CN1357044A - 副粘病毒衍生的rnp - Google Patents

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Abstract

已成功制备一种含有来自仙台病毒的负链单链RNA的功能性RNP,该RNP已被修饰为不表达任何包膜蛋白。制备含有外源基因的RNP并使用阳离子脂质体将其插入到细胞内,借此成功地表达外源基因。

Description

副粘病毒衍生的RNP
                    技术领域
本发明涉及副粘病毒衍生的核糖复合体及其应用。
                    背景技术
副粘病毒是一种含有负链RNA作为基因组的病毒。负链RNA病毒载体具有许多明显不同于逆转录病毒、DNA病毒或正链病毒载体的特征。负链RNA病毒的基因组和反基因组不直接象mRNA那样起作用，因此它们不能引起病毒蛋白合成和基因组的复制。这些病毒的RNA基因组和反基因组通常表现为核糖核蛋白复合体(RNP)的形式，因此它们几乎不会造成反义链的问题，如在正链RNA病毒的情况下，mRNA与裸基因组RNA混合而干扰基因组与RNP的组配。这些病毒包括它们自身的利用RNA复合体作为模板进行病毒mRNAs转录或病毒基因组复制的RNA聚合酶。值得一提的是反链RNA(nsRNA)病毒只在宿主细胞的细胞质上增殖，并不造成其结合到染色体上，因为它们不经过DNA阶段。而且，在RNAs中仍未识别到类似的重组。这些性质被认为非常有助于作为基因表达载体的负链RNA病毒的稳定性和安全性。
在负链RNA病毒中，本发明者已将其注意力倾注于仙台病毒(SeV)。仙台病毒是属于副粘病毒属的非片断类型负链RNA病毒，并且是鼠副流感病毒的一种类型。据说这种病毒对人不具有致病性。此外，已分离出仙台病毒的一种仅在啮齿动物，天然宿主上引起轻度肺炎的减毒实验室菌株(Z菌株)(J.General Virology91997)78，3207-3215)。该菌株已广泛地用作用于分子水平研究副粘病毒转录-复制机理的研究模型。仙台病毒结合到该宿主细胞膜上并通过它的两个包膜糖蛋白、血细胞凝集素-神经氨酸苷酶(HN)和融合蛋白(F)造成膜融合，并有效地将其自身RNA聚合酶和以核糖核蛋白复合体(RNP)的形式存在的RNA基因组释放至宿主细胞的细胞质内以进行病毒mRNA的转录和其上的基因组复制(Bitzer，M.et.al.，J.Virol.71(7)：5481-5486，1997)。
迄今本发明者研制了一种从对应于仙台病毒基因组的cDNA上回收感染的仙台病毒粒子的方法。例如，在该方法中，在用编码T7 RNA聚合酶牛痘病毒感染LLC-MK2细胞之后，在T7促进剂、仙台病毒的核蛋白的(NP)和RNA聚合酶蛋白(P和L)的控制下，进一步分别用三种编码仙台病毒的反基因组同时转染以形成作为在细胞中病毒基因组复制的中间产物的反基因组核糖核蛋白复合体(RNPs)，然后生物复制能引起病毒蛋白转录和病毒颗粒装配的活性(功能性)基因组RNPs。在回收野生型仙台病毒时，将这些功能性基因组RNPs与重建细胞注入到鸡蛋的绒毛尿囊中以进行病毒颗粒的增殖(Kato，A.et al.，Genes cells 1，569-579(1996))。
但是，已知在病毒颗粒的形成过程中仙台病毒在其上结合宿主细胞蛋白(J.Biol.Chem.(1997)272，16578-16584)，而该结合的蛋白可能是其被转移到靶细胞时的抗原性和细胞毒性的原因。
在这点上，尽管存在利用RNP作为载体而不利用仙台病毒颗粒的明显需求，仍没有有关这种利用的报道。
                         发明公开
本发明的目的在于分离来源于副粘病毒科病毒的RNP，并提供将其作为载体的应用。在优选的实施方案中，提供了包括RNP复合体和阳离子化合物的载体。
本发明者已从属于副粘病毒科的仙台病毒中制得RNPs，并研究其作为载体的应用。
具体地说，本发明者首先制得缺陷作为这种病毒的一种包膜蛋白的F蛋白基因的仙台病毒基因组cDNA，从而在靶细胞上不产生野生型仙台病毒，并进一步构建载体以在细胞内表达cDNA(将GFP基因插入到载体内作为在F基因缺陷位点的报道基团)。将如此制得的载体转移到表达RNP形成所需的蛋白的细胞上以产生含有F缺陷基因的基因组的RNP。然后，重复以下循环从细胞中除去RNP：冷冻并融化细胞、与阳离子脂转染反应剂混合，并转移到F基因表达细胞上。结果在转入RNP的细胞内检测到作为报道基因的GFP表达。
也就是说，本发明者不仅成功地从仙台病毒上制得功能性RNP，还发现即使在采用基因转移反应剂如阳离子脂质体而不只是将作为仙台病毒的构成成分的RNP感染细胞而将该RNP转移到靶细胞时，表达RNP中所含的外源基因并因此实现本发明的可能性。
也就是说，本发明涉及副粘病毒衍生的RNP和其作为载体的应用，更为具体地说涉及：(1)一种复合体包括(a)负链单链RNA的复合体，其中该RNA被修饰为不表达至少一种副粘病毒的包膜蛋白，和(b)由该负链单链RNA编码并与其结合的蛋白；
(2)根据(1)的复合体，其中该负链单链RNA被修饰为表达NP、P和L蛋白但不是F、HN或M蛋白，或者它们的任意组合；
(3)根据(1)或(2)的复合体，其中该负链单链RNA来源于仙台病毒；
(4)根据(1)-(3)的任一复合体，其中该负链单链RNA进一步编码外源基因；
(5)一种用于基因转移的组合物，包括根据(4)的复合体和阳离子脂类；
(6)一种用于基因转移的组合物，包括根据(4)的复合体和阳离子聚合物；
(7)一种在细胞内表达外源基因的方法，包括往细胞内引入根据(5)或(6)的用于基因转移的组合物的步骤。
副粘病毒科病毒的“NP、P、M、F、HN和L基因”指分别编码核壳、磷酸、基质、融合、血细胞凝集素-神经氨酸苷酶和大蛋白质的基因。副粘病毒科的亚科的各种病毒基因一般表示如下。NP基因一般还描述为“N基因”。
属          N    P/C/V     M    F    HN    -    L
呼吸道病毒
属          N    P/C/      M    F    HN   (SH)  L
风疹病毒
属          N    P/C/V     M    F    H     -    L
麻疹病毒
归类于副粘病毒科呼吸道病毒的仙台病毒基因的核苷酸序列数据库入藏号是：NP基因为M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046和X17218，P基因为M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、XOO583、X17007和X17008，M基因为D11446、KO2742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、XOO584和X53056，F基因为DOO152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、XOO152和XO2131，HN基因为D26475、M.12397、M30202、M30203、M30204、M69046、XOO586、XO2808和X56131，而L基因为DOOO53、M30202、M30203、M30204、M69040、XOO587和XS8886。
本发明涉及一种来源于副粘病毒科病毒的任何包膜基因缺陷的核糖核蛋白复合体(RNP)。该复合体被修饰为在不存在包膜蛋白的情况下在靶细胞上不产生具有包膜蛋白的病毒。也就是说，根据本发明的RNP包括(a)来源于副粘病毒并被修饰为不表达至少一种副粘病毒包膜蛋白的负链单链RNA，(b)由该负链单链RNA编码并与其结合的蛋白。
能与负链单链RNA结合的蛋白指直接或间接地与负链单链RNA结合以形成具有负链单链RNA的RNP复合体的蛋白。一般来说，副粘病毒的负链单链RNA(基因组RNA)结合到NP、P和L蛋白上。RNP中所含的RNA用作RNA转录和复制的模板(Lamb，R.A.and D.Kolakofsky，1996，Paramyxoviridae：The viruses and thir replication，pp.1177 1204.InFields Virology，3rd edn.Fields，B.N.，D.M.Knipe，and P.M.Howley et al.(ed.)，Raven Press，New York，N.Y.)。本发明的复合体包括含有来源于副粘病毒的负链单链RNAs和同样来源于副粘病毒并结合到RNAs上的蛋白。例如，本发明的复合体为含有结合这些蛋白(NP、P和L蛋白)的负链单链RNA的RNP复合体。一般而言，副粘病毒的RNP复合体能自主地在宿主细胞上自我复制。因此，转移到细胞的RNPs在细胞内增殖以增加基因(RNP复合体中所含的RNA)的复制数，借此导致从携带外源基因的RNP上高水平表达外源基因。本发明的载体优选能在被转染的细胞中复制复合体(RNP)所含的RNA。
本发明RNP复合体的来源没有限制，只要它是副粘病毒科的病毒，但是特别优选属于副粘病毒属的仙台病毒。除了仙台病毒之外，本发明的RNPs可以来源于麻疹病毒、猿副流感病毒(SV5)和人副流感病毒类型3，但其来源并不限于此。
构建本发明的RNPs中所含的负链单链RNAs以抑制表达至少一种副粘病毒的包膜蛋白。表达受到抑制的包膜蛋白的实例为F蛋白、HN蛋白或M蛋白，或它们的任意组合。构建负链单链RNA以表达RNPs形成所需的NP、P和L蛋白。例如可以修饰本发明RNPs中所含的负链单链RNAs以表达NP、P和L蛋白，而不是F和/或HN蛋白。
在仙台病毒(SeV)的情况下，天然病毒的基因组大小约为15,000个核苷酸，而该负链包括跟随3’-短前导区和另一端的短5’-尾随区成一长行排列的六个编码NP(核壳)、P(磷)、M(基质)、F(融合)、HN(血细胞凝集素-神经氨酸苷酶)和L(大)蛋白的基因。在本发明中，可以通过设计缺陷任何F、HN和M基因或其任意组合的基因组而将该基因组修饰为不表达包膜蛋白。优选F基因或HN基因或这两者缺陷。由于RNP形成不需要这些蛋白，可以在NP、P和L蛋白存在下转录该基因组RNA(正或负链)来制造本发明的RNPs。例如在L1C-MK2细胞等中进行RNP形成。可以往细胞引入携带这些蛋白各自基因的表达载体中而提供NP、P和L蛋白(cf.例)。还可以往宿主细胞的染色体内结合各基因。用于表达形成RNP的NP、P和L基因无需与RNP所含基因组中编码的基因完全相同。也就是说，这些基因编码的蛋白质氨基酸序列可以不与RNP基因组编码的蛋白质氨基酸序列相同，而只要它们可以结合到基因组RNA上和能够在细胞中复制RNP，并可以具有突变或被其它病毒的同源基因所置换。一旦形成RNP，NP、P和L基因表达形成RNP，从而在细胞中自主地复制RNP。
为了重建和扩增细胞中的RNP，将RNP转移到表达包膜蛋白的细胞中(辅助细胞)，其中通过修饰RNP中所含的负链单链RNA而抑制其表达，或者可以在这些细胞中重建RNP。例如，为了从已被修饰为不表达F基因的负链单链RNA上扩增RNP，排列F蛋白以被细胞中的NP、P和L蛋白所表达。这样便构建了保留包膜蛋白的病毒载体，并通过其对辅助细胞的感染而将其扩增。
此外，还可以使用与通过修饰负链单链RNA而使其表达受到抑制的包膜蛋白不同的包膜蛋白。这种包膜蛋白的类型没有特别的限定。其它病毒包膜蛋白的一个实例是水泡性口炎病毒(VSV)的的G蛋白(VSV-G)。例如，可以使用表达VSV的G蛋白(VSV-G)的细胞来扩增本发明的RNP复合体。
通常可以通过(a)往表达包膜蛋白的细胞(辅助细胞)中引入编码已被修饰为不表达至少一种副粘病毒的病毒包膜蛋白的副粘病毒衍生的负链单链RNA，或该RNA的互补链的载体DNA来表达该RNAs，和(b)培养这些细胞以从其培养上清液或细胞提取物中回收RNP复合体。通过在载体DNA表达时同时表达NP、L和P蛋白，形成RNPs并构建具有包膜蛋白的病毒。
在辅助细胞中被表达的载体DNA编码本发明复合体中所含的负链单链RNA(负链)或其互补链(正链)。虽然在细胞内被转录的链可以是正或负链，优选排列为转录正链以改进复合体的重建效率。例如，编码负链单链RNA的DNA或其互补链连接到T7启动子的下游以通过T7聚合酶被转录到RNA上。
例如，可以通过将表达包膜基因缺陷的重组仙台病毒基因组的质体与表达该缺陷包膜蛋白的载体和NP、P/C和L蛋白表达载体一起转染到宿主细胞内来重建含有RNP复合体的病毒。例如可选择采用其染色体结合有F基因的宿主细胞来制造RNP复合体。从该病毒基因组外部提供的蛋白组的氨基酸序列无需与来源于该病毒的氨基酸序列相同。只要这些蛋白与天然类型的蛋白在向细胞中转移核酸的活性相等或更大，则可以通过引入突变或用来自其它病毒的同源基因置换来修饰编码这些蛋白质的基因。一般来说，已知由于包膜蛋白的细胞毒性和细胞形状变异活性因而有时难以长期培养这些宿主细胞，因此可以将它们排列成仅在引入启动子控制下重建载体时被表达。
一旦形成RNP或含有RNP的病毒，就可以通过再次往上述的辅助细胞中引入该RNP或病毒并对其培养来扩增本发明的复合体。该方法包括步骤：(a)往表达包膜蛋白的细胞引入本发明的复合体或含有该复合体的病毒载体，和(b)培养这些细胞并从培养上清液或细胞提取物中回收病毒颗粒。
例如，可将RNP与脂转染胺和聚阳离子脂质体一起作为复合体引入到细胞。具体地说，可以使用各种的转染剂。其实例为DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boheringer#1811169)等。可以加入氯奎以防止RNP在核内体中分解(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)。
一旦在宿主细胞中如此构建了病毒载体，可以通过采用表达包膜蛋白的细胞培养这些细胞来进一步将本发明的复合体或含有该复合体的病毒载体扩增。如在实施例12中所述，优选的实例为在产生细胞的病毒上增加表达包膜蛋白的细胞的方法。
例如，本发明的复合体可以含有由已被修饰为降低抗原性或增加转录和复制效率的复合体RNA编码的病毒基因。
本发明的复合体可以包括在其负链单链RNA上编码外源基因的RNA。任何在靶细胞中表达所期望的基因可以被用作外源基因。例如，在要进行基因治疗时，将治疗目标疾病的基因插入到编码该复合体所含的RNA的载体DNA中。例如，在将外源基因插入到该载体DNA如仙台病毒载体DNA上的情况下，优选在转录终止序列(E)和转录起始序列(S)之间插入含有核苷酸数目为6的倍数的序列(Journal of Virology Vol.67，No.8，1993，p.4822-4830)。可以在各个病毒基因(NP、P、M、F、HN和L基因)之前或之后插入该外源基因(cf.例)。在外源基因之前或之后适宜地插入E-I-S序列(转录起始序列-间插序列-转录终止序列)或其部分以在外源基因之前或之后不干扰基因的表达。可以采用在外源基因的上游和基因插入位点加入的转录起始序列和在该基因之前或后的核苷酸序列类型来调节所插入的外源基因的表达水平。例如，在仙台病毒中，插入位点与负链RNA的3’-端越近(在野生型病毒基因组的基因排列中，与NP基因越近)，则插入基因的表达水平越高。为了确保外源基因的高表达水平，优选在NP基因的上游(在负链的3’-侧)或在NP和P基因之间插入外源基因。相反，插入位点与负链RNA的5’-端越近(在野生型病毒基因组的基因排列中，与L基因越近)，则该插入基因的表达水平越低。例如，为了将外源基因的表达抑制在低水平，将外源基因插入到最远的该负链的5’-侧，也就是野生型病毒基因组L基因的下游(在负链中与L基因相邻的5’-侧)或L基因的上游(在负链中与L基因相邻的3’-侧)，为了便于插入外源基因，要以在插入位点设计一个克隆位点。例如，可以将克隆位点排列为限制酶的识别序列。可以将外源基因片断插入到编码该基因组的载体DNA的限制酶位点。可以将克隆位点排列为所谓的含有多个限制酶识别序列的多克隆位点。本发明复合体的RNA基因组可以藏匿在除了上述以外的外源基因的插入位点。
例如，可以根据如以下在“Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587”和“Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2：457-466”中的描述，构建含有来源于携带有外源基因的重组仙台病毒的RNP复合体的病毒载体。
首先，制备含有期望的外源基因的cDNA核苷酸序列的DNA试样。该DNA试样优选可被电泳识别为浓度为25ng/μl或更大的单一质体。以下将利用NotI位点将外源基因插入到编码病毒基因组的DNA的情况作为一个实例予以描述。当在目标cDNA核苷酸序列上包括NotI识别位点时，优选预先采用位点-特异性诱变修饰该核苷酸序列来检测该NotI位点，并使该方法不改变该cDNA编码的氨基酸序列。从该DNA中扩增期望的基因并通过PCR回收。为了在扩增的DNA片断的两端具有NotI位点并进一步往一端加入仙台病毒的转录终止序列(E)、间插序列(I)和转录起始序列(S)(EIS序列)的副本，制备正向副合成DNA序列和逆向副合成DNA序列(反义链)作为含有NotI限制酶分解位点序列、转录终止序列(E)、间插序列(I)、转录起始序列(S)目标基因部分序列的引物。
例如，为了确保通过NotI分解，将正向副合成DNA序列排列成这样的形式：其中在该合成DNA的5’-侧上选择任何两个或两个以上的核苷酸(优选4个来自NotI识别位点的除了GCG和GCC之外的核苷酸序列，更优选ACTT)；将NotI识别位点“gcggccgc”加入它的3’-侧；在它的3’-侧，加入任意期望的9个核苷酸或9个核苷酸加6的倍数个核苷酸作为间隔序列；而在其3’-侧，加入约25个核苷酸当量的含有期望的cDNA的初始密码子ATG的ORF。优选从期望的cDNA上选择约25个核苷酸作为正向副合成DNA序列以在它的3’-端具有作为最终核苷酸的G或C。
在逆向副合成DNA序列中，从该合成DNA的5’-侧上选择任何两个或两个以上的核苷酸(优选4个来自NotI识别位点的除了GCG和GCC之外的核苷酸序列，更优选ACTT)；将NotI识别位点“gcggccgc”加入它的3’-侧；在它的进一步的3’-侧，加入寡DNA作为插入片断以调节长度，该寡DNA设计为包括NotI识别位点“gcggccgc”、cDNA的互补序列和以下所述的来源于病毒的仙台病毒基因组EIS核苷酸序列的核苷酸总数成为6的倍数(所谓的“6的规则(rule of six)”；Kolakofski，D.et al.，J.Virol.72：891-899，1998)；进一步往插入片断的3’-侧加入与仙台病毒的S序列互补的序列，优选为5’-CTTTCACCCT-3’、I序列优选5’-AAG-3’和与E序列互补的序列，优选5’-TTTTTCTTACTACGG-3’；而进一步在其3’-侧，选择并加入从该期望的cDNA序列的终止密码子上呈逆向计数的大约25核苷酸当量的互补序列作为逆向副合成DNA3’-端，该序列的长度调节为具有作为终止核苷酸的G或C。
可以根据常规的方法采用如ExTaq聚合酶(Takara Shuzo)完成PCR。优选采用vent聚合酶(NEB)进行PCR，而用NotI消化如此扩增的期望的片断，然后将其插入到质体载体p蓝本(pBluescript)的NotI位点。用序列分析仪确认如此得到的PCR产物的核苷酸序列以选择具有正确序列的质体。采用NotI从该质体上切除该插入的片断，并克隆至携带包膜基因缺陷的基因组cDNA的质体的NotI位点。可选择地，可以通过往该NotI位点直接插入该片断而不借助质体载体p蓝本(pBluescript)获得重组仙台病毒cDNA。
还可以在试管或细胞中转录编码病毒基因组的载体DNA，用病毒L、P和NP蛋白重建RNP，并产生含有该RNP的病毒载体。可以根据现有技术中已知的方法采用细胞表达包膜蛋白从该载体DNA上进行病毒的重建(WO97/16539和97/16538：Durbin，A.P.et al.，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell，M.J.et al.，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.et al.，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579；Baron，M.D.和Barrett，T.，1997，J.Virol.71：1265-1271；Bridgen，A.和Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404)。在制备F、HN和/或M基因缺陷的病毒载体DNA时，采用这种缺陷载体不形成感染的病毒颗粒。但是，可以通过分别将这些缺陷基因、编码其它病毒包膜蛋白的基因等转移到宿主细胞并在那里表达它们来形成感染的病毒颗粒和扩增含有该复合体的病毒。
将载体DNA转移到细胞的方法包括以下：1)制备可被目标细胞摄入的DNA沉淀物的方法；2)制备含有适于被目标细胞摄入的复合体和不具强细胞毒性并具有正电荷的DNA的方法；和3)立即在目标细胞膜上钻出足以通过电泳使DNA分子穿透宽度的孔的方法。
