CN112759654A

CN112759654A - 一种病毒囊膜蛋白装配系统及其方法和应用

Info

Publication number: CN112759654A
Application number: CN201911075506.8A
Authority: CN
Inventors: 董春升; 刘牧龙
Original assignee: Shenzhen Pufico Life Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Pufico Life Technology Co ltd
Priority date: 2019-11-06
Filing date: 2019-11-06
Publication date: 2021-05-07

Abstract

本申请提供了一种病毒囊膜蛋白装配系统，其制备方法及应用。所述囊膜蛋白装配系统包含依次连接的分泌肽信号序列，外源装配目的蛋白分子和跨膜区(TM)。其方法为利用基因合成技术，将含有分泌肽信号序列、外源装配目的蛋白分子、跨膜区的多组件整合到基因表达载体中，转染细胞，然后以病毒感染细胞。本申请的方案可用于溶瘤病毒或病毒疫苗候选载体的改造，所述囊膜蛋白装配系统能够在病毒表面进行正确组装。病毒囊膜装配外源装配目的蛋白分子后，重组病毒的施用途径和应用得到更多拓展。且该方法无需对病毒基因进行复杂的内部编辑改造，制备方法简单，应用范围广。

Description

一种病毒囊膜蛋白装配系统及其方法和应用

技术领域

本申请属于病毒学，分子生物学领域，涉及基因重组及囊膜病毒蛋白装配系统，及其制备方法和应用。

背景技术

病毒是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸(DNA或RNA)，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。病毒的蛋白质外壳称为衣壳，遗传物质多为RNA或DNA。在病毒的衣壳外面，有时还有脂双分子层，脂双分子层是病毒从宿主细胞释放所获得。因此病毒可以根据囊膜的有无，分为两类：囊膜病毒(Envelope virus)和非囊膜病毒(Non-envelope virus)。

常见的囊膜病毒有人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、埃博拉病毒(EBOV)等，在这些病毒的衣壳外面都包裹有脂双分子层囊膜，在囊膜上嵌有病毒囊膜蛋白。在病毒感染早期，囊膜蛋白主要负责病毒与感染细胞受体的结合与进入。例如，HIV的囊膜蛋白是GP120和GP41。在HIV感染CD4+T细胞过程中，GP120和细胞受体CD4，辅助受体CCR5或者CXCR4结合，进一步GP41以三聚体的形式促进病毒囊膜和感染细胞膜的融合，从而把病毒衣壳粒子释放到感染细胞的细胞中，病毒颗粒脱衣壳，继而发生逆转录。因此病毒囊膜蛋白对于囊膜病毒感染细胞的特异性和感染效率起了决定性的作用。

病毒载体在基因治疗、疫苗发展中扮演了一个重要角色。例如：以VSV病毒为骨架，EBOV囊膜蛋白的重组VSV-delG-EBOV疫苗，已经在非洲人体通过一期临床实验；以疱疹病毒HSV为骨架，重组人M-CSF细胞因子的病毒T-Vec在2015年获得美国FDA批准，治疗恶性黑色素瘤；不久前诺华制药重组腺相关病毒AAV获得FDA批准，用于重症肌无力的基因治疗。

VSV属于弹状病毒科，为单负链RNA病毒，能感染多种动物和昆虫。VSV病毒内部为紧密盘旋的螺旋对称的核衣壳，VSV基因组为不分节段的线性单股负链RNA，长约11kb。从3’→5’端依次排列着N、NS(P)、M、G、L等5个不重叠的基因，分别编码核(N)蛋白、磷酸(P)蛋白、基质(M)蛋白、糖(G)蛋白、及RNA聚合酶(L)蛋白等5种不同的主要蛋白。VSV因为1)其安全性高，自然感染宿主是马、牛(羊)、猪，而人群中自然状态下几乎不存在水泡型口炎病毒主动感染，对人的感染不会引起很明显的病症；2)细胞培养，病毒复制产量高。

发明内容

本申请的目的在于提供一种在病毒囊膜组装外源蛋白分子的病毒囊膜蛋白装配系统和方法。

本申请的目的在于提供一种独立于病毒基因拯救系统外的，独立的病毒囊膜蛋白装配系统和方法。

本申请的另一个目的在于提供一种可以有效稳定地锚定在病毒囊膜位置的病毒囊膜蛋白装配系统和方法。

为了更好的利用病毒骨架做为载体递送系统，本申请设计了一种在病毒囊膜组装外源目的蛋白分子的系统和方法，通过建立了绿色荧光蛋白(GFP)外源报告基因(模拟系统)来展示重构囊膜的新病毒的改造是否成功，为后续重组病毒在靶向性感染细胞尤其是靶向肿瘤治疗方面的应用，提供了坚实的理论和应用基础，基于此技术可以有效引导病毒靶向目的组织或器官，增强治疗效果的同时，降低全身性给药时的毒副作用。需要说明的是，GFP为本领域公知的模式蛋白，GFP仅做为外源目的蛋白分子的一个模板，不作为本申请的限制。

本申请的上述目的通过以下技术手段实现：

一方面，本申请提供了一种病毒囊膜蛋白装配系统，所述系统至少含有直接或间接连接的分泌肽信号序列和跨膜区。

在一些实施方案中，所述分泌肽信号序列与跨膜区还含有外源装配目的蛋白分子。所述的外源装配目的蛋白分子用于靶向性地与疾病相关的抗原结合，用于诊断或者靶向性治疗疾病。

在一些实施方案中，所述的系统还包含蛋白标签。所述的蛋白标签用于检测囊膜蛋白装配系统是否成功表达或者成功组装到病毒，或者，所述蛋白标签用于检测被装配后的病毒是否靶向到目标组织。用于蛋白标记的蛋白标签在现有技术中是已知的。

在一些实施方案中，所述蛋白标签位于外源装配目的蛋白分子的N端或C端。

在一些实施方案中，所述跨膜区后还连接有胞质区。

在一些实施方案中，所述病毒囊膜蛋白装配系统含有依次连接的IgG k轻链前导序列，蛋白标签，囊膜蛋白跨膜区，以及囊膜蛋白胞质区。

在一些实施方案中，所述病毒囊膜蛋白装配系统含有依次连接的IgG k轻链前导序列，Flag蛋白标签，绿色荧光蛋白GFP，囊膜蛋白跨膜区，以及囊膜蛋白胞质区。

在一些实施方案中，所述病毒囊膜蛋白装配系统含有依次连接的IgG k轻链前导序列，HA蛋白标签，Flag蛋白标签，绿色荧光蛋白GFP，囊膜蛋白跨膜区，以及囊膜蛋白胞质区。

