CN101070350A

CN101070350A - 针对cd13的靶向肽与力达霉素构成的强化融合蛋白ngr－ldp－ae

Info

Publication number: CN101070350A
Application number: CNA2007101072702A
Authority: CN
Inventors: 郑艳波; 甄永苏; 尚伯杨; 刘秀筠; 吴淑英
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2007-05-25
Filing date: 2007-05-25
Publication date: 2007-11-14
Anticipated expiration: 2027-05-25
Also published as: WO2008145013A1; WO2008145013A8; CN101070350B

Abstract

本发明涉及一种强化融合蛋白NGR－LDP－AE，它由CD13靶向肽NGR和力达霉素辅基蛋白LDP形成的融合蛋白NGR－LDP及与LDP结合的活化型烯二炔发色团AE构成，主要通过DNA重组技术制备融合蛋白NGR－LDP和分子强化技术组装发色团AE制备而成，体外能与表达CD13的肿瘤细胞结合，对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，体内对小鼠移植性肝癌H22有非常显著的疗效，使用可耐受剂量，抑瘤率达94.8％，显著高于力达霉素，是迄今为止构建的最小的以力达霉素为“弹头”的靶向药物，可望成为一种小型化、高效化的靶向抗肿瘤药物。

Description

针对CD13的靶向肽与力达霉素构成的强化融合蛋白NGR-LDP-AE

技术领域：

本发明涉及一种强化的基因工程融合蛋白NGR-LDP-AE、其制备方法及其在制备抗肿瘤靶向药物中的应用。

背景技术：

近年来，随着美罗华(Rituxan)、赫赛汀(Herceptin)等靶向抗癌药物的问世，靶向治疗已成为肿瘤治疗的新理念和新手段。与传统的化疗药物相比，靶向药物能选择性地杀伤肿瘤细胞，降低毒副作用，提高疗效。靶向药物一般由能与肿瘤部位特异受体结合的靶向分子和能杀伤细胞的“弹头”药物构成。小型化、高效化已成为靶向药物的发展趋势。

肿瘤靶向肽是一类能与肿瘤部位特异受体结合的寡肽。与抗体及其片段相比，这类靶向性寡肽分子量更小，免疫原性更弱，不易引起人体对外源抗体的反应。NGR(Asn-Gly-Arg)肽是Arap等通过体内噬菌体文库筛选技术获得的肿瘤靶向肽，能与肿瘤新生血管内皮细胞表达的CD13异构体特异结合。CD13即氨肽酶N(aminopeptidase N，APN；EC 3.4.11.2)，是一种分子量约为150kDa的跨膜糖蛋白(糖基化程度不同，分子量亦有差异，并形成不同异构体)，具有金属蛋白酶活性，催化多肽氨基端氨基酸尤其是中性氨基酸的水解。CD13在多种组织的细胞表面均有表达，肿瘤新生血管内皮细胞表达的CD13是正常组织CD13的异构体。CD13在肿瘤血管内皮细胞中的高表达，能促进新生血管的形成，其作用机理可能与CD13的氨肽酶活性降解细胞外基质、促进内皮细胞的侵袭及调节某些生长因子和细胞因子的活性有关(Int J Cancer，1993，54：137-43)。某些肿瘤细胞如乳腺癌细胞、人黑色素瘤细胞等CD13也呈高表达，这些高表达的细胞可能也是NGR肽的靶向位点。NGR肽虽具有靶向性，但其自身并无细胞毒作用，将NGR肽与高效的“弹头”药物偶联，才能真正发挥其靶向杀伤的效果。Arap等将NGR肽与阿霉素偶联，明显提高了阿霉素的抗肿瘤作用，降低了毒性。

