CN116640801A - 一种covid-19病毒基因工程预防性疫苗及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种COVID‑19病毒基因工程预防性疫苗及制备方法，所述COVID‑19病毒基因工程预防性疫苗的制备方法，选用SARS‑CoV‑2的S蛋白的S1亚基作为疫苗的研制基因，避免了全病毒的培养的安全性及GMP管理的难题；选择昆虫杆状病毒表达系统进行表达生产S1蛋白，能够充分发挥该表达系统的优点，极大地提高了疫苗研发速度。此外，本申请的制备方法设计用T4噬菌体的Foldon序列，可以促进S1形成三聚体，从而大大提高S1的免疫原性和保护效果，并且通过分泌表达，降低生产成本，而通过构建人工设计的三聚体抗原，大大提高疫苗的免疫原性和保护效果，并且避免了天然病毒或者天然S蛋白可能引发的抗体依赖性增强的严重副作用。

Description

一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗及制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗及制备方法。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus)自被发现以来已经有50多年历史，在自然界中广泛存在。冠状病毒属(Coronavirus)属于冠状病毒科(Coronaviridae)，基因组为完整的单股正链RNA，长约30Kb，具有正链RNA病毒所具有的重要特征：5’端有甲基化“帽，”3’端有PolyA“尾”结构。病毒有4种结构蛋白：S蛋白(Spike protein，刺突蛋白)，M蛋白(membraneprotein膜蛋白)，E蛋白(envelope protein，包膜蛋白)，N蛋白(nucleocapsid，核衣壳蛋白)。其中S蛋白在病毒结构中是三聚体糖蛋白，为I类融合蛋白，和SARS-Co V一样，SARS-CoV-2侵入人体的机理也是通过S蛋白内部的受体结合区(r eceptor binding domain，RBD)可与宿主细胞的病毒受体血管紧张素ACE2结合，为决定病毒入侵易感细胞的关键蛋白。S蛋白可被宿主的furin蛋白酶裂解为S1与S2两条多肽。S1多肽内部的RBD与宿主受体结合，而S2多肽则形成皇冠状突起的茎部。冠状病毒的免疫标为集中在S蛋白上，为疫苗研发的靶点。
SARS-CoV-2感染性极强、潜伏期很长，可以达到2周～1个月，一旦在人群中发现个例感染就已经在人群中广泛传播开了。SARS-CoV-2能引起严重急性呼吸综合征、肺炎，更多的是无症状感染，危害极大。研发安全性好、保护期长的有效疫苗，对遏制新冠病毒对人类健康及人类生产和社交、生活的正常化具有重要的意义。
新冠病毒疫苗的研发有多种管线，如灭活疫苗、重组腺病毒疫苗、mR NA疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗、基于免疫细胞的疫苗等。主要是基于SARS-CoV-2的S蛋白/基因为靶点，包括全长和受体结合区(RBD)。目前的研究发现机体产生的抗SARS-CoV-2抗体维持时间不长，通常1～3个月，这给疫苗的有效性带来了难题。
鉴于SARS-CoV的S蛋白有抗体依赖的增强(antiboy-dependent enhan cement,ADE)，谨慎起见，选用SARS-CoV-2的S蛋白的S1亚基作为疫苗的研制基因。
选择昆虫杆状病毒表达系统进行表达生产S1蛋白，是因为该表达系统具有以下优点：1)蛋白翻译后加工比细菌、酵母生产系统完善，表达产物通常具有天然构象，活性有保障、免疫原性强；2)产物表达量高；3)昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白，容易大规模生产；4)从构建到表达整个过程迅速，整个周期远比其他动物或植物细胞表达系统短，有利于在应急情况下迅速开展工作甚至生产相关药品。5)重组效率达到100％，不会有野生型病毒污染，因此表达稳定；6)杆状病毒能容纳大分子的插入片段，能包装大的基因片段。7)杆状病毒表达系统具备在同一细胞内同时表达多个基因的能力，既可采用不同的重组病毒同时感染细胞，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。8)生物安全性好，昆虫杆状病毒具有限制性的宿主范围，只对特定种属的昆虫及其细胞进行感染，对人畜等脊椎动物没有感染能力，因此具有比在哺乳动物及其培养细胞生产系统更为安全，对研究生产人员安全，无环境污染。
T4噬菌体的Foldon短肽可以自发形成三聚体，与相应蛋白融合后可促进其形成三聚体，因此构建人工设计的三聚体抗原，从而大大提高疫苗的免疫原性和保护效果，并且避免了天然病毒或者天然S蛋白可能引发的抗体依赖性增强(antibody-dependentenhancemeng,ADE)的严重副作用。
因此，提供一种疫苗的制备方法能够充分利用昆虫杆状病毒表达系统的优点，成为人们亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗及制备方法，能够充分利用昆虫杆状病毒表达系统的优点。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，提供一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、获取SARS-CoV-2-S1的氨基酸序列，对第602位氨基酸突变处理，获得突变后的SARS-CoV-2-S1氨基酸序列，且突变后的SARS-CoV-2-S1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤二、由突变后的SARS-CoV-2-S1的氨基酸序列设计SARS-CoV-2S1编码基因，所述SARS-CoV-2S1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N O.3所示；
步骤三、设计gp64信号肽编码基因，所述gp64信号肽编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
步骤四、设计噬菌体Foldon+(His)6标签的核苷酸序列，所述噬菌体F oldon+(His)6标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
步骤五、通过步骤二设计的SARS-CoV-2S1编码基因、步骤三设计的gp64信号肽编码基因、步骤四设计的噬菌体Foldon+(His)6标签的核苷酸序列合成gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis氨基酸序列；
步骤六、合成gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis编码基因，且gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis编码基因的序列如SEQ ID NO.5所示；
步骤七、构建杆状病毒转移质粒pFBD-gp64ss-SARS-CoV-2S1-Foldon His，且pFBD-gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis的序列如SEQ ID NO.6所示；
步骤八、转化大肠杆菌Dh10Bac转座产生gp64ss-SARS-CoV-2S1-Fol donHis重组杆状病毒基因组，提取Bacmid DNA并PCR扩增获得bacmid-gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis；
步骤九、用bacmid-gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis转染昆虫细胞获得重组杆状病毒；
步骤十、用步骤九获得的重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集上清液获得纯化重组S1FoldonH蛋白，将纯化重组S1FoldonH蛋白与CpG佐剂混合均匀后制得所述的COVID-19病毒基因工程预防性疫苗。
