JP6679484B2

JP6679484B2 - ヒトヘルペスウイルス三量体糖タンパク質Ｂ、三量体ｇＢを含むタンパク質複合体、及びワクチンとしてのそれらの使用

Info

Publication number: JP6679484B2
Application number: JP2016535131A
Authority: JP
Inventors: シンラツェイ; クリフォードエム．スナッパー; ジェームズジェイ．モンド
Original assignee: ザヘンリーエム．ジャクソンファウンデーションフォーザアドヴァンスメントオブミリタリーメディシンインコーポレイテッド
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2020-04-15
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: CN106102769A; WO2015089340A1; AU2014362234A1; CA2931853A1; CA2931853C; EP3079718A1; US9907844B2; EP3079718A4; US20160303225A1; JP2017500298A; AU2014362234B2

Description

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１３年１２月１１日付で出願された米国仮特許出願第６１／９１４，９０３号の利益を主張し、その出願日に依拠し、その開示全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

［政府の権利］
本発明は一部、米国軍保健科学大学（USUHS Dean’s Research and Education Endowment）の政府による支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。

［配列表］
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。２０１４年１２月１１日付けで作製された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前はＨＭＪ−１４３−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、１０３３４５バイトのサイズである。

ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は普遍的に存在する病原体であり、免疫不全宿主において重症疾患を引き起こす。ＨＣＭＶは先進国世界において最もよく見られる子宮内感染するウイルス感染であり、新生児における先天性欠損の主な原因となっている。米国及び欧州では、全生産児の推計０．２％〜１．２％がＨＣＭＶに感染する。先天性ＨＣＭＶ感染は小児における感音性難聴の主要原因であり、小児における中枢神経系損傷の主要感染原因となっている。

このウイルスは新生児に加えて、臓器移植レシピエント及びＨＩＶ感染者等の免疫抑制患者においても重症疾患を引き起こし得る。ＨＣＭＶはこれらの患者において日和見病原体となり、罹患率及び死亡率の高い重症疾患を引き起こす可能性がある。

ＨＣＭＶはヘルペスウイルス科のエンベロープ二本鎖ＤＮＡ β−ヘルペスウイルスである。ヘルペスウイルス科の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）は、その融合活性形態の共通の三量体構造及びヘアピンの融合後三量体を有するＩＩＩ型融合タンパク質である。ＨＣＭＶｇＢはＵＬ５５遺伝子によってコードされ、感染細胞において９０６アミノ酸前駆体分子として合成される。アミノ末端シグナル配列は新生ポリペプチドを小胞体（ＥＲ）へと指向し、そこでｇＢはフォールディングし、同一の分子によって形成されるジスルフィド依存性高分子複合体へと急速に会合する。ＨＣＭＶｇＢはＥＲからの輸送後にゴルジ装置に入り、そこでグリコシル化を受け、宿主のサブチリシン様酵素であるフーリンによるタンパク質分解によってアミノ末端及びカルボキシ末端フラグメント（それぞれｇｐ１１５及びｇｐ５５）へとプロセシングされる。これら２つのｇＢの単量体形態のフラグメント（ｇｐ１１５及びｇｐ５５）は、分子内ジスルフィド結合によって互いに結び付けられる。次いで、成熟産物が感染細胞の表面へと送達され、そこでエンドソーム小胞と細胞膜との間で再利用され、最終的にビリオンへと組み込まれる。ネイティブＨＣＭＶｇＢは近年、ホモ三量体である関連ウイルスにおけるｇＢタンパク質、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ｇＢ及びエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ｇＢの３Ｄ結晶構造に基づいてホモ三量体と仮定されている（２９〜３２）。ＨＣＭＶ関連疾患を標的とする弱毒化生ワクチン及びサブユニットワクチンを含む様々なワクチンが開発されている。例えば、ｇＢはウイルス−宿主細胞融合、ひいてはウイルス侵入の媒介におけるその重要な役割に基づいて中和抗体を誘発する主要ワクチン標的抗原とみなされる。実際に、ヒト血清中の中和抗体のかなりの部分がｇＢエピトープに特異的である。ＨＣＭＶ感染の予防に効果的なワクチンを開発する取組みにおいて、このｇＢに対する体液性応答を利用する他の試みもなされている。例えば、組み換えｇＢタンパク質が非特許文献１及び国際公開第２０１２／０４９３１７号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。類似の方法で行われるｇＢタンパク質の分析に基づくと、この組み換えｇＢタンパク質は主として二量体ｇＢ、並びに微量の単量体及び三量体ｇＢから構成されると考えられる。この組み換えｇＢタンパク質は、フーリン切断部位でｇＢをコードする遺伝子を突然変異させ、この部位を無効にし、膜貫通ドメインを欠失させることで細胞外及び細胞内ドメインを残すことによって生成した。

この組み換えｇＢタンパク質に基づくワクチンが第２相臨床試験に使用されている（非特許文献２）。３つの用量のＨＣＭＶワクチン又はプラシーボをＨＣＭＶ血清反応陰性の女性に出産後１年以内に０、１ヶ月及び６ヶ月の時点で与えた。ＨＣＭＶ感染を、４２ヶ月間にわたって四半期試験中の女性において糖タンパク質Ｂ以外のＨＣＭＶタンパク質に対するＩｇＧ抗体についてのアッセイを用いて決定した。感染をウイルス培養又は免疫ブロット法によって確認した。主要エンドポイントはＨＣＭＶ感染の検出までの時間とした。ＨＣＭＶワクチンを受ける２３４人の被験体及びプラシーボを受ける２３０人の被験体を無作為に割り当てた。最低でも１年間の経過観察の後、ワクチン群１８人及びプラシーボ群３１人の４９人に感染が確認された。カプラン・マイヤー分析から、ワクチン群が４２ヶ月の期間にわたってプラシーボ群よりも非感染のままである可能性が高いことが示された（Ｐ＝０．０２）。１００人年当たりの感染率に基づくワクチン有効性は５０％（９５％信頼区間、７〜７３）であった。被験体の乳児においてワクチン群では１例の先天性感染、プラシーボ群では３例の感染が生じた。

しかしながら、第３相臨床試験が始められたＨＣＭＶの予防用のワクチン候補は存在しない。ＨＣＭＶ感染時のｇＢの天然立体構造は三量体であると予測されるが、組み換え三量体ｇＢの作製に成功したという報告はない。

同様に、ヒトヘルペスウイルス４としても知られるエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は免疫抑制患者におけるバーキットリンパ腫、上咽頭癌、伝染性単核球症、一部のホジキン病及びリンパ球増殖性症候群等の病理学的疾患単位（pathologic entities）に関与する罹患率及び死亡率の主な世界的原因である。ＥＢＶは、Ｂ細胞及び上皮細胞に感染する二本鎖線状ＤＮＡゲノムを有するγ−ヘルペスウイルスである。ＥＢＶ感染を標的とする開発中のワクチンは糖タンパク質３５０（ｇｐ３５０）に焦点を合わせたものであるが（非特許文献３）、ＥＢＶ感染時の天然立体構造が三量体であることが示されているＥＢＶｇＢを標的としたＥＢＶの予防用のワクチン候補は存在しない（非特許文献４）。

Spaete et al., A recombinant subunit vaccine approach to HCMV vaccine development, Transplantation Proceedings, Vol 23, No 3, Suppl 3 (June), 1991: pp 90-96 Pass et al., Vaccine Prevention of Maternal Cytomegalovirus Infection, N Engl J Med 2009; 360:1191-1199 E.M. Sokal et al., J. Infect. Dis. 196: 1749 (2007) Backovic M, Longnecker R, Jardetzky TS. 2009. Structure of a trimeric variant of the Epstein-Barr virus glycoprotein B. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 2880-5

本開示は、ヘルペスウイルス感染に対する免疫応答を増強する新たな改善された戦略を提供する。これらの改善された戦略は、ペプチドリンカーをヘルペスウイルスｇＢポリペプチド細胞外ドメインのフーリン切断部位に挿入することによって修飾ヘルペスウイルスｇＢを作り出すことを含む。ペプチドリンカーの挿入によりフーリン認識配列が除去され、そのため修飾ヘルペスウイルスｇＢの発現によって、免疫原性の増強をもたらすホモ三量体ｇＢ複合体が作製される。いかなる理論にも束縛されることを意図するものではないが、かかるリンカー配列により修飾ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドがネイティブ立体構造フォールディングを受け、ホモ三量体を形成することができると考えられる。

別の態様は、修飾ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドをコードする組み換え核酸、及び細胞内で修飾ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドを発現させるために組み換え核酸を使用する方法である。更に別の態様は、被験体に修飾ヘルペスウイルスｇＢポリペプチド又はそれをコードする核酸を含むワクチン組成物を投与することにより被験体において免疫応答を誘導する方法であって、該ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドが被験体において免疫応答を誘導する、方法に関する。ワクチン組成物は、糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）、糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）、糖タンパク質３５０（ｇｐ３５０）、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１又はそれらの組合せの１つ又は複数を含むが、これらに限定されない他のヘルペスウイルス抗原を任意に含み得る。

別の態様は、ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体と、ヘルペスウイルスｇＨ糖タンパク質と、ヘルペスウイルスｇＬ糖タンパク質とを含むタンパク質複合体であって、該ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体が３つの修飾ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドの三量体を含む、タンパク質複合体に関する。幾つかの実施の形態では、ヘルペスウイルスｇＨ及びｇＬ糖タンパク質はヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質を含む。幾つかの実施の形態では、タンパク質複合体はヘルペスウイルスＵＬ１２８、ＵＬ１３０又はＵＬ１３１ポリペプチドの１つ又は複数を更に含む。

タンパク質複合体を作製する方法であって、第１のタンパク質及び少なくとも第２のタンパク質をｉｎｖｉｔｒｏでインキュベートしてタンパク質複合体を形成することを含む、方法も提供される。一実施の形態では、該タンパク質複合体を作製する方法は、３つの修飾ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドの三量体を含むヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体、ヘルペスウイルスｇＨ糖タンパク質及びヘルペスウイルスｇＬ糖タンパク質をｉｎｖｉｔｒｏでインキュベートし、タンパク質複合体を形成することを含む。幾つかの実施の形態では、ヘルペスウイルスｇＨ及びｇＬ糖タンパク質はヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質を含む。幾つかの実施の形態では、該方法はヘルペスウイルスＵＬ１２８、ＵＬ１３０又はＵＬ１３１ポリペプチドの１つ又は複数をインキュベートすることを更に含む。このため、幾つかの実施の形態では、該方法は修飾ヘルペスウイルスｇＢタンパク質のホモ三量体の複合体、ヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質、並びに任意にヘルペスウイルスＵＬ１２８、ヘルペスウイルスＵＬ１３０及びヘルペスウイルスＵＬ１３１ポリペプチドをインキュベートすることを含む。

ヘルペスウイルスタンパク質複合体を含むワクチン組成物を被験体に投与することによって被験体において免疫応答を誘導する方法であって、ヘルペスウイルスタンパク質複合体が被験体において免疫応答を誘導する、方法も提供される。ヘルペスウイルスタンパク質複合体はヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体と、ヘルペスウイルスｇＨ糖タンパク質と、ヘルペスウイルスｇＬ糖タンパク質とを含み、該ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体は３つの修飾ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドの三量体を含む。幾つかの実施の形態では、ヘルペスウイルスｇＨ及びｇＬ糖タンパク質はヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質を含む。幾つかの実施の形態では、タンパク質複合体はヘルペスウイルスＵＬ１２８、ＵＬ１３０又はＵＬ１３１ポリペプチドの１つ又は複数を更に含む。このため、幾つかの実施の形態では、タンパク質複合体は修飾ヘルペスウイルスｇＢタンパク質のホモ三量体の複合体、ヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質、並びに任意にヘルペスウイルスＵＬ１２８、ヘルペスウイルスＵＬ１３０及びヘルペスウイルスＵＬ１３１Ａポリペプチドを含む。

