KR20230027320A - IgG 결합 펩타이드에 의한 부위 특이적 RI 표지 항체 - Google Patents

IgG 결합 펩타이드에 의한 부위 특이적 RI 표지 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방사성 금속 핵종과 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 IgG 결합 펩타이드, 방사성 금속 핵종으로 표지된 IgG 결합 펩타이드, 상기 IgG 결합 펩타이드와 IgG와의 복합체 및 상기 IgG 결합 펩타이드 또는 복합체를 포함하는 핵 의학 영상 진단제 또는 암의 진단제 등에 관한 것이다.

Description

IgG 결합 펩타이드에 의한 부위 특이적 RI 표지 항체{SITE-SPECIFIC RADIOISOTOPE-LABELED ANTIBODY USING IgG-BINDING PEPTIDE}
본 발명은, 방사성 금속 핵종과 결합할 수 리간드를 포함하는 IgG 결합 펩타이드, 방사성 금속 핵종으로 표지된 IgG 결합 펩타이드, 상기 IgG 결합 펩타이드와 IgG와의 복합체, 및 상기 IgG 결합 펩타이드 또는 복합체를 포함하는 핵의학 영상 진단제 또는 암 진단제 등에 관한 것이다.
항체는 종래부터 각종의 연구·개발에 있어서, 표적 분자의 검출에 많이 이용되고 있으며, 검출 시약과 진단 약으로서 산업면에서도, 매우 중요한 것으로 되어있다. 또한, 항체는, 이의 표적 분자에 대한 특이성으로부터 질환의 치료를 위한 의약품으로도 주목받고 있다.
항체의 기능 추가를 위해, 요오드화나 킬레이트 화합물의 부가(비특허문헌 1) 등을 통해 방사성 동위 원소에 의한 표지가 이루어지고 있다. 이러한 수식은, 지금까지 주로 항체에 포함된 라이신의 아미노기와 시스테인의 티올기, 및 활성화 된 카르복실기 등을 통해 이루어지고 있으며, 이들은 관능기에 대해 특이적이지만, 부위 특이적이지 않기 때문에, 항체의 항원 결합 부위에 대한 수식 등에 의해 항체의 활성을 저하시키는 등의 문제나, 결합하는 화합물의 수를 컨트롤하기 어려운 등의 문제가 있었다.
이러한 문제를 극복하기 위해, 특정의 작용기를 부위 특이적으로 도입한 항체를 사용하여, 항체를 수식하는 일이 시행되고 있다. 예를 들면, 비천연 아미노산 (비특허문헌 2-4)이나 프리의 시스테인(비특허문헌 5-6)을 특정의 부위에 유전자 공학적 개변하여 도입함으로써, 특정의 부위에서의 수식이 가능하게 되었다. 이처럼 부위 특이적인 항체 수식 기술은 개발되고 있으나, 대부분의 경우, 항체 자체를 항체 공학적으로 개변할 필요가 있고, 그 개변에 따른 항체의 기능 저하와 개발의 높은 비용을 고려하면 반드시 유리한 방법이라고 할 수 없다.
Rodwell, J. D. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1986, 83, pp.2632-2636; Axup, J. Y. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109, pp. 16101-16106; Tian, F. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111, pp. 1766-1771; Zimmerman, E. S. et al., Bioconjugate chemistry, 2014, 25, pp. 351-361; Shen, B. Q. et al., Nature biotechnology, 2012, 30, pp. 184-189; Bernardes, G. J. et al., Nature protocols 2013, 8, pp. 2079-2089.
따라서, 특이적이고 간편하게 항체를 수식할 수 있는 방법이 필요하게 되고 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들은, IgG 결합 펩타이드와 IgG Fc와의 복합체의 X선 결정 구조 해석에 따라, 결합 상태에서 IgG 결합 펩타이드의 각 아미노산의 위치와 IgG Fc의 각 아미노산과의 위치 관계를 상세하게 검토하였다. 또한, 가교제와 결합 가능한 아미노산 펩타이드에 도입하고, 상기 아미노산을 가교제에 의해 수식하는 것에 대해, 가교제에 의해 부위 특이적으로 수식된 IgG 결합 펩타이드를 제조하고, 이를 이용하여, IgG를 수식할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명은 방사성 금속 핵종으로 표지된 IgG 결합 펩타이드와 IgG와의 복합체를 암 진단제로 이용할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
따라서, 본 발명은 이하의 실시 형태를 포함한다.
(1) 하기의 식 I :
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(식에서, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고;
C는 시스테인 잔기이며;
H는 히스티딘 잔기이고;
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린산, 또는 디아미노 프로피온산이며;
G는 글리신 잔기이고;
Xaa2는 글루탐산 잔기, 글루타민 잔기 또는 아스파라긴 잔기이며;
L은 류신 잔기이고;
V는 발린 잔기이며; 및
W는 트립토판 잔기이다)
에 의해 나타내지는 13 ~ 17 아미노산 잔기로부터 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG와 결합 가능하며, 또한 방사성 금속 핵종과 결합할 수 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
(2) 하기의 식 I :
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(식에서, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고;
C는 시스테인 잔기이며;
H는 히스티딘 잔기이고;
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린산, 또는 디아미노 프로피온산이며;
G는 글리신 잔기이고;
Xaa2는 글루탐산 잔기, 글루타민 잔기 또는 아스파라긴 잔기이며;
L은 류신 잔기이고;
V는 발린 잔기이며; 및
W는 트립토판 잔기이다)
에 의해 나타내지는 13 ~ 17 아미노산 잔기로부터 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG와 결합 가능하며, 또한 방사성 금속 핵종으로 표지된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
(3) 하기의 식 V :
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(식에서,
D는 아스파르트산 잔기이고;
C는 시스테인 잔기이며;
G는 글리신 잔기이고;
L은 류신 잔기이며;
W는 트립토판 잔기이고;
T는 트레오닌 잔기이며;
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린산, 또는 디아미노 프로피온산이고;
Xaa2는 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이며;
Xaa3은 트립토판 잔기 또는 티로신 잔기이고;
Xaa4는 히스티딘 잔기, 아르기닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이며;
Xaa5는 글루탐산 잔기, 글루타민 잔기, 아스파라긴 잔기, 아르기닌 잔기 또는 아스파르트산 잔기이고; 및
Xaa6은 이소류신 잔기 또는 발린 잔기이다)
에 의해 나타내지는 13 아미노산 잔기로부터 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG와 결합 가능하며, 또한 방사성 금속 핵종이 리간드를 통해 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
(4) 펩타이드와 IgG의 복합체에 있어서, Xaa1이 가교제로 수식되어 있는, 상기 기재된 펩타이드와 IgG의 가교 반응에 의해 형성되는 상기 복합체.
(5) 방사성 금속 핵종이 펩타이드에 결합하고 있는, (2) 또는 (3)에 기재된 펩타이드 또는 (4)에 기재된 복합체를 포함하는, 핵의학 영상 진단제 또는 암의 진단제.
(6)피험체의 암의 우환의 유무를 결정하는 방법에 있어서,
피험체로부터 얻어진 시료에, 방사성 금속 핵종이 펩타이드에 결합하고 있는 (2) 또는 (3)에 기재된 펩타이드 또는 (4)에 기재된 복합체를 반응시키는 공정;
시료 중의 방사성 금속 핵종에 유래하는 방사능의 수준 또는 존재를 측정하는 공정; 및
방사능의 수준 또는 존재에 따라, 피험체의 암의 우환의 유무를 결정하는 공정;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(7) 피험체의 암의 우환의 유무를 결정하는 방법에 있어서,
방사성 금속 핵종이 펩타이드에 결합하고 있는 (2) 또는 (3)에 기재된 펩타이드 또는 (4)에 기재된 복합체를 피험체에 투여하는 공정;
피험체에서 방사성 금속 핵종에 유래하는 방사능의 수준 또는 존재를 측정하는 공정; 및 방사능의 수준 또는 존재에 따라, 피험체의 암의 우환의 유무를 결정하는 공정; 를 포함하는 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본특허 출원번호 2016-117395 호, 2016-227025호의 공개 내용을 포함하고 있다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드는 방사성 금속 핵종을 용이하게 결합시킬 수 있기 때문에, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드를 이용함으로써 방사성 금속 핵종에 의해 IgG 특이적이고 간편하게 표지할 수 있다. 또한, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드는 항체 분자의 배열을 개변할 필요가 없는 것으로부터, 항체 분자의 유전자 변형에 따른 기능 저하를 초래할 수 없다. 또한, 종래 필요로 되어 있는 방사성 금속 핵종에서 IgG를 직접 표지하는 반응을 필요로 하지 않으며, 더욱이, 해당 반응에 의한 항체의 기능 저하를 초래할 수가 없다.
도 1(A)는, IgG 결합 펩타이드(C35A-3/15: DCAYHRGELVWCT(서열 번호 33))와 인간 IgG Fc의 복합체의 구조를 나타낸다. IgG 결합 펩타이드는 스페이스 필링 모델로, IgG Fc는 리본 모델로, Fc의 당쇄를 와이어 모델로 나타낸다. 도 1(B)는, DSG에 의해 수식한 IgG 결합 펩타이드(C35A-3/15(R8K): DCAYHKGELVWCT(서열 번호 34))과 IgG Fc와의 가교 구조의 모델을 보여준다. 펩타이드의 주쇄는 리본 모델로 나타낸다. peptide-Lys8은, C35A-3/15(R8K)의 6번째 리신 잔기를, peptide-Tyr6-Gly9는 C35A-3/15(R8K)의 4번째 티로신 잔기부터 7번째 글리신 잔기를 나타낸다. 또한, Fc-Lys248는 EU numbering에 따라 Fc의 Lys248을, Fc-Pro247-Asp249은 EU numbering에 따라 Fc의 Pro247부터 Asp249를 나타낸다.
도 2는 표지된 IgG 결합 펩타이드 및 각종 단백질의 혼합물의 SDS-PAGE (A) 및 웨스턴 블롯(B)의 결과를 나타낸다. 도 중, DSG는 DSG(디숙신이미딜 글루타레이트)와 반응시킨 IgG 결합 펩타이드를 DSS는 DSS(디숙신이미딜 수버레이트)와 반응시킨 IgG 결합 펩타이드를 공식한 것을 나타낸다. 또한, 도 중, hIgG은 인간 IgG를, hIgA은 인간 IgA를, HSA는 인간 혈청 알부민을 각각 나타낸다.
도 3은 표지된 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 반응에 따른 반응 몰비(A) 및 반응 시간(B)의 ELISA에 의한 검토 결과를 나타낸다. DSS R8K 0 min은, IgG의 10배 몰비의 표지화 IgG 결합 펩타이드 Tris-HCl(pH 7.0)을 추가한 NHS기를 블로킹 후 웰에 첨가한 것이다. No DSS R8K은, DSS를 결합시키지 않은 비오틴화 IgG 결합 (R8K) 펩타이드를 사용한 것이며, no pep은, 펩타이드를 첨가하지 않은 컨트롤을 나타낸다.
도 4는 표지된 IgG 결합 펩타이드의 각 단백질(hIgA, hIgG, BSA(소 혈청 알부민))에 대한 반응성을, 크기 배제 크로마토 그래피를 이용하여 측정한 결과를 나타낸다. (A)는 DSS에 의해 수식한 IgG 결합 펩타이드의 반응성을, (B)는 DSG에 의해 수식된 IgG 결합 펩타이드의 반응을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5(A)는, 인간 IgG의 Fc 용액과, DMF에 용해한 DSG 수식한 IgG 결합 펩타이드를, 인간 IgG에 대한 몰비로 0.5, 1.0, 2.0 또는 5.0 추가하여, 교반 후 실온에서 반응시킨 후의, 액체 크로마토 그래피의 결과를 나타낸다. 도 5(B)는 인간 IgG와 DSG 수식한 IgG 결합 펩타이드를 각 몰비로 반응시킨 경우의, 미반응(피크 2), 1개의 펩타이드의 부가물(피크 3) 및 2개의 펩타이드의 부가물(피크 4)의 생성량의 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 pH 4.0(A), pH 5.5(B) 또는 pH 7.0(C)에서 제조한 인간 IgG의 Fc 용액에 대해 DMF에 용해하여 DSG 수식한 IgG 결합 펩타이드를 몰비로 1.0 추가하여, 교반 후 실온에서 반응시켜 반응의 5 및 10 또는 30 분 후의, 미반응(피크 2), 1 개의 펩타이드의 부가물(피크 3) 및 2 개의 펩타이드의 부가물(피크 4)의 생성량의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 [111In] 표지 Trastuzumab-1 투여 6 시간 후의 종양 부위를 포함하는 SPECT/CT 영상(A) 및 CT 영상(B) 및 [111In] 표지 Trastuzumab-2 투여 4 시간 후의 종양 부위를 포함하는 SPECT/CT 영상(C)를 나타낸다.
도 8은 [111In] 표지 Trastuzumab-1 투여 24 시간 후(A) 및 48 시간 후(B)의 종양 부위를 포함하는 SPECT/CT 영상, 및 [111In] 표지 Trastuzumab-2 투여 24 시간 후(C) 및 48 시간 후(D)의 종양 부위를 포함하는 SPECT/CT 영상을 나타낸다.
도 9는 [111In] 표지 Trastuzumab-1 투여 6 시간 후(A) 및 [111In] 표지 Trastuzumab-2 투여 4 시간 후(B)의, 간장을 포함하는 SPECT/CT 영상을 나타낸다.
도 10은 실시예 9에서 제조된 디클로로프로파논에 의해 SS 가교 구조를 가지는 IgG 결합 펩타이드의 합성 구조를 나타낸다.
도 11는 [89Zr] 표지 Trastuzumab-1 또는 2의 투여 6 시간 후, 24 시간 후 및 48 시간의 종양 부위를 포함하는 PET 영상을 나타낸다. 실선 화살표는, HER2 고발현 종양 조직을, 점선 화살표는, HER2 저발현 종양 조직을 나타낸다.