进一步的，步骤七中杆状病毒转移质粒pFBD-gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis的构建方法包括，对质粒pUC57S1进行BamHI+HindIII双酶切，切胶回收后溶于去离子水中，得混合物Ⅰ；对pFastBacI进行BamHI+HindII I双酶切切胶回收后溶于去离子水中，得混合物Ⅱ；将混合物Ⅰ和混合物Ⅱ置于同一个容器中，加入T4 DNA Ligase缓冲液、T4 DNA Ligase、去离子水，连接后转化DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒DNA，PCR鉴定后获得pFBD-ss64S1FoldonH。
进一步的，质粒pUC57S1进行BamHI+HindIII双酶切后，切胶回收2kb片段后溶于50μL去离子水中；对pFastBacI进行BamHI+HindIII双酶切并切胶回收后，溶于50μL去离子水中。
进一步的，各取5μL混合物Ⅰ和混合物Ⅱ置于1.5ml的离心管中，之后加入2μL T4DNA Ligase缓冲液、0.5μL T4 DNA Ligase，7.5μL去离子水。
进一步的，在温度为16℃的环境下连接1h，转化DH5α感受态细胞。
进一步的，挑取单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200RPM培养15h，提取质粒DNA后PCR鉴定。
进一步的，步骤十中，纯化重组S1FoldonH蛋白与CpG佐剂按1:20～1:100的质量比混合均匀。
根据本发明实施例的第二方面，提供一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗。
根据本发明实施例的第三方面，提供一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的中和抗体检测方法，包括以下步骤：用PEI转染293T细胞，加入pcDNA3.1S2 30ug，于37℃CO2孵箱中孵育24h，用VSVΔG-GFP病毒感染4h，弃液体，使用无菌PBS洗3次，加入培养基，在CO2孵箱中37℃孵育48h，2000rpm离心3m后收集上清保存于-80℃冰箱；在293T细胞下进行假型病毒测定，在六孔板上生长的293T细胞用200μL病毒原液感染，1h吸附后，除去接种物，加入新鲜培养基，并将细胞在CO2孵箱中37℃孵育16h于荧光显微镜下进行检测，记录细胞图像；取96孔板每孔接种104个293T细胞，系列稀释的小鼠血清于37℃孵箱1h，然后加入到96孔板293T细胞，于37℃CO2孵箱中孵育24h，弃上清，加入新鲜培养基，72h后检测即可，在具体实施中，pcDNA3.1S2的加入量还可选择10ug、20ug中的任意一种。
本发明实施例具有如下优点：本发明实施例提供一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗及制备方法，本申请基因工程预防性疫苗的制备方法，选用SARS-CoV-2的S蛋白的S1亚基作为疫苗的研制基因，避免了全病毒的培养的安全性及GMP管理的难题；选择昆虫杆状病毒表达系统进行表达生产S1蛋白，能够充分发挥该表达系统的优点，极大地提高了疫苗研发速度，昆虫细胞杆状病毒系统生产周期短、表达量高、产能高，能够满足全球70亿人口的免疫需要，这是其它系统不能比拟的巨大优势。此外，本申请的制备方法设计用T4噬菌体的Foldon序列，可以促进S1形成三聚体，从而大大提高S1的免疫原性和保护效果，并且通过分泌表达，降低生产成本，而通过构建人工设计的三聚体抗原，大大提高疫苗的免疫原性和保护效果，并且避免了天然病毒或者天然S蛋白可能引发的抗体依赖性增强的严重副作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验1中酶标仪于450nm波长下检测抗体吸光度(OD)值为纵坐标，不同实验组为横坐标的柱状图；
图2为本发明实验2中和试验的柱状图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、从GenBank查到SARS-CoV-2基因组序列NC_045512.2，经过分析获得SARS-CoV-2-S1的氨基酸序列，将第602位氨基酸突变为G，获得突变后的SARS-CoV-2-S1氨基酸序列，且突变后的SARS-CoV-2-S1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤二、由突变后的SARS-CoV-2-S1的氨基酸序列设计SARS-CoV-2S1编码基因，所述SARS-CoV-2S1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N O.3所示；
步骤三、设计gp64信号肽编码基因，所述gp64信号肽编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
步骤四、设计噬菌体Foldon+(His)6标签的核苷酸序列，所述噬菌体F oldon+(His)6标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
步骤五、通过步骤二设计的SARS-CoV-2S1编码基因、步骤三设计的gp64信号肽编码基因、步骤四设计的噬菌体Foldon+(His)6标签的核苷酸序列合成gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis氨基酸序列；
步骤六、合成gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis编码基因，且gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis编码基因的序列如SEQ ID NO.5所示，根据以上核苷酸序列，委托北京瑞芯诺安生物科技有限公司进行合成全序列，克隆于PUC57载体中(pUC57S1)，并对其进行测序验证；
步骤七、构建杆状病毒转移质粒pFBD-gp64ss-SARS-CoV-2S1-Foldon His，且pFBD-gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis的序列如SEQ ID NO.6所示；
步骤八、转化大肠杆菌Dh10Bac转座产生gp64ss-SARS-CoV-2S1-Fol donHis重组杆状病毒基因组，提取Bacmid DNA并PCR扩增获得bacmid-gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis；
步骤九、用bacmid-gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis转染昆虫细胞获得重组杆状病毒；
步骤十、用步骤九获得的重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集上清液获得纯化重组S1FoldonH蛋白，将纯化重组S1FoldonH蛋白与CpG佐剂按1:20～1:100的质量比混合均匀后制得所述的COVID-19病毒基因工程预防性疫苗。
进一步的，本申请还提供一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗。
实施例2
在采取实施例1技术方案的基础上，步骤七中杆状病毒转移质粒pFBD-gp64ss-SARS-CoV-2S1-FoldonHis的构建方法包括，对质粒pUC57S1进行BamHI+HindIII双酶切，切胶回收2kb片段后溶于50μL去离子水中，得混合物Ⅰ；对pFastBacI进行BamHI+HindIII双酶切并切胶回收后，溶于50μL去离子水中，得混合物Ⅱ；各取5μL混合物Ⅰ和混合物Ⅱ置于1.5ml的离心管中，之后加入2μL T4 DNA Ligase缓冲液、0.5μL T4 DNA Ligase、7.5μL去离子水，在温度为16℃的环境下连接1h，转化DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200RPM培养15h，提取质粒DNA，PCR鉴定后获得pFBD-ss64S1FoldonH。
实施例3
在采取实施例1技术方案的基础上，提供一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的中和抗体检测方法，包括以下步骤：用PEI转染293T细胞，加入pcDNA3.1S2 30ug，于37℃CO2孵箱中孵育24h，用VSVΔG-GFP病毒感染4h，弃液体，使用无菌PBS洗3次，加入培养基，在CO2孵箱中37℃孵育48h，2000rpm离心3m后收集上清保存于-80℃冰箱；在293T细胞下进行假型病毒测定，在六孔板上生长的293T细胞用200μL病毒原液感染，1h吸附后，除去接种物，加入新鲜培养基，并将细胞在CO2孵箱中37℃孵育16h于荧光显微镜下进行检测，记录细胞图像；取96孔板每孔接种104个293T细胞，系列稀释的小鼠血清于37℃孵箱1h，然后加入到96孔板293T细胞，于37℃CO2孵箱中孵育24h，弃上清，加入新鲜培养基，72h后检测即可。