在方法2)中，可以利用各种转染反应剂，例如DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boheringer#1811169)等。方法1)的一个实例为采用磷酸钙的转染方法，其中将进入细胞的DNA结合到吞噬体内，并往该核内结合足够的数量(Graham，F.L.和Van Der Eb，J.，1973，，Virology 52；456；Wigler，M.和Silverstein，S.1977，Cell 11：223)。Chen和Okayama已研究了这种转移技术的优化，并报道可以在以下条件下获得优化的DNA沉淀物，其中：1)在2-4％的CO2气氛下于35℃下用DNA对细胞培养15-24小时，2)具有比在使用线性DNA时更高沉淀物-形成活性的环DNA，和3)在沉淀混合物中将DNA浓缩至20-30μg/ml(Chen，C.和Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.7：2745)。方法2)适于瞬间转染。本技术中已知一种老方法，其中以期望的DNA浓度比率制备DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885，M.W.5×105)混合物以进行转染。由于大部分的复合体在核本内分解，可以加入氯奎以增强转染效果(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：3015)。方法3)被指示作为电穿孔，且比方法1)和2)更为通用，因为它不具有细胞选择性。认为方法3)在以下的优选条件下有效：脉冲电流持续时间、脉冲形状、电场效力(电极间隙，电压)、缓冲器导电率、DNA浓度和细胞密度。
在上述的三类方法中，转染试剂(方法2)适用于本发明，因为方法2)易于操作，并有助于利用大量的细胞检查试样。优选使用Superfect转染试剂(QIAGEN，Cat.No.301305)或DOSPER脂质体转染试剂(BoechringerMannheim，Cat.No.1811169)。
具体而言，可以如下从cDNA中进行病毒载体的重建。
采用含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100单位/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)在24-孔至6-孔塑料培养皿或100mm直径的培养皿培养来自猿肾脏的LLC-MK2细胞直到70-80融合，并用在2PFU/细胞上表达T7聚合酶的重组牛痘病毒vTF7-3感染该细胞。已通过在1μg/ml的补骨脂素的存在下用UV照射处理20分钟将该病毒灭活(Fuerst，T.R.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8122-8126，1986；Kato，A.et al.，GenesCells 1：569-579，1996)。可以适当地调节加入的补骨脂素的数量和UV照射的时间。在该感染一小时后，通过同时利用表达全长度仙台病毒基因组所需的反式作用病毒蛋白的质体(24-0.5μg的PGEM-N、12-0.25μg的PEM-P和24-0.5μg的PEM-L，更优选为1μg的PGEM-N、0.5μg的PEM-P和1μg的PEM-L)(Kato，A.et al.，Genes Cells 1：569-579，1996)和Superfect(QIAGEN)的脂转染法等，采用2-60μg、更优选为3-5μg的上述重组仙台病毒cDNA转染该细胞。在含有100μg/ml的各利福平(Sigma)和需要时所用的阿糖胞苷(AraC)，优选只含有40μg/ml阿糖胞苷(AraC)(Sigma)的不含血清的MEM中被转染的细胞，并可以将反应剂的浓度设至最适条件以使由于牛痘病毒的细胞毒最小化和使病毒的回收率最大化(Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1，569-579)。在该转染后培养约48-72小时后，回收这些细胞，重复三次冷冻和融化将其破裂，转染到表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞上并加以培养。在细胞培养3-7天以后，收集该培养物溶液。可选择通过转染已表达具有表达NP、L和P蛋白的质体的包膜蛋白的LLC-MK2细胞，或与包膜-转染质体一起转染而更为有效地获得感染的病毒载体。可以通过培养覆盖在表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞上的这些细胞(cf.例)而扩增病毒载体。可以通过测定血细胞凝集活性(HA)来确定该培养上清液中所含的病毒的滴定度，其中血细胞凝集活性(HA)可以通过“endo-point dilution method”(Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1，569-579)来测定。如此得到的病毒原种可在-80℃下贮藏。
用于病毒重建所需的宿主细胞的类型没有特别限制，只要RNP复合体或病毒载体可以在其中重建。例如，在仙台病毒载体或RNP复合体的重建中，可以使用培养细胞如来源于猿肾的CV-I细胞和LLC-MK2细胞、来源于仓鼠肾的BHK细胞等等。还可以通过在这些细胞中适宜地表达包膜蛋白而获得具有包膜的感染病毒颗粒。为了获得大量的仙台病毒载体，可以通过将RNP或从上述宿主细胞上得到的病毒载体与表达包膜基因的载体一起接种到含胚鸡蛋中。可选择采用结合包膜蛋白基因的转基因鸡蛋。采用鸡蛋制造病毒液的方法已被提出(Nakanishi，et al.(eds.)，1993，“xhinkei-kagaku Kenkyu-no Sentan-gijutu Protocol III(HighTechnology Protocol III of Neuroscience Research)，Milecular NeurocytePhysiology，Koseisha，Osaka，pp.153-172”。例如，具体地说将受精卵放在孵化器中并在37-38℃下孵化9-12天以生长胚胎。将仙台病毒载体或RNP复合体与表达包膜蛋白的载体一起接种到蛋的绒毛尿囊腔中，在培养数日以增殖病毒。条件如培养持续时间可以根据所用的重组仙台病毒的类型而变。然后，加收含有该病毒的绒毛尿囊液。可以根据标准方法进行仙台病毒载体的分离和纯化(Tashiro，M.，“Virus ExperimentProtocols”，Nagai和Ishihama(eds.)，Medicalview，pp.68-73(1995))。
作为表达包膜蛋白的载体，可以使用本发明的复合体或含有本发明复合体的病毒载体自身。例如，在将两种病毒基因组上的基因缺陷不同的RNP复合体类型转移到相同的细胞上时，通过表达另一种复合体而提供缺陷一种RNP复合体的包膜蛋白从而使彼此互补，借此导致形成感染的病毒颗粒和活化扩增该病毒的复制循环。也就是说，当两种或更多种类型的本发明RNP复合体或含有这些复合体的病毒载体组合接种到细胞以互被彼此的包膜蛋白时，可以大量而低成本地生产缺陷各自包膜蛋白的病毒载体的混合物。如此产生的混合病毒可以用于疫苗等的生产。由于包膜蛋白的缺陷，这些病毒与完整的病毒相比具有更小的基因组大小，因而它们能藏匿更长的外源基因。而且，由于将这些源于非传染性病毒的病毒在细胞外加以稀释，且难以保持它们的共感染，因此它们的是无菌的，而这有利于使它们释放到环境中去。
例如可以采用以下的超离心方法由病毒制备本发明的RNP。将TritonX-100加到含有病毒颗粒的滤液中以制得最终浓度为0.5％，使该混合物在室温下保持10-15分钟。以10-40％的蔗糖密度梯度将如此得到的上清液分层，并在20,000-30,000rpm下离心30分钟以回收含有RNP的部分。
可选择将该病毒溶于含有0.6％的NP40、1％的脱氧胆酸盐、1M的KCl、10mM的β-氢硫基乙醇、10mM的Tris-HCl(PH 7.4)和5mM的EDTA(最终浓度)的混合物中，在20℃下保持20分钟，然后在11,000×g下离心20分钟。将含有RNP的上清液置于含有0.2％的NP40、30mM的NaCl、10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA的50％的甘油中，在39,000rpm和4℃下离心2小时以回收沉淀物。可以通过以下方法将该沉淀物中所含的RNP复合体纯化：将该沉淀物再次分散在含有0.5％的Triton X-100的溶液中，在10-40％的蔗糖密度梯度下分层该分散体，并在20,000-30,000rpm下离心30分钟以回收含有高度纯化的RNP的单光谱带。
可以采用生理盐水和磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)适宜稀释本发明的复合体以制备组合物。当在鸡蛋等等中增殖本发明的复合体时，该组合物可以包括绒毛尿囊液。含有本发明的复合体的组合物可以含有生理学上可接受的培养液如去离子水、50％葡聚糖水溶液等等，而且还可以含有其它稳定剂和抗生素。
一旦制得插入外源基因的含有RNP的RNA，可以采用基因转移试剂将它转移到靶细胞上。作为基因转移试剂，优选阳离子脂质或阳离子聚合物。
阳离子脂质包括在国际专利公开号Hei5-508626的公开的日文译文中式(I)所代表的化合物。阳离子脂质为优选的合成脂化合物。阳离子脂质还可以是二醚或二酯化合物，优选为脂肪醚。特定的实例为以下的化合物：
DOGS(TransfectamTM)或DOTMA(LipofectinTM)(二醚化合物)；
DOTAP(二酯化合物)；
DOPE(二油酰磷脂酰基乙醇胺)；
DOPC(二油酰磷脂酰基胆碱)；
DPRI Rosenthal抑制剂(RI)(DL-2，3-二硬脂酰氧丙基(二甲基)β-羟乙铵溴化物(Sigma)的二棕榈酰衍生物)；和
DORI(以上化合物的二油酰衍生物)。
阳离子聚合物为阳离子高分子化合物，优选为合成分子。特定的实例为聚赖氨酸、脂肪聚胺、聚乙乙烯亚胺等等。
本发明的复合体可与上述的阳离子脂质或阳离子聚合物混合以制备用于基因转移的组合物。用于基因转移的组合物可以适宜地与培养液如生理盐水和溶液如盐、稳定等组合。通过加入本发明的用于基因转移的组合物，可以将本发明的复合体转移到细胞内以从该复合体所含的RNA上表达基因。
在将治疗基因用作外源基因时可以进行基因治疗。在将本发明的复合体用于基因治疗时，可以通过直接或间接(体外)给予该复合体来表达预期治疗效果的外源基因和患者体内不足的内源基因。外源基因的类型没有特别的限制，除了编码蛋白质的核酸以外，它们可以是不编码蛋白质的核酸，如反义或核酶。此外，当采用编码在传染性疾病中所涉及的细菌或病毒的抗原的基因作为外源基因时，通过将这些基因给予动物可以在动物上引入免疫。也就是说，这些基因可以用作疫苗。
在用作疫苗时，这些基因可以用于癌、传染性疾病或其它全身疾病。例如，作为癌治疗，可以在肿瘤细胞或抗原呈递细胞(APC)如DC细胞上表达具有治疗效果的基因。这种基因的实例为编码肿瘤抗原Muc-1或Muc-1类似的突变子串联重复肽(美国专利号5,744,144)、黑素瘤gp100抗原等。这种采用基因的治疗已广泛应用于乳腺、结肠、胰腺、前列腺、肺等处的癌。在基因治疗中与细胞因子组合以增强辅助效果也是有效的。这种基因的实例为i)与IL-2组合的单链IL-12(Proc.Natl. Acad.Sci.USA 96(15)：8591-8596，ii)与IL-2组合的干扰素-γ(美国专利号5,798，100)，iii)单独使用的粒细胞菌落刺激因子(GM-CSF)，和iv)与IL-4组合的用于治疗脑瘤的GM-CSF(J.Neurosurgery，90(6)，1115-1124(1999))等等。
用于治疗传染性疾病的基因的实例为编码以下蛋白的基因：毒性菌株H5N1类型的流感病毒的包膜蛋白、日本脑炎病毒的包膜嵌合体蛋白(Vaccine，Vol.17，No.15-16，1869-1882(1999))、AIDS病毒的HIV gag或SIV gag蛋白(J.Immunology(2000)，Vol.164，4968-4978)、被结合用作装入给药的聚乳酸乙二醇共聚物微粒胶囊中的口服疫苗的HIV包膜蛋白(Kanko，H.et al.，Virology 267，8-16(2000))、霍乱毒素的B亚单元(CTB)(Arakawa，T.et al.Nature Biotechnology(1998)15(10)：934-8；Arakawa，T.et al.，Nature Biotechnology(1998)16(3)：292-297)、狂犬病病毒的糖蛋白(Lodmell，D.L.et al.，1998，Nature Medicine 4(8)：949-52)和引起颈癌的人乳头瘤病毒6的衣壳蛋白(J.Med.virol.，60,200-204(2000)。
还可以将基因治疗用于全身疾病。例如，在糖尿病的情况下，已在I型糖尿病模型动物上，通过接种编码肽的质体DNA而进行胰岛素肽片断的表达(Coon，B.et al.，J.Clin.Invest.，1999，104(2)：189-94)。
                     附图的简要说明
图1为表示采用Western印迹法通过Cre-loxP-引入表达系统对F蛋白表达的分析结果的图形。它显示了通过化学发光法检测与抗-SeV-F抗体交叉反应的转移膜上蛋白质的结果。
图2显示了表示通过Cre-loxP系统引入其表达的F蛋白的细胞表面显示分析结果的图表。它表示了采用抗-SeV-F抗体对LLC-MK2/F7进行流动血细胞计数分析的结果。
图3显示了表示采用Western印迹法由胰蛋白酶确认被表达的F蛋白的分解的结果图。
图4显示了表明确认在细胞表面吸收到红细胞上的实验中HN的细胞表面表达的结果的图。
图5显示了表明通过尝度采用细胞表达缺陷蛋白而收获缺陷病毒所得的结果图。它揭示了通过用于F缺陷的SeV重建的牛痘病毒快速地终止辅助细胞系的F蛋白的表达。
1.LLC-MK2和CV-1代表来自各细胞类型的细胞溶解产物。
2.LLC-MK2/F+ad和CV-1/F+ad代表来自各个已被引入表达且已被加入腺病毒AxCANCre的细胞的细胞溶解产物。
3.LLC-MK2/F-ad和CV-1/F-ad代表来自已加入F基因但未加入腺病毒AxCANCre的细胞系的细胞溶解产物。
4.LLC-MK2/F+ad 3 rd代表来自由腺病毒AxCANCre引入其表达然后进一步传代三次的细胞的细胞溶解产物。
5.1d和3d分别表示在引入表达的一天或三天之后。
6.Vacld和Vac3d分别表示在感染牛痘病毒的1天或3天后的细胞。
7.Vacld和Vac3d分别表示在加入Arac的1天或3天后的细胞。
8.CHX 1d和CHX 3d分别表示在加入蛋白合成抑制剂放线菌酮的1天或3天后的细胞。
图6所显示的图表示了在将含有F缺陷的SeV cDNA的GFP(pSeV181/ΔF-GFP)转移至不表达F的LLC-MK2细胞之后通过观测GFP表达而获得的结果(RNP的检测)。在对照组中，用NP基因在3’-端改组F基因，然后使用已在F缺陷的位点引入GFP的SeV cDNA。记号“all”表示用指导NP基因、P基因和L基因(pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L)表达的质体与SeV cDNA同时转染的细胞；“cDNA”表示只用cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP)转染的细胞。为了RNP转染，收集表达GFP的P0细胞；将细胞(107细胞/ml)悬浮在optiMEM(GIBCO BRL)中；将100μl在采用冷却-融化循环处理三次后而制得的溶解产物与25μl的阳离子脂质体DOSPER9Boehringer Mannheim)混合并于室温下静置15分钟；将该混合物加到已引入表达F的细胞(+ad)中完成RNP转染。使用未引入重组腺病毒的表达Cre DNA重组酶的细胞作为细胞对照组(-ad)。其结果表明GFP的表达取决于在LLC-MK2细胞的P0中的SeV的RNP形成；而F缺陷的病毒的扩增取决于在P1中表达F的引入。
图7显示的图表示研究是否可以通过F-表达辅助细胞拯救由F缺陷基因组cDNA重建的功能性RNA并形成该缺陷病毒的感染病毒颗粒的结果。RNP/o表示覆盖RNP的细胞；RNP/t表示用RNP转染的细胞。
图8显示的图表示F缺陷病毒的F-表达细胞特异性生长的证据。如在实施例2所示，将包含由该基因缺陷的基因组构成的功能性RNP的溶解产物脂转染到表达F的细胞上；然后除去培养上清液。将该培养上清液加到表达F的细胞的培养液中以实现感染；在第三天，移出培养上清液并同时将其加到F-表达细胞和未表达过F的细胞；然后在存在或不存在胰蛋白酶的情况下培养三天。这里显示了结果。在F-表达细胞中仅在存在胰蛋白酶的情况下扩增该病毒。
图9显示的图表示F缺陷细胞在引入表达F的细胞中以后特异性地释放到培养上清液的证据。如在实施例2所示，将包含由该基因缺陷的基因组构成的功能性RNP的溶解产物脂转染到表达F的细胞上；然后除去培养上清液。将该培养上清液加到表达F的细胞的培养液中以实现感染；在第三天，移出培养上清液并同时将其加到F-表达细胞和未表达F的细胞；然后在存在或不存在胰蛋白酶的情况下培养三天。下方图案表示了不表达F的细胞上清液的结果。
图10显示的图表示了通过以下步骤所得到的结果：从表达F的细胞的培养上清液中回收病毒、提取全部RNA并采用F和HN作为探针进行Northen印迹分析以校正从F缺陷cDNA中回收到的病毒颗粒的基因组结构。在从表达F的细胞中回收到的病毒中，检测到HN基因但F基因不能被检测；因此它表明了在病毒基因组中不存在F基因。
图11显示的图表示RT-PCR的结果，它表明如在cDNA的构成物一样，在已被检测到F的位点存在GFP基因。1：+18-NP，用于确认存在+18 NotI位点；2：M-GFP，用于确认在F基因缺陷区域存在GFP基因；3：F基因，用于确认存在F基因。在上图中显示了野生型SeV和F缺陷GFP表达SeV的基因组结构。它被校正为GFP基因存在于F缺陷位点，源于+18的NotI位点存在于NP的3’-端，而F基因在RNA基因组的任何部分都不存在。
图12显示的图是采用与病毒的F或HN特异性反应的黄金胶体结合的IgG(抗-F、抗-HN)进行免疫-电子显微检查而获得的。它表明峰状结构的病毒包膜含有F和HN蛋白。
图13显示的图表表示RT-PCR的结果，它表明除了GFP基因之外的基因结构与野生型的基因结构相同。
图14显示的图表示采用电子显微检查F缺陷病毒颗粒形态而获得的结果。与野生型病毒颗粒类似，F缺陷病毒颗粒内部具有螺旋状RNP结构和峰状结构。
图15显示的图表示采用具有高效力的F缺陷基因SeV载体在体内将基因转移到各种细胞的结果。
图16显示的图表表示在往小鼠的原发骨髓细胞(BM c-kit+/-)中引入F缺陷SeV载体以后得到的分析结果。开口的柱代表PE-阳性/GFP-阴性；封闭的柱代表PE-阳性/GFP-阳性。
图17显示的图表示将载体在体内给予大鼠大脑室的结果。
图18显示的图表示如此得到的结果：采用含有从表达F的细胞回收的F缺陷SeV病毒的培养上清液以感染不表达F的LLC-MK2细胞，在存在或或不存在胰蛋白酶下培养细胞三天以通过HA测定确认在上清液中存在病毒。
图19的图表示在已用绒毛尿囊液(通道11和12)从图18B中的HA-阳性含胚卵中培养含胚鸡蛋二天以后进行绒毛尿囊液的HA分析而获得的结果。
图20显示的图表示通过免疫电子显微检查HA-阳性和不具有传染性的病毒液体而获得的结果。查证病毒颗粒的存在，并发现病毒颗粒包膜对识别用金胶体标记的HN蛋白的抗体具有活性，但对识别用金胶体标记的F蛋白的抗体不具有活性。
图21显示的图表示将F缺陷病毒颗粒转染至细胞内的结果。
图22显示的图表示形成共表达F和HN的细胞的结果，它是采用Western印迹法进行评价的。LLC/VacT7/pGEM/FHN代表采用pGEM/FHN质体转染疫苗感染的LLC-MK2细胞而获得的细胞。LLCMK2/FHNmix代表已引入F和HN基因但不克隆的LLC-MK2细胞。LLC/FHN代表已引入F和HN基因并由腺病毒引入表达(三天后)的LLC-MK2细胞。1-13、2-6、2-16、3-3、3-18、3-22、4-3和5-9为在克隆中细胞系的数字(名称)。
图23显示的图表示确认病毒形成取决于pGEM/FHN的存在或不存在的的结果。将FHN缺陷的GFP表达的SeV cDNA、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和pGEM/FHN混合并引入到LLC-MK2细胞中。在基因转移3小时，用含有Arac和胰蛋白酶的MEM置换培养液然后进一步培养细胞三天。在该基因转移2天后，用实体镜荧光显微镜进行观测以评价根据pGEM/FHN的存在或不存在的差异，并在扩散GFP表达细胞的基础上查证病毒的形成。这里显示了结果。当在重建时加入pGEM/FHN，则识别到GFP-表达的细胞的扩散；但是当不加入pGEM/FHN，只观测到单一细胞的GFP-表达。