<IgG 결합 펩타이드>
일양태에서, 본 발명은, 방사성 금속 핵종과 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 IgG 결합 펩타이드에 관한 것이다. IgG 결합 펩타이드 중의 리간드의 위치는 특히 한정하지 않으나, 예를 들면 IgG 결합 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단, 바람직하게는 N 말단에 연결시킬 수 있다. 리간드를 펩타이드에 연결시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 리간드를 IgG 결합 펩타이드의 N 말단에 연결시키는 경우에는, N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS), 이소티오시아노기(ITC), 술폰산 클로라이드, 카르복실산 클로라이드, 에틸렌 옥사이드, 알킬 클로라이드, 알데히드기 및 카르복실산 무수물 등의 반응기를 리간드에 추가하고, 이를 IgG 결합 펩타이드의 N 말단 아미노기와 반응시키면 된다. 또는, 이러한 리간드를 포함하는 IgG 결합 펩타이드를 주지의 합성법 등으로 직접 합성할 수도 있다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드에 포함될 수 있는 방사성 금속 핵종과 결합할 수 있는 리간드로는, 킬레이트제, 예를 들면 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 데페록사민, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA), 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌디아민디아세트산, 트리에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA), 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA), 디피리 드헥실디포스페이트(DPDP), TPPS4, 에틸렌비스하이드록시페닐글리신(EHPG), 헥사메틸렌디아민테트라아세트산, 디메틸포스피노메탄(DMPE), 메틸렌디인산, 디메르캅토 숙신산(DMPA) 및 이들의 유도체 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일실시예에서, IgG 결합 펩타이드는 방사성 금속 핵종이 결합하고 있다. 방사성 금속 핵종의 예로서, 111In(인듐), 89Zr(지르코늄), 67/68Ga(갈륨), 99mTc(테크네튬) 64Cu(구리), 바람직하게는 111In 및 89Zr을 들 수 있다. IgG 결합 펩타이드에 결합시키는 방사성 금속 핵종은, IgG 결합 펩타이드, 및 후술하는 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체의 용도에 따라 선택할 수 있다. 예를 들면, 암의 검출·진단에는 111In, 89Zr, 64Cu, 67/68Ga 및 99mTc을 사용할 수 있으며, 예를 들면 PET(Positron Emission Tomography)는 89Zr 및 64Cu을, SPECT(Single Photon Emission Computed Tomography)에는 111In및 99mTc을 사용할 수 있다.
방사성 금속 핵종은 IgG 결합 펩타이드에 직접 결합하고 있어도 좋으나, 바람직하게는, 상기 킬레이트제 등의 리간드를 통해 IgG 결합 펩타이드에 결합하고 있다. 방사성 금속 핵종과 리간드의 바람직한 조합은 당업자라면 적당히 선택할 수 있고(예를 들면, 사쿠라이 히로시와 요코야마 아키라 편집, 방사 화학 개론을 참조하기 바람) 그 예로, 111In 및 DTPA; 89Zr와 데페록사민; 64Cu과 DOTA 또는 NOTA; 99mTc과 디메틸포스피노메탄(DMPE), DTPA, 메틸렌인산, 디메르캅토숙신산(DMPA), 디티오세미카바존, 또는 디아미노에탄디올; 67/68Ga와 데페록사민 또는 DTPA 유도체 등, 바람직하게는 111In 및 DTPA; 89Zr과 데페록사민; 및 64Cu과 DOTA 또는 NOTA, 더욱 바람직하게는 111In 및 DTPA; 및 89Zr과 데페록사민, 보다 바람직하게는 111In 및 DTPA를 들 수 있다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드에 대하여, 이하에 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 사용하는 「IgG」는, 포유 동물, 예를 들면 인간과 침팬지 같은 영장류, 쥐(rat), 마우스 및 토끼 등의 실험 동물, 돼지, 소, 말, 양, 산양 등의 가축 동물, 및 개 및 고양이 등의 애완 동물의 IgG, 바람직하게는 인간의 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)을 가리키는 것으로 한다. 본 명세서에서 IgG는 보다 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4, 또는 토끼 IgG이며, 특히 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4이다.
일양태에서, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드는, 하기의 식 I:
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(식에서, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고;
C는 시스테인 잔기이며;
H는 히스티딘 잔기이고;
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린산, 또는 디아미노 프로피온산이며;
G는 글리신 잔기이고;
Xaa2는 글루탐산 잔기, 글루타민 잔기 또는 아스파라긴 잔기이며;
L은 류신 잔기이고;
V는 발린 잔기이며; 및
W는 트립토판 잔기이다)
에 의해 나타내지는 13 ~ 17 아미노산 잔기로부터 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG와 결합 가능하다.
상기 식에서, N 말단 또는 C 말단의 X1-3라는 표기는, 시스테인(C 또는 Cys) 이외의 독립적으로 임의의 아미노산 잔기 X가 1 ~ 3개 연속하고 있는 것을 의미하며, 그것을 구성하는 아미노산 잔기는 동일 또는 상이한 잔기이나, 바람직하게는 3개 모두 동일한 잔기가 아닌 배열로부터 된다. 마찬가지로, X2도 시스테인(C 또는 Cys) 이외의 독립적으로 임의의 아미노산 잔기 X가 2 개 연속하고 있는 것을 의미하며, 그것을 구성하는 아미노산 잔기는 동일 또는 상이한 잔기이나, 바람직하게는 상기 2개의 연속된 아미노산 잔기는 동일한 잔기가 아닌 배열로부터 된다.
식 I의 2 개의 시스테인 잔기는 디설파이드(disulfide) 결합하여 환상 펩타이드를 형성할 수 있다. 통상, 식(I)의 펩타이드에서, (Xaa1이 시스테인 잔기인 경우, Xaa1은 아님) 외측의 2개의 시스테인 잔기는 디설파이드 결합하고 있다. 또는 식 (I)의 펩타이드에서, 외측의 2개의 시스테인 잔기 중의 설파이드기는 이하의 식:
[화학식 1]
Figure pat00001
로 표시되는 링커에 의해 연결되어 있어도 좋다. 상기 식에서 점선 부분은 설파이드기와의 결합 부분을 의미한다. 해당 링커는, 통상의 디설파이드 결합보다도, 환원 반응 등에 대하여 안정하다. 따라서 해당 링커, 예를 들면, 지르코늄 등의 디설파이드 결합을 불안정화 시킬 수 있는 방사성 금속 핵종을 이용하는 경우에 바람직하게 사용될 수 있다.
이의 펩타이드는, 예를 들면 이하의 방법 :
시스테인 잔기를 2개 이상, 바람직하게는 2개 포함하는 펩타이드와, 이하의 식:
[화학식 2]
Figure pat00002
로 표시되는 화합물(식 중, R1 및 R2는, 각각 독립적으로 임의의 할로겐 원자이다)를 혼합하여, 2개 이상, 바람직하게는 2개의 시스테인 잔기 중 설파이드기가 이하의 식 :
[화학식 3]
Figure pat00003
로 표시되는 링커에 의해 연결된 펩타이드를 얻는 공정을 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 상기 식에서의 점선 부분은, 설파이드 기와의 결합 부분을 의미한다.
상기 화합물에서, R1 및 R2는, 바람직하게는 F, Cl, Br 및 I, 보다 바람직하게는 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된다. R1 및 R2는 바람직하게는 동일하며, 보다 바람직하게는 R1 및 R2는 모두 Cl이다.
본 방법에서의 혼합 공정의 조건은, 펩타이드의 시스테인 잔기 사이에 연결 반응이 생기는 조건이라면 특히 한정하지 않는다. 예를 들면, 펩타이드와 상기 화합물을 적절한 버퍼, 예를 들면, 염화 구아닌디움(Guanidinium chloride)을 포함하는 완충액 중에서, 실온(예를 들면, 약 15℃ ~ 30℃)에서 혼합하는 것에 반응을 수행할 수 있다. 상기 혼합 공정은 필요에 따라 연결 반응을 촉진하는 촉매를 적당량 더해 수행해도 좋다.
본 방법의 혼합 공정에서 펩타이드와 화합물의 혼합 비율은, 특히 한정하지 않는다. 펩타이드와 화합물의 몰 비율은, 예를 들면 1 : 0.2 ~ 1 : 10, 바람직하게는 1 : 0.5 ~ 1 : 5 또는 1 : 1 ~ 1 : 2로 할 수 있다.
상기 혼합 공정에서 혼합 시간(반응 시간)은 펩타이드의 시스테인 잔기 사이에 연결 반응이 생기는 만큼 한정하는 것은 아니나, 예를 들면, 1분 ~ 5시간, 바람직하게는 10분 ~ 2시간 또는 15분 ~ 1시간으로 할 수 있다.
본 방법은, 필요에 따라, 상기 공정을 수행 한 후의 혼합물로부터, 불순물, 예를 들면, 미반응의 펩타이드 및 화합물 등을 분리하여, 시스테인 잔기가 결합된 펩타이드를 정제하는 공정을 더 포함할 수 있다. 상기 공정은 본 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토 그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC 등의 크로마토그래피 등으로 할 수 있다.
식 I의 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서 아미노산 잔기 X를 더 특정한 식 I' 및 식 I''로 표시되는 펩타이드는 이하에 나타낸다.
즉, 식 I'로 표시되는 펩타이드는,
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3) (I')
(식에서, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고;
C는 시스테인 잔기이며;
Y는 티로신 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이며;
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린산, 또는 디아미노 프로피온산이고;
G는 글리신 잔기이며;
N은 아스파라긴 잔기이고,
L은 류신 잔기이며;
V는 발린 잔기이고; 및
W는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 나타내지는 13 ~ 17 아미노산 잔기로부터된 아미노산 서열을 포함한다.
식 I''로 표시되는 펩타이드는,
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (I'')
(식에서, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고;
C는 시스테인 잔기이며,
A는 알라닌 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이고,
G는 글리신 잔기이며,
E는 글루탐산 잔기이고,
L은 류신 잔기이며,
V는 발린 잔기이며, 한편
W는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 나타내지는 13 ~ 17 아미노산 잔기로부터된 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 식 I의 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서 아미노산 잔기 X를 더 특정한 식 II로 표시되는 펩타이드를 이하에 나타낸다.
즉, 식 II로 표시되는 펩타이드는,
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(식에서, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고;
C는 시스테인 잔기이며;
H는 히스티딘 잔기이고;
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린산, 또는 디아미노 프로피온산이며;
G는 글리신 잔기이고;
Xaa2는 글루탐산 잔기, 글루타민 잔기 또는 아스파라긴 잔기이며,
L은 류신 잔기이고;
V는 발린 잔기이며;
W는 트립토판 잔기이고;
Xaa3은 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이며; 및
Xaa4은 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 나타내지는 13 ~ 17 아미노산 잔기로부터 이루어진 아미노산 서열을 포함한다.
상기의 식 I', 식 I' 및 식 II의 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서, 17 아미노산 잔기로 한 경우의, N 말단으로부터 1번째와 2번째 및 16번째와 17번째 아미노산 잔기 X는 결실하여 있어도 좋고, 그런 펩타이드는 13 아미노산 길이로부터 된다.
본 명세서에서 사용하는 「17 아미노산 잔기로 한 경우」라 함은, 펩타이드의 아미노산 잔기를 아미노산 번호로 부를 경우, 식 I의 펩타이드에 대해서 최장의 아미노산 길이인 17 잔기의 N 말단으로부터 순서대로 1 번째에서 17 번째까지 번호를 부여하기 위해 편의적으로 표현한 용어이다.
또한, 식 I의 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서 아미노산 잔기 X를 더 특정한 식 III로 표시되는 펩타이드를 이하에 나타낸다.
즉, 식 III로 표시되는 펩타이드는,
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(식에서, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고;
C는 시스테인 잔기이며;
A는 알라닌 잔기이고;
Y는 티로신 잔기이며;
H는 히스티딘 잔기이고;
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린산, 또는 디아미노 프로피온산이며;
G는 글리신 잔기이고;
Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 글루타민 잔기이며;
L은 류신 잔기이고;
V는 발린 잔기이며; 및
W는 트립토판 잔기이다)
에 의해 나타내지는 13 ~ 17 아미노산 잔기로부터 이루어진 아미노산 서열을 포함한다.
상기의 식 III의 펩타이드의 아미노산 서열에서 17 아미노산 잔기로 한 경우의 N 말단으로부터 1번째와 2번째 및 16번째와 17번째 아미노산 잔기 X는 결실하여 있어도 좋고, 그런 펩타이드는 13 아미노산 길이로부터 되어 있다.
또한, 상기의 각 식의 펩타이드의 아미노산 서열의 시스테인(C) 이외의 아미노산 잔기, 즉, 17 아미노산 잔기로 한 경우의 N 말단으로부터 1 ~ 3, 5, 6, 15 ~ 17번째 각 아미노산 잔기는, 이하의 것으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 여기에서, 각 대문자의 알파벳은, 아미노산의 첫문자 표기이다 :
1 번째 아미노산 잔기 = S, G, F, R 또는, 없음;
2 번째 아미노산 잔기 = D, G, A, S, P, 호모시스테인, 또는, 없음;
3 번째 아미노산 잔기 = S, D, T, N, E 또는 R;
15 번째 아미노산 잔기 = S, T 또는 D;
16 번째 아미노산 잔기 = H, G, Y, T, N, D, F, 호모시스테인, 또는 없음;
17 번째 아미노산 잔기 = Y, F, H, M 또는, 없음;
5 번째 아미노산 잔기 = A 또는 T,
6 번째 아미노산 잔기 = Y 또는 W.
또한, 식 I의 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서 아미노산 잔기 X를 더 특정한 식 IV로 표시되는 펩타이드를 이하에 나타낸다.
즉, 식 IV로 표시되는 펩타이드는,
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(식에서,
D는 아스파르트산 잔기이고;
C는 시스테인 잔기이며;
H는 히스티딘 잔기이고;
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트 산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린 산, 또는 디아 미노 프로피온산이며;
G는 글리신 잔기이고;
Xaa2는 글루탐산 잔기, 글루타민 잔기 또는 아스파라긴 잔기이며;
L은 류신 잔기이고;
V는 발린 잔기이며;
W는 트립토판 잔기이고;
T는 트레오닌 잔기이며;
Xaa3은 알라닌 잔기 또는 트레오닌 잔기이고; 및
Xaa4은 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기이다.)에 의해 나타내지는, 13 아미노산 잔기로부터 이루어진 아미노산 서열을 포함한다.
식 I의 펩타이드의 구체적인 예의 몇 가지를 이하의 1) ~ 18)에 열거하나, 이에 한정되지 않음은 물론이다:
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT (서열 번호 1),
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열 번호 2),
3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS (서열 번호 3),
4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH (서열 번호 4),
5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열 번호 5),
6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열 번호 6),
7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열 번호 7),
8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH (서열 번호 8),
9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH (서열 번호 9),
10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY (서열 번호 10),
11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY (서열 번호 11),
12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY (서열 번호 12),
13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH (서열 번호 13),
14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H (서열 번호 36),
15) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT (서열 번호 14),
16) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT (서열 번호 15),
17) DCTYH(Xaa1)GELVWCT (서열 번호 16) 및
18) DCAWH(Xaa1)GELVWCT (서열 번호 17)
(식에서, Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이며, Xaa2는 호모시스테인이고, 바람직하게는 호모시스테인끼리는 서로 디설파이드 결합을 형성하고 있다).
식 I의 펩타이드의 바람직한 구체적인 예로서,
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT (서열 번호 1),
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열 번호 2),
13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH (서열 번호 13) 및
14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H (서열 번호 36)를 들 수 있으며,
특히, 바람직한 예로는, 2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열 번호 2)를 들 수 있다(식에서, Xaa1은 리신 잔기이고, Xaa2는 호모시스테인이며, 바람직하게는 시스테인끼리 및/또는 호모시스테인끼리는 서로 디설파이드 결합을 형성하고 있다).