力达霉素(lidamycin，LDM，又称C-1027)是本所从我国湖北省潜江县土壤分离得到的一株放线菌(Streptomyces globisporus C-1027，菌种保藏号：CGMCCNo.0704)产生的大分子抗肿瘤抗生素。力达霉素由两部分构成：一是含9元烯二炔结构的活性发色团(active enediyne，AE，相对分子质量为843Da)，具有很强的细胞毒作用，但不稳定；一是含110个氨基酸的酸性辅基蛋白(lidaprotein，LDP，相对分子质量为10 506 Da)，对发色团起保护作用。发色团和辅基蛋白以非共价键结合，二者可以拆分和重建。力达霉素对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，动物体内试验表明，力达霉素对移植性小鼠结肠癌26以及移植于裸鼠的人肝癌Bel-7402和盲肠癌Hce-8693等有显著疗效(中国抗生素杂志，1994，19：164-8)。分子药理学研究表明，其主要作用机制是引起特异DNA断裂，从而诱导细胞凋亡。由于力达霉素具有很强的细胞毒作用，在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也有杀伤作用，致使动物耐受剂量受到限制。然而正是由于其很强的细胞毒作用，力达霉素可用作制备靶向药物的高效“弹头”药物。

迄今为止，尚未见有CD13靶向肽NGR与力达霉素构成的强化融合蛋白NGR-LDP-AE及其作为靶向抗肿瘤药物的相关报道。本发明的目的是，提供一种CD13靶向肽NGR与力达霉素的强化融合蛋白NGR-LDP-AE及其制备方法和在肿瘤靶向治疗中的应用。

发明内容：

本发明提供的强化融合蛋白NGR-LDP-AE，是由CD13靶向肽NGR、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组氨酸六聚体尾构成的融合蛋白NGR-LDP(分子量约为12.1kDa)及活化型烯二炔发色团AE(分子量843Da)构成的，NGR-LDP基因全长441bp，编码146个氨基酸，其中氨基端的信号肽序列共22个氨基酸，在目的蛋白分泌到周质腔的过程中被切除。

本发明还提供了所说强化融合蛋白的制备方法。NGR-LDP-AE主要通过DNA重组技术制备NGR与LDP的融合蛋白NGR-LDP，再通过分子强化技术组装发色团AE制备而成。具体步骤包括：

CD13靶向肽NGR与力达霉素辅基蛋白LDP融合基因的克隆；

融合蛋白大肠杆菌重组表达质粒pET30sngrldp的构建；

融合蛋白NGR-LDP在大肠杆菌BL21 Star^TM(DE3)中的表达；

融合蛋白NGR-LDP的亲和层析纯化；

强化融合蛋白NGR-LDP-AE的制备分离。

本发明还提供了所说强化融合蛋白的生物学活性试验如下：

融合蛋白NGR-LDP结合活性分析；

强化融合蛋白NGR-LDP-AE对肿瘤细胞的细胞毒作用检测；

强化融合蛋白NGR-LDP-AE的动物试验性治疗方案。

本发明的优点与积极效果在于，所说强化融合蛋白NGR-LDP-AE作为抗肿瘤靶向药物，其靶向序列只有5个氨基酸CNGRC构成，分子量小，免疫原性弱，其受体为肿瘤血管内皮细胞特异表达的CD13异构体，靶向性好，药物易于到达肿瘤部位；而力达霉素具有强烈的细胞毒作用，是高效的“弹头”药物。因此，本发明所说的强化融合蛋白NGR-LDP-AE有望成为一种新型小型化高效化的靶向抗肿瘤药物，具有良好的临床应用前景。

