CN1155710C - 使用gB基因启动子的重组疱疹病毒 - Google Patents

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Abstract

一种重组疱疹病毒，它可以在用其接种的宿主动物体中有效地表达目的外源蛋白，并且能够产生出色的免疫效果。该重组疱疹病毒中整合进外源基因表达盒，其中使用了源于疱疹病毒的gB基因(一种与单纯疱疹病毒gB基因同源的基因)启动子作为表达外源基因的启动子。

Description

使用gB基因启动子的重组疱疹病毒
技术领域
本发明涉及一种新的重组病毒，它可以在动物细胞或动物体中表达外源基因，并且在避开宿主免疫系统的攻击的同时，甚至在母体抗体存在的情况下也可以在相当长的一段时间内持续感染以延长抗原的刺激作用，从而提供了一种甚至对具有母体抗体的常规动物有效的疫苗。本发明还涉及一种使用上述重组病毒的用于动物的多价活性疫苗。本发明进一步涉及一种重组病毒载体，它可被用于活体内的药物递送系统(DDS)，以生产生理活性物质，例如激素或促细胞分裂素。
发明背景
病毒载体对接种的有效性，以及它作为活体基因导入系统已被广泛研究。特别是在家禽工业中，对痘病毒，尤其是鸟痘病毒的研究已经取得了长足的进展。在这种情况下，为了开发一种更有效的载体，本发明人对由1型马立克氏(Marek’s)病毒(以下也称作“MDV1”，一种鸟类疱疹病毒)制备载体进行了研究，并且报告了其多项结果。例如，本发明人已经研究了MDV1基因组上20多个位点，结果鉴别出US10基因作为外源基因的插入位点，可以稳定地保留外源基因，但并不减弱疫苗对马立克氏病的效果(日本专利申请4-205933(日本专利出版物6-22757)；第四届国际马立克氏病讨论会(1992)，阿姆斯特丹；疫苗，1994，第12卷，953-957页)。一种将新城病毒的F蛋白基因插入到US10基因中的重组病毒，作为疫苗在SPF小鸡中显示了充分的效果，该效果在接种后至少持续24周(第四届国际马立克氏病讨论会(1992)，阿姆斯特丹)。已经证明该重组病毒甚至在有母体抗体的小鸡中，对马立克氏病和新城病都有预防效果，但预防效果多少低于在SPF小鸡中。即，该重组病毒在SPF小鸡中显示对新城病有100％的预防效果，然而在具有母体抗体的野生鸡(fieldchicken)中显示出低一些的效果，例如70-90％的水平(《(马立克氏病毒分子生物学研究组当前进展》，1995，佛罗里达)。推测效果的降低归因于当野生鸡被该重组病毒免疫的同时，通过母体抗体对新城病和马立克氏病的作用，抑制了重组病毒在体内的生长。
发明公开
如上所述，当一种包含重组病毒的活性疫苗被接种到具有母体抗体的动物中时，就产生了问题，即该病毒被被宿主免疫系统(如母体抗体)消除或其生长被抑制。因此，需要一种改进的重组病毒，在避开免疫系统的攻击的同时，它可以在相当长的一段时间内保持活性疫苗的特性，并能够持续提供抗原的刺激作用。
为了解决上述问题，本发明人注意到了源于MDV1的启动子，并且克隆了几种源于马立克氏病毒(以下也称作“MDV”)基因组的假定启动子基因。用这些启动子基因，本发明人进行了在包含外源基因的重组病毒中表达该外源基因的实验。结果发现，在本发明人克隆的几种启动子基因中，从糖蛋白B(以下也称作“gB”)基因(一种与单纯疱疹病毒gB基因同源的基因)中获得的启动子，在外源基因(例如新城病毒F蛋白(以下也称为“NDV-F”))的表达方面显示了特别出色的效果，而且，在动物体内产生了比预期的好得多的免疫效果。即，在培养的细胞中，用该启动子表达的F蛋白的量明显低于用常规启动子(例如SV40启动子)的重组病毒表达的量，但无论如何，与期望的相比，在动物(小鸡)体内观察到了相当高的免疫原性，即有该启动子的重组病毒与常规的重组病毒相比，对新城病显示出了更多的预防效果，甚至在用它免疫具有母体抗体的野生鸡时，仍能稳定地表现出95％以上的预防效果，具有母体抗体的动物的有效免疫仍是正在解决的问题。
附图的简要描述
图1是克隆的假定gB启动子片段的示意图。
图2显示了gB基因上游的核苷酸序列，以及用于核苷酸序列测定和PCR引物的每一个引物的位置。
图3显示了用gB启动子表达NDV-F蛋白的插入载体质粒(pKA4BPF和pKA4BNF)的构建。
图4显示了在US10BPF和US10BNF中插入gB启动子和NDV-F基因的理论方案，以及用于构建插入载体质粒的片段A4的位置。
图5显示了用重组病毒US10BPF和US10BNF感染后，从CEF中提取的DNA的限制性酶PstI的切割产物的Southern杂交的结果，用从gB启动子中获得的片段P或片段A4作探针。
图6是用重组病毒US10BPF、US10BNF或US10BLF接种的以及未被接种的小鸡在ELISA中抗F抗体滴度变化的曲线图。