또한, 일양태에 있어서, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드는, 광의의 1차 구조로서, 하기의 식 V:
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(식 중,
D는 아스파르트산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이며,
G는 글리신 잔기이고,
L은 류신 잔기이며,
W는 트립토판 잔기이고,
T는 트레오닌 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이고,
Xaa2는 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이며,
Xaa3은 트립토판 잔기 또는 티로신 잔기이고,
Xaa4는 히스티딘 잔기, 아르기닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이며,
Xaa5는 글루탐산 잔기, 글루타민 잔기, 아스파라긴 잔기, 아르기닌 잔기 또는 아스파르트산 잔기이며, 및
Xaa6은 이소류신 잔기 또는 발린 잔기이다)에 의해 표시되는, 13 아미노산 잔기로부터 된 아미노산 서열을 포함한다.
식 V의 2 개의 시스테인 잔기는 디설파이드 결합하여 환상 펩타이드를 형성 할 수 있다. 통상, 식 V 펩타이드(Xaa1이 시스테인 잔기인 경우, Xaa1은 아님) 외측 2개의 시스테인 잔기는 디설파이드 결합하고 있다. 또는 식 V의 펩타이드에 있어서 외측 2개의 시스테인 잔기 중 설파이드 기는, 이하의 식:
[화학식 4]
Figure pat00004
로 표시되는 링커에 의해 연결되어 있어도 좋다. 상기 식에서 점선 부분은 설파이드기와의 결합 부분을 의미한다. 해당 링커는, 통상의 설파이드 결합보다도, 환원 반응 등에 대하여 안정하다. 따라서, 해당 링커는, 예를 들면 지르코늄 등의 디설파이드 결합을 불안정화시킬 수 있는 방사성 금속 핵종을 이용하는 경우에 바람직하게 사용된다. 이 펩타이드는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조 할 수 있다.
식 V의 펩타이드의 구체적인 예의 일부를 이하의 18) ~ 29)에 열거하나, 이에 한정되지 않음은 물론이다:
18) DCTYT(Xaa1)GNLVWCT (서열 번호 18),
19) DCAYT(Xaa1)GNLVWCT (서열 번호 19),
20) DCSYT(Xaa1)GNLVWCT (서열 번호 20),
21) DCTWT(Xaa1)GNLVWCT (서열 번호 21),
22) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT (서열 번호 22),
23) DCTYR(Xaa1)GNLVWCT (서열 번호 23),
24) DCTYS(Xaa1)GNLVWCT (서열 번호 24),
25) DCTYT(Xaa1)GNLVWCT (서열 번호 25),
26) DCTYT(Xaa1)GELVWCT (서열 번호 26),
27) DCTYT(Xaa1)GRLVWCT (서열 번호 27),
28) DCTYT(Xaa1)GDLVWCT (서열 번호 28) 및
29) DCTYT(Xaa1)GNLIWCT (서열 번호 29).
(식에서, Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이다).
상술한 바와 같이, 본 발명에 관한 상기 식의 펩타이드는, 각 아미노산 서열의 중간에 이간한 적어도 2개의 시스테인(C) 잔기를 가지며, 상기 시스테인 잔기 사이에서 디설파이드 결합을 형성할 수 있도록 시스테인 잔기가 배치되어 있는 것을 특징으로 하고 있으며, 바람직한 펩타이드는, 2개의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합하여 환상 펩타이드를 형성하고, 각 시스테인 잔기의 N 말단 측 및 C 말단측에 1 또는 2개의 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기를 가지고 있어도 좋다. 각 시스테인 잔기의 N 말단측 및 C 말단측에는 1 또는 2개의 아미노산 잔기를 가지는 경우에 있어서, 17 아미노산 잔기로 한 경우의 N 말단으로부터 1 ~ 2, 16 ~ 17 번째의 각 아미노산 잔기는, 상기 예시의 것이다.
상기와 같이, 본 발명의 펩타이드에서 Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 및 글루탐산 잔기 등의 단백질 구성 아미노산, 및 디아미노 프로피온산 및 2- 아미노스베린산 등의 비단백질 구성 아미노산, 바람직하게는 리신 잔기이다. Xaa1은, 후술하는 가교제에 의해 수식 가능한 것이 바람직하다. 본 명세서에서 「비단백질 구성 아미노산」은, 생체에서 단백질을 구성하는데 사용되지 않는 아미노산을 가르킨다. 본 발명의 펩타이드를 가교제에 의해 수식할 경우의 부위 특이성을 높이기 위해, 본 발명의 펩타이드는, 그의 서열 중에 Xaa1와 동일한 잔기를, 전혀 갖지 않거나, 거의 갖지 않는(예를 들면, 1개 또는 2개 밖에 갖지 않음) 것이 바람직하다. 예를 들면, Xaa1이 리신 잔기인 경우에는, 본 발명의 펩타이드는, 이의 서열 중에 Xaa1 이외의 장소에 리신 잔기를 전혀 갖지 않거나, 거의 갖지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 펩타이드는 인간 IgG와의 결합 친화성이, 다른 인간 면역 글로불린(IgA, IgE, IgM)과 비교하여 약 10배 이상, 바람직하게는 약 50배 이상, 보다 바람직하게는 약 200배 이상 높다. 본 발명의 펩타이드와 인간 IgG와의 결합에 대한 해리 정수(Kd)는, 표면 플라즈몬 공명 스펙트럼 분석(예를 들면 BIACORE 시스템 사용)에 의해 결정 가능하고, 예를 들면, 1 × 10-1M ~ 1 × 10-3M 미만, 바람직 1 × 10-4M 이하, 보다 바람직하게는 1 × 10-5M 미만이다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드는, IgG의 Fc 도메인에 결합한다. 본 발명의 IgG 결합 펩타이드는, 후술하는 실시예에서 알 수 있듯이, 상기 Xaa1에서, IgG Fc의 특정 영역, 즉, 인간 IgG Fc의 Eu numbering에 따라 Lys248 잔기(이하, 본 명세서에서는 간단히 「Lys248」로도 표기하고, 인간 IgG CH2(서열 번호 30)의 18번째 잔기에 해당한다) 또는 Lys246 잔기(이하, 본 명세서에서는 간단히 「Lys246」로도 표기하며, 인간 IgG CH2(서열 번호 30)의 16 번째 잔기에 해당한다), 바람직하게는 Lys248 근접한다.
본 발명의 펩타이드는, 관용의 액상 합성법, 고상 합성법 등의 펩타이드 합성법, 자동 펩타이드 합성기에 의한 펩타이드 합성 등 (Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, JK eds., Plenum Press NY (1990) Vol.12, p.1-19; Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) WH Freeman Co .; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82 : p.5132; 「새로운 생화학 실험 강좌 1 단백질 IV」(1992) 일본 생화학 회편, 도쿄 화학 동인)에 의해 제조할 수 있다. 또는, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산을 이용한 유전자 재조합법이나 파지 디스플레이법 등에 의해 펩타이드를 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 발현 벡터 중에 재조합하여, 숙주 세포 중에 도입하여 배양함으로써, 목적의 펩타이드를 제조할 수 있다. 제조 된 펩타이드는, 통상적인 방법에 의해, 예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, HPLC 등의 크로마토그래피, 황산 암모늄 분획법, 한외 여과 및 면역 흡착법 등에 의해 회수 또는 정제할 수 있다.
펩타이드 합성은, 예를 들면, 각 아미노산(천연인지 비천연인지를 불문한다)의 결합하려고하는 α- 아미노기와 α- 카르복실기 이외의 관능기를 보호하는 아미노산류를 준비하고, 각각의 아미노산의 α- 아미노기와 α- 카르복실기 사이에 펩타이드 결합 형성 반응을 수행한다. 일반적으로, 펩타이드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기의 카르복실기를 적당한 스페이서 또는 링커를 통해 고상에 결합해 둔다. 이렇게 얻어진 디펩타이드의 아미노 말단의 보호기를 선택적으로 제거하고, 다음의 아미노산의 α- 카르복실기 사이의 펩타이드 결합을 형성한다. 이러한 작업을 연속하여 수행한 측 기가 보호된 펩타이드를 제조하고, 마지막으로, 모든 보호기를 제거하고 고상 분리한다. 보호기의 종류와 보호 방법, 펩타이드 결합 방법의 자세한 내용은 상기의 문헌에 자세히 설명되어 있다.
유전자 재조합에 의한 제조는, 예를 들면, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 DNA를 적당한 발현 벡터 중에 삽입하여, 적당한 숙주 세포에 벡터를 도입하고, 세포를 배양하여, 세포 내로부터 또는 세포 외액으로부터 목적의 펩타이드를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해 이루어질 수 있다. 벡터는, 한정되지 않으나, 예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 파스미드 및 바이러스 등의 벡터이다. 플라스미드 벡터로는 한정하는 것은 아니나, 대장균 유래의 플라스미드(예를 들면, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript 등), 고초균 유래의 플라스미드(예를 들면, pUB110, pTP5 등) 및 효모 유래 플라스미드 (예를 들면, YEp13, YCp50 등) 등을 들 수 있다. 파지 벡터로는 한정하는 것은 아니나, T7 파지 디스플레이 벡터(T7Select10-3b, T7Select1-1b, T7Select1-2a, T7Select1-2b, T7Select1-2c 등 (Novagen)) 및 λ파지 벡터(Charon4A, Charon21A , EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP, λZAPII 등)을 들 수 있다. 바이러스 벡터로는 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 수반 바이러스, 박시니아 바이러스 및 센다이 바이러스 등의 동물 바이러스, 및 바큘로 바이러스 등의 곤충 바이러스 등을 들 수 있다. 코스미드 벡터로는 한정하는 것은 아니나, Lorist 6 Charomid9-20 및 Charomid9-42 등을 들 수 있다. 파스미드 벡터로는 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 pSKAN, pBluescript, pBK 및 pComb3H 등이 알려져 있다. 벡터는 목적의 DNA가 발현 가능하도록 조절 서열과, 목적 DNA를 포함하는 벡터를 선별하기 위한 선택 마커, 목적 DNA를 삽입하는 멀티 클로닝 사이트 등이 포함되어 있다. 그러한 조절 서열에는, 프로모터, 인핸서, 터미네이터, S-D 배열 또는 리보좀 결합 부위, 복제 개시점 및 폴리 A 사이트 등이 포함된다. 또한, 선택 마커에는, 예를 들면 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자 및 디히드로 엽산 환원 효소 유전자 등이 사용될 수 있다. 벡터를 도입하는 숙주 세포는, 대장균이나 고초균 등의 세균, 효모 세포, 곤충 세포, 동물 세포(예를 들면, 포유 동물 세포) 및 식물 세포 등이며, 이러한 세포에의 형질 전환 또는 트랜스펙션, 예를 들면, 인산 칼슘법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 유전자총(particle gun)법 및 PEG법 등을 포함한다. 형질 전환 세포의 배양은, 숙주 생물의 배양에 사용될 수 있는 통상의 방법에 따라 수행된다. 예를 들면, 대장균이나 효모 세포 등의 미생물의 배양액은 숙주 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원 및 무기 염류 등을 함유한다. 본 발명의 펩타이드의 회수를 용이하게하기 위해, 발현에 의해 생성된 펩타이드를 세포 밖으로 분비시키는 것이 바람직하다. 이것은 그의 세포에서 펩타이드의 분비를 가능하게 하는 단백질 서열을 코딩하는 DNA를, 목적의 펩타이드를 코딩하는 DNA의 5' 말단측에 결합하는 것에 의해 수행할 수 있다. 세포막에 이행한 융합 펩타이드가 시그널 펩티다아제에 의해 절단되어, 목적의 펩타이드가 배지에 분비 방출된다. 또는, 세포 내에 축적된 목적 펩타이드를 회수 할 수 있다. 이 경우, 세포를 물리적 또는 화학적으로 파괴하고, 단백질 정제 기술을 사용하여 목적의 펩타이드를 회수한다.
따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 여기서, 핵산은 DNA 또는 RNA(예를 들면, mRNA)를 포함한다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 다른 단백질을 융합시키는 경우, IgG 결합 펩타이드와 다른 단백질을 별도로 제조한 후, 필요에 따라 링커를 사용하여 IgG 결합 펩타이드와 단백질을 융합시켜도 좋고, 유전자 재조합법에 의해 필요에 따라 적당한 링커를 첨가하여 융합 단백질로 제조할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드가 IgG와의 연결성을 해치지 않도록 융합 단백질을 제조하는 것이 바람직하다.
<가교제로 수식된 펩타이드>
일양태에서, 본 발명의 상기 IgG 결합 펩타이드는 가교제에 의해 수식되는 것이 바람직하다.
상기와 같이, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드는, 후술하는 실시예에서 알 수 있듯이, 상기 Xaa1에서 IgG Fc의 특정 영역, 즉 인간 IgG Fc의 Eu numbering에 따라 Lys248 또는 Lys246, 바람직하게는 Lys248와 근접하다. 따라서, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드의 Xaa1을 가교제로 한정하고, IgG와 가교 반응시킴으로써, IgG 결합 펩타이드의 Xaa1와 IgG Fc의 Lys248 또는 Lys246, 바람직하게는 Lys248 사이의 부위 특이적으로 가교 구조를 형성시킬 수 있다. 상기와 같이, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드의 Xaa1을 가교제 및 다양한 화합물로 수식하여, IgG와 가교 반응시킴으로써, 여러 가지 화합물을, 특이적이고 간편하게 IgG에 도입할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, IgG 결합 펩타이드를 통해 화합물을 도입할 수 있기 때문에 다양한 구조의 화합물을 IgG에 도입할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 얻어지는 산물의 수율이 높고, 또한, 항체 자체 변경을 수반하지 않기 때문에, 항체의 기능을 저하시킬 가능성이 낮다는 장점도 있다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드는, 인간 이외의 동물, 바람직하게는 포유 동물의 IgG에 사용할 수도 있다. 이 경우, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드가 결합하는 IgG 중인 부위는, 본 명세서를 읽은 당업자라면, 예를 들면, 인간 IgG의 배열과 다른 동물의 IgG의 배열을 얼라이먼트하는 것에 의해, 용이하게 특정할 수 있다.
