JP2020527034A - 皮膚透過促進用ペプチドが結合された融合タンパク質を含む皮膚改善用化粧料組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、皮膚透過促進用ペプチドが結合された融合タンパク質を含む皮膚改善用化粧料組成物に関し、より具体的には、本発明は、皮膚透過促進用ペプチドにＰＤＧＦａが結合された融合タンパク質、上記融合タンパク質を含む皮膚改善用化粧料組成物、皮膚改善用機能性化粧品、脱毛改善用化粧料組成物及び前記融合タンパク質を含む医薬部外品組成物に関する。

Description

本発明は、皮膚透過促進用ペプチドが結合された融合タンパク質を含む皮膚改善用化粧料組成物に関し、より具体的に、本発明は、皮膚透過促進用ペプチドに生理活性タンパク質が結合された融合タンパク質、上記融合タンパク質を含む皮膚改善用化粧料組成物、皮膚改善用機能性化粧品、脱毛改善用化粧料組成物及び上記融合タンパク質を含む医薬部外品組成物に関する。

皮膚を通過する薬物は、使用の利便性により鎮痛パッチ、禁煙パッチ、妊娠調節剤などとして使用されており、皮膚を通じて体循環系（systemic circulation）に伝達しようとする目的を有する。これと共にアトピー治療剤、美白、しわ改善用化粧品など、皮膚自体の器官に伝達しようとする目的を有する場合もある。このような利便性と機能性を有する目標にもかかわらず、皮膚の構造上、薬物の伝達の困難さを有するが、これは皮膚の構造を見ると理解することができる。約１０〜１５層の角質細胞（corneocyte）からなる皮膚の角質層は、ケラチンが豊富な角質細胞で構成されているブリック（brick）の構造と、このような角質細胞間をセラミド（ceramide）、脂肪酸（fatty acid）、またはワックス（wax）などのような脂質が満たされたモルタル（mortar）構造で構成されており、約１０〜４５ｕｍ程度の厚さを成している。このような構造は、内部の水分の損失を防ぎ、外部からの侵入を防ぐ役割をする。したがって、その役割に忠実に物質透過性が非常に低いが、５００Ｄａ以下の低分子構造成分のみが拡散方式により皮膚内に伝達される（Exp. Dermatol., 2000, 9, 165-9.（非特許文献１））。これは、モルタル構造の細胞内脂質層や、脂質層間の水溶性構造を通じて行われ、物質透過性は、薬物の性質によって大きく左右される（Current Drug Delivery、2005、2、23-3（非特許文献２））。また、皮膚の表面を直接通過する方式以外に、皮膚の汗腺、毛孔、皮脂腺などの構造を利用して伝達されることもある。

このような理由から、分子の大きさや性質に関係なく、皮膚を透過することができ、皮膚の全体に均等に伝達する方法を開発しようとする研究が活発に進められた。

例えば、米国特許第７，６５９，２５２号（特許文献１）には、皮膚疾患の治療及び薬学的活性剤製の皮膚透過促進に使用できる皮膚透過性ペプチドが開示されている。

上記ペプチドは、優れた皮膚透過度を示すだけでなく、他の薬物の経皮伝達用担体としても使用することができるという利点があるが、皮膚を透過した後は、体内の循環システムを通じて消費されるため、皮膚を目標とする薬物の場合には、それほど効果を発揮できないという欠点があった。

このような欠点は、コラーゲン合成、内皮細胞の成長またはヒアルロン酸の生成を促進し、しわ改善効果を示す様々な有効成分が正常に皮膚を通じて吸収されないことが主な原因として知られているため、上記有効成分の吸収を促進させる方法を開発しようとする研究が活発に進められた。たとえば、韓国登録特許第１０５４５１９号（特許文献２）には、天然のヒト成長ホルモンと比較して安定性及び皮膚透過度が優れたヒト成長ホルモン由来ペプチド及びこれを含む組成物が開示されており、韓国登録特許第１１０４２２３号（特許文献３）には、ヒトＩＬ−１０の機能と同様な機能を果たし、天然ＩＬ−１０と比較して安定性及び皮膚透過度が非常に優れたＩＬ−１０由来のペプチド及びこれを含む組成物が開示されているが、これらのペプチドは、それ自体で機能性を示すだけで、他の薬物の伝達用担体として使用することができないという欠点があった。このような欠点は、皮膚透過性に優れている特性だけでは薬物の伝達に使用することができないということを示唆していると分析されたため、皮膚透過性に優れているだけでなく、皮膚残留性を向上させる二つの属性を含む新たな物質の開発が要求されたが、まだ特別な研究結果が報告されていないのが実情である。

米国特許第7,659,252号 韓国登録特許第1054519号 韓国登録特許第1104223号 US2010-0021510A1

Exp. Dermatol., 2000, 9, 165-9. Current Drug Delivery、2005、2、23-3 Sambrook et al.,supra、9.50-9.51、11.7-11.8 J. Sambrook et al.,Molecular Cloning、A Laboratory Manual、2nd Edition、Cold Spring Harbor Laboratory press、 Cold Spring Harbor、New York、1989 FM Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley&Sons、Inc.、New York ABI User’s Manual.Jan、1992 Introduction to Cleavage Techniques、P6-19(1990)

このような背景の下で、本発明者らは、皮膚透過性に優れているだけでなく、皮膚残留性に優れた二つの特性を含む新たな物質を開発すべく鋭意研究努力した結果、薬物の経皮伝達用担体として使用することができ、かつ皮膚に長く残留する皮膚透過促進用ペプチドを開発し、上記皮膚透過促進用ペプチドに生理活性タンパク質を融合させた融合タンパク質は、皮膚透過性に優れているだけでなく、皮膚残留性を向上させる特性をもいずれも示すことを確認し、本発明を完成した。

本発明の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、皮膚透過促進用ペプチド及び生理活性タンパク質を含む融合タンパク質を提供することにある。

本発明の他の一つの目的は、上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、上記融合タンパク質を有効成分として含む皮膚改善用化粧料組成物を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、上記化粧料組成物を有効成分として含む皮膚改善用機能性化粧品を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、上記融合タンパク質を有効成分として含む脱毛改善用化粧料組成物を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、上記融合タンパク質を有効成分として含む皮膚改善用医薬部外品組成物を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、上記融合タンパク質を有効成分として含む脱毛改善用医薬部外品組成物を提供することにある。

本発明の融合タンパク質は、生理活性タンパク質に皮膚透過促進用ペプチドが結合され、しわの改善などの有用な効果を示すペプチドの能力が維持または向上しながらも、同時に皮膚透過性と皮膚残留性を顕著に向上させるため、皮膚改善用化粧料組成物、皮膚改善用機能性化粧品、脱毛改善用化粧料組成物、皮膚改善用医薬部外品組成物または脱毛改善用医薬部外品組成物の有効成分として広く活用されることができるものである。

本明細書に添付される次の図面は、本発明の好適な実施例を例示するものであり、前述した発明の内容と共に、本発明の技術思想をさらに理解させる役割をするので、本発明は、そのような図面に記載された事項のみに限定されて解釈されてはならない。
Argireline（登録商標）(Acetyl-EEMQRR配列番号２）及び神経伝達物質放出調節融合タンパク質（配列番号３２）の筋収縮抑制効果を確認した結果を示す。 人体を対象にArgireline（登録商標）(Acetyl-EEMQRR）及び神経伝達物質放出調節融合ペプチド含有クリームのしわ改善効果を確認した結果を示したグラフである。

本発明の目的を達成するための一つの様態として、配列番号１のアミノ酸配列を含む、皮膚透過促進用ペプチドが生理活性タンパク質に結合された融合タンパク質を提供する。

本発明で使用された上記配列番号１のアミノ酸配列は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に応じて、次のように略語で記載した。

皮膚透過促進用ペプチド：ＮＧＳＬＮＴＨＬＡＰＩＬ（配列番号１）

具体的には、Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ（アスパラギン）Ａｓｎ Ｎ−Ｇｌｙｃｉｎｅ（グリシン）Ｇｌｙ ＧＳｅｒｉｎｅ（セリン）Ｓｅｒ Ｓ−Ｌｅｕｃｉｎｅ（ロイシン）Ｌｅｕ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ（アスパラギン）Ａｓｎ ＮＴｈｒｅｏｎｉｎｅ（スレオニン）Ｔｈｒ Ｔ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ（ヒスチジン）Ｈｉｓ Ｈ−Ｌｅｕｃｉｎｅ（ロイシン）Ｌｅｕ ＬＡｌａｎｉｎｅ（アラニン）Ａｌａ Ａ−Ｐｒｏｌｉｎｅ（プロリン）Ｐｒｏ Ｐ−Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ（イソロイシン）Ｉｌｅ ＩＬｅｕｃｉｎｅ（ロイシン）Ｌｅｕ Ｌで表すことができる。

上記ペプチドと結合された神経伝達物質放出調節ペプチド、血小板由来成長因子ａサブユニット（ＰＤＧＦａ）、内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）またはチモシンベータ４（Ｔβ４）は、皮膚透過性であり、皮膚残留性を有するものとして使用することができる。

本発明において、「皮膚透過促進用ペプチド」とは、分子の大きさや性質に関係なく皮膚を透過することができ、皮膚の全体に均等に伝達することができ、皮膚透過性及び皮膚残留性に優れたペプチドを意味する。

本発明の上記融合タンパク質において、上記生理活性タンパク質の皮膚透過性及び皮膚残留性が増大されたものであってもよい。

本発明において、「皮膚透過性」とは、ペプチドが皮膚を透過して皮膚の内部に浸透する能力または性質を意味し、本発明の皮膚透過促進用ペプチドは、他のペプチドに比べて顕著に優れた皮膚透過性を示す。

本発明において、「皮膚残留性」とは、皮膚を透過したペプチドが皮膚組織を通過して循環系に伝達されず、皮膚内の組織に結合されて皮膚内で残留する能力を意味する。皮膚組織を標的組織とする薬学的製剤または化粧料の場合には、上記ペプチドと結合された成分が皮膚組織または皮膚細胞に長期間作用できるように、皮膚組織に残留する特性に優れた担体を使用することが望ましい。