图24显示的图表示RNP转染和FHN缺陷的病毒的生长的重建结果。在引入表达后的第三天，采用P0 RNP增加物或DOSPER脂转染共表达FHN(12孔)的细胞，然后在4天后观测GFP。在进行RNP转染时，与对F缺陷细胞(上图)一样成功地收获P1表达FHN的细胞的病毒。在将含有病毒的液体接种到在用Ade/Cre感染的6或更多小时后引入FHN蛋白质的表达的细胞中以后，查证FHN缺陷的病毒的生长。
图25显示的图表示了将含有从FHN缺陷的GFP表达的cDNA重建的病毒的液体接种到LLC-MK2、LLC-MK2/F、LLC-MK2/HN和LLC-MK2/FHN，并在存在或不存在胰蛋白酶下培养它们而获得的结果。在培养3天后查证表达GFP蛋白的细胞的扩散。这里显示了结果。仅用LLC-MK2/FHN观测到了GFP的扩散，并因此查证在该液体中所含的病毒的生长方式对FHN共表达具有特异性且取决于胰蛋白酶。
图26的图表示对来自表达FHN的细胞上清液的RNA的基因组结构进行确认的结果。
图27的图表示对来自用FHN缺陷的病毒感染的表达F的细胞上清液的RNA的基因组结构进行确认的结果。
图28的图表示当补骨脂素浓度在补骨脂素/UV照射下变化时牛痘病毒和T7活性的灭活。
图29的图表示当在补骨脂素/UV照射下UV照射的持续时间变化时牛痘病毒和T7 RNA聚合酶活性的灭活。
图30显示的图表示在补骨脂素/UV照射以后牛痘病毒的细胞毒性(CPE)。将3×105的LLC-MK2细胞植到6孔平板上。培养过夜后，用Moi＝2的牛痘病毒感染细胞。24小时后，测定CPE。在A中显示了用牛痘病毒模拟处理的CPE结果。在B、C和D中分别显示了在用牛痘病毒处理15、20或30分钟后的CPE。
图31的图表表示牛痘病毒的UV处理持续时间对仙台病毒的重建效率的影响。
图32的图表表示在仙台病毒的重建实验之后在细胞中残留的能复制的牛痘病毒的滴定度。
图33的图表示采用抗-VSV-G抗体进行Western印迹分析的结果。
图34显示的图表表示采用抗-VSV-G进行流动血细胞计数分析的结果。它表示在AxCANCre感染(moi＝0、2.5、5)后的第四天LLC-MK2细胞系(L1)对引入VSV-G表达的分析结果。使用的主要抗体为抗-VSV-G抗体(MoAb I-1)；次要抗体为FITC标记的抗-小鼠Ig。
图35显示的图表示以下的结果：其中，在用变化数量的AxCANCre(MOI＝0、1.25、2.5、5、10)、恒量的具有F基因缺陷的基因组的假型仙台病毒感染后除去上清液，在VSV-G引入(-)之前和引入(+)之后进一步用将该上清液感染细胞，并在5天后观测表达GFP的细胞。
图36显示的图表示病毒产生数量期间所得的结果。
图37显示的图表示检查通过具有F基因缺陷的基因组的假型的仙台病毒处理，传染性是否受到影响的结果，它是采用VSV-G-表达的细胞系和用抗-VSV抗体处理的FHN缺陷的仙台病毒而得到的。
图38显示的图表示以下结果，其中在采用含GFP基因的F和HN缺陷的仙台病毒感染VSV-G基因表达的细胞LLCG-L1之后，测试GFP基因的表达作为确定在其衣壳中具有VSV-G的假型病毒的产生存在的指数。
图39显示的图表示通过Western分析感染的细胞提取物中的蛋白质确认在VSV-G基因表达细胞内生长的病毒缺陷F和HN基因。
图40显示的图表示在荧光显微镜下观测GFP-表达细胞的结果。
图41的图表表示通过结合使用包膜表达的质体和细胞增加物而改进了SeV/ΔF-GFP的重建效率。在P0(在传代之前)的d3-d4(3天至4天)识别到相当的改进。
图42的图表表示评价通过结合使用包膜表达的质体和细胞增加物而重建SeV/ΔF-GFP的处理条件的结果。GFP-阳性细胞代表重建的病毒数。
图43的图表表示测试从cDNA中拯救F缺陷仙台病毒的结果。它表示通过结合使用包膜表达的质体和细胞增加物而改进了SeV/ΔF-GFP的重建效率。所有的测试在第7天为阳性。但是，在第成功的机率适中的第三天评价效率。
图44显示的图表示含有lacZ、F缺陷但不含有GFP的仙台病毒载体的LacZ表达的结果。
图45显示的图表表示亚克隆仙台病毒基因组cDNA片断(A)和用最新引入的NotI位点(B)构造的5个仙台病毒基因组cDNAs的结构。
图46的图表表示用于克隆以向SEAP加入NotI位点、转录起始信号、间插序列和转录终止信号的质体的结构。
图47显示的图表示各仙台病毒载体的噬斑分析的结果。它显示了由LAS1000得到的在噬斑分析中的部分荧光图。
图48的图表表示各仙台病毒载体之间彼此比较报道基因(SEAP)变化的表达水平的结果将SeV18+/SEAP的数据看作100，而各个表示都是相对于它的。已发现在将SEAP置于更下游时，活性即表达水平减小。
图49显示的显微图表示在共表达FHN的P1细胞内GFP的表达。
图50显示的图表示采用抗F抗体(抗F)、抗HN抗体(抗HN)和抗仙台病毒抗体(抗仙台病毒)，对由VSV-G假型的Sev/F：GFP感染的细胞提取物进行Western印迹法分析的结果。
图51显示的图表示在存在或不存在中和抗体(VGV抗体)的情况下被VSV-G假型SeV感染的F和HN缺陷的细胞上发出的荧光。
图52显示的图表示Westem分析由密度梯度超离心而分离出来的，具有F基因缺陷或F和HN基因缺陷的基因组的VSV-G假型仙台病毒的结果。
图53显示的图表示由具有F基因缺陷的基因组的仙台病毒、或F基因缺陷或者F基因和HN基因缺陷的基因组的假型仙台病毒参与的血细胞凝集测试。
图54显示的图表示对具有F基因缺陷的基因组的仙台病毒或VSV-G假型的仙台病毒的培养细胞的感染特异性。
图55显示的图表示确认表达NGF、F缺陷仙台病毒(NGF/SeV/F)的结构。
图56的图表表示由被F缺陷SeV感染的含NGF的细胞表达的NGF的活性。经最初的培养，将SeV感染的细胞或NGF蛋白(对照)的稀释上清液加至一个分离的基本鸡脊神经后根神经节(DRG)神经元培养物上。三天后，采用线粒体减少活性作为指数(n＝1)来计算存在活的细胞。加入的培养上清液的数量相当于1000倍的稀释液。
图57显示的图表示被F缺陷SeV感染的含NGF的细胞表达的NGF的活性。经最初的培养，将SeV感染的细胞或NGF蛋白(对照)的稀释上清液加至一个分离的基本鸡脊神经后根神经节(DRG)神经元培养物上。三天后，在显微镜下观测试样。
A)对照(不含NGF)；
B)加入NGF蛋白(10ng/ml)；
C)加入NGF/SeV感染的细胞的培养上清液(100倍稀释)；
D)加入NGF/SeV感染的细胞的培养上清液(100倍稀释)；
E)加入NGF/SeV/F感染的细胞的培养上清液(100倍稀释)，和；
F)加入NGF/SeV/F感染的细胞的培养上清液(100倍稀释)。
图58的图表示Ad-Cre的Moi和F蛋白的表达水平。
图59显示的图表示通过Adeno-Cre的LLC-MK2/G的表达。
图60的图表示在传代期间的表达持久性。
图61的图表示F在传代期间的F蛋白的定位。
图62的图表表示GFP-CIU和抗-SeV-CIU之间的联系。
               本发明的最佳实施方式
以下参照实施例对本发明的进行详细地例举，但不要理解为是对本发明的限制。
[实施例1]构建F缺陷仙台病毒
<1>构建F缺陷SeV基因组cDNA和表达F的质体
用SphI/KpnI消化仙台病毒的全长度基因组cDNA(SeV)，pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 78：2813-2820)(＂pSeV18+b(+)＂也称为＂pSeV18+＂)，回收所得的片断(14673bp)并克隆至PUC18中，称它为质体PUC18/KS。其F破裂位点建构在PUC18/KS上。结合使用PCR-连接方法进行F基因的破裂，结果是除去了F基因(ATG-TGA＝1698 bp)的ORF；将atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO：1)连接它上面以构建F缺陷SeV基因组cDNA(pSeV18+/F)。在PCR中，将采用引物对(正向：5’-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO：2，逆向：5′-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO：3)产生的PCR产物上游连接到F基因上，而将由引物对(正向：5’-atgcatgccggcagatga/SEQ IDNO：4，逆向：5’-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO：5)产生的另一PCR产物上游连接到F基因的EcoT22I位点。用SacI和SalI消化所得的质体，然后回收生成含有F破裂位点的区域的片断(4931bp)并克隆至PUC18中以产生PUC18/dFSS。用DraIII消化该PUC18/dFSS。回收所得的片断，用来自pSeV18+的含有F基因的区域的DraIII片断取代，并进行连接以产生质体pSeV18+/F。
为了进一步建构已在F破裂位点引入EGFP的cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP)，通过PCR扩增EGFP基因。为了设置具有6的倍数的EGFP基因(Hausmann，S.et al.，RNA 2，1033-1045(1996))，在5′端采用NsiI尾随的引物(5’-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac：SEQ ID NO：6)而在3′端采用NgoMIV尾随的引物(5′-Tgccggctattattacttgtacagctcgtc：SEQ ID NO：7)进行PCR。用限制酶NsiI和NgoMIV消化PCR产物，然后从凝胶中回收该片断；将该片断连接到破裂F所处的NsiI和NgoMIV限制酶位点之间的pUC18/dFSS位点，并测定该序列。除去含有EGFP基因的DraIII片断，并从该位点回收，取代pSeV18+的含F基因区域的DraIII片断；然后进行连接以获得质体pSeV18+/ΔF-GFP。
另一方面，通过采用PCR扩增SeV F基因，确认该序列，并插入到质体pCALNdlw的独特位点SwaI来建构用于F基因表达的Cre-loxP引入表达质体，(Arai et.al.，J.Virology 72，1998，pll15-1121)，其中已设计采用Cre DNA重组酶引入基因产物的表达，以得到质体pCALNdLw/F。
<2>制备引入SeV-F蛋白表达的辅助细胞
为了回收来自F缺陷基因组的传染性病毒颗粒，建立一种表达SeV-F蛋白的辅助细胞菌株。所用的细胞为常用于SeV生长的LLC-MK2细胞和来自猴肾的细胞菌株。在含有10％热处理灭活的牛胎血清(FBS)、青霉素钠G(50单位/ml)和链霉素(50μg/ml)的MEM中于37℃和5％的CO2气体下培养该LLC-MK2细胞。由于SeV-F基因产物有细胞毒性，因而采用磷酸钙法(根据基因转移方案的哺乳动物转染试剂盒(Stratagene))将上述的设计用于通过Cre DNA重组酶引入F基因产物的表达的质体pCALNdLw/F引入到LLC-MK2细胞中。
将10μg质体pCALNdLw/F引入到10cm的平板中的生长到40％融合的LLC-MK2细胞，在保温箱中在10ml含有10％的FBS的MEM中于37℃和5％的CO2气体下培养该细胞24小时。24小时后，刮去细胞，将其悬浮在10ml的培养液中；然后将细胞植入5个具有10cm直径的皿(一个5ml的皿，二个2ml的皿，二个0.2ml的皿)的含有10ml 10％的FBS和1200μg/ml的G418(GIBCO-BRL)的MEM中以进行培养。培养持续14天，同时每2天间隔换一次培养液，以选择已稳定引入基因的细胞系。采用克隆环回收30个细胞菌株作为在培养液生长的抗G418细胞。在10cm的平板中将每一克隆培养至融合。
在采用表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒AxCANCre感染各克隆以后，如以下通过Western印迹法采用抗-SeV-F蛋白单克隆IgG(f236；J.Biochem.123：1064-1072)测试各细胞的SeV-F蛋白表达。
在6cm的皿中生长至融合以后，根据Saito等人的方法在moi＝3处采用腺病毒AxCANCre感染各克隆(Saito etal.，Nucl.Acids Res.23：3816-3821(1995)；Arai，T.et al.，JVi.rol 72，1115-1121(1998))。在感染之后，培养细胞3天。弃去培养上清液并用PBS缓冲剂洗涤细胞两次，用刮棒刮去细胞，并在1500x g下离心五分钟来收集细胞。
在-80℃下保存细胞且在需要时可将其融化。将收集到的细胞悬浮在150μl的PBS缓冲剂中，向其加入相当于2×Tris-SDS-BME样品装载量的缓冲剂(0.625M Tris、PH6.8、5％SDS、25％2-ME、50％甘油、0.025％BPB；OWL)。在98℃下热处理该混合物3分钟，然后将其用作电泳试样。通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Multi Gel 10/20，Daiichi Pure Chemicals)电泳而分离出试样(1×105细胞/通道)。通过半干燥印迹法将分离的蛋白转移到PVDF转移膜(Immobilon-P转移膜；微孔)。在恒定的电流1mA/cm2下在已在100％甲醇中浸泡30秒，然后在水中浸泡30分钟的转移膜上进行转移1小时。
在含有0.05％Tween 20和1％BSA(BlockAce；Snow BrandMilkProducts)阻断溶液摇晃该转移膜1小时，然后在室温下用已被1000倍的含有0.05％Tween 20和1％BSA的阻断溶液稀释的抗-SeV-F抗体(f236)培养2小时。在20ml的PBS-0.1％Tween 20中洗涤该转移膜3次，同时摇晃5分钟，然后在PBS缓冲剂中洗涤同时摇晃5分钟。将该转移膜在10ml用含有0.05％Tween 20和1％BSA的阻断溶液稀释2000倍的过氧化酶连接的抗小鼠IgG抗体(山羊抗小鼠IgG；酶)中培养1小时。用20ml的PBS-0.1％Tween 20中洗涤该转移膜3次，同时摇晃5分钟，然后在PBS缓冲剂中洗涤同时摇晃5分钟。
采用化学发光法检测在转移膜上与该抗-SeV-F抗体交叉反应的蛋白(ECL western印迹检测试剂；Amersham)。结果如图1所示。检测对AxCANCre感染具有特异性的SeV-F表达以确认引入SeV-F基因产物表达的LLC-MK2的形成。
通过流式细胞术，采用抗-SeV-F抗体分析多种所得细胞系之一的LLC-MK2/F7细胞(图2)。具体而言，通过在15,000rpm下于4℃下离心5分钟而沉淀出1×105细胞，用200μl的PBS洗涤，并使其在含有100倍稀释的抗F单克隆抗体(f236)、0.05％叠氮化钠、2％的FCS的FACS(NIKKEN CHEMICALS)的PBS中于4℃下在黑暗处反应一小时。再次将该细胞在15,000rpm下于4℃下离心5分钟，用200μl的PBS洗涤，然后使其在冰上与1μl/ml的FITC标记的抗小鼠IgG(CAPPEL)反应30分钟。再次用200μl的PBS洗涤该细胞，然后将该细胞在15,000rpm下于4℃下离心5分钟。将该细胞悬浮在1ml FACS的PBS中，然后采用EPICS ELITE(计数器)氩激光在488nm的激发波长和525nm的荧光波长处分析。结果表明LLC-MK2/F7以对SeV-F基因表达引入特异性的方式表现出对抗体的高度活性，并因此查证在细胞表面表达SeV-F蛋白。
[实施例2]确认由辅助细胞表达的SeV-F蛋白的功能
测试由辅助细胞引入其表达的SeV-F蛋白是否保持了来源蛋白的功能。
在放置于6cm的皿中并生长至融合以后，根据Saito等人的方法用腺病毒AxCANCre在moi＝3处感染LLC-MK2/F7细胞(上述)。然后在保温箱中在含有腺蛋白酶(7.5μg/ml；GIBCOBRL)的MEM(不含血清)中于37℃和5％的CO2气体下培养该细胞三天。
弃去培养上清液并用PBS缓冲剂洗涤细胞两次，用刮棒刮去细胞，并在1500x g下离心五分钟来收集细胞。用上述的Western印迹法查证被表达的F蛋白的破裂(图3)。合成SeV-F作为非活性蛋白前体F0，然后在通过胰蛋白酶进行蛋白分解而该前体消化至两个亚单元F1和F2中之后将该前体活化。与普通的细胞一样，在引入F蛋白表达之后的LLC-MK2/F7细胞因而继续表达F表达，即使在被传代之后，没有观测到由被表达的F蛋白调节的细胞毒性，也没有观测到表达F蛋白的细胞发生细胞融合。但是，在将SeV-HB表达质体(pCAG/SeV-HN)转染至表达F的细胞并在含有胰蛋白酶的MEM中培养该细胞三天时，频繁的观测到细胞融合。在采用吸附到细胞表面的红细胞的实验中确认了在该细胞表面的HN的表达(血吸附测试；Had测试)(图4)。具体而言，将1％的鸡红细胞以1ml/皿的浓度加到培养细胞中并使该混合物在4℃下静置10分钟。用PBS缓冲剂洗涤该细胞3次，然后在该细胞表面观测到红细胞群。在红细胞聚集的细胞确认了细胞融合；已发现通过F蛋白与HN的相互作用引入了细胞融合；因此表明在LLC-MK2/F7中保留其表达的F蛋白仍保留了它的原始功能。
[实施例3]含有F缺陷基因组的功能性RNP和病毒颗粒的形成
为了从该缺陷病毒上回收病毒颗粒，有必要使用表达该缺陷蛋白的细胞。因此，尝试采用表达该缺陷蛋白的细胞回收该缺陷病毒，但是发现采用辅助细胞系的F蛋白的表达由于在F缺陷SeV的重建中所用的牛痘病毒而快速终止(图5)，并因此使以辅助细胞系直接提供F蛋白为基础的病毒的重建失败。已报道牛痘病毒的复制能力被灭活，但T7表达的活性没有因在加入补骨脂素下采用长波长紫外光线(长波UV)而进行的牛痘病毒处理(PLWUV处理)而受损(Tsung et al.，J Virol 70，165-171，1996)。因此，尝试采用PLWUV处理的牛痘病毒(PLWUV-VacT7)进行病毒的重建。采用配有5个15瓦灯泡的UV Stratalinker 2400(Catalog No.400676(100V)；Stratagene，La Jolla，CA，USA)进行紫外光线照射。结果表明F蛋白的表达由于在该重建中所用的表达F的细胞而受到抑制，但在来自用该PLWUV-VacT7重组的细胞的溶解产物被感染至该辅助细胞以后在araC的存在下疫苗几乎不生长，并且还发现采用辅助细胞系的F蛋白的表达几乎不受到影响。而且，采用该PLWUV-VacT7的野生型SeV的重建可以实现从甚至103个细胞中回收病毒，而采用先前的方法这是不可能的除非存在105或更多的细胞，因此大大改进了病毒重建的效率。因此，尝试采用该方法进行缺陷SeV病毒的重建。
<F缺陷SeV病毒的重建和扩增>
用在上述的pSeV18+/ΔF-GFP转染LLC-MK2细胞以后观测GFP的表达，其中已根据6n规则以下述的方式往F破裂的位点引入增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报道基因。还测试了存在作为RNP形成中所需的三种组分，病毒衍生的基因NP、P和L的影响。
将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿的浓度置于100mm陪替氏培养皿中并培养24小时。在培养完成后，用补骨脂素和长波(365nm)紫外光线处理该细胞20分钟，并用表达T7 RNA聚合酶(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))的重组牛痘病毒在室温下感染该细胞1小时(moi＝2)(moi＝2-3；优选moi＝2)。在洗涤该细胞三次以后，将质体pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A.et al.，Genescells 1,569-579(1996))分别以12μg、4μg、2μg和4μg/皿的量悬浮在OptiMEM(GIBCO)中；向其加入SuperFect转染试剂(1μgDNA/5μlSuperFect；QiAGEN)；将该混合物在室温下静置10分钟；然后将其加到3ml含有3％FBS的OptiMEM中；向其加入细胞并培养。采用野生型SeV基因组cDNA(pSeV(+))(Kato，A.et al.，Genes cells 1,569-579(1996))作为对照代替pSeV18+/ΔF-GFP。在培养3小时后，用不含血清的MEM洗涤该细胞两次，然后在含有胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，40μg/ml；Sigma)和胰蛋白酶(7.5μg/ml；GIBCO)的MEM中培养70小时。收获这些细胞，并将这些粒状物悬浮在OptiMEM(107细胞/ml)中。在冷冻和融解处理重复3次以后，用脂转染试剂DOSPER(Boehringer Mannheim)(106细胞/25μl DOSPER)混合这些细胞，并使其在室温下静置15分钟。然后转染表达F的LLC-MK2/F细胞系(在12孔平板为106细胞/孔)，在不含血清的MEM(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)中培养该细胞。