引用することにより本明細書の一部をなす添付の図面は、いくつかの実施形態を解説し、本明細書と共に本明細書に開示される構築物及び方法のいくつかの原理を説明するのに役立つ。

抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を用いた完全還元条件下でのＨＣＭＶｇＢのウエスタンブロット分析を示す図である。抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を用いた部分還元条件下でのＨＣＭＶｇＢのウエスタンブロット分析を示す図である。抗ＨＣＭＶｇＢモノクローナル抗体を用いた修飾ネイティブ条件下でのウエスタンブロットを示す図である。抗ＨＣＭＶｇＢモノクローナル抗体を用いた還元条件下でのウエスタンブロットを示す図である。野生型ＨＣＭＶｇＢと本開示の修飾ＨＣＭＶｇＢとの間の概略的な差を示す図である。本開示の修飾ＨＣＭＶｇＢ（「三量体」）が、非特許文献２により第２相臨床試験に使用されたものとほぼ同一である非三量体対照ＨＣＭＶｇＢ（「Ｓｉｎｏ」）よりも顕著に高免疫原性であることを示す図である。修飾ＨＣＭＶｇＢと対照タンパク質との間の有意性、スチューデントｔ検定によるｐ＜０．０５。０日目、２１日目及び４２日目に三量体ＨＣＭＶｇＢにより免疫化したウサギにおけるＨＣＭＶｇＢ特異的ＩｇＧの血清力価を示す図である。ＭＲＣ−５線維芽細胞を用いて生ＨＣＭＶに対する三量体ＨＣＭＶｇＢにより免疫化したウサギに由来する血清のｉｎｖｉｔｒｏ中和活性を示す図である。ＣＭＶ免疫患者に由来するヒト血清を陽性対照として用いた（「ヒト血清」）。ＡＲＰＥ−１９上皮細胞を用いて生ＨＣＭＶに対する三量体ＨＣＭＶｇＢにより免疫化したウサギに由来する血清のｉｎｖｉｔｒｏ中和活性を示す図である。ＣＭＶ免疫患者に由来するヒト血清を陽性対照として用いた（「ヒト血清」）。抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を用いた還元条件下での三量体ＥＢＶｇＢのウエスタンブロット分析を示す図である。抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を用いた非還元条件下での三量体ＥＢＶｇＢのウエスタンブロット分析を示す図である。抗ＥＢＶｇＢ抗体を用いた非還元条件下での三量体ＥＢＶｇＢのウエスタンブロット分析を示す図である。野生型ＥＢＶｇＢと本開示の修飾ＥＢＶｇＢとの間の概略的な差を示す図である。抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を用いた還元条件下でのＨＣＭＶｇＨ／ｇＬヘテロ二量体のウエスタンブロット分析を示す図である。抗ＨＣＭＶｇＨ抗体を用いた還元条件下でのＨＣＭＶｇＨ／ｇＬヘテロ二量体のウエスタンブロット分析を示す図である。非還元条件下でのＨＣＭＶｇＢ／ｇＨ／ｇＬタンパク質複合体のウエスタンブロット分析を示す図である。

以下の発明を実施するための形態は読者に本発明の幾つかの実施形態、特徴及び態様の詳細のより十分な理解をもたらすために提示され、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではないことを理解されたい。

定義。本発明がより容易に理解され得るように、幾つかの用語を初めに定義する。付加的な定義は発明を実施するための形態の全体にわたって説明する。

「ペプチドリンカー」という用語は、２つのタンパク質又はタンパク質のフラグメントを連結する短い非ネイティブペプチド配列を指す。

「ヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質」という用語は、ヘルペスウイルスｇＬタンパク質に接合したヘルペスウイルスｇＨタンパク質を含む組み換え融合タンパク質を指す。ヘルペスウイルスｇＨタンパク質は、ペプチドリンカーによってヘルペスウイルスｇＬタンパク質に接合することができる。

「修飾細胞外ドメイン」という用語は、アミノ酸配列がネイティブアミノ酸配列とならないように操作されたヒトヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂの細胞外ドメインを指す。本明細書で使用される場合、ヒトヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂの細胞外ドメインは、ペプチドリンカーをフーリン切断部位に挿入し、フーリン認識配列を効果的に除去することによって修飾されている。かかるヒトヘルペスウイルスの例としては、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウイルス−１）、ＨＳＶ−２（単純ヘルペスウイルス−２）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）及びＨＳＨＶ（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。

「修飾ヘルペスウイルスｇＢ」及び「修飾ヘルペスウイルスｇＢポリペプチド」という用語は区別なく使用され、修飾細胞外ドメインを含むヒトヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂポリペプチドを指す。

「修飾ＨＣＭＶｇＢ」及び「修飾ＨＣＭＶｇＢポリペプチド」という用語は区別なく使用され、修飾細胞外ドメインを含むヒトＣＭＶ糖タンパク質Ｂポリペプチドを指す。

「修飾ＥＢＶｇＢ」及び「修飾ＥＢＶｇＢポリペプチド」という用語は区別なく使用され、修飾細胞外ドメインを含むヒトエプスタインバーウイルス糖タンパク質Ｂポリペプチドを指す。

「リーダー配列」という用語は、細胞による組み換えタンパク質の分泌を指向する組み換えタンパク質のＮ末端の短いペプチド配列を指す。

「ホモ三量体」、「ホモ三量体複合体」及び「ホモ三量体の複合体」という用語は区別なく使用され、３つの修飾ヘルペスウイルス又はＨＣＭＶｇＢポリペプチド等の３つのポリペプチドの会合を指す。

「薬学的に許容可能な担体」又は「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、薬学的投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤等を意味する。薬学的に活性な物質へのかかる媒体及び作用物質の使用は当該技術分野で既知である。幾つかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤は天然由来ではない。

「単離された」という用語はポリペプチド又は核酸との関連で使用される場合、その自然環境を実質的に含まないため、自然に発生し得るポリペプチド又は核酸から区別可能であるポリペプチド又は核酸を指す。例えば、単離されたポリペプチド又は核酸は、由来元である細胞又は組織起源からの細胞物質又は他のポリペプチド若しくは核酸を実質的に含まない。この用語は、単離されたポリペプチド又は核酸が医薬組成物にとって十分な純度、又は少なくとも７０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）の純度、又は少なくとも８０％（ｗ／ｗ）〜９０％（ｗ／ｗ）の純度、又は少なくとも９０％（ｗ／ｗ）〜９５％（ｗ／ｗ）の純度の調製物も指す。

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は本明細書で区別なく使用され、アミノ酸の重合体を指す。

「組換え核酸」という用語は核酸との関連で使用される場合、本来結合していないヌクレオチド配列を有する核酸を意味し、そうでなければ分離された配列の２つのセグメントを人工的に合わせることによって作製され得る。この人工的な結合は、化学合成、又はより一般的には、核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子工学の技法によって完成されることが多い。組換え核酸は、好適な宿主細胞を形質転換又は形質移入するために使用することができる増幅した又は会合した核酸を含む核酸ベクターを含む。組換え核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。遺伝子は、その後、組換え宿主細胞において発現されて「組換えポリペプチド」を産生する。また、組換え核酸は、非コーディング機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位等）の役目をする場合がある。

ホモ三量体ヘルペスウイルスｇＢは、非特許文献２により以前に試験された非三量体ｇＢとは対照的に、その多量体形態のためにより高い全ｇＢ特異的ＩｇＧ応答及びヘルペスウイルスに対するより多様な中和抗体、並びにおそらくはホモ三量体ヘルペスウイルスｇＢによる独自の立体構造の中和エピトープの発現を誘発する可能性がある。このため、免疫応答を増強するための新たな改善された構築物、特にヘルペスウイルス感染に応答して免疫応答を増強するために使用することができるＨＣＭＶｇＢ構築物を含むが、これに限定されないヘルペスウイルスｇＢ構築物が必要とされる。

修飾ヘルペスウイルス／ＨＣＭＶｇＢ。野生型ＨＣＭＶｇＢをコードする核酸配列は配列番号１に規定される。野生型ＨＣＭＶｇＢのポリペプチド配列は配列番号２に規定される。野生型ＨＣＭＶｇＢは９０６アミノ酸前駆体タンパク質として発現される。最初の２２アミノ酸は、プロセシングのために前駆体タンパク質を小胞体（ＥＲ）へと送り出すネイティブシグナルペプチドを含む。ネイティブシグナルペプチドはＥＲにおけるタンパク質のフォールディングの際に切断される。野生型ＨＣＭＶｇＢのポリペプチド配列は細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２３〜７５０）、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン（ともに配列番号１のアミノ酸７５１〜９０６）からなる。

ＥＲからの輸送後にＨＣＭＶｇＢはゴルジ装置に入り、そこでグリコシル化を受け、宿主酵素フーリンによって細胞外ドメイン内の配列番号１のアミノ酸４６０〜４６１で切断される。このタンパク質分解プロセシングにより、２つのポリペプチドフラグメントｇｐ１１６及びｇｐ５５が生じる。これら２つのフラグメントは、ｇＢサブユニットを形成するジスルフィド結合によって共有結合的に会合したままである。３つのＨＣＭＶｇＢサブユニットが会合して、ウイルス−宿主細胞融合を媒介するホモ三量体複合体を作り出すと考えられる（２９〜３２）。

本開示は、修飾ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドを生成する新たな戦略に関する。本開示は、修飾ＨＣＭＶｇＢポリペプチドを生成する戦略を記載する。しかしながら、この戦略がＨＣＭＶに限定されず、細胞外ドメイン内のフーリン切断部位を含む相同ｇＢ構造を共通して有するヒトヘルペスウイルス全体にわたって広く適用することができることが理解される。かかるヒトヘルペスウイルスの例としては、ＣＭＶ、ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウイルス−１）、ＨＳＶ−２（単純ヘルペスウイルス−２）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）及びＨＳＨＶ（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶのｇＢポリペプチドのヌクレオチド及びアミノ酸配列は既知である。

この戦略は、ペプチドリンカーをヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶ）ｇＢの細胞外ドメイン内のフーリン切断部位で挿入するための核酸構築物を、コードされるヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶ）ｇＢが、三連で会合してｇＢ三量体複合体を生じるサブユニットを形成するように作り出すことを含む。驚くべきことに、本開示に従って作製される修飾ＨＣＭＶｇＢポリペプチドは一様に一貫してホモ三量体の複合体を形成する。理論に束縛されるものではないが、以前に行われたような（非特許文献１を参照されたい）、ＨＣＭＶｇＢにおけるフーリン切断部位の該部位を無効にするような突然変異はＨＣＭＶｇｐ１１６及びｇｐ５５フラグメントの動きを制限し、それによりホモ三量体の複合体を形成するフラグメントの能力を妨げると考えられる。このことは、以前に記載される組み換えＨＣＭＶｇＢタンパク質がホモ三量体へとフォールディングすることができないことの説明となり得る。一方、フーリン切断部位をペプチドリンカーで置き換えることで、細胞内で自然に形成されると考えられるホモ三量体と同様に、ｇＢポリペプチドに三量体の複合体を形成させることができる。