本発明の皮膚透過促進用ペプチドは、皮膚透過性だけでなく、皮膚残留性が顕著に優れているため、薬学的製剤または化粧料の担体として使用することができる。

本発明の皮膚透過促進用ペプチドは、ファージライブラリと経皮製剤の溶出試験方法を組み合わせたファージディスプレイ法を行って発掘された、皮膚透過性と皮膚残留性に優れたペプチドを含むことができ、具体的には、配列番号１のアミノ酸列を含むペプチドを含むことができる。本発明の一実施例では、ファージディスプレイ法を通じて皮膚透過促進用ペプチドとして配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを製造した（実施例１）。

本発明において、用語「生理活性タンパク質」とは、治療学的効果のために使用されるすべてのタンパク質を含む。

好ましくは、本発明において生理活性タンパク質は、生体の機能（生理）を調節するタンパク質を総称し、生理活性ポリペプチドとも呼ばれる。本発明の生理活性タンパク質は、皮膚に処理できるタンパク質であれば制限がなく、上記生理活性ポリペプチドの天然型と実質的に同等または増加した機能、構造、活性または安定性を有する限り、任意の誘導体または誘導体も、本発明の生理活性タンパク質の範囲に含まれる。

より好ましくは、上記生理活性タンパク質は、神経伝達物質放出調節ペプチド、血小板由来成長因子ａサブユニット（ＰＤＧＦａ）、内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）またはチモシンベータ４（Ｔβ４）であってもよい。

本発明において、「神経伝達物質」とは、脳をはじめとして体内の神経細胞から放出されて隣接している神経細胞などに情報を伝達する一連の物質であり、１つのニューロンから別の「標的」ニューロンにシナプスを横切って信号を伝達する内因性の化学物質である。神経伝達物質は、シナプスのシナプス前の部分で軸索末端の膜の下に群集化したシナプス小胞にパッケージ化された後、シナプス間隙内に放出され、シナプス間隙を横切って発散されるが、この時、神経伝達物質は、シナプスのシナプス後の部分で膜の特異的受容体に結合される。本発明の神経伝達物質は、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミン、アセチルコリン、アドレナリン、ノルアドレナリン、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｌ−グルタミン酸、グリシンなどを含むことができるが、これに限定されるものではない。

また、本発明において、「神経伝達物質放出調節ペプチド」とは、神経伝達物質が神経伝達物質の受容体に伝達されることを遮断して筋収縮効果を抑制することができ、しわ改善効果を示すペプチドを意味する。より具体的には、筋肉を動かすためには、神経伝達物質が神経細胞から筋細胞にシナプスを通じて伝達されなければならないが、シナプスから神経伝達物質であるアセチルコリンが分泌されるためには、神経細胞の末端からスネア複合体（ＳＮＡＲＥ Ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成されてシナプスに放出される過程が必要である。一般に知られているボトックスはスネア複合体を形成する成分（ＳＮＡＰ−２５）を破壊し、アセチルコリンがシナプスに放出されないようにする。一方、ボトックス様ペプチドは、スネア複合体の構成成分（ＳＮＡＰ−２５）の一部と類似した構造を有しており、ＳＮＡＰ−２５の代わりに複合体の構成過程に関与してアセチルコリンが放出される過程を防ぐ役割をする。

本発明の神経伝達物質放出調節ペプチドは、業界で広く知られているものを使用することができ、ペプチドの種類に特に制限されない。天然ペプチドだけでなく、化学的に合成されたペプチドも含むことができる。また、しわの改善効果を有することが知られているペプチドのペプチド誘導体も、本発明の範囲に含むことができる。

具体的には、上記神経伝達物質放出調節ペプチドは、Ａｒｇｉｒｅｌｉｎｅ（登録商標）（Ａｃｅｔｙｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（Ａｃｅｔｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ、配列番号２）、Ｉｎｆｉｎｉｔｅｃ社のＸ５０ Ｍｙｏｃｅｐｔ（登録商標）、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ−５２（［Ｐａｌ］−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（［Ｐａｌ］ ＤＤＭＱＲＲ配列番号３）、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｈｅｐｔａｐｅｐｔｉｄｅ−１８（［Ｐａｌ］−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（［Ｐａｌ］ ＹＰＷＴＱＲＦ配列番号４））、ＧＡＢＡ（γ−ａｍｉｎｏ ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、ボツリヌストキシン（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）、またはこれらの混合物群から選択されたいずれか一つ以上のペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。

また、本発明の神経伝達物質放出調節ペプチドは、下記化学式（１）で示されるペプチド、その異性体、ラセミ化合物、その化粧学的または薬学的に許容可能な塩を含むことができる。

化学式（１）
Ｒ_１−ＡＡ−Ｒ_２ ・・・・（１）

上記化学式（１）において、ＡＡは３−４０のアミノ酸を含むアミノ酸配列であってもよく、Ｒ_１は、ＨまたはＣ_３〜Ｃ_２４のアルキル、アリール、またはアシルグループの中から選択されたいずれかであってもよく；

上記化学式（１）のペプチドのＲ_１は、炭素数３〜２４のアシル基であってもよく、上記アシル基は飽和（saturated）または不飽和（unsaturated）であってもよく、線状（linear）、分岐状（branched）または環状（cyclic）であってもよい。

具体的には、上記のＲ_１は、化学式ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＯ−のアシル基であり、ｍは１〜２２から選択されたいずれか一つであってもよく、より具体的には、上記Ｒ１は、分子量２００〜３５，０００Ｄａであるポリエチレングリコールポリマーであってもよいが、これに限定されない。

また、上記ＡＡはＭＡＥＤＡＤＭＲＮＥＬＥＥＭＱＲＲＡＤＱＬ（配列番号５）、ＡＤＥＳＬＥＳＴＲＲＭＬＱＬＶＥＥＳＫＤＡＧＩ（配列番号６）、ＥＬＥＥＭＱＲＲＡＤＱＬＡ（配列番号７）、ＥＬＥＥＭＱＲＲＡＤＱＬ（配列番号８）、ＥＬＥＥＭＱＲＲＡＤＱ（配列番号９）、ＥＬＥＥＭＱＲＲＡＤ（配列番号１０）、ＥＬＥＥＭＱＲＲＡ（配列番号１１）、ＥＬＥＥＭＱＲＲ（配列番号１２）、ＬＥＥＭＱＲＲＡＤＱＬ（配列番号１３）、ＬＥＥＭＱＲＲＡＤＱ（配列番号１４）、ＬＥＥＭＱＲＲＡＤ（配列番号１５）、ＬＥＥＭＱＲＲＡ（配列番号１６）、ＬＥＥＭＱＲＲ（配列番号１７）、ＥＥＭＱＲＲＡＤＱＬ（配列番号１８）、ＥＥＭＱＲＲＡＤＱ（配列番号１９）、ＥＥＭＱＲＲＡＤ（配列番号２０）、ＥＥＭＱＲＲＡ（配列番号２１）、ＥＥＭＱＲＲ（配列番号２２）、ＬＥＳＴＲＲＭＬＱＬＶＥＥ（配列番号２３）、ＮＫＤＭＫＥＡＥＫＮＬＴ（配列番号２４）、ＫＮＬＴＤＬ（配列番号２５）、ＩＭＥＫＡＤＳＮＫＴＲＩＤＥＡＮＱＲＡＴＫＭＬＧＳＧ（配列番号２６）、ＳＮＫＴＲＩＤＥＡＮＱＲＡＴＫＭＬＧＳＧ（配列番号２７）、ＴＲＩＤＥＡＮＱＲＡＴＫＭＬＧＳＧ（配列番号２８）、ＤＥＡＮＱＲＡＴＫＭＬＧＳＧ（配列番号２９）、ＮＱＲＡＴＫＭＬＧＳＧ（配列番号３０）及びＱＲＡＴＫＭＬＧＳＧ（配列番号３１）からなる群から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を含むことができる。また、上記ＡＡは、ＳＮＡＰ−２５タンパク質のアミノ及びカルボキシ基のドメインに由来したアミノ酸配列を含むことができる。

また、上記化学式（１）のペプチドのＲ_２は、Ｃ_１〜Ｃ_２４のアリファチック（aliphatic）またはサイクリック（cyclic）基は置換されていないか、アミノ基、ヒドロキシル基またはチオール基から選択されたいずれか一つ以上で置換することができる。

具体的には、上記化学式（１）のＲ_１及びＲ_２の置換基は、ＵＳ２０１０−００２１５１０Ａ１（特許文献４）に公知された例を用いることができ、上記ＵＳ２０１０−００２１５１０Ａ１の内容全体は本明細書に含まれる。上記化学式１の化合物は、ＵＳ２０１０−００２１５１０Ａ１に公知された例を用いることができる。

本発明の一実施例において、神経伝達物質放出調節ペプチドであるＡｃｅｔｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ＤＤＭＱＲＲ、及びＰａｌｍｉｔｏｙｌ−ＹＰＷＴＱＲＦを単独で使用する場合より配列番号１の皮膚透過促進用ペプチドと融合して使用する場合、ＳＮＡＲＥの形成を直接抑制し、神経細胞内のＣａ^２＋イオンの流入を遮断し、間接的にＳＮＡＲＥの形成を抑制することができ、共に使用するとき、より優れた皮膚しわの減少効果が得られることを確認した。

本発明において、「血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor; PDGF)」とは、二つのペプチド鎖からなる低分子量の塩基性タンパク質であり、平滑筋細胞、線維芽細胞及び血管壁のような間葉由来細胞の増殖を促進することを意味する。

「血小板由来成長因子サブユニットａ（ＰＤＧＦａ）」とは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の系列に属するタンパク質の一つであり、血液中の血小板に含有されており、約１８ｋＤａのサイズを有するタンパク質を意味する。血小板に存在するＰＤＧＦは、約１４ｋＤａのサイズを有するサブユニットｂと、上記サブユニットａで構成されるが、これらはジスルフィド結合を通じて同型二量体であるＰＤＧＦ−ＡＡまたはＰＤＧＦ−ＢＢを形成したり、異形二量体であるＰＤＧＦ−ＡＢを形成することが知られている。