结果表明，仅在存在来源于该病毒的所有组分，NP、P和L时才确认GFP的表达，并可以产生表达外源基因的缺陷病毒RNP(图6)。
<确认F缺陷病毒颗粒>
测试通过表达F的辅助细胞是否可以拯救采用上述方法由F缺陷基因组cDNA重建的功能性RNP，并形成F缺陷病毒的传染性病毒颗粒。用阳离子脂质体混合细胞溶解产物；如上述，在形成功能性RNP的条件下(PSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L同时被转染的条件)或不形成功能性RNP的条件下(两种质体pSeV18+/ΔF-GFP和pGEM/NP被转染的条件)通过冷冻/融化从重建的细胞中制得该溶解产物；将该溶解产物脂转染到表达F的细胞和不表达的细胞中；根据表达GFP的细胞分布的扩散来观测病毒颗粒的形成。结果表明仅在采用于重建功能性RNP的条件下获得的溶解产物而引入表达F的细胞的时候识别到了表达GFP的细胞的分布的扩散(图7)。而且，即使在噬斑测定中，仅在相同的条件下看到噬斑的形成。根据这结果，揭示了由F缺陷病毒基因组产生的功能性RNPs在来源于表达F的细胞的F蛋白的存在下进一步转化成传染性病毒颗粒并从该细胞中释放出该颗粒。
通过以下的实验表明在培养上清液中存在传染性F缺陷病毒颗粒。如实施例2所述，将含有由F基因缺陷的基因组构建的功能性RNP的溶解产物脂转染到表达F的细胞中，并回收该培养上清液。将该培养上清液加到表达F的细胞中以获得感染；在第三天，回收该培养上清液并同时将其加到表达F的细胞和不表达F的细胞上；然后在胰蛋白酶存在或不存在下培养三天。在表达F的细胞中，仅在存在胰蛋白酶下扩增病毒(图8)。还发现非传染性病毒释放到不表达F的细胞上清液中(在图9的下图)或从不存在胰蛋白酶下培养的表达F的细胞中释放出来。以上说明的总结如下：F缺陷表达GFP的病毒的生长对表达F的细胞具有特异性并取决于采用胰蛋白酶的蛋白水解。如此生长的传染性F缺陷仙台病毒的滴定度范围为0.5×107-1×107CIU/ml。
[实施例4]分析F缺陷表达GFP的病毒
为了确认从F缺陷cDNA中回收的病毒颗粒的基因组结构，从表达F的细胞培养上清液中回收病毒，提取全部RNA并采用F和HN作为探针进行Northern印迹分析。结果表明在从表达F的细胞上收获的病毒中HN基因是可检测的，但F基因是不可检测的，它表明在该病毒基因组中不存在F基因(图10)。而且，通过RT-PCR GFP，如在cDNA的建构中所示，已确认在F的检测位点存在该基因(图11)，而其它基因的结构与野生型的结构相同。根据上述发现，已表明在病毒重建过程中没有发生基因组的重排。此外，通过电子显微镜检查回收的F缺陷病毒颗粒的形态。与野生型病毒相似，F缺陷病毒颗粒内部具有螺旋状RNP结构和峰样结构(图14)。而且，通过免疫电子显微法，采用与F或HN特异性反应的金胶体连接的IgG(抗-F、抗-HN)检查这些病毒。结果表明，该病毒包膜的峰样结构包括F和HN蛋白(图12)，这表明该病毒颗粒中有效地结合了由辅助细胞产生的F蛋白。以下将详细描述该结果。
<检查全部RNA、Northern印迹分析和RT-PCR>
根据该方案，从利用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(QIAGEN)，用该病毒感染表达F的细胞LLC-MK2/F7的3天后得到的培养上清液提取全部RNA。在1％的含有甲醛的变性琼脂糖凝胶中通过电泳分离该纯化的全部RNA(5μg)，然后在一真空印迹仪器(Amersham-Pharmacia)中将其转移到Hybond-N+膜上。用0.05M的NaOH固定所制得的膜，用2倍稀释的SSC缓冲剂(Nacalai tesque)冲洗，然后在杂交溶液(BoehringrerMannheim)中使其预杂交30分钟；向其加入采用地高辛配基(DIG)-dUTP(碱敏感性)由随机引物DNA标记(DIG DNA标记试剂盒；BoehringerMannheim)制得的F或HN基因探针，然后进行杂交16小时。接着，洗涤该膜，并使其与碱性磷酸酶结合的抗-DIG抗体(抗地高辛配基AP)反应；采用DIG检测试剂盒进行分析。结果表明在从表达F的细胞中收获的病毒中可检测HN基因但不可检测F基因，它表明在该病毒基因组中不存在F基因(图10)。
进一步地，采用RT-PCR进行详细地分析。根据该方案，在RT-PCR中，首先采用SUPERSCRIPTII预扩增系统(Gibco BRL)从该纯化的病毒RNA中合成链cDNA；采用LA PCR试剂盒(TAKARA ver2.1)并使用以下的PCR条件：94℃/3分；30次循环94℃/45秒、55℃/45秒、72℃/90秒的扩增；在72℃下培养10分钟；然后将该试样在2％的琼脂糖凝胶中在100v下电泳30分钟，用溴化乙锭固定该凝胶以进行照相成像。插入到F缺陷位点的用于确认M基因和EGFP的引物是正向1：5′～atcagagacctgcgacaatgc(SEQ ID NO：8)和逆向1：5′-aagtcgtgctgcttcatgtgg(SEQ ID NO：9)；用于确认插到F缺陷位点的EGFP和HN基因的引物为正向2：5’-acaaccactacctgagcacccagtc(SEQ ID NO：10)和逆向2：5′-gcctaacacatccagagatcg(SEQ ID NO：11)；而采用正向3：5′-acattcatgagtcagctcgc(SEQ ID NO；12)逆向2引物(SEQ ID NO：11)确认M基因和HN基因之间的连接。结果表明在F缺陷位点存在GFP基因，如cDNA的结构所示(图11)，而其它基因与来自野生型的基因相同(图13)。以上所示的发现表明在病毒的重建期间没有发生基因组的重排。
<采用金胶体连接的免疫球蛋白的电子显微分析>
用电子显微镜检查回收的F缺陷病毒颗粒的形态。首先，将用该缺陷病毒感染的细胞的培养上清液于28,000rpm下离心30分钟以获得病毒颗粒，然后将该颗粒再次悬浮在10倍量稀释的浓度为1×109HAU/ml的PBS中；将一滴该悬浮液滴到具有一个支承过滤器的微细网眼上，然后在室温下干燥该网眼；用含有3.7％的福尔马林的PBS处理该网眼15分钟以进行固定，然后用含有0.1％的BSA的PBS溶液预处理30钟；进一步将用相同的溶液200倍稀释的抗-F单克隆抗体(f236)或抗-HN单克隆抗体(Miura，N.et al.，Exp.Cell Res.(1982)141～409-420)滴到该网眼上并使其在潮湿条件下反应60分钟。接着，用PBS洗涤该网眼，然后用无菌蒸馏水洗涤，并在室温下风干；将4％的乙酸铀溶液放在该网眼上染色2分钟并将该网眼干燥；在JEM-1200EXII电子显微镜(JEOL.)观测并拍摄试样。结果表明病毒包膜的峰样结构包括F和HN蛋白(图12)，它说明已将由辅助细胞产生的F蛋白有效地结合到病毒颗粒上。此外，与野生型病毒类似，F缺陷病毒颗粒内部具有螺旋RNP结构和峰样结构(图14)。
[实施例5]在体内通过F缺陷SeV载体将高效基因转移到各种细胞上
<引入到大鼠大脑皮质神经细胞的基本培养细胞>
如下制备并培养大鼠大脑皮质神经细胞的基本培养细胞：用二乙醚深度麻醉在怀孕第18天的SD大鼠(SPF/VAF Crj：CD，雌性，332g，至多9周大；Charles River)，然后从腋动脉放血将其处死。从腹部后的子宫移出胎儿。切下颅皮和骨并取出大脑。在立体显微镜下将小脑半球转移到工作溶液DMEM(含5％的马血清、5％小牛血清和10％的DMSO)；将它们切下并向其加入冰冻的木瓜蛋白酶溶液(1.5U，0.2mg的半胱氨酸，0.2mg的牛血清清蛋白，5mg的葡萄糖，0.1mg/ml的DNase)；将含有该切片组织的溶液培养15分钟，同时在32℃下通过反转小瓶而摇晃15分钟。在查证悬浮液已充分混浊而组织部分半透明时，用移液管将该组织部分压碎成小片。将该悬浮液在1200rpm下于30℃下离心5分钟，然后将该细胞再次悬浮在B27-补充的神经基本培养液(GibcoBRL，Burlington，Ontario，Canada)。将该细胞置于涂有聚-d-赖氨酸的密度为1×105细胞/皿的平板上(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA，U.S.A.)，然后在37℃下在5％的CO2下培养。
在来自大脑皮质神经细胞(5×105/孔)基本培养物培养5天后，用F缺陷SeV载体(moi＝5)感染该细胞并进一步培养3天。在室温下在含有1％的低聚甲醛、5％的山羊血清和0.5％的Triton-X的固定溶液中将该细胞固定5分钟。在室温下采用BlockAce(Snow Brand Milk Products)进行阻断反应2小时，然后在室温下用500倍稀释的山羊抗大鼠微管相关的蛋白2(MAP-2)(Boehringer)IgG培养1小时。进一步用PBS(-)洗涤该细胞15分钟，然后在室温下用被5％的山羊血清/PBS作100稀释的cys3-连接的抗小鼠IgG培养1小时。进一步地，在用PBS(-)洗涤该细胞15分钟后，往该细胞中加入Vectashield封固剂(Vector Laboratories，Burlingame，U.S.A.)；用同焦显微镜(Nippon Bio-Rad MRC 1024，Japan)和配备470-500nm或510-550nm的激发带通滤波器反转Nikon Diaphot 300荧光观测已被MAP-2免疫染色和GFO荧光双染色的细胞。结果表明已在大约100％的MAP2-阳性的神经细胞中引入了GFP。
<引入到正常人细胞中>
从DAINIPPON PHARMACEUTICAL购得正常人平滑肌细胞、正常人肝细胞和正常人肺毛细血管内皮细胞(细胞系统)，并在37℃和5％的CO2气体下用SFM CS-C培养基试剂盒(细胞系统)培养。
用F缺陷SeV载体(m.o.i＝5)感染正常人平滑肌细胞(图15，肌肉)、正常人肝细胞(图15，肝)和正常人肺毛细血管内皮细胞(图15，肺)，然后观测GFP的表达。已查证引入效率大约为100％，而在所有的细胞中以非常高的水平表达GFP基因(图15)。
<引入到小鼠基本骨髓细胞中>
进一步进行实验，其中利用血统标记分离小鼠基本骨髓细胞，并用F缺陷SeV载体对其进行感染。首先，通过腹膜内注射(IP注射)给予C57BL小鼠(6周大雄性)150mg/kg剂量的5-氟尿嘧啶；在给药2天以后，从股骨中收集骨髓细胞。采用Lympholyte-M(Cedarlane)通过密度梯度离心法分离单核细胞。将已涂有生物素标记的抗-CD45R(B220)、抗-Ly6G(Gr-a)、抗-Ly-76(TER-119)、抗-1(Thyl.2)和抗-Mac-1的链霉抗生物素蛋白-磁性玻珠(Pharmingen；Funakoshi)的混合物加到该单核细胞(3×106细胞)，将所得的混合物在4℃下反应1小时；回收已用磁体除去其Lin+细胞的部分(Lin-细胞)(Erlich，S.et al.，Blood 1999，93(1)，80-86)。往4×105的Lin-细胞中加入2×107HAU/ml的SeV，进一步向其加入重组大鼠SCF(100ng/ml，BRL)和重组人IL-6(100 U/ml)。此外，将4×107HAU/ml的F缺陷SeV加到8×105的全骨髓细胞中，将5×107HAU/ml的GFP-SeV加到1×106细胞中。通过插入PCR扩增的NotI片断制得GFP-SeV，它含有绿色荧光蛋白(GFP)基因(该结构基因的长度为717bp)，在该基因的SeV转录单元pUC18/T7HJRz.RNA(+18)的限制酶NotI分解位点加入转录起始(R1)、终止(R2)信号和间插(IG)序列(Genes Cells，1996，1：569-579)。根据已知的方法(Genes Cells，1996，1：569-579)，采用LLC-MK2细胞和含胚卵进行含有GFP基因的病毒的重建，然后回收含有有用基因的病毒。在用GFP-SeV感染后经48小时的培养，将细胞分成两组；其中一组与藻红蛋白(PE)标记的抗-CD117(c-试剂盒；Pharmingen)反应1小时；另一组为对照组。用PBS洗涤该细胞3次，然后在流式血细胞计数器中分析(EPICSElite ESP；Coulter，Miami，FL)。
结果表明已将F缺陷载体感染到富含已被用作血原始干细胞标记的抗-c-抗体的骨髓细胞上，并观测到GFP基因的表达(图16)。通过在往LLC-MK2细胞中加入与胰蛋白酶反应的细胞培养上清液三天后测定表达GFP的细胞的存在，确认了在该培养上清液中存在传染性颗粒。它表明这些细胞都没有释放出传染性病毒颗粒。
[实施例6]脑室的载体给药
通过腹膜内注射用重量盐水(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.)作10倍稀释的(5mg/ml)戊巴比妥钠溶液(Dainabot)将大鼠(F334/Du Crj，6周大，雌性，Charles River)麻醉。对于小动物(DAVID KOPF)采用大脑趋实体性容器给予病毒。在距离耳间线的前囟5.2mm、距离人字缝尖右耳2.0mm、大脑表面下2.4mm的点，采用30G可交换探针(Hamilton)注射20μl(108CIU)。在室管膜细胞上观测到了GFP蛋白的高水平表达(图17)。而且，在F缺陷SeV载体的情况下，仅在与病毒发生接触的室管膜细胞或注射位点周围的神经细胞上观测到GFP蛋白的表达，而在该区域没有发现损害。直到解剖时在给药的大鼠上没有到行为和体重变化的异常。在解剖后，在大脑或任何被分析的组织和器官如肝、肺、肾、心、脾、胃、肠等没有发现损害。
[实施例7]由F缺陷SeV基因组形成F缺陷病毒颗粒
                                                      <1>
用F缺陷SeV病毒感染不表达F的LLC-MK2细胞和表达F的LLC-MK2细胞(LC-MK2/F7)并采用(+)或不采用(-)胰蛋白酶培养。在图18A中显示了3天后细胞培养上清液的HA测定结果。将该培养上清液接种到含胚鸡蛋中，在图18中显示了2天的培养后绒毛尿囊液的HA测定的结果。上方图的“C”代表用作对照组的PBS。在“Dilution”下显示的数字表示该病毒溶液的稀释倍数。进一步地，将含胚鸡蛋(通道11和12)中的HA阳性绒毛尿囊液再次接种到含胚鸡蛋中，并在培养两天后，采用HA测定检查该绒毛尿囊液(图19C)。结果是发现不表达F的细胞或被F缺陷SeV病毒感染的含胚鸡蛋为HA阳性。但是，如果该HA-阳性病毒溶液不具有二次传染性的话，则病毒在被接种到含胚鸡蛋以后并不繁殖。
                                                        <2>
检查在不表达F的细胞内扩增的非传染性病毒溶液中病毒颗粒的存在。采用QIAamp病毒RNA微试剂盒(QIAGEN)，利用F基因和HN基因作为探针，对由来自表达F的细胞、HA-阳性、非传染性绒毛尿囊液和野生型SeV的培养上清液制得的全部RNA进行Northern印迹分析。结果是，在将HN基因用作探针时检测到了来自表达F的细胞培养上清液的绒毛尿囊液或病毒的RNA的光谱带(图10)。它证明HA-阳性、非传染性液体含有具有F缺陷基因组的非传染性病毒样颗粒。进一步地，通过免疫电子显微镜法分析HA-阳性、非传染性病毒溶液揭示了病毒颗粒和与识别金胶体标记的HN蛋白的抗体反应的病毒颗粒包膜的存在(图20)。该结果表明F缺陷病毒颗粒的存在，证明即使不存在F蛋白，该病毒可以单独形成为具有HN基因的病毒颗粒(Leyer，S.et al.，J Gen.Virol79，683-687(1998))，而该结果第一次证明了可以单独用HN蛋白形成SeV病毒颗粒。因此，在含胚鸡蛋中可以批量地瞬间产生F缺陷病毒颗粒的事实表明可以批量地产生包装SeV F缺陷的RNP的病毒粒子。
<3>如上所述，在含胚鸡蛋中瞬间扩增的F缺陷病毒颗粒对由仙台病毒感染的细胞不具有传染性。为了确认功能性RNP结构包装在包膜中，用阳离子脂质体(DOSPER Boehringer Mannheim)混合表达F的细胞和不表达的细胞，并在室温下通过培养15分钟而进行转染。结果是，在不用阳离子脂质体混合该细胞时根据观测不到表达GFP的细胞，而用阳离子脂质体混合时所有的细胞都不表达GFP。在不表达F的细胞中，仅在个别细胞中观察到GFP表达，且这种表达并没有扩张到相邻细胞，而在表达F的细胞中，表达GFP的细胞扩张形成了菌群(图21)。因此，显然在含胚鸡蛋中瞬间扩增的非传染性病毒颗粒在采用诸如转染的方法被引到细胞时不能表达基因。
[实施例8]从FHN缺陷的SeV基因组中重建和扩增病毒
<构建FHN缺陷的基因组cDNA>
为了构建FHN缺陷的SeV基因组cDNA(pSeV18+/FHN)，首先用EcoRI消化PUC18/KS以构建PUC18/Eco，然后检测从F基因的起始密码子至HN基因的终止密码子的全序列(4866-8419)，接着将其连接到BsiwI位点(cgtacg)。在用碱基序列确认FHN检测区域的序列以后，从凝胶中回收EcoRI片断(4057bp)以取代PUC18/KS的EcoRI片断，从而完成构建。从凝胶中回收含有FHN检测区域的KpnI/sphI片断(14673bp)以取代pSeV18+的KphnI/SphI片断，从而获得质体pSeV18+/FHN。
另一方面，如下完成构建由GFP引入的的FHN缺陷的SeV cDNA。从pSeV18+/FHN中回收SalI/XhoI片断(7842bp)，将其克隆至pGEM11Z(Promega)。将所得的质体称为pGEM11Z/SXdFHN。通过BsixI酶的消化将在d2EGFP的ATG-TAA(846bp)的两端具有BsixI位点的PCR产物(Clontech)连接到pGEM11Z/SXdFHN的FHN缺陷的位点。所得的质体称为pSeV18+/FHN-d2GFP。
<建立FHN缺陷、蛋白质共表达的细胞系>
表达F基因的质体与用于建立FHN缺陷、蛋白质共表达的细胞系的质体，并类似地构建表达HN基因的质体，并将HN的含有ORF的片断插入到pCALNdlw(Arai et al.上述)的独特的SwaI位点以得到称为pCALNdLw/HN的质体。
根据制造者的方案，将LLC-MK2细胞与等量或不同比率的pCALNdLw/F和pCALNdLw/HN混合，以采用哺乳动物转染试剂盒(Stratagene)引入基因。在用G418进行三周的选择之后克隆细胞。用表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒(Ade/Cre，Saito et al.，上述)(moi＝10)感染所得的抗药克隆。接着在用PBS(-)洗三次后，诱发F和HN蛋白的表达三天，之后收集这些细胞，采用Western印迹法使用单抗SeV-F蛋白和抗-SeV HN蛋白的单克隆IgG探测它们(图22)。
<构建pGEM/FHN>
将用于构建pCALNdLw/F和pCALNdLw/HN的F和HN片断克隆至pGEM4Z和pGEM3Z(Promega)以分别获得pGEM4Z/F和pGEM3Z/F。回收通过PvuII消化含有T1启动子和pGEM3Z/HN的HN的区域而获得的片断，并连接到在pGEM4Z/F的F基因下游的SacI独特位点削切的平位点。通过Western印迹法采用在以相同方向排列时同时被表达的抗-F或抗HN单克隆抗体确认F和HN蛋白。
<FHN缺陷的病毒的重建>
以两种方式进行FHN缺陷的病毒的重建。一种是采用如在F缺陷病毒的重建中所用的RNP转染方法，另一种是采用T7以提供共表达质体。同时，在T7启动子的调节下，分别构建表达F和HN蛋白的质体，并采用提供用于重建的质体F和HN蛋白。在两种方法中，通过FHN共表达细胞扩增重建的病毒。以12μg/10cm皿、4μg/10cm皿、2μg/10cm皿、4μg/10cm皿和4μg/10cm皿(最终容积，3ml/10cm皿)的比率混合FHN缺陷、表达GFP的SeV cDNA(pSeV18+/FHN-d2GFP)、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和pGEM/FHN以与上述的F缺陷SeV重建的方式将基因引入到LLC-MK2细胞中。在引入基因3小时后，将培养液换成含有AraC(40μg/ml，SIGMA)和胰蛋白酶(7.5μg/ml，GIBCO)的MEM，并进一步培养3天。在基因引入2天后采用荧光立体显微镜进行观测，通过扩散表达GFP的细胞确认病毒的形成。结果是，如果在重建时加入pGEM/FHN，则观测到表达GFP的细胞的扩散，而如果不加入pGEM/FHN而没有观测到该扩散，且仅在单一细胞上观测到GFP表达(图23)。它表明在FHN重建时的加入导致病毒颗粒的形成。另一方面，在RNP转染的情况下，与在F缺陷情况上一样，在P1的表达FHN的细胞上成功地完成病毒回收(图24，上图)。
在用FHN缺陷的病毒溶液感染被引入以在Ade/Cre感染的6或更多小时之后表达FHN蛋白的细胞以后确认病毒的扩增(图24，下图)。