附图说明：

图1：PCR扩增sngrldp基因

其中：1-DNA分子量标准(DL 2000)；2-PCR扩增得到的sngrldp片段。

图2：重组T载体酶切及PCR鉴定

其中：1-pGMTsngrldp；2-pGMTsngrldp/Nde I+Xho I；

3-PCR，引物T7/a； 4-PCR，引物T7/b；

5-DNA分子量标准(DL 2000)。

图3：重组质粒pET30sngrldp限制性内切酶分析

其中：1-DNA分子量标准(DL 2000)； 2-pET30sngrldp/Nde I+Xho I；

3-pET30sngrldp； 4-DNA分子量标准(DL 15 000)。

图4：NGR-LDP在大肠杆菌中诱导表达的SDS-PAGE分析

其中：1-低分子量蛋白质标准；

2-转化菌诱导后发酵液上清部分；3-转化菌诱导前发酵液上清部分；

4-空菌诱导后发酵液上清部分； 5-空菌诱导前发酵液上清部分。

图5：表达产物定位的SDS-PAGE分析

其中：1-低分子量蛋白质标准；

2-发酵液上清总蛋白； 3-周质腔蛋白；

4-胞质可溶部分； 5-胞质不可溶部分。

图6：表达产物鉴定和定位的Western-blot分析

其中：1-发酵液上清总蛋白； 2-周质腔蛋白；

3-胞质可溶部分； 4-胞质不可溶部分。

图7：融合蛋白经硫酸铵沉淀和金属螯合层析纯化后的SDS-PAGE分析

其中：1-低分子量蛋白质标准； 2-亲和层析纯化后的样品；

3-发酵液上清总蛋白； 4-硫酸铵沉淀后的总蛋白。

图8：ELISA检测NGR-LDP对人纤维肉瘤HT-1080细胞和人乳腺癌MCF-7细胞的结合活性

其中：

HT-1080

MCF-7

图9：ELISA检测NGR-LDP和rLDP对人纤维肉瘤HT-1080细胞的结合活性

其中：

NGR-LDP

rLDP

图10：竞争性ELISA检测NGR肽对NGR-LDP与人纤维肉瘤HT-1080细胞结合的影响

图11：MTT检测NGR-LDP-AE、LDM和NGR-LDP对人纤维肉瘤HT-1080细胞的细胞毒作用

其中： LDM

NGR-LDP-AE

NGR-LDP

图12：MTT检测NGR-LDP-AE、LDM和NGR-LDP对人乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒作用

其中： LDM

NGR-LDP-AE

NGR-LDP

图13：强化融合蛋白NGR-LDP-AE对小鼠皮下移植性肝癌H22的生长抑制作用

其中：

对照 NGR-LDP-AE 0.2mg/kg组

NGR-LDP 2.0mg/kg组

NGR-LDP-AE 0.4mg/kg组

LDM 0.05mg/kg组

NGR-LDP-AE 0.8mg/kg组

具体实施方式：

以下所举实施例，对于本发明而言只是说明性的，而非限制性的。

<实施例1.>融合蛋白NGR-LDP表达质粒的构建

上游引物a：5′-GGAATTC CATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGG

Nde I

TCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCCATGGCCTGCAACGGCC

GTTGCGGCGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGT-3’

下游引物b：5′-GTTA CTCGAGGCCGAAGGTCAGAGCCACGTG-3’

Xho I

以a、b为引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，以含LDP基因的质粒pEFL(专利申请号：03150240，公开号：1475506)为模板，按常规PCR条件进行扩增，得到长约0.4kb的含信号肽、NGR肽和LDP编码序列的sngrldp片段(图1)，引物序列中含信号肽和NGR肽编码序列，同时在sngrldp两侧引入Nde I/Xho I酶切位点。将此片段连接到T载体(天根生化科技有限公司pGM-T vector)中得pGMTsngrldp，转化E.coli DH5α，蓝白斑筛选，经PCR和双酶切验证阳性克隆(图2)，以T7启动子为引物测序(北京华大基因研究中心测序)。

将pGMTsngrldp进行Nde I/Xho I双酶切，酶切片段连接到经同样酶切的pET-30a(+)(Novagen公司产品)载体中，连接产物转化E.coli DH5α，37℃培养后挑取单克隆，小量培养后提取质粒，进行Nde I/Xho I双酶切鉴定(图3)，以T7启动子为引物测序(北京华大基因研究中心测序，见序列表)。将重组的含sngrldp基因的质粒命名为pET30sngrldp。本发明使用的pET-30a(+)，在其多克隆位点的3’端融合有一段编码组氨酸六聚体尾的序列，经翻译表达后，His6-Tag便于融合蛋白的表达鉴定和分离纯化。

