jの約 1 0分の 1であった （図 8)。 なお、 ここで、 この凝 集活性は、 HV J懸濁液の 2倍希釈系列をつく り、それぞれに希釈液と等量の 1 % 赤血球含有液を混和して赤血球凝集を観察し、 以下の計算式で HV J懸濁液の力 価 （HAU/m l ) を求めて算出した。
HAU/m 1 = 2 n X希釈倍率
n：凝集反応を認める最大希釈数
希釈倍率：元のサンプルが希釈されている場合のその希釈倍率 次に、ウィルス粒子数あたりの赤血球凝集活性を測定した。図 9に示すように、 やはり HN— 8 99 s i R NA導入細胞から得られたウィルスは、その赤血球凝 集活性が低減していた。 実施例 2
( 1 ) HVJ-Fと G F Pあるいは Dsg- 3-scFvとのキメラ Fタンパク質発現ベクター の作製
図 1 0の （ i ) 〜 （ i v) に示すキメラ EGF P-Fタンパク質を発現するため のベクターを作製した。
Mutagenesis (Promega)を用レ、て、 pcDNA3.1- F プラスミ ドを、 元来有している Bglll認識部位（279- 284)を削除し、新たに Agel認識部位（82-87)および Bgl II認 識部位（346- 351)を作製し、 新たなプラスミ ドベクターを得た（pcDNA3.卜 Fmut)。 これを Hindlll/Xholで切断し、得られた F断片を同様に切断した pCY4Bに挿入し、 pCY4B-Fmutを作製した。 pCY4B- Fmut中の Bglll切断部位（図 1 0中 （ i ) )、 Agel -Bglll部位（図 1中 （ i i ) )、 AgeI-Eco47III部位（図 1 0中 （ i i i ) )、 お よび AgeI_EcoNI部位（図 1 0中 （ i v) )のそれぞれに EGFPを挿入するために、 pEGFP- Cl(BDBiosiencesClontech)から PCRにより増幅させて EGFPcDNA断片を得 た。
ここで用いた PCRプライマーは以下の通りである ：
GFP-Bgl I I-f： 5 ' -CATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3 ' (配列番号 1 2 )
GFP-BglII-r:5' - TTCTAGATCCGGTGGATCCG-3 ' (配列番号 1 3)
GFP-Agel-f：5' - TATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG- 3 ' (配列番号 1 4) GFP- Eco47III- r:5， - GCTCTAGATCCGGTGGATCCCG- 3' (配列番号 1 5) GFP- EcoNI_r:5， - ATCTAGATCCGGTGGATCCCG-3' (配列番号 1 6)。
図 1 0中 （ i ). の Bglll切断部位揷入 EGFPcDNA断片の取得には、 GFP- Bglll- f と GFP- Bglll- rを、 図 1 0中 （ i i ) の Agel— Bglll部位挿入 EGFPcDNA断片の取 得には、 GFP-Agel-f と GFP-Eco47III-rを、図 10中 （ i i i ) の Agel— Eco47IIl 部位挿入 EGFPcDNA断片の取得には、 GFP-AgeI_f と GFP- Eco47II I- rを、 および図 10中. （ i V ) の Agel— EcoNI部位挿入 EGFPcDNA断片の取得には、 GFP-Agel- f と GFP-EcoNI-rとを用いて、 PCR増幅を行った。
pCY4B-Fmutを、 Bglll単独、 Agelと Bglll, Agelと Eco47IIIまたは Agelと EcoNI で切断後、 Blunting High (TOYOBO) により平滑末端化した後、 上記増幅して得た EGFPcDNA を、 Ligation High (TOYOBO)により室温にて 5分間反応させることによ りライゲーションさせ、 図 10の （ i ) 〜 （ i v) に模式的に示すキメラ EGFP- F タンパク質発 ¾ベクターを作製した。
Fタンパク質の cDNA 配列を配列番号 1 0に示すが、 上記 （ i ) では、 345位 と 346位の間に PCR産物断片が挿入され、上記（ i i )では 8 7〜345位が、 上記 （ i i i ) では 8 7〜4 55位が、 上記 （ i v) では 8 7〜： I 46 5位が、 それぞれ対応する PCR産物断片と置換されている。
(2) 上記ベクターの細胞内導入 （トランスフエクシヨン） と GFP免疫染色 トランスフエクション前日に 6 wellプレートにカバーガラス（IWAKI)を敷き、 2 X 105の LLCMK2細胞を播種した。