图7是用重组病毒US10BPF接种的小鸡在ELISA中抗F抗体滴度变化的曲线图。
实施本发明的最佳方式
考虑到上述免疫实验中获得的出色的预防效果，本发明使用的由疱疹病毒获得的gB启动子据推测具有如下特性：
即，无论血液中是否存在可以对MDV诱发高抗体滴度的中和抗体，马立克氏病的活性疫苗病毒将在小鸡体内持续感染。虽然该病毒如何绕过宿主免疫系统以持续诱导抗原的刺激作用的机理是未知的，但一种可能性是：潜伏感染的病毒存在的组织不同于抗原(例如gB)表达的组织。即推测在马立克氏病毒潜伏感染的组织中，免疫系统的目标抗原不被表达，结果，病毒可以避开宿主免疫系统的防卫。推测这样的潜伏病毒经常被激活，通过感染另一个组织，并在其中表达病毒抗原来刺激免疫系统，从而诱导抗体的大量产生。
gB是一种诱导抗病毒的中和抗体产生的糖蛋白，其表达被其本身的gB基因启动子所控制，该启动子在本发明中被成功地克隆。据推测，虽然抗gB的抗体(例如中和抗体)的产生在MDV感染的小鸡中被诱发，但是MDV避开了中和抗体，并且持续感染以引起抗原刺激作用，从而产生高抗体滴度。即，推测gB启动子在特殊的细胞中表达gB，但不在MDV潜伏的细胞中表达，结果MDV持续感染，同时避开了宿主的免疫系统。相应地，通过使用表达新城病毒F蛋白的gB启动子，F蛋白的表达同样被gB启动子所控制，结果，重组病毒获得了持续感染，同时避开宿主免疫系统攻击的特性。
相反，对于本发明人迄今构建的插入不同重组病毒中的从SV40获得的启动子，虽然启动子自身的活性是很高的，但是重组病毒在可能潜伏感染的细胞表面表达F蛋白，结果，这些病毒被宿主的免疫系统作为攻击目标，并因此很容易地在活体中被排除，其原因在于缺乏上述的控制机制。在这样的情况下，尤其是存在母体抗体的情况下，推测由于被免疫系统更快速地排除，这些重组病毒不能充分繁殖。
与MDV-gB同源的其它的糖蛋白也存在于许多疱疹病毒中，并且被认为是负责预防感染的抗原(R.Eberl等，医学病毒学杂志，卷27：309-316页，(1989))。考虑到这一点，对于用作载体的马立克氏病毒和其它疱疹病毒，使用gB基因启动子被认为是对有效地表达感兴趣的外源基因以及长时间保持疫苗功效非常有效的。在优选的实施方案中，有效的重组疱疹病毒是用从疱疹病毒中获得的gB启动子基因制备的(即，该疱疹病毒本身所含有的gB启动子基因)。除MDV之外，这样的疱疹病毒包括saimiri疱疹病毒【R.C.Desrosiers等，分子和细胞生物学，卷5，2796-2803页，(1994)】；假狂犬病毒K.L.Glazenburg等，病毒学杂志，卷69，189-197页，(1995)】；1型单纯疱疹病毒(以下称作“HSV1”)【H.J.Federoff等，美国国家科学院院刊，卷59，1636-1640页，(1992)】；2型单纯疱疹病毒(以下称作“HSV2”)【J.B.David等，病毒学，卷155，322-333页，(1986)】；带状疱疹病毒【R.S.Lowa等，美国国家科学院院刊，卷84，3896-3900页，(1987)】；1型马疱疹病毒【A.R.Elizabeth等，病毒学，卷189，304-316页，(1992)】；1型牛疱疹病毒(以下称作“BHV1”)【J.C.Whitbeck等，病毒学杂志，卷62，3319-3327页，(1988)】；2型牛疱疹病毒(以下称作“BHV2”)【W.Hammerschmitdt等，病毒学，卷165，388-405页，(1988)】；1型猫疱疹病毒【R.S.Spaete等，美国国家科学院院刊，卷84，7213-7217页，(1987)；NaoakiYokoyama等，第119届日本兽医协会纪要，116页，(1995)】；火鸡疱疹病毒(以下称作“HVT”)【P.J.Sondermeijer等，疫苗，卷11，349-358页，(1993)】；人细胞肥大病毒(以下称作“HCMV”)【J.K.McDougall，细胞肥大病毒，Springer-Verlag，Berlin-Heidelberg】；6型人疱疹病毒(以下称作“HHV6”)【K.Ellinger等，普通病毒学杂志，卷74，495-500页，(1993)】；7型人疱疹病毒(以下称作“HHV7”)【Atsuko Haneda等，第42届日本病毒学协会纪要，166页，(1994)】；复发型假性白血病毒(以下称作“EBV”)【A.J.Davison等，普通病毒学杂志，卷68，1067-1079页，(1987)】等。
根据本发明，除上述外源基因的表达在接种该病毒的宿主细胞中被控制的效果以外，还发现表达外源基因的启动子基因片段比常规的启动子(例如SV40启动子)要短，由于有缩短的部分，用于表达的更长的结构基因(外源基因)可以合适地插入到质粒中，这样，质粒和重组病毒的构建变得更加容易。