幾つかの実施形態では、本開示の修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶ）ｇＢポリペプチドは、野生型ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶ）ｇＢの修飾細胞外ドメインを含み、野生型ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶ）ｇＢの膜貫通ドメイン又は細胞内ドメインを含まない。修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶ）ｇＢは概して、ウイルス−宿主細胞融合を媒介する能力、又はネイティブヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶ）ｇＢを認識することが可能な抗体（ウイルス中和抗体を含むが、これに限定されない）を誘発する能力のような対応するネイティブヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶ）ｇＢの１つ又は複数の特徴を保持する。この特徴の１つ又は複数について修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶ）ｇＢを評価するために従来の方法論を用いることができる。

例としては、限定されるものではないが、ポリヌクレオチド配列はネイティブヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶ）ｇＢのリーダー配列（例えば、リーダー配列は修飾ＨＣＭＶｇＢポリペプチドの配列番号１のアミノ酸１〜２２ではない）ではないリーダー配列をコードするヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、ポリヌクレオチド配列はＩｇＧκリーダー配列をコードするヌクレオチドを含む配列番号３を含む。一実施形態では、ＩｇＧκリーダー配列はアミノ酸配列ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ（配列番号６）を有する。

一態様では、野生型ＨＣＭＶｇＢの細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２３〜７５０）をコードする核酸構築物を用い、フーリン切断配列（配列番号１のアミノ酸４５７〜４６１）を（（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号５））等のペプチドリンカーで置き換えて修飾ＨＣＭＶｇＢを作り出した。修飾ＨＣＭＶｇＢをコードする核酸配列は配列番号３に規定される。修飾ＨＣＭＶｇＢのポリペプチド配列は配列番号４に規定される。一実施形態では、修飾ＨＣＭＶｇＢは、ペプチドリンカーで互いに接合したｇｐ１１６及びｇｐ５５フラグメントを含む細胞外ドメインのみを含む。この修飾ＨＣＭＶｇＢ構築物は、以前の方法によって作製される従来の非三量体ＨＣＭＶｇＢタンパク質と比較すると発現時に一様にホモ三量体の複合体を形成する。この修飾ＨＣＭＶｇＢを作り出す戦略は、下記のような様々な長さ及び組成の他のペプチドリンカーとともに活用することができる。この修飾ＨＣＭＶｇＢを作り出す戦略により、修飾ＨＣＭＶｇＢが少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％又は９０％のホモ三量体を含む組成物を得ることができる。

別の態様では、アミノ酸残基４６０及び４６１間のフーリン切断部位にペプチドリンカーを挿入することで、フーリン認識配列ＲＴＫＲＳ（配列番号１９）のアミノ酸残基のいずれも欠失させることなく修飾ＨＣＭＶｇＢを作り出すことができる。更に別の態様では、フーリン切断部位でのペプチドリンカーの挿入はフーリン認識配列ＲＴＫＲＳ（配列番号１９）の１、２、３、４又は５つのアミノ酸残基の欠失と併用することができる。

更なる態様では、修飾ＨＣＭＶｇＢは、ペプチドリンカーのアミノ末端に野生型ＨＣＭＶｇＢのアミノ酸残基２３〜４６０の部分配列、及びペプチドリンカーのカルボキシル末端に野生型ＨＣＭＶｇＢのアミノ酸残基４６１〜７５０の部分配列を含み得る。

このタンパク質内でペプチドリンカーを切断部位に挿入する戦略は、正確なタンパク質フォールディングを達成するために酵素認識配列の一部又は全体を欠失させるか否かにかかわらず、他のウイルス、細菌、寄生生物、自己免疫及び腫瘍抗原タンパク質を含むヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂ以外のタンパク質とともに活用することができる。このため一態様は、野生型形態のポリペプチドに存在するフーリン切断配列等の酵素切断配列を破壊するペプチドリンカーを含む組み換えポリペプチドに関する。このプラットホームを用いて、宿主細胞における発現時に酵素切断なしに正確なネイティブフォールディングパターンを達成する組み換え多量体タンパク質を作り出すことができる。例えば、ホモ若しくはヘテロ二量体、ホモ若しくはヘテロ三量体又は四量体を、ペプチドリンカー（複数の場合もあり）を多量体形成に関与する切断部位（複数の場合もあり）に挿入することによって作り出すことができる。コードされるタンパク質構築物は、宿主細胞による酵素切断なしに適切な自然発生多量体を形成する。一態様では、修飾タンパク質をコードする組み換え核酸、及び細胞における修飾タンパク質の発現に該組み換え核酸を使用する方法が企図される。更に別の態様では、修飾タンパク質又はそれをコードする核酸を含むワクチン組成物を被験体に投与することによって被験体において免疫応答を誘導する方法であって、該修飾タンパク質が被験体において免疫応答を誘導する、方法が企図される。

修飾ＥＢＶｇＢ
野生型ＥＢＶｇＢをコードする核酸配列は配列番号７に規定される。野生型ＥＢＶｇＢのポリペプチド配列は配列番号８に規定される。ＨＣＭＶｇＢと同様に、ｇＢのタンパク質分解プロセシングは、ｇＢサブユニットを形成するジスルフィド結合によって共有結合的に会合したままである２つのセグメントを生じる。

一態様では、修飾ＥＢＶｇＢは、野生型ＥＢＶｇＢの細胞外ドメイン（配列番号８のアミノ酸２３〜７３２）をコードするが、フーリン切断配列（配列番号８のアミノ酸４２９〜４３３）が（（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号５））等のペプチドリンカーで置き換えられた核酸構築物を含む。修飾ＥＢＶｇＢをコードする核酸配列は配列番号９に規定される。修飾ＥＢＶｇＢのポリペプチド配列は配列番号１０に規定される。一実施形態では、修飾ＥＢＶｇＢは、ペプチドリンカーで互いに接合した２つのフラグメントを含む細胞外ドメインのみを含む。この修飾ＥＢＶｇＢ構築物は発現時に一様にホモ三量体の複合体を形成する。この修飾ＥＢＶｇＢを作り出す戦略は、下記のような様々な長さ及び組成の他のペプチドリンカーとともに活用することができる。この修飾ＥＢＶｇＢを作り出す戦略により、修飾ＥＢＶｇＢが少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％又は９０％のホモ三量体を含む組成物を得ることができる。

別の態様では、アミノ酸残基４３２と４３３との間のフーリン切断部位にペプチドリンカーを挿入することで、フーリン認識配列ＲＲＲＲＤ（配列番号２０）のアミノ酸残基のいずれも欠失させることなく修飾ＥＢＶｇＢを作り出すことができる。更に別の態様では、フーリン切断部位でのペプチドリンカーの挿入はフーリン認識配列ＲＲＲＲＤ（配列番号２０）の１、２、３、４又は５つのアミノ酸残基の欠失と併用することができる。

更なる態様では、修飾ＥＢＶｇＢは、ペプチドリンカーのアミノ末端に野生型ＥＢＶｇＢのアミノ酸残基２３〜４３２の部分配列、及びペプチドリンカーのカルボキシル末端に野生型ＥＢＶｇＢのアミノ酸残基４３３〜７３２の部分配列を含み得る。

ペプチドリンカー配列。修飾ヘルペスウイルスｇＢポリペプチド（例えばＨＣＭＶｇＢ、ＨＳＶ−１ｇＢ、ＨＳＶ−２ｇＢ、ＶＺＶｇＢ、ＥＢＶｇＢ又はＨＳＨＶｇＢ）において、リンカー配列はフーリン切断部位に挿入される。例えば、野生型ＨＣＭＶｇＢがフーリンによって酵素的に切断されると自然に形成されるｇｐ１１６及びｇｐ５５フラグメントは、本発明の修飾ＨＣＭＶｇＢにおいてペプチドリンカーによって接合する。ペプチドリンカーがネイティブタンパク質配列において自然に存在しない非ネイティブ配列であることが理解される。

一実施形態では、リンカー配列は５〜７０アミノ酸、特に６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０アミノ酸長を有するポリペプチドである。別の実施形態では、リンカー配列は１０〜２５アミノ酸を有するポリペプチドである。リンカー配列はグリシン及びセリンアミノ酸を含むのが好ましい。一実施形態では、リンカー配列は１５アミノ酸長であり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号５）を有する。

他の好適なペプチドリンカーは米国特許第４，７５１，１８０号、同第４，９３５，２３３号及び同第５，０７３，６２７号（各々引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるペプチドリンカーである。所望のリンカー配列をコードするＤＮＡ配列は、当該技術分野で既知の従来の技法を用いて、例えばネイティブフーリン切断部位の１つ又は複数のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列（例えばＨＣＭＶ中のＲＴＫＲＳ（配列番号１９）又はＥＢＶ中のＲＲＲＲＤ（配列番号２０））の代わりに同じ読み取り枠内に挿入することができる。例えば、リンカーをコードする化学合成されたオリゴヌクレオチドを、ネイティブフーリン切断部位をコードする配列に挿入される完全ポリヌクレオチド配列にライゲートすることができる。

タンパク質複合体。本開示は、ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体と、ヘルペスウイルスｇＨ糖タンパク質と、ヘルペスウイルスｇＬ糖タンパク質とを含むタンパク質複合体であって、該ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体が３つの修飾ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドの三量体を含む、タンパク質複合体も提供する。幾つかの実施形態では、ヘルペスウイルスｇＨ及びｇＬ糖タンパク質はヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質の一部である。他の実施形態では、タンパク質複合体はヘルペスウイルスＵＬ１２８、ＵＬ１３０又はＵＬ１３１ポリペプチドの１つ又は複数を更に含む。タンパク質複合体と薬学的に許容可能な担体及び／又はアジュバントとを含むワクチン組成物も提供される。

タンパク質複合体中のタンパク質は、水素結合及び塩橋を含むが、これらに限定されない非共有結合性タンパク質間相互作用によって連結される。タンパク質複合体は、個々のタンパク質の集合及び相互作用によって生じる配置又は形状に対応して四次構造を有するため、ｇＢ／ｇＨ／ｇＬタンパク質複合体上の立体構造エピトープに対する中和抗体の誘導に有用である。本明細書で使用されるタンパク質複合体は、ヘルペスウイルスの表面上に存在するようなネイティブタンパク質複合体を指すものではない。それどころか、タンパク質複合体は個々のタンパク質をｉｎｖｉｔｒｏでインキュベートし、再構成タンパク質複合体を作り出すことによって形成される。天然の立体構造のこれらのヘルペスウイルスタンパク質がｉｎｖｉｔｒｏコインキュベーション時にネイティブ複合体へと集合することを実証する報告は見られない。

本開示は、ＣＭＶ、ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウイルス−１）、ＨＳＶ−２（単純ヘルペスウイルス−２）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）及びＨＳＨＶ（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）を含むが、これらに限定されない任意のヒトヘルペスウイルスに適用することができる、上で論考されたようなヘルペスウイルスｇＢ／ｇＨ／ｇＬタンパク質複合体を生成する戦略を記載する。ＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶのｇＢ、ｇＨ及びｇＬポリペプチドのヌクレオチド及びアミノ酸配列は既知である。

核酸、クローニング及び発現系。本開示は、開示の修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢポリペプチドをコードする単離核酸を更に提供する。核酸はＤＮＡ又はＲＮＡを含んでいてもよく、完全又は部分的に合成又は組み換えされていてもよい。本明細書に規定されるようなヌクレオチド配列への言及は、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、指定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、ＴがＵに置換された指定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。

本開示は、修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢをコードする少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、ファージミド、転写又は発現カセットの形態の構築物も提供する。本開示は、上記のような１つ又は複数の構築物を含む宿主細胞を更に提供する。