トランスフエクシヨ ン当日 800 μ 1 の D-MEM (-)に変えて 3時間培養後、 Lipofectamin Plus(invitrogen)を用いて 1 ； u gのプラスミ ド DNAを導入し、 4時 間後に 1 mLの D- MEM(+)を加え、 48時間培養した。
固定は 4%パラホルムアルデヒ ドで 4°C ' 15分間行い、 一部は 0. l%Triton-Xで 2 分間インキュベーション後、 5%スキムミルク/ PBSで 1時間ブロ ッキングした。
1次抗体 Anti— Green Fluorescent Protein (GFP) PoAb Purified IgG(MBし）： 1/2000 で 1時間ィンキュベーションし、 PBSで 3回洗浄し、 2次抗体 Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG(H+L)： 1/1000で 1時間ィンキュベーションした後、 PBSで 3回洗 浄した。 カバーガラスで封入後、 共焦点顕微鏡（Nikon)にて観察した。
図 1 1にその結果を示す。 上段は、 0.1% Triton- X でめインキュベーションを 行わなかった場合であり、 下段は 0.1% Triton-Xでのインキュベーションを行つ た場合の結果である。 ともに、 EGFPは赤色に染色されており、 核が Hoechst33258 により青色に染色されている。
図 1 1より判るとおり、 上記 （ i ) 〜 （ i V ) のキメラタンパク質は全て細胞 内で発現されたが （図 1 1下段）、 Triton- Xで細胞を透過化させないと EGFPで染 色されるのは （ i V ) のみであり、 （ i V ) のキメラタンパク質のみが細胞表面に 局在していることが判る。
意図したとおりのキメラタンパク質が発現されていることは、 抗 GFP抗体によ るウェスタンプロッ トによつて確認できた （図 1 2 )。 ウェスタンブロッ トの方法 は以下のとおりである。
トランスフエクシヨン 48時間後、 2X105個の細胞を 20 ； Lの SDSサンプルバ ッファーに溶解し、 サンプルを調製した。 サンプルは 12%SDS ポリアクリルアミ ドゲルで分離し、 PVDFメンブレン（Millipore)へ転写した。 メンブレンは 5%スキ ムミルク/ wash buffer (2 mM Tris-HCl pH8.0, 0.02% NaCl, 0.05% Tween20) ；
、 ■ ■ ■ blocking bufferで 1時間ィンキュベーションし、次に 1次抗体 1： 2000 Anti- Green Fluorescent Protein (GFP) PoAb Purified IgG( BL), 1:400 f236(抗 F抗体）， 1:1500 抗 HN抗体を blocking bufferで希釈し、 室温で 1時間インキュベーションした。 Wash buffer でメ ンブレンを洗った後、 horseradish peroxidase - con jugate anti-rabbit 又 は anti-mouse secondary antibodies ： 1000, Amersham Pharmacia)で検出した。
図 1 2に示すとおり、 意図したキメラタンパク質の分子量の位置にそれぞれの バンドが検出された。
. したがって、 Fタンパク質の N末端 2 9残基のトランスメンブランドメインの みが G F Pと融合したキメラタンパク質のみが細胞表面への局在が可能であるこ とが判った。
(3) キメラ G F P-Fタンパク質を有する HV Jの産生
上記キメラ G F P-Fタンパク質発現べクターを導入した細胞に、野生型の HV Jを m.o. i=0.6で感染させた。 MEM培地で 48時間培養後、 上清を回収し遠心 (440 g、 5分間）により細胞を除去しさらに上清を遠心（100000g、 2時間）し、 得ら れた HV Jペレツドを PB Sで洗浄後、適当量に懸濁し、 SDS- PAGE後抗 G F Ρίΐ体によるウェスタンプロッ トに供した。 その結果を図 1 3に示す。 図 1 3 のレーンは左から、 HV Jを感染させていない上記キメラ GF P-Fタンパク質発 現ベクター導入細胞（F-GF P (細胞））、 該導入細胞の培養上清（F- 0F P (培養 上清））、 該導入細胞に野生型の HV Jを感染させた後その上清から回収されたゥ ィルス （F_GF P+HV J)、 遺伝子導入していない L LC-MK 2細胞に野生型 HV Jを感染させた培養上清から回収されたウィルス （HV J (L L C- MK 2細 胞で生産））、およびコントロールとして鶏卵で産生させて精製した HV Jである。 図 1 3より、 該導入細胞に野生型の HV Jを感染させた後その上清から回収さ れたウィルスは、 GF Pが検出された。 さらに、 Fタンパク質の細胞外ドメイン を認識する抗体でウェスタンブロッ トを行ったところ、 上記ウィルスでも タン パク質が検出され、 該抗体はキメラ GF P-Fタンパク質は認識しないことから、 該ウィルスは、 野生型とキメラの両方の Fタンパク質を発現していることがわか つた。 さらに、 HNタンパク質も発現していた。