借助(以实施例方式)一种重组病毒，本发明将被更详细地加以说明，在该重组病毒中，MDV被用作疱疹病毒。
本发明克隆了编码gB、US10、US537和US420的基因的5’位点【Sakaguchi等，病毒基因，卷6，365-378页，(1992)】用作从MDV获得的启动子，并使用这些基因片段进行了外源基因表达的实验。结果，在这些启动子中，gB基因的5’片段可以在培养的细胞中成功地表达外源基因，因此，gB启动子被选出进行下述的进一步研究。
MDV1基因组中的gB基因的位置已经被Anne E.Buckmaster等所报道【普通病毒学杂志，卷69，2033-2042页，(1988)】。之后，gB基因的核苷酸序列及其上游360个碱基的序列也已被报道【L.J.N.Ross等，普通病毒学杂志，卷70，1789-1804页，(1989)】。但是，尚未报道已鉴别出参与gB基因表达的启动子区域及其活力。因此，本发明人首先确定了用于重组病毒的启动子区域。
首先，参照Ross等报道的核苷酸序列【普通病毒学杂志，卷70，1789-1804页，(1989)】，设计了引物，并通过引物延伸方法测定了上游的核苷酸序列。
然后，在确定的区域中设计一个5’引物，以及就在gB开放阅读框架(ORF)前的一个3’引物，用PCR扩增并克隆约500个核苷酸。然后，一个NDV的F蛋白基因连接到该核苷酸的下游以构建一个表达质粒。同样地，只使用PCR扩增的核苷酸的3’部分，构建一个用于表达F蛋白基因的质粒，供实验使用。
为了测定启动子的活性，首先确认在培养细胞中的表达。即，该质粒被导入小鸡胚胎成纤维细胞(CEF)，F蛋白的表达通过用单克隆抗体识别F蛋白的荧光抗体法来检测。然后，用各质粒构建重组病毒，并确认F蛋白在各重组病毒中的表达。最后的实验是，将各重组病毒接种到具有母体抗体的小鸡中，并比较其免疫原性。结果，重组病毒在培养细胞中表达F蛋白的量没有差别，然而给小鸡接种后的免疫原性出乎意料地非常不同。即，发现具有PCR扩增的全部核苷酸序列的的重组病毒显示了极高的免疫原性，而只包含作为启动子的扩增序列3’部分的重组病毒显示了极低的免疫原性。
因此，作为在重组病毒中表达外源基因的gB启动子区域，不仅翻译启始密码子上游200至300个核苷酸(通常是作为启动子的最小区域)是关键的，而且包括转录控制因子的从-262核苷酸到-561核苷酸的更远的上游区域(参考图2)也是关键的。即，考虑到F蛋白在培养细胞中的表达，表明启动子的最小必需序列包含在克隆的大约500个核苷酸序列中的3’部分，但是包含在克隆序列5’部分的转录控制区域对在小鸡活体中有效表达方面起着重要的作用。
本发明中用于外源基因表达的该启动子基因片段的最优选的实施方案是这样一个基因片段，它包含序列表中SEQ ID NO：1的从第61个核苷酸到第557个核苷酸的序列。由于存在马立克氏病毒的不同的亚型，在gB启动子基因中的一部分可能发生突变。对于本发明中使用的gB启动子基因的序列，除马立克氏病毒之外，任何与上述SEQ ID NO：1中的序列高度同源的gB启动子序列都可以不加限制地用于外源基因的表达。
除马立克氏病毒1型外，其它的疱疹病毒也具有与gB蛋白氨基酸序列高度同源的结构蛋白氨基酸序列，因此，用于控制这些蛋白表达的启动子序列也可被用于构建本发明的重组质粒。
用于插入马立克氏病毒基因组的该gB启动子控制的外源基因，包括编码蛋白的各种基因，这些蛋白是针对各种小鸡疾病的可能的疫苗抗原，这些疾病包括病毒疾病、细菌疾病、寄生虫疾病等。例如，为了制备一种用于小鸡的多价疫苗，插入的外源基因包括编码新城病毒(NDV)抗原(例如编码NDV-F蛋白或HN蛋白的基因)、编码鸟类传染性喉气管炎(ILTV)的糖蛋白的基因、编码传染性粘液囊病毒(IBDV)的病毒结构蛋白的基因(例如编码VP2或全部VP243的基因)，编码传染性支气管炎病毒(IBV)的棘蛋白的基因、编码 副鸡嗜血杆菌的HA蛋白(一种传染性鼻炎的成因剂)的基因，等等。由于已表明在流感病毒的情况下，核蛋白(NP)是在不考虑血清型时用于有效预防的关键性抗原，在另一病毒中的核蛋白基因可能是用于预防的关键抗原基因。
为了表达上述外源基因，用本发明的gB启动子基因构建一个表达盒(expression cassette)，由于MDV本身具有抗马立克氏病毒疫苗的功能，所以将表达盒插入MDV以用一个单病毒(重组MDV)制备多价疫苗。如果需要，还可以制备多于2价的疫苗，并且可以通过将多种不同外源基因的表达盒插入单一病毒来制备大于3价的、只包含一种重组病毒的多价疫苗。这样的疫苗可以用已有的专业技术很容易地制备。
本发明的重组病毒可以接种到任何周龄的小鸡中。应注意，本发明的重组病毒的最显著的特征是：它可以有效地接种到具有母体抗体的小鸡(如刚刚孵出的)中。而且，它还有可能被接种到处于发育阶段的卵中，最适合的是17至18日龄的胚胎。