これらの核酸によってコードされる修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢポリペプチドを作製する方法も提供される。修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質は組み換え技法を用いて作製することができる。組み換えタンパク質の作製及び発現は当該技術分野で既知であり、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Ed. 2012), Cold Spring Harbor Pressに開示されるもののような従来の手順を用いて行うことができる。例えば、修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質の発現は、ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質をコードする核酸を含有する組み換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成することができる。発現による作製の後、修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質を任意の好適な技法を用いて単離及び／又は精製し、続いて必要に応じて使用することができる。

様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のための系は当該技術分野で既知である。本願に開示される構築物に適合する任意のタンパク質発現系を用いて、修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質を作製することができる。

好適なベクターをプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含有するように選択又は構築することができる。

本開示の更なる態様は本明細書で開示されるような核酸を含む宿主細胞を提供する。また更なる態様では、かかる核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。導入には任意の利用可能な技法を用いることができる。真核細胞については、好適な技法としてリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えばワクシニアウイルス、又は昆虫細胞についてはバキュロウイルスを用いた形質導入を挙げることができる。細菌細胞については、好適な技法として塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションを挙げることができる。これらの技法は当該技術分野で既知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons (2010)を参照されたい。ＤＮＡ導入に続いて、ベクターを含有する細胞を選択する選択法（例えば抗生物質耐性）を行うことができる。

ワクチン組成物。修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢポリペプチド及びそれをコードする核酸、並びに本願に記載のヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢ／ｇＨ／ｇＬタンパク質複合体は、被験体における免疫原性の増強を達成するワクチンを開発するための改善されたプラットホームをもたらす。修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢのホモ三量体の複合体又は修飾ヘルペスウイルスｇＢのホモ三量体の複合体を含むタンパク質複合体は、以前に開示された非三量体ｇＢとは対照的に、その多量体形態のためにより高い全ｇＢ特異的ＩｇＧ応答及びＨＣＭＶに対するより多様な中和抗体、並びにおそらくは三量体ｇＢによる独自の立体構造の中和エピトープの発現を誘発する可能性がある。このため、一実施形態は、修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質をコードする核酸と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物に関する。別の実施形態は、修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質のホモ三量体の複合体、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤及び任意にアジュバントを含む組成物に関する。更に別の実施形態は、修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質のホモ三量体の複合体と、ヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質とを含むタンパク質複合体、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤及び任意にアジュバントを含む組成物に関する。これらの組成物は「ワクチン組成物」と総称される。幾つかの実施形態では、ワクチン組成物はアジュバントを含まない。

薬学的に許容可能な賦形剤は、例えばデンプン、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、スクロース、メチルデキストリン等の希釈剤、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ジヒドロキシプロピルセルロース及びカルボキシルメチルセルロース（carboxylmethylcellulose）ナトリウム等の結合剤、並びにクロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム等の崩壊剤、並びに上述のいずれかの混合物から選ぶことができる。薬学的に許容可能な賦形剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、硬化（hydrogenated）植物油、フマル酸（fumarate）グリセリン等の潤滑剤、及びコロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤、並びにそれらの混合物から更に選ぶことができる。一部の実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は微結晶性セルロース、デンプン、タルク、ポビドン、クロスポビドン、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、ドデシル硫酸ナトリウム、及び上述のいずれかの混合物から選ばれる。賦形剤は粒内、粒間又はそれらの混合物であり得る。

ワクチン組成物は、当該技術分野で好適な任意の手段に従って凍結乾燥又は液体調製物として配合することができる。液体形態調製物の非限定的な例としては、溶液、懸濁液、シロップ、スラリー及びエマルションが挙げられる。好適な液体担体としては、好ましくは滅菌形態の任意の好適な有機又は無機溶媒、例えば水、アルコール、食塩溶液、緩衝食塩溶液、生理食塩溶液、デキストロース溶液、プロピレングリコール水溶液等が挙げられる。配合の後、ワクチン組成物を滅菌容器に入れ、続いて密閉し、低温（例えば４℃）で保管することができるか又は凍結乾燥させることができる。

ワクチン組成物は中性又は塩形態で配合することができる。薬学的に許容可能な塩としては、例えば塩酸若しくはリン酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸により形成される酸付加塩（活性ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基から形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基等に由来していてもよい。

ワクチン組成物は、アジュバント等のワクチンの予防効果を増強する作用物質を任意に含み得る。アジュバントには、修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質、それを含むホモ三量体の複合体又はホモ三量体複合体を含むタンパク質複合体に対する免疫応答を増大し、それによりワクチンに必要とされるヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢ（又はそれをコードする核酸）の量、及び／又は防御免疫応答を生じさせるのに必要な投与頻度を低減するように作用する任意の化合物（単数又は複数）が含まれる。アジュバントとしては、例えば乳化剤、ムラミールジペプチド、アブリジン、水酸化アルミニウム等の水性アジュバント、キトサン系アジュバント及び様々な任意のサポニン、油、並びに当該技術分野で既知の他の物質、例えばＡｍｐｈｉｇｅｎ、ＬＰＳ、細菌細胞壁抽出物、細菌ＤＮＡ、ＣｐＧ配列、合成オリゴヌクレオチド及びそれらの組合せ（Schijns et al. (2000) Curr. Opin. Immunol. 12:456）、マイコバクテリウム・フレイ（Mycobacterialphlei；M. phlei）細胞壁抽出物（ＭＣＷＥ）（米国特許第４，７４４，９８４号）、マイコバクテリウム・フレイＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）及びマイコバクテリウム・フレイ細胞壁複合体（ＭＣＣ）を挙げることができる。乳化剤として機能し得る化合物としては、天然及び合成乳化剤、並びにアニオン性、カチオン性及び非イオン性化合物が挙げられる。合成化合物の中でも、アニオン性乳化剤としては、例えばラウリン酸及びオレイン酸のカリウム、ナトリウム及びアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム、マグネシウム及びアルミニウム塩、並びにラウリル硫酸ナトリウム等の有機スルホン酸塩が挙げられる。合成カチオン性作用物質としては、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（cetyltrimethylammonium）が挙げられ、合成非イオン性作用物質はグリセリルエステル（例えばモノステアリン酸グリセリル）、ポリオキシエチレングリコールエステル及びエーテル、並びにソルビタン脂肪酸エステル（例えばモノパルミチン酸ソルビタン）及びそれらのポリオキシエチレン誘導体（例えばポリオキシエチレンモノパルミチン酸ソルビタン）によって例示される。天然乳化剤としては、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン及びコレステロールが挙げられる。

他の好適なアジュバントは単一の油、油の混合物、油中水型エマルション又は水中油型エマルション等の油成分により形成することができる。油は鉱油、植物油又は動物油であり得る。鉱油は石油（petroleum）から蒸留法によって得られる液体炭化水素であり、当該技術分野で流動パラフィン、流動ワセリン又は白色鉱油とも称される。好適な動物油としては、例えばタラ肝油、ハリバ油、メンヘーデン油、オレンジラフィー油及びサメ肝油が挙げられ、それら全てが市販されている。好適な植物油としては、例えば菜種油、扁桃油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油等が挙げられる。フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）及びフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）はワクチン調製に一般に使用され、本発明への使用にも好適な２つの一般的なアジュバントである。ＦＣＡ及びＦＩＡはどちらも鉱油中水型エマルションであるが、ＦＣＡは死んだマイコバクテリウム属の一種も含有する。

ワクチンの有効性を増強するために、ワクチン組成物に例えばアジュバントとして免疫調節サイトカインを使用することもできる。かかるサイトカインの非限定的な例としては、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）又はそれらの組合せが挙げられる。

ワクチン組成物は、ワクチンの予防効果を更に増強するために任意にヘルペスウイルスに由来する他の抗原を更に含み得る。一実施形態では、更なるヘルペスウイルス抗原は修飾ｇＢタンパク質と同じウイルス種に由来する。例えば、ワクチン組成物が修飾ＨＣＭＶｇＢタンパク質を含む場合、更なる抗原はＨＣＭＶ抗原でもある。別の非限定的な例では、ワクチン組成物が修飾ＥＢＶｇＢタンパク質を含む場合、更なる抗原はＥＢＶ抗原でもある。かかるヘルペスウイルス抗原の非限定的な例としては、糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）、糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）、糖タンパク質３５０（ｇｐ３５０）、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１又はそれらの組合せが挙げられる。これらのヘルペスウイルス抗原の核酸及びアミノ酸配列は既知である。

非限定的な他の抗原のいずれも国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５２２７０号（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に従って多量体化することができる。一実施形態では、ワクチン組成物は少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は最大５つの他の抗原を含み得る。別の実施形態では、これらの抗原を各々多量体化して、対象の単一抗原の多数のコピーを用いる多量体融合タンパク質（例えば同じ抗原の２つ、３つ又は４つのコピーを含むホモ二量体、ホモ三量体又は四量体）を作り出すか、又は２つ以上の異なる対象の抗原を含む多量体融合タンパク質（例えばヘテロ二量体、ヘテロ三量体、四量体、五量体、六量体又は八量体）を作り出すことができる。好ましくは、ワクチン組成物がＨＣＭＶｇＢのホモ三量体の複合体を含む場合、ワクチン組成物にはＨＣＭＶｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１の五量体複合体、又はＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１を含む若しくは含まないＨＣＭＶｇＨ／ｇＬ融合タンパク質も含まれる。また好ましくは、ワクチン組成物がＥＢＶｇＢのホモ三量体の複合体を含む場合、ワクチン組成物にはＥＢＶｇｐ３５０の四量体及びＥＢＶｇＨ／ｇＬ融合タンパク質の単量体も含まれる。

幾つかの実施形態では、ヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質は、ｇＨタンパク質をｇＬタンパク質に接合する本明細書で記載されるようなペプチドリンカー配列を含む。幾つかの実施形態では、ヘルペスウイルスｇＨ及びｇＬタンパク質はＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＨＳＨＶからなる群から選択されるヘルペスウイルスに由来する。これらのヘルペスウイルスｇＨ及びｇＬタンパク質のアミノ酸配列は既知である。一実施形態では、ＨＣＭＶｇＨ／ｇＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２５の配列を含む。

ワクチン組成物は混合、超音波処理及び顕微溶液化（microfluidization）を含むが、これらに限定されない当業者に既知の技法を用いて調製することができる。アジュバントは約１０％〜約８０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２０％〜約５０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２０％〜約３０％（ｖ／ｖ）又はこれらの範囲内の任意の整数値のワクチン組成物を含み得る。

ワクチン組成物は任意の動物、好ましくはヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ等の哺乳動物に投与することができる。ヒトが最も好ましい。

ワクチン組成物の投与は注入又は注射（例えば静脈内、筋肉内、皮内、皮下、髄腔内、十二指腸内、腹腔内等）によるものであり得る。ワクチン組成物は鼻腔内、経膣、直腸内、経口、扁桃内又は経皮でも投与することができる。さらに、ワクチン組成物は「無針」送達系によって投与することができる。

ワクチン組成物の有効量は患者の種、種族、大きさ、身長、体重、年齢、全身健康状態、配合物のタイプ、又は投与の様式若しくは方法を含むが、これらに限定されない様々な変動要素に左右され得る。適切な有効量は、日常的な最適化法及び専門家の情報に基づいた判断及び当業者に明白な他の要因を用いて当業者によって日常的に決定することができる。本明細書に記載のワクチン組成物の治療上効果的な用量は、被験体に対して実質的な毒性を引き起こすことなく治療的な予防効果をもたらすものであるのが好ましい。

ワクチン組成物は、ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢ又はｇＢ／ｇＨ／ｇＬを含むヘルペスウイルスタンパク質複合体に対する免疫応答を誘導する及び／又は持続させる適切な任意の計画で患者に投与することができる。例えば、本明細書に記載及び例示されるように患者にワクチン組成物を一次免疫として投与し、続いて防御免疫を強化及び／又は維持するために二次免疫又は追加免疫を実施することができる。