(4) s c F V融合キメラ Fタンパク質発現ベクターの作製
上記の結果から、 表皮基底層に発現するデスモグレイン（deSm0grein)3タンパ ク質を認識する単鎖抗体（mDSg3-SCFV)を用いて、 表記基底層ターグティング H V Jの作製を試みた（図 1 4)。 デスモグレイン 3タンパク質を認識する単鎖抗体の c DNAは配列番号l 7に示している。 これは、 pCANTAB5-AK7/scFv (慶應大学医 学部皮膚科天谷教授より供与）を銬型に、
Dsg3-scFv-AgeI-f ： 5' -TATGGCGGACTACAAAGATATTGTGTTAAC-3' (配列番号 1 8)お よび Dsg3- scFv-EcoNI- r:5' -AGGAGACTGTGAGAGTG-3 ' (配列番号 1 9) のプライマー対を用いて、 P CRで増幅するこどによって得た。
これを、先述の pCY4B-Fmutの Agel— EcoNI部位に挿入し、 さらに検出を容易に するために C末端に Myc-Tagが付くように DN Aを設計した
(pCAGIpuro-Dsg3- scFv- F)。
(5) 恒常的遺伝子導入細胞 （stable transformant) の作製
5X 106個の L L CMK 2細胞を、 235 μ の Minimum Esential Medium 培地 (GIBC0)に懸濁した。 pCAGIpuro-Dsg3-scFv-F 15 μ gを、 15 /z 1の P B Sに溶解 した。 細胞と DNAを混合し、 Gene Pulser Cuvette (BIO- RAD)内で GENE PULSER II(BI0- RAD)を用いて 250 V、975/zFでエレク ト口ポレーシヨンを行った後、 100 μ Lずつ 10 cmディッシュに分注した。 lOmL MEMに対し 90 μ g puromycin (ナカ ライテスタ）を加え 37°Cで培養し、 プラスミ ド DNAの挿入された細胞を選択し た。 ' ..
選択された細胞を、 抗 M y c抗体で染色したところ、 細胞膜上にキメラ Dsg3-scF-F タンパク質が局在してぃた （図 1 5)。 またウェスタンブロッ トによ つても該キメラタンパク質のサイズの位置にバンドが確認された。
(6) Dsg3- scFv-Fキメラ分子を持つ HVJの産生
次いで、 キメラ Dsg3- scFv-Fタンパク質を持つ HVJの産生を試みた。
15 cmディッシュに stable formant LLCMK2糸田月包力 S confluent状態で、 M0I=0.4 で HVJを感染させた。 MEM (P/S)で 48時間培養後、 上清を回収し遠心 （440 g、 5分間）により細胞を除去しさらに上清を遠心（100000g、 2時間）し、得られた HV Jペレッ トを P B Sで洗浄後、 適当量に懸濁した。
得られたウィルスを抗 Myc- tag抗体によるウェスタンブロット （図 1 6左図 ： Myc)、 および Fタンパク質の膜貫通ドメインを認識する抗体によるウェスタンブ ロッ ト （図 1 6中図 ： TMD) に供したところ、 所定のサイズにバンドが検出され、 キメラタンパク質が確認された。
さらに、 抗 Myc抗体にて染色した該ウィルスを電子顕微鏡により観察した。 100HAUの HV Jを 4 /xLの MilliQに懸濁し、 電顕用グリッドに滴下して乾燥 させた。 3.7%ホルムアルデヒ ドで 4°C、 15分間固定し、 P B Sで 3回洗浄し、 0.5% Triton- Xで 3分間ィンキュベーション後、再び P B Sで 3回洗浄した。 1次抗体； Anti- Myc- tag(MBL)l:100で室温、 1時間インキュベーションした。 P B Sで 3回 洗浄後、 P B Sで 1:100 希釈した Rabbit anti-Mouse IgG-Gold Colloidal Particles- 10 nm (EY KAB0RAT0RIES)で室温、 1時間ィンキュベーションし、 uranium acetate で染色後、 電子顕微鏡により観察した（図 1 6右図）。 ウィルス表面にキ メラタンパク質が染色された黒点が確認された。
(7) E L I S Aによる Dsg3- scFv- F- HVJの Dsg3親和性検討