본 발명에서 「가교제」로는, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와, IgG Fc를 공유 결합에 의해 연결시키기 위한 화학 물질이다. 본 발명의 가교제는, 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하며, 소망의 아미노산(예를 들면, 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2- 아미노스베린산, 또는 디아미노 프로피온산 및 아르기닌 등)과 결합 가능한 부위를 적어도 2개 가지는 화합물로 할 수 있다. 그 예로서, 한정하는 것은 아니나, DSG(disuccinimidyl glutarate, 디숙신이미딜 글루타레이트), (DSS disuccinimidyl suberate, 디숙신이미딜 수버레이트) 등의 숙신이미딜기를 바람직하게는 2 이상 포함하는 가교제, DMA(dimethyl adipimidate·2HCl, 아디프이미드산 디메틸이염산염), DMP(dimethyl pimelimidate·2HCl, 피멜리미드산 디메틸이염산염) 및 DMS(dimethyl suberimidate·2HCl, 수버리미드산 디메틸이염산염) 등의 이미드산 부분을 바람직하게는 2 이상 포함하는 가교제, 및 DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl, 3,3'-디티오비스프로피온아미드산 디메틸이염산염) 및 DSP(dithiobis(succinimidyl propionate), 디티오비스숙신이미딜 프로피온산) 등의 SS 결합을 가지는 가교제를 들 수 있다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드는, 다른 기능성 물질, 예를 들면, IgA 또는 VHH 등의 항체, 표지 물질 및/또는 다른 약물에 의해 수식되어 있어도 좋다. IgG 결합 펩타이드 및 기타 기능성 물질의 결합은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면, 아지드기와 디벤조사이클로옥틴(dibenzocyclooctyne)과의 반응, 또는 말레이미드 기와 설프히드릴기의 반응 등에 의해 수행할 수 있다. 표지 물질에 의해 표지되는 경우, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드가 IgG와 복합체를 형성함으로써, 상기 표지 물질을 통해 IgG의 검출 또는 정량을 수행하는 것이 가능하게 된다. 표지 물질은 한정되지 않으나, 예를 들면, 상기의 방사성 동위 원소 금속 핵종, 형광 색소, 화학 발광 색소, 및 비오틴 및 GFP (녹색 형광 단백질) 등의 형광 단백질, 발광 단백질, 및 퍼옥시다아제 등의 효소를 포함하고, 바람직한 표지 물질의 예는, 플루오레세 인 및 FITC 등의 플루오레세인 유도체, 로다민 및 테트라 메틸로다민 등의 로다민 유도체 및 텍사스 레드 등의 형광 색소이다 . 본 발명의 펩타이드를 다른 약제에 의해 수식하는 경우, 약제로서, 한정하는 것은 아니나, 예를 들면, 올스타틴(allstatin), 메이탄신(maytansine), 독소루비신(doxorubicin), 브레오마이신(bleomycin) 또는 이들의 유도체 등의 항암제; 및 혈액 뇌관문 상의 리셉터에 결합하여 중추 신경으로의 이행을 가능하게 하는 약제, 또는 암세포 등에 결합하여 항체의 세포 내로의 이행을 가능하게 하는 약제 등의 표적 화제를 들 수 있다.
본 발명의 가교제에 의해 수식된 IgG 결합 펩타이드는, 예를 들면 상기 <IgG 결합 펩타이드> 항목에 기재한 방법에 따라 얻어진 IgG 결합 펩타이드를 가교제와 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 이 경우, IgG 결합 펩타이드 중의 상기 Xaa1 아미노산 잔기의 측쇄를 특이적으로 수식하는 것이 필요하며, 이것은, 예를 들면, Xaa1의 종류와 가교제의 조합을 선택함으로써 이루어 질 수 있다. 예를 들면, DSS 또는 DSG 등의 숙신이미딜기를 포함하는 가교제는, 리신 잔기의 측쇄 및 폴리 펩타이드의 N 말단에 존재하는 1급 아민과 반응하기 때문에, IgG 결합 펩타이드의 N 말단을 블로킹한 후 DSS 또는 DSG와 반응시킴으로써, 리신 잔기의 측쇄만을 DSS 또는 DSG로 특이적으로 수식할 수 있다. 이러한 아미노산 잔기와 가교제의 조합은, 당업자라면 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 가교제에 의해 수식이 된 IgG 결합 펩타이드는, 예를 들면, 가교제에 의해 수식된 아미노산 잔기를 이용하여 펩타이드 합성함으로써 제조할 수 있다. 마찬가지로, IgG 결합 펩타이드를 표지 물질 및/또는 다른 약제로 수식하는 경우에는, 이러한 수식을 추가한 아미노산 잔기를 이용하여 펩타이드 합성하는 것에 의해 표지 물질 및/또는 다른 약제로 수식한 IgG 결합 펩타이드를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드는, 그 안정성의 향상 등을 위하여, 예를 들면, N 말단의 PEG화(폴리에틸렌 글리콜 부가) 및 C 말단 아미드화 등에 의해 수식되어 있어도 좋다. PEG화를 할 경우의 PEG의 분자 수는 특히 한정되지 않으나, 예를 들면, 1~50분자, 1~20분자, 2~10분자, 2~6분자, 또는 4 자의 PEG를 부가할 수 있다.
<가교 반응>
일양태에서, 본 발명은, 본 발명의 가교제로 수식되어 있는 IgG 결합 펩타이드와 IgG를 혼합하는 공정을 포함하는, IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 공정에 의해, 가교제로 수식되어 있는 IgG 결합 펩타이드와 IgG 사이에서 가교 반응이 발생할 수 있다. 가교 반응은, 특히 IgG 결합 펩타이드의 상기 Xaa1 아미노산 잔기와 IgG Fc의 Lys248 또는 Lys246, 바람직하게ㄴ는 Lys248 사이의 부위 특이적으로 발생할 수 있다.
상기 혼합 공정의 조건은, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG 사이에서 가교 반응이 생기는 조건으로 수행하는 것이면 특히 한정하지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG를, 적당한 버퍼 중에서, 실온(예를 들면 약 15℃ ~ 30℃)에서 혼합하는 것에 의해 반응할 수 있다. 해당 혼합 공정은, 필요에 따라 가교 반응을 촉진하는 촉매를 적당량 더해 수행하여도 좋다.
상기 혼합 공정에 있어서, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 혼합 비율은, 특히 한정하지 않는다. 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 몰 비율은, 예를 들면 1 : 1 ~ 20 : 1, 바람직하게는 2 : 1 ~ 20 : 1 또는 5 : 1 ~ 10 : 1로 할 수 있다.
상기 혼합 공정에 있어서 혼합 시간(반응 시간)은, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG 사이에서 가교 반응이 생기는 만큼 한정하는 것은 아니나, 예를 들면, 1 분 ~ 5 시간, 바람직하게는 10 분 ~ 2 시간 또는 15 분 ~ 1 시간으로 할 수 있다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체를 생산하는 방법은, 필요에 따라 상기 공정을 수행한 후 혼합물로부터, 불순물, 예를 들면, 미반응의 IgG 결합 펩타이드, IgG 및 시약 등을 분리하여, 해당 복합체를 정제하는 공정을 더 포함할 수 있다. 상기 공정은, 본 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC 등의 크로마토그래피 등으로 할 수 있다.
<복합체>
한 구체 예에서, 본 발명은 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG와의 복합체에 관한 것이다. 상기 복합체는, 상기 가교 반응에 의해 형성될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 바람직하게는 IgG 결합 펩타이드의 상기 Xaa1 아미노산 잔기와 IgG Fc의 Lys248 또는 Lys246, 바람직하게는 Lys248이 부위 특이적으로 가교제를 통해 결합 된 IgG 결합 펩타이드와 IgG와의 복합체에 관한 것이다.
본 발명의 복합체는, 부위 특이적인 가교 반응에 의해 형성되는 것으로부터, 상기 가교 반응이, IgG의 활성에 부정적인 영향을 미칠 가능성이 적다. 또한, 수식한 IgG 결합 펩타이드를 IgG에 연결하는 것에 의해 IgG에 새로운 기능을 추가할 수 있다. 예를 들면, 111In, 89Zr, 64Cu, 67/68Ga 및 99mTc 등의 방사성 금속 핵종을 추가 한 IgG 결합 펩타이드를 연결시킨 IgG는, 암의 검출·진단에 이용할 수 있다. 이 경우 IgG는 암종에 따라 적절하게 선택할 수 있으며, 예를 들면, 유방암이면 트라스트주맙(Trastuzumab), 대장암이면 세툭시맙(Cetuximab)을 사용할 수 있다.
<핵의학 영상 진단제 또는 암의 진단제, 및 핵의학 영상 진단법 또는 암의 발병 유무를 결정하는 방법>
일양태에서, 본 발명은 방사성 금속 핵종이 결합되어 있는 상기 IgG 결합 펩타이드, 상기 가교제로 수식된 IgG 결합 펩타이드, 또는 상기 가교제로 수식된 IgG 결합 펩타이드와 IgG와의 복합체를 포함하는, 핵의학 영상 진단제 또는 암 진단제에 관한 것이다.
본 발명의 핵 의학 영상 진단제는 생체 내에서 다양한 물질의 분포 및/또는 체내 동태를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체를 포함하는 핵 의학 영상 진단제는, IgG의 표적이 되는 염증 마커 등의 항원의 분포 상황, 및 IgG 항체 자체의 체내 동태를 측정하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 암의 진단제의 대상이 되는 암으로서, 한정하는 것은 아니나, 예를 들면, 유방암, 간암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 대장암, 예를 들면, 결장암, 위암, 자궁 경부암, 뇌종양, 골수종, 골육종, 폐암, 백혈병과 악성 림프종 등을 들 수 있다.
본 발명의 핵 의학 영상 진단제 또는 암 진단제는, 경구 투여 또는 비경구 투여(예를 들면, 정맥 주사, 근육 주사, 피하 주사, 복강 내 투여, 직장 투여 또는 경점막 투여 등)로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵 의학 영상 진단제 또는 암 진단제는, 투여 경로에 따라 적당한 제형으로 할 수 있다. 구체적으로는 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 시럽제, 유제, 현탁제, 정맥 주사, 동맥 주사, 또는 근육 주사용 주사제, 점적제, 외용제 또는 좌제 등의 각종 제제 형태로 제조할 수 있다. 투여 방법 및 제형은 환자의 성별, 연령, 체중, 증상 등에 따라 당업자라면 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 핵 의학 영상 진단제 또는 암 진단제는 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있고(예를 들면, Remington 's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, 미국을 참조하기 바람), 의약적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 함께 포함하는 것이라도 좋다.
본 발명의 핵 의학 영상 진단제 또는 암 진단제에 포함될 수 있는 담체 및 의약 첨가제의 예로는, 물, 의약적으로 허용되는 유기 용제, 콜라겐, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 카르복시비닐 폴리머, 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시 메틸스타치 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 잔탄 검, 아라비아 고무, 카제인, 한천, 폴리에틸렌 글리콜, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 바셀린, 파라핀 , 스테아릴 알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토스 및 의약 첨가물로 허용되는 계면 활성제 등을 들 수 있다.
실제의 첨가제는, 본 발명의 핵 의학 영상 진단제 또는 암 진단제의 제형에 따라 상기 중에서 단독으로 또는 적절히 조합하여 선택하면 되나, 이에 한정하는 것은 아니다. 예를 들면, 주사용 제제로 사용하는 경우, 본 발명의 IgG 결합 단백질 또는 IgG 결합 단백질과 IgG의 복합체 용액, 예를 들면, 생리 식염수, 완충 용액, 포도당 용액 등에 용해하여, 이에 용기 흡착 방지제, 예를 들면 Tween 80, Tween 20, 젤라틴, 인간 혈청 알부민 등을 더한 것을 사용할 수 있다. 또는 사용 전에 용해하여 재구성하는 제형으로 하는 동결 건조된 것으로서도 좋고, 동결 건조를 위한 안정화제로는, 예를 들면, 만니톨, 포도당 등의 당알콜 및/또는 당류를 사용할 수 있다.
본 발명의 핵 의학 영상 진단제 또는 암 진단제의 유효 투여량 및 투여 간격은 환자의 성별, 연령, 체중 및 증상 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
일양태에서, 본 발명은 피험체의 암의 발병 유무를 결정하는 방법으로서,
피험체로부터 얻어진 시료에 본 명세서에 기재된 IgG 결합 펩타이드 또는 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체를 반응시키는 공정으로서, 방사성 금속 핵종이, 상기 IgG 결합 펩타이드에 결합하고 있는 공정;
시료의 방사성 금속 핵종에 유래 방사능의 수준 또는 존재를 측정하는 공정; 및
방사능의 수준 또는 존재에 따라, 피험체의 암의 우환의 유무를 결정하는 공정;
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일양태에서, 본 발명은 피험체의 항원 또는 IgG를 검출하는 방법으로서,
피험체로부터 얻어진 시료에, 본 명세서에 기재된 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체를 반응시키는 공정으로서, 방사성 금속 핵종이 상기 IgG 결합 펩타이드에 결합하는 공정;
시료 중의 방사성 금속 핵종에 유래 방사능 수준 또는 존재를 측정하는 공정; 및
방사능 수준 또는 존재에 따라 항원 또는 IgG를 검출하는 공정;
를 포함하는 방법에 관한 것으로, 시료의 항원 또는 IgG를 검출함으로써 피험체의 항원 또는 IgG의 분포 및/또는 체내 동태를 추측할 수 있다.
본 방법에서 사용하는 시료로는, 조직 및 생체 시료를 들 수 있다. 조직의 예로는, 병변 부위, 예를 들면, 유방, 간장, 췌장, 전립선, 난소, 대장, 예를 들면, 결장, 위, 자궁 경부, 골수, 림프절 등이 있다, 예를 들면, 이러한 조직의 생검 시료를 사용할 수 있다. 생체 시료의 예로는, 예를 들면, 혈액, 혈장, 림프액, 조직액, 소변, 및 세포, 예를 들면, 말초 혈액 세포, 모모 세포, 구강 세포, 비강 세포, 창자 세포, 질내 세포, 점막 세포 및 객담(폐포 세포 또는 신경 간세포 등을 포함) 등, 바람직하게는 혈액 또는 혈장을 들 수 있다.
방사능의 수준 또는 존재를 측정하는 방법은 특히 제한되지 않으나, 당업자에게 알려진 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, SPECT/CT 등의 영상 분석을 실시해도 좋고, 신틸레이션 카운터 등의 검출기를 이용하여 방사능 수준 또는 존재를 측정할 수 있다.
방사능의 수준 또는 존재에 따라, 피험체의 암의 우환 유무를 결정 또는 검출하는 공정은, 특히 한정되지 않고, 당업자에게 알려진 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 암의 우환하여 있지 않은 것을 알고 있는 피험체 유래의 복수, 예를 들면 2 이상, 3 이상, 4 이상, 바람직하게는 5개 이상의 시료에 대해, 본 발명의 방법으로 제공되는 피험체 유래 시료의 방사능 수준이 상당히 높은 경우, 피험체가 암에 우환하고 있을 가능성이 높다고 판단할 수 있다.
일양태에서, 본 발명은, 피험체 암의 우환 유무를 결정하는 방법으로서,
본 명세서에 기재된 IgG 결합 펩타이드 또는 IgG 결합 펩타이드와 IgG와의 복합체를 피험체에 투여하는 공정으로서, 방사성 금속 핵종이 상기 IgG 결합 펩타이드에 결합하는 공정;
피험체에서, 방사성 금속 핵종에 유래하는 방사능 수준 또는 존재를 측정하는 공정; 및
방사능 수준 또는 존재에 따라 피험체의 암의 우환 유무를 결정하는 공정;
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일양태에서, 본 발명은, 피험체 내에서 항원 또는 IgG를 검출하는 방법이며, 본 명세서에 기재된 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체를 피험체에 투여하는 공정으로서, 방사성 금속 핵종이, 상기 IgG 결합 펩타이드에 결합하는 공정;
피험체에서, 방사성 금속 핵종에 유래하는 방사능 수준 또는 존재를 측정하는 공정; 및
방사능 수준 또는 존재에 따라 항원 또는 IgG를 검출하는 공정;
를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은, 바람직하게는 핵 의학 영상 진단법이다. 본 방법에 의해 피험체의 항원 또는 IgG의 분포 및/또는 체내 동태를 추측할 수 있다.