用由FHN缺陷的表达GFP的SeV cDNA重建的病毒溶液感染LLC-MK2、LLC-MK2/F、LLC-MK2/HN和LLC-MK2/FHN细胞，并在加入或不加入胰蛋白酶的情况下进行培养。在培养3天后，分析表达GFP蛋白的细胞的扩散。结果是，仅在LLC-MK2/FHN中观测到GFP的扩散，确认可以通过FHN共表达和依赖胰蛋白酶的方式扩增该病毒溶液(图25)。
为了确认FHN缺陷的病毒基因组，将从LLC-MK2/FHN细胞上回收的培养上清液离心，根据制造者的方案，采用QIAamp病毒RNA微试剂盒(QIAGEN)提取RNA。采用该RNA利用用于第一链合成的Superscript预扩增系统(GIBCO BRL)进行RT-PCR的模板合成，并采用TAKARA Z-Taq(Takara)进行PCR。将F缺陷病毒用作对照组。选择PCR引物组作为M基因和GFP基因的组合，或M基因和L基因的组合(用于M基因和GFP基因的组合(M-GFP)，正向：5’-atcagagacctgcgacaatgc/SEQ ID NO：13，5’-aagtcgtgctgcttcatgtgg/SEQ IDNO：14；用于M基因和L基因的组合(M-L)，正向：5’-gaaaaacttagggataaagtccc/SEQ ID NO：15，5’-gttatctccgggatggtgc/SEQ IDNO：16)。结果是，在RT条件下在采用M和GFP基因作为引物时在F缺陷和FHN缺陷的病毒上都获得了特定的光谱带。在采用M和L基因作为引物的情况下，检测FHN缺陷的试样的包含GFP的给定大小的光谱带，并检测F缺陷试样的包含HN基因具有该大小的延长光谱带。因此，证明了在基因组结构中FHN缺陷(图26)。
另一方面，与在采用F缺陷病毒的情况类似，用FHN缺陷的病毒感染表达F的细胞，并在4天后回收培养上清液以进行对LLC-MK2、LLC-MK2/F和LLC-MK2-FHN的感染。结果是，在任何被感染的细胞上都没有观测到GFP表达，表明该病毒对这些细胞不具有传染性。但是，已报道F蛋白单独就足以形成病毒颗粒(Kato，A.et al.，Genes cells 1，569-579(1996))，而脱唾液酸糖蛋白受体(ASG-R)调节对肝细胞的特定感染(Spiegel et al.，J.Virol72，5296-5302，1998)。因此，含有FHN缺陷的RNA基因组和仅用F蛋白构造的病毒包膜的病毒被释放到表达F的细胞的培养上清液上。因此，回收用FHN缺陷的病毒感染的表达F的细胞的培养上清液，并在离心之后，如上述提取RNA并采用上述的RT-PCR方法对其进行分析。结果是，如在图27所示，证明了含有FHN缺陷的基因组的RNA的存在。
病毒颗粒变成具有VSV-G的假型的Western印迹分析清楚地表明没有表达F和HN基因。因此可以说，这里建立了FHN缺陷的病毒的病毒颗粒的生产系统。
而且，将从表达F蛋白的细胞中释放的病毒颗粒在与阳离子脂质体(50μl/DOSPER/500μl/孔)混合或不混合的情况下加到表达FHN或不表达的LLC-MK2细胞上。结果是，在作为与DOSPER的混合物加入时观测到表达GFP的细胞的扩散，而HN缺陷的病毒颗粒根本不具有传染性，没有表现出表达GFP的细胞，而这可以在上述F缺陷颗粒的情况下看到。在不表达FHN的细胞中观测到表达GFP的细胞，但没有发现关于病毒重新形成或扩散的证据。
这些从表达F的细胞中回收的病毒样颗粒可以感染持续地表达ASG-R基因的细胞、不表达ASG-R的细胞或肝细胞，并可以采用Spiegel等人的方法检查该感染是肝特异性还是ASG-R特异性。
[实施例9]缺陷基因组RNA病毒载体的应用
1.用F缺陷病毒包膜封闭在上述系统中扩增的F缺陷RNP。可以采用化学修饰方法等等往该包膜上加入任何所需的细胞引入能力，或采用基因引入试剂或基因枪等(RNP转染，或RNP注射)而将该包膜引入到细胞中，并可以复制重组RNA基因组和在细胞中自主和持续地产生蛋白质。
2.可以生产具有特定靶向能力的载体，此时HN的细胞内区域按目前状况在左方，HN的细胞间区域与能以特定的方式靶向作用于其它受体的配体融合，而往病毒基因组中结合能产生化学蛋白的重组基因。此外，可以在产生重组蛋白的细胞中制备该载体。这些载体可用于基因治疗，如作为疫苗等等。
3.由于已成功地完成两种FHN缺陷的SeV病毒的重建，可以通过以下方法制得靶向载体：将该具有靶向能力的包膜嵌合蛋白基因代替GFP基因引入到FHN检测位点，采用与在FHN缺陷的载体的情况下对它进行重建，在F缺陷细胞上扩增产物一次，将产物感染到不表达的细胞上，回收仅由该病毒基因组转录的具有靶向能力的嵌合包膜蛋白形成的病毒颗粒。
4.已报道通过往细胞中引入NP、P、L和F基因形成仙台病毒的微基因组和具有由包装微基因组的F蛋白的病毒颗粒(leyer et al.，J Gen.Virol 79，683-687，1998)。还已报道了这样的载体，其中采用仙台F蛋白将鼠白血病病毒转化为假型(Spiegel et al.，J.Virol 72，5296-5302，1998)。目前还报道了通过ASG-R的调节将胰蛋白酶分解的F蛋白特异性地靶向作用于肝细胞(Bitzer et al.，J.Virol.71，5481-5486，1997)。前一报道是瞬间颗粒形成系统，但它难以持续地回收载体颗粒。虽然Spiegel等人已报道采用仙台F蛋白将后病毒载体转变为假型，但这种方法带来了其固有一些问题如后病毒仅将基因引入到有丝分裂细胞中。本发明中采用共FHN缺陷的SeV病毒基因组回收该病毒颗粒，而且仅有作为包膜蛋白的F蛋白是能够在细胞质中自主地复制而不管细胞有丝分裂的有效RNA载体。它们是新的病毒颗粒，并且是便于大量生产的实用系统。
[实施例10]从FHN缺陷的SeV基因组中重建和扩增病毒
已成功建立从克隆该病毒基因组的cDNA中为许多单链负链RNA病毒如仙台病毒、麻疹病毒重建传染性病毒颗粒的技术。
在大部分的这些系统中，通过往细胞中引入已在T7启动子的下游引入cDNA、NP、P和L基因的质体，并采用T7聚合酶表达cDNA和各基因而进行重建。为提供T7聚合酶，主要采用表达T7聚合酶的重组牛痘病毒。
表T7的牛痘病毒可以在大部分的细胞中有效地表达T7聚合酶。虽然，由于牛痘病毒诱发的细胞毒性，被感染的细胞仅可存活2或3天。在大部分的情况下，将利福平用作一种抗疫苗试剂。在Kato等人的系统中(Kato，A.et al.，Genes cellsl，569-579(1996))，同时使用Arac和利福平以将牛痘病毒生长抑制到最低水平，并有效地重建仙台病毒。
除了仙台病毒，检查腺病毒作为提供T7聚合酶的一种方法，但没有获得良好的效果。牛痘病毒编码在细胞质内作用的RNA封端酶作为除了T7聚合酶之外的自身的酶，但是认为该酶通过将在细胞质内由T7启动子转录的RNA封端而增强翻译的效率。本发明试图采用补骨脂素-长波UV方法处理牛痘病毒而增强仙台病毒的重建效率，从而避免由牛痘病毒引起的细胞毒性。
通过与补骨脂素交联的DNA和长波紫外光线，可以获得这样一种状态，其中具有DNA基因组的病毒的复制被抑制，同时又不特别影响早期基因表达。在该系统中通过活化这些病毒而观察到的显著效果归功于具有长基因组的牛痘病毒(Tsung，K.et al.，J Virol 70，165-171(1996))。
在可以自主繁殖的野生型病毒的情况下，即使是通过重建而形成的单一病毒颗粒，也可以通过将被转染的细胞接种到含胚鸡蛋中而繁殖仙台病毒。因此不必多加考虑重建和该仙台牛痘病毒的效率。
但是，在重建各种用于研究病毒复制、颗粒形成机理等的突变型病毒的情况下，人们不得不使用表达来自病毒等而不是含鸡蛋的蛋白的细胞系，以繁殖该病毒。而且，很可能该突变型病毒或缺陷病毒的繁殖明显比野生型病毒慢。
为了采用这种突变体繁殖仙台病毒，应将被转染的细胞加到其下一代的细胞上并长期培养。在这种情况下，重建效率和牛痘病毒的残留滴定度可能是未定的。在本发明的方法，成功地减少了存活的牛痘病毒的滴定度，同时提高了重建的效率。
采用本发明的方法，可以通过重建(F，FHN缺陷的病毒)而成功地获得在先前的系统中采用未处理的牛痘病毒而未能得到的突变型病毒。本发明的系统可以是可能在未来更多采用的重建突变型病毒的强大武器。因此，本发明者检查了补骨脂素的数量和紫外光线(UV)，以及牛痘病毒灭活的条件。
<实验>
首先，采用固定的2分钟照射时间测试补骨脂素的浓度。通过以下方法测试灭活：由噬斑形成来测定牛痘病毒的滴定度，在T7启动子和仙台病毒的微基因组的控制下由pGEM-Luci质体测定T7聚合酶的活性。仙台病毒的微基因组的T7聚合酶活性的测定是这样一个系统：其中与仙台病毒的微基因组质体和通过T7表达仙台病毒的Np-、P-和L-蛋白的pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L质体同时转染细胞，以检查在形成核糖核蛋白复合体之后采用仙台病毒的RNA聚合酶转录萤虫素酶蛋白。
在2分钟的UV照射之后，观察到取决于补骨脂素浓度的牛痘病毒的滴定度降低。但是，对于至多0、0.3和1μg/ml的补骨脂素浓度来说，T7聚合酶的活性没有改变，但在10μg/ml时大约降低到1/10(图28)。
进一步地，通过将补骨脂素的浓度固定于0.3μg/ml而检查UV照射时间。与照射时间增加一致的是，牛痘病毒的滴定降低，虽然直到30分钟的照射没有发现对T7聚合酶活性的影响。在这种情况下，在0.3μg/ml和30分钟的照射的条件，在不影响T7聚合酶活性的情况下滴定度被降低到1/1000(图29)。
但是，在滴定度降低至1/1000的牛痘病毒中，在moi＝2处的感染24小时后校正至预处理滴定(moi＝0.002作为在处理后的残留滴定度)的CPE与在moi＝2处感染的非处理的病毒没有不同(图30)。
采用在上述条件下处理的牛痘病毒，检查仙台病毒的重建效率。采用下述的方法，修正的上述的Kato等人的方法进行重建。将LLC-MK2细胞以3×106细胞/孔的浓度播种到6-孔微板上，并在培养过夜后，在PLWUV处理之间将牛痘病毒稀释到校准的6×105pfu/100μl，并将其感染PBS洗涤的细胞。在感染1小时以后，分别加入100μl的OPTI-MEM和1、0.5、1和4μg的质体pGEM-NP、P、L和cDNA，进一步加入10μlSuperfect(QIAGEN)，并在室温下放置15分钟，在加入1ml的OPTI-MEM(GIBCO)(含Rif.和AraC)之后，将其覆盖到这些细胞上。
在转染的2、3和4天之后，回收细胞，将其离心并悬浮在300μl/孔的PBS上。将100μl含有由其自身悬浮液或通过稀释该悬浮液10或100倍而制备的溶液的细胞接种到饲养10天后的含胚鸡蛋中，有4个鸡蛋用于各种稀释(分别为1×105、1×104和1×103细胞)。3天后，从蛋中回收尿囊液并通过HA试验检查病毒的重建(表1)。对于分别用1×105、1×104和1×103细胞接种的蛋，给具有HA活性的蛋打分为1点、10点和100点，从而计算重组计分(图31)。公式如表1所示。
表1牛痘病毒的UV处理持续时间对仙台病毒重建效率的影响
接种细胞 打分(a)                                            HA阳性蛋的数目(b)
的数量                 2d                  3d                 4d
   0’     15’     20’     30’    0’     15’     20’     30’   0’   15’   20’   30’
105     1(a1)    1     2     4     4    0     2     4     4   1   3   4   4
104     10(a2)    0     1     3     2    0     2     3     4   0   0   4   0
103     100(a3)    0     0     0     1    0     1     0     2   0   0   0   0
  重建打分 (a1+a2+a3)×b    1     12     24     124    0     122     34     244   1   3   44   4
重建打分＝(a1+a2+a3)×b
而且，在细胞内转染的2、3和4天以后的牛痘病毒的残留滴定度比处理组的要小，并与在转染之前的给定的滴定度成正比(图32)。
采用PLWUV灭活牛痘病毒，可以将滴定度降低到1/1000而不影响T7聚合酶的活性。但是，来自牛痘病毒的CPE在显微观察下并没有不同于高100倍滴定度的未处理病毒的CPE。
利用由上述用于重建仙台病毒的条件处理的牛痘病毒重建效率提高了10-100倍(图31)。同时，转染后牛痘病毒的残留滴定度不为5pfu/105细胞或更大。因此，可复制的牛痘病毒的存活率保持在0.005％或更小。
[实施例11]假型仙台病毒的重建
<1>制备引入VSV-G基因产物的辅助细胞
因为VSV-G基因产物具有细胞毒性，采用质体pCALNdLG(Arai T.etal.，J.Virology 72(1998)p1115-1121)在LLC-MK2细胞中建立稳定的转变，其中VSV-G基因产物可由Cre重组酶产生。根据附属的手册，采用磷酸钙方法(CalphosTMMammalian转染试剂盒，Clontech)完成将质体引入到LLC-MK2细胞中。
将10微克的质体pCALNdLG引入到在10cm的培养皿中生长到60％融合的LLC-MK2细胞中。在5％的CO2的保温箱中用10ml MEM-FBS 10％的培养液，于37℃下培养该细胞24小时。
24小时后，刮去细胞，将其悬浮在10ml的培养液中；然后采用5个10cm的培养皿，1、2和2个皿分别播种5ml、2ml和0.5ml。
然后在10ml含有1200μg/ml的G418(GIBCO-BRL)的10％的MEM-FCS 10％的培养液中培养14天，同时隔于改换培养液以选择稳定的转化。采用克隆环中移取28个在培养物中生长的抗G418的克隆。在10cm的平板中将每一克隆扩散至融合。
对于每一克隆，在用含有Cre重组酶的重组腺病毒AxCANCre进行感染之后，通过上述的Western印迹法，采用抗-VSV-G单克隆抗体检查VSV-G的表达。
各克隆在6cm的培养皿中生长至融合，之后采用Saito等人的方法在MOI＝10处感染腺病毒AxCANCre(参见以上)，并培养3天。在除去培养上清液以后，用PBS洗涤这些细胞，加入0.5ml含有0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)的PBS从该培养物中分离该细胞，并在37℃下培养5分钟。在将这些细胞悬浮在3ml的PBS中以后，在1500xg下离心五分钟来收集这些细胞。将收集到的细胞再次悬浮在2ml的PBS中，然后在1500x g下离心五分钟来收集细胞。
可以在-20℃下保存细胞且根据需要可将其融化。将收集到的细胞溶解于100μl的细胞溶解液中(RIPA缓冲剂，Boehringer Mannheim)，并采用这些细胞的全蛋白(1×105细胞每通道)进行Western印迹法。将细胞溶解产物溶于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试样缓冲剂(含有6mMTris-HCL(PH6.8)、2％SDS、10％甘油、5％的2-氢硫基乙醇的缓冲剂)，并使其在95℃下加热5分钟后作为电泳的试样。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Multigel 10/20，Daichi Pure Chemicals Cl.，Ltd)通过电泳分离试样，然后通过半干燥印迹法将分离的蛋白转移到转移膜(Immobilon-P转移膜；微孔)。在恒定的电流1mA/cm2下在已在100％甲醇中浸泡30秒，然后在水中浸泡30分钟的转移膜上进行转移1小时。
在40ml的阻断溶液中摇晃该转移膜(BlockAce；Snow BrandMilkProducts)1小时，并在PBS中洗涤一次。
将该转移膜和5ml已被含有10％阻断溶液的PBS稀释的抗-VSV-G抗体(克隆P4D4，Sigma)封装于乙烯袋中并在4℃静置。
将该转移膜两次浸泡在40ml的PBS-0.1％Tween20中5分钟，并在洗涤之后在PBS浸泡5分钟以进行洗涤。
将该转移膜和5ml在含有10％的阻断溶液中稀释至1/2500的用过氧化酶标记的抗小鼠IgG抗体(抗小鼠免疫球蛋白，Amersham)封装于乙烯袋中并在室温下摇晃1小时。
在摇晃后，将该转移膜两次浸泡在PBS-0.1％Tween 20中5分钟，并在洗涤后将其浸泡在PBS中5分钟以进行洗涤。
采用发光法(ECL Western印迹法检测试剂，Amersham)检测与抗VSV-G抗体交叉反应的膜上的蛋白。结果表示为图33。三种克隆表现出AxCANCre感染特异性VSV-G表达，确认了可以引入VSV-G基因产物的LLC-MK2细胞的形成。
采用抗VSV抗体对所获得的克隆中一种称为LLCG-L1的克隆进行流式血细胞计断分析(图34)。结果是，在LLCG-L1中检测到具有对VSV-G基因引入的抗体特异性的反应活性，确认在该细胞表面表达VSV-G蛋白。
<2>采用辅助细胞制备含有F基因缺陷的假型仙型病毒
将含有F基因缺陷的基因组的仙台病毒感染表达VSV-G基因的细胞，并采用上述实施例中所述的含有GFP基因的F缺陷仙台病毒来检查是否可观观察到具有VSV-G的假型的病毒的产物。结果是，在没有感染含有Cre重组酶的重组腺病毒AxCANCre的LLCG-L1中，通过F缺陷仙台病毒的感染引入了病毒基因并检测到了表达GFP的细胞，虽然表达细胞的数量没有增加。在VSV-G引入的细胞中，发现表达GFP的细胞的按时间顺序增加。当进一步向最新的VSV-G引入的细胞中加入1/5的上清液时，在前一上清液中中没观察到引入，而在后一上清液中发现表达GFP的细胞的增加和基因的引入。而且在往没有引入VSV-G的LLCG-L1细胞中加入后一上清液的情况下，引入了基因，但没有观察到表达GFP的细胞增加。综上所述，已发现对表达VSV-G的细胞具有特异性的病毒的繁殖，并发现具有VSV-G的假型F缺陷的病毒的形成。
<评价用于产生具有F基因缺陷的基因组的假型仙台病毒>
改变AxCANCre感染(MOI＝0、1.25、2.5、5和10)的数量而感染某一数量的具有F缺陷基因组的假性类型仙台病毒，并在第7或第8天回收培养上清液。然后在引入VSV-G之前或之后将该上清液感染这些细胞，并在5天后比较表达GFP细胞的数量以观察VSV-G基因表达数量的效果。结果是，在MOI＝0处没有发现病毒产物并在MOI＝10处发现最大产物(图35)。此外，在分析病毒生产的时间过程时，从第5天起或之后，该生产水平开始增加，持续到第8天(图36)。在用连续稀释(每次10倍)的病毒溶液感染仍未用VSV-G引入的细胞5天后通过计算表达GFP的细胞，计算在该病毒溶液(CIU)中感染病毒的颗粒的数量，从而完成对病毒滴定度的测定。结果是，发现最大的病毒产量为5×105CIU/ml。
<抗-VSV抗体对具有F基因缺陷的基因组的假型仙台病毒的传染性的影响>
关于采用表达VSV-G的细胞的而获得的F基因缺陷的基因组的假型仙台病毒在该壳体中是否含有VSV-G蛋白，采用抗-VSV抗体评价是否影响传染性的中和活性。混合病毒溶液和抗体并至少在室温下静置30分钟，然后感染没有引入VSV-G的细胞。在第5天，采用表达GFP的细胞的存在检查基因引入能力。结果，采用抗-VSV抗体观察到了极佳的传染性抑制作用，而在具有原始壳体的F基因缺陷的基因组的仙台病毒中，没有观察到该抑制作用(图37)。因此，它清楚地表明所得的病毒为在其壳体中含有VSV-G蛋白的假型仙台病毒，其中可以采用抗体特殊地抑制该病毒的传染性。
<5>确认假型仙台病毒含有F缺陷基因组
对受感染的细胞提取进行Western印迹法分析以检查在表达VSV-G基因的细胞中繁殖的病毒是否是F缺陷类型。采用上述的方法完成Western分析。作为基本抗体，采用由兔制备的抗-仙台病毒多克隆抗体、由小鼠制备的抗-F蛋白单克隆抗体和由小鼠制备的抗-HN蛋白单克隆抗体。作为第二抗体，在抗仙台病毒多克隆抗体的情况下采用过氧化酶标记的抗-兔IgG抗体，而在抗-F蛋白单克抗体和抗-HN蛋白单克隆抗体的情况下采用过氧化酶标记的抗-小鼠IgG抗体。结果是，没有检测到F蛋白，而检测到来自仙台病毒的蛋白的HN蛋白，确认它是F缺陷的类型。
<6>利用辅助细胞由F和HN基因缺陷的基因组制备假型仙台病毒
采用与以上述实施例类的方法，在采用GFP基因表达作为指示剂和含有在以上实施例中所述的GFP基因的F和HN基因缺陷的仙台病毒分析具有F和HN基因缺陷的基因组的仙台病毒对表达VSV-G基因的LLCG-L1细胞的感染之后，观察在其衣壳中具有VSV-G的假型病毒的产生。结果是，观察到对表达VSV-G的细胞特异性的病毒繁殖，而并观察到具有VSV-G的假型F和HN缺陷的仙台病毒的的产生(图38)。通过在用连续(每次10倍)稀释的病毒溶液感染未引入VSV-G的细胞以后计算表达GFP的细胞，计算感染病毒溶液中的细胞(CIU)的颗粒数量，从而完成对病毒滴定度的测定。结果是，最大病毒产量为1×106CIU/ml。