次に、 デスモグレイン 3を認識する s c F Vを持つ変異 HV Jのデスモグレイ ン 3への結合を E L I S Aで測定した。 E L I SAの方法は、 以下のとおりであ る。
50 μ Lの assay diluent (MESACUP デスモグレインテスト： MBIJに各濃度の H V J ウィルスサンプルが含まれるように調製し、 あらかじめ mDsg3を固相化した 96 wellプレート（慶應大学皮膚科天谷教授より供与）にアプライした。室温で 1時間 インキュベート後 wash buffer (MESACUP デスモグレインテス ト： MBL)で 4回洗浄 し、， 1:10希釈した f 2 3 6で室温 1時間ィンキュベーションした。 Wash buffer で 4回洗浄し、 con jugate diluent (MESACUP デスモグレインテスト： MBL)で 1： 9000 希 釈 し 7こ horseradish peroxidase - con jugate anti-mouse secondary antibodies (Amersham Pharmacia)で室温 1日寺間ィンキュべーションし、 substrate solution (MESACUP デスモグレイ ンテス ト ： MBいで 10 分間反応後、 stop solution (MESACUP デスモグレインテスト： MBいで反応を停止させた。 Mithras LB 940 (BERTH0LD)で 450 nmの吸光度を測定した。
図 1 7に示すように、 キメラ分子を有する HV Jでは野生型 HV Jに比べて、 有意に結合が増強されていた。
(8) 培養細胞への HV J感染実験
該キメラタンパク質を有する HV Jの培養細胞への感染を試験した。 6wellプレートにカバーガラス（IWAKI)をしき、 3 X 105の L L C MK 2、 5X105 の P AM、 または 3X 105の N I H 3 T 3を播種した。 翌日、 終濃度 4 μ g/mL Trypsinで 37°C、 30分間処理したウィルスサンプル（細胞由来野生型 H V J及び キメラ HV J)を M0I=0.6となるように Opt i- MEMで希釈し、 各細胞にアプライ後 5分間感染させた。 PB Sで 2回洗浄後、 D-MEM及び MEMで 24時間培養後、 f 236にて免疫染色した。
図 1.8にその結果を示す。 試験した 3種の細胞中、 マウスケラチノサイ ト由来 の PAM細胞のみで、 キメラ Fタンパク質が野生型に比べて多く発現していた。 (9) 器官培養のキメラ HV Jの感染実験
さらに、 マウスの表皮組織への感染を試験した。 この試験には、 表皮組織の分 離が容易であることから、 7 型コラーゲンノックアウトマウスを用いた。 このマ ウスは、 腹部皮膚に水泡があるため、 表皮と真皮が分離しやすい。
出生直後の 7.型コラーゲンノックアウ トマウスの水疱部分皮膚を切除し、 D- MEMで満たした 10 cmディッシュ上で器官培養した。 Trypsin処理したウィル スサンプル（ （8) 参照）を 5X 105 particles/100 ； u L Opti-MEM となるように調 製し、 水疱内に注入。 37°C、 5 分間感染後、 表皮と真皮を剥がし PB Sで洗浄し D— MEMで培養した。 24時間後に P B Sで洗浄し、 4%パラホルムアルデヒ ドで 固定した後ウィルスのゲノム由来 Fタンパク質を f 236で免疫染色した。
その結果、 図 1 9に示すように、 キメラ HV Jの方が、 野生型 HV Jより有意 に表皮細胞に検出された。 さらに、 組織切片を同様に染色したところ、 該キメラ タンパク質の発現は、 表皮規定細胞に限定的に局在していることがわかった （図 20)。 実施例 3
( 1) ウィルス粒子表面にトランスフェリンが提示され、且つ HNタンパク質の発 現が低減した HV Jの作製
図 2 1に示すように、 HVJの Fタンパク質をコードする遺伝子を改変し、 発現 プラスミ ド pCY4Bに挿入した。 Fタンパク質の膜貫通ドメイン （TMD) の N末端側 にヒ ト トランスフェリンが連結された該 TMDとピト トランスフェリンとの融合タ ンパク質を発現するように組換え pCY4Bを構築した。 ヒ ト トランスフェリンの c D N Aを配列番号 2 2に示す。 この際、 その後の解析に便利なように mycタグが 融合タンパク質の N末端につくように挿入部位を設計した。 ここで挿入した融合 タンパク質の配列を、 配列番号 2 5に示す。