在一些实施方案中，所述病毒囊膜蛋白装配系统含有依次连接的IgG k轻链前导序列，VAR2CSA或其截断型分子VAR，以及囊膜蛋白跨膜区。其中，VAR2CSA是从疟原虫体内分离出的一种吸附蛋白质。在一些实施方案中，所述病毒囊膜蛋白装配系统含有依次连接的IgG k轻链前导序列，VAR2CSA或其截断型分子VAR，囊膜蛋白跨膜区，以及囊膜蛋白胞质区。

在一些实施方案中，所述病毒囊膜蛋白装配系统含有依次连接的IgG k轻链前导序列，Flag蛋白标签，VAR2CSA或其截断型分子VAR，囊膜蛋白跨膜区，以及囊膜蛋白胞质区。

在一些实施方案中，所述病毒囊膜蛋白装配系统中，被装配的病毒选自囊膜病毒。

另一方面，本申请还提供了一种氨基酸序列，所述氨基酸序列编码所述病毒囊膜蛋白装配系统。

在一些实施方案中，所述病毒囊膜蛋白装配系统含有SEQ ID NO:1或3所示的氨基酸序列，

另一方面，本申请提供了一种核酸序列，所述核酸序列编码上述病毒囊膜蛋白装配系统。

在一些实施方案中，所述核酸序列含有SEQ ID NO:2或4所示的序列。

另一方面，本申请还提供了一种载体，所述载体含有上述核酸序列。

在一些实施方案中，所述载体选自质粒和/或病毒骨架载体。

在一些实施方案中，所述载体选自pcDNA3.1质粒。

另一方面，本申请还提供了一种细胞，所述细胞含有上述载体。

在一些实施方案中，所述细胞选自真核细胞。

另一方面，本申请还提供了一种病毒，所述病毒包含上述病毒囊膜蛋白装配系统。

另一方面，本申请还提供了一种病毒囊膜蛋白装配的方法，所述方法包含以下步骤：

将同时编码分泌肽信号序列和跨膜区的核酸序列克隆到载体上；然后用载体转染细胞；接下来病毒感染转染后的细胞。

在一些实施方案中，所述核酸序列同时依次编码分泌肽信号、外源装配目的蛋白分子和跨膜区。

在一些实施方案中，所述核酸序列同时依次编码分泌肽信号、外源装配目的蛋白分子、跨膜区和胞质区。

在一些实施方案中，所述核酸序列还编码蛋白标签。

在一些实施方案中，所述核酸序列具有SEQ ID NO:2或4所示序列。

在一些具体的实施方案中，所述方法包含以下步骤：

1)将编码含有IgG k轻链前导序列、HA蛋白标签、Flag蛋白标签、绿色荧光蛋白GFP或VAR2CSA的截短型分子VAR、VSV G蛋白跨膜区和VSV G蛋白胞质区的核苷酸序列克隆到质粒载体上，筛选含有阳性基因的质粒载体；

2)将所述的阳性质粒载体瞬时转染细胞；

3)细胞转染后，在转染后的细胞中加入待装配的病毒，病毒感染后，分离纯化装配后的病毒。

在一些具体的实施方案中，所述方法包含以下步骤：

2)将所述的阳性质粒载体瞬时转染细胞；

3)12-48小时后，在转染后的细胞中加入待装配的病毒，12-48h小时候后，分离纯化装配后的病毒。

在一些具体的实施方案中，所述方法包含以下步骤：

1)将编码含有IgG k轻链前导序列、HA蛋白标签、Flag蛋白标签、绿色荧光蛋白GFP或VAR2CSA的截短型分子VAR、VSV G蛋白跨膜区和胞质区(TM+TC)的多核苷酸序列克隆到质粒载体上，筛选含有阳性基因的质粒的克隆pcDNA3.1-MGFP载体；

2)将所述的阳性质粒pcDNA3.1-MGFP瞬时转染293T细胞；

3)24小时后细胞中加入不带标签的野生型VSV病毒，感染24h，收集细胞上清液；

4)将所述的上清液梯度稀释在预先准备的Vero细胞(噬斑纯化计数)中，24小时后对重构的VSV-MGFP进行分离纯化计数。

另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有上述病毒。

在一些实施方案中，所述药物组合物还含有药物上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述药物组合物的制剂形式包含注射剂、冻干制剂、喷雾制剂、液体制剂、膏剂和片剂中的一种或多种。

另一方面，本申请还提供了所述病毒囊膜蛋白装配系统，或所述氨基酸序列，或所述核酸序列，或所述载体，或所述细胞，在病毒囊膜装配中的应用。

另一方面，本申请还提供了所述病毒囊膜蛋白装配系统，或所述氨基酸序列，或所述核酸序列，或所述载体，或所述细胞，或所述病毒，在制备治疗疾病的药物中的应用。

另一方面，本申请还提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包含对受试者施用所述的病毒。

在一些具体实施方案中，本申请还提供了一种治疗肿瘤的方法，所述方法包含对受试者施用所述的病毒。

在一些实施方案中，所述治疗肿瘤的方法还包括第二肿瘤疗法。

在一些实施方案中，所述第二抗肿瘤疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法中的一种或多种。

申请人利用基因测序技术、免疫印迹(Western Blot)、荧光显微镜拍摄技术对囊膜蛋白装配系统的表达进行了基因和蛋白水平的验证，同时用免疫胶体金技术对囊膜蛋白装配系统表面展示进行了电镜观察和分析，多种途径确证构建的蛋白分子能够在病毒囊膜表面能够进行正确组装。

在一个技术方案中，本申请的囊膜装配系统可以有效稳定地锚定在病毒囊膜位置，且维持了病毒的本身形状和特性。

在另一个技术方案中，本申请的技术方案可以任意展示各种蛋白，而非仅仅局限于具有外源囊膜蛋白特性的蛋白。

在另一个技术方案中，本申请的技术方案无需对病毒的基因组进行改造，操作简便。

在另一个技术方案中，本申请的技术方案是独立于病毒拯救体系之外的独立系统，不受限于囊膜病毒的种类，无论囊膜病毒的遗传物质是单链、双链或环状的DNA，或者RNA均可以采用本申请的技术方案，应用范围广。

在另一个技术方案中，本申请的技术方案在病毒的囊膜上额外多了一个其他的蛋白分子，并不是对病毒的蛋白进行缺失，所以不会影响病毒本身的复制和感染。

附图说明

图1是组装分子mGFP(Membrane Green Fluorescence Protein)元件示意图；

图2是组装分子mGFP核酸序列；

图3是组装分子mGFP蛋白序列；

图4是组装分子mGFP在293T细胞中表达图；

图5是组装分子mGFP在VSV-mGFP病毒表达图；

图6是野生型VSV和VSV-mGFP的免疫电镜照片；

图7是疱疹病毒HSV膜型Igκ-mGFP或者膜型分子Igκ-VAR的组装；

图8是囊膜装配VAR分子的病毒在不同肿瘤中的靶向性检测统计图；

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本申请的技术方案，具体实施例不代表对本申请保护范围的限制。其他人根据本申请理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本申请的保护范围。