本申请基因工程预防性疫苗的制备方法，选用SARS-CoV-2的S蛋白的S1亚基作为疫苗的研制基因，避免了全病毒的培养的安全性及GMP管理的难题；选择昆虫杆状病毒表达系统进行表达生产S1蛋白，能够充分发挥该表达系统的优点，极大地提高了疫苗研发速度，昆虫细胞杆状病毒系统生产周期短、表达量高、产能高，能够满足全球70亿人口的免疫需要，这是其它系统不能比拟的巨大优势。此外，本申请的制备方法设计用T4噬菌体的Foldon序列，可以促进S1形成三聚体，从而大大提高S1的免疫原性和保护效果，并且通过分泌表达，降低生产成本，而通过构建人工设计的三聚体抗原，大大提高疫苗的免疫原性和保护效果，并且避免了天然病毒或者天然S蛋白可能引发的抗体依赖性增强的严重副作用。
实验1
选取10只4～6周龄的SPF级的健康雌BALB/c雌性小鼠随机分为2组，每组5只，在第一周大腿肌肉注射免疫，实验组每只打100μL疫苗，对照组每只打100μL PBS。每隔两周打1次，共打3次。最后免疫三周后采集小鼠的静脉血，分离血清，检测免疫反应。
用0.1M Na2CO3缓冲液(pH9.6)溶解重组蛋白S1，配制成1μg/mL，以每孔100μL加入96孔板，于4℃过夜孵育；用PBST(PBS+0.1％吐温-20)洗板3次(300μL/孔/次)。每孔加入250μL 5％脱脂奶粉；室温温孵育1h，用PBST洗板3次。小鼠血清样品分别用PBS稀释1000倍，以每孔100μL加入96孔板，每个稀释梯度平行做二个副孔；37℃培养箱孵育2h，洗板3次。将HRP(辣根过氧化物酶)标记的IgG二抗5000倍，每孔加入100μL，室温孵育1h；洗板3次。加入TMB溶液，每孔加入100μL，温避光显色20分钟。每孔加100μL加入0.5M H2SO4终止液。立即用酶标仪于450nm波长下检测吸光度。以稀释1000倍血清的抗体吸光度(OD)值为纵坐标，不同实验组为横坐标作柱状图，如图1所示。
实验2
在实验1的基础上进行中和抗体检测。
在采取实施例3技术方案的基础上，提供一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的中和抗体检测方法，包括以下步骤：
步骤①、假病毒制备，用PEI转染293T细胞，加入pcDNA3.1S2 30μg，于37℃CO2孵箱中孵育24h，用VSVΔG-GFP病毒感染4h，弃液体，使用无菌PBS洗3次，加入培养基，在CO2孵箱中37℃孵育48h，2000rp m离心3m后收集上清保存于-80℃冰箱。在293T细胞下进行假型病毒测定，在六孔板上生长的293T细胞用200μL病毒原液感染，1h吸附后，除去接种物，加入新鲜培养基，并将细胞在CO2孵箱中37℃孵育16h于荧光显微镜下进行检测，记录细胞图像。
步骤②、取96孔板，每孔接种104个293T细胞，将实验1中系列稀释的小鼠血清于37℃孵箱1h，然后加入到96孔板293T细胞。于37℃CO2孵箱中孵育24h，弃上清，加入新鲜培养基，72h后检测。结果如图2所示。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 王立良
<120> 一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗及制备方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 669
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Gly Cys Val Ala Leu Thr Thr Ala Thr Gly Leu Pro Pro Ala Thr
1 5 10 15
Thr Ala Ser Pro Thr Ala Gly Val Thr Thr Pro Ala Leu Val Pro Ala
20 25 30
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gly Ala Leu Pro Leu Pro Pro Pro Ser
35 40 45
Ala Val Thr Thr Pro His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Ala Gly Thr
50 55 60
Leu Ala Pro Ala Ala Pro Val Leu Pro Pro Ala Ala Gly Val Thr Pro
65 70 75 80
Ala Ser Thr Gly Leu Ser Ala Ile Ile Ala Gly Thr Ile Pro Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Ala Ser Leu Thr Gly Ser Leu Leu Ile Val Ala Ala Ala Thr
100 105 110
Ala Val Val Ile Leu Val Cys Gly Pro Gly Pro Cys Ala Ala Pro Pro
115 120 125
Leu Gly Val Thr Thr His Leu Ala Ala Leu Ser Thr Met Gly Ser Gly
130 135 140
Pro Ala Val Thr Ser Ser Ala Ala Ala Cys Thr Pro Gly Thr Val Ser
145 150 155 160
Gly Pro Pro Leu Met Ala Leu Gly Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Ala
165 170 175
Leu Ala Gly Pro Val Pro Leu Ala Ile Ala Gly Thr Pro Leu Ile Thr
180 185 190
Ser Leu His Thr Pro Ile Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly Pro
195 200 205
Ser Ala Leu Gly Pro Leu Val Ala Leu Pro Ile Gly Ile Ala Ile Thr
210 215 220
Ala Pro Gly Thr Leu Leu Ala Leu His Ala Ser Thr Leu Thr Pro Gly
225 230 235 240
Ala Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Val Gly
245 250 255
Thr Leu Gly Pro Ala Thr Pro Leu Leu Leu Thr Ala Gly Ala Gly Thr
260 265 270
Ile Thr Ala Ala Val Ala Cys Ala Leu Ala Pro Leu Ser Gly Thr Leu
275 280 285
Cys Thr Leu Leu Ser Pro Thr Val Gly Leu Gly Ile Thr Gly Thr Ser
290 295 300
Ala Pro Ala Val Gly Pro Thr Gly Ser Ile Val Ala Pro Pro Ala Ile
305 310 315 320
Thr Ala Leu Cys Pro Pro Gly Gly Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ala
325 330 335
Ser Val Thr Ala Thr Ala Ala Leu Ala Ile Ser Ala Cys Val Ala Ala
340 345 350
Thr Ser Val Leu Thr Ala Ser Ala Ser Pro Ser Thr Pro Leu Cys Thr
355 360 365
Gly Val Ser Pro Thr Leu Leu Ala Ala Leu Cys Pro Thr Ala Val Thr
370 375 380
Ala Ala Ser Pro Val Ile Ala Gly Ala Gly Val Ala Gly Ile Ala Pro
385 390 395 400