配列番号 2 5で示されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 1〜2 9は、 HVJ 由来 Fタンパク質のシグナル配列に、 アミノ酸番号 3 0〜 3 9は、 mycタグに、 アミノ酸番号 4 0〜7 1 8は、 七 ト トランスフェリンのアミノ酸配列に、 アミノ 酸番号 7 1 9〜 7 9 7は、 HVJ由来 Fタンパク質の膜貫通ドメインのァミノ酸配 列に、 それぞれ相当する。
この mycタグつき Fタンパク質 TMDおよびヒ ト トランスフェリン融合タンパク 質 （F/Tf) 発現 pCY4Bを LLCMK2細胞に導入して、 F/Tf タンパク質を恒常的に産 生する恒常的形質転換細胞を単離した。
該形質転換細胞に野生型 HVJを感染させて複製させることにより、 該細胞から 産生されて細胞外に放出される HVJウィルス粒子は、 その表面にはネィティプな Fタンパク質の他に F/Tf を有しており （F/Tf キメラウィルス）、 トランスフェリ ン部分が粒子外に提示されることとなる （図 2 2 )。
さらに、 該細胞の産生する HVJウィルスの HNタンパク質を欠損させるために、 実施例 1に示した方法と同様に HN遺伝子の発現を s iRNA法により抑制した。 このようにして、 産生させたウィルスは、 ウィルス粒子表面にトランスフェリ ンが提示され、さらに HNタンパク質の発現が顕著に低減もしくは完全に欠失する こととなる。
実際に、 該細胞から産生されたウィルスを培地から回収し、 常法にしたがって 抗 HN抗体によるウェスタンブロッ トに供したところ、 siRNA処理をした細胞か,ら 回収したウィルスでは HNタンパク質は検出されず、 HNタンパク質が欠損してい た （図 2 3、 上のパネル）。 さらに、常法に従って抗 myc抗体でのウェスタンブロッ 卜に供したところ、 F/Tf 発現 pCY4Bで形質転換した LLCMK2細胞で産生された HVJ ウィルスは、期待した通 り、 抗 myc抗体陽性のタンパク質を発現しているのに対し、 ネガティブコント口 ールである野生型 LLCMK2細胞で産生させた HVJウイルスでは抗 myc抗体陽性のタ ンパク質は検出されなかった （図 2 3、 下のパネル）。
この結果から、 F/Tf 発現 pCY4Bで形質転換した LLCMK2細胞で産生された HVJ ウィルスは F/Tf タンパク質を有していることが示された。
( 2 ) 培養細胞への H V J感染実験
続いて、 （1 ) で産生されたウィルスの感染能力を調べた。
HNタンパク質が欠損した HVJ (HN欠損 HVJ)および HNタンパク質が欠損した上 に F/Tf を有する HVJ (F/Tf -HN欠損 HVJ) をそれぞれ、 非癌細胞である HEK293 細胞に 0. 05M0Iまたは 0. 4M0Iで感染させ、 Fタンパク質の発現を抗 Fタンパク質 抗体で検出した。 その結果、 いずれの HVJを感染させた場合でも、 Fタンパク質 ポジティブの細胞は非常に少数の細胞でしか観察されなかった （図 2 4 )。
一方、 ヒ ト子宫類部癌由来 Hela細胞に同様に感染させたところ（図 2 5 )、 F/Tf 一 HN欠損 HVJを感染させた細胞 （下のパネル） では、 HNタンパク質が欠損しただ けで F/Tf を有していない HN欠損 HVJ (上のパネル） に比べて、 細胞表面に Fタ ンパク質を有する細胞が顕著に多かった。 この Fタンパク質陽性細胞をカウント してグラフに示す （図 2 6 )。
これらの結果から、 HNタンパク質が欠損されて F/Tf を有する F/Tf— HN欠損 HVJ ウィルスは、 癌細胞に特異的に感染することがわかった。
( 3 ) トランスフェリン依存性の確認
F/Tf - HN欠損 HVJゥィルスの癌細胞への感染力の強さが、 F/Tf タンパク質が含 有する トランスフェリン部分に依存していることを証明するために、 トランスフ ヱリン （200 / g/ml) 存在下で、 Tf一 HN欠損 HVJを 0. 05M0Iで Hela細胞に感染さ せた。 その結果、 Tf存在下では、 Tf 非存在下に比べて、 Fタンパク質陽性細胞が 明らかに減少しており （図 2 7下のパネル、 および図 2 8 )、 トランスフェリンの 存在により F/Tf— HN欠損 HVJの感染が阻害されたことが示された。
この結果から、 F/Tf— HN欠損 HVJの癌細胞への感染力が、 F/Tf タンパク質のト ランスフェリンに依存していることが示された。
( 4 ) Qdot (登録商標） 蛍光粒子を用いた in vivo癌特異的送達試験