本発明において、ＰＤＧＦａはコラーゲンの生成またはエラスチンの生成を増大させる効果などにより、損傷した皮膚の再生、毛髪の再生及び成長を促進する効果を示す限り、そのアミノ酸配列は特に制限されないが、上記ＰＤＧＦａの全体アミノ酸配列を使用することもでき、その変異されたアミノ酸配列を使用することもでき、その一部断片を使用することもできる。上記ＰＤＧＦａの具体的なアミノ酸配列またはそれをコードする遺伝子の塩基配列情報は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなど公知のデータベースから取得することができる。上記ＰＤＧＦａは、具体的には、配列番号３５のアミノ酸配列で表示されるペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、「血管内皮細胞成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ； ＶＥＧＦ）」とは、シグナル伝達タンパク質の一種であり、脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に重要な役割をすることを意味する。ＶＥＧＦは、血液の循環が不十分な場合、組織に酸素を貯蔵、供給するシステムの一部として機能するが、ＶＥＧＦの一般的な機能は、胚芽発達、負傷または運動後の筋肉、梗塞された血管を迂回する血管の形成などの過程で新たな血管を生成することである。しかし、増加された量のＶＥＧＦは、非正常的な血管新生を引き起こすことができる。

血管新生において重要な役割をするＶＥＧＦは、主に血管内皮を構成する細胞に影響を与える。試験管内（in vitro）の結果によると、ＶＥＧＦは血管内皮細胞の分裂及び遊走を刺激し、微細血管透過性を高める。ＶＥＧＦは、哺乳類においてＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＰｌＧＦ（placenta growth factor）の５種類に分類される。ＶＥＧＦＡは血管新生、血管内皮細胞の遊走、分裂、血管内腔の形成、大食細胞及び顆粒細胞（granulocyte）の走化性、血管拡張などを促進し、ＶＥＧＦ−Ｂは、胚芽の血管新生、特に心筋組織の形成を促進する。ＶＥＧＦ−Ｃはリンパ管形成（Lymphangiogenesis）を促進し、ＶＥＧＦ−Ｄは、肺細気管支を取り巻くリンパ管の発達に必要である。ＰｌＧＦは、脈管形成（Vasculogenesis）、虚血（ischemia）、炎症、傷の回復、癌における血管新生に重要な役割を果たす。

本発明において、ＶＥＧＦは血管新生誘導、表皮細胞の増殖、細胞移動の促進、微細血管水溶性の増加などにより、損傷した皮膚の再生、毛髪の再生及び成長を促進する効果を示す限り、そのアミノ酸配列は特に制限されないが、上記ＶＥＧＦの全体アミノ酸配列を使用することもでき、その変異されたアミノ酸配列を使用することもでき、その一部断片を使用することもできる。上記ＶＥＧＦの具体的なアミノ酸配列またはそれをコードする遺伝子の塩基配列情報は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなど公知のデータベースから取得することができる。上記ＶＥＧＦは、具体的には、配列番号３８のアミノ酸配列で表示されるペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。

さらに、ＶＥＧＦは、複数の位置におけるスプライシング（splicing）によりＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１２１など、様々な長さの形態（isoform）で存在することができ、代表的な形態であるＶＥＧＦ−１６５の場合、サイズが約１９．２ｋＤａである。ＶＥＧＦは、ジスルフィド結合を通じて同型二量体をなして存在するか、他の成長因子タンパク質であるＰＩＧＦと異形二量体をなして存在することもできる。

本発明において、「インスリン様成長因子（Insulin-like growth factor; IGF)」とは、シグナル伝達タンパク質の一種であり、インスリンと構造が類似する分子量７，５００のポリペプチドからなる成長因子を意味する。インスリン様成長因子は、血清中でインスリンと類似した作用をするが、インスリン抗体により抑制されていない物質であり、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２の構造が知られている。ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２はいずれもＡ〜Ｄの４種類のポリペプチド鎖で構成されており、軟骨細胞の増殖やタンパク質の生合成で成長ホルモンの作用を媒介することに加えて、インスリンと類似した生理作用をする。

また、ＩＧＦ−１は、大きさが約７．６ｋＤａであり、単量体としてインスリン様成長因子受容体に結合して細胞内のメカニズムを操作することができる。

本発明において、ＩＧＦ−１は、角質細胞成長の促進を通じて損傷した皮膚の再生、毛髪の再生及び成長を促進する効果を示す限り、そのアミノ酸配列は、特に制限されないが、上記ＩＧＦ−１の全アミノ酸配列を使用することもでき、その変異されたアミノ酸配列を使用することもでき、その一部断片を使用することもできる。

上記ＩＧＦ−１の具体的なアミノ酸配列またはそれをコードする遺伝子の塩基配列情報は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなど公知のデータベースから取得することができる。上記ＩＧＦ−１は、具体的には、配列番号４１のアミノ酸配列で表示されるペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、「角質細胞成長因子（keratinocyte growth factor; KGF)」とは、シグナル伝達タンパク質の一種であり、上皮を形成するために角質細胞が傷を覆う段階である傷修復の上皮形成段階で示される。

ＫＧＦタンパク質はＦＧＦ７遺伝子により暗号化されるが、これは線維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor; FGF）ファミリーに属する。ＦＧＦファミリーは、広範な類似分裂または細胞生存活性を有しており、これは胚芽発達、細胞成長、形態形成、組織治癒、癌の成長及び浸透を含む様々な生物学的過程に関連している。ＫＧＦは、強力な上皮細胞特異的成長因子であり、このような類似分裂活性は、角質細胞で主に示され、線維芽細胞や内皮細胞では示されない。ＫＧＦは線維芽細胞成長因子受容体２ｂ（ＦＣＦＲ２ｂ）と結合して信号伝達が進行され、ＦＧＦ１０は「角質細胞成長因子２」として知られている。

本発明において、ＫＧＦは傷修復に核心的な成長因子であり、皮膚細胞の成長を促進して皮膚を回復させたり、毛包内の細胞の増殖を促進し、脱毛を予防する効能を示す限り、そのアミノ酸配列は、特に制限されないが、上記ＫＧＦの全体アミノ酸配列を使用することもでき、その変異されたアミノ酸配列を使用することもでき、その一部断片を使用することもできる。上記ＫＧＦの具体的なアミノ酸配列またはそれをコードする遺伝子の塩基配列情報は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなど公知のデータベースから取得することができる。上記ＫＧＦは、具体的には、配列番号４４のアミノ酸配列で表示されるペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、「チモシンベータ４（Thymosin beta 4;Tβ4)」とは、胸腺の抽出物として最初に発見され、４３個のアミノ酸で構成され、分子量が５ＫＤａで比較的小さいタンパク質であり、赤血球を除いたほぼすべての細胞に存在している。上記Ｔβ４は本来アクチンを調節するタンパク質であり、Ｇ−アクチンに結合してアクチンの重合体の合成を抑制し、内皮細胞の分化及び移動し、血管新生を誘導することが知られていたが、最近では、創傷治癒に効果的に作用し、心筋細胞の再生に優れた効果を示すことが報告されている。

本発明において、Ｔβ４は、細胞の分裂、分化及び移動機序を調律する役割を果たし、血管新生の誘導、表皮細胞の増殖、細胞移動の促進、微細血管水溶性の増加などにより、損傷した皮膚の再生、毛髪の再生及び成長を促進する効能を示す限り、そのアミノ酸配列は、特に制限されないが、上記Ｔβ４の全体アミノ酸配列を使用することもでき、その変異されたアミノ酸配列を使用することもでき、その一部断片を使用することもできる。上記Ｔβ４の具体的なアミノ酸配列またはそれをコードする遺伝子の塩基配列情報は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなど公知のデータベースから取得することができる。上記Ｔβ４は、具体的には、配列番号４７のアミノ酸配列で表示されるペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。

さらに、Ｔβ４はＹ誘電体とＸ誘電体ｑ．２１．３−ｑ．２２に遺伝子が位置しており、この両遺伝子は、相同遺伝子として４４のアミノ酸のうちの３つだけ異なる程度に配列が非常に類似している。本発明の実施例では、Ｘ誘電体配列をもとに融合タンパク質を作製したが、必ずしもＸ染色体上のＴβ４のみに限定されず、Ｙ誘電体上のＴβ４でも融合タンパク質の作製が可能である。

本発明において、「融合タンパク質」とは、上記皮膚透過促進用ペプチドが他のタンパク質またはペプチドに結合されるように人為的に合成されたペプチドであり、具体的には、上記皮膚透過促進用ペプチド及び上記神経伝達物質放出調節ペプチド、血小板由来成長因子ａサブユニット（ＰＤＧＦａ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）及びチモシンベータ４（Ｔβ４）からなる群から選択されたいずれか一つを含むことができる。より具体的には、上記皮膚透過促進用ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよく、上記神経伝達物質放出調節ペプチドは、配列番号２〜３１からなる群から選択されたいずれか一つ以上のペプチド、具体的には、配列番号２、３、４のペプチドであるか、上記化学式１で示されるペプチド、その異性体、ラセミ化合物、その化粧学的または薬学的に許容可能な塩などを含むことができる。より具体的には、上記融合ペプチドは、配列番号３２、３３、３４、及びボツリヌストキシン＋配列番号１の融合ペプチドを含むことができる。また、上記血小板由来成長因子ａサブユニット（ＰＤＧＦａ）は配列番号３５のアミノ酸配列を含むことができ、内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むことができ、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むことができ、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むことができ、上記チモシンベータ４（Ｔβ４）は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むことができるが、これに限定されない。

上記融合タンパク質は、これに含まれる各ドメインの野生型のアミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が異なる配列を有するペプチドを含むことができる。分子の活性を全体的に変更させないペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野において公知となっている。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。また、アミノ酸配列上の変異または修飾によりタンパク質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加したり、タンパク質の活性が増加したタンパク質を含むことができる。

上記融合タンパク質または上記融合タンパク質を構成するタンパク質は、当該分野において公知となった化学的タンパク質合成方法で製造したり、上記融合タンパク質をコードする遺伝子をＰＣＲ（polymerase chain reaction）により増幅したり、公知の方法で合成した後、発現ベクターにクローニング（cloning）して発現させて製造することができる。

本発明の融合タンパク質は、上記皮膚透過促進用ペプチド及び上記生理活性タンパク質との間にリンカーペプチドを含むことができる。具体的には、上記融合タンパク質は、上記皮膚透過促進用ペプチドが上記生理活性タンパク質のＮ末端に直接連結することもでき、リンカー（Linker）を通じて融合連結することもできる。