<实施例2.> 融合蛋白NGR-LDP在大肠杆菌中的表达

将构建好的pET30sngrldp质粒转化大肠杆菌BL21 Star^TM(DE3)(Invitrogen公司产品)，挑选单克隆，少量培养OD₆₀₀至0.8，加入0.05mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导8小时。取少量培养基离心，上清三氯乙酸沉淀后，15％SDS-PAGE检测目的蛋白的表达(图4)。然后分别从培养基上清、细胞周质腔、胞浆可溶和不可溶部分中制备样品，进行SDS-PAGE分析(图5)，并进行Western-blot鉴定(图6)，确认目的蛋白的定位。结果显示，在培养基上清、细胞周质腔和胞浆可溶部分中均有目的蛋白存在，胞浆不可溶部分含信号肽未切除的目的蛋白前体。由于提取细胞周质腔和胞浆蛋白易混入前体蛋白，故只提取发酵液中的蛋白。将表达NGR-LDP的菌株命名为CAMS/NGRLDP，并送交中国微生物菌种保臧管理委员会普通微生物中心保臧，保藏编号：CGMCCNo.2010。

<实施例3.>融合蛋白NGR-LDP的亲和层析纯化

菌体发酵液4℃，10 000g离心10分钟，收集上清。以390g/L的浓度在4℃，缓慢搅拌的条件下加入硫酸铵。4℃静止放置半小时，4℃，10 000g离心20分钟，收集沉淀。每100ml发酵液所得的沉淀用2ml 1×Ni-NTA Bind Buffer(300mM NaCl，50mM NaH₂PO₄，10mM咪唑，pH 8.0)溶解后用相同溶液透析。将Ni-NTA His·Bind树脂(Novagen)装入层析柱中，用约5倍体积1×Ni-NTA BindBuffer平衡，直至A₂₈₀回到基线附近且稳定，流速不超过2ml/分钟。将透析后的样品用0.45μm的滤膜过滤后缓慢加入层析柱中，用5-10倍柱床体积的1×Ni-NTA Bind Buffer洗涤层析柱，直至A₂₈₀稳定，收集流出液，流速0.5-1ml/分钟。用5-10倍柱床体积的1×Ni-NTA Wash Buffer(300mM NaCl，50mMNaH₂PO₄，20mM咪唑，pH 8.0)洗涤层析柱，直至A₂₈₀稳定，收集流出液。用5倍柱床体积的1×Ni-NTA Elution Buffer(300mM NaCl，50mM NaH₂PO₄，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱结合到层析柱上的目的蛋白，根据A₂₈₀收集洗脱成份，进行SDS-PAGE分析(图7)。将含目的蛋白的洗脱液PBS(pH 7.4)透析，超滤浓缩得高浓度目的蛋白。蛋白定量显示每升发酵液可获得纯度在95％以上的目的蛋白约10mg。

<实施例4.>强化融合蛋白NGR-LDP-AE的制备分离

取力达霉素冻干品10mg，加入5ml冷甲醇振摇5分钟，-20℃放置1小时，中间振荡一次；在0℃，12 000rpm离心20分钟，上清液中含发色团，沉淀物为辅基蛋白，重复提取2次。自然蒸发浓缩甲醇溶液，上述操作需4℃低温、避光进行。取一定体积和浓度的融合蛋白溶于0.01mol/L磷酸盐(pH 7.0)缓冲液中，加入发色团，融合蛋白和发色团的分子比1∶5，体积比50∶1，室温摇床缓慢振摇12小时进行分子组装，将反应液以PD-10(Sephadex G-25柱，Pharmacia产品)层析分离，经280nm紫外检测后收集强化融合蛋白NGR-LDP-AE，弃过量未结合的发色团。