F/Tf— HN欠損 HVJのゲノムを失活させた F/Tf— HN欠損 HVJエンベロープによ る in vivoにおける癌細胞特異的なターグティングを試験した。 F/Tf— HN欠損 HVJ を、 UV照射によりゲノムを失活させて F/Tf— HN欠損 HVJエンベロープを作製し た。これを 1000 HAU/200 /z 1 - PBSに懸濁し、 Qdot (登録商標） 605ITK (商標） Carboxyl Quantum Dot を最終濃度 Ι μ Μ になるように添加してエレク トロポレーション (250V、 950 ^ F) に供し、 Qdot (登録商標） 蛍光粒子をエンベロープ中に封入し た。 エレク トロポレーシヨン後すぐに、 DMEM lmlを添加し、 軽く遠心し、 凝集粒 子を除去した後、 20400 X gで 15分高速遠心して、 そのペレッ トを回収し、 5 0 0 μ 1 の生理的食塩水に懸濁した。 得られた Qdot封入 HVJエンベロープを Hela 細胞培養液中に添加した。 これを蛍光検出したところ、細胞膜上に Qdotによる蛍 光が認められ（データ示さず）、細胞表面に HVJ-Eが吸着していることが示された。 この Qdot封入 F/Tf _ HN欠損 HVJ -エンベロープを用いて、 in vivoにおける F/Tf 一 HN欠損 HVJ-エンベロープの癌特異的なターゲティングを調べた。
ヌードマウスに Hela細胞 （5 X 106) を皮下注射により移植し、 癌組織が直径 7 〜8画にまでなつたら、 Qdot封入 F/Tf— HN欠損 HVJ-エンベロープ 500HAUを尾静 脈に注射した。 48時間後、 マウスをパラホルムアルデヒ ドで固定し、 Qdotの分布 を精査した。 Qdot封入 F/Tf— HN欠損 HVJ-エンベロープを注射したマウスの移植 癌組織にのみ Qdotによる蛍光が認められ、 F/Tf タンパク質を有していない Qdot 封入 HN欠損 HVJ-エンベロープを注射した場合では癌組織に蛍光は認められなか つた。癌組織を蛍光顕微鏡にて観察し、一つの視野内の Qdot陽性細胞を数えた結 果を図 2 9に示す。 HVJ-Eを用いず、 Qdotのみを注射した場合 （Q only) および F/Tf タンパク質を有していない Qdot封入 HN欠損 HVJ-エンベロープを用いた場合 (Wl〜3)に比べて、 F/Tf— HN欠損 HVJ-エンベロープを用いた場合は約 30倍以上の Qdot陽性細胞が認められた。
この結果から、 F/Tf— HN欠損 HVJ-エンベロープが癌に特異的にターグティング されることが示唆された。 産業上の利用可能性
本発明の改変パラミクソウィルスは、 受容体結合タンパグ質の量が低減してお り、 ¾容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響などを軽減することが できるので、 安全性の高いベクターとして利用可能である。 また、 該改変パラミ クソウィルスに、 標的細胞表面に発現しているマー^ータンパク質に特異的に結 合するポリペプチド等の標的分子を付加すれば、 特異性および安全性の高いベタ ターとして利用可能である。 さらに、 本発明の改変パラミクソウィルスの作製方 法は、 簡便かつ安定して改変パラミクソウィルスを得ることができる。 また該方 法を応用することにより、 特定のウィルス機能をノックアウトした変異ウィルス を簡便に得ること できる。
また、 本発明のキメラタンパク質もしくはタンパク質コンジュゲートを有する パラミクソウィルスは、 組織 ·細胞特異性が高く、 薬剤を部位特異的に送達しう るベクターとして有用である。 また、 他の融合タンパク質を欠損させることによ り、 さらに特異性の高いウィルスベクターとすることも可能であり、 疾病治療へ の応用が期待される。 また、 本発明のターゲティングパラミクソウィルスの作製 方法によれば、 簡便かつ安定して該ターグティングパラミクソウィルスを得る とができる。 本出願はョ本で出願された特願 2 0 0 5 _ 3 3 8 4 4 9 (出願日 ： 2 0 0 5年 1 1月 2 4ョ） 及び特願 2 0 0 5— 3 3 9 4 7 4 (出願日 ： 2 0 0 5年 1 1月 2 4日） を基礎としており、 その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
1. 野生型に比べて、 含有する受容体結合タンパク質の量が低減していることを 特徴とする、 改変パラミクソウィルス。
2. 受容体結合タンパク質が HNタンパク質であり、 パラミクソウィルスが HV Jである、 請求項 1記載のウィルス。
3： パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含む、 請求項 1または 2記載のウィルス。
4. 請求項 1または 2記載のウィルスから調製される、 ウィルスエンベロープべ クタ一。 .
5. 改変パラミクソウィルスを作製する方法であって、 以下のステップ：
(1) パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を動物 細胞に導入するステップ、