Gly Gly Thr Gly Leu Ile Ala Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Ala Ala
405 410 415
Pro Thr Gly Cys Val Ile Ala Thr Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ser Leu
420 425 430
Val Gly Gly Ala Thr Ala Thr Leu Thr Ala Leu Pro Ala Leu Ser Ala
435 440 445
Leu Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ile Ser Thr Gly Ile Thr Gly Ala Gly
450 455 460
Ser Thr Pro Cys Ala Gly Val Gly Gly Pro Ala Cys Thr Pro Pro Leu
465 470 475 480
Gly Ser Thr Gly Pro Gly Pro Thr Ala Gly Val Gly Thr Gly Pro Thr
485 490 495
Ala Val Val Val Leu Ser Pro Gly Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
500 505 510
Cys Gly Pro Leu Leu Ser Thr Ala Leu Val Leu Ala Leu Cys Val Ala
515 520 525
Pro Ala Pro Ala Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Gly Ser Ala
530 535 540
Leu Leu Pro Leu Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ala Ala Ile Ala Ala Thr
545 550 555 560
Thr Ala Ala Val Ala Ala Pro Gly Thr Leu Gly Ile Leu Ala Ile Thr
565 570 575
Pro Cys Ser Pro Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Ala Thr
580 585 590
Ser Ala Gly Val Ala Val Leu Thr Gly Gly Val Ala Cys Thr Gly Val
595 600 605
Pro Val Ala Ile His Ala Ala Gly Leu Thr Pro Thr Thr Ala Val Thr
610 615 620
Ser Thr Gly Ser Ala Val Pro Gly Thr Ala Ala Gly Cys Leu Ile Gly
625 630 635 640
Ala Gly His Val Ala Ala Ser Thr Gly Cys Ala Ile Pro Ile Gly Ala
645 650 655
Gly Ile Cys Ala Ser Thr Gly Thr Gly Thr Ala Ser Pro
660 665
<210> 2
<211> 60
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggtgtcag ctatcgtgct gtacgtgttg ctcgctgctg ctgctcacag cgctttcgcg 60
<210> 3
<211> 2010
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtctcagt gcgtgaacct gaccaccaga acccagctgc caccagctta caccaactct 60
ttcaccagag gagtgtacta cccagacaag gtgttcagat cttctgtgct gcactctacc 120
caggacctgt tcctgccatt cttctctaac gtgacctggt tccacgctat ccacgtgtct 180
ggaaccaacg gaaccaagag attcgacaac ccagtgctgc cattcaacga cggagtgtac 240
ttcgcttcta ccgagaagtc taacatcatc agaggatgga tcttcggtac caccctggac 300
tctaagaccc agtctctgct gatcgtgaac aacgctacca acgtggtgat caaggtgtgc 360
gagttccagt tctgcaacga cccattcctg ggagtgtact accacaagaa caacaagtct 420
tggatggagt ctgagttcag agtgtactct tctgctaaca actgcacctt cgagtacgtg 480
tctcagccat tcctgatgga cctggaggga aagcagggaa acttcaagaa cctgagagag 540
ttcgtgttca agaacatcga cggatacttc aagatctact ctaagcacac cccaatcaac 600
ctggtgagag atctgccaca gggattctct gctctggagc cactggtgga cctgccaatc 660
ggaatcaaca tcaccagatt ccagaccctg ctggctctgc acagatctta cctgacccca 720
ggagactctt cttctggatg gaccgctgga gctgctgctt actacgtggg atacctgcag 780
ccaagaacct tcctgctgaa gtacaacgag aacggaacca tcaccgacgc tgtggactgc 840
gctctggacc cactgtctga aaccaagtgc accctgaagt ctttcaccgt ggagaaggga 900
atctaccaga cctctaactt cagagtgcag ccaaccgagt ctatcgtgag attcccaaac 960
atcaccaacc tgtgcccatt cggagaggtg ttcaacgcta ccagattcgc ttctgtgtac 1020
gcttggaaca gaaagagaat ctctaactgc gtggctgact actctgtgct gtacaactct 1080
gcttctttct ctaccttcaa gtgctacgga gtgtctccaa ccaagctgaa cgacctgtgc 1140
ttcaccaacg tgtacgctga ctctttcgtg atcagaggag acgaggtgag acagatcgct 1200
ccaggacaga ccggaaagat cgctgactac aactacaagc tgccagacga cttcaccgga 1260
tgcgtgatcg cttggaactc taacaacctg gactctaagg tgggaggaaa ctacaactac 1320
ctgtacagac tgttcagaaa gtctaacctg aagccattcg agagagacat ctctaccgag 1380
atctaccagg ctggatctac cccatgcaac ggagtggagg gattcaactg ctacttccca 1440
ctgcagtctt acggattcca gccaaccaac ggagtgggat accagccata cagagtggtg 1500
gtgctgtctt tcgagctgct gcacgctcca gctaccgtgt gcggaccaaa gaagtctacc 1560
aacctggtga agaacaagtg cgtgaacttc aacttcaatg gcctcaccgg aaccggagtg 1620
ctgaccgagt ctaacaagaa gttcctgcca ttccagcagt tcggaagaga catcgctgac 1680
accaccgacg ctgtgagaga tccacagacc ctggagatcc tggacatcac cccatgctct 1740
ttcggaggag tgtctgtgat caccccagga accaacacct ctaaccaggt ggctgtgctg 1800