本申请中，提供了一个全新的病毒囊膜蛋白装配系统和方法，可以使得外源装配目的蛋白分子能够有效的装配进入病毒囊膜。实施例中，采用绿色荧光蛋白做为外源装配目的蛋白分子，只是做为一个模式系统，并不是对外源装配目的蛋白分子的限制。

本申请中，所述外源装配目的蛋白分子包含与疾病相关的靶点拮抗剂、激动剂、共抑制分子中的一种或多种，用于有效引导病毒靶向目的组织或器官，增强治疗效果的同时，降低全身性给药时的毒副作用。

在一些实施方案中，所述外源装配目的蛋白分子选自肿瘤抗原和/或免疫疾病抗原相关的拮抗剂。

在一些方案中，所述肿瘤抗原包含包括但不限于表皮生长因子受体家族(EGFR)，包括HER1、HER2、HER4和HER8、STEAP(前列腺的六次跨膜上皮抗原.)、CD55、CD19、CD20、CD22、RORl、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR和CEA及其他现有技术中的肿瘤抗原。

在一些实施方案中，所述拮抗剂选自抗体或抗体片段、肽及肽模拟物中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述抗体可能是单克隆抗体，多克隆抗体，多价抗体，多特异性抗体(例如：双特异性抗体)，和/或抗体片段。该抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或人型抗体。抗体片段可以是，例如，Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，Fd，单链Fv(scFv)，具二硫键的FV(sdFv)，或VL、VH结构域。抗体可能是一个共轭的形式，例如，结合一个标签、一个可检测标记，或一种细胞毒性剂。抗体可能是同型IgG(例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgM、IgE或IgD。

本申请中，所述分泌肽信号序列包括但不限于真核生物血液和胞外基质中的细胞因子、补体、降解酶类、肽类激素和免疫球蛋白中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述分泌肽信号序列包含长度为5-30个氨基酸的肽链。

在一些实施方案中，所述分泌肽信号序列选自IgG k轻链前导序列。

本申请中，所述跨膜区选自具备粘附特性的糖蛋白的跨膜区。

在一些实施方案中，所述具备粘附特性的糖蛋白包括但不限于钙粘素、选择素、免疫球蛋白超家族的CAM和整合素中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述跨膜区选自囊膜蛋白跨膜区。

本申请中，所述胞质区可选自整合性膜蛋白的胞质区，包括但不局限为白细胞分化抗原、黏附分子、病毒囊膜蛋白等的胞质区。

在一些实施方案中，所述胞质区选自囊膜蛋白胞质区。

本申请中，所述蛋白标签仅用于辅助检测外源装配目的蛋白分子是否成功装配到细胞膜或者囊膜病毒表面。现实应用时，所述囊膜蛋白装配系统可以含有也可以不含有蛋白标签。

在一些实施方案中，所述蛋白标签包括但不限于荧光蛋白、HA蛋白标签、Flag蛋白标签、Myc蛋白标签、His蛋白标签中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述蛋白标签包括但不限于藻红蛋白、藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白GFP中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述囊膜蛋白装配系统或者方法中，被装配病毒选自囊膜病毒，包括野生型和/或突变型。

在一些实施方案中，所述囊膜病毒包括但不限于艾滋病毒、新城疫病毒、SARS冠状病毒、弹状病毒、单纯疱疹病毒、埃博拉病毒(EBOV)、流感病毒属如人类甲(A)、乙(B)、丙型(C)流感病毒，和肝病毒属如乙型肝炎病毒(HBV)中的任意一种或多种。

所述囊膜病毒的遗传物质可以是DNA或RNA；经实验证实，囊膜病毒的遗传物质的种类不影响本申请的技术方案实现。

在一些实施方式中，所述囊膜病毒选自单纯疱疹病毒HSV和/或水泡性口炎病毒VSV。

在一些实施方案中，所述囊膜病毒选自所述水泡性口炎VSV病毒选自印第安纳株Indiana strain。

本申请的病毒囊膜蛋白装配系统和方法中，所述跨膜区和胞质区可来源于病毒的囊膜，也可以来源于非病毒囊膜。

当所述跨膜区和胞质区可来源于病毒的囊膜(此时可称为囊膜蛋白跨膜区、囊膜蛋白胞质区)，囊膜蛋白跨膜区、囊膜蛋白胞质区所对应或者是来源的病毒(野生型或突变型)与被装配的病毒(野生型或突变型)，可以是同种病毒，或者异种病毒。也即，我们要在某个病毒的囊膜上加入一个外源装配目的蛋白分子，和这个外源装配目的蛋白分子相连的不一定是这个病毒囊膜蛋白的跨膜区和胞质区的序列)。如本申请的实施例中，在病毒囊膜蛋白装配系统中，跨膜区和胞质区来源于单纯疱疹病毒VSV，可用于装配水泡性口炎病毒VSV，也可以用于装配到HSV。

本申请中，所述分泌肽信号序列如IgG k轻链前导序列，跨膜区如囊膜蛋白跨膜区，胞质区如囊膜蛋白胞质区、蛋白标签、外源装配目的蛋白分子如抗体或绿色荧光蛋白等囊膜蛋白装配系统中的组件可以选自现有技术中序列，包括天然序列、突变序列、人工序列等等。

在一些实施方案中，所述病毒囊膜蛋白装配系统的氨基酸序列与SEQ ID NO:1或3所示序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。

本领域公知，组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：；2、极性不带电荷的氨基酸；3、带正电荷的氨基酸；4、带负电荷的氨基酸。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白质的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr和Phe、Ala和pro、Lys和Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白质的立体结构和功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述囊膜蛋白的任意一个氨基酸残基位置上。

在一些实施方案中，编码所述病毒囊膜蛋白装配系统的核酸序列与SEQ ID NO:2或4所示的序列具有至少50％，55％，60％，65％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白质的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本申请公开的氨基酸序列，或者其他现有技术中的序列，完全可以推导出能够编码它们的核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本申请范围内。同道理，利用本文公开的核酸序列，也可以通过本领域公知的方法，通过修改本申请提供的核苷酸序列，得到与本申请所述囊膜蛋白装配系统功能一致的氨基酸序列。

本申请中，所述细胞可以是各种本申请病毒的能够感染的宿主细胞。

在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。

在一些实施方案中，所述细胞包括但不限于例如非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、原代兔肾细胞、鸡胚细胞、羊膜细胞、人宫颈癌细胞(Hela细胞)以及人胚肺二倍体成纤维细胞(WI-38细胞)、人肾上皮细胞293及多种衍生株，如293T。

在本申请中，“药学上可接受的载体”是指是指当对受试者如人施用时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类用于药物活性物质的介质和试剂的使用在本领域内是熟知的。除了在任何常规介质或试剂与活性组分不相容的情况下外，预期将其用于所述组合物。