除了上述疫苗抗原的表达外，本发明的重组病毒还可以用作表达除接种动物的疫苗抗原之外的生理活性蛋白的病毒载体。即，由于本发明的重组疱疹病毒不是瞬态表达系统(transient expression system)，但当施用给动物时，可以在动物体内引起持续的传染性，同时避开免疫系统，因此它被认为是用于在活体内有效生产外源基因产物的非常有效的药物释放系统(DDS)。
用以下的制备方法和实施例更详细地说明本发明。
[制备方法]
(1)病毒毒株
1型马立克氏病毒CVI988毒株被用于克隆gB启动子基因区域，并构建重组病毒。
(2)病毒DNA的制备
在将该病毒接种至小鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中后，当感染的细胞强烈地表现出细胞病变(CPE)时收获它们。感染的细胞悬于1％-SDS溶液(0.1％Tris-HCl，pH7.4，1 mM EDTA，1％肌酸，Wako Junyaku Kogyo K.K.生产)，包含0.1％的蛋白激酶K(Boehlinger Mannheim)，然后将悬液在37℃静置过夜。然后，进行苯酚处理和乙醇沉淀以回收DNA，它们被溶于适量的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)，得到病毒DNA溶液。
(3)病毒DNA片段的克隆
制备的病毒DNA(5μg)用限制性酶切割，并用0.8％的琼脂糖电泳分离片段。用电洗脱法将DNA片段从凝胶中洗脱，通过苯酚处理和乙醇沉淀回收DNA片段。用连接试剂盒(Takarashuzo)将获得的片段插入适当的质粒载体(例如pUC119，Takarshuzo)，用该载体转化感受态细胞(例如，JM109)以得到大肠杆菌转化体。然后，转化体细胞在循环生长培养基中培养(BIO101公司)，该培养基包含100μg/ml的氨苄青霉素，随后用碱法从细胞中收集质粒。
(4)核苷酸序列的确定
在将基因片段克隆进pUC119的多克隆位点之后，质粒被转化进感受态细胞，例如JM109。在所获得的转化体在LB培养基中培养过夜后，30ul的转化体用60μl的M13噬菌体(109PFU/ml或更多)感染，之后继续振摇培养过夜。离心除去细胞后，从上清液中收集噬菌体，用传统方法制备包括所需基因片段的核苷酸序列的单链DNA(ssDNA)。根据这里所附的方案用SEQUENASE Ver 2.0(Toyobo)测定所获的单链DNA的核苷酸序列。
(5)PCR
病毒DNA(0.1μg)溶于1×Vent缓冲液(10mM KCl，20mM Tris-HCl，pH8.8，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4)，其中包含100μg/ml BSA，并且加入0.5mM dNTP，上游和下游引物各100pmmol，以及1μl Vent DNA聚合酶(New England BioLabs)。反应进行35个循环，每个循环为95℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟。
(6)荧光抗体(FA)法
106个细胞/孔的CEF被接种到一个有盖玻片的6孔平板(MATSUNAMI No.1，18X18)中，并在含有5％FBS的伊格尔培养基中于37℃培养5小时。用无血清的伊格尔培养基洗两次后，加入1ml含有10μg lipofectin和30μg插入质粒的无血清伊格尔培养基，然后在37℃培养细胞16小时。加入1ml含有10％FBS的伊格尔培养基后，培养两天，然后除去盖玻片，将细胞在室温下与丙酮混合20分钟，之后贮存于-80℃。F蛋白在重组病毒中的表达通过如下方法确认，与用PBS(-)稀释20倍的抗NDV-F单克隆抗体#3 13的反应(Y.Umino等，普通病毒学杂志，卷71，1199页，(1990))，在4℃下过夜，然后与FITC标记的、用PBS(-)稀释20倍的抗鼠IgG在37℃下反应2小时，之后洗涤，并在荧光显微镜下观察。
(7)重组病毒的制备
37℃过夜培养的CEF原代培养物在用EDTA-胰蛋白酶溶液收获并清洗之后，被悬于补充了5％牛血清(BS)的伊格尔-MEM(E-MEM：Nissui)，细胞浓度为2×105细胞/毫升。在一个Falcon生产的组织培养瓶(3028号)中加入40毫升的悬液，并接种约8×105个用马立克氏病毒感染的CEF细胞，随后在37℃培养4小时。然后，细胞再次用EDTA-胰蛋白酶溶液收获并清洗，并用PBS(-)清洗两次，其中5×106个细胞被转入Bio-Rad公司生产的基因脉冲仪(Gene Pulser，目录号165-2075)的反应池中，并加入插入质粒。按照所附的方案施加脉冲以使插入质粒导入病毒感染的细胞中。然后，将细胞悬于15ml补充了5％BS的E-MEM(Nissui)中，再转入直径10厘米的培养皿(Falcon生产，3003号)中，在37℃培养。次日，除去培养基以及未吸附的细胞，加入原代培养的CEF(第二CEF)，后者在前一天被单独培养，并悬于15ml补充了5％BS的E-MEM(尼素依)中，浓度为5×105细胞/毫升，在37℃继续培养4至7天。