<实施例5.>融合蛋白NGR-LDP的结合活性检测

取对数生长期的肿瘤细胞，按2×10⁴个细胞/井的密度接种于96井培养板，37℃培养24小时后，加4℃预冷的0.05％戊二醛50μl/井，于4℃固定细胞15分钟。1％的BSA封闭后，每孔加入倍比稀释的融合蛋白，37℃孵育1-2小时后，先后用His-Tag抗体(Novagen公司产品)为一抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG(SantaCruz公司产品)为二抗孵育，每孔加入100μl OPD反应底物显色，酶标仪测定492nm处吸光值。竞争性ELISA检测时每孔加入50μM NGR-LDP，再分别加入0.2mM和1mM的游离NGR肽与之竞争。结果表明，NGR-LDP与表达CD13的人纤维肉瘤HT-1080细胞和人乳腺癌MCF-7细胞均有较强的结合(图8)，而重组的不含NGR肽的力达霉素辅基蛋白(rLDP)基本没有结合(图9)。游离的NGR肽对NGR-LDP与HT-1080细胞的结合有明显抑制作用，0.2mM的NGR肽抑制率约为40.6％，1mM的NGR肽抑制率约为73.7％(图10)。以上结果说明，融合蛋白NGR-LDP中的结合序列为NGR，且结合位点与游离的NGR肽相同，融合蛋白中的LDP序列并未影响NGR序列与靶位点的结合。

<实施例6.>强化融合蛋白NGR-LDP-AE对肿瘤细胞的细胞毒作用检测

取对数生长期的细胞消化计数，3000个细胞/井铺于96井板，在37℃含5％CO₂的培养箱中培养24小时后，加入不同浓度的药物，每个药物浓度设3个平行井。继续培养48小时后，每井加入以PBS溶解的MTT(5mg/ml)20μl，37℃继续培养4小时后，吸弃上清，加入150μl二甲基亚砜，室温下摇床振摇15分钟，酶标仪上测定570nm的光吸收值A。每次实验均设无药对照井和无细胞空白井各3井。按下列公式计算细胞的存活率及样品的IC₅₀值：

结果表明，强化融合蛋白NGR-LDP-AE对人纤维肉瘤HT-1080细胞和人乳腺癌MCF-7细胞作用48小时的IC₅₀值分别为1.94×10^-9M和2.67×10^-9M，LDM为1.08×10^-10M和2.44×10^-10M，而未经强化的融合蛋白NGR-LDP对两种细胞均无杀伤作用(图11、图12)。与力达霉素相比，强化融合蛋白NGR-LDP-AE的体外细胞毒作用有所下降。

<实施例7.> 强化融合蛋白NGR-LDP-AE的动物试验性治疗方案。

根据剂量初筛结果，设计动物试验治疗的给药方式和剂量。取体重为18g-22g的昆明小鼠60只，随机分6组，每组10只。实验第0天，取小鼠肝癌H22腹水，以生理盐水稀释成细胞数为7.5×10⁶/ml，按0.2ml/只接种于昆明小鼠腋窝皮下。接种后3天和10天分别给于生理盐水、力达霉素、NGR-LDP以及三个剂量组的NGR-LDP-AE，尾静脉注射，0.2ml/只。实验期间每3-4天测量一次肿瘤长径a和与之垂直的短径b，并记录动物体重。以公式V＝1/2ab²计算瘤体积和抑制率(对照组瘤体积-试验组瘤体积)/对照组瘤体积×100％)。

实验结果表明，强化融合蛋白NGR-LDP-AE体内有显著疗效(图13)，在0.8mg/kg、0.4mg/kg和0.2mg/kg剂量时，能显著抑制H22皮下瘤的生长；实验第16天，0.8mg/kg的NGR-LDP-AE抑瘤率达94.8％，显著高于0.05mg/kg(耐受剂量)的游离力达霉素(66.9％)(表1)。

表1.强化融合蛋白对小鼠肝癌H22的生长抑制作用(实验第16天)

^**P＜0.01 vs.LDM ^##P＜0.01vs.对照

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>针对CD13的靶向肽与力达霉素构成的强化融合蛋白NGR-LDP-AE

<160>2

<210>1

<211>441

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)…(66)

<223>

<400>1

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcc 60

atggcctgca acggccgttg cggcgcgccc gccttctccg tcagtcccgc ctcgggtctg 120

agtgacggac agagcgtgtc ggtgtcggtc agcggtgccg ccgccggcga gacctactac 180

atcgcccagt gcgctccggt cggtggccag gacgcgtgca acccggcgac cgcgacgtcc 240

ttcaccacgg acgcgtccgg agcggcgtcg ttcagcttcg tcgtgcgcaa gtcgtacacg 330

ggctccacgc ccgaaggcac gccggtcggc agcgtcgact gcgccacggc cgcctgtaac 360

ctcggcgccg gcaactccgg gctcgacctc ggccacgtgg ctctgacctt cggcctcgag 420

caccaccacc accaccactg a 441

<210>2

<211>146

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>SIGNAL

<222>(-22)...(-1)