适宜的组合物包括水性或非水性等渗无菌溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂和抗菌剂，以及水性和非水性无菌混悬剂，其可以包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。所述组合物可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器中，如安瓿和小瓶，并且可以贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前加入无菌液体载体例如水。即用溶液和混悬液可以由无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。优选地，所述载体是缓冲盐溶液。更优选地，将所述病毒配制成组合物的一部分以保护病毒在给药前不被损坏。例如，可以将所述组合物制剂以降低病毒在用于制备、贮存或给予所述病毒的装置上(例如玻璃器皿、注射器或针头)的损失。可以将所述组合物制剂以降低病毒的光敏性和/或温度敏感性。

还可以将所述组合物制剂以增强转导效率。此外，本领域的普通技术人员将理解所述病毒载体可以存在于与其他治疗剂或生物活性剂的组合物中。例如，可以将控制炎症的因子例如布洛芬或类固醇作为组合物的一部分以减轻与体内给予病毒相关的肿胀和炎症。如果病毒用于向宿主递送编码抗原的核酸序列，则可以给予免疫系统刺激剂或佐剂例如白介素、脂多糖或双链RNA以增强或改善针对所述抗原的任意免疫应答。可以存在抗生素即杀菌剂和杀真菌剂以治疗现有感染和/或降低未来感染的风险，如与基因转移程序相关的感染。

本申请中药物组合物的摄入方式为腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、瘤内、皮下或鼻内施用。

在本申请中，“治疗”是指缓解症状，暂时或永久地消除症状的病因，或者防止或减缓指定的疾病或病症的症状表现。

在本申请中，溶瘤病毒(oncolytic viruses)是指在肿瘤细胞中选择性复制的病毒。

本申请中“有效量”包括在本申请中使用的病毒或者药物组合物足以提供期望治疗效果的量。所需的精确量将因对象而不同，其取决于诸如以下的因子：被治疗的物种，对象的年龄和一般病况，被治疗病况的严重性，施用的特定药剂以及施用模式等等。然而，对于给定的情况，可以通过本领域普通技术人员根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本申请药物组合物的剂量。

实施例一mGFP的设计和细胞分布鉴定

(1)mGFP模型表达GFP的分子，在蛋白的N端设计了IgG抗体k链的前导链序列，在此之后加了Flag标签序列，用于mGFP分子的鉴定，后面加了绿色荧光蛋白GFP序列，用于mGFP表达荧光显微镜下的检测，在GFP序列之后，加了VSV G蛋白的跨膜区序列(TM)，用于mGFP在细胞或者病毒囊膜的锚定，最后在mGFP分子的末端加了VSV G蛋白的胞质序列(TC)，具体mGFP各元件结构如图(1)展示。mGFP分子的核酸和氨基酸序列如图(2)和(3)所示。根据我们的设计，mGFP分子在细胞内翻译成蛋白分子后，会通过N端IgG抗体k链的前导链出细胞，但是由于在mGFP分子的内部还有VSV G蛋白的跨膜区和胞内区序列，所以整个mGFP最后表达可能会展示在细胞膜的表面，在病毒出芽释放的时候，就有可能把mGFP包装进入病毒囊膜，随后释放到细胞培养基中。

SEQ ID NO.1：mGFP分子的氨基酸序列

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYADYKDDDDKMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK

SEQ ID NO.2：mGFP分子的核酸序列

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTATCCATATGATGTTCCAGATTATGCTGACTACAAAGACGATGACGACAAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTAA

(2)首先通过金唯智生物技术公司，根据mGFP分子的核酸序列用化学合成的方法进行基因合成，进一步将合成的mGFP分子基因序列克隆到pcDNA3.1真核质粒载体上，获得的重组质粒命名为pcDNA3.1-mGFP。

(3)通过脂质体转染的方法(脂质体转染的具体操作步骤参见Invitrogen Lipo2000脂质体说明书，把pcDNA-mGFP质粒转染到293T细胞，让其在293T细胞瞬时表达。首先，通过蛋白免疫印迹western blot的方法(蛋白免疫印迹的具体操作步骤参见Methods MolBiol.2017；1606:133-139)，检测在转染mGFP的细胞中，检测发现了蛋白标签Flag的表达(图4A)。

进一步，在转染后48小时后，在荧光显微镜下检测绿色荧光mGFP在细胞内的分布情况，经检测发现GFP主要分布在细胞膜的边缘，另外通过mGFP分子Flag标签的染色，也发现相同的现象，DAPI染色标记的细胞核(图4B)。

为了进一步确证mGFP在细胞膜上表达，利用细胞流式仪(FACS)检测。通过细胞表面染色(不破坏细胞膜，因而无法对细胞内部分子进行染色)，检测了mGFP标签分子Flag，发现Flag标签确实在转染的mGFP分子的细胞膜表面表达(图4C)。

以上结果表明，通过序列组装，设计了一个细胞膜型表达的分子mGFP，其中包含了VSV G蛋白跨膜区域和胞质区域的关键序列。在mGFP转染的293T细胞中，通过多种方法确证mGFP能够展示在细胞膜表面。

实施例二mGFP分子在VSV病毒囊膜的装配

(1)pcDNA-mGFP质粒转染到293T细胞，转染后24小时利用VSV病毒以MOI＝0.1感染细胞，在感染后24小时收集细胞上清，采用蔗糖密度梯度离心，纯化得到VSV-mGFP病毒。对野生型VSV和重组型VSV-mGFP病毒样品进行跑SDS-PAGE胶，通过Western blot实验检测mGFP分子中的Flag标签，检测证明mGFP分子包装进入VSV-mGFP病毒颗粒(图5)。

(2)在表达mGFP分子的293T中，利用VSV以MOI＝0.1感染细胞，在感染后24小时收取细胞上清，利用蔗糖梯度密度离心纯化病毒，然后对纯化的病毒进行免疫透射电镜观察。利用带有胶体金颗粒的Flag抗体标记病毒，与野生型VSV病毒比较，VSV-mGFP病毒颗粒表面有更多的胶体金颗粒共定位(如图6箭头所指)，从分子图像层面表明本申请的mGFP分子已经成功装配到VSV病毒囊膜表面(图6)。

实施例三mGFP分子在HSV病毒囊膜的装配

单纯疱疹病毒HSV属于疱疹病毒科DNA病毒，为了验证囊膜病毒分子的适用性，拟利用上述方法在HSV病毒囊膜上装配Igκ-mGFP(同实施例1中的mGFP分子，即其氨基酸序列和核酸序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)或者Igκ-VAR分子(其氨基酸序列以及核酸序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)。