(2) パラミクソウィルスを該細胞に感染させるステップ、 および
(3) 該細胞で複製されるパラミクソウィルス粒子を単離するステップ、 を含む、 上記方法。
6. パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が、 該タ ンパク質をコードする mRN Aに対する s i RNAである、請求項 5記載の方法。
7. パラミクソウィルスが HV Jである、 請求項 5記載の方法。
8. 受容体結合タンパク質が HNタンパク質である、 請求項 7記載の方法。
9. HV Jの HNタンパク質の発現を抑制する核酸が、 配列番号 3、 4および 5 に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなる、 HV Jの HN mRNAに対する s i RNAである、 請求項 8に記載の方法。
10. 請求項 5記載の方法により得られた、 改変 HV
1 1. パラミクソウィルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含む 動物細胞。
1 2. パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が、 配 列番号 3、 4および 5に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列か らなる、 HV Jの HNmRN Aに対する s i RNAである、 請求項 1 1記載の動 物細胞。
1 3. 配列番号 3、 4および 5に示すヌクレオチド配列からなる群より選択され る配列からなる、 H V Jの HNmR N Aに対する s i RNA。
14. パラミクソウィルス由来の Fタンパク質の膜貫通ドメィンの N末端側に、 所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが、 直接またはペプチドリン カーを介して連結されている、 キメラタンパク質。
1 5. Fタンパク質由来のシグナルペプチド、 および哺乳動物細胞で機能し得る シグナルぺプチドからなる群より選択されるシグナルぺプチドが N末端側に、 直 接またはリンカ一ペプチドを介して、 さらに付加されたものである、 請求項 1 4 記載のキメラタンパク質。
1 6. Fタンパク質由来のシグナルぺプチドを含む請求項 1 5記載のキメラタン パク質であって、 該シグナルペプチドが、 以下の （ 1) 〜 （4) のいずれかのァ ミノ酸配列からなる、 キメラタンパク質。
(1) 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜25で示される ァミノ酸配列
(2) 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜 25で示される アミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ酸の置換および Zまたは欠失およ び/または挿入および または付加を含み、 かつ、 シグナルペプチドとしての機 能を有するアミノ酸配列
(3) 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜29で示される ァミノ酸配列
(4) 配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜29で示される 了ミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ酸の置換およひ ' または欠失およ び/または挿入および または付加を含み、 かつ、 シグナルペプチドとしての機 能を有するアミノ酸配列
1 7. パラミクソウィルスが HV Jである請求項 1 4記載のキメラタンパク質。
1 8. HV J由来 Fタンパク質の膜貫通ドメインが、 以下の （1) 〜 （4) のい ずれかのアミノ酸配列からなる、 請求項 1 7記載のキメラタンパク質。
( 1 ) 配列番号 1 1に示すァミノ酸配列のァミノ酸番号 490〜 56 5で示され るァミノ酸配列
(2) 配列番号 1 1に示すァミノ酸配列のァミノ酸番号 4 90〜 56 5で示され るアミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ酸の置換および/または欠失お よび Zまたは挿入およびノまたは付加を含み、 かつ、 膜貫通ドメインとしての機 能を有するアミノ酸配列
(3) 配列番号 1 1に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 48 7〜56 5で示され るァミノ酸配列