上記リンカーは、具体的には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニン酸などのアミノ酸を使用して連結させることができ、より具体的には、バリン、ロイシン、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、プロリンなどのアミノ酸を複数使用して連結させることができ、より具体的には、遺伝子操作の容易性を考慮してグリシン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸などのアミノ酸を１つから５つずつ連結して使用することができる。例えば、上記皮膚透過促進用ペプチドのＣ末端と生理活性タンパク質のＮ末端を、二つのペプチド（ＧＧ）で構成されたリンカーを通じて連結させて融合タンパク質を製造することができる。

具体的には、本発明の融合タンパク質は、配列番号３２〜３４、３６、３９、４２、４５、及び４８からなる群から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドであってもよいが、これに限定されない。

本発明の他の一つの様態として、上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

上記ポリヌクレオチドは、上記融合タンパク質と類似した活性を有する限り、配列番号３２〜３４、３６、３９、４２、４５及び４８からなる群から選択されたいずれか一つの配列で記載されるアミノ酸配列、または上記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができるが、これに制限されるものではない。また、コドン縮退性（codon degeneracy）により上記配列番号３２〜３４、３６、３９、４２、４５及び４８からなる群から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質またはその相同性を有するタンパク質に翻訳され得るポリヌクレオチドも含まれることは自明である。または公知の遺伝子配列から調製することができるプローブ、例えば、上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件の下でハイブリッド化し、配列番号３２〜３４、３６、３９、４２、４５及び４８からなる群から選択されたいずれか一つの配列のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列であれば、制限なく含むことができる。

具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３７、４０、４３、４６、及び４９からなる群から選択されるいずれか一つの塩基配列を含むことができるが、これに限定されない。

上記「厳しい条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al., ）に具体的に記載されている。例えば、相同性が高い遺伝子同士、８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性を有する遺伝子同士ハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士ハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を列挙することができる。

混成化は、たとえ混成化の厳密度に応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であるとしても、二つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」とは、互いに混成化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明は、また、実質的に類似した核酸配列だけでなく、全体の配列に相補的な単離された核酸断片を含むことができる。

具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を使用し、上述した条件を使用して探知することができる。

また、上記Ｔｍ値は６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに限定されるものではなく、その目的に応じて、当業者により適切に調節されてもよい。

ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野においてよく知られている（Sambrook et al.,supra、9.50-9.51、11.7-11.8（非特許文献３）を参照）。

本発明において、用語、「相同性」とは、二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの一部（moiety）との間の同一性のパーセントをいう。与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示される。本明細書において、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一または類似した活性を有するその相同性配列が「％相同性」と表示される。一部から他の一部までの配列間の相同性は知られている当該技術により決定されてもよい。例えば、スコア（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）などの媒介変数（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を計算する標準ソフトウェア、具体的には、ＢＬＡＳＴ ２．０を利用したり、定義された厳格な条件の下でサザン混成化実験により配列を比較することにより確認することができ、定義される適切な混成化条件は、当該技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、J. Sambrook et al.,Molecular Cloning、A Laboratory Manual、2nd Edition、Cold Spring Harbor Laboratory press、 Cold Spring Harbor、New York、1989（非特許文献４）; FM Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley&Sons、Inc.、New York（非特許文献５））で決定されてもよい。

本発明で使用される用語「ベクター」とは、適切な宿主内で目的のポリペプチドを発現させることができるように、適切な調節配列に作動可能に連結された上記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。

上記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合することができる。

本発明で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを使用することができる。本発明で使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターを使用することができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＰＩＣ、ｐＧＡＰベクターなどを使用することができ、大腸菌、乳酸菌、バチルス菌などのバクテリア及び酵母で発現されるベクターなどを含むことができる。

一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを通じて染色体内に目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドで交換することができる。上記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えにより行うことがあるが、これに限定されない。

本発明において、用語「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で上記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現させるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できさえすれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体の外に位置するかに関係なく、これらをいずれも含むことができる。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（CaPO₄）沈殿、塩化カルシウム（CaCl₂）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などがあるが、これに限定されない。また、上記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態で導入されても構わない。例えば、上記ポリヌクレオチドは、自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。上記発現カセットは、通常、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含むことができる。上記発現カセットは、自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。

また、上記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。

上記において用語「作動可能に連結された」とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と上記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。

本発明の他の一つの様態として、上記融合タンパク質を有効成分として含む皮膚改善用化粧料組成物を提供する。

具体的には、本発明の上記融合タンパク質を有効成分として含む皮膚しわ改善または皮膚弾力性増進用化粧料組成物を提供することができる。

本発明における「皮膚弾力性増進」または「皮膚しわの改善」とは、皮膚が張りがなくなったり弛んだ程度を緩和させること、または皮膚にしわが生成することを抑制または阻害したり、すでに生成されたしわを緩和させることであり、皮膚表皮の細胞間の結果、真皮の結合組織に分布するコラーゲンまたはヒアルロン酸の量が増加するにつれて、皮膚弾力性が維持され、それに応じてしわの生成が緩和されることをいう。

上記用語、コラーゲン（collagen）」とは、１０００以上のアミノ酸分子が集まったものであり、ヒドロキシプロリンの含量が多いタンパク質を意味する。コラーゲン分子三つが三重らせん状にねじれたコラーゲン繊維は、皮膚を堅くし、弾力性があるように維持させる役割をする。また、コラーゲンは皮膚、血管、骨、歯、筋肉など、すべての結合組織の主なタンパク質であり、コラーゲンは、皮膚弾力性に関与することが知られている。

上記用語、「ヒアルロン酸（hyaluronic acid）」とは、グリコサミノグリカン（glycosaminoglycans）の一種であり、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミン残基が繰り返して連結されている鎖状の高分子多糖類物質である。多量の水と結合してゲルを作る性質があり、高粘度と弾性を有する。また、ヒアルロン酸は、細胞外基質の主要成分であり、水分保持、細胞間間隔の維持、細胞成長因子及び栄養成分の貯蔵と拡散に関与するだけでなく、細胞の分裂と分化、移動などにも関与することが知られている。

具体的な一実施例によると、上記神経伝達物質放出調節ペプチドとしてＡｒｇｉｒｅｌｉｎｅ（登録商標）、（Ａｃｅｔｙｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｃｅｔｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ）配列番号２）、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ−５２（［Ｐａｌ］−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（［Ｐａｌ］ ＤＤＭＱＲＲ配列番号３）、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｈｅｐｔａｐｅｐｔｉｄｅ−１８（［Ｐａｌ］−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（［Ｐａｌ］ ＹＰＷＴＱＲＦ配列番号４））、ボツリヌストキシン（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）に配列番号１のアミノ酸配列を含む皮膚透過促進ペプチドを結合して融合ペプチドを製造（配列番号３２、３３、３４、及びボツリヌストキシン＋配列番号１）し、上記製造された融合タンパク質の効果を従来の神経伝達物質放出調節ペプチドと比較した結果、しわ改善効果も優れることを確認した（図１）。

具体的な一実施例によると、本発明の皮膚弾力性及び皮膚しわの改善などの効果を確認するために融合タンパク質がコラーゲン及びヒアルロン酸の生成に及ぼす効果を確認した。ヒト由来真皮線維芽細胞にＰＤＧＦａ及び融合タンパク質（Ｔ−ＰＤＧＦａ）を添加して培養した結果、対照群に比べてＴ−ＰＤＧＦａもＰＤＧＦａと同等レベルのコラーゲン及びヒアルロン酸の生成効能を有していることを確認した（表４及び５）。

具体的な一実施例によると、本発明の皮膚弾力性及び皮膚しわの改善などの効果を確認するために融合タンパク質がヒアルロン酸の生成に及ぼす効果を確認した。ヒト由来真皮線維芽細胞にＶＥＧＦ及び融合タンパク質（Ｔ−ＶＥＧＦ）を添加して培養した結果、対照群に比べてＴ−ＶＥＧＦもＶＥＧＦと同等レベルのヒアルロン酸の生成効能を有していることを確認した（表９）。

また、具体的な一実施例によると、本発明の皮膚弾力性及び皮膚しわの改善などの効果を確認するために融合タンパク質がヒト臍帯静脈内皮細胞増殖に及ぼす効果を確認した。ヒト臍帯静脈内皮細胞にＶＥＧＦ及び融合タンパク質（Ｔ−ＶＥＧＦ）を添加して培養した結果、対照群に比べてＴ−ＶＥＧＦもＶＥＧＦと同等レベルの細胞増殖効果を有していることを確認した（表１０）。

具体的な一実施例によると、本発明の皮膚弾力性及び皮膚しわの改善などの効果を確認するために融合タンパク質が角質細胞の成長に及ぼす効果を確認した。皮膚角質細胞にＩＧＦ−１及び融合タンパク質（Ｔ−ＩＧＦ−１）を添加して培養した結果、対照群に比べてＴ−ＩＧＦ−１もＩＧＦ−１と同等レベルの角質細胞の成長機能を有していることを確認した（表１４）。

具体的な一実施例によると、本発明の皮膚弾力性及び皮膚しわの改善などの効果を確認するために融合タンパク質が角質細胞の成長に及ぼす効果を確認した。皮膚角質細胞にＫＧＦ及び融合タンパク質（Ｔ−ＫＧＦ）を添加して培養した結果、対照群に比べてＴ−ＫＧＦもＫＧＦと同等レベルの細胞増殖効果を有していることを確認した（表１８）。

具体的な一実施例によると、本発明の皮膚弾力性及び皮膚しわの改善などの効果を確認するために融合タンパク質がヒト臍帯静脈内皮細胞増殖に及ぼす効果を確認した。ヒト臍帯静脈内皮細胞にＴβ４及び融合タンパク質（Ｔ−Ｔβ４）を添加して培養した結果、対照群に比べてＴ−Ｔβ４もＴβ４と同等レベルの細胞増殖効果を有していることを確認した（表２２）。

これにより、生理活性タンパク質、例えば神経伝達物質放出調節ペプチド、ＰＤＧＦａ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＫＧＦまたはＴβ４に皮膚透過促進用ペプチドが融合されても生理活性タンパク質の皮膚のしわ及び弾力改善効能をそのまま有していることが認められる。