在用E-MEM培养基清洗了出现培养斑的培养皿后，加入含有单克隆抗体#313的等渗溶液，在室温下使反应进行1小时。清洗后，加入用等渗溶液稀释200倍的过氧化物酶标记的鼠抗体(Bio-Rad Code No.172-1011)，在室温下继续使反应进行1小时。清洗后，加入每10ml包含5mg3，3-二氨基联苯胺四盐酸(DAB；Wako Junvaku Kogyo K.K.，CodeNo.343-00901)和1.6mg的过氧化氢(Mitsubishi Gasu Kagaku K.K.，含31％H2O2)的0.1 M Tris缓冲液，反应在室温下进行10至60分钟以使重组病毒斑着色。染成棕色的斑被封入青霉素杯(cup)中，只有在杯中的部分被含0.1％EDTA的胰蛋白酶溶液切割，以收获用重组病毒感染的细胞，这些细胞用新鲜的CEF培养来纯化重组病毒。确认100％的病毒斑表达F蛋白之后，按照日本专利申请4-205933号(日本专利出版物6-22757)中所描述的方法进行两次超声处理来得到无细胞的病毒，从而完成重组病毒的纯化。
(8)Southern杂交
使用Boehlinger Mannheim生产的DIG-DNA标记试剂盒(目录号150350)，根据所附的使用说明制备探针并进行杂交。
用上述方法获得的适量的重组病毒DNA在琼脂凝胶上走电泳，电泳后，被转移至Hybond N+(Amersham，日本，目录号PRN.303B)。根据使用说明进行杂交。然后，使用Boehlinger Mannheim生产的DIG-DNA检测试剂盒(目录号150350)，根据所附方案检测目的DNA。
(9)免疫测试
1日龄的Babcock小鸡用每只鸡104PFU的重组病毒皮下接种。自接种4周后开始，周期性地从每组小鸡中取血，并用ELISA检测重组病毒诱导的抗F蛋白抗体的滴度变化。使用了用于检测抗体的ELISA法，其中被固定于一个96孔的组织培养用的平板上的持续产生F蛋白的细胞(在β肌动蛋白基因启动子控制下，用NDV-F基因转化的鼠骨髓瘤细胞P3-X63-AG8.653)被用作一种抗原，见日本专利申请第5-96727号(日本专利出版物6-289028)中公开的详细方法。
另一方面，为了评价对新城病毒感染的预防效果，每组小鸡中的半数在6周龄时用104致命剂量的有毒的NDV Sato毒株进行肌肉内攻击，并观察2周。关于对1型马立克氏病毒感染的预防效果，用500PFU/鸡的极毒的MDV(vvMDV)RBIB(感染的脾细胞)进行的腹膜间攻击在1周龄时施行，观察小鸡至10周龄。杀死所有存活的小鸡，验尸以检查肿瘤损害的情况。
(10)从小鸡体内回收病毒
在用1ml吸入肝素的注射器取血后，加入PBS(-)至4ml，它们被轻轻涂覆到在锥形管(Falcon，目录号2099)中的3ml Ficoll-Paque(Pharmacia)上，并在1500rpm离心5分钟(库拨塔，KN-30F)。除去含有淋巴细胞和单核细胞(Buffy coat)的中间层，在悬于含0.1％EDTA的PBS(-)后，再次在1000rpm离心5分钟以收集淋巴细胞和单核细胞，它们被接种到培养了4小时的CEF中(第二CEF)并且CEF被培养、观察10天。对那些没有显示MDV的CPE的CEF，它们被继续培养得到第3代，然后进行评价。
[实施例]
以下通过实施例说明一种载体(其中马立克氏病毒被用作疱疹病毒)，gB启动子区域的克隆和重组病毒的构建，以用于构建鸡的重组活疫苗。
实施例1：确定gB基因上游的核苷酸序列
包含Ross等[普通病毒学杂志，卷70，1789-1804页，(1989)]描述的gB基因核苷酸序列的BamHI-I3片段用限制性酶EcoRV和SspI切割，所得的约1.2Kbp的片段被亚克隆进pUC119。如“制备方法”中所述，用该质粒确定gB基因上游更远的一个区域的核苷酸序列。首先被确定的是上游方向约300bp的核苷酸序列，然后测定下游方向到SspI位点的序列，这样整个557bp的核苷酸序列就被确定了。结果示于SEQ ID No：1。SEQID No：2中从核苷酸558到翻译启始密码子ATG(核苷酸624)之间的片段是在上述557 bp序列的3’位置，并已被Ross等报道(引文同上)。本发明使用的用于测定核苷酸序列的引物对应于SEQ ID No：1中核苷酸275至291。
实施例2：通过PCR克隆gB基因启动子区域