<7>确认假型仙台病毒含有F和HN缺陷的基因组
对受感染的细胞提取进行Western印迹法以分析在表达VSV-G基因的细胞中繁殖的病毒是否是F和HN缺陷的类型。结果是，没有检测到F和HN蛋白，而检测到来自仙台病毒的蛋白的HN蛋白，确认它是的F和HN缺陷的类型(图39)。
[实施例12]分析病毒重建的方法
<常规方法>
将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿播种到100mm的培养皿中。24小时培养后，用不含血清的MEM培养液洗涤一次，然后在室温下用表达T7 RNA聚合酶的重组牛痘病毒感染(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126 1986)(vTF7-3)1小时(moi＝2)(moi＝2-3，优选采用moi＝2)。用3μg/ml的补骨脂素和长波紫外光线(365nm)预处理这里所用的病毒5分钟。将质体pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A.et al.，Genes cells 1，569-579(1996))分别悬浮在12μg、4μg、2μg和4μg/皿的比率的opti-MEM培养液(GIBCO)中。然后，加入SuperFect转染试剂(1μgDNA/5μl，QIAGEN)，并将其在室温下静置15分钟，加入3ml含有3％FBS的opti-MEM培养液。然后，用不含血清的MEM培养液洗涤该细胞两次，并加入DNA-SuperFect混合物。在3小时的培养之后，用不含血清的MEM培养液洗涤两次，并在含有40μg/ml的胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)的MEM中培养70小时。收集细胞和培养上清液作为P0-d3试样。将P0-d3颗粒悬浮在opti-MEM培养液(107细胞/ml)。将它们冷冻-融解三次，然后与脂转染试剂DOSPER(Boehringer Mannheim)(106细胞/25μl DOSPER)混合，并使其在室温下静置15分钟。然后转染表达F的LLC-MK2/F细胞(在24孔平板为106细胞/孔)，用不含血清的MEM培养液(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)培养该细胞。在第3和第7天回收培养上清液，并将它们指定为P1-d3和P1-d7试样。
<覆盖表达包膜质体+F的细胞的方法>
与如述进行类似的转染，除了加入4μg/皿的包膜质体pGEM/FHN。在3小时的培养之后，用不含血清的MEM培养液洗涤细胞两次，并在含有40μg/ml的胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC；Sigma)和7.5μg/ml的胰蛋白酶的MEM中培养48小时。在除去培养上清液以后，往细胞覆盖用不含血清的MEM悬浮的表达F的LLC-MK2/F7细胞的100mm皿中的5ml细胞悬浮液(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)。在48小时培养之后，回收细胞和上清液并将其指示为P0-d4试样。将P0-d4颗粒悬浮在opti-MEM培养液(2×107细胞/ml)并冷冻-融解三次。然后用该悬浮液(2×106细胞/孔，24-孔平析)并在不含血清的MEM培养液(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)中培养。在培养的第3天和第7天回收培养上清液，将其指示为P1-d3和Pa-d7试样。作为对照，采用上述相同的方法进行实验，但不进行覆盖，且仅加入该包膜质体。
<通过计算表达GFP的细胞(GFP-CIU)来测定CIU(细胞感染单元)>
将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿播种到12孔平板上。在24小时培养后，用不含血清的MEM培养液洗涤一次。然后用100μl/孔的适宜稀释的上述试样(P0-d3或P0-d4，P1-d3和P1-d7)感染该细胞，其中该试样被稀释至在10cm2上含有10-100阳性细胞。15分钟以后，加入1ml/孔的不含血清的MEM培养液，并在进一步的24小时以后，在荧光显微镜下观测细胞以计算表达GFP的细胞。
<测定CIU(细胞感染单元)>
将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿播种到12孔平板上。在24小时培养后，用不含血清的MEM培养液洗涤一次。然后用100μl/孔的上述试样感染该细胞，其中将所含的病毒载体指示为SeV/ΔF-GFP。15分钟以后，加入1ml/孔的不含血清的MEM培养液，并进一步培养24小时。在该培养后，用PBS(-)洗涤该细胞3次并在室温下静置大约10分钟至15分钟而将其干燥。为固定细胞，加入1ml/孔的乙酮并立即除去乙酮，然后再次通过将细胞于室温下静置大约10分钟至15分钟而将其干燥。往细胞中加入300μl/孔的由兔制得并由PBS(-)作100倍稀释的抗-SeV多克隆抗体(DN-1)，并在37℃培养45分钟。在用PBS(-)洗涤三次以后，在荧光显微镜下观测该细胞(发射：560nm，吸收：645nm滤光器，Leica)以发现荧光细胞(图40)。
作为对照，以100μl/孔感染上述的试样(SeV/ΔF-GFP)，并在15分钟之后加入1ml/孔的不含血清的MEM，在24小时的培养之后，在荧光显微镜下观测细胞(发射：360nm，吸收：470nm滤光器，Leica)以培养之后不进行处理而发现表达GFP的细胞。
[实施例13]评价用于提高缺陷类型的仙台病毒受体的重建效率的最适宜的牛痘病毒(vTF7-3)PLWUV(补骨脂素和长波UV光线)处理条件
将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿播种到100mm的培养皿中。24小时培养后，用不含血清的MEM培养液洗涤一次，然后在室温下用表达T7 RNA聚合酶的重组牛痘病毒(vTF-3)(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986)感染该细胞1小时(moi＝2)(moi＝2-3，优选采用moi＝2)。用0.3-3μg/ml的补骨脂素和长波紫外光线(365nm)预处理该病毒2-20分钟。将质体pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A.et al.，Genes cells 1，569-579(1996))分别悬浮在12μg、4μg、2μg和4μg/皿的比率的opti-MEM培养液(GIBCO)中。然后，加入SuperFect转染试剂(1μgDNA/5μl，QIAGEN)，并将其在室温下静置15分钟，加入3ml含有3％FBS的opti-MEM培养液。然后，用不含血清的MEM培养液洗涤该细胞两次，接着加入DNA-SuperFect混合物。在3小时的培养之后，用不含血清的MEM培养液洗涤两次，并在含有40μg/ml的胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)的MEM中培养48小时。用荧光显微镜观测100mm培养皿中的大约1/20的视场并计算表达GFP的细胞。为了测试牛痘病毒(vTF-3)的灭活，采用噬斑形成(Yoshiyuki Nagai et al.，virus experimentprotocols，p291-296，1995)进行滴定测试。
进一步地，将转染后的回收时机固定在第3天，检查补骨脂素和UV照射的时间。采用用各个PLWUV处理的牛痘病毒(vTF7-3)检查仙台病毒重建的效率。采用修正的上述的Kato等人的方法，即下述的方法进行重建。将LLC-MK2细胞以5×105细胞/孔的浓度播种到6-孔微板上，并在培养过夜后(认为细胞生长至1×106细胞/孔)，在PLWUV处理之前用稀释的计算滴定度为2×106pfu/100μl的牛痘病毒(vTF-3)感染用PBS洗涤的细胞。在感染1小时以后，分别加入50μl的OPTI-MEM和1、0.5、1和4μg的质体pGEM-NP、P、L和cDNA，进一步加入10μlSuperfect(QIAGEN)，并在室温下放置15分钟。然后加入1ml的Opti-MEM(含40μg/ml的AraC)并将其覆盖到这些细胞上。
在转染三天之后回收细胞，然后将其离心并悬浮在100μl/孔的PBS上。将悬浮液稀释到10、100箅1000倍，并将100μl含有所得细胞溶液接种到饲养10天后的含胚鸡蛋中，有3个鸡蛋用于各种稀释(分别为1×105、1×104和1×103细胞)。3天后，从蛋中回收尿囊液并通过HA试验检查病毒的重建(表1)。为了计算重建效率，对于分别用1×105、1×104和1×103细胞接种的具有HA活性的蛋分别计算为1点、10点和100点。
<结果>
实施例12和13的结果如在图40-43和表2所示。表达质体的包膜和细胞覆盖的组合提高了SeV/ΔF-GFP的重建效率。在P0的d3-d4(第3天到第4天)(在传代培养之前)获得明显的改进。在表2，在转染3天后用细胞培养鸡蛋。在用0.3μg/ml的补骨脂素处理20分时，在第3天获得了最高的重建效率。因此，认为这些条件是最佳条件(表2)。
表2：牛痘病毒的PLWUV处理对仙台病毒重建的影响
   接种细胞      打分(a)                                 HA阳性蛋的数目(b)
    的数量 0μg/ml  0.3μg/ml         3μg/ml         4μg/ml
    0’     20’   5’  10’   20’   2’   5’   10’
    105     1(a1)     0     3   3  3   3   3   3   3
    104     10(a2)     0     3   2  3   3   1   3   1
    103     100(a3)     0     3   0  1   1   0   1   0
    重建打分     (a1+a2+a3)×b     0     333   43  133   133   13   133   13
重建打分＝(a1+a2+a3)×b
[实施例14]制备含有LacZ、F缺陷、不含GFP的仙台病毒载体
<F缺陷型、含LacZ基因的SeV载体的cDNA的构建>
为了在存在于实施例1(pSeV(+18：LacZ))/ΔF)中所述的pSeV18+/ΔF的基因上游区域存在的NotI限制位点中构建带有LacZ基因的cDNA，采用PCR扩增LacZ基因。通过以下途径进行PCR：调整LacZ基因至达到6的倍的数(Hausman，S et al.，RNA 2，1033-1045(1996)，并使用带有NotI限制位点的引物(5’-GCGCGGCCGCCGTACGGTGGCAACCATGTCGTTTTACTTTGACCAA-3’/SEQ ID NO：17)作为5’端，采用带有转录终止信号SeV(E)、间插序列(I)、转录起始信号(S)和NotI限制位点的引物(5’-GCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGCTATTACTTCTGACACCAGACCAACTGGTA-3’/SEQ IDNO：18)作为3’末端，采用PCMV-β(Clontech)作为模板。反应条件如下：取50ng的PCMV-β、200μM的dNTP(Pharmacia Biotech)、100pM的引物、4U Vent聚合酶(New England Biolab)与伴随的缓冲液混合。循环25次的反应温度94℃30秒、50℃2分钟、72℃2分钟。用琼脂糖凝胶电泳产物。纯化后切割3.2kb片断并用NotI消化。通过NotI消化的pSeV18+/ΔF片段连接就得到pSeV(+18＝LacZ//ΔF)。
<常规方法>
将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿播种到100mm的培养皿中。24小时培养后，用不含血清的MEM培养液洗涤一次，然后在室温下用表达T7 RNA聚合酶的重组牛痘病毒感染(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126 1986)(vTF7-3)1小时(moi＝2)(moi＝2-3，优选采用moi＝2)。用3μg/ml的补骨脂素和长波紫外光线(365nm)预处理这里所用的病毒5分钟。将含有LacZ、F缺陷型仙台病毒载体cDNA(pSeV(+18＝LacZ//ΔF)、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A.etal.，Genes cells 1，569-579(1996))分别悬浮在12μg、4μg、2μg和4μg/皿的比率的opti-MEM培养液(GIBCO)中。再加入4μg/皿的pGEM/FHN包被的质粒和SuperFect转染试剂(1μg DNA/5μl，QIAGEN)，并将其在室温下静置15分钟，加入3ml含有3％FBS的opti-MEM培养液。然后，用不含血清的MEM培养液洗涤该细胞两次，并加入DNA-SuperFect混合物。在3小时的培养之后，用不含血清的MEM培养液洗涤两次，并在含有40μg/ml的胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)和7.5μg/ml的MEM中培养24小时。
在除去培养上清液以后，往细胞覆盖用不含血清的MEM悬浮的表达F的LLC-MK2/F7细胞的100mm皿中的5ml细胞悬浮液(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)。在48小时培养之后，回收细胞和上清液并将其指示为P0-d4试样。将P0-d4颗粒悬浮在opti-MEM培养液(2×107细胞/ml)并冷冻-融解三次。用脂转染试剂DOSPER(BoehringerMannheim)(106细胞/25μl DOSPER)混合这些细胞，并使其在室温下静置15分钟。然后转染表达F的LLC-MK2/F细胞系(在12孔平板为106细胞/孔)，在不含血清的MEM(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)中培养该细胞。在第7天回收培养上清液，并将其指示为Pa-d7试样，并且用所有上清液在37℃、1小时的条件下感染播种在12孔板平板上的表达F的LLC-MK2/F7细胞系。然后用MEM培养液洗涤一次，用不带血清的MEM培养液(含40μg/ml的Arac和7.5μg/ml的胰蛋白酶)培养该细胞。第七天收集上清培养液，并将其指示P2-d7细胞系，然后用MEM培养液洗涤一次，用不带血清的MEM培养液(含7.5μg/ml的胰蛋白酶)培养该细胞，七天收集上清液，将其指示为P3-d7试样。继续用所有上清液在37℃、1小时的条件下感染播种在12孔板平板上的表达F的LLC-MK2/F7细胞系。用MEM培养液洗涤一次，用不带血清的MEM培养液(含7.5μg/ml的胰蛋白酶)培养该细胞，七天收集上清液，将其指示为P4-d7试样。
<计算LacZ-表达细胞以沉淀CIU(LacZ-CIU)>
将LLC-MK2细胞以2.5×106细胞/皿播种到100mm的培养皿中。用不含血清的MEM培养液洗涤一次，然后用每次10倍的连续稀释的P3-d7溶液37℃感染该细胞1小时，再用MEM培养液洗涤细胞一次，加入含有10％血清的MEM培养液1.5ml。37℃下培养3天后，用β-半乳糖染色试剂盒(Invitrogen)染色细胞，平行三次实验结果显示在图44。计算LacZ显然细胞的结果显示：在任何情况下，P3-d7试样均得到1×106CIU/ml病毒量。
[实施例15]利用仙台病毒的极性作用调节基因表达水平
<SeV基因组cDNA的构建>
在仙台病毒的全部基因组cDNA长度中加入额外的NotI倍点，即pSeV(+)(Kato，A.et al，Genes to cells：569-579，1996)，夹在起始信号和各个基因的ATG转录起始信号之间。特别地，用SPHI/SalI(2645bp)，ClaI/ECoRI(5146bp)消化过的pSEV(+)的各片断经琼脂糖凝胶电泳分离，各相应电泳带被挑出，利用QIAEXII凝胶提取系统(QIAGEN)收集、纯化各片断，如图45A所示。用ClaI/ECoRI消化的片断、ClaI消化的片断和ClaI/ECoRI消化的片断分别与LITMUS38(NEW ENGLANDBIOLABS)、pBluescriptII KS+(STRATAGENE)和pBluescriptKSt(STRATAGENE)相连，用于亚克隆，用Quickchange site-DirectedMutagenesis试剂盒(STRATAGENE)来连续导入NotI位点，每次导入所用的引物分别为：对于NP-P是反义链：5′-ccaccgaccacacccagcggccgcgacagccacggcttcgg-3′(SEQ ID NO；19)，反义链：5′-ccgaagccgtggctgtcgcggccgctgggtgtggtcggtgg-3′(SEQ ID NO：20)；对于P-M是：反义链5′-gaaatttcacctaagcggccgcaatggcagatatctatag-3′(SEQ ID NO：21)，反义链5′-ctatagatatctgccattgcggccgcttaggtgaaatttc-3′(SEQ ID NO：22)，对于M-F是：反义链5′-gggataaagtcccttgcggccgcttggttgcaaaactctcccc-3′(SEQ ID NO：23)，反义链5′-ggggagagttttgcaaccaagcggccgcaagggactttatccc-3′(SEQ ID NO：24)；对于F-HN是：反义链5′-ggtcgcgcggtactttagcggccgcctcaaacaagcacagatcatgg-3′(SEQ ID NO：25)，反义链5′-ccatgatctgtgcttgtttgaggcggccgctaaagtaccgcgcgacc-3′(SEQ IDNO：26)；对于HN-L是：反义链5′-cctgcccatccatgacctagcggccgcttcccattcaccctggg-3′(SEQ ID NO：27)和5′-cccagggtgaatgggaagcggccgctaggtcatggatgggcagg-3′(SEQ ID NO：28)。
至于模板分别为NP-P的SalI/SphI片断，RM和PF的ClaI片断、FHN和HN-L的Clai/FCoRI片断，如上所述被亚克隆。采用QuickchangeSite-Directed Mutagenesis试剂盒方案进行导入。用亚克隆所用的酶再一次消化产物，收集纯化，然后被组装入仙台病毒基因组cDNA。于是，在每个基因之间导入了NotI位点的五种仙台病毒基因组cDNA(pSeV(+)NPP、pSeV(+)PM、pSeV(+)MF、pSeV(+)FHN和pSeV(+)HNL)构建完成，如图45B所示。
人类分泌型碱性磷酸酶(SEAP)通过PCR亚克隆作为报道基因来检测基因表达水科。引物为5’引物：5′-gcggcgcgccatgctgctgctgctgct9ctgctgggcctg-3′(SEQ ID NO：29)和3’引物：5′-gcggcgcgcccttatcatgtctgctcgaagcggccggccg-3′(SEQ ID NO：30)。加入ASCI限制位点共同合成，再进行PCR。使用PSEAP Basic(LONTECH)作为模板，Pfu Eurbo DNA聚合酶(STRATAGENE)作为酶。PCR后，产物经过ASCI消化，再通过电泳回收纯化。在pBluescriptIIKS+的NotI位点掺入合成的双链DNA(反义链：5′-gcggccgcgtttaaacggcgcgccatttaaatccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc-3′(SEQ ID NO：31)，反义链：5′-gcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggatttaaatggcgcgccgtttaaacgcggccgc-3′(SEQ ID NO：32)，该双链DNA含有多克隆位点)PmeI-ASCI-SwaI)和终止信号-间插序列-起始信号，这样就构建完成要亚克隆的质粒(图46)。PCR产物收集、纯化后，连接并克隆得到质粒AscI位点。产物经过NotI消化，并且SEAP基因片断通过电泳回收、纯化，分别连接到5种类型的仙台病毒基因组cDNA和pSeV18+的NotI位点上。得到的病毒载体分别指示为pSeV(+)NPP/SEAP、pSeV(+)PM/SEAP、pSeV(+)MF/SEAP、pSeV(+)FHN/SEAP、pSeV(+)HNL/SEAP和pSeV(+)/SEAP。