また、本発明の実施例では、上記生理活性タンパク質（神経伝達物質放出調節ペプチド、ＰＤＧＦａ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＫＧＦ及びＴβ４）に配列番号２〜４、３５、３８、４１、４４、及び４７のいずれか一つのアミノ酸配列を含む皮膚透過促進用ペプチドを結合して融合タンパク質を製造（配列番号３２〜３４、３６、３９、４２、４５、及び４８）し、上記製造された融合タンパク質の効果を、従来の生理活性タンパク質と比較した結果、皮膚透過度及び皮膚残留性が顕著に改善され、しわ改善効果も優れることを確認した（表１、２、７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、及び２５）。

従って、本発明で提供する融合タンパク質は、生理活性タンパク質に皮膚透過促進用ペプチドが結合され、損傷した皮膚及び毛髪の再生を増加させる生理活性タンパク質自体の効能を維持しながらも、皮膚透過性と皮膚残留性を顕著に向上させることができるため、化粧料組成物、機能性化粧品及び医薬部外品組成物の有効成分として有用に使用できることが認められる。

本発明の融合タンパク質は、全化粧料組成物の重量比０．０００１〜５０重量％で含まれてもよい。上記融合タンパク質の含量が全化粧料組成物の重量比０．０００１重量％未満の場合には、実質的な皮膚の改善効果を期待しにくく、５０重量％以上の場合には、製剤が不安定になるなどの問題が発生することがある。

本発明に係る化粧料組成物は、溶液、外用軟膏、クリーム、フォーム、栄養化粧水、柔軟化粧水、パック、柔軟水、乳液、メイクアップベース、エッセンス、石鹸、液体洗浄料、入浴剤、日焼け止めクリーム、サンオイル、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、ローション、パウダー、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パッチ及びスプレーで構成された群から選択される剤形で製造することができるが、これに限定されない。

また、本発明の化粧料組成物は、一般的な皮膚化粧料に配合される化粧品学的に許容可能な担体を１種以上さらに含むことができ、通常の成分として例えば、油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などを適切に配合することができるが、これに限定されない。

本発明の化粧料組成物に含まれる化粧品学的に許容可能な担体は、剤形に応じて多様である。

本発明の剤形が軟膏、ペースト、クリームまたはゲルの場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛、またはこれらの混合物が使用されてもよい。

本発明の剤形がパウダーまたはスプレーの場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、ポリアミドパウダーまたはこれらの混合物が利用されてもよく、特にスプレーの場合には、さらにクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。

本発明の剤形が溶液または乳濁液の場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用され、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイルが利用されてもよく、特に、綿実油、ピーナッツ油、コーン胚種オイル、オリーブオイル、ヒマシ油及びごま油、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルが利用されてもよい。

本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラカントなどが利用されてもよい。

本発明の剤形が石鹸の場合には、担体成分として脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステル塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イセチオン酸、ラノリン誘導体、脂肪族アルコール、植物油、グリセロール、糖などが利用されてもよい。

本発明の一実施例では、上記生理活性タンパク質に皮膚透過促進用ペプチドを結合して製造された融合タンパク質を含浸してクリームを製造し、上記クリームの皮膚改善効果を確認した結果、従来の生理活性タンパク質が含浸されたクリームに比べてしわ改善効果が２倍以上優れることを確認した（表３及び図２）。

本発明のもう一つの様態として、上記化粧料組成物を有効成分として含む皮膚改善用機能性化粧品を提供する。

また、具体的には、本発明の上記化粧料組成物を有効成分として含むしわ改善用機能性化粧品を提供することができる。上記化粧料組成物、しわの改善、及び弾力性増進は、上記で説明した通りである。

本発明において、「機能性化粧品（cosmedical、cosmeceutical）」とは、化粧品に医薬品の専門的な治療機能が導入され、一般的な化粧品とは異なり、生理活性的な効能、効果が強調された専門的な機能性を有する製品であり、皮膚の美白に役立つ製品、皮膚しわの改善に役立つ製品、皮膚をこんがりと焼いたり、紫外線から皮膚を保護するに役立つ製品の中で、保健福祉部令で定める化粧品を意味する。

本発明の機能性化粧品は、上記化粧料組成物に一般の皮膚用化粧品の製造時に使用される適切な担体を加えて製造することができる。そのときに使用される担体は、特にこれに限定されないが、具体的には、油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などを単独で、または適宜組み合わせて使用することができる。

本発明の機能性化粧品は、皮膚しわの改善効果または皮膚の弾力性増進効果を示し、その剤形は、特に制限されるものではない、例えば、溶液、乳濁液、懸濁液、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、パウダー、スプレー、界面活性剤含有クレンジング、オイル、石鹸、液体洗浄料、入浴剤、ファンデーション、メイクアップベース、エッセンス、化粧水、フォーム、パック、柔軟水、日焼け止めクリーム、サンオイルなどの剤形で製造されてもよく、具体的には、皮膚外用軟膏、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、パック、エマルジョンまたはオイルゲルの剤形に製造することができるが、そのときに使用される担体は、化粧品の剤形に応じて選択的に使用することができる。

例えば、軟膏、ペースト、クリームまたはゲルの形態の化粧品を製造する場合には、担体成分としてワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛などを単独で、または組み合わせて使用することができ；パウダーまたはスプレーの形態の化粧品を製造する場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、ポリアミドパウダー、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン、ジメチルエーテルなどを単独または組み合わせて使用することができ；溶液または乳濁液の形態の化粧品を製造する場合には、担体成分として水、エタノール、イソプロパノール、エチルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、綿実油、ピーナッツオイル、コーン胚種オイル、オリーブオイル、ヒマシ油、ゴマ油、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルなどを単独で、または組み合わせて使用することができ；懸濁液の形態の化粧品を製造する場合には、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコール、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー、トラガントなどを単独または組み合わせて使用することができ；化粧石鹸の形態の化粧品を製造する場合には、担体成分として脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステル塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イセチオン酸、ラノリン誘導体、脂肪族アルコール、植物油、グリセロール、糖などを単独で、または組み合わせて使用することができる。

具体的には、皮膚外用軟膏は、本発明の融合タンパク質に加えて、ワセリン５０〜９７重量％及びポリオキシエチレンオレイルエーテルホスフェート０．１〜５重量％を含有するように製造することができ；柔軟化粧水は、本発明の融合タンパク質に加えて、プロピレングリコールまたはグリセリンのような多価アルコール類１〜１０重量％及びポリエチレンオレイルエーテルまたはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油のような界面活性剤０．０５〜２重量％を含有するように製造することができ；栄養化粧水及び栄養クリームは、本発明の融合タンパク質に加えてスクアラン、ワセリンまたはオクチルドデカノールのようなオイル類５〜２０重量％及びセタノール、ステアリルアルコール、または蜜蝋のようなワックス成分３〜１５重量％を含有するように製造することができ；エッセンスは、本発明の融合タンパク質に加えて、グリセリンまたはプロピレングリコールのような多価アルコール類５〜３０重量％を含有するように製造することができ；マッサージクリームは、本発明の融合タンパク質に加えて流動パラフィン、ワセリンまたはイソノナン酸イソノニルのようなオイル類を３０〜７０重量％含有するように製造することができ；パックは、本発明の融合タンパク質に加えて、ポリビニルアルコールを５〜２０重量％含有するピール・オフ（peel off）パックに製造され、又は一般の乳化型化粧料にカオリン、タルク、酸化亜鉛または二酸化チタンのような顔料が５〜 ３０重量％含有されたウォッシュオフ（wash off）パックに製造することができる。

本発明のもう一つの様態として、上記融合タンパク質を有効成分として含む脱毛改善用化粧料組成物を提供する。

本発明で使用される用語「脱毛の改善」とは、遺伝的な原因、ホルモンの不均衡、社会生活の精神的ストレス、大気汚染への露出、加工食品の摂取などの様々な習慣と環境的な影響により正常に毛髪が存在すべき部位に毛髪がない状態を改善し、脱毛が進行されることを防止し、毛が生えることを意味する。

具体的な一実施例によると、本発明の融合タンパク質を処理した皮膚毛乳頭細胞（dermal papilla cell）を培養してＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて、細胞増殖量の差を定量分析した結果、対照群に比べて生理活性タンパク質と皮膚透過促進用ペプチドが結合された融合タンパク質も生理活性タンパク質と同等レベルの細胞増殖効果を有していることを確認した（表６、１１、１５、１９、及び２３）。

これにより、生理活性タンパク質に皮膚透過促進用ペプチドが融合されても生理活性タンパク質の脱毛改善効能をそのまま有していることが認められる。

上記化粧料組成物は、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、ヘアエッセンス、ヘアローション、ヘア栄養ローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアクリーム、ヘア栄養クリーム、ヘアモイスチャークリーム、ヘアマッサージクリーム、ヘアワックス、ヘアエアロゾル、ヘアパック、ヘア栄養パック、ヘアソープ、ヘアクレンジングフォーム、ヘアオイル、毛髪乾燥剤、毛髪保存処理剤、毛髪染料剤、毛髪用ウエーブ剤、毛髪脱色剤、ヘアゲル、ヘアグレーズ、ヘアドレッシング、ヘアラッカー、ヘアモイスチャライザー、ヘアムースまたはヘアスプレーの剤形で含まれてもよいが、これに限定されるものではない。

具体的には、本発明の組成物は、毛髪または頭皮に直接塗布または散布するなどの方法により使用することができる。本発明の組成物が適用される毛髪とは、頭の毛根及び毛包、髪の毛及びまつげと眉毛、ひげ、脇の下、陰毛、全身体において毛根及び毛包があるすべての部位を含む。

本発明のもう一つの様態として、上記融合タンパク質を有効成分として含む皮膚改善用医薬部外品組成物を提供する。

また、具体的には、本発明の上記融合タンパク質を有効成分として含む皮膚しわ改善または皮膚弾力性増進用医薬部外品組成物を提供することができる。

本発明のもう一つの様態として、上記融合タンパク質を有効成分として含む脱毛改善用医薬部外品組成物を提供する。

上記用語、融合タンパク質、皮膚しわの改善、皮膚弾力性増進及び脱毛の改善は、上記で説明した通りである。

本発明の医薬部外品組成物には、上記の成分以外に必要に応じて薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。上記薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤は、本発明の効果を害しない限り制限されず、例えば充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤、潤滑剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などをを含むことができる。