一次免疫及び追加免疫の実施を含むワクチン投与計画は、患者に必要とされる期間にわたって、例えば数年間にわたって、更には患者の生涯を通じて継続することができる。一次ワクチン及び追加免疫の実施の頻度並びに投与用量は、管理医師によって決定されるように当該技術分野で好適な任意の手段に従って、個々の患者の特定の要求を満たすように変更及び／又は調整することができる。

ワクチン組成物は予防的（対象の抗原又は病原体への曝露前）又は治療的（対象の抗原又は病原体への曝露後）に投与することができる。

免疫応答を誘導する方法。別の態様では、１）修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質（又は修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質をコードする核酸）のホモ三量体複合体、又は２）修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質のホモ三量体の複合体と、ヘルペスウイルスｇＨと、ｇＬタンパク質（例えばヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質）とを含むタンパク質複合体を含む組成物を、免疫応答を誘導する方法に使用することができる。免疫応答は、以前にＨＣＭＶ又は他のヘルペスウイルスに曝露されていない未処置被験体において誘導することができる。代替的には、以前にヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）に曝露され、既存の免疫応答を増強するために用いられた被験体において免疫応答を誘導することができる。

一実施形態では、免疫応答を増強する方法は、１）修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質のホモ三量体複合体、又は２）修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質のホモ三量体の複合体と、ヘルペスウイルスｇＨと、ｇＬタンパク質（例えばヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質）とを含むタンパク質複合体を含む組成物を被験体に投与することを含み、該ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質のホモ三量体複合体又は該タンパク質複合体がＨＣＭＶ又は他のヘルペスウイルスに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、免疫応答を増強する方法は、本願に記載されるような修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質をコードする核酸構築物を含む組成物を被験体に投与することを含み、該修飾ヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）ｇＢタンパク質が被験体において発現され、そのホモ三量体複合体が被験体においてヘルペスウイルス（例えばＨＣＭＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ又はＨＳＨＶ）に対する免疫応答を誘導する。

免疫応答を誘導又は抑制するこれらの方法では、免疫応答は本願に開示されるもののような当該技術分野で日常的な方法を用いて測定することができる。これらの日常的方法としては、組み換えベクターによってコードされるタンパク質に対する抗体応答等の抗体応答の測定、及び例えばトリチウムチミジン取込み又はサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）産生の測定による細胞増殖の測定が挙げられるが、これらに限定されない。

他に規定のない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様の又は均等の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書に従うものとする。さらに、材料、方法、及び実施例は一例にすぎず、限定を意図するものではない。

実施例１ − 三量体ＨＣＭＶｇＢタンパク質の発現
三量体ＨＣＭＶｇＢの作製のためのプラスミドの構築。三量体ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂが、ＨＣＭＶ感染に対する免疫応答を増強する効果的かつ再現可能な手段をもたらすことができるか否かを試験するために、組み換え核酸プラスミド（配列番号３）を配列番号１のアミノ酸２３〜７５０をコードするように設計し、フーリン切断部位のコード配列（配列番号１のアミノ酸４５７〜４６１間のＲＴＫＲＳ（配列番号１９））を（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号５）リンカーのコード配列に置き換えた。理論に束縛されることを意図するものではないが、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号５）リンカーの導入は適当なタンパク質フォールディング、ひいてはホモ三量体ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂ複合体の形成を可能にすると考えられる。組み換え核酸としては、細胞上清へのタンパク質分泌を指向する５’末端のＩｇＧκリーダー配列をコードする核酸、並びに精製及び免疫組織化学的分析に役立つ３’末端のＨｉｓ_６（配列番号２６）配列をコードする核酸も挙げられる。組み換え核酸（配列番号３）をｐＯｐｔｉＶＥＣベクター（Life Technologies, Carlsbad, CA）にクローニングし、シークエンシングによって検証した。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＧ４４株）のトランスフェクション。ＣＨＯＤＧ４４細胞を「ＣＤＤＧ４４」培地（Life Technologies, Carlsbad, CA）中で維持し、２×１０^７細胞をトランスフェクションに使用した。３０μｇの組み換え核酸構築物をＰｖｕＩによる線状化後に１．２ｍｌのＯｐｔｉＰｒｏ（商標）（Life Technologies, Carlsbad, CA）ＳＦＭ培地に再懸濁し、続いて３０μｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘ試薬（Life Technologies, Carlsbad, CA）を添加し、静かに混合し、室温で１０分間インキュベートした。ＤＮＡ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘ試薬（Life Technologies, Carlsbad, CA）複合体を、静かに振盪しながら２×１０^７のＤＧ４４細胞の入ったフラスコにゆっくりと添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした。細胞を１２００ｒｐｍで遠心分離し、ＣＤＯｐｔｉＣＨＯ（商標）（Life Technologies, Carlsbad, CA）無血清培地中で維持した。ＭＴＸの濃度を５０ｎＭから４μＭへと徐々に増大させながら、メトトレキサート（ＭＴＸ、Sigma, St. Louis, MO）を使用して高組み換えタンパク質分泌細胞を選択した。

抗Ｈｉｓ抗体による修飾ＨＣＭＶｇＢタンパク質の免疫組織化学的分析。ＭＴＸ選択の後、修飾ＨＣＭＶｇＢを発現するＣＨＯ細胞を「Ｆｉｂｅｒｃｅｌｌ」カートリッジ（FiberCell Systems, Inc., Frederick, MD）に投入し、濃縮上清を毎日回収した。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（商標）ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔ、３００００ＭＷカットオフ（Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA）を用いた３０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により、上清を更に濃縮した。コバルトカラム（Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA）を用い、製造業者の取扱説明書に従ってアフィニティー精製を行った。簡潔に述べると、濃縮上清を等量の平衡化バッファーと混合し、コバルト精製カラムに添加した。カラムを静かにかき混ぜながら４℃で６０分間インキュベートし、洗浄バッファーで３回洗浄した。修飾ＨＣＭＶｇＢタンパク質を溶出バッファーにより溶出し、完全還元条件下又は部分還元条件下で３％〜８％ＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｔｒｉｓ−ＡｃｅｔａｔｅＭｉｎｉＧｅｌｓ（Life Technologies, Carlsbad, CA）で電気泳動によって分析し、抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Life Technologies, Carlsbad, CA）でブロッティングした。

完全還元条件（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、β−メルカプトエタノール及び１０分間の煮沸による）下での抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロットによる分析により、図１Ａに示されるように１２０ｋＤａのバンドが明らかになった。完全還元条件により任意のネイティブオリゴマーがその単量体形態へと破壊されるため、この１２０ｋＤａのバンドは単量体ＨＣＭＶｇＢと一致する。これらの結果により、本開示の修飾ＨＣＭＶｇＢがその非ネイティブ形態で単量体であることが実証される。

そのネイティブ形態でのＨＣＭＶｇＢの検出を可能にする部分還元条件（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、β−メルカプトエタノール及び７０℃で１０分間の加熱による）下での抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロットによる分析により、図１Ｂに示されるようにおよそ３６０ｋＤａというより高い分子量の一様なバンドが明らかになった。この約３６０ｋＤａのバンドは、ＨＣＭＶｇＢのネイティブホモ三量体形態と一致する。

抗ｇＢ抗体による修飾ＨＣＭＶｇＢタンパク質の免疫組織化学的分析。修飾ＨＣＭＶｇＢタンパク質を、同様に変性条件下又は修飾ネイティブ条件下での３％〜８％ＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｔｒｉｓ−ＡｃｅｔａｔｅＭｉｎｉＧｅｌｓ（Life Technologies, Carlsbad, CA）での電気泳動によって分析し、抗ＣＭＶｇＢ抗体（２Ｆ１２、Virusys, Taneytown, MD；又はＬＳ−Ｃ６４４５７、LifeSpan BioSciences, Seattle, WA）でブロッティングした。

任意のネイティブオリゴマーをその単量体形態へと破壊する変性条件下で、５０ｍＭＤＴＴを含有するローディングバッファー中で修飾ＨＣＭＶｇＢを１０分間煮沸した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、抗ｇＢモノクローナル抗体（２Ｆ１２、Virusys, Taneytown, MD；又はＬＳ−Ｃ６４４５７、LifeSpan BioSciences, Seattle, WA）でブロッティングした。図２Ｂに示されるように、ブロットにより単量体ＨＣＭＶｇＢに対応する１２０ｋＤａのバンドが明らかになった。これらの結果から、非ネイティブ形態の本開示の修飾ＨＣＭＶｇＢが単量体であることが実証される。

そのネイティブ形態でのＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂの検出を可能にする修飾ネイティブ条件下で、修飾ＨＣＭＶｇＢを、ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）を含有するがＤＴＴを含有しないローディングバッファーと混合し、ネイティブランニングバッファー中で分割した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、抗ｇＢモノクローナル抗体（ＬＳ−Ｃ６４４５７、LifeSpan BioSciences, Seattle, WA）でブロッティングした。図２Ａに示されるように、ブロットによりＨＣＭＶｇＢのネイティブホモ三量体形態と一致する約３６０ｋＤａの一様なバンドが明らかになった。

実施例２ − 三量体ＨＣＭＣｇＢタンパク質によるマウスの免疫化
精製非三量体組み換えＨＣＭＶｇＢタンパク質。合計２ｍｇのＨＣＭＶｇＢタンパク質をSino Biological, Inc.（Beijing, P.R. China）から購入した。このＨＣＭＶｇＢタンパク質はヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞系列中で、細胞質ドメイン（配列番号１のアミノ酸７７７〜９０７）と連結した細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸１〜７００）をコードし、タンパク質精製に役立つＣ末端にポリヒスチジンタグが融合したＤＮＡ配列を用いて作製された。フーリン切断部位は無傷のままであったが、無効となるように突然変異していた。このＨＣＭＶｇＢタンパク質は８１８アミノ酸を含み、還元条件下での予測分子質量は９３ｋＤａであるが、グリコシル化のために分子質量は１３０ｋＤａ〜１４０ｋＤａである。このタンパク質の生物活性を、機能ＥＬＩＳＡアッセイにおいてビオチン化ヒトＣＤ２０９−Ｆｃと結合するその能力によって確認した。重要なことには、このＨＣＭＶｇＢタンパク質は、臨床試験に使用される非三量体ＨＣＭＶｇＢタンパク質と本質的に同一である（非特許文献２）。

マウス。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを米国国立癌研究所（National Cancer Institute）（Frederick, MD）から購入し、７週齢〜１０週齢で全タンパク質免疫化に用いた。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをHarlan Laboratories（Indianapolis, IN）から購入し、４週齢〜６週齢で全プラスミドＤＮＡワクチン接種に用いた。これらの研究は、実験動物の管理と使用に関する指針（Guide for Care and Use of Laboratory Animals）（米国実験動物資源協会（Institute of Laboratory Animal Resources）、全米研究評議会（National Research Council）、１９９６年改正）に規定される原則に従って行われ、米国軍保健科学大学及びワシントン大学動物実験委員会によって認可された。

免疫化。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３つの異なる用量（２５μｇ、５．０μｇ及び１．０μｇ／マウス）の修飾ＨＣＭＶｇＢのホモ三量体の複合体又は市販の非三量体ＨＣＭＶｇＢタンパク質により腹腔内免疫化した。ホモ三量体又は非三量体ＨＣＭＶｇＢを１３μｇのアラムアジュバント（Ａｌｌｈｙｄｒｏｇｅｌ２％、Brenntag Biosector, Denmark）に吸着させ、２５μｇの刺激性３０ｍｅｒＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）を用いて又は用いずに投与した。ｇＢ特異的ＩｇＧの血清力価の測定のために、ＥＬＩＳＡアッセイの血清サンプルを０日目、１４日目、２８日目及び４２日目に尾静脈から採取した血液から得た。