본 방법에 있어서, 투여 방법은, 본 발명의 핵 의학 영상 진단제 또는 암 진단제에 대해 설명하는 것과 동일하기 때문에 설명을 생략한다. 또한 방사능 수준 또는 존재를 측정하는 공정과, 피험체 암의 우환 유무를 결정하는 공정은 상기와 동일하기 때문에 설명을 생략한다.
본 명세서에서, 피험체의 생물종은, 예를 들면 인간과 침팬지 같은 영장류, 렛트, 마우스, 토끼 등의 실험 동물, 돼지, 소, 말, 양, 산양 등의 가축 동물 및 개 및 고양이 등의 애완 동물을 들 수 있으며, 바람직하게는 인간이다.
[실시예]
하기의 실시 예를 참조하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1: IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체의 X선 결정 구조 해석]
<방법>
(1) IgG 결합 펩타이드 용액의 제조
G(HC)DCAYHRGELVWCT(HC)H-NH2의 배열(배열 번호 31, 단, HC는 호모시스테인이며, 4 번째와 14 번째의 2 개의 Cys, 2 번째와 16 번째의 2개의 호모시스테인은, 각각 분자 내에서 디설파이드 결합을 형성한다)을 가지는 환상 호모시스테인 펩타이드를, F-moc법에 의해 펩타이드 고상 합성법에서 통상적인 방법에 따라 제조하였다. 제조한 IgG 결합 펩타이드 0.8 mg의 분말을 24μL의 100% 디메틸 설폭사이드 (와코 순약)에 녹여, IgG 결합 펩타이드 용액을 제조하였다.
(2) Fc와 IgG 결합 펩타이드와의 복합체의 제조
인간 IgG (중외 제약)의 힌지(hinge) 부분을, 10 mM EDTA 및 1 mM L-시스테인을 포함하는 20 mmol/L 인산 완충액(pH 7.0) 내에서 37℃에서 파파인(로슈 사제)를 이용하여 절단하였다. 다음으로, 인간 IgG Fc를 양이온 교환 컬럼(TSKgel SP5-PW(도소))를 이용하여 유속 1 mL/min, 20 mM 초산 나트륨 완충액(pH 5.0) 중, 0-0.3 M NaCl의 그레디언트 용출로 정제하였다. 16 mg/mL의 인간 IgG Fc를 포함하는 63 μL의 용액(0.1M 염화나트륨(와코 순약). 0.04 M의 2-몰포리노 에탄술폰산(와코 순약)(pH6.0))를, 상기 (1)에서 제조한 IgG 결합 펩타이드 용액 2 μL와 혼합하여, Fc와 IgG 결합 펩타이드와의 복합체 용액을 제조하였다.
(3) Fc와 IgG 결합 펩타이드와의 복합체의 결정의 제조
Fc와 IgG 결합 펩타이드와의 복합체의 결정은, 싯팅 드롭(Sitting drop) 증기 확산법에 의해 얻었다. 즉, 상기 (2)에서 제조한 Fc와 IgG 결합 펩타이드와의 복합체 용액 0.3 μL와 결정화제(20% 폴리에틸렌 글리콜 3350(시그마 알드리치), 0.2 M 요오드화칼륨(와코 순약)(pH6. 9)) 0.3 μL을, 결정화용 로봇인 HydoraII + (매트릭스 사제)를 이용하여 인텔리 결정화 플레이트(베리타스 사제)의 S1 웰 상에서 혼합하여, 결정화 드롭하였다. 저류층 용액으로는, 상기 결정화제 70 μL를 분주하였다. 플레이트를 PowerSeal CRISTAL VIEW(구라이나 바이오원 사제)로 밀폐 후, 20℃의 항온조 내에 약 2 주간 정치하여, 결정을 얻었다.
(4) Fc와 IgG 결합 펩타이드와의 복합체의 결정의 X선 회절 강도 데이터의 수집
상기 (3)에서 얻어진 결정,을 안정화 모액(22% 폴리에틸렌 글리콜 3350, 0.2 M 요오드화 칼륨, 0.1 M 염화나트륨, 25% 글리세롤(w/v), 0.04 M의 2- 몰포리노 에탄 술폰산(pH 6.0))에 옮겨, -170℃의 질소 가스 기류에서 급속 동결하고, X선 회절 데이터를 진동법으로 측정하였다. X선의 파장은 1 옹스트롱, 진동 각도는 1°/ 프레임에서 실시하였다. 다음으로, 회절 강도 데이터 처리 프로그램 HKL2000(HKL Research 사제)를 사용하여 회절 강도 데이터를 해상도 3.0 옹스트롬으로 처리하였다. 그 결과, 결정의 공간군이 P21이며, 격자 정수 a = 66.1 옹스트롬, b = 60.5 옹스트롬, c = 69.5 옹스트롬, α = γ = 90°, β = 101.3°였다. 얻어진 데이터 완전성(Completeness)은 99.9%, Rmerge은 13.8%였다.
(5) Fc와 IgG 결합 펩타이드와의 복합체의 결정 구조 결정
DCAYHRGELVWCT(서열 번호 33)에 대해, 상기 (4)에서 얻어진 회절 강도 데이터를, CCP4(Collaborative Computational Project Number 4)에 포함된 프로그램 Phaser을 이용하여 분자 치환법에 의한 위상 결정을 시도하였다. 분자 치환법의 검색 모델에는 Protein Data Bank(PDB, URL: http://www.rcsb.org/pdb/)에 PDB accession code: 1DN2로서 등록된 Fc 부분 모델을 이용하였다. 그 결과, 비대칭 단위에서 1분자의 모델을 발견할 수 있었다. 다음으로, CCP4에 포함된 구조 정밀화 프로그램 Refmac5을 이용한 구조 정밀화와 모델 구축 프로그램인 X-tal view를 이용한 모델의 수정을 반복 실시하여, Fc와 IgG 결합 펩타이드(DCAYHRGELVWCT (서열 번호 33))와의 복합체의 결정 구조를 얻었다. Fc의 펩타이드 결합 부위에 IgG 결합 펩타이드에 상당하는 전자 밀도가 관찰되었다. 결정한 결정 구조의 정확도의 지표 인 R 인자는 0.216였다. 또한, 정밀화 단계에서 계산에 넣지 않았던 전반사의 5%에 상당하는 구조 인자로부터 계산되는 Rfree 인자는 0.317였다.
(6) 가교 구조 모델 작성
상기의 X선 결정 해석의 구조를 바탕으로, 계산 과학 소프트웨어 MOE (Molecular Operating Environment)에 가교 구조 모델을 작성하였다. DCAYHRGELVWCT(서열 번호 33)의 6 번째 아미노산을 Lys로 치환 후, 이의 Lys의 ε 아미노기 및 항체 Fc의 248 번째 Lys의 ε 아미노기 사이를 잇는 형태로, DSG 또는 DSS에 의한 가교 구조를 모델화하였다.
<결과>
도 1A에 나타낸 바와 같이, IgG 결합 펩타이드는, 단백질 A의 결합 부위와 겹치는 CH2와 CH3 도메인의 경계에 결합하여, 이미 보고된 IgG 결합 펩타이드 Fc-III(DeLano, WL et al., Science, 2000, 287, pp. 1279-1283)과 유사한 형태로 IgG와 결합하고 있다고 생각되었다. IgG 결합 펩타이드 및 Fc와 특징적인 상호 작용은, IgG 결합 펩타이드의 8 번째 잔기 Arg의 측쇄의 구아니디노기가 2.91 옹스트롬에서 Fc의 Glu380(EU numbering에 근거한다. 이하 동일)의 측쇄의 카복실산과 염 결합하고 있는 점이다. 이 Glu380의 측쇄는, 인간 IgG Fc에서 Lys248과 염 결합하여 분자 내에서의 염 결합 네트워크를 형성하고 있으며, IgG 결합 펩타이드의 Arg8 및 Fc의 Lys248는 Fc의 Glu380과의 상호 작용을 통해 접근하고 있다. 그래서 IgG 결합 펩타이드의 8 번째 잔기 Arg를 Lys으로 바꾸고, 이 염 결합 네트워크 구조와 유사한 형태로, 펩타이드의 Lys8과 항체 Lys248의 측쇄의 아미노기를 가교제로 가교하는 것을 고안하였다. 사실, IgG 결합 펩타이드와 인간 IgG Fc의 복합체 구조를 기반으로 DSG(디숙신이미딜 글루타레이트) 또는 DSS(디숙신이미딜 수버레이트)에 의한 가교 구조의 모델을 작성하였으나, 공간적에도 항체의 주쇄 구조의 변형을 수반하지 않고 가교제의 도입이 가능하다고 생각되었다(도 1B).
[실시예 2 : 표지용 펩타이드의 제조 및 특성]
<방법>
아미노기를 비오틴(Biotin) 또는 5/6T AMURA 숙신이미딜 에스터(succinimidyl ester)(AnaSpec, Inc.)(형광 색소)에서 수식한 아미노-PEG4화 합성 펩타이드 GPDCAYHXGELVWCTFH(서열 번호 2)(단, C 말단은 아미드화)는 Fmoc 고상 합성법에 의해 통상적인 방법에 따라 합성 하였다. 보호기를 제거한 후, pH 8.5의 수용액 중에서 산화 조건 하에 분자 내 SS 결합을 형성시켜, 역상 HPLC를 이용하여 유속 1.0 ml/min, 0.1%의 TFA를 포함하는 10%부터 60%의 아세토나이트릴의 그레디언트 용출에 의해 분자 내 SS 결합을 갖는 펩타이드를 정제하였다.
제조한 IgG 결합 펩타이드를 1mM 포함하는 DMF 용액 100 μL와 100 mM의 DSS 또는 DSG(Thermo Fisher Scientific 사)의 아세토나이트릴 용액 100μL를 혼합 후, 실온에서 밤샘 반응시켰다. 반응물을 0.1% TFA에서 2.5 배로 희석한 후, Waters 사의 μ Bondasphere 5C18 100 옹스트롬(직경 3.9 mm x 150 mm)에 인젝트하여, 0.1% TFA를 포함하는 4%부터 60%까지의 아세토나이트릴의 그레디언트로 용출하였다. 얻어진 생성물에 가교제의 추가에서는, BEH300 C18(1.7μm, 직경 2.1 mm x 50 mm) 컬럼을 연결한 LC-Mass spectrometry(Acquity SQD UPLC system, Waters Corp.) 상에서 0.1% 포름산을 포함하는 4%부터 60%로 아세토나이트릴의 그레디언트로 용출하여, 피크의 분자량 측정에 의해 확인하였다.
얻어진 라벨화 시약 펩타이드의 친화성 분석은, 1 M Tris-HCl(pH = 7.0)를 10 분의 1 양 추가로 15분 반응시킴으로써 NHS기를 가수 분해 후, 이하의 방법으로 실시하였다. BIAcoreT200(GE healthcare)에 셋팅한 CM5 센서 칩 상에, 0.4M EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)-카르보디이미드)와 0.1M 설포-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide, 설포-N-하이드록시 숙신이미드)를 동량 혼합 후, 10 μl/ml의 유속으로 센서 칩에 7 분 인젝트하여 센서 칩을 활성화하고, pH 4.0(10 mM 초산 Na)의 조건에서, 고정화량이 RU 값으로 4000 ~ 5000가 되도록, IgG를 고정하였다. HBS-EP 완충액(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA, pH 7.0)을 사용하면서, 유속 50 μl/ml에서, 10 nM로부터 2μM의 농도의 펩타이드를 180초간 인젝트하여 결합 반응을 모니터 한 후, 완충액에 의해 600 초 세척하여 해리 반응을 측정하였다. 결합 매개 변수의 분석은 BIAevalution T100 소프트웨어를 이용하여 수행 하였다.
<결과>
가교 구조의 도입이, IgG 결합 펩타이드의 특이성 및 친화성에 영향을 미치는지 검토하기 위하여, 가교 구조를 도입한 IgG 결합 펩타이드의 IgG에 대한 결합력을 SPR 분석으로 측정하였다(표 1). 8 잔기 번째 아르기닌을 리신으로 치환한 IgG 결합 펩타이드(이하, Type I(R8K)라고도 함)의 인간 IgG에 대한 선호도는 131 nM(Kd)이며, 치환 전의 IgG 결합 펩타이드(이하, Type I라고도 함)에 비해 10 배 친화성이 떨어졌다. Type I(R8K) 펩타이드에 각 가교제를 결합시킨 것은, 인간 IgG에 대한 친화성은, Type I(R8K)-DSG-OH에서 약 330 nM (Kd), Type I(R8K)-DSS-OH 에서 약 390 nM(Kd)이며, 가교제가 결합한 것에 의해 친화력의 큰 감소는 보이지 않았다. 어느 펩타이드에서도, Kd 값으로 μM 이하의 친화력을 갖고 있기 때문에 충분히 특이적인 표지화가 가능하다고 생각된다.
펩타이드 배열 ka kd KD (nM)
1:1
바인딩		 평형치
Type I GPDCAYHRGELVWCTFH-NH2 1.57E+06 0.0144 9.1 10
Type I(R8K) GDDCAYHKGELVWCTFH-NH2 1.25E+06 0.195 156 131
Type I(R8K)-DSG-OH GDDCAYHK(DSG-OH)GELVWCTFH-NH2 3.29E+05 0.1036 315 330
Type I(R8K)-DSS-OH GDDCAYHK(DSS-OH)GELVWCTFH-NH2 1.68E+05 0.06136 365 389
Type I(R8K)와 각 가교제 결합 펩타이드의 가수 분해물의 친화성(모든 펩타이드의 N 말단을 비오틴화 PEG4에서 차단한 것을 사용하였다). Type I(R8K)-DSG-OH, Type I(R8K)-DSS-OH는, Type I(R8K)에서, 도입한 가교제의 NHS기를 가수 분해 한 것을 나타낸다.[실시예 3: IgG 결합 펩타이드에 의한 인간 IgG-Fc의 특이적 수식]
<방법>
실시예 2와 동일한 방법으로 N 말단에 Biotin-PEG4을 부가한 IgG 결합 펩타이드(TypeI (R8K))를 DSS 또는 DSG으로 수식한 표지된 시약 펩타이드를 제조하여, 이를 인간 IgG Fc와 반응시켜 인간 IgG Fc 표지화 반응을 조사하였다. 즉, 실시예 2와 동일한 방법으로 과잉된 DSS 또는 DSG와 반응시킨 IgG 결합 펩타이드(R8K) (200 pmol/5μL in 0.1% TFA)을 역상 컬럼에서 정제 후, 감압 하에서 아세토나이트릴을 제거 후, 0.5 M Na2HPO4를 약 1/8 더하여 중화시키고, 즉시 단백질 시료(hIgG (중외 제약), hIgA(Athens Research & Technology), HSA (시그마 알드리치) 또는 혈청(정상인에서 채혈한 것))(각 40 pmol/5μL, 혈청은, PBS에 의해 10배 희석한 것을 사용)에, 몰비 10 배 양으로 더해 최종 양을 PBS로 20μL한 후, 실온에서 5 분 방치하였다. 그 후, 1 M Tris-HCl(pH = 7.0)을 1μl 추가하여 반응을 정지한 후, 4 x SDS 시료 용액 6.7 μl 및 2-메르캅토 에탄올 1.4 μl(최종 5%)을 첨가하고 95℃, 10 분 처리한 후, 프리캐스트 겔 SuperSepTMAce, 5-20% (와코 순약)을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하였다. 영동 후의 겔은, 호에퍼·세미포어 TE70(Hoefer Semiphor TE70) 트랜스 블럭 시스템을 이용하여 35 mA, 60분에서, PMDF막에 전사 후, 0.5% BSA로 블로킹하였다. 비오틴화 펩타이드로 표지된 단백질은 SA 콘쥬게이트 HRP (1000배 희석, Vector Laboratories)를 이용하여 화학 발광 시약(이뮤노스타 (등록 상표) 베이직, 와코 순약)에 의해 검출하였다.