本発明の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤の代表的な例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マルチトール、澱粉、ゼラチン、グリセリン、アカシアゴム、アルギン酸塩、カルシウムホスフェート、カルシウム炭酸塩、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、注射可能なエステル、ウイテプゾール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂などを挙げることができる。

また、本発明の融合タンパク質を有効成分として含む組成物を医薬部外品として使用する場合、追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。例えば、皮膚の損傷の防御、弾力性増進、しわの改善及び保湿成分を含むことができる。上記成分の追加時には、複合使用による皮膚安全性、製剤化の容易性、有効成分の安定性を考慮することができる。上記医薬部外品組成物は、当業界において公知となった美白成分として、コウジ酸（Kojic acid）、アルブチン（Arbutin）などのようなチロシナーゼ酵素活性を阻害する物質、ヒドロキノン（Hydroquinone）、ビタミン−Ｃ（L-Ascorbic acid）；当業界において公知となった皮膚弾力性、しわの改善または保湿成分として、レチノイン酸、ＴＧＦ、動物胎盤由来のタンパク質、ベツリン酸及びクロレラエキス；及びこれらの誘導体と各種植物エキスからなる群から選択される１種または２種以上の成分をさらに含むことができる。追加の成分は、全体組成物の重量に対して０．０００１重量％〜５重量％で含むことができ、上記含量の範囲は、皮膚安全性、容易性などの要件に応じて調節することができる。

本発明の医薬部外品組成物は、消毒ウォッシュ、シャワーフォーム、軟膏液、ウェットティッシュ、コーティング剤などを例示することができるが、これに限定されるものではなく、医薬部外品の製剤化方法、容量、利用方法、構成成分などは、技術分野において公知となった通常の技術から適宜選択することができる。

また、本発明の上記融合タンパク質を有効成分として含む医薬部外品組成物は、個体の皮膚に塗布する段階を含む、皮膚弾力性増進、皮膚のしわ改善用、または脱毛の改善に使用することができる。上記個体はマウス、家畜、ヒトなどを含む哺乳動物を制限なく含む。

以下、実施例を通じて本発明の構成及び効果をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、ひたすら本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲が実施例により制限されるものではない。

実施例１：皮膚透過促進ペプチドの選別
皮膚透過促進ペプチドを選別するためにファージライブラリと経皮製剤の溶出試験方法を組み合わせた、ファージディスプレイ法を実施した。

まず、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ（50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl）溶液５００ｍＬ Ｐｈ．Ｄ−１２ファージライブラリキット（New England Biolab）に由来した１０^９個のファージを加えてファージ溶液を得た。

次に、Ｆｒａｎｚ ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌ（Ｓｔａｎｄａｒｄ直径９ｍｍ、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ５ｍＬ、Ｐｅｒｍｇｅａｒ）の上段と下段との間に豚皮（０．７ｍｍの厚さ、Ｍｅｄｉｋｉｎｅｔｉｃｓ）を装着した後、上段に上記ファージ溶液を加えて、１６時間反応させた後、上記豚皮を透過して下段の受容部（Receiver）に到達したファージを得て、これを増幅させた。

上記増幅は、宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８（New England Biolab）を利用して行われた。具体的には、２５ｍＬのＬＢ培地に振とう培養した大腸菌ＥＲ２７３８菌株に、上記ファージ溶液５ｍＬを加えて４時間培養した。続いて、上記培養液を８，０００Ｇで遠心分離してファージ分画が含まれている上澄液を得た。上記上澄液に６ｍＬの沈殿液（２０％ＰＥＧ６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を処理して反応させてファージを沈殿させ、上記反応液を８，０００Ｇで遠心分離してファージを沈殿させ、上記沈殿物をＴＢＳ溶液に懸濁させて増幅されたファージ溶液を得た。

このように、豚皮にファージを加え、皮膚を透過させたファージを得て、これを増幅させる過程を１回行うことを１Ｒｏｕｎｄと定義し、１Ｒｏｕｎｄで増幅されたファージをもってさらに２Ｒｏｕｎｄを進め、皮膚透過力を競合する方式で皮膚透過力が良いファージを選別し、合計３Ｒｏｕｎｄを行った。

上記３Ｒｏｕｎｄの実施結果、最終的に得られたファージに含まれているペプチドの配列を確認するために、上記ファージを含むＴＢＳ溶液を大腸菌ＥＲ２７３８株に加えて懸濁させ、上記懸濁液にＴＯＰ ａｇａｒを加えて混合した後、上記混合物をＬＢ／Ｘ−ｇａｌ／ＩＰＴＧ平板培地の上に加え固形化させた。その後、固形化された培地を１６時間培養した後、青色のコロニー（colony）を選別した。上記選別されたコロニーに由来した菌株を６時間培養し、そこからＤＮＡを得て、ファージ由来の塩基配列を解析することにより、豚皮を透過する特性を示す皮膚透過促進用ペプチド（配列番号１）を選別した。

実施例２：生理活性タンパク質に皮膚透過促進用ペプチドが結合された融合タンパク質の製造
実施例２−１：神経伝達物質放出調節ペプチドに皮膚透過促進用ペプチドが結合された融合タンパク質の製造
上記実施例１で得られた配列番号１のアミノ酸配列を有する、皮膚透過促進用ペプチドと配列番号２のアミノ酸配列を有する神経伝達物質放出調節ペプチドが結合された配列番号３２の融合タンパク質、配列番号１のアミノ酸配列を有する皮膚透過促進用ペプチドと配列番号３のアミノ酸配列を有する神経伝達物質放出調節ペプチドが結合された配列番号３３の融合タンパク質、配列番号１のアミノ酸配列を有する皮膚透過促進用ペプチドと配列番号４のアミノ酸配列を有する神経伝達物質放出調節ペプチドが結合された配列番号３４の融合タンパク質及び配列番号１のアミノ酸配列を有する皮膚透過促進用ペプチドとボツリヌストキシン（botulinum toxin）の神経伝達物質放出調節ペプチドが結合されたボツリヌストキシン＋配列番号１の融合タンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドを合成し、分離及び精製して神経伝達物質放出調節融合タンパク質を製造した。

実施例２−１−１：神経伝達物質放出調節融合ペプチドの合成
上記神経伝達物質放出調節融合タンパク質をペプチド自動合成器（Applied Biosystems Model 431A）を用いて、固相（solid phase）ペプチド合成法で合成した。

具体的には、０．２５ｍｍｏｌのパラヒドロキシフェニルオキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）レジンを標準反応容器（３８ｍＬ）に入れて、合成するペプチドのカルボキシル末端のＦｍｏｃ−アミノ酸を入れた後、合成を開始した。１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−アミノ酸が含まれているカートリッジをカルボキシル末端アミノ酸からアミノ酸末端のアミノ酸までの配列順にガイドウェイに配列した。そのとき、カートリッジの金属キャップを外して、最初と最後には、アミノ酸が含まれていない空のカートリッジを置いた。

ペプチド合成は、ＡＢＩ社で開発した標準スケールＦｍｏｃカップリングプロトコル（protocol）に基づいて施行前にパラメータを編集し、自動合成メニューにより実施した（ABI User’s Manual.Jan、1992（非特許文献６）を参照）。標準スケールＦｍｏｃを使用するときはデプロテクション（deprotection）をＮ−メチルピロリジン（ＮＭＰ）で希釈した２０％のピペリジンを使用して２１分間行い、ＮＭＰで９分間洗浄し、カップリングを７１分実施した。カップリングには、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を使用し、ＮＭＰで７分間洗浄するシステムを用いた。

実施例２−１−２：融合タンパク質の分離及び精製
上記実施例２−１−１で合成された神経伝達物質放出調節融合タンパク質を下記のような過程を経て分離及び精製した。

まず、実施例２−１−１で合成された融合タンパク質をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して固体支持体（solid support）から分離し、ＡＢＩ社のマニュアル（Introduction to Cleavage Techniques、P6-19(1990）（非特許文献７））を参考にして、上記融合ペプチドを分離した。具体的には、実施例２−１−１で合成された融合タンパク質がついたレジンを丸底フラスコに入れて冷却させた後、結晶フェノール０．７５ｇ、１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）０．２５ｍＬ、チオアニソール０．５ｍＬ 、蒸留水０．５ｍＬ、及びＴＦＡ １０ｍＬを入れ、蓋を閉じて、室温で１〜２時間反応させた。反応が終わった後、レジンと反応液をシンタード（ｓｉｎｔｅｒｅｄ）ガラス漏斗を通じて低真空で濾過し、レジンと融合タンパク質溶液を分離した。フラスコとガラス漏斗を５〜１０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗った溶液が融合タンパク質溶液と混ぜるようにし、５０ｍＬ以上の冷たいジエチルエーテルを添加して融合タンパク質の沈殿物を得た。上記沈殿物を低真空に漏斗で濾過して漏斗の上に集められた沈殿物を乾燥させた後、３０％の酢酸に溶かして凍結乾燥させた。このようにして得られた融合タンパク質をＨＰＬＣ（High Performance Liquid Chromatography）で精製した。この時、コラムはＣ１８ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｏｌｕｍｎ（Pharmacia）を使用し、緩衝溶液Ａは１０％のアセトニトリル＋ ０．０５％ＴＦＡを使用して平衡化させ、緩衝溶液Ｂは８０％のアセトニトリル＋ ０．０５％ＴＦＡを使用して融合タンパク質を溶出した。その結果、高純度に精製された神経伝達物質放出調節融合タンパク質（配列番号３２）を得、合成収率は３０±５％程度であった。

実施例２−２：血小板由来成長因子ａサブユニット（ＰＤＧＦａ）に皮膚透過促進用ペプチドが結合された融合タンパク質の製造
上記実施例１で得られた配列番号１のアミノ酸配列を有する、皮膚透過促進用ペプチドのＣ末端と配列番号３５のアミノ酸配列を有する血小板由来成長因子ａサブユニット（ＰＤＧＦａ）のＮ末端が２個のアミノ酸（ＧＧ）で構成されたリンカーを媒介として連結された形態の融合タンパク質であるＴ−ＰＤＧＦａ（配列番号３６）を生産した。

具体的には、上記配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号３５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ合成し、２個のアミノ酸（ＧＧ）をコードするヌクレオチド配列を中心に連結させて、上記配列番号３６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製した。上記収得したポリヌクレオチドをｐＰＩＣ発現ベクターに導入して発現ベクターを作製した。