(4) 配列番号 1 1に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 48 7〜 565で示され るアミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ酸の置換および/または欠失お よび または挿入および/または付加を含み、 かつ、 膜貫通ドメインとしての機 能を有するアミノ酸配列
1 9. 細胞表面分子に特異的に結合するペプチドが該分子に対する単鎖抗体であ る、 請求項 14記載のキメラタンパク質。
20. 単鎖抗体がデスモグレイン 3に対する抗体である、 請求項 1 9記載のキメ ラタンパク質。
2 1. 以下の （ 1) または （2) の、 請求項 20記載のキメラタンパク質。 (1) 配列番号 ·2 1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(2) 配列番号 2 1に示すアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸の 置換および Ζまたは欠失および または挿入およびノまたは付加を含み、 かつ、 シグナルぺプチド部分がプロセシングにより切断されてウィルス粒子に取り込ま れた場合、 その粒子表面に存在してデスモグレイン 3に結合することができる、 タンパク質
22. 細胞表面分子に特異的に結合するペプチドがトランスフユリンである、 請 求項 14記載のキメラタンパク質。
23. 以下の （ 1) または （2) のアミノ酸配列を含む、 請求項 22記載のキメ ラタンパク質。
( 1) 配列番号 25に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号 40〜7 97で示される ァミノ酸配列 (2) 配列番号 25に^すアミノ酸配列中アミノ酸番号 40〜797で示される ァミノ酸配列において 1もしぐは複数のァミノ酸の置換および/または欠失およ び /または揷入およびノまたは付加を含み、 かつ、 ウィルス粒子に取り込まれた 場合、 その粒子表面に存在して細胞膜上に発現されてトランスフェリン受容体と 結合する機能を有するアミノ酸配列
24.請求項 1 4〜2 3のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする核酸。
25. 以下の （ 1) または （2) の塩基配列からなる、 請求項 24記載の核酸。 (1) 配列番号 20に示す塩基配列
(2) 配列番号 20に示す塩基配列の相補鎖配列とハイス トリンジェン卜な条件 下でハイブリダィズすることができ、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有し、 デスモグレイン 3に結合することができるタンパク質をコードする塩基配列 26. 請求項 24記載の核酸を発現可能な形態で含み、 該核酸がコードするキメ ラタンパク質中の所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るぺプチドを細胞表面 に発現し得る動物細胞。
27. 請求項 1 4記載のキメラタンパク質中の所望の細胞表面分子に特異的に結 合し得るペプチドをウィルス粒子表面に提示する改変パラミクソウィルス。
28. HV Jである、 請求項 2 7記載の改変パラミクソウィルス。
29. 野生型に比べて HNタンパク質が低減または欠損されていることをさらな る特徴とする、 請求項 28記載の改変パラミクソウィルス。
30. 請求項 2 7〜2 9のいずれか記載のウィルスから調製される、 ウィルスェ ンべ口一プべクタ一
3 1. 組織ターグティングパラミクソウィルスを作製する方法であって、 以下の (1) 〜 （3) のステヅプを含む方法。 - (1) パラミクソウィルス由来の Fタンパク質の膜貫通ドメインの N末端側に、 0〜30残基からなるリンカーべプチド、 さらにその N末端に所望の細胞表面分 子に特異的に結合し得るぺプチドが連結されている、 キメラタンパク質をコード する核酸を、 所定の動物細胞の細胞膜上に該キメラタンパク質を発現させ得る形 態で該細胞に導入すること
(2) パラミクソウィルスを該細胞に感染させること
(3) 該細胞で複製されるパラミクソウィルス粒子を単離すること
32. 核酸が動物細胞で機能し得るプロモータ一の制御下に置かれ、 且つ該細胞 で機能し得るシグナルぺプチドをコードする核酸が付加された形態である、 請求 項 3 1記載の方法。
33. ウィルスが HV Jである請求項 3 1記載の方法。
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