(1)在表达Igκ-mGFP或者疟原虫变异抗原膜型分子Igκ-VAR的293T中，将HSV以MOI＝1感染细胞，在感染后24小时收取细胞上清，首先利用蔗糖梯度密度离心纯化病毒，然后对纯化的病毒进行跑SDS-PAGE胶，利用抗Flag抗体检测野生型HSV和Igκ-mGFP-HSV,Igκ-VAR-HSV的标签。检测发现，在普通的HSV纯化的病毒颗粒中没有检测到Flag蛋白标签，而在表达模型分子Igκ-mGFP或者Igκ-VAR的细胞中来源的HSV纯化的病毒颗粒中，确实能够检测到Flag标签，而且大小与预期的一致，分别为45kD和110kD左右，如图7所示，结果表明创建的病毒囊膜蛋白分子组装系统不仅仅对RNA囊膜病毒适用，同时也适用于DNA囊膜病毒的重组装配，为后续设计靶向性病毒提供了技术支持和方案设计基础。

SEQ ID NO.3：Igκ-VAR的氨基酸序列

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYADYKDDDDKNYIKGDPYFAEYATKLSFILNPSDANNPSGETANHNDEACNCNESGISSVGQAQTSGPSSNKTCITHSSIKTNKKKECKDVKLGVRENDKDLKICVIEDTSLSGVDNCCCQDLLGILQENCSDNKRGSSSNDSCDNKNQDECQKKLEKVFASLTNGYKCDKCKSGTSRSKKKWIWKKSSGNEEGLQEEYANTIGLPPRTQSLYLGNLPKLENVCEDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKNLKKRYPQNKNSGNKENLCKALEYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQNNFGKLFGKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAEMNITTCNADGSVTGSGSSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVENFCEQRQAKVKDVITNCKSCKESGNKCKTECKTKCKDECEKYKKFIEACGTAGGGIGTAGSPWSKRWDQIYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGTSSTTNAAASTDENKCVQSDIDSFFKHLIDIGLTTPSSYLSNVLDDNICGADKAPWTTYTTYTTTEKCNKERDKSKSQSSDTLVVVNVPSPLGNTPYRYKYACQCKIPTNEETCDDRKEYMNQWSCGSARTMKRGYKNDNYELCKYNGVDVKPTTVRSNSSKLSSIASFFFIIGLIIGLFFVLRIGVYLCIKLKHTNKRQIYTDIEMNRLGK

SEQ ID NO.4：Igκ-VAR的核酸序列

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC-TATCCATATGATGTTCCAGATTATGCTGACTACAAAGACGATGACGACAAGAACTACATCAAGGGCGACCCCTATTTCGCTGAGTACGCTACAAAACTGAGCTTCATCCTGAACCCCAGCGACGCCAACAACCCCAGCGGCGAGACAGCCAACCACAACGACGAGGCCTGCAACTGCAACGAGAGCGGCATCAGCAGCGTGGGCCAGGCTCAGACATCCGGCCCTAGCAGCAACAAGACCTGTATCACCCACAGCTCCATCAAGACCAACAAGAAAAAAGAATGCAAGGACGTGAAGCTGGGCGTGCGGGAGAACGACAAGGATCTGAAGATCTGCGTGATCGAGGACACCAGCCTGAGCGGCGTGGACAACTGCTGCTGCCAGGATCTGCTGGGCATCCTGCAGGAAAACTGCAGCGACAACAAGCGGGGCAGCAGCTCCAACGACAGCTGCGACAATAAGAACCAGGACGAGTGCCAGAAAAAGCTGGAAAAGGTGTTCGCCAGCCTGACCAACGGCTACAAGTGCGATAAGTGCAAGAGCGGCACCTCCCGGTCCAAGAAGAAGTGGATCTGGAAGAAGTCCAGCGGCAACGAGGAAGGCCTGCAGGAAGAGTACGCCAACACCATCGGCCTGCCCCCCAGGACCCAGAGCCTGTACCTGGGCAATCTGCCCAAACTGGAAAACGTGTGCGAGGATGTGAAGGACATCAACTTCGACACCAAAGAGAAGTTTCTGGCCGGCTGCCTGATCGTGTCCTTCCACGAGGGCAAGAATCTGAAGAAGCGCTACCCCCAGAATAAGAACAGCGGCAACAAAGAAAACCTGTGCAAGGCTCTGGAATACAGCTTCGCCGACTACGGCGACCTGATCAAGGGCACCTCCATCTGGGACAACGAGTACACAAAGGACCTGGAACTGAATCTGCAGAACAACTTCGGCAAGCTGTTCGGCAAGTACATCAAGAAGAACAATACCGCCGAGCAGGACACCTCCTACAGCTCCCTGGACGAGCTGCGCGAGTCTTGGTGGAATACCAATAAGAAGTACATCTGGACCGCCATGAAGCACGGCGCCGAGATGAACATCACCACCTGTAACGCCGACGGCTCCGTGACCGGCAGCGGCTCCAGCTGCGACGACATCCCCACCATCGACCTGATCCCCCAGTACCTGAGATTTCTGCAGGAATGGGTCGAGAACTTCTGCGAGCAGCGGCAGGCCAAAGTGAAGGACGTGATCACCAACTGCAAGAGCTGCAAAGAATCCGGCAACAAATGCAAGACCGAGTGCAAAACCAAGTGCAAGGATGAGTGCGAGAAGTACAAGAAGTTCATCGAGGCCTGCGGCACAGCCGGCGGAGGCATCGGAACAGCCGGCAGCCCCTGGTCCAAGAGATGGGACCAGATCTACAAGCGGTACAGCAAGCACATCGAGGACGCCAAGCGGAACCGGAAGGCCGGCACCAAGAACTGCGGCACCAGCTCCACCACCAACGCCGCTGCCAGCACCGACGAGAATAAGTGCGTGCAGAGCGACATCGACAGCTTTTTCAAGCACCTGATCGATATCGGCCTGACCACCCCCAGCAGCTACCTGAGCAACGTGCTGGACGACAACATCTGTGGCGCCGACAAGGCCCCCTGGACAACCTATACAACATACACTACAACCGAGAAGTGCAACAAAGAGCGGGACAAGAGCAAGAGCCAGAGCAGCGACACCCTGGTGGTGGTGAACGTGCCCAGCCCCCTGGGCAACACACCCTACCGGTACAAGTACGCCTGCCAGTGCAAGATCCCCACCAACGAGGAAACATGCGACGACCGGAAAGAATACATGAACCAGTGGTCCTGCGGGAGCGCTCGGACCATGAAGAGAGGGTATAAGAACGATAACTACGAACTGTGCAAGTACAACGGCGTGGATGTGAAGCCCACCACCGTGCGGAGCAACTCCAGCAAGCTGAGCTCTATTGCTTCCTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGATTATTCTTTGTTCTCCGAATTGGTGTTTACCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAATAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTAA

实施例四带有囊膜装配VAR分子的病毒肿瘤靶向检测

VAR分子VAR2CSA的截短型分子。VAR2CSA基因编码的蛋白介导了恶性疟原虫和胎盘受体软骨素A(CSA)的吸附。也有研究报道表明，多种肿瘤细胞高表达CSA，因此VAR2CSA可以做为一个肿瘤靶向的蛋白分子[Cancer Cell.2015Oct 12；28(4):500-514]。在实施例三，设计了Igκ-VAR分子，已经能够证明此分子能够装配到病毒囊膜表面。在本实施例中，利用VSV-△G病毒(产生的子代病毒不含有G囊膜蛋白)，感染表达有Igκ-VAR分子的293T细胞，制备含有Igκ-VAR膜型分子的VSV病毒(VSV-Igκ-VAR，实验组)，对照病毒是不表达Igκ-VAR膜型分子的VSV病毒(VSV-empty)。利用荧光定量PCR的方式，对这两个病毒的基因组RNA进行了定量。

接下来，在6孔细胞培养皿中，分别培养有4x10⁵小鼠肿瘤细胞:非小细胞肺癌细胞(LLC)，结肠癌细胞(MC-38)，非肿瘤细胞：仓鼠肾细胞BHK，非洲绿猴肾细胞Vero。然后分别在这些细胞中加入含有1x10⁶拷贝的VSV-Igκ-VAR(实验组)，VSV-empty(对照组)病毒，在4℃孵育30分钟(4℃孵育，病毒只能和细胞吸附，不会被内吞进入细胞)，孵育之后用PBS洗细胞2次，洗去不结合的病毒，然后利用Qiagen公司RNAeasy kit对培养皿中的细胞RNA进行抽提，逆转，利用q-PCR方法，检测抽提到的RNA中的病毒核酸拷贝，以此来判别病毒和细胞吸附的能力。我们的结果显示如图8，在LLC和MC-38细胞中，VSV-Igκ-VAR病毒对细胞的结合能力明显比VSV-empty要高，分别为3.3和4.0倍；而在非肿瘤细胞BHK和Vero细胞中，这两种病毒对细胞的吸附能力没有明显差别，说明我们装配到VSV病毒上的Igκ-VAR分子对肿瘤细胞有一定的靶向能力，能让病毒在肿瘤细胞表面富集。

序列表

<110> 深圳普菲科生命科技有限公司

<120> 一种病毒囊膜蛋白装配系统及其方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 378

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mGFP分子的氨基酸序列

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Asp Tyr

20 25 30

Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr

35 40 45

Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His

50 55 60

Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys

65 70 75 80

Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp

85 90 95

Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg

100 105 110

Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro

115 120 125

Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn

130 135 140

Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn

145 150 155 160

Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu

165 170 175

Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met

180 185 190

Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His

195 200 205

Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn

210 215 220

Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His

245 250 255

Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met

260 265 270

Asp Glu Leu Tyr Lys Asp Leu His Leu Ser Ser Lys Ala Gln Val Phe

275 280 285

Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala Ala Ser Gln Leu Pro Asp Asp Glu

290 295 300

Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu

305 310 315 320

Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe

325 330 335

Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly

340 345 350

Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr

355 360 365

Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

370 375

<210> 2

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mGFP分子的核酸序列

<400> 2

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gactatccat atgatgttcc agattatgct gactacaaag acgatgacga caagatggtg 120

agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 180

gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 240

ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 300

accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 360

gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 420

gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 480

cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 540

gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 600

aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 660

taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 720

agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 780

gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa ggatcttcat 840

cttagctcaa aggctcaggt gttcgaacat cctcacattc aagacgctgc ttcgcaactt 900

cctgatgatg agagtttatt ttttggtgat actgggctat ccaaaaatcc aatcgagctt 960

gtagaaggtt ggttcagtag ttggaaaagc tctattgcct cttttttctt tatcataggg 1020

ttaatcattg gactattctt ggttctccga gttggtatcc atctttgcat taaattaaag 1080

cacaccaaga aaagacagat ttatacagac atagagatga accgacttgg aaagtaa 1137

<210> 3

<211> 726

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Igκ-VAR的氨基酸序列

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Asp Tyr

20 25 30

Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asn Tyr Ile Lys Gly Asp Pro Tyr Phe Ala

35 40 45

Glu Tyr Ala Thr Lys Leu Ser Phe Ile Leu Asn Pro Ser Asp Ala Asn

50 55 60

Asn Pro Ser Gly Glu Thr Ala Asn His Asn Asp Glu Ala Cys Asn Cys

65 70 75 80

Asn Glu Ser Gly Ile Ser Ser Val Gly Gln Ala Gln Thr Ser Gly Pro

85 90 95

Ser Ser Asn Lys Thr Cys Ile Thr His Ser Ser Ile Lys Thr Asn Lys

100 105 110

Lys Lys Glu Cys Lys Asp Val Lys Leu Gly Val Arg Glu Asn Asp Lys

115 120 125

Asp Leu Lys Ile Cys Val Ile Glu Asp Thr Ser Leu Ser Gly Val Asp

130 135 140

Asn Cys Cys Cys Gln Asp Leu Leu Gly Ile Leu Gln Glu Asn Cys Ser

145 150 155 160

Asp Asn Lys Arg Gly Ser Ser Ser Asn Asp Ser Cys Asp Asn Lys Asn

165 170 175

Gln Asp Glu Cys Gln Lys Lys Leu Glu Lys Val Phe Ala Ser Leu Thr

180 185 190

Asn Gly Tyr Lys Cys Asp Lys Cys Lys Ser Gly Thr Ser Arg Ser Lys

195 200 205

Lys Lys Trp Ile Trp Lys Lys Ser Ser Gly Asn Glu Glu Gly Leu Gln

210 215 220

Glu Glu Tyr Ala Asn Thr Ile Gly Leu Pro Pro Arg Thr Gln Ser Leu

225 230 235 240

Tyr Leu Gly Asn Leu Pro Lys Leu Glu Asn Val Cys Glu Asp Val Lys

245 250 255

Asp Ile Asn Phe Asp Thr Lys Glu Lys Phe Leu Ala Gly Cys Leu Ile

260 265 270

Val Ser Phe His Glu Gly Lys Asn Leu Lys Lys Arg Tyr Pro Gln Asn

275 280 285

Lys Asn Ser Gly Asn Lys Glu Asn Leu Cys Lys Ala Leu Glu Tyr Ser

290 295 300

Phe Ala Asp Tyr Gly Asp Leu Ile Lys Gly Thr Ser Ile Trp Asp Asn

305 310 315 320

Glu Tyr Thr Lys Asp Leu Glu Leu Asn Leu Gln Asn Asn Phe Gly Lys

325 330 335

Leu Phe Gly Lys Tyr Ile Lys Lys Asn Asn Thr Ala Glu Gln Asp Thr

340 345 350

Ser Tyr Ser Ser Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ser Trp Trp Asn Thr Asn

355 360 365

Lys Lys Tyr Ile Trp Thr Ala Met Lys His Gly Ala Glu Met Asn Ile

370 375 380

Thr Thr Cys Asn Ala Asp Gly Ser Val Thr Gly Ser Gly Ser Ser Cys

385 390 395 400

Asp Asp Ile Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Gln Tyr Leu Arg Phe Leu