ＥＬＩＳＡによるマウスにおけるｇＢ特異的ＩｇＧ及びＩｇＧアイソタイプの血清力価の測定。Ｉｍｍｕｌｏｎ４ＥＬＩＳＡプレート（Dynex Technologies, Inc., Chantilly, VA）をＰＢＳ中、４℃で一晩ホモ三量体ＨＣＭＶｇＢ（５μｇ／ｍｌ）でコーティングした（５０μＬ／ウェル）。プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡでブロッキングした。ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中５０倍の血清希釈率から開始した免疫化マウスからの血清サンプルの３倍希釈物を添加し、４℃で一晩インキュベートし、プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中のアルカリホスファターゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ２ａ抗体（SouthernBiotech, Birmingham, AL）（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。次いで、ＴＭバッファー（１Ｍトリス＋０．３ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．８）中１ｍｇ／ｍｌの基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム；Sigma）を発色のために添加した。ＭｕｌｔｉｓｋａｎＡｓｃｅｎｔ（商標）ＥＬＩＳＡリーダー（Labsystems, Finland）により４０５ｎｍの吸光度で色を読み取った。結果を図４に示し、これにより本開示の修飾ＨＣＭＶｇＢ（「三量体」）が、非三量体対照ＨＣＭＶｇＢ（「Ｓｉｎｏ」）よりも顕著に高免疫原性（顕著に高い抗ＨＣＭＶｇＢＩｇＧ）であることが実証される。

競合的ＥＬＩＳＡによる血清ｇＢ特異的中和抗体の測定。競合的ＥＬＩＳＡは本発明者らが以前に記載したものを応用した（Colino J, Duke L, Arjunaraja S, Chen Q, Liu L, Lucas AH, Snapper CM. 2012. Differential Idiotype Utilization for the In Vivo Type 14 Capsular Polysaccharide-Specific Ig Responses to Intact Streptococcus pneumoniae versus a Pneumococcal Conjugate Vaccine. J Immunol 189: 575-86）。簡潔に述べると、様々な希釈率の血清と１０μｇ／ｍｌのＨＣＭＶｇＢタンパク質とを混合し、４℃で２４時間インキュベートすることによって阻害混合物を調製した後、１μｇ／ｍｌの中和マウスＩｇＧ１抗ＨＣＭＶｇＢｍＡｂＬＳ−Ｃ６４４５７（LifeSpan BioSciences, Inc, Seattle, WA）で予めコーティングし、ＰＢＳ−ＢＳＡでブロッキングしたウェルに移す。未処置マウス、又はＥＢＶｇｐ３５０等の対照タンパク質で免疫化したマウスからの血清は陰性対照として働く（すなわち阻害なし）。最終検出工程では、プレートをアルカリホスファターゼコンジュゲート非中和マウスＩｇＧ１抗ｇＢｍＡｂ２Ｆ１２（Virusys, Taneytown, MD）を用いて３７℃で１時間インキュベートし、続いてＴＭバッファー中１ｍｇ／ｍｌで添加される基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム）を発色のために添加する。標準ウェルのＯＤ４０５ｎｍが所定値に達するまで、ＭｕｌｔｉｓｋａｎＡｓｃｅｎｔ（商標）ＥＬＩＳＡリーダー（Labsystems, Finland）により４０５ｎｍの吸光度で色を読み取る。阻害混合物中既知の濃度の中和マウスＩｇＧ１抗ＨＣＭＶｇＢｍＡｂＬＳ−Ｃ６４４５７を用いて標準曲線を作成し、血清希釈について補正した４パラメーターロジスティック回帰法を用いて各血清サンプルのＯＤ４０５ｎｍをｇＢ特異的中和抗体の最終ｕｇ／ｍｌ濃度へと変換する。

ＣＭＶ中和アッセイ。各血清サンプルの１０倍希釈物を調製することによって中和活性を決定し、続いて培養培地中で更なる２倍段階希釈を行う。各々の希釈物を、４０００ｐｆｕのＨＣＭＶ（ＢＡＤｒＵＬ１３１−Ｙ４株）を含有する等量の培養培地と混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、ＡＲＰＥ−１９（上皮細胞系列、ATCC）又はＭＲＣ−５（線維芽細胞系列、ATCC）単分子層の入った３８４ウェルプレートのウェルに添加する。各血清サンプルを三連で検査し、ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴＳ１００倒立ＵＶ顕微鏡を用いて感染４日後に代表的な顕微鏡写真を撮影した。ＧＦＰ蛍光を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＶｉｃｔｏｒＶ１４２０マルチラベル（multilabel）カウンターを用いて感染後７日目に測定する。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値及び平均の標準誤差を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて各血清希釈物の三連ＧＦＰ値の平均をｌｏｇ２血清濃度に対してプロットし、データの最良適合４パラメーター方程式を算出し、ＩＣ５０中和力価として曲線の中点に血清希釈率を内挿することによって算出する。

統計。全ての研究を再現性のために少なくとも１回繰り返す。血清力価を幾何平均±平均の標準誤差として表し、有意性を両側スチューデントｔ検定によって決定する（ｐ≦０．０５が有意とみなされる）。本発明者らは以前に、１群当たり７匹のマウスがこれらの研究に対して適切な統計的検出力をもたらすことを決定している。

実施例３ − 三量体ＨＣＭＣｇＢタンパク質によるウサギの免疫化
ＨＣＭＶ三量体の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）は、ウサギにおいて線維芽細胞及び上皮細胞のｉｎｖｉｔｒｏＨＣＭＶ感染を防ぐ高度にブーストされたｇＢ特異的ＩｇＧ応答を誘導する。１２週齢〜１５週齢の４匹の雄性ニュージーランドホワイトウサギの群を、水酸化アルミニウム（アラム；１ｍｇのタンパク質当たり０．２５ｕｇのアラム）に吸着させた２５ｕｇの三量体ＨＣＭＶｇＢにより皮下免疫化した。ウサギを０日目、２１日目及び４２日目に免疫化し、初回免疫化の前及び各免疫化の１０日後に血清サンプルを採取した。ＨＣＭＶｇＢ特異的ＩｇＧの血清力価を決定した。三量体ＨＣＭＶｇＢによる一次免疫は、二次免疫後に約１００倍にブーストされた検出可能なＨＣＭＶｇＢ特異的ＩｇＧの血清力価を誘発した（図５）。３回目の免疫化は血清力価の更なる増大を示さなかった。

線維芽細胞（ＭＲＣ−５）及び上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）を用いた生ＨＣＭＶに対するｉｎｖｉｔｒｏ中和活性（図６）も分析した。ＣＭＶ免疫患者からのヒト血清を対照として使用した（「ヒト血清」）。三量体ＨＣＭＶｇＢにより免疫化したウサギによる血清中和力価の誘導が観察され、線維芽細胞（ＭＲＣ−５）で検査した場合にヒトＨＣＭＶ免疫血清において測定されるものと同等であった（図６）。上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）に対する血清中和力価もＨＣＭＶ三量体ｇＢにより免疫化したウサギにおいて観察され、これはヒトＨＣＭＶ免疫血清において観察されるよりも顕著に低く（図６）、上皮細胞に対する保護を媒介する更なるＨＣＭＶタンパク質の潜在的役割が示唆された。

ＥＬＩＳＡによるｇＢ特異的ＩｇＧアイソタイプのウサギにおける血清力価の測定。Ｉｍｍｕｌｏｎ４ＥＬＩＳＡプレート（Dynex Technologies, Chantilly, VA）を、ＰＢＳ（５０μｌ／ウェル）中５μｇ／ｍｌのＨＣＭＶｇＢタンパク質を用いて４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートをＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１００μｌ／ウェル）により３７℃で２時間ブロッキングした。次いで、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（５０μｌ／ウェル）中５０倍の血清希釈率から開始した血清サンプルの３倍段階希釈物を添加し、４℃で一晩インキュベートし、続いてＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した（３回）。次いで、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中のアルカリホスファターゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧＡｂ（Southern Biotechnology）（２００ｎｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、発色のために基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム；Sigma-Aldrich）をＴＭバッファー（１Ｍトリス＋０．３ｍＭＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８）中１ｍｇ／ｍｌで添加した。ＭｕｌｔｉｓｋａｎＡｓｃｅｎｔＥＬＩＳＡリーダー（Labsystems, Finland）により色を４０５ｎｍの吸光度で読み取った。

ＣＭＶ中和アッセイ。各血清サンプルの１０倍希釈物を調製することによって中和活性を決定し、続いて培養培地中で更なる２倍段階希釈を行った。各々の希釈物を、４０００ｐｆｕのＨＣＭＶ（ＢＡＤｒＵＬ１３１−Ｙ４株）を含有する等量の培養培地と混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、ＡＲＰＥ−１９（上皮細胞系列、ATCC）又はＭＲＣ−５（線維芽細胞系列、ATCC）単分子層の入った３８４ウェルプレートのウェルに添加した。各血清サンプルを三連で検査し、ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴＳ１００倒立ＵＶ顕微鏡を用いて感染４日後に代表的な顕微鏡写真を撮影した。ＧＦＰ蛍光を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＶｉｃｔｏｒＶ１４２０マルチラベルカウンターを用いて感染後７日目に測定した。５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）値及び平均の標準誤差を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて各血清希釈物の三連ＧＦＰ値の平均をｌｏｇ_２血清濃度に対してプロットし、データの最良適合４パラメーター方程式を算出し、ＩＣ_５０中和力価として曲線の中点に血清希釈率を内挿することによって算出した。

実施例４ − 三量体ヒトＥＢＶｇＢタンパク質の発現
三量体ＥＢＶｇＢの作製のためのプラスミドの構築。ホモ三量体ＥＢＶ糖タンパク質Ｂが、ＥＢＶ感染に対する免疫応答を増強する効果的かつ再現可能な手段をもたらすことができるか否かを試験するために、組み換え核酸プラスミド（配列番号９）を配列番号８のアミノ酸２３〜７３２をコードするように設計し、フーリン切断部位のコード配列（配列番号８のアミノ酸４２９〜４３３間のＲＲＲＲＤ（配列番号２０））を（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号５）リンカーのコード配列に置き換えた（図８）。理論に束縛されることを意図するものではないが、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーの導入は適当なタンパク質フォールディング、ひいては三量体ＥＢＶ糖タンパク質Ｂ複合体の形成を可能にすると考えられる。ＥＢＶｇＢシグナルペプチド（配列番号８のアミノ酸１〜２２）をＩｇＧκリーダー配列（配列番号６）に置き換えた。このため、組み換え核酸として更に、細胞上清へのタンパク質分泌を指向する５’末端のＩｇＧκリーダー配列をコードする核酸、並びに精製及び免疫組織化学的分析に役立つ３’末端のＨｉｓ_６（配列番号２６）配列をコードする核酸も挙げられる。組み換え核酸（配列番号９）をｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）ベクター（Life Technologies, Carlsbad, CA）にクローニングし、シークエンシングによって検証した。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＧ４４株）のトランスフェクション。ＣＨＯＤＧ４４細胞を「ＣＤＤＧ４４」培地（Life Technologies, Carlsbad, CA）中で維持し、２×１０^７細胞をトランスフェクションに使用した。３０μｇの組み換え核酸構築物を、ＰｖｕＩによる線状化後に１．２ｍｌのＯｐｔｉＰｒｏ（商標）（Life Technologies, Carlsbad, CA）ＳＦＭ培地中に再懸濁し、続いて３０μｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅＭａｘ試薬（商標）（Life Technologies, Carlsbad, CA）を添加し、静かに混合し、室温で１０分間インキュベートした。ＤＮＡ−ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＭａｘ試薬（商標）（Life Technologies, Carlsbad, CA）複合体を、２×１０^７ＤＧ４４細胞の入ったフラスコに静かに振盪しながらゆっくりと添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした。細胞を１２００ｒｐｍで遠心分離し、ＣＤＯｐｔｉＣＨＯ（商標）（Life Technologies, Carlsbad, CA）無血清培地中で維持した。ＭＴＸの濃度を５０ｎＭから４μＭへと徐々に増大させながら、メトトレキサート（ＭＴＸ、Sigma, St. Louis, MO）を使用して高組み換えタンパク質分泌細胞を選択した。