将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿播种到100mm的培养皿中。24小时培养后，在室温下用表达T7 RNA聚合酶的重组牛痘病毒(PLWUV-VacT7)感染(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-81261986，Kato A.et al.，Genes cells1：569-579，1996)1小时(moi＝2)。用补骨脂素和紫外光线预处理所用的病毒，将掺入了SEAP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L的每种仙台病毒分别分别悬浮在12μg、4μg、2μg和4μg/皿的比率的opti-MEM培养液(GIBCO)中。然后加入110μl的SuperFect转染试剂(QIAGEN)，并将其在室下静置15分钟，加入3ml含有3％FBS的opti-MEM培养液。然后洗涤细胞，加入DNA-SuperFect混合物，经3-5小时培养后，用不含血清的MEM培养液洗涤细胞2两次，然后在含有胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC；Sigma)的MEM中培养72小时。收集细胞，颗粒悬浮于1ml的PBS中，冷冻融化三次。取100μl产物接种于已预温育10天的鸡蛋中，再继续在35℃下温育3天后，从蛋中回收尿囊液，将回收的尿囊液稀释至10-5-10-7，再重新接种于鸡蛋以使其不含有牛痘疫苗。然后同样地回收并分别分成小份贮存在-80℃下。病毒载体被指示为SeVNPP/SEAP、SeVPM/SEAP、SeVMF/SEAP、SeVFHN/SEAP、SeVHNL/SEAP和SeV18/SEAP。
<噬菌斑分析测定滴定>
CV-1细胞以5×106细胞/孔播种于6孔平板并培养24小时，用PBS洗涤细胞，然后将由BSA/PBS(含1％BSA的PBS)稀释至10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的重组SeV与细胞温育小时，再用PBS洗涤，然后覆盖以3ml/孔的BSA/MEM琼脂糖(0.2％BSA+2×MEM，与等体积的2％的琼脂糖混匀，在37℃，0.5％的CO2条件下培养6天，然后加入3ml乙醇/乙酸(乙醇∶乙酸＝1∶5)，再静置3小时，然后去除琼脂糖，用PBS洗涤3次后，与稀释100倍的兔抗仙台病毒抗体在室温下温育1小时，然后用PBS洗涤三次，细胞与稀释200倍的Alexa Flour TM标记的羊抗兔Ig(G+H)(分子探针)室温下温育1小时，再用PBS洗涤三次，通过鲁米诺-显像分析仪LAS1000(FujiFilm)可以看到荧光影像，计算噬菌斑。结果如图47。此外，滴定实验结果显示在表3中。
表3噬菌斑分析每种重组仙台病毒的滴度结果
重组病毒                滴定(pfu/ml)
SeV18/SEAP                 3.9×109
SeVNPP/SEAP                4.7×108
SeVPM/SEAP                 3.8×109
SeVMF/SEAP                 1.5×1010
SeVFHN/SEAP                7.0×109
SeVHNL/SEAP                7.1×109
<报道基因表达的对比>
将LLC-MK2细胞以5×105细胞/孔播种于6孔板并培养24小时，每种病毒载体以moi＝2进行感染，24小时后回收100μl培养上清，采用SEAP分析法，使用报道基因测定试剂盒(Reporter Assay Kit)-SEAP-(Toyobo)，并利用鲁米诺图像分析仪LAS1000(Fuji Film)进行测定。
[实施例16]通过缺陷ΔF-HN双覆盖的方法提高缺陷SeV的繁殖效率
由于目前应用的SeV病毒重建方法采用表达T7RNA聚合酶(Vtf-3)的重组牛痘病毒，通过牛痘病毒的细胞毒性杀死部分感染细胞。而且，病毒只可能在部分细胞中繁殖，优选更多的细胞中高效、持久地进行病毒繁殖。但对于副粘病毒，当同种病毒的F和HN蛋白在细胞表面同时存在时发生细胞融合，形成合胞体(Lamb和Kolakofsky，1996，FieldsVirology，p1189)。因此，共表达FHN的细胞难以传代培养。鉴于此，本发明人认为，可通过将表达被检测蛋白(F和HN)辅助细胞覆盖到重建细胞上来提高缺陷病毒的回收率。通过检查具有不FHN表达时间的覆盖细胞，显著得提高共FHN缺陷的病毒的回收率。
室温条件下，在moi＝2处用牛痘病毒处理的PLMUV感染已在10cm培养皿中生长至100％融合的LLC-MK2细胞(1×107细胞/皿)1小时。然后混合12μg/10cm培养皿，4μg/10cm培养皿，2μg/10cm培养皿，4μg/10cm培养皿，4μg/10cm培养皿的分别含有d2EGFP(pSeV18+/ΔFHN-d2GFP(实施例8))、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L，和pGEM/FHN的FHN缺陷的的cDNA(终体积为3ml//10cm培养皿)。用基因导入试剂SuperFect(QIAGEN)，以与上述F缺陷细胞重建相类似的方法，将基因引入LLC-MK2细胞，3小时后用无血清的培养基洗涤细胞3次，然后低速离心(1000rpm/2min)回收分离出的细胞，用无血清，但含40μg/mlAraC(Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)的MEM培养基悬浮细胞，加入细胞中过夜培养。在moi＝10处用腺病毒感染单独制备的在10cm的培养皿中的100％融合FHN共表达细胞，并分别在4小时，6小时，8小时，2天，3天时，用5ml的PBS(-)洗一次，然后用细胞分离试剂(Sigma)分离细胞，低速离心(1000rpm/2min)收集细胞后，悬浮于无血清，但添加了40μg/ml AraC(Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)的MEM培养基中。将其加入细胞中，FHN共缺陷病毒在所述细胞中重建(P0)培养过夜。覆盖细胞两天后，用荧光显微镜观察细胞，以确认细胞中通过GFP表达的病毒的扩散。结果如表49所示。与没有覆盖细胞的常规情况相比(左栏)，覆盖细胞的细胞中观察到的GFP表达细胞明显增多(右栏)。回收这些细胞，用每ml Opti-MEM培养基107个细胞的浓度悬浮细胞，反复冻融3次，制备溶胞产物，然后，用106细胞/100μl/孔的溶胞产物感染引入2天后的FHN共表达细胞。在无血清，但添加了40μg/mlAraC(Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)的MEM培养基，在含5％CO2的培养箱中37℃条件下培养两天。用CIU-GFP检测P1细胞悬浮培养物中的病毒效价(表4)，结果在FHN引入4小时后，未检测到病毒扩增效应。在引入6小时或6小时以上由于细胞覆盖，检测到了明显的病毒扩增效应，尤其是6小时以上，与未经细胞覆盖的对照相比，经细胞覆盖后，释放到P1细胞悬浮培养物中的病毒数量可增加10倍以上。
表4通过ΔFHN双缺陷细胞覆盖方法扩增缺陷SeV
GFP-CIU                               x103/ml
                                        FHN cell+ad/cre
FHN cell-         4h     6h       8h      2d      3d
8-10              6-9    80-100   70-100  60-100  20-50
[实施例17]拥有F缺陷基因组的假型仙台病毒的确证
对感染细胞抽提物中的蛋白进行Western分析以确证由上述VSV-G基因表达增殖的病毒F-缺陷型。结果，检测到了仙台病毒的蛋白，未发现F蛋白，说明该病毒为F缺陷病毒(图50)。
[实施例18]抗VSV抗体对含有F和HN基因缺陷基因组的假型仙台病毒感染性的影响
为了发现采用VSV-G表达系所获得的包含F和HN缺陷基因组的假型仙台病毒的衣壳是否包含VSV-G蛋白，用抗VSV抗体检测感染性是否受到影响的中和活性，将病毒溶液与抗体混合，室温放置30min，然后，用该混合物感染尚未引入抗VSV抗体表达的LLCG-L1细胞。第4天，由GFP表达细胞的存在分析所引入基因的能力。结果，在F和HN缺陷基因组的假型仙台病毒(图中VSV-G)中，抗VSV抗体很好地抑制了病毒感染，而包含正常衣壳(图中F、HN)(图51)的仙台病毒中未检测到抑制现象。从而证明了，本实施例中所获得的病毒是包含以VSV-G蛋白为其衣壳的仙台病毒，该抗体可特异地抑制其感染。
[实施例19]由密度梯度超离心法纯化含有F-HN基因缺陷基因组的假型仙台病毒
用病毒感染细胞培养物的上清液进行蔗糖密度梯度离心，分级分离并纯化包含F基因缺陷及F和HN基因缺陷基因组的假型仙台病毒，将病毒溶液加到20％-60％梯度的蔗糖溶液中，用SW41转头(Beckman)超离心15到16小时，超离心结束后，在管底开一个孔，用分级收集器，收集300μl的分离物，对每一分离物均进行Western分析以验证所得病毒是以VSV-G蛋白为衣壳，带有F基因缺陷及F和HN基因缺陷基因组的假型仙台病毒。Western分析依上述方法进行。结果，对F缺陷的假型仙台病毒在同一分离物中检测到了仙台病毒衍生蛋白，HN蛋白和VSV-G蛋白而未检测到F蛋白，确证了其是一种F缺陷的假型仙台病毒。另一方面，对F和HN缺陷的假型仙台病毒在同一分离物中检测到了仙台病毒衍生蛋白，和VSV-G蛋白而未检测到HN蛋白和F蛋白，确证了其是一种F和HN缺陷的假型仙台病毒。
[实施例20]带有F缺陷或F和HN缺陷的假型仙台病毒的血红素凝集弱化实验
分别用带有带有F缺陷或F和HN缺陷的假型仙台病毒和带有正常衣壳的仙台病毒感染LLC-MK2细胞，第三天，加入1％禽红细胞悬浮液，4℃放置30min。此后，观察到感染细胞表面表达了GFP。结果对带有F基因缺陷基因组的病毒和F缺陷假型仙台病毒(SeV/ΔF，and pseudotypeSeV/ΔF(VSV-G)by VSV-G)在经感染的细胞表面观察到了凝集反应。另一方面，在包含F和HN基因缺陷基因组的假型仙台病毒感染的细胞表面未发现凝集现象。(SeV/ΔF-HN(VSV-G))(图53)。
[实施例21]包含F基因缺陷基因组的假型仙台病毒对培养细胞的感染特异性
用流式细胞光度法检验病毒感染3天后存活细胞中GFP的表达程度，来测定包含F基因缺陷基因组的VSV-G假型仙台病毒的感染效率。包含F基因缺陷基因组的假型仙台病毒对LLC-MK2细胞的感染效率与作为对照的带有正常衣壳的仙台病毒对LLC-MK2细胞的感染效率几乎相同。结果对人卵巢癌HRA细胞上述病毒的感染效率没有区别，而对于Jurkat细胞系包含F基因缺陷基因组的假型仙台病毒的感染效率比对照高出约2倍。(图54)
[实施例22]包含NGF的F缺陷型仙台病毒载体的构建
HGF/SeV/ΔF的构建
HGF/SeV/ΔF的构建依上述“包膜质粒+F表达细胞覆盖方法”完成。利用抗SeV多克隆抗体的方法进行效价的测定。
HGF/SeV/ΔF(RT-PCR)病毒基因组的确认
为确证HGF/SeV/ΔF病毒基因组(图55上栏)，将LLC-MK2/F细胞回收的培养物上清液离心，依制造商提供的方法用QIAamp Viral RNAminikit，抽提RNA，以RNA为模板，合成，并用SUPERSCRIPTTMONE-STEPTM RT-PCR系统(GIBCO BRL)进行RT-PCR，用附加类型的SeVCdna(pSeV18+b(+))(Hasan，M.K.等，普通病毒学杂志78：2813-2820，1997)作为对照组，NGF-N和NGF-C用作PCR引物。NGF-N，正向：ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAGTAATGTCCATGTTGTTCTACACTCTG(序列号SEQ ID NO：33)，NGF-C，反向：ATCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGCCTCTTCTTGTAGCCTTCCTGC(序列号SEQ ID NO：34)。结果，室温条件下，在NGF/SeV/ΔF中检测到NGF特异的带。而对照组中没有检测到带。(图55底栏)
[实施例23]NGF蛋白的定量和包含NGF基因的F-缺陷型SeV感染后体外活性表达的测定
用在直径为10cm或6cm的培养皿中长到几乎融合的LLC-MK2细胞或LLC-MK2/F细胞完成感染和NGF蛋白的表达。NGF/SeV/ΔF和NGF/SeV/ΔF-GFP感染LLC-MK2/F细胞，NGF/SeV和GFP/SeV感染LLC-MK2，感染复数为0.01，在含有7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)无血清的MEM培养基中培养3天。3天后，几乎100％的细胞被感染，更换成无胰蛋白酶和血清的培养基继续培养3天，然后，回收每一培养物的上清液，以48，000xg离心60min。然后进行NGF蛋白的定量和上清液体外活性检测，尽管本实施例中F-缺陷型SeV(NGF/SeV/ΔF，NGF/SeV/ΔF-GFP)(见图55)感染LLC-MK2/F细胞，若感染高感染复数(例如1或3)，即，所感染细胞自始即接近100％融合，用F非表达细胞进行的实验给出相似的结果。
用ELISAkit NGF Emax Immuno Assay System(Promega)和其辅助方法对NGF蛋白的定量。在NGF/SeV/ΔF-GFP，NGF/SeV/ΔF和NGF/SeV感染的细胞培养物上清液中分别检测到了32.4μg/ml，37.4μg/ml和10.5μg/ml的NGF蛋白。与NGF/SeV感染的细胞培养物的上清液相似，在NGF/SeV/ΔF和NGF/SeV/ΔF-GFP感染的细胞的培养物上清液中，存在高浓度的NGF蛋白，确证了F缺陷型SeV表达足够量的NGF。
以残存的活性为指标，(神经生长因子(Wiley，纽约)，pp.95-109(1989))用原代鸡卵背部根神经节(DRG；鸡的感觉神经原)的分离培养物完成NGF蛋白体外活性的检测。背部根神经节取自第10天的鸡胚，用0.25％胰蛋白酶(GIBCO)37℃条件下处理20min后使其分散。用含100unit/ml青霉素(GIBCO)100unit/ml链霉素(GIBCO)，250unit/ml，两性霉素B(GIBCO)20μM2-脱氧]尿苷(Nakarai)，2Mm L谷氨酸盐(Sigma)和5％的血清的高葡萄糖D-MEM培养基，以5000细胞/孔，将细胞接种于96孔细胞培养板培养。用聚赖氨酸预覆的96孔细胞培养板(Iwaki)在使用前再用昆布宁(Sigma)涂覆一次。在起始点，加入对照NGF蛋白或预先制备的经SeV感染的培养物上清液。3天后，用显微镜观察或以线粒体的还原活性为指标，通过加入Alamer兰对存活细胞进行定量，(530nm激发，590nm荧光检测)在对照(未添加NGF)中检测到等价的荧光信号，其中加入了稀释到1/1000的经附加型GFP(GFP/SeV)感染的细胞培养物上清液，反之，添加有稀释到1/1000的经NGF/SeV/ΔF，NGF/SeV/ΔF-GFP，和NGF/SeV感染的细胞培养物上清液的对照，引起荧光强度的明显增强，且经鉴定其中有相当高数量的存活细胞和残余活性。(图56)结果的值与由ELISA计算出的NGF蛋白添加量具有可比性。在显微镜下观察证明了相似的结果。即添加经NGF/SeV/ΔF，NGF/SeV/ΔF-GFP，和NGF/SeV感染的细胞培养物上清液，可增加存活细胞，且可观察到显著的神经突延长(图57)。从而证明：在包含F-缺陷型的SeV感染表达的NGF是活性形式。
[实施例24]F-表达细胞的详细分析
经由Adeno-Cre的感染复数和引入时间
通过使用不同的Adeno-Cre感染复数感染LLC-MK2细胞，F蛋白引入后，分析蛋白的表达量和细胞形状的改变。
与感染复数为1(图58)比较，感染复数为10时的表达水平稍有提高。在引入后的6小时，12小时，24小时和48小时分析表达量，在所有的检测中引入后48小时的表达量最高。
另外，在感染复数为1，3，10，30和100时监控一定时间段内受感染的细胞形状的变化。尽管在感染复数达到10时已观察到了明显的不同，但在感染复数为30或更高时才观察到细胞毒性。(图59)
细胞传代数
用Adeno-Cre将F蛋白引入LLC-MK2/F细胞后，细胞经传代7次，再用显微镜的观察对F蛋白表达水平和细胞形态进行分析。另一方面，用激光显微镜分析：F蛋白引入细胞后，细胞传代到第20代时F蛋白细胞间的定位。
根据激光显微镜观察的结果，引入F蛋白表达的LLC-MK2/F细胞置于玻璃槽中，过夜培养后，去除培养基，用PBS洗细胞一次，用3.7％的.福尔马林-PBS固定5min。洗细胞一次后，将细胞用0.1％Triton x100-PBS处理5min，然后依下述顺序用抗F蛋白单克隆抗体(γ-236)(稀释至1/100)和FITC标记的羊抗兔IgG抗体(稀释至1/200)处理细胞，最后用PBS洗细胞后用激光显微镜观察。
结果，在传代7次后的细胞中，F蛋白的表达水平没有变化。(图60)在形态学变化，SeV的感染性和产率上也没有观察到明显的不同。另一方面，细胞传代20次，用免疫抗体的方法分析F蛋白在细胞间的定位，当传代到15代时仍未发现大的差异，但在传代15代以上即可观察到F蛋白定位趋势。
综合上述，在传代15代以前的细胞，可以认为是F缺陷SeV的生产所需。
[实施例25]GFP-CIU和抗-SeV-CIU之间的相互关系
通过两种方法分析了检测感染细胞单元()的结果之间的相互关系。LLC-MK2细胞以2×105细胞/皿接种于12孔细胞培养板，培养24小时后，用无血清的MEM培养基洗细胞一次，用100μl/孔SeV/ΔF-GFP感染细胞。15min后，每孔添加1ml无血清的MEM培养基，继续培养24小时。培养结束后用PBS(-)洗细胞3次，干燥(室温下放置10min到15min)，每孔添加1ml丙酮固定细胞，然后立即去除丙酮。重新干燥细胞(室温下放置10min到15min)。然后每孔加入300μl用兔制备并用PBS(-)稀释了100倍的抗SeV多克隆抗体(DN-1)，在37℃条件下孵育45min，然后用PBS(-)洗3次。然后，每孔加入300μl用荧光标记的二抗，抗兔IgG(H+D)(AlexTM 568，分子探针)在37℃条件下孵育45min，然后用PBS(-)洗3次。然后在荧光显微镜下观察带有荧光的细胞。(发射：560nm，吸收：645nm，滤光器：Leica)
作为对照，用100μl/孔的SeV/ΔF-GFP感染细胞，15min后，每孔添加1ml无血清的MEM培养基。继续培养24小时后，无需进一步的操作即可在荧光显微镜下观察到表达GFP的细胞。(发射：360nm，吸收：470nm，滤光器：Leica)。
通过定量评估荧光强度得出了很好的相关性。(图62)
[实施例26]多克隆位点的构建
应用下述的两种方法，在SeV载体上添加多克隆位点。
破坏在全长的仙台病毒(SeV)基因组cDNA和p SeV18+基因组cDNA中的几个限制性酶切位点，将包含上述破坏了的酶切位点的另外的酶切位点，引入每个基因的起始信号和翻译起始密码ATG之间。
在已经构建好的SeV载体cDNA添加多克隆位点和转录起始信号，其间间隔有序列终止信号，并将插入序列整合到NotI位点。
在方法1中，下述为一种推荐方法：用琼脂糖电泳分离p SeV18+的EagI消化片段(2644kb)，ClaI消化片段(3246kb)，ClaI-EcoRI消化片段(5146kb)和EcoRI消化片段(5010kb)，切下相应的带，用QIAEXII凝胶提取系统(QIAGEN)回收并纯化DNA片段。连接EagI消化片段，并传代克隆到LITMUS38上(新英格兰BIOLABS)。ClaI消化片段(3246kb)，ClaI-EcoRI消化片段(5146kb)和EcoRI消化片段(5010kb)相互连接后，传代克隆到pBluescriptIIKS+(STRATAGENE)。用Quickchange Site-Directed Mutagenesis kit(STRATAGENE)进行连续的破坏和酶切位点的引入。