405 410 415

Gln Glu Trp Val Glu Asn Phe Cys Glu Gln Arg Gln Ala Lys Val Lys

420 425 430

Asp Val Ile Thr Asn Cys Lys Ser Cys Lys Glu Ser Gly Asn Lys Cys

435 440 445

Lys Thr Glu Cys Lys Thr Lys Cys Lys Asp Glu Cys Glu Lys Tyr Lys

450 455 460

Lys Phe Ile Glu Ala Cys Gly Thr Ala Gly Gly Gly Ile Gly Thr Ala

465 470 475 480

Gly Ser Pro Trp Ser Lys Arg Trp Asp Gln Ile Tyr Lys Arg Tyr Ser

485 490 495

Lys His Ile Glu Asp Ala Lys Arg Asn Arg Lys Ala Gly Thr Lys Asn

500 505 510

Cys Gly Thr Ser Ser Thr Thr Asn Ala Ala Ala Ser Thr Asp Glu Asn

515 520 525

Lys Cys Val Gln Ser Asp Ile Asp Ser Phe Phe Lys His Leu Ile Asp

530 535 540

Ile Gly Leu Thr Thr Pro Ser Ser Tyr Leu Ser Asn Val Leu Asp Asp

545 550 555 560

Asn Ile Cys Gly Ala Asp Lys Ala Pro Trp Thr Thr Tyr Thr Thr Tyr

565 570 575

Thr Thr Thr Glu Lys Cys Asn Lys Glu Arg Asp Lys Ser Lys Ser Gln

580 585 590

Ser Ser Asp Thr Leu Val Val Val Asn Val Pro Ser Pro Leu Gly Asn

595 600 605

Thr Pro Tyr Arg Tyr Lys Tyr Ala Cys Gln Cys Lys Ile Pro Thr Asn

610 615 620

Glu Glu Thr Cys Asp Asp Arg Lys Glu Tyr Met Asn Gln Trp Ser Cys

625 630 635 640

Gly Ser Ala Arg Thr Met Lys Arg Gly Tyr Lys Asn Asp Asn Tyr Glu

645 650 655

Leu Cys Lys Tyr Asn Gly Val Asp Val Lys Pro Thr Thr Val Arg Ser

660 665 670

Asn Ser Ser Lys Leu Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly

675 680 685

Leu Ile Ile Gly Leu Phe Phe Val Leu Arg Ile Gly Val Tyr Leu Cys

690 695 700

Ile Lys Leu Lys His Thr Asn Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu

705 710 715 720

Met Asn Arg Leu Gly Lys

725

<210> 4

<211> 2181

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Igκ-VAR的核酸序列

<400> 4

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gactatccat atgatgttcc agattatgct gactacaaag acgatgacga caagaactac 120