<223>

<400>2

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu

-20 -15 -10

Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Cys Asn Gly Arg Cys Gly Ala Pro

-5 -1 1 5

Ala Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser Asp Gly Gln Ser

10 15 20

Val Ser Val Ser Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr Tyr Tyr

25 30 35

Ile Ala Gln Cys Ala Pro Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys Asn Pro

40 45 50

Ala Thr Ala Thr Ser Phe Thr Thr Asp Ala Ser Gly Ala Ala Ser

55 60 65

Phe Ser Phe Val Val Arg Lys Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Pro Glu

70 75 80

Gly Thr Pro Val Gly Ser Val Asp Cys Ala Thr Ala Ala Cys Asn

85 90 95

Leu Gly Ala Gly Asn Ser Gly Leu Asp Leu Gly His Val Ala Leu

100 105 110

Thr Phe Gly Leu Glu His His His His His His

115 120

Claims

1.一种强化融合蛋白NGR-LDP-AE，其特征在于它由CD13靶向肽NGR和力达霉素辅基蛋白LDP形成的融合蛋白NGR-LDP(分子量12.1kDa)及与LDP结合的活化型烯二炔发色团AE(分子量843Da)构成，NGR-LDP基因全长441bp，编码146个氨基酸。

2.如权利要求1所述的强化融合蛋白NGR-LDP-AE，其特征在于其中NGR基因长15bp，编码5个氨基酸；NGR前的信号肽基因长66bp，编码22个氨基酸，在蛋白质分泌到周质腔时被切除；LDP基因长330bp，编码110个氨基酸；NGR基因和LDP基因间以3bp序列相连，编码1个氨基酸；羧基末端的组氨酸六聚体基因长18bp，编码6个氨基酸；组氨酸六聚体标签与LDP基因间的Xho I酶切位点长6bp，编码2个氨基酸；终止密码子3bp。

3.一种制备如权利要求1所述强化融合蛋白NGR-LDP-AE的方法，其特征在于所说方法主要采用DNA重组和分子强化技术路线，具体步骤如下：

A.CD13靶向肽NGR与力达霉素辅基蛋白LDP融合基因sngrldp的克隆；

B.融合蛋白大肠杆菌重组表达质粒pET30sngrldp的构建；

C.融合蛋白NGR-LDP在保藏编号为CGMCC No.2010的大肠杆菌CAMS/NGRLDP中的诱导表达；

D.融合蛋白NGR-LDP的纯化；

E.强化融合蛋白NGR-LDP-AE的制备及分离。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤A中以含LDP基因的质粒为模板，PCR扩增得到sngrldp基因，引物序列中含信号肽和NGR肽编码序列，同时在sngrldp两侧引入Nde I和Xho I酶切位点，将扩增得到的sngrldp基因克隆到T载体中得到pGMTsngrldp。

5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征是将pGMTsngrldp经Nde I和Xho I双酶切后得到的sngrldp片段，克隆到经同样双酶切的pET-30a(+)载体中，构建重组表达质粒pET30sngrldp。

6.如权利要求3或5所述的制备方法，其特征是将pET30sngrldp转入大肠杆菌BL21 Star^TM(DE3)中，经IPTG诱导获得分泌表达的融合蛋白NGR-LDP。

7.如权利要求3或6所述的制备方法，其特征是通过硫酸铵沉淀和亲和层析，分离纯化融合蛋白NGR-LDP，再进行透析、浓缩，制备高纯度融合蛋白。

8.如权利要求3或7所述的制备方法，其特征是将纯化得到的融合蛋白NGR-LDP与经甲醇提取制备的力达霉素活性发色团AE，按分子比1∶5，室温下强化12小时组装发色团，PD-10柱层析去除多余发色团，获得强化融合蛋白NGR-LDP-AE。

9.强化融合蛋白NGR-LDP-AE在制备新型抗肿瘤靶向药物中的应用。