上記製作された発現ベクターをＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに導入して形質転換体を得て、上記得られた形質転換体を培養した後、培養液を濾過して皮膚透過促進用ペプチド−ＶＥＧＦで構成された融合タンパク質を回収した。ＧＰＣカラムクロマトグラフィーに適用することにより、最終的に皮膚透過促進用ペプチド−ＰＤＧＦａで構成された融合タンパク質であるＴ−ＰＤＧＦａ（配列番号３６）を生産した。

実施例２−３：血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）に皮膚透過促進用ペプチドが結合された融合タンパク質の製造
上記実施例１で得られた配列番号１のアミノ酸配列を有する皮膚透過促進用ペプチドのＣ末端と配列番号３８のアミノ酸配列を有する血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）のＮ末端が２個のアミノ酸（ＧＧ）で構成されたリンカーを媒介として連結された形態の融合タンパク質であるＴ−ＶＥＧＦ（配列番号３９）を生産した。

具体的には、上記配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号３８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ合成し、２個のアミノ酸（ＧＧ）をコードするヌクレオチド配列を中心に連結させ、上記配列番号３９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製した。上記収得したポリヌクレオチドをｐＰＩＣ発現ベクターに導入して発現ベクターを作製した。

上記作製された発現ベクターをＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに導入して形質転換体を得て、上記得られた形質転換体を培養した後、培養液を濾過して皮膚透過促進用ペプチド−ＶＥＧＦで構成された融合タンパク質を回収した。ＧＰＣカラムクロマトグラフィーに適用することにより、最終的に皮膚透過促進用ペプチド−ＶＥＧＦで構成された融合タンパク質であるＴ−ＶＥＧＦ（配列番号３９）を生産した。

実施例２−４：インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ１）に皮膚透過促進用ペプチドが結合された融合タンパク質の製造
上記実施例１で得られた配列番号１のアミノ酸配列を有する皮膚透過促進用ペプチドのＣ末端と配列番号４１のアミノ酸配列を有するインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端が２個のアミノ酸（ＧＧ）で構成されたリンカーを媒介として連結された形態の融合タンパク質であるＴ−ＩＧＦ−１（配列番号４２）を生産した。

具体的には、上記配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号４１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ合成し、２個のアミノ酸（ＧＧ）をコードするヌクレオチド配列を中心に連結させ、上記配列番号４２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製した。上記収得したポリヌクレオチドをｐＰＩＣ発現ベクターに導入して発現ベクターを作製した。

上記作製された発現ベクターを Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに導入して形質転換体を得て、上記得られた形質転換体を培養した後、培養液を濾過して皮膚透過促進用ペプチド−ＶＥＧＦで構成された融合タンパク質を回収した。ＧＰＣカラムクロマトグラフィーに適用することにより、最終的に皮膚透過促進用ペプチド−ＩＧＦ−１で構成された融合タンパク質であるＴ−ＩＧＦ−１（配列番号４２）を生産した。

実施例２−５：角質細胞成長因子（ＫＧＦ）に皮膚透過促進用ペプチドが結合された融合タンパク質の製造
上記実施例１で得られた配列番号１のアミノ酸配列を有する皮膚透過促進用ペプチドのＣ末端と配列番号４４のアミノ酸配列を有する角質細胞成長因子（ＫＧＦ）のＮ末端が２個のアミノ酸（ＧＧ）で構成されたリンカーを媒介として連結された形態の融合タンパク質であるＴ−ＫＧＦ（配列番号４５）を生産した。

具体的には、上記配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号４４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ合成し、２個のアミノ酸（ＧＧ）をコードするヌクレオチド配列を中心に連結させ、上記配列番号４５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製した。上記収得したポリヌクレオチドをｐＰＩＣ発現ベクターに導入して発現ベクターを作製した。

上記作製された発現ベクターをＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに導入して形質転換体を得て、上記得られた形質転換体を培養した後、培養液を濾過して皮膚透過促進用ペプチド−ＶＥＧＦで構成された融合タンパク質を回収した。ＧＰＣカラムクロマトグラフィーに適用することにより、最終的に皮膚透過促進用ペプチド−ＫＧＦで構成された融合タンパク質であるＴ−ＫＧＦ（配列番号４５）を生産した。

実施例２−６：チモシンベータ４（Ｔβ４）に皮膚透過促進用ペプチドが結合された融合タンパク質の製造
上記実施例１で得られた配列番号１のアミノ酸配列を有する皮膚透過促進用ペプチドのＣ末端と配列番号４７のアミノ酸配列を有するチモシンベータ４（Ｔβ４）のＮ末端が２個のアミノ酸（ＧＧ）で構成されたリンカーを媒介として連結された形態の融合タンパク質であるＴ−Ｔβ４（配列番号４８）を生産した。

具体的には、上記配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号４７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ合成し、２個のアミノ酸（ＧＧ）をコードするヌクレオチド配列を中心に連結させて、上記配列番号４８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製した。上記収得したポリヌクレオチドをｐＰＩＣ発現ベクターに導入して発現ベクターを作製した。

上記作製された発現ベクターをＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに導入して形質転換体を得て、上記得られた形質転換体を培養した後、培養液を濾過して皮膚透過促進用ペプチド−ＶＥＧＦで構成された融合タンパク質を回収した。ＧＰＣカラムクロマトグラフィーに適用することにより、最終的に皮膚透過促進用ペプチド−Ｔβ４で構成された融合タンパク質であるＴ−Ｔβ４（配列番号４８）を生産した。

実施例３：融合タンパク質の効果検証
実施例３−１：神経伝達物質放出調節融合タンパク質の効果検証
上記実施例２−１で製造した神経伝達物質放出調節融合ペプチドの皮膚改善用途を確認するために下記のように筋収縮抑制効果、皮膚透過性、皮膚残留性及びしわ改善効果を確認する実験を行った。

３−１−１：神経伝達物質放出調節融合タンパク質の筋収縮抑制効果
上記実施例２−１で製造した神経伝達物質放出調節融合タンパク質の筋収縮抑制効果を確認するためには、まずＣ２Ｃ１２細胞をプレートに１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清と１％（ｖ／ｖ）の抗生物質が入ったＤＭＥＭ培地で培養した後、神経芽細胞を同じプレートに追加的に共同培養した。その後、Ｃ２Ｃ１２細胞の細胞収縮が始まるとき、３０秒間Ｃ２Ｃ１２細胞の収縮回数を測定し、培地をすべて除去した後、ＰＢＳで３回洗浄した後、子牛血清が入っていない培地と、上記融合ペプチド５０ｐｐｍを入れて２時間反応させた。その後、Ｃ２Ｃ１２細胞の収縮回数を再び３０秒間測定し、筋収縮抑制程度を確認した。

その結果、図１に示すように、皮膚透過促進ペプチドが結合されていない対照群であるＡｒｇｉｒｅｌｉｎｅ^ＴＭだけでなく、神経伝達物質放出調節融合ペプチドも神経細胞から神経伝達物質の放出を抑制し、Ｃ２Ｃ１２細胞の収縮回数を減少させることが認められた。

３−１−２：神経伝達物質放出調節融合タンパク質の皮膚透過性の確認
上記実施例２−１で製造した神経伝達物質放出調節融合タンパク質の皮膚透過性を確認するために、Ｆｒａｎｚ ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌ（Ｓｔａｎｄａｒｄ直径９ｍｍ、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ５ｍｌ、Ｐｅｒｍｅｇｅａｒ）を用いた。

具体的には、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの上段と下段との間に豚皮（０．７ｍｍの厚さ、Ｍｅｄｉｋｉｎｅｔｉｃｓ）を装着し、１％ＢＳＡと０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を準備した。その後、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの上段（Ｄｏｎｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ）には上記ＴＢＳを５００μＬ加え、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの下段（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）には上記ＴＢＳを５ｍＬ加えた。続いて、対照群ペプチド（Ａｇｉｒｅｌｌｉｎｅ^ＴＭ、［Ｐａｌ］ ＤＤＭＱＲＲ、［Ｐａｌ］ ＹＰＷＴＱＲＦ、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｏｉｄ）２μｇと神経伝達物質放出調節融合タンパク質２μｇをそれぞれ上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの上段に加え、１６時間反応させた。その後、下段に存在する対照群ペプチドまたは神経伝達物質放出調節融合タンパク質の濃度を定量分析し、対照群ペプチド含量に対する神経伝達物質放出調節融合ペプチド量の相対的な含量を透過促進量で算出し、その結果は下記表１に示した。

上記表１に示すように、神経伝達物質放出調節融合タンパク質を処理する場合、対照群より皮膚透過性が約２．８〜４，２倍に増加することを確認した。

したがって、本発明の神経伝達物質放出調節融合タンパク質を使用すると、神経伝達物質放出調節タンパク質の皮膚透過率が顕著に増加することが認められる。

３−１−３：神経伝達物質放出調節融合タンパク質の皮膚残留性の確認
上記実施例２−１で製造した神経伝達物質放出調節融合タンパク質の皮膚残留性を確認するために、Ｆｒａｎｚ ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌ（Ｓｔａｎｄａｒｄ直径９ｍｍ、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ５ｍＬ、Ｐｅｒｍｅｇｅａｒ）を用いた。

具体的には、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの上段と下段との間に豚皮（０．７ｍｍの厚さ、Ｍｅｄｉｋｉｎｅｔｉｃｓ）を装着し、それぞれ５００μＬと５ｍＬのＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）溶液に１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０を溶かした後、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの上段には、上記ＴＢＳを５００μＬ加え、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの下段には、上記ＴＢＳを５ｍＬ加えた。対照群である対照群ペプチド（Ａｇｉｒｅｌｌｉｎｅ^ＴＭ、［Ｐａｌ］ ＤＤＭＱＲＲ、［Ｐａｌ］ＹＰＷＴＱＲＦ、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｏｉｄ）と上記実施例２で製造した神経伝達物質放出調節融合タンパク質を豚皮を利用したＦｒａｎｚ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍのＤｏｎｏｒ ｃｈａｍｂｅｒに処理し、豚皮内に存在する対照群ペプチドと神経伝達物質放出調節融合タンパク質の量を測定するために豚の皮膚組織を破砕した後、ＨＰＬＣ定量を利用し、その結果は表２に示した。