抗Ｈｉｓ抗体による修飾ＥＢＶｇＢタンパク質の免疫組織化学的分析。ＭＴＸ選択の後、修飾ＥＢＶｇＢを発現するＣＨＯ細胞を「Ｆｉｂｅｒｃｅｌｌ」カートリッジ（FiberCell Systems, Inc., Frederick, MD）に投入し、濃縮上清を毎日回収した。修飾ＥＢＶｇＢを発現するＣＨＯ細胞をＭ−ＰＥＲ哺乳動物タンパク質抽出試薬（Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA）により溶解させ、３５００ｒｐｍで６０分間遠心分離して、細胞残屑を除去した。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（商標）ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔ、３００００ＭＷカットオフ（Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA）を用いた３０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により、上清を更に濃縮した。コバルトカラム（Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA）を用い、製造業者の取扱説明書に従ってアフィニティー精製を行った。簡潔に述べると、濃縮上清を等量の平衡化バッファーと混合し、コバルト精製カラムに添加した。カラムを静かにかき混ぜながら４℃で６０分間インキュベートし、洗浄バッファーで３回洗浄した。

抗ＥＢＶｇＢ抗体による修飾ＥＢＶｇＢタンパク質の免疫組織化学的分析。修飾ＥＢＶｇＢタンパク質を、変性条件下又は修飾ネイティブ条件下で３％〜８％ＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｔｒｉｓ−ＡｃｅｔａｔｅＭｉｎｉＧｅｌｓ（Life Technologies, Carlsbad, CA）で電気泳動によって分析し、抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Life Technologies, Carlsbad, CA）及び抗ＥＢＶｇＢ抗体（Virusys, Taneytown, MD）でブロッティングした。

任意のネイティブオリゴマーをその単量体形態へと破壊する変性条件下で、５０ｍＭＤＴＴを含有するローディングバッファー中で修飾（「三量体」）ＥＢＶｇＢを１０分間煮沸した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（（Life Technologies, Carlsbad, CA）又は抗ｇＢモノクローナル抗体（Virusys, Taneytown, MD）でブロッティングした。図７Ａに示されるように、ブロットにより単量体ＥＢＶｇＢに対応する８０ｋＤａのバンドが明らかになった。これらの結果から、非ネイティブ形態の修飾ＥＢＶｇＢが単量体であることが実証される。

そのネイティブ形態でのＥＢＶｇＢの検出を可能にする修飾ネイティブ条件下で、修飾ＥＢＶｇＢを、ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）を含有するがＤＴＴを含有しないローディングバッファーと混合し、ネイティブランニングバッファー中で分割した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（図７Ｂ）又は抗ｇＢモノクローナル抗体（図７Ｃ）でブロッティングした。図７Ｂ／Ｃに示されるように、ブロットによりＥＢＶｇＢのネイティブ三量体形態と一致する約２４０ｋＤａの一様なバンドが明らかになった。

実施例５ − 三量体ヒトＥＢＶｇＢタンパク質を用いた免疫化研究
マウス。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを米国国立癌研究所（Frederick, MD）から購入し、７週齢〜１０週齢で全タンパク質免疫化に用いる。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをHarlan Laboratories（Indianapolis, IN）から購入し、４週齢〜６週齢で全プラスミドＤＮＡワクチン接種に用いる。これらの研究は、実験動物の管理と使用に関する指針（米国実験動物資源協会、全米研究評議会、１９９６年改正）に規定される原則に従って行われ、米国軍保健科学大学及びワシントン大学動物実験委員会によって認可される。

免疫化。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３つの異なる用量（２５μｇ、５．０μｇ及び１．０μｇ／マウス）の修飾ＥＢＶｇＢのホモ三量体の複合体又は非三量体ＥＢＶｇＢタンパク質により腹腔内免疫化する。ホモ三量体又は非三量体ＥＢＶｇＢを１３μｇのアラムアジュバント（Ａｌｌｈｙｄｒｏｇｅｌ２％、Brenntag Biosector, Denmark）に吸着させ、２５μｇの刺激性３０ｍｅｒＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）を用いて又は用いずに投与した。ｇＢ特異的ＩｇＧの血清力価の測定のために、ＥＬＩＳＡアッセイの血清サンプルを０日目、１４日目、２８日目及び４２日目に尾静脈から採取した血液から得た。

ＥＬＩＳＡによるｇＢ特異的ＩｇＧ及びＩｇＧアイソタイプの血清力価の測定。Ｉｍｍｕｌｏｎ４ＥＬＩＳＡプレート（Dynex Technologies, Inc., Chantilly, VA）をＰＢＳ中、４℃で一晩ホモ三量体ＥＢＶｇＢ（５μｇ／ｍｌ）でコーティングする（５０μＬ／ウェル）。プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡでブロッキングする。免疫化マウスからの血清サンプルの３倍希釈物を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中５０倍の血清希釈率から開始して添加し、４℃で一晩インキュベートし、プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。次いで、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中のアルカリホスファターゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ２ａ抗体（SouthernBiotech, Birmingham, AL）（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄する。次いで、ＴＭバッファー（１Ｍトリス＋０．３ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．８）中１ｍｇ／ｍｌの基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム；Sigma）を発色のために添加する。ＭｕｌｔｉｓｋａｎＡｓｃｅｎｔ（商標）ＥＬＩＳＡリーダー（Labsystems, Finland）により４０５ｎｍの吸光度で色を読み取る。

ＥＢＶ中和アッセイ。ＮＩＨのJeffery Cohen博士の研究室で開発された方法を用いる（Sashihara J et al, Virology 2009, 391: 249-256）。簡潔に述べると、血清サンプルを２倍段階で段階希釈し（未希釈から１８段階希釈まで）、２５μＬの希釈サンプル又は対照抗体を９６ウェルプレートのウェルに三連で添加する。次いで、２５μｌのＢ９５−８／ＦＥＢＶウイルスを各ウェルに添加し、２時間インキュベートする。５０μｌの１×１０^５Ｒａｊｉ細胞を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、プレートを３００×ｇで５分間遠心分離し、培地を交換することによって細胞を２回洗浄し、３７℃で３日間インキュベートする。次いで、プレートを遠心分離し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで固定する。

ＧＦＰ発現細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star Inc., Ashland, OR）を用いて定量化する。ＧＦＰ陽性細胞数の低減に基づく感染性が５０％阻害される抗体の効果的な希釈率（ＥＤＩ５０）は、ＧｒａｐｈＰａｄＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェア（GraphPad Software, La Jolla, CA）を用いた非線形回帰分析によって算出される。

実施例６ − ＨＣＭＶｇＨ／ｇＬ融合タンパク質の発現
ＨＣＭＶｇＨ／ｇＬヘテロ二量体は、ＨＣＭＶ融合並びに線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞及び樹状細胞への透過に必要とされるヘルペスウイルス科コア融合機構の一部である。組み換えｇＨ／ｇＬ単独によるウサギのワクチン接種は、線維芽細胞及び上皮細胞に対する中和抗体を誘発したが、その中和は完全五量体複合体（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ）を使用した場合に上皮細胞に対して幾らか高かった（６６）。

ＨＣＭＶｇＨ及びｇＬのコード配列を、ｇＨヌクレオチド１０９２２４〜１１１４５２（配列番号２１）、ｇＬヌクレオチド１６５０２２〜１６５８５８（配列番号２２）を含むＮＣＢＩの参照配列ＮＣ＿００６２７３．２、バージョンＧＩ：１５５５７３６２２（この配列全体が引用することにより本明細書の一部をなす）からダウンロードした。ヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質の構築物を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒを用いて設計した。野生型ＨＣＭＶｇＨ（配列番号１８）及びＨＣＭＶｇＬ（配列番号２４）のアミノ酸配列は既知である。野生型ＨＣＭＶｇＬのアミノ酸３１〜２７８をコードする核酸を使用し（配列番号２３）、シグナルペプチド１〜３０をＩｇＧκリーダー配列（配列番号６）に置き換えた。野生型ＨＣＭＶｇＨのアミノ酸２４〜７１８をコードする核酸を使用し（配列番号１７）、１５アミノ酸リンカー（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３配列（配列番号５）によって隔てられるｇＬの３’末端に連結し、Ｈｉｓ６（配列番号２６）コード配列をタンパク質精製のためにｇＨの３’末端に連結した。ｇＨ／ｇＬ構築物のアミノ酸配列は配列番号２５に対応する。ｇＨ／ｇＬをコードするＤＮＡはBlue Heron Biotechnology, Incによって合成され、ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）（Invitrogen）にクローニングし、シークエンシングによって検証した。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＤＧ４４株）（Invitrogen）に、Ｆｒｅｅ−ｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘ試薬（Invitrogen）を用いてｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）−ｇＨ／ｇＬ構築物をトランスフェクトし、メトトレキサートの濃度を最大４μＭまで徐々に増大させながら選択した。上清を濃縮し、コバルトアフィニティー精製（Thermo Scientific）を用いて精製し、抗Ｈｉｓ６（配列番号２６）抗体及び抗ＨＣＭＶｇＨ／ｇＬ抗体（Santa Cruz Biotech）の両方を使用するウエスタンブロットによって分析した。還元条件下で、ウエスタンブロットからモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体（図９Ａ）又はモノクローナル抗ｇＨ抗体（図９Ｂ）により１１０ＫＤａバンドとして単量体ｇＨ／ｇＬが実証される。

実施例７ − ＨＣＭＶタンパク質複合体ｇＢ／ｇＨ／ｇＬの作製
線維芽細胞へのＨＣＭＶの侵入には、三量体ｇＢ、ｇＨ及びｇＬタンパク質のＨＣＭＶエンベロープ複合体が必要とされるが、ＵＬ１２８／１３０／１３１ＡからｇＢと会合したｇＨ／ｇＬへの更なる複合体形成が、内皮細胞、上皮細胞及び樹状細胞並びに白血球への侵入に必要とされる（４、５、６）。

実施例１で作製される精製ＨＣＭＶ三量体ｇＢを、実施例６で作製される精製単量体ｇＨ／ｇＬと１：１の分子比で混合し、室温で２時間インキュベートした。非還元条件下でのウエスタンブロットによるその後の分析により、分子量が約６００ｋＤａのタンパク質複合体（図１０）が、１つのＨＣＭＶ三量体ｇＢ及び２つのＨＣＭＶ単量体ｇＨ／ｇＬヘテロ二量体の複合体と一致することが実証された。これらのウイルスタンパク質が天然の立体構造でｉｎｖｉｔｒｏコインキュベーション時にネイティブ複合体へと集合するということを実証する報告は見られない。これは一つには、その天然の立体構造のＨＣＭＶｇＢを示す完全三量体ＨＣＭＶｇＢタンパク質を作製することがこれまで可能ではなかったという事実によるものであり得る。これまでｉｎｖｉｔｒｏで発現されたことのない、このＨＣＭＶタンパク質の天然の複合体は予防ワクチンの設計における飛躍的進歩を示す。