taccagggcg tgaactgcac cgaggtgcca gtggctatcc acgctgacca gctgacccca 1860
acctggagag tgtactctac cggatctaac gtgttccaga ccagagctgg atgcctgatc 1920
ggagctgagc acgtgaacaa ctcttacgag tgcgacatcc caatcggagc tggaatctgc 1980
gcttcttacc agacccagac caactctcca 2010
<210> 4
<211> 111
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatacatcc cagaggctcc aagagacgga caggcttacg tgagaaagga cggagagtgg 60
gtgttcctgt ctaccttcct gggaggagga tctcaccacc accaccacca c 111
<210> 5
<211> 2200
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttggatcca ccatggtgtc agctatcgtg ctgtacgtgt tgctcgctgc tgctgctcac 60
agcgctttcg cgtctcagtg cgtgaacctg accaccagaa cccagctgcc accagcttac 120
accaactctt tcaccagagg agtgtactac ccagacaagg tgttcagatc ttctgtgctg 180
cactctaccc aggacctgtt cctgccattc ttctctaacg tgacctggtt ccacgctatc 240
cacgtgtctg gaaccaacgg aaccaagaga ttcgacaacc cagtgctgcc attcaacgac 300
ggagtgtact tcgcttctac cgagaagtct aacatcatca gaggatggat cttcggtacc 360
accctggact ctaagaccca gtctctgctg atcgtgaaca acgctaccaa cgtggtgatc 420
aaggtgtgcg agttccagtt ctgcaacgac ccattcctgg gagtgtacta ccacaagaac 480
aacaagtctt ggatggagtc tgagttcaga gtgtactctt ctgctaacaa ctgcaccttc 540
gagtacgtgt ctcagccatt cctgatggac ctggagggaa agcagggaaa cttcaagaac 600
ctgagagagt tcgtgttcaa gaacatcgac ggatacttca agatctactc taagcacacc 660
ccaatcaacc tggtgagaga tctgccacag ggattctctg ctctggagcc actggtggac 720
ctgccaatcg gaatcaacat caccagattc cagaccctgc tggctctgca cagatcttac 780
ctgaccccag gagactcttc ttctggatgg accgctggag ctgctgctta ctacgtggga 840
tacctgcagc caagaacctt cctgctgaag tacaacgaga acggaaccat caccgacgct 900
gtggactgcg ctctggaccc actgtctgaa accaagtgca ccctgaagtc tttcaccgtg 960
gagaagggaa tctaccagac ctctaacttc agagtgcagc caaccgagtc tatcgtgaga 1020
ttcccaaaca tcaccaacct gtgcccattc ggagaggtgt tcaacgctac cagattcgct 1080
tctgtgtacg cttggaacag aaagagaatc tctaactgcg tggctgacta ctctgtgctg 1140
tacaactctg cttctttctc taccttcaag tgctacggag tgtctccaac caagctgaac 1200
gacctgtgct tcaccaacgt gtacgctgac tctttcgtga tcagaggaga cgaggtgaga 1260
cagatcgctc caggacagac cggaaagatc gctgactaca actacaagct gccagacgac 1320
ttcaccggat gcgtgatcgc ttggaactct aacaacctgg actctaaggt gggaggaaac 1380
tacaactacc tgtacagact gttcagaaag tctaacctga agccattcga gagagacatc 1440
tctaccgaga tctaccaggc tggatctacc ccatgcaacg gagtggaggg attcaactgc 1500
tacttcccac tgcagtctta cggattccag ccaaccaacg gagtgggata ccagccatac 1560
agagtggtgg tgctgtcttt cgagctgctg cacgctccag ctaccgtgtg cggaccaaag 1620
aagtctacca acctggtgaa gaacaagtgc gtgaacttca acttcaatgg cctcaccgga 1680
accggagtgc tgaccgagtc taacaagaag ttcctgccat tccagcagtt cggaagagac 1740
atcgctgaca ccaccgacgc tgtgagagat ccacagaccc tggagatcct ggacatcacc 1800
ccatgctctt tcggaggagt gtctgtgatc accccaggaa ccaacacctc taaccaggtg 1860
gctgtgctgt accagggcgt gaactgcacc gaggtgccag tggctatcca cgctgaccag 1920
ctgaccccaa cctggagagt gtactctacc ggatctaacg tgttccagac cagagctgga 1980
tgcctgatcg gagctgagca cgtgaacaac tcttacgagt gcgacatccc aatcggagct 2040
ggaatctgcg cttcttacca gacccagacc aactctccag gatacatccc agaggctcca 2100
agagacggac aggcttacgt gagaaaggac ggagagtggg tgttcctgtc taccttcctg 2160
ggaggaggat ctcaccacca ccaccaccat aagcttaaac 2200
<210> 6
<211> 7332
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttctctgtca cagaatgaaa atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga 60
ctgaatatca acgcttattt gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc 120
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 180
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 240
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 300
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 360
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 420
aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 480
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 540
attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 600
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 660
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 720
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 780
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 840
cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 900
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 960
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 1020
tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 1080
tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 1140
caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 1200
accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 1260
attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 1320
ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 1380
taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 1440
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 1500
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 1560
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 1620
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 1680
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 1740
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 1800
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 1860
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1920
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1980
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 2040
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 2100
acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 2160
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 2220
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 2280
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 2340
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 2400
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 2460
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 2520
tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct ggcaaaatcg gttacggttg 2580
agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa 2640
caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag acagaatagt tgtaaactga 2700
aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt tgttatggct aaagcaaact 2760
cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga ggggcgtggc caagggcatg 2820
gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac aactccgcgg ccgggaagcc 2880
gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg tcgatatcaa agtgcatcac 2940
ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg ggatcgtcac cgtaatctgc 3000
ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca tgcttgagga gattgatgag 3060
cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact gcgagatcat agatatagat 3120
ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc gcgagagcgc caacaaccgc 3180
ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta cggagcaagt tcccgaggta 3240
atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct ccgaactcac gaccgaaaag 3300
atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg agcctacatg tgcgaatgat 3360
gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt 3420
gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg 3480
cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa acagtcataa caagccatga 3540
aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg 3600
agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca ggcttatgtc aactgggttc 3660
gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg 3720
aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg 3780
cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg cacggatctg ccctggcttc 3840
aggagatcgg tagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag 3900
tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt gttcgcccag gactctagct 3960
atagttctag tggttggcct acgtacccgt agtggctatg gcagggcttg ccgccccgac 4020
gttggctgcg agccctgggc cttcacccga acttgggggt tggggtgggg aaaaggaaga 4080
aacgcgggcg tattggtccc aatggggtct cggtggggta tcgacagagt gccagccctg 4140
ggaccgaacc ccgcgtttat gaacaaacga cccaacaccc gtgcgtttta ttctgtcttt 4200
ttattgccgt catagcgcgg gttccttccg gtattgtctc cttccgtgtt tcagttagcc 4260
tcccccatct cccggtaccg catgctatgc atcagctgct agcaccatgg ctcgagatcc 4320
cgggtgatca agtcttcgtc gagtgattgt aaataaaatg taatttacag tatagtattt 4380
taattaatat acaaatgatt tgataataat tcttatttaa ctataatata ttgtgttggg 4440
ttgaattaaa ggtccgtata ctccggaata ttaatagatc atggagataa ttaaaatgat 4500
aaccatctcg caaataaata agtattttac tgttttcgta acagttttgt aataaaaaaa 4560
cctataaata ttccggatta ttcataccgt cccaccatcg ggcgcggatc caccatggtg 4620
tcagctatcg tgctgtacgt gttgctcgct gctgctgctc acagcgcttt cgcgtctcag 4680
tgcgtgaacc tgaccaccag aacccagctg ccaccagctt acaccaactc tttcaccaga 4740
ggagtgtact acccagacaa ggtgttcaga tcttctgtgc tgcactctac ccaggacctg 4800
ttcctgccat tcttctctaa cgtgacctgg ttccacgcta tccacgtgtc tggaaccaac 4860
ggaaccaaga gattcgacaa cccagtgctg ccattcaacg acggagtgta cttcgcttct 4920
accgagaagt ctaacatcat cagaggatgg atcttcggta ccaccctgga ctctaagacc 4980
cagtctctgc tgatcgtgaa caacgctacc aacgtggtga tcaaggtgtg cgagttccag 5040
ttctgcaacg acccattcct gggagtgtac taccacaaga acaacaagtc ttggatggag 5100
tctgagttca gagtgtactc ttctgctaac aactgcacct tcgagtacgt gtctcagcca 5160
ttcctgatgg acctggaggg aaagcaggga aacttcaaga acctgagaga gttcgtgttc 5220
aagaacatcg acggatactt caagatctac tctaagcaca ccccaatcaa cctggtgaga 5280
gatctgccac agggattctc tgctctggag ccactggtgg acctgccaat cggaatcaac 5340
atcaccagat tccagaccct gctggctctg cacagatctt acctgacccc aggagactct 5400
tcttctggat ggaccgctgg agctgctgct tactacgtgg gatacctgca gccaagaacc 5460
ttcctgctga agtacaacga gaacggaacc atcaccgacg ctgtggactg cgctctggac 5520
ccactgtctg aaaccaagtg caccctgaag tctttcaccg tggagaaggg aatctaccag 5580
acctctaact tcagagtgca gccaaccgag tctatcgtga gattcccaaa catcaccaac 5640
ctgtgcccat tcggagaggt gttcaacgct accagattcg cttctgtgta cgcttggaac 5700
agaaagagaa tctctaactg cgtggctgac tactctgtgc tgtacaactc tgcttctttc 5760
tctaccttca agtgctacgg agtgtctcca accaagctga acgacctgtg cttcaccaac 5820
gtgtacgctg actctttcgt gatcagagga gacgaggtga gacagatcgc tccaggacag 5880
accggaaaga tcgctgacta caactacaag ctgccagacg acttcaccgg atgcgtgatc 5940
gcttggaact ctaacaacct ggactctaag gtgggaggaa actacaacta cctgtacaga 6000
ctgttcagaa agtctaacct gaagccattc gagagagaca tctctaccga gatctaccag 6060
gctggatcta ccccatgcaa cggagtggag ggattcaact gctacttccc actgcagtct 6120
tacggattcc agccaaccaa cggagtggga taccagccat acagagtggt ggtgctgtct 6180
ttcgagctgc tgcacgctcc agctaccgtg tgcggaccaa agaagtctac caacctggtg 6240
aagaacaagt gcgtgaactt caacttcaat ggcctcaccg gaaccggagt gctgaccgag 6300
tctaacaaga agttcctgcc attccagcag ttcggaagag acatcgctga caccaccgac 6360
gctgtgagag atccacagac cctggagatc ctggacatca ccccatgctc tttcggagga 6420
gtgtctgtga tcaccccagg aaccaacacc tctaaccagg tggctgtgct gtaccagggc 6480
gtgaactgca ccgaggtgcc agtggctatc cacgctgacc agctgacccc aacctggaga 6540
gtgtactcta ccggatctaa cgtgttccag accagagctg gatgcctgat cggagctgag 6600
cacgtgaaca actcttacga gtgcgacatc ccaatcggag ctggaatctg cgcttcttac 6660
cagacccaga ccaactctcc aggatacatc ccagaggctc caagagacgg acaggcttac 6720
gtgagaaagg acggagagtg ggtgttcctg tctaccttcc tgggaggagg atctcaccac 6780
caccaccacc ataagcttgt cgagaagtac tagaggatca taatcagcca taccacattt 6840
gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa 6900
atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 6960
aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 7020
tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatctgat cactgcttga gcctaggaga 7080
tccgaaccag ataagtgaaa tctagttcca aactattttg tcatttttaa ttttcgtatt 7140
agcttacgac gctacaccca gttcccatct attttgtcac tcttccctaa ataatcctta 7200
aaaactccat ttccacccct cccagttccc aactattttg tccgcccaca gcggggcatt 7260
tttcttcctg ttatgttttt aatcaaacat cctgccaact ccatgtgaca aaccgtcatc 7320
ttcggctact tt 7332

Claims (9)

1.一种COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、获取SARS-CoV-2-S1的氨基酸序列，对第602位氨基酸突变处理，获得突变后的SARS-CoV-2-S1氨基酸序列，且突变后的SARS-CoV-2-S1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤二、由突变后的SARS-CoV-2-S1的氨基酸序列设计SARS-CoV-2S1编码基因，所述SARS-CoV-2 S1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
步骤三、设计gp64信号肽编码基因，所述gp64信号肽编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
步骤四、设计噬菌体Foldon+(His)6标签的核苷酸序列，所述噬菌体Foldon+(His)6标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
步骤五、通过步骤二设计的SARS-CoV-2 S1编码基因、步骤三设计的gp64信号肽编码基因、步骤四设计的噬菌体Foldon+(His)6标签的核苷酸序列合成gp64ss-SARS-CoV-2 S1-FoldonHis氨基酸序列；
步骤六、合成gp64ss-SARS-CoV-2 S1-FoldonHis编码基因，且gp64ss-SARS-CoV-2 S1-FoldonHis编码基因的序列如SEQ ID NO.5所示；
步骤七、构建杆状病毒转移质粒pFBD-gp64ss-SARS-CoV-2 S1-FoldonHis，且pFBD-gp64ss-SARS-CoV-2 S1-FoldonHis的序列如SEQ ID NO.6所示；
步骤八、转化大肠杆菌Dh10Bac转座产生gp64ss-SARS-CoV-2 S1-FoldonHis重组杆状病毒基因组，提取Bacmid DNA并PCR扩增获得bacmid-gp64ss-SARS-CoV-2 S1-FoldonHis；
步骤九、用bacmid-gp64ss-SARS-CoV-2 S1-FoldonHis转染昆虫细胞获得重组杆状病毒；
步骤十、用步骤九获得的重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集上清液获得纯化重组S1FoldonH蛋白，将纯化重组S1FoldonH蛋白与CpG佐剂混合均匀后制得所述的COVID-19病毒基因工程预防性疫苗。
2.根据权利要求1所述COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的制备方法，其特征在于，步骤七中杆状病毒转移质粒pFBD-gp64ss-SARS-CoV-2 S1-FoldonHis的构建方法包括，对质粒pUC57S1进行BamHI+HindIII双酶切，切胶回收后溶于去离子水中，得混合物Ⅰ；对pFastBacI进行BamHI+HindIII双酶切切胶回收后溶于去离子水中，得混合物Ⅱ；将混合物Ⅰ和混合物Ⅱ置于同一个容器中，加入T4 DNA Ligase缓冲液、T4 DNA Ligase、去离子水，连接后转化DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒DNA，PCR鉴定后获得pFBD-ss64S1FoldonH。
3.根据权利要求2所述COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的制备方法，其特征在于，质粒pUC57S1进行BamHI+HindIII双酶切后，切胶回收2kb片段后溶于50μL去离子水中；对pFastBacI进行BamHI+HindIII双酶切并切胶回收后，溶于50μL去离子水中。
4.根据权利要求2所述COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的制备方法，其特征在于，各取5μL混合物Ⅰ和混合物Ⅱ置于1.5ml的离心管中，之后加入2μL T4 DNA Ligase缓冲液、0.5μL T4 DNA Ligase，7.5μL去离子水。
5.根据权利要求2所述COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的制备方法，其特征在于，在温度为16℃的环境下连接1h，转化DH5α感受态细胞。
6.根据权利要求2所述COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的制备方法，其特征在于，挑取单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200RPM培养15h，提取质粒DNA后PCR鉴定。
7.根据权利要求1所述COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的制备方法，其特征在于：步骤十中，纯化重组S1FoldonH蛋白与CpG佐剂按1:20～1:100的质量比混合均匀。
8.一种如权利要求1-7中任一项所述方法制备的COVID-19病毒基因工程预防性疫苗。
9.一种如权利要求8所述COVID-19病毒基因工程预防性疫苗的中和抗体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：用PEI转染293T细胞，加入pcDNA3.1S2 30ug，于37℃CO2孵箱中孵育24h，用VSVΔG-GFP病毒感染4h，弃液体，使用无菌PBS洗3次，加入培养基，在CO2孵箱中37℃孵育48h，2000rpm离心3m后收集上清保存于-80℃冰箱；在293T细胞下进行假型病毒测定，在六孔板上生长的293T细胞用200μL病毒原液感染，1h吸附后，除去接种物，加入新鲜培养基，并将细胞在CO2孵箱中37℃孵育16h于荧光显微镜下进行检测，记录细胞图像；取96孔板每孔接种104个293T细胞，系列稀释的小鼠血清于37℃孵箱1h，然后加入到96孔板293T细胞，于37℃CO2孵箱中孵育24h，弃上清，加入新鲜培养基，72h后检测即可。
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Citations (3)

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CN101007168A (zh) * 2006-01-23 2007-08-01 北京大学 一种sars疫苗及其制备方法
CN101100680A (zh) * 2007-06-15 2008-01-09 中国科学院武汉病毒研究所 高效表达sars冠状病毒s蛋白的重组杆状病毒及构建
CN111676248A (zh) * 2020-07-02 2020-09-18 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 表达新型冠状病毒S基因与流感M1基因嵌合SARS-CoV-2 VLP的构建

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FAN WU等: "Fan Wu等，Neutralizing antibody responses to SARS-Cov-2 in a Covid-19 recovered patient cohort and their implications，《MedRXIV》，2020.04.20", 《MEDRXIV》, pages 1 *

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