atcaagggcg acccctattt cgctgagtac gctacaaaac tgagcttcat cctgaacccc 180

agcgacgcca acaaccccag cggcgagaca gccaaccaca acgacgaggc ctgcaactgc 240

aacgagagcg gcatcagcag cgtgggccag gctcagacat ccggccctag cagcaacaag 300

acctgtatca cccacagctc catcaagacc aacaagaaaa aagaatgcaa ggacgtgaag 360

ctgggcgtgc gggagaacga caaggatctg aagatctgcg tgatcgagga caccagcctg 420

agcggcgtgg acaactgctg ctgccaggat ctgctgggca tcctgcagga aaactgcagc 480

gacaacaagc ggggcagcag ctccaacgac agctgcgaca ataagaacca ggacgagtgc 540

cagaaaaagc tggaaaaggt gttcgccagc ctgaccaacg gctacaagtg cgataagtgc 600

aagagcggca cctcccggtc caagaagaag tggatctgga agaagtccag cggcaacgag 660

gaaggcctgc aggaagagta cgccaacacc atcggcctgc cccccaggac ccagagcctg 720

tacctgggca atctgcccaa actggaaaac gtgtgcgagg atgtgaagga catcaacttc 780

gacaccaaag agaagtttct ggccggctgc ctgatcgtgt ccttccacga gggcaagaat 840

ctgaagaagc gctaccccca gaataagaac agcggcaaca aagaaaacct gtgcaaggct 900

ctggaataca gcttcgccga ctacggcgac ctgatcaagg gcacctccat ctgggacaac 960

gagtacacaa aggacctgga actgaatctg cagaacaact tcggcaagct gttcggcaag 1020

tacatcaaga agaacaatac cgccgagcag gacacctcct acagctccct ggacgagctg 1080

cgcgagtctt ggtggaatac caataagaag tacatctgga ccgccatgaa gcacggcgcc 1140

gagatgaaca tcaccacctg taacgccgac ggctccgtga ccggcagcgg ctccagctgc 1200

gacgacatcc ccaccatcga cctgatcccc cagtacctga gatttctgca ggaatgggtc 1260

gagaacttct gcgagcagcg gcaggccaaa gtgaaggacg tgatcaccaa ctgcaagagc 1320

tgcaaagaat ccggcaacaa atgcaagacc gagtgcaaaa ccaagtgcaa ggatgagtgc 1380

gagaagtaca agaagttcat cgaggcctgc ggcacagccg gcggaggcat cggaacagcc 1440

ggcagcccct ggtccaagag atgggaccag atctacaagc ggtacagcaa gcacatcgag 1500

gacgccaagc ggaaccggaa ggccggcacc aagaactgcg gcaccagctc caccaccaac 1560

gccgctgcca gcaccgacga gaataagtgc gtgcagagcg acatcgacag ctttttcaag 1620

cacctgatcg atatcggcct gaccaccccc agcagctacc tgagcaacgt gctggacgac 1680

aacatctgtg gcgccgacaa ggccccctgg acaacctata caacatacac tacaaccgag 1740

aagtgcaaca aagagcggga caagagcaag agccagagca gcgacaccct ggtggtggtg 1800

aacgtgccca gccccctggg caacacaccc taccggtaca agtacgcctg ccagtgcaag 1860

atccccacca acgaggaaac atgcgacgac cggaaagaat acatgaacca gtggtcctgc 1920

gggagcgctc ggaccatgaa gagagggtat aagaacgata actacgaact gtgcaagtac 1980

aacggcgtgg atgtgaagcc caccaccgtg cggagcaact ccagcaagct gagctctatt 2040

gcttcctttt tctttatcat agggttaatc attggattat tctttgttct ccgaattggt 2100

gtttaccttt gcattaaatt aaagcacacc aataaaagac agatttatac agacatagag 2160

atgaaccgac ttggaaagta a 2181

Claims

1.一种病毒囊膜蛋白装配系统，所述系统至少含有直接或间接连接的分泌肽信号序列和跨膜区。

2.如权利要求1所述系统，所述分泌肽信号序列与跨膜区之间还含有外源装配目的蛋白分子；

优选地，所述外源装配目的蛋白分子包含与疾病相关的靶点拮抗剂、激动剂、共抑制分子中的一种或多种；

优选地，所述外源装配目的蛋白分子包含肿瘤抗原和/或免疫疾病抗原相关的拮抗剂；

优选地，所述拮抗剂包含抗体或抗体片段、抗体类似物、肽及肽模拟物中的一种或多种。

3.如权利要求1所述系统，所述分泌肽信号序列包含真核生物血液和胞外基质中的细胞因子、补体、降解酶类、肽类激素和免疫球蛋白中的一种或多种；

优选地，所述分泌肽信号序列包含长度为5-30个氨基酸的肽链；

优选地，所述分泌肽信号序列选自IgG k轻链前导序列。

4.如权利要求1所述系统，所述跨膜区后还连接有胞质区；

优选地，所述跨膜区包含具备粘附特性的糖蛋白的跨膜区；

优选地，所述具备粘附特性的糖蛋白包含钙粘素、选择素、免疫球蛋白超家族的CAM和整合素中的一种或多种；

优选地，所述跨膜区选自囊膜蛋白跨膜区。

5.如权利要求1所述系统，所述系统还包含蛋白标签；

优选地，所述蛋白标签位于外源装配目的蛋白分子的N端或C端；

优选地，所述蛋白标签包含荧光蛋白、HA蛋白标签、Flag蛋白标签、Myc蛋白标签和His蛋白标签中的一种或多种；

优选地，所述蛋白标签包含藻红蛋白、藻蓝蛋白和绿色荧光蛋白GFP中的一种或多种。

6.如权利要求1所述系统，所述系统含有依次连接的IgG k轻链前导序列，蛋白标签，囊膜蛋白跨膜区，以及囊膜蛋白胞质区；

优选地，所述系统含有依次连接的IgG k轻链前导序列，Flag蛋白标签，绿色荧光蛋白GFP或VAR2CSA的截短型分子VAR，囊膜蛋白跨膜区，以及囊膜蛋白胞质区；

优选地，所述系统含有依次连接的IgG k轻链前导序列，HA蛋白标签，Flag蛋白标签，绿色荧光蛋白GFP或VAR2CSA的截短型分子VAR，囊膜蛋白跨膜区，以及囊膜蛋白胞质区。

7.如权利要求1所述系统，所述病毒囊膜蛋白装配系统中，被装配的病毒选自囊膜病毒；

优选地，所述囊膜病毒包含艾滋病毒、新城疫病毒、SARS冠状病毒、弹状病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒属和肝病毒属中的任意一种或多种；

优选地，所述囊膜病毒包括野生型和/或突变型；

优选地，所述囊膜病毒的遗传物质选自DNA或RNA；

优选地，所述囊膜病毒选自单纯疱疹病毒HSV和/或水泡性口炎病毒VSV。

8.一种氨基酸序列，所述氨基酸序列编码权利要求1-7任一所述病毒囊膜蛋白装配系统；

优选地，所述氨基酸序列含有SEQ ID NO:1或3所示的序列。

9.一种核酸序列，所述核酸序列编码权利要求1-7任一所述病毒囊膜蛋白装配系统；

优选地，所述核酸序列含有SEQ ID NO:2或4所示序列。

10.一种载体，所述载体包含权利要求9所述核酸序列；

优选地，所述载体选自质粒和/或病毒骨架载体。

11.一种细胞，所述细胞包含权利要求10所述载体；

优选地，所述细胞选自真核细胞。

12.一种病毒，所述病毒包含权利要求1-7任一所述病毒囊膜蛋白装配系统。

13.一种病毒囊膜蛋白装配的方法，所述方法包含以下步骤，

将同时编码分泌肽信号序列和跨膜区的核酸序列克隆到载体上；然后用载体转染细胞；

接下来用病毒感染转染后的细胞；

优选地，所述核酸序列编码分泌肽信号、外源装配目的蛋白分子和跨膜区；

优选地，所述核酸序列编码分泌肽信号、外源装配目的蛋白分子、跨膜区和胞质区；

优选地，所述核酸序列还编码蛋白标签；

优选地，所述蛋白标签位于外源装配目的蛋白分子的N端或C端。

14.根据权利要求13所述方法，所述分泌肽信号包含真核生物血液和胞外基质中的细胞因子、补体、降解酶类、肽类激素和免疫球蛋白中的一种或多种；

优选地，所述分泌肽信号序列选自IgG k轻链前导序列；

优选地，所述外源装配目的蛋白分子包含与疾病相关的靶点拮抗剂、激动剂共抑制分子中的一种或多种；

优选地，所述拮抗剂选自抗体或抗体片段、肽及肽模拟物中的一种或多种；

优选地，所述跨膜区包含具备粘附特性的糖蛋白的跨膜区；

优选地，所述具备粘附特性的糖蛋白包含钙粘素、选择素、免疫球蛋白超家族的CAM、和整合素中的一种或多种；

优选地，所述跨膜区选自囊膜蛋白跨膜区；

优选地，所述蛋白标签包含荧光蛋白、HA蛋白标签、Flag蛋白标签、Myc蛋白标签、His蛋白标签中的一种或多种；

优选地，所述蛋白标签包含藻红蛋白、藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白GFP中的一种或多种；

优选地，所述方法中，被装配的病毒选自囊膜病毒；

优选地，所述囊膜病毒包括野生型和/或突变型；

优选地，所述囊膜病毒的遗传物质选自DNA或RNA；

15.根据权利要求13所述方法，所述方法包含以下步骤：

2)将所述的阳性质粒载体瞬时转染细胞；

3)细胞转染后，加入待装配的病毒，病毒感染后，分离纯化装配后的病毒。

16.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求12所述病毒；

优选地，还含有药物上可接受的载体；

优选地，所述药物组合物的制剂形式包含注射剂、冻干制剂、喷雾制剂、液体制剂、膏剂和片剂中的一种或多种。

17.权利要求1-7任一所述病毒囊膜蛋白装配系统，或权利要求8所述氨基酸，或权利要求9所述核酸序列，或权利要求10所述载体，或权利要求11所述细胞，在病毒囊膜装配中的应用；

优选地，所述病毒选自艾滋病毒、新城疫病毒、SARS冠状病毒、弹状病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒属和肝病毒属中的任意一种或多种。

18.权利要求1-7任一所述病毒囊膜蛋白装配系统，或权利要求8所述氨基酸，或权利要求9所述核酸序列，或权利要求10所述载体，或权利要求11所述细胞，或权利要求12所述病毒，在制备治疗疾病的药物中应用；

优选地，所述疾病选自肿瘤、先天性遗传病、艾滋病、糖尿病及心血管疾病中的一种或多种；

优选地，所述肿瘤选自肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌或白血病。