为破坏酶切位点合成下列序列用于反应：Sal I(有义链)5’-ggagaagtctcaacaccgtccacccaagataatcgatcag-3’(序列号SEQ ID NO：35)(反义链)，5’-ctgactgattatcttgggtggacggtattgagacttctcc-3’(序列号SEQ IDNO：36)，Nhe I(有义链)5’-gtatatgtgttcagttgagcttgctgtcggtctaaggc-3’(序列号SEQ ID NO：37)(反义链)5’-gccttagaccgacagcaagctcaactgaacacatatac-3’(序列号SEQ ID NO：38)Xho I：(有义链)5’-caatgaactctctagagaggctggagtcactaaagagttacctgg-3’(序列号SEQ ID NO：39)(反义链)，5’-ccaggtaactctttagtgactccagcctctctagagagttcattg-3’(序列号SEQ ID NO：40)为引入酶切位点合成下列序列用于反应：NP-P(有义链)5’-gtgaaagttcatccaccgatcggctcactcgaggccacacccaaccccaccg-3’(序列号SEQ ID NO：41)(反义链)5’-cggtggggttgggtgtggcctcgagtgagccgatcggtggatgaactttcac-3’’(序列号SEQID NO：42)P-M：(有义链)5’-cttagggtgaaagaaatttcagctagcacggcgcaatggcagatatc-3’(序列号SEQ ID NO：43)(反义链)5’-gatatctgccattgcgccgtgctagctgaaatttctttcaccctaag-3’(序列号SEQ ID NO：44)，M-F：(有义链)5’-cttagggataaagtcccttgtgcgcgcttggttgcaaaactctcccc-3’(序列号SEQ ID NO：45)(反义链)5’-ggggagagttttgcaaccaagcgcgcacaagggactttatccctaag-3’(序列号SEQ ID NO：46)，F-HN：(有义链)5’-ggtcgcgcggtactttagtcgacacctcaaacaagcacagatcatgg-3’(序列号SEQ ID NO：47)(反义链)5’-ccatgatctgtgcttgtttgaggtgtcgactaaagtaccgcgcgacc-3’(序列号SEQ ID NO：48)，HN-L：(有义链)5’-cccagggtgaatgggaagggccggccaggtcatggatgggcaggagtcc-3’(序列号SEQ ID NO：49)(反义链)5’-ggactcctgcccatccatgacctggccggcccttcccattcaccctggg-3’(序列号SEQ ID NO：50)。引入后每一DNA片段均依上述相似的方法进行回收和纯化，并组建cDNA。
在方法2中，合成下列序列：(有义链)5’-ggccgcttaattaacggtttaaacgcgcgccaacagtgttgataagaaaaacttagggtgaaagttcatcac-3’(序列号SEQ ID NO：51)(反义链)5’-ggccgtgatgaactttcaccctaagtttttcttatcaacactgttggcgcgcgtttaaaccgttaattaagc-3’(序列号SEQ ID NO：52)。磷酸化后，85℃条件下2min，65℃条件下15min，37℃条件下15min进行退火，室温条件下15min整合到SeV的cDNA上。或者，用包含：终止信号-插入序列-起始信号的引物进行PCR扩增pUC 18或pBluescriptII或类似的多克隆位点进行传代克隆，然后整合到SeV的cDNA上。可利用上述方法用所得DNA对病毒进行重建。
                         序列表<110>株式会社载体研究所(DNAVEC Research Inc.)<120>副粘病毒衍生的RNP<130>D3-102PCT<140><141><150>JP1999-200740<151>1999-05-18<160>52<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>1atgcatgccg gcagatga                                            18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>2gttgagtact gcaagagc                                            18<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>3tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc                   42<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>4atgcatgccg gcagatga                                              18<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>5tgggtgaatg agagaatcag c                                          21<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>6atgcatatgg tgatgcggtt ttggcagtac                                 30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>7tgccggctat tattacttgt acagctcgtc                                 30<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>8atcagagacc tgcgacaatg c                                          21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>9aagtcgtgct gcttcatgtg g                                          21<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>10acaaccacta cctgagcacc cagtc                                      25<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>11gcctaacaca tccagagatc g                                          21<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>12acattcatga gtcagctcgc                                            20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>13atcagagacc tgcgacaatg c                                          21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>14aagtcgtgct gcttcatgtg g                                          21<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>15gaaaaactta gggataaagt ccc                                        23<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>16gttatctccg ggatggtgc                                             19<210>17<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>17gcgcggccgc cgtacggtgg caaccatgtc gtttactttg accaa                45<210>18<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>18gcgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg ctattacttc 60tgacaccaga ccaactggta                                             80<210>19<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>19ccaccgacca cacccagcgg ccgcgacagc cacggcttcg g                    41<210>20<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>20ccgaagccgt ggctgtcgcg gccgctgggt gtggtcggtg g                    41<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>21gaaatttcac ctaagcggcc gcaatggcag atatctatag                      40<210>22<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>22ctatagatat ctgccattgc ggccgcttag gtgaaatttc                      40<210>23<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>23gggataaagt cccttgcggc cgcttggttg caaaactctc ccc                   43<210>24<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>24ggggagagtt ttgcaaccaa gcggccgcaa gggactttat ccc                   43<210>25<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>25ggtcgcgcgg tactttagcg gccgcctcaa acaagcacag atcatgg               47<210>26<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>26ccatgatctg tgcttgtttg aggcggccgc taaagtaccg cgcgacc               47<210>27<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>27cctgcccatc catgacctag cggccgcttc ccattcaccc tggg                  44<210>28<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>28cccagggtga atgggaagcg gccgctaggt catggatggg cagg                  44<210>29<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>29gcggcgcgcc atgctgctgc tgctgctgct gctgggcctg                       40<210>30<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>30gcggcgcgcc cttatcatgt ctgctcgaag cggccggccg                       40<210>31<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>31gcggccgcgt ttaaacggcg cgccatttaa atccgtagta agaaaaactt agggtgaaag 60ttcatcgcgg ccgc                                                   74<210>32<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>32gcggccgcga tgaactttca ccctaagttt ttcttactac ggatttaaat ggcgcgccgt 60ttaaacgcgg ccgc                                                   74<210>33<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>33acttgcggcc gccaaagttc agtaatgtcc atgttgttct acactctg              48<210>34<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>34atccgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag cctcttcttg 60tagccttcct gc                                                     72<210>35<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>35ggagaagtct caacaccgtc cacccaagat aatcgatcag                      40<210>36<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>36ctgatcgatt atcttgggtg gacggtgttg agacttctcc                      40<210>37<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>37gtatatgtgt tcagttgagc ttgctgtcgg tctaaggc                        38<210>38<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>38gccttagacc gacagcaagc tcaactgaac acatatac                        38<210>39<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>39caatgaactc tctagagagg ctggagtcac taaagagtta cctgg                 45<210>40<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>40ccaggtaact ctttagtgac tccagcctct ctagagagtt cattg                 45<210>41<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>41gtgaaagttc atccaccgat cggctcactc gaggccacac ccaaccccac cg         52<210>42<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>42cggtggggtt gggtgtggcc tcgagtgagc cgatcggtgg atgaactttc ac         52<210>43<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>43cttagggtga aagaaatttc agctagcacg gcgcaatggc agatatc               47<210>44<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>44gatatctgcc attgcgccgt gctagctgaa atttctttca ccctaag               47<210>45<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>45cttagggata aagtcccttg tgcgcgcttg gttgcaaaac tctcccc               47<210>46<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>46ggggagagtt ttgcaaccaa gcgcgcacaa gggactttat ccctaag               47<210>47<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>47ggtcgcgcgg tactttagtc gacacctcaa acaagcacag atcatgg               47<210>48<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>48ccatgatctg tgcttgtttg aggtgtcgac taaagtaccg cgcgacc               47<210>49<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>49cccagggtga atgggaaggg ccggccaggt catggatggg caggagtcc            49<210>50<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>50ggactcctgc ccatccatga cctggccggc ccttcccatt caccctggg            49<210>51<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>51ggccgcttaa ttaacggttt aaacgcgcgc caacagtgtt gataagaaaa acttagggtg 60aaagttcatc ac                                                     72<210>52<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>52ggccgtgatg aactttcacc ctaagttttt cttatcaaca ctgttggcgc gcgtttaaac 60cgttaattaa gc                                                     72

Claims (7)

1.一种复合体，包括(a)来自副粘病毒的负链单链RNA，其中该RNA被修饰为不表达副粘病毒科病毒的至少一种包膜蛋白，和(b)由该负链单链RNA编码并与该RNA结合的蛋白。
2.根据权利要求1的复合体，其中该负链单链RNA被修饰为表达NP、P和L蛋白而不表达F、HN或M蛋白，或者它们的任意组合。
3.根据权利要求1或2的复合体，其中该负链单链RNA来自仙台病毒。
4.根据权利要求1-3中任一项的复合体，其中该负链单链RNA还编码一种外源基因。
5.一种用于基因转移的组合物，其包括根据权利要求4的复合体以及一种阳离子脂质。
6.一种用于基因转移的组合物，其包括根据权利要求4的复合体以及一种阳离子聚合物。
7.一种在细胞内表达外源基因的方法，包括往细胞内引入根据权利要求5或6的用于基因转移的组合物的步骤。
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