引物的设计基于实施例1中获得的核苷酸序列(参见SEQ ID No：1)，用于上游引物，或基于Ross等报道的序列[普通病毒学杂志，卷70，1789-1804页，(1989)]，用于下游引物。即，上游引物被设计为SEQ IDNo：1中核苷酸61至82之间的序列，下游引物是核苷酸566至586之间的序列。引物的每个序列如下所示。
上游
5’-GGAATTCCGTGTTGAAAATGTAGGGCTGCT-3’
下游
5’-GGAATTCCTGTGAGATAAAATGCAGGGAC-3’
PCR的条件如下：病毒DNA 0.1μg溶于1×Vent缓冲液(10mM KCl，20mM Tris-HCl，pH8.8，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4)，它包含100μg/mlBSA，然后向该溶液中加入0.5mM dNTP，上游和下游引物各100pmmol以及1μl Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)。反应进行35个循环，每个循环包括95℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟。结果，大约0.5Kbp的DNA片段被成功地扩增。该DNA片段用EcoRI和SspI切割，得到一个约0.5Kbp的DNA片段(以下称为“片段P”，相当于SEQ ID No：1中核苷酸61至557的核苷酸序列)，使用EcoRI和NdeI得到230bp的DNA片段(以下称为“片段N”，相当于SEQ ID No：2中核苷酸359至586的核苷酸序列)，作为gB基因启动子区域(参见图1和2)。
实施例3：用于通过gB启动子表达NDV-F蛋白的插入载体质粒的构建
在用限制性酶HindIII和XbaI切割通过SV40晚期启动子表达NDV-F蛋白的插入载体质粒pKA4BLF(在日本专利申请4-205933号(日本专利出版物6-22757)中描述)后，从SV40晚期启动子序列中获得的大约7.9Kbp的DNA片段用0.8％的琼脂凝胶电泳回收。该片段用平末端连接试剂盒(TaKaRa)平末端后，gB基因启动子片段P或N被克隆。在获得的质粒中，在正确的方向，即在可以表达NDV-F的方向上包含gB启动子片段P的质粒，被称为“pKA4BPF”，在正确的方向包含片段N的质粒被称为“pKA4BNF”(图3)。
实施例4：通过荧光抗体法确定NDV-F蛋白的表达
进行如“制备方法”中所描述的FA，结果表明pKA4BPF和pKA4BNF都在CEF中表达了NDV-F蛋白。没有发现导入各质粒的细胞的荧光强度有差别，因此推测片段P和N在CEF中的启动子活性基本上是相同的。
实施例5：重组病毒US10BPF和US10BNF的制备
实施例3中构建的插入质粒pKA4BPF和pKA4BNF用限制性酶ScaI切割而线性化后，按照重组病毒“制备方法”中所描述的方法将这些质粒导入CVI988毒株感染的细胞中。这样获得的重组病毒被分别称为“US10BPF”和“US10BNF”。重组病毒斑用抗F蛋白单克隆抗体DAB(日本专利申请4-205933号(日本专利出版物6-22757))染色。结果，两种重组病毒在表达F蛋白的量方面没有显著的区别，因此推测片段P和N在培养细胞中的启动子活性基本上是相同的。
为了确定重组病毒US10BPF和US10BNF中表达盒的插入位置，从感染的CEF中提取出的DNA被限制性酶切割，并进行Southem杂交。通过使用gB启动子片段P和A4中任何一个作为探针，只有那些期望的带被检测到，以确认通过同源重组完成了表达盒的插入，并且重组病毒的纯化确实发生了(图4和5)。
实施例6：免疫检测
为了证明制备的US10BPF和US10BNF对新城病(ND)的疫苗效果，1日龄的小鸡被用这些重组病毒接种，并在6周后进行攻击实验。结果示于表1。此处使用的对照之一的US10BLF是重组病毒，其中F蛋白的表达受控于SV40晚期启动子，它是通过插入质粒pKA4BF制备的，其构建方法公开于日本专利申请第4-205933号(日本专利出版物6-22757)中。该重组病毒在SPF小鸡中对NDV攻击显示了很强的疫苗功效，但是ND的预防效果如表1所示在具有母体抗体的小鸡中被减弱。如表1所示，对照组的小鸡和没有接种的SPF小鸡都表现出了0％的预防率，然而，所有小鸡、甚至有母体抗体的小鸡用US10BPF接种后，那些在gB基因启动子控制下表达F蛋白的重组病毒表现了出色的疫苗效果。但是，包含gB-N启动子(具有gB-P启动子一半长度的gB启动子)的重组病毒US10BNF，没有表现出疫苗效果。虽然在培养细胞中，US10BNF显示的F蛋白的表达水平与US10BPF相当，但是体内US10BPF和US10BNF的预防效果相差甚远，这说明使用gB-P区域作为启动子是向活体施用的重组病毒表达外源基因所必需的。