<결과>
도 2B에 나타낸 것처럼, 웨스턴 블로팅(Western Blotting)에서, IgG와 반응시킨 경우에만, 복합체로 보이는 밴드가 관찰된 것으로부터, DSG 또는 DSS와 반응시킨 IgG 결합 펩타이드는, 함께, IgA 및 HAS, 혈청 중의 IgG 이외의 단백질과 결합하지 않고, IgG에 선택적으로 결합하고 있는 것으로 나타났다
[실시예 4: IgG에 대한 IgG 결합 펩타이드의 반응 조건 검토]
<방법>
(1) 반응 몰비의 검토
96구 마이크로 플레이트(Nunc (등록 상표) MaxiSorp)의 웰에, 각 단백질 (IgG(중외 제약), IgA(Athens Research & Technology) 또는 Bovine gelatin(와코 순약))(50 ng(0.33 pmol)/μl/well)을 포함하는 0.1 M NaHCO3 용액을 플레이트에 첨가하여 실온에서 하룻밤 방치하고, 각 단백질을 플레이트의 표면에 흡착시켜, 0.5% BSA로 블로킹을 수행한 후, 각 웰에서, 실시예 2와 동일하게 제조한 DSG로 수식한 비오틴화 IgG 결합 펩타이드(몰비에서, 0,1,2,5,10)를 넣고, 1시간 경과 후, 1M Tris-HCl(pH 7.0)을 3μL 추가하여 반응을 정지하였다. 0.5% BSA에서 2000배 희석 한 SA-HRP(Vector Laboratories)를 50 μL 첨가하고, 실온에서 1시간 반응 후, 0.1% PBST로 5 회 세척 후 HRP의 정색에 TMB 용액 (Wako Chemicals)를 이용하여 5 분의 발색 반응 후, 450 nm의 흡광도를 ELISA 플레이트 리더(모델 680 마이크로 플레이트 리더(바이오 래드))로 측정하였다.
(2) 반응 시간 검토
50 ng/50 μL 용액에 의해 4 ℃에서 하룻밤 고정된 hIgG(50 ng)에 대하여, DSG로 수식한 비오틴화 IgG 결합 펩타이드를 몰비 2로 추가하여, 각 반응 시간 (0~60분)에서 1M Tris-HCl(pH7.0)를 3μL 추가 반응을 정지하였다. 결합의 검출은 (A)와 동일하게 수행하였다.
<결과>
DSS 표지된 IgG 결합 펩타이드를 사용하여, 항체와 반응시키는 몰수 및 반응 시간의 차이에 의한 반응 효율을 ELISA로 검토하였다(도 3). 즉, 플라스틱 플레이트에 고정화한 IgG 결합 펩타이드의 몰비를 1에서 10까지 변화시켜 hIgG과 반응시킨 결과, 거의 몰비 5의 부근에서 포화가 보인 것으로부터 몰비 5 정도의 펩타이드 시약을 가하면 항체의 표지화에는 충분하다고 생각되었다(도 3A). DSS로 수식하지 않은 비오틴화 IgG 결합(R8K) 펩타이드(NO DSS R8K)는 매우 약한 결합을 볼 수 있는데, 이것은 비공유 결합으로 결합된 펩타이드에 의한 결합 활성으로 생각된다. 또한, 표지화 IgG 결합 펩타이드 시약을 과잉으로 추가하여도, 다른 단백질(hIgA, 보바인 단백질(Bovine gelatin) 또는 차단제로 사용하는 BSA)에의 결합은 전혀 검출되지 않았다.
다음으로, IgG 및 IgG 결합 펩타이드의 몰비 1 : 2로 반응시켰을 때의, 반응 시간의 검토를 실시하였다. 그 결과, 약 15분에서 포화가 보였기 때문에 반응은 15 분에서 거의 종료된 것으로 간주되었다(도 3B).
이상의 결과로부터, 가교제로 수식한 본 발명의 IgG 결합 펩타이드는, 짧은 시간에 매우 특이적으로 IgG와 결합하는 것이 나타났다.
[실시예 5: 형광 IgG 결합 펩타이드에 의한 Fc 표지화]
<방법>
IgG(중외 제약), IgA(Athens Research & Technology) 또는 BSA(시그마 알드리치)(15 μg: IgG 환산으로 100 pmol)와 실시예 2에 따라 제조된 DSG 가교 펩타이드 또는 DSS 가교 펩타이드(500 pmol)를 200μL 내에서 실온으로 60분 반응시켜, 1M Tris-HCl(pH = 7.0)을 10μL 첨가 반응을 정지시켰다. 그 후, SuperdexTM200 10/30GL 직경 1.0 cm × 30 cm(GE 헬스 케어); 유속 : 0.3 ml/min; 런닝 버퍼: PBS pH 7.4, 에서 크기 배제 크로마토그래피를 실시하여 형광 검출기 RF-10A(시마즈 제조소)(여기광: 541 nm 형광: 565 nm)를 이용하여 측정하였다.
<결과>
DSS 또는 DSG를 반응시킨 표지화 IgG 결합 펩타이드를 각 단백질에 대하여 몰비 1 : 5에서 단백질과 실온에서 60분 반응시키고, 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 어느 표지화 IgG 결합 펩타이드(DSS 또는 DSG)를 이용하여도 IgG에 대한 반응성의 특이성은 동일한 정도이며, hIgA와 BSA 등 다른 단백질에 형광 표지화는 전혀 검출되지 않았다(도 4). 이상의 점으로부터, 제조한 어느 IgG 결합 펩타이드를 이용하여도 높은 특이성을 가지고, 인간 IgG를 형광 표지할 수 있는 것으로 나타났다.
[실시예 6 : IgG 결합 펩타이드에 의한 Fc의 수식물의 분석(pH4.5)]
<방법>
인간 IgG(중외 제약)의 Fc용액(20 μM, 0.1 M 초산 완충액 pH 4.5) 200 μL와, DMF에 용해한, 실시예 2와 동일한 방법에 의해 DSG 수식한 IgG 결합 펩타이드(RGNCAYHXGQLVWCTYH(서열 번호 35), X는 리신)(4 mM)를 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 μL(몰비로 0.5, 1.0, 2.0, 5.0) 추가하여, 빠르게 교반 후, 실온에서 15분 반응시키고 1M Tris-HCl(pH 7. 0)을 10 μL 첨가하여, 반응을 정지시켰다. 반응물 50 μL를 Shodex IEC SP-825 컬럼을 연결한 NGC Chromatography system(바이오 래드)에 인 젝트하여 25 mM 아세테이트 버퍼(pH4.5)에서 1 M NaCl을 포함하는 25 mM 아세테이트 버퍼(pH4.5)에 그레디언트 용출하고, 단백질의 용출을, 215 nm의 흡광도에서 모니터하였다. 얻어진 각 피크를 분취하여, LC/MS에 의한 분자량 측정에 사용하였다.
Waters ACQUITY UPLC BEH C8(1.7 μm 2.1 mm × 100 mm) 컬럼을 연결한 Shimadzu LCMS-8030에서, 얻어진 피크의 분획을 20μL 인젝션한 후, 0.1% 포름산을 포함하는 4% 아세토나이트릴로부터 0.1% 포름산을 포함하는 60% 아세토나이트릴까지의 그레디언트 용출을 실시하였다. 용출된 피크의 질량 스펙트럼 분석을 수행하여, 해석 소프트웨어를 이용한 다가 이온 피크로부터의 디콘볼루션(deconvolution)에 의해 질량을 계산하였다.
<결과>
인간 IgG1-Fc와 DSG 수식한 IgG 결합 펩타이드(4 mM, Biotin-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH-NH2; 분자량 2760, X는 DSG화한 리신에서, 2개의 Cys는 분자 내의 SS 결합을 형성)을 몰비로 0.5, 1.0, 또는 5.0에서 반응시킨 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, 원래의 인간 IgG1-Fc의 용출 위치의 피크(피크 2)와 2개의 피크 3, 4가 나타났다(피크 1은 DSG화한 IgG 결합 펩타이드인 것으로 간주된다). 이러한 분자 종을 동정하기 위해 LCMS 분석을 실시하였다. 반응 전의 IgG1-Fc는 이온 교환 크로마토그램에서 피크 1의 곳에서 용출되었고, LCMS 분석에서는 55084이라는 값이 얻어졌다. 반응 후의 2,3,4 피크의 LCMS 분석을 실시한 결과, 각각 55087, 57735(55087 + 2648), 60384(55087 + 5297)이라는 값이 얻어졌다. 이 때문에 반응 후의 피크 2는 미반응의 Fc이며, 피크 3과 4는 Fc에 각각 1개와 2개의 펩타이드가 결합한 것임을 알 수 있었다.
도 5B는, 각 몰비로 반응시킨 경우의, 미반응(피크 2), 1개의 펩타이드의 부가물(피크 3), 2개의 펩타이드의 부가물(피크 4)의 생성량의 변화를 그래프화 한 것이다. 예를 들면, 몰비 1 : 1로 반응시킨 경우에도 미반응물은 20% 이하로 되고, 몰비 1 : 2에서는 미반응물은 10% 이하로 매우 수득양이 높은 것을 알 수 있다. 또한, 과잉한 몰비 1 : 5의 경우에도 상대적으로 2개의 펩타이드 부가물의 생성 비율이 증가했으나, 그 이상의 펩타이드가 부가된 Fc는 이온 교환 크로마토그램에서 검출되지 않은 것으로부터, 이 표지 반응은 매우 특이하다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 7: IgG 결합 펩타이드에 의해 Fc의 반응에 대한 pH 및 반응 시간의 영향]
<방법>
pH 4.0(25 mM 초산 완충액), pH 5.5(25 mM 초산 완충액), 또는 pH 7.0(PBS)에서 제조한 인간 IgG의 Fc용액 200μL에 대하여, 실시예 5에서 제조한 DMF 내 용해한 DSG 수식한 IgG 결합 펩타이드(4 mM)를 1.0 μL(몰비 1.0) 추가하여, 신속하게 교반 후, 실온에서 반응하였다. 반응 후, 1, 5 및 10 또는 30분에, 1M Tris-HCl(pH 7.0)을 10 μL 첨가하여, 반응을 정지시키고, 반응물 50 μL를 Shodex IEC SP-825 컬럼을 연결한 NGC Chromatography system(바이오 래드)에 인젝트하여 25 mM 아세테이트 버퍼(pH4.5)로부터 1M NaCl을 포함하는 25 mM 아세테이트 버퍼(pH4.5)에 그레디언트 용출하고, 단백질의 용출을 215 nm의 흡광도에서 모니터하였다. 얻어진 크로마토그램을 바탕으로 각 피크의 비율을 계산하였다.
<결과>
도 6에 나타낸 것처럼, 시험한 pH 4.0, pH 5.5 및 pH 7.0의 모두에서 표지 화 반응은 빠르게, 반응의 90% 이상이 1분 이내에 종료하는 것으로 나타났다. 또한, pH 4.0에서는, 미반응물의 잔량이 40%를 넘고 있어 반응 수율이 낮고, 특히, 2 개의 펩타이드의 부가물(피크 4)의 수율이 15% 정도로 다른 pH의 경우(35-40%)에 비해 낮았다. pH 5.5 및 7.0의 미반응물의 수율도 10% 대로 낮아 효율적으로 반응하고 있는 것으로 나타났다. pH 5.5과 7.0의 차이로는, 약간, 피크 4의 수율이 pH 7.0로 낮아지는 경향을 보였다.
[실시예 8: 방사성 금속 핵종에 의한 IgG 결합 펩타이드 표지 및 이를 이용한 암의 검출 1]
1) DTPA 함유 IgG 결합 펩타이드의 제조
N 말단의 아미노기를 DTPA-테트라(tBu)에스터(CheMatech사 제)로 수식한 아미노 PEG4화 IgG 결합 펩타이드 GPDCAYHKGELVWCTFH(서열 번호 37, 분자 내의 2 개의 Cys는 SS 결합을 형성, C 말단 아미드화)은 Fmoc 고상 합성법에 의해 통상적인 방법에 따라 합성하였다. 탈보호 후, 정제한 DTPA-IgG 결합 펩타이드를 DMSO20 μL(19 mM)에 용해시켰다. 펩타이드 용액에 아세토나이트릴에 용해된 DSG(500 mM) 20 μL와 피리딘 0.2 μL(최종 농도 0.5%)을 첨가하여, 50℃에서 3 시간 반응시켰다. 전량을 0.1% TFA를 포함한 15% 아세토 니트릴 10 ml에 희석하여 원심 후 상청을 InertSustain(등록 상표) C18 컬럼(7.6 mm × 250 mm, GL Science)에 주입하고, 0.1% TFA를 포함하여 15%부터 80%까지의 아세토나이트릴의 그레디언트로 용출하였다. 용출물의 질량 분석을 수행하고, 목적물(DSG 자격 DTPA-PEG4화 IgG 결합 펩타이드)을 회수한 후 용매를 제거하고 동결 건조하였다.
2) DTPA 함유 IgG 결합 펩타이드를 트라스트주맙(Trastumab)에 결합한, 방사성 핵종 표지 항체 「DTPA 수식 Trastumab」의 제조
상기 1)에서 제조한 DSG 자격 DTPA-PEG4화 IgG 결합 펩타이드를 5.0 mM의 농도로 DMSO에 용해시킨 용액 1.36 μL과 10 mM 초산 완충액(pH 5.5)에 녹인 6.8μM 항 HER2 인간 항체(Trastuzumab)(중외 제약) 1 mL를 혼합하고 실온에서 30분간 반응(펩타이드와 항체의 몰비 = 1 : 1)시켰다. 이렇게 제조한 DTPA 수식 인간 항체(항체 약물 복합체, ADC)는 음이온 교환 컬럼 Shodex QA825(8.0 mm × 75 mm, Shodex)에서 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.0)을 포함하여 0 M에서 0.5 M까지의 NaCl의 그레디언트 용출로 정제하였다. 미반응 항체 이외의 2개의 피크(피크 A, B)을 분취 후, Vivaspin(10000Da 컷 오프, Sartorius) 상 에서, 3000 g으로 원심하여 탈염 농축을 실시하였다. 얻어진 시료는 MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG(Bruker Daltonics)로 질량을 측정하고, 피크 A가 원래 항 HER2 인간 항체에 비해 2716(이론치 2722), 피크 B가 원래의 항 HER2 인간 항체에 비해 5398(이론치 5444) 증가하고 있기 때문에 각각 DTPA가 부가된 DTPA-PEG4 화 IgG 결합 펩타이드가 1개(항 HER2 항체-DTPA * 1), 및 2개(항 HER2 항체-DTPA * 2) 도입되어 있는 것을 확인하였다.