このタンパク質複合体ワクチンはまた、同じ原理を他のウイルス又は細菌病原体の個々のタンパク質からタンパク質複合体への再構成に用いることができるため、ヘルペスウイルスワクチンを超えた影響を有し、タンパク質複合体中の立体構造エピトープに対する極めて効率的な中和抗体を誘導するワクチンとして用いることができる。

実施例８ − ＨＣＭＶタンパク質複合体ｇＢ／ｇＨ／ｇＬを用いた免疫化研究
マウス。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを米国国立癌研究所（Frederick, MD）から購入し、７週齢〜１０週齢で全タンパク質免疫化に用いる。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをHarlan Laboratories（Indianapolis, IN）から購入し、４週齢〜６週齢で全プラスミドＤＮＡワクチン接種に用いる。これらの研究は、実験動物の管理と使用に関する指針（米国実験動物資源協会、全米研究評議会、１９９６年改正）に規定される原則に従って行われ、米国軍保健科学大学及びワシントン大学動物実験委員会によって認可される。

免疫化。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３つの異なる用量（２５μｇ、５．０μｇ及び１．０μｇ／マウス）の実施例６で作製されるＨＣＭＶｇＢ／ｇＨ／ｇＬタンパク質複合体により腹腔内免疫化する。ＨＣＭＶｇＢ／ｇＨ／ｇＬタンパク質複合体を１３μｇのアラムアジュバント（Ａｌｌｈｙｄｒｏｇｅｌ２％、Brenntag Biosector, Denmark）に吸着させ、２５μｇの刺激性３０ｍｅｒＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）を用いて又は用いずに投与する。ｇＢ、ｇＨ、及び／又はｇＬ特異的ＩｇＧの血清力価の測定のために、ＥＬＩＳＡアッセイの血清サンプルを０日目、１４日目、２８日目及び４２日目に尾静脈から採取した血液から得る。

ＥＬＩＳＡによるｇＢ／ｇＨ／ｇＬ特異的ＩｇＧ及びＩｇＧアイソタイプの血清力価の測定。Ｉｍｍｕｌｏｎ４ＥＬＩＳＡプレート（Dynex Technologies, Inc., Chantilly, VA）をＰＢＳ中、４℃で一晩ＨＣＭＶｇＢ／ｇＨ／ｇＬタンパク質複合体（５μｇ／ｍｌ）でコーティングする（５０μＬ／ウェル）。プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡでブロッキングする。免疫化マウスからの血清サンプルの３倍希釈物を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中５０倍の血清希釈率から開始して添加し、４℃で一晩インキュベートし、プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。次いで、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中のアルカリホスファターゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ２ａ抗体（SouthernBiotech, Birmingham, AL）（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄する。次いで、ＴＭバッファー（１Ｍトリス＋０．３ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．８）中１ｍｇ／ｍｌの基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム；Sigma）を発色のために添加する。ＭｕｌｔｉｓｋａｎＡｓｃｅｎｔ（商標）ＥＬＩＳＡリーダー（Labsystems, Finland）により４０５ｎｍの吸光度で色を読み取る。

ＣＭＶ中和アッセイ。各血清サンプルの１０倍希釈物を調製することによって中和活性を決定し、続いて培養培地中で更なる２倍段階希釈を行う。各々の希釈物を、４０００ｐｆｕのＨＣＭＶ（ＢＡＤｒＵＬ１３１−Ｙ４株）を含有する等量の培養培地と混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、ＡＲＰＥ−１９（上皮細胞系列、ATCC）又はＭＲＣ−５（線維芽細胞系列、ATCC）単分子層の入った３８４ウェルプレートのウェルに添加する。各血清サンプルを三連で検査し、ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴＳ１００倒立ＵＶ顕微鏡を用いて感染４日後に代表的な顕微鏡写真を撮影した。ＧＦＰ蛍光を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＶｉｃｔｏｒＶ１４２０マルチラベルカウンターを用いて感染後７日目に測定する。５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）値及び平均の標準誤差を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて各血清希釈物の三連ＧＦＰ値の平均をｌｏｇ_２血清濃度に対してプロットし、データの最良適合４パラメーター方程式を算出し、ＩＣ_５０中和力価として曲線の中点に血清希釈率を内挿することによって算出する。

以下の参照文献は本願に引用され、本発明の分野に関する一般的情報を提示し、本願において論考されるアッセイ及び他の詳細を提示するものである。以下の参照文献の全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

１．Spaete RR. 1991. A recombinant subunit vaccine approach to HCMV vaccine development. Transplant Proc 23: 90-6
２．Pass RF, Zhang C, Evans A, Simpson T, Andrews W, Huang ML, Corey L, Hill J, Davis E, Flanigan C, Cloud G. 2009. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. N Engl J Med 360: 1191-9
３．Backovic M, Longnecker R, Jardetzky TS. 2009. Structure of a trimeric variant of the Epstein-Barr virus glycoprotein B. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 2880-5
４．Hahn G, Revello MG, Patrone M, Percivalle E, Campanini G, Sarasini A, Wagner M, Gallina A, Milanesi G, Koszinowski U, Baldanti F, Gerna G. 2004. Human cytomegalovirus UL131-128 genes are indispensable for virus growth in endothelial cells and virus transfer to leukocytes. J Virol 78: 10023-33
５．Akter P, Cunningham C, McSharry BP, Dolan A, Addison C, Dargan DJ, Hassan-Walker AF, Emery VC, Griffiths PD, Wilkinson GW, Davison AJ. 2003. Two novel spliced genes in human cytomegalovirus. J Gen Virol 84: 1117-22
６．Gerna G, Percivalle E, Lilleri D, Lozza L, Fornara C, Hahn G, Baldanti F, Revello MG. 2005. Dendritic-cell infection by human cytomegalovirus is restricted to strains carrying functional UL131-128 genes and mediates efficient viral antigen presentation to CD8+ T cells. J Gen Virol 86: 275-84

Claims

修飾細胞外ドメイン又はそのフラグメントを含むヒトヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドであって、
該修飾細胞外ドメインがフーリン切断部位に挿入されたペプチドリンカーを含み、
前記ペプチドリンカーが約６アミノ酸長〜約７０アミノ酸長であり、且つ
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチドがホモ三量体複合体を形成する、
ヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＢ、ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウイルス−１）ｇＢ、ＨＳＶ−２（単純ヘルペスウイルス−２）ｇＢ、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）ｇＢ、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）ｇＢ及びＨＳＨＶ（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）ｇＢからなる群から選択される、請求項１に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢがＨＣＭＶｇＢ又はＥＢＶｇＢである、請求項２に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢがＨＣＭＶｇＢであり、前記修飾細胞外ドメインが、野生型ＨＣＭＶアミノ酸配列（配列番号２）のフーリン切断部位に挿入されたペプチドリンカー配列を含む、請求項３に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチドが膜貫通ドメイン又は細胞内ドメインを含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢがＥＢＶｇＢであり、且つ前記修飾細胞外ドメインが、野生型ＥＢＶアミノ酸配列（配列番号８）のフーリン切断部位に挿入されたペプチドリンカー配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
前記ペプチドリンカーが１０〜２５アミノ酸長である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
前記ペプチドリンカーがアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
前記ｇＢポリペプチドのＮ末端にリーダー配列を更に含み、該リーダー配列がネイティブｇＢポリペプチドリーダー配列ではない、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
前記リーダー配列がアミノ酸配列ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ（配列番号６）を有する、請求項９に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号４を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチドを３つ含む、ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体。
前記ホモ三量体複合体が単量体ｇＨ／ｇＬのヘテロ二量体との混合時にタンパク質複合体を形成する、請求項１２に記載のヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体。
前記ヘルペスウイルスがＨＣＭＶであり、前記ホモ三量体複合体の分子量（ＭＷ）が約３６０ｋＤａである、請求項１２に記載のヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体。
請求項１２〜１４のいずれかに記載のヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含むワクチン組成物。
少なくとも１つのヒトヘルペスウイルス抗原を更に含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
少なくとも１つのヒトヘルペスウイルス抗原が糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）、糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）、糖タンパク質３５０（ｇｐ３５０）、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載のワクチン組成物。
前記少なくとも１つのヒトヘルペスウイルス抗原が多量体である、請求項１６又は１７に記載のワクチン組成物。
アジュバントを更に含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチドの少なくとも７０％がホモ三量体である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
ヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体と、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）と、糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）とを含むタンパク質複合体であって、前記ホモ三量体複合体が３つのヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチドを含み、各々のヒトヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドが修飾細胞外ドメイン又はそのフラグメントを含み、該修飾細胞外ドメインがフーリン切断部位に挿入されたペプチドリンカーを含み、且つ前記ペプチドリンカーが約６アミノ酸長〜約７０アミノ酸長である、タンパク質複合体。
前記ヘルペスウイルスｇＨ及び前記ヘルペスウイルスｇＬがヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質を形成する、請求項２１に記載のタンパク質複合体。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢがヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＢ、ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウイルス−１）ｇＢ、ＨＳＶ−２（単純ヘルペスウイルス−２）ｇＢ、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）ｇＢ、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）ｇＢ及びＨＳＨＶ（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）ｇＢからなる群から選択される、請求項２１又は２２に記載のタンパク質複合体。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢがＨＣＭＶｇＢ又はＥＢＶｇＢである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢがＨＣＭＶｇＢであり、前記修飾細胞外ドメインが、野生型ＨＣＭＶアミノ酸配列（配列番号２）のフーリン切断部位に挿入されたペプチドリンカー配列を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチドが膜貫通ドメイン又は細胞内ドメインを含まない、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢがＥＢＶｇＢであり、且つ前記修飾細胞外ドメインが、野生型ＥＢＶアミノ酸配列（配列番号８）のフーリン切断部位に挿入されたペプチドリンカー配列を含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
前記ペプチドリンカーが１０〜２５アミノ酸長である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
前記ペプチドリンカーがアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）からなる、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
前記ヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチドがＮ末端にリーダー配列を更に含み、該リーダー配列がネイティブｇＢポリペプチドリーダー配列ではない、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
前記リーダー配列がアミノ酸配列ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ（配列番号６）を有する、請求項３０に記載のタンパク質複合体。
前記ヘルペスウイルスｇＨ／ｇＬ融合タンパク質が配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
ヘルペスウイルスＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１ポリペプチドを更に含む、請求項２１〜３２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
請求項２１〜３３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体と薬学的に許容可能な賦形剤とを含むワクチン組成物。
アジュバントを更に含む、請求項３４に記載のワクチン組成物。
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体、請求項１５〜２０若しくは３４若しくは３５のいずれか一項に記載のワクチン組成物、又は請求項２１〜３３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体を含有する、ヘルペスウイルス感染の予防及び／又は治療のための組成物。
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のヘルペスウイルスｇＢポリペプチドホモ三量体複合体、請求項１５〜２０若しくは３４若しくは３５のいずれか一項に記載のワクチン組成物、又は請求項２１〜３３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体を含有する、ヘルペスウイルス感染に対する免疫の誘導のための組成物。
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチドをコードする核酸。
請求項３８に記載の核酸を含む組み換えベクター。
前記ペプチドリンカーのアミノ酸配列がグリシン及びセリンを含む、請求項７に記載のヒトヘルペスウイルスｇＢポリペプチド。
前記ペプチドリンカーのアミノ酸配列がグリシン及びセリンを含む、請求項２８に記載のタンパク質複合体。