至于抗马立克氏病(MD)疫苗效果，从表2中可以清楚地看出，本发明的重组病毒US10BPF对极毒的马立克氏病毒1型表现出了90％的免疫率(protective rate)，该免疫率相当于或大于其亲本毒株的(非重组的)，后者免疫率为89％，以及作为商品可以买到的MDV1疫苗，其免疫率为84％。
如上所述，本发明的重组病毒US10BPF被证明对新城病(ND)和马立克氏病(MD)显示了很强的预防效果，因此可用作多价疫苗。
                                表1
接种病毒     启动子    被保护的鸡数/受攻击的鸡数(免疫率)
US10BLF     SV40晚期               14/20(70％)
US10BPF     gB-P                   20/20(100％)
US10BNF     gB-N                   0/20(0％)
未接种        -                    0/20(0％)
                              表2
病毒     接种量(PFU)  受试鸡(数)  MD发病(数)  MD免疫率(％)
US10BPF    10000        20            2            90％
           1000         20            6            70％
*1         10000        19            2            89％
           1000         20            9            55％
*2         1剂量        19            3            84％
*3         (-)          20            19           5％
*1：非重组病毒(亲本毒株)
*2：市售MDV1疫苗
*3：未免疫
小鸡血清中抗F抗体的滴度用ELISA测量，如图6所示。在未接种组中的抗体滴度为母体抗体滴度，而且随时间的增加而减少。在US10BLF组中，只有在母体抗体降低到一定程度，即第5至第6周，抗F蛋白抗体的滴度才开始增加。另一方面，在用US10BPF接种的小鸡中，抗体滴度一到第4周就开始增加，在第6周进行攻击时，其滴度比US10BLF中的高许多。在此方面，US10BNF在第5至第6周时，抗体滴度多少增加了一些，但是没有达到预防新城病毒攻击的程度，它支持攻击实验的结果。
在用US10BPF接种后的一年中发现了小鸡抗F抗体滴度的变化，结果示于图7。抗F抗体滴度全年超过用US10BLF接种组的抗F抗体滴度，即0.65(图6)，它是从新城病毒攻击实验中70％的免疫率(表1)得到的，这说明在大多数个体中，重组病毒的疫苗效果至少持续一年。
接种后第7周回收病毒，结果示于表3。US10BLF为0/5(+)，即没有病毒回收，而US10BPF是5/5(+)，即高度病毒血症，表明US10BPF在体内显示了出色的繁殖性能。而且，回收的所有的重组病毒斑都表达了F蛋白，确认了本发明的重组病毒甚至在体内也是遗传学稳定的，并且能持续传染。这证明了本发明的病毒载体系统不仅是一个转运表达系统，而且即使存在母体抗体时也持续感染，因此是一种非常有用的药物释放系统(DDS)，适用于在活体内有效地生产外源基因产物。相应地，本发明的系统不仅是一个施用疫苗的载体，而且也是在活体内释放需要长期供应的物质(例如激素或促细胞分裂素)的非常有用的DDS。
                        表3
接种的病毒    启动子   小鸡编号     病毒回收
                                   回收   重组病毒率
US10BLF       SV40晚期    61        -
                          62        -
                          63        -
                          64        -
                          65        -
US10BPF       gB-P        51        +        69/69
                          52        +4       7/47
                          53        +        22/22