3) DTPA 수식 Trastuzumab의 111In 표지 및 [111In] 표지 DTPA 수식 Trastuzumab의 방사 화학 순도의 확인
상기 2)에서 제조한 DTPA 수식 Trastuzumab을 마이크로 피펫(Myjector)으로 정확하게 달아 취하여, 용량 1.5 mL의 에펜도르프 튜브에 넣었다. 여기에 10 mM 구연산 함유 0.15 M 초산-암모니아 완충액(pH 5.5)를 첨가하였다. DTPA 수식 Trastuzumab 용액 전량을 마이젝터(주사기)로 빼내어 15 mL 용량의 무색 유리병에 넣었다. DTPA 수식 Trastuzumab 용액 전량과 동량의 [111In] Cl3 용액을 마이젝터로 무색 유리제의 바이알에 넣고 잘 혼합하였다. 또한, [111In] 대한 DTPA 수식 Trastuzumab의 몰수가 20-100 배가 되도록 제조하였다. 이것을 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후 방사능 양을 방사성 동위 원소 도스·캘리브레이터로 측정하였다.
1 M 구연산 용액과 1 M 구연산 트리나트륨 용액을 각각 5 mL 마이크로 피펫으로 정확하게 취하여 100 mL 메스 플라스크에 옮겼다. 순수한 물을 넣어 정확하게 100 mL로 하였다. 1% EDTA 용액 1 mL를 마이크로 피펫으로 정확하게 취하여 공정 1의 100 mL 메스 플라스크에 옮기고 잘 혼합하였다. 이를 전개 용매로 하였다(사용시 제조). 전개 용기 속에 전개 용매를 용기의 바닥에서 1 cm 정도까지 넣었다. 시험 물질 3 μL을 마이크로 피펫으로 정확하게 취하여 여과지의 하단 2 cm를 원점으로 하여, 원점에 적하하였다. 적하 후 즉시 건조시켰다. 용매 프런트를 원점보다 10 cm로 하고, 전개 용매에 하단이 담가지도록 전개 용매에 넣었다. 용매 전면 상단에 도달한 후 즉시 건조시켰다. 여과지에 잔류하는 방사능을 라디오 박층 크로마토그래피 분석기로 측정(조건 Counting time: 20분, Energy Range: 125-285keV, Binning: 2)하여, 원점의 피크 면적의 비율로부터, [111In] 표지 DTPA 수식 Trastuzumab의 방사 화학 순도(%)를 산출하였다.
표 2에, Trastuzumab 한 분자에 대한 DTPA 결합 펩타이드의 수식 개수가 다른 2 종류의 DTPA 수식 Trastuzumab를 이용하여 표지 검토를 실시한 결과를 나타낸다. 표 2에 나타난 바와 같이, 모든 DTPA 수식 Trastuzumab에 [111In]으로 표지가 가능하였다.
시료명 Trastuzumab한 분자에 대한
DTPA 결합 펩타이드의 수식수		 첨가방사능량 방사화학순도
1-I 1 5.76MBq 79.12%
2-I 1 6.57MBq 18.99%
1-II 2 6.57MBq 93.99%
2-II 2 6.67MBq 97.94%
4) 111In 표지 Trastuzumab의 HER2 결합능 및 특이성의 평가HER2 고발현 세포주 SK-OV-3(인간 유래 난소암 세포) 및 HER2 저발현 세포주 MDA-MB-231(인간 유래 유방암 세포)(모두 American Type Culture Collection에서 입수)를 트립신-EDTA 혼합액을 이용하여 회수하고, 혈청 배지에서 1.5 × 107 개/mL로 제조한 세포 현탁액을 제조하였다. 세포 현탁액 200 μL를 마이크로 피펫으로 정확하게 달아 취하여, 용량 1.5 mL의 마이크로 튜브에 넣고, 얼음 냉각하였다. 또한, 시료 수를 각각 3으로 하였다.
상기 3)에서 제조한 111In 표지 Trastuzumab를 무 혈청 배지로 희석하여 방사능 농도가 10 ~ 200 kBq/mL가 되도록 준비하였다.
방사능 농도를 제조한 111In 표지 Trastuzumab 함유 혈청 배지 500μL를 마이크로 피펫으로 정확하게 달아 취하여, 세포 현탁액이 들어간 마이크로 튜브에 첨가하여 세포 현탁액과 잘 혼합하였다. 이를 얼음 상에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, HER2를 통하지 않고 비특이적으로 각 세포에 부착되어 있는 111In 표지 Trastuzumab을 세척하기 위해 원심 분리기(원심 가속도: 5000 g, 온도: 4℃, 시간: 5 분)로 수행하여, 상청을 마이크로 피펫으로 제거하였다. 그 후, 차가운 인산 완충액 1 mL를 첨가하여 재현탁하고 원심 분리(원심 가속도: 5000 g, 온도: 4℃, 시간: 5 분)하였다. 이 세척 작업을 3회 반복하였다. 최종적으로 펠릿(pellet)만 남도록 상청을 마이크로 피펫으로 완전히 제거하였다.
111In 표지 Trastuzumab 함유 혈청 배지를 500 μL 마이크로 피펫으로 정확하게 달아 취하고, 용량 1.5 mL 플라스틱 튜브에 넣었다. 또한, 블랭크로서 플라스틱 튜브만을 마련하였다(하기의 계산식의 net value를 계산하기 위한 백그라운드 값을 측정하는데 사용하였다). 또한, 시료를 각각 3으로 하였다. 각 시료의 방사능량을 오토 웰 감마 카운터(측정 조건: Energy Range: 111-252 keV, 프리셋 타임: 60 초)에서 측정한 측정 값을 이용하여, 다음의 계산식에서 각 세포에 대한 111In 표지 Trastuzumab의 결합율(%)을 산출하였다.
[식 1]
Figure pat00005
※ 카운트 값은, 모두 net value(측정값에서 백그라운드 값을 빼고 감쇠 보정한 것)을 나타낸다.
결과를 표 3에 나타낸다. 모든 [111In] 표지 Trastuzumab에서 HER2에의 결합능 및 특이성을 가지고 있음을 확인하였다.
시료명 결합율(%)(n=3, 평균±SD)
SK-OV-3 MDA-MB-231
1-I 59.94±1.94 3.03±0.10
2-I 76.68±2.08 3.83±0.59
1-II 54.17±1.63 2.68±0.17
2-II 80.00±3.11 4.29±0.50
5) SPECT 이미징 분석에 의한 [111In] 표지 Trastuzumab의 종양 내 HER2 결합능 및 특이성 확인마우스(BALB/c, nu/nu 19주령, ♀, 각 1 마리)의 좌우 다리에 SK-OV-3(HER2 고 발현 세포주) 및 MDA-MB-231(HER2 저발현 세포주)를 이식한 담암 모델을 제조하여, SPECT/CT 이미징을 실시하였다. SPECT 이미징에는 2종류의 [111In] 표지 Trastuzumab(Trastuzumab1 분자에 대한 DTPA 결합 펩타이드 1 분자 또는 2 분자를 수식한 것)을 사용하였다.
(111In 표지 Trastuzumab 준비)
111In 표지 Trastuzumab는 상기 「3) DTPA 수식 Trastuzumab의 111In 표지, 및 [111In] 표지 DTPA 수식 Trastuzumab의 방사 화학 순도의 확인」에 기재한 방법으로 제조하여, 한외 여과법으로 정제한 것을 이후의 실험에 사용하였다. 또한 항체 1 분자 내에 DTPA를 1 분자 가지는 것을 [111In] 표지 Trastuzumab-1, 2 분자 가지는 것을 [111In] 표지 Trastuzumab-2로 하였다.
(담암 모델의 제조)
BALB/c nu/nu 누드 마우스의 왼쪽 다리에 HER2 고발현 세포주 SK-OV-3를 이식하고, 오른쪽 다리에 HER2 저발현 세포주 MDA-MB-231을 이식하여, 담암 모델을 제조하였다. 또한, 각 세포는 동일한 개체에 이식하였다. 누드 마우스는 일본 에스 엘시 회사에서 구입한 6주령의 암컷 6 마리 이용하였다. 이미징 실시 당일에 각 종양 체적을 측정하고 이미징 실험에 적절한 종양 체적을 갖는 모델을 2 마리 선출하였다. 또한, 이러한 마우스에 사용된 각 암세포는, 각각 American Type Culture Collection으로부터 입수한 것을 사용하였다.
(SPECT/CT 영상)
(SPECT 영상)
이식 후 13 주에, [111In] 표지 Trastuzumab-1 용액(3.83 MBq) 또는 [111In] 표지 Trastuzumab-2(2.64 MBq) 용액을 모델 꼬리 정맥으로 투여하였다. 투여 후, 4 시간 이후부터 SPECT/CT 카메라(제품명 : FX3000 Pre-Clinical Imaging System)의 촬영을 실시하였다. 이후, 투여 후 24시간, 48시간의 시점으로 촬영을 실시하였다.
(CT 촬영)
CT 촬영은 각 종양 조직이 동시에 SPECT 촬영의 시야 내에 들어 오는지 확인하기 위해 SPECT 촬영의 전에 실시하였다. 이소플루레인에 의한 마취 도입하고, 마취를 유지한 상태에서 동물 침대에 장착하였다. 이 모델을 CT 장치에 넣어 X 선을 조사하여 종양이 시야의 중심이 되도록 위치 결정을 실시하였다. CT 영상은 다음과 같은 촬영 조건에서 실시하고 종양의 CT 이미지(raw 파일)를 취득하였다.
프로젝트 수: 200 views
프레임 평균 : 1 frames/view
검출기 비닝 : 2 x 2
X-선 관 전류 : 기본값(150 μA)
X선 관 전압 : 60 kV
노출시간 : 230 ms
배율 : 1.8
얻어진 raw 파일을 Trifoil Console에서 재구성(재구성 조건 : Half Res) 재구성 이미지를 그래픽 뷰어에서 더욱 변환하고 DICOM 파일을 제조하고 이를 이미지 분석 소프트웨어(제품명 PMOD 3.6)에서 로드 이미지를 표시하여 이후의 분석에 사용하였다.
(SPECT/CT 촬영 분석)
[111In] 표지 Trastuzumab-1 용액 또는 [111In] 표지 Trastuzumab-2 용액 투여 후 각 시간 점에서 SPECT 및 CT의 융합 이미지를 제조하고, 관상면에서 표시하였다.
표 4는 생체 내(in vivo) 실험에 사용된 모델의 상세 및 투여한 [111In] 표지 Trastuzumab-1, [111In] 표지 Trastuzumab-2의 정보를 기재하였다.
투여한 방사성 약제 [111In]표지
Trastuzumab-1		 [111In] 표지
Trastuzumab-2
Trastuzumab한 분자에 대한
DTPA 결합 펩타이드의 수식수 		1 2
동물(성별) BALB/c nu/nu 마우스(♀)
주령 19주령
체중 17.60g 18.13g
종양체적
(SK-OV-3, HER2 고발현 세포주)		 873mm3※ 205mm3
종양체적
(MDA-MB-231, HER2 저발현 세포주)		 650mm3 133mm3
투여방사능량 3.83MBq(액량F0.14mL) 2.64MBq
(액량F0.14mL)
방사화학적 순도 91.41% 65.18%
※종양괴에 궤양을 확인하였다.SPECT의 촬영 조건을 표 5에, 이미지 재구성 조건을 표 6에 나타낸다.
동위체 인듐-111 고에너지
시준기 MMP(Multiplexed Multi-Pinhole)16
회전반경(ROR) 55 mm
사영극한 150초 또는 300초
회전각도 90도
항목 수치·조건
Smoothing Middle
Resolution Middle
Iteration Middle
SPECT/CT 촬영 후, SPECT 및 CT의 융합 이미지를 제조하고, 관상면으로 표시하였다. [111In] 표지 Trastuzumab-1 및 [111In] 표지 Trastuzumab-2를 투여한 SPECT/CT 영상의 결과를 도 7, 8 및 9에 나타내었다.[111In] 표지 Trastuzumab-1 및 [111In] 표지 Trastuzumab-2를 각각 투여 후 6 시간 및 투여 후 4 시간에 촬영한 SPECT/CT 영상을, 종양을 포함하는 슬라이스 영상으로 도 7에 나타내었다. [111In] 표지 Trastuzumab-1 및 [111In] 표지 Trastuzumab-2는 HER2 고발현 종양 조직에 집적을 확인했으나, HER2 저발현 종양 조직에서는 집적을 확인되지 않았다. 또한, [111In] 표지 Trastuzumab-1은 꼬리에 비특이적인 집적이 확인되지만, 이것은 투여 시 일부 용액이 혈관 밖으로 유출되었기 때문이다.
[111In] 표지 Trastuzumab-1 및 [111In] 표지 Trastuzumab-2 투여 후 24 시간, 48 시간의 SPECT/CT 영상을, 종양을 포함하는 슬라이스 영상으로서 도 8에 나타내었다. SPECT 영상은 [111In] 표지 Trastuzumab-1 투여 후 24 시간 점의 촬영 시간을 기준으로 감쇠 보정을 실시하고 스케일 값을 맞춰서 나타내었다. [111In] 표지 Trastuzumab-1 및 [111In] 표지 Trastuzumab-2는 HER2 고발현 종양 조직에 집적을 확인하였지만, HER2 저발현 종양 조직에서 집적 확인되지 통합을 인정하지 않았다. 또한, 어느 시간 점에서도 HER2 고발현 종양 조직에서의 집적은 [111In] 표지 Trastuzumab-1 의 쪽이 [111In] 표지 Trastuzumab-2보다 높았다.
[111In] 표지 Trastuzumab-1 및 [111In] 표지 Trastuzumab-2를 각각 투여 후 6 시간 및 투여 후 4 시간에 촬영한 SPECT/CT 영상을, 간장을 포함하는 슬라이스 영상으로서 도 9에 표시하였다. 투여 초기의 간장에의 집적은 [111In] 표지 Trastuzumab-1과 비교하여 [111In] 표지 Trastuzumab-2의 쪽이 높았다. 또한, 간장의 위치는 상부가 흉강인 것에 의해 판단하였다.