                          54        +        9/9
                          55        +        48/48
序列表
SEQ ID NO：1
序列长度：557
序列类型：核苷酸
链型：双链
拓扑结构：线型
分子类型：基因组DNA
来源：微生物：1型马立克氏病毒
序列描述：
GATGTTTAGT CACGATAGAC ATCGGTTCGC CCCAGCCGTC GAATACAGCA TTATATTTTA  60
GTGTTGAAAA TGTAGGGCTG CTTCCTCACT TAAAGGAGGA AATGGCTCGA TTCATGTTTC  120
ATAGCAGTAG AAAAACAGAT TGGACCGTCA GTAAGTTTAG AGGGTTTTAT GACTTTAGCA  180
CTATAGATAA TGTACTGCGG CCCATCGCAT GGCTTGGAAA TATATCAAAG AACTGATTTT  240
TGCAACAGCT TTATTTTCTT CTGTATTTAA ATGTGGCGAA TTGCACATCT GTCGTGCCGA  300
CAGTTTGCAG ATCAACAGCA ATGGAGACTA TGTATGGAAA AATGGAATAT ATATAACATA  360
TGAAACCGAA TATCCACTTA TAATGATTCT GGGGTCAGAA TCAAGCACTT CAGAAACGCA  420
AAATATGACT GCAATTATTG ATACAGATGT TTTTTCGTTG CTTTATTCTA TTTTGCAGTA  480
TATGGCCCCC GTTACGGCAG ATCAGGTGCG AGTAGAACAG ATTACCAACA GCCACGCCCC  540
CATCTGACCC GTCCAAT                                                 557
SEQ ID NO：2
序列长度：624
序列类型：核苷酸
链型：双链
拓扑结构：线型
分子类型：基因组DNA
来源：微生物：1型马立克氏病毒
序列描述：
GATGTTTAGT CACGATAGAC ATCGGTTCGC CCCAGCCGTC GAATACAGCA TTATATTTTA  60
GTGTTGAAAA TGTAGGGCTG CTTCCTCACT TAAAGGAGGA AATGGCTCGA TTCATGTTTC  120
ATAGCAGTAG AAAAACAGAT TGGACCGTCA GTAAGTTTAG AGGGTTTTAT GACTTTAGCA  180
CTATAGATAA TGTACTGCGG CCCATCGCAT GGCTTGGAAA TATATCAAAG AACTGATTTT  240
TGCAACAGCT TTATTTTCTT CTGTATTTAA ATGTGGCGAA TTGCACATCT GTCGTGCCGA  300
CAGTTTGCAG ATCAACAGCA ATGGAGACTA TGTATGGAAA AATGGAATAT ATATAACATA  360
TGAAACCGAA TATCCACTTA TAATGATTCT GGGGTCAGAA TCAAGCACTT CAGAAACGCA  420
AAATATGACT GCAATTATTG ATACAGATGT TTTTTCGTTG CTTTATTCTA TTTTGCAGTA  480
TATGGCCCCC GTTACGGCAG ATCAGGTGCG AGTAGAACAG ATTACCAACA GCCACGCCCC  540
CATCTGACCC GTCCAATATT CTTGTGTCCC TGCATTTTAT CTCACACAAT TTATGAACAG  600
CATCATTAAG ATCATCTCAC TATG                                         624

Claims (4)

1.一种重组1型马立克氏病毒，它掺入了一个外源基因表达盒，其中来自1型马立克氏病毒的gB基因启动子被用作表达外源基因的启动子，该外源基因编码有效预防小鸡疾病的疫苗抗原，其中所述gB基因启动子含有SEQ ID NO：1的61-557位核苷酸的序列区。
2.权利要求1的重组1型马立克氏病毒，其中所述外源基因是新城疫病毒F蛋白基因。
3.一种用于小鸡的活疫苗，它包含权利要求1中的重组1型马立克氏病毒。
4.一种用于小鸡的多价活疫苗，它包含权利要求2中的重组1型马立克氏病毒。
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