[실시예 9: 디클로로프로파논에 의한 SS 가교 구조를 가지는 IgG 결합 펩타이드의 제조]
N 말단 아세틸화 RRC(Acm 보호)-PEG4 화합성 펩타이드 GPDCAYHXGELVWCTFH(서열 번호 2, X는 라이신으로, C 말단 아미드화)를, 펩타이드 합성 비즈(Rink-amide-Chemmatrix resin, Biotage) 상에서, Fmoc 고상 합성법으로 통상적인 방법에 따라 합성하였다. 수지로부터 펩타이드를 잘라내어, 탈보호한 후, 펩타이드(도 10a)를 얻었다. 얻어진 펩타이드 65 mg(15.6 μmol)을 6 M Gn·HCl을 포함하는 인산 완충액(pH = 7.3) 5 mL에 용해하고, 이를 아세토나이트릴 120 μL에 용해된 1,3-디클로로-2-프로파논(2.9 mg, 23.4 μmol 1.5 동량 몰)을 첨가하여 실온에서 교반하였다. 1 시간 후, HPLC 분석에 의해 반응 종료를 확인하고 반응 용액을 직접 HPLC로 정제하여 고리화 펩타이드(도 10, b, 33 mg, 7.8 μmol 수율 50%)을 얻었다. 이 고리 화 펩타이드에 대해 90% 초산 수용액(8.8 mL)에 현탁한 디티오트레이톨(dithiothreitol, 30.8 mg, 184.5 μmol)을 첨가하여 실온 차광에서 5시간 교반 하였다. 디티오트레이톨(DTT : 352 mg, 2.3 mmol)을 더 가하고 생긴 침전을 원심 분리하여 제거하고, 얻어진 상층액을 HPLC에 의해 정제하여 고리화 펩타이드(도 10, c, 20.5 mg 5.2 μmol, 수율 67%)을 얻었다.
[실시예 10:방사성 금속 핵종에 의한 IgG 결합 펩타이드의 표지 및 이를 이용한 암의 검출 2]
<방법>
1) 데페록사민 함유 IgG 결합 펩타이드의 제조
N 말단의 아미노기를 데페록사민-테트라(tBu)에스터(CheMatech사 제)로 수식한 아미노 PEG4화 IgG 결합 펩타이드 GPDCAYHKGELVWCTFH(서열 번호 37, 분자 내의 2 개의 Cys는 SS 결합을 형성, C 말단은 아미드화)은 Fmoc 고상 합성법으로 통상적 인 방법에 따라 합성하였다. 탈보호 후, 정제한 데페록사민-IgG 결합 펩타이드를 DMSO 40 μL(18 mM)에 용해시켰다. 펩타이드 용액에 아세토나이트릴에 용해된 DSG(500 mM) 40 μL와 피리딘 0.5μL(최종 농도 0.6%)을 첨가하고, 50℃에서 3 시간 반응시켰다. 전량을 0.1% TFA를 포함하는 15% 아세토나이트릴 10 ml로 희석하여 원심 후 상청을 InertSustain(등록 상표) C18 컬럼(6.0 × 250 mm, GL Science)에 주입하고, 0.1% TFA를 포함하여 10%부터 66%까지의 아세토나이트릴의 그레디언트로 용출하였다. 용출물의 질량 분석을 수행하고, 목적물(DSG 수식 데페록사민-PEG4 화 IgG 결합 펩타이드)을 회수한 후, 용매를 제거하여 동결 건조하였다.
2) 데페록사민 함유 IgG 결합 펩타이드를 Trastuzumab에 결합한, 방사성 핵종 표지 항체 「데페록사민 수식 Trastuzumab」의 제조
상기 1)에서 제조한 DSG 수식 데페록사민-PEG4화 IgG 결합 펩타이드를 13 mM의 농도로 DMSO에 용해시킨 용액 10 μL와 10 mM 초산 완충액(pH 5.5)에 용해된 22μM 항 HER2 인간 항체(Trastuzumab)(중외 제약) 1 mL를 혼합하고, 실온에서 2 시간 반응(펩타이드와 항체의 몰비 = 6 : 1)시켰다. 이렇게 하여 제조된 데페록사민 수식 인간 항체(항체 약물 복합체 ADC)는 음이온 교환 컬럼 QA-825(8.0 mm × 75 mm, Shodex)에서 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.0)을 포함하여 0 M에서 0.5 M까지의 NaCl의 그레디언트 용출로 정제하였다. 미반응 항체 이외의 2 개의 피크(피크 A, B)을 분취 후 Vivaspin(등록 상표)(10000 Da 컷 오프, Sartorius)에서, 3000g에서 원심하여 탈염 농축을 실시하였다. 얻어진 시료는 MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG(Bruker Daltonics)에 질량을 측정하고, 피크 A가 원래 항 HER2 인간 항체에 비해 2716(이론치 2722), 피크 B가 원래 항 HER2 인간 항체에 비해 5398(이론치 5444) 증가하고 있기 때문에, 데페록사민이 부가된 데페록사민-PEG4 화 IgG 결합 펩타이드가 각각 Trastuzumab 1 분자 또는 2 분자 도입되어 있는 것을 확인하였다.
3) 데페록사민 수식 Trastuzumab의 89Zr 표지 및 정제
89Zr을 200 MBq/200 μL가 되도록, 1 M 옥살산 용액에 용해시켰다. 마이크로 튜브에 200 μL의 89Zr-옥살산 용액 90 μL의 2 M 탄산 나트륨을 첨가하여 실온에서 3분간 방치하였다. 3분간 방치한 후 마이크로 튜브에 교반하면서 1030 μL의 5 mg/mL 겐티신산(gentisic acid) 함유 0.5 M HEPES 완충액(pH 7.1-7.3)를 첨가하였다. 이 용액 650μL에, 상기 2)에서 제조한 데페록사민 수식 Trastuzumab(1가 또는 2가) 300μL를 첨가 혼합하여, 반응 바이알 중의 반응액의 pH가 pH 6.8-7.2임을 pH 시험지로 확인하였다. pH 확인 후, 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 후, PD-10 컬럼을 20 mL의 5 mg/mL 겐티신산 함유 0.25 M 아세트산나트륨(pH 5.4-5.6) 용매 교환한 후, 89Zr 표지 용액을 PD-10 컬럼(GE 헬스 케어)에 붙였다. 1.5 mL의 5 mg/mL 겐티신산 함유 0.25 M 아세트산 나트륨(pH 5.4-5.6)을 넣고 용출액을 폐기하였다. 2 mL의 5 mg/mL 겐티신산 함유 0.25 M 아세트산 나트륨(pH 5.4-5.6)를 추가하여 용출액을 0.2 mL 씩 분취하였다. 방사능을 포함하는 분획을 모아, 한외 여과 용 원심 컬럼(Amicon Ultra, 밀리포아사 제)에 의해 농축 작업을 실시하였다. 역상 수식 실리카겔 박층 크로마토그래피(TLC)플레이트, TLC 실리카겔 60 RP-18 F254s(밀리포아)를 이용하여 50 mM EDTA(pH 5.0)을 전개 용매로 89Zr 표지 용액을 전개하였다. 전개 후 TLC 플레이트를 이미징 플레이트(후지 필름)에 노출하여, 플루오로 이미지 분석기(FLA-7000, GE 헬스 케어 사제)에서 오토 라디오그램을 취득하였다. 얻어진 오토 라디오그램의 원점의 피크 면적의 비율로부터 [89Zr] 표지 Trastuzumab(1가 또는 2가)의 방사 화학 순도(%)을 산출하였다.
4) 89Zr 표지 Trastuzumab의 투여 및 PET 영상
마우스(BALB/c-nu/nu, ♀ 13 주령)의 좌우 다리에 SK-OV-3(HER2 고발현 세포주) 및 MDA-MB-231(HER2 저발현 세포주)(모두 American Type Culture Collection에서 입수)를 이식한 담암 모델을 제조하고, PET 이미징을 하였다. PET 이미징은 상기 3)에 따라 제조한 2 종류의 [89Zr] 표지 Trastuzumab(Trastuzumab1 분자에 대하여 데페록사민 결합 펩타이드 1 분자 또는 2 분자를 수식한 것)을 사용하였다. 또한 항체 분자 내에 데페록사민를 1 분자 가지는 것을 [89Zr] 표지 Trastuzumab-1, 2 분자 가지는 것을 [89Zr] 표지 Trastuzumab-2로 하였다.
[89Zr] 표지 Trastuzumab-1 용액 또는 [89Zr] 표지 Trastuzumab-2 용액을 모델 꼬리 정맥에서 투여하였다. 투여 후 6 시간 이후부터 PET 카메라(제품명 : Clairvivo(등록 상표) PET)의 촬영을 실시하였다. 그 후, 투여 후 24 시간 및 48 시간의 시점으로 촬영을 실시하였다. PET 영상의 재구성법은 3D-DRAMA 법을 사용 하였다.
표 7은 생체 내(in vivo) 실험에 사용된 모델의 상세 및 투여한 [89Zr] 표지 Trastuzumab-1, 89Zr 표지 Trastuzumab-2의 정보를 정리하였다.
투여한 방사성 약제
 [89Zr]표지
Trastuzumab-1		 [89Zr]표지
Trastuzumab-2
Trastuzumab한 분자에 대한
DTPA 결합 펩타이드의 수식수		 1 2
동물(성별) BALB/c nu/nu 마우스(♀)
주령 13주령
체중 18.8g 20.0g
종양체적(SK-OV-3) 150.8mm3 88.7mm3
종양체적(MDA-MB-231) 55.2mm3 116.2mm3
투여방사능량 1.84MBq 4.28MBq
방사화학적순도 100% 100%
표 8에 각 시간 점에서 촬영 시간을 나타낸다. 각 시간 점의 촬영 시간 설정은 각 표지체의 투여량 및 방사능의 감쇠를 고려하였다.
6시간 24시간 48시간
[89Zr]표지Trastuzumab-1 30분 30분 60분
[89Zr]표지Trastuzumab-2 15분 15분 30분
<결과>[89Zr] 표지 Trastuzumab-1 및 [89Zr] 표지 Trastuzumab-2를 각각 투여 후 6, 24 및 48 시간에 촬영한 PET 상영을, 종양을 포함 슬라이스 영상으로서 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타낸대로, [89Zr] 표지 Trastuzumab-1 및 [89Zr] 표지 Trastuzumab-2는 HER2 발현이 종양 조직과 비교하여, HER2 고발현 종양 조직에 높은 집적을 인정하였다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드는 방사성 금속 핵종으로 용이하게 결합시킬 수 있기 때문에, 방사성 금속 핵종에 의해 IgG를 특이적이고 간편하게, 그 기능을 손상시키지 않고 표지할 수 있다. 방사성 금속 핵종에 의해 표지된 IgG는, 암 진단에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
<110> Kagoshima University <120> Site-specific RI labelled antibody with an IgG binding peptide <130> PH-6993-PCT <150> JP 2016-117395 <151> 2016-06-13 <150> JP 2016-227025 <151> 2016-11-22 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 1 Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 2 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, 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Ala Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 20 Asp Cys Ser Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 21 Asp Cys Thr Trp Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 22 Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 26 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 27 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Arg Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 28 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asp Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 29 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Ile Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 30 <211> 110 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 30 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is homocysteine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is homocysteine <400> 31 Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa 1 5 10 15 His <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 32 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <400> 33 Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <400> 34 Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 35 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is homocysteine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is homocysteine <400> 36 Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa 1 5 10 15 His <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <400> 37 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His

Claims (24)

  1. 하기의 1) 내지 3) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 13~17 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드로서,
    상기 펩타이드는 상기 Xaa1에 가교되는 가교제를 통해 인간 IgG와 결합 가능하며, 방사성 금속 핵종과 결합할 수 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 펩타이드:
    1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT (서열 번호 1)
    2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열 번호 2)
    3) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH (서열 번호 13)
    (여기서 Xaa1은 리신 잔기이다)
  2. 하기의 1) 내지 3) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 13~17 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드로서,
    상기 펩타이드는 상기 Xaa1에 가교되는 가교제를 통해 인간 IgG와 결합 가능하며, 방사성 금속 핵종으로 표지된 것을 특징으로 하는, 펩타이드:
    1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT (서열 번호 1)
    2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열 번호 2)
    3) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH (서열 번호 13)
    (여기서 Xaa1은 리신 잔기이다)
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 방사성 금속 핵종은 111In, 89Zr, 64Cu, 67/68Ga, 및 99mTc로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 방사성 금속 핵종은 리간드를 통해 펩타이드에 결합하고 있는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    상기 리간드는 N 말단에 연결되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  6. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    상기 리간드는 킬레이트제인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 킬레이트제는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 데페록사민, 1,4,7,10- 테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA), 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA) 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 방사성 금속 핵종과 리간드의 조합은 111In과 DTPA, 89Zr과 데페록사민, 및 64Cu과 DOTA 또는 NOTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 펩타이드는 외측의 2개의 시스테인(C) 잔기 사이에 디설파이드 결합을 형성하거나 또는 펩타이드의 외측의 2 개의 시스테인 잔기 중의 설파이드기가 이하의 식 :
    [화학식 1]
    Figure pat00006

    으로 나타내지는 링커에 의해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 펩타이드에 있어서 N 말단이 PEG화 및/또는 C 말단이 아미드화되어 있는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 펩타이드는 Xaa1이 가교제를 통해 가교화되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,,
    상기 가교제는 DSG(디숙신이미딜글루타레이트), DSS(디숙신이미딜수버레이트), DMA(아디프이미드산 디메틸이염산염), DMP(피멜리미드산 디메틸이염산염), DMS(수버리미드산 디메틸이염산염), DTBP(3,3'- 디티오비스프로피온아미드산 디메틸이염산염) 및 DSP(디티오비스숙신이미딜 프로피온산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 가교제는 DSG(디숙신이미딜글루타레이트) 또는 DSS(디숙신이미딜수버레이트)인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 펩타이드는 GPDCAYHKGELVWCTFH(서열번호 37, 분자 내의 2개의 Cys(C)는 SS 결합을 형성)의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  15. 제11항에 기재된 펩타이드와 IgG의 가교 반응에 의해 형성되는, 펩타이드와 IgG의 복합체.
  16. 제15항에 있어서,
    방사성 금속 핵종은 리간드를 통해 상기 펩타이드의 N 말단에 연결되는 것을 특징으로 하는, 복합체.
  17. 제16항에 있어서,
    리간드는 DOTA인 것을 특징으로 하는, 복합체.
  18. 제16항에 있어서,
    리간드를 통한 방사성 금속 핵종에 의한 펩티드의 N-말단의 변형은 아지드기와 디벤조시클로옥틴(dibenzocyclooctyne)의 반응에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 복합체.
  19. 제16항에 있어서,
    펩타이드의 N 말단이 1 내지 50 분자의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 의해 PEG 화되는 것을 특징으로 하는, 복합체.
  20. 제16항에 있어서,
    IgG 단일 분자에 결합하는 상기 펩타이드의 수는 1 인 것을 특징으로 하는, 복합체.
  21. 제16항에 있어서,
    IgG 단일 분자에 결합하는 상기 펩타이드의 수는 2 인 것을 특징으로 하는, 복합체.
  22. 제16항에 있어서,
    IgG는 항 HER2 인간 IgG 항체인 것을 특징으로 하는, 복합체.
  23. 제16항에 있어서,
    상기 IgG는 세툭시맙인 것을 특징으로 하는, 복합체.
  24. 방사성 금속 핵종이 펩타이드에 결합된 제2항에 기재된 펩타이드를 포함하는, 핵의학 영상 진단제.

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