上記表２に示すように、神経伝達物質放出調節融合タンパク質を処理する場合、対照群ペプチドより皮膚残留量が約６２〜９８倍に増加することを確認した。

したがって、本発明の神経伝達物質放出調節融合タンパク質を使用すると、神経伝達物質放出調節タンパク質の皮膚残留性が顕著に増加することが認められる。

３−１−４：神経伝達物質放出調節融合タンパク質のしわ改善効果の確認
上記実施例２−１で製造した神経伝達物質放出調節融合タンパク質のしわ改善効果を確認するためには、一般的な水中油型乳化剤形（oil in water emulsion）のクリームにＡｒｇｉｒｅｌｉｎｅ^ＴＭと上記神経伝達物質放出調節融合タンパク質をそれぞれ含浸してしわ改善効果を比較し、それぞれの含有クリームに含まれる成分及び含量は、下記表３の通りである。

Ａｒｇｉｒｅｌｉｎｅ^ＴＭ含有クリームと神経伝達物質放出調節融合タンパク質含有クリームを目元のしわに１２週間、毎日処理し、しわの改善程度をシリコーンレプリカ（silicone replica）及びしわ画像解析方法を通じて確認した（Ｎ＝２１）。

その結果、図２に示すように、Ａｒｇｉｒｅｌｉｎｅ^ＴＭクリームに比べて神経伝達物質放出調節融合タンパク質クリームが２倍以上の優れた改善効果を示し、これにより神経伝達物質放出調節融合タンパク質が神経伝達物質放出調節タンパク質に比べて皮膚内に効果的に浸透し、しわ改善効果が優れていることが認められた。

これは、既存の成長因子のような分子量の大きい因子に比べて神経伝達物質は、分子量が小さいため、皮膚透過促進用ペプチドを結合させた融合タンパク質の場合にも、分子量がより小さくなり、皮膚透過性及び皮膚残留性が増加し、これにより、皮膚しわの改善効果が増加することを示唆するものである。

実施例３−２：血小板由来成長因子ａサブユニットの融合タンパク質（Ｔ−ＰＤＧＦａ）の効果検証
上記実施例２−２で製造したＴ−ＰＤＧＦａの皮膚改善用途を確認するために下記のように皮膚弾力性の改善、皮膚しわの改善、脱毛の改善、皮膚透過性及び皮膚残留性の効果を確認する実験を行った。

実施例３−２−１：コラーゲン生成効果の検定
上記実施例２−２で合成されたＴ−ＰＤＧＦａをＰＤＧＦａと比較してコラーゲンの生成に及ぼす効果を検証した。

具体的には、真皮線維芽細胞（dermal fibroblast）を２４ウェルプレートに接種し、２４時間培養して７０〜８０％の飽和度を示す培養物を得た。上記培養物をＰＢＳで洗浄した後、１０ｎｇ／ｍｌのＴ−ＰＤＧＦａまたはＰＤＧＦａが含まれている無血清ＤＭＥＭ培地で２日間培養した。培養物の上澄液を収得してＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて培養液に生産及び分泌されたコラーゲンの含量を定量分析した（表４）。

上記表４に示すように、ＰＤＧＦａに皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−ＰＤＧＦａもＰＤＧＦａと同等レベルのコラーゲン生成効能を有していることを確認した。

これにより、ＰＤＧＦａに皮膚透過促進用ペプチドが融合されてもＰＤＧＦａの皮膚のしわ及び弾力性改善効能をそのまま有していることが認められる。

実施例３−２−２：ヒアルロン酸（ＨＡ）の生成効能の検定
上記実施例２−２で合成されたＴ−ＰＤＧＦａをＰＤＧＦａと比較してヒアルロン酸（ＨＡ）の生成に及ぼす効果を検証した。

具体的には、真皮線維芽細胞（dermal fibroblast）を２４ウェルプレートに接種し、２４時間培養して７０〜８０％の飽和度を示す培養物を得た。上記培養物をＰＢＳで洗浄した後１０ｎｇ／ｍｌのＴ−ＰＤＧＦａまたはＰＤＧＦａが含まれている無血清ＤＭＥＭ培地で２日間培養した。培養物の上澄液を収得してＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて培養液に生産及び分泌されたヒアルロン酸の含量を定量分析した（表５）。

上記表５に示すように、ＰＤＧＦａに皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−ＰＤＧＦａもＰＤＧＦａと同等レベルのヒアルロン酸の生成効能を有していることを確認した。

これにより、ＰＤＧＦａに皮膚透過促進用ペプチドが融合されてもＰＤＧＦａの皮膚のしわ及び弾力性改善効能をそのまま有していることが認められる。

実施例３−２−３：毛包幹細胞増殖効能の検証
上記実施例２−２で合成されたＴ−ＰＤＧＦａをＰＤＧＦａと比較して皮膚細胞の増殖に及ぼす効果を検証した。

具体的には、皮膚毛乳頭細胞（dermal papilla cell）を９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養してウェル（ｗｅｌｌ）当たり６，０００個の細胞数を示す培養物を得た。上記培養物をＰＢＳで洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。さらにＰＢＳで洗浄を行った後、１ｎｇ／ｍｌのＴ−ＰＤＧＦａまたはＰＤＧＦａが含まれている無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。培養物を得てＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて、細胞増殖量の差を定量分析した。この時、対照群としては、Ｔ−ＰＤＧＦａまたはＰＤＧＦａが含まれていない無血清ＤＭＥＭ培地で培養した結果物を使用した（表６）。

上記表６に示すように、ＰＤＧＦａに皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−ＰＤＧＦａもＰＤＧＦａと同等レベルの細胞増殖効果を有していることを確認した。

これにより、ＰＤＧＦａに皮膚透過促進用ペプチドが融合されてもＰＤＧＦａの脱毛改善効能をそのまま有していることが認められる。

実施例３−２−４：皮膚透過性の検証
上記実施例２−２で合成された融合タンパク質のＴ−ＰＤＧＦａをＰＤＧＦａと比較して皮膚透過性を検証した。

具体的には、Ｆｒａｎｚ ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌ（Ｓｔａｎｄａｒｄ直径９ｍｍ、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ５ｍｌ、Ｐｅｒｍｅｇｅａｒ）の上段と下段との間に豚皮（０．７ｍｍの厚さ、Ｍｅｄｉｋｉｎｅｔｉｃｓ）を装着し、１％ＢＳＡと０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を準備した後、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの上段（Ｄｏｎｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ）にはＴＢＳを５００μｌ加え、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの下段（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）にはＴＢＳを５ｍｌ加えた。続いて、２μｇのＰＤＧＦａまたはＴ−ＰＤＧＦａを上段に加え、１６時間反応させた後、下段に存在するＰＤＧＦａまたはＴ−ＰＤＧＦａの濃度をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量分析し、ＰＤＧＦａの含量に対するＴ−ＰＤＧＦａの量の相対的な含量を透過量として算出した（表７）。

上記表７に示すように、Ｔ−ＰＤＧＦａの場合、ＰＤＧＦａより皮膚透過性が約３倍に増加することを確認した。

これにより、本発明のＴ−ＰＤＧＦａ融合タンパク質を使用すると、皮膚透過性が顕著に増加することが認められる。

実施例３−２−５：皮膚残留性の検証
上記実施例２−２で合成された融合タンパク質のＴ−ＰＤＧＦａをＰＤＧＦａと比較して皮膚残留性を検証した。

具体的には、実施例３−２−４での実験後に残った豚皮を回収した後、液体窒素冷凍後粉砕し、これに含まれているＰＤＧＦａまたはＴ−ＰＤＧＦａの含量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量分析した。また、ＰＤＧＦａの含量に対するＴ−ＰＤＧＦａの量の相対的な含量を残留量として算出した（表８）。

上記表８に示すように、Ｔ−ＰＤＧＦａの場合、ＰＤＧＦａより皮膚残留性が約１００倍に増加することを確認した。

これにより、本発明のＴ−ＰＤＧＦａ融合タンパク質を使用すると、皮膚残留性が顕著に増加することが認められる。

実施例３−３：血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）融合タンパク質の効果検証
上記実施例２−３で製造したＴ−ＶＥＧＦの皮膚改善用途を確認するために、下記のように皮膚弾力性の改善、皮膚しわの改善、脱毛の改善、皮膚透過性及び皮膚残留性の効果を確認する実験を行った。

実施例３−３−１：ヒアルロン酸（ＨＡ）の生成効能
上記実施例２−３で合成されたＴ−ＶＥＧＦをＶＥＧＦと比較してヒアルロン酸の生成に及ぼす効果を検証した。

具体的には、真皮線維芽細胞（dermal fibroblast）を２４ウェルプレートに接種し、２４時間培養して７０〜８０％の飽和度を示す培養物を得た。上記培養物をＰＢＳで洗浄した後、１０ｎｇ／ｍｌのＴ−ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦが含まれている無血清ＤＭＥＭ培地で２日間培養した。培養物の上澄液を収得し、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて培養液に生産及び分泌されたヒアルロン酸（ＨＡ）の含量を定量分析した（表９）。

上記表９に示したように、ＶＥＧＦに皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−ＶＥＧＦもＶＥＧＦと同等レベルのヒアルロン酸の生成効能を有していることを確認した。

これにより、ＶＥＧＦに皮膚透過促進用ペプチドが融合されてもＶＥＧＦの皮膚のしわ及び弾力改善効能をそのまま有していることが認められる。

実施例３−３−２：内皮細胞増殖効能の検定
上記実施例２−３で合成されたＴ−ＶＥＧＦをＶＥＧＦと比較して内皮細胞増殖に及ぼす効果を検証した。

具体的には、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）を９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養してウェル（ｗｅｌｌ）当たり５，０００個の細胞数を示す培養物を得た。上記培養物をＰＢＳで洗浄した後、無血清Ｍ１９９培地で１６時間培養した。さらにＰＢＳで洗浄を行った後、１００ｎｇ／ｍｌのＴ−ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦが含まれている無血清Ｍ１９９培地で１日間培養した。培養物を得てＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて、細胞増殖量の差を定量分析した。この時、対照群としては、Ｔ−ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦが含まれていない無血清Ｍ１９９培地で培養した結果物を使用した（表１０）。

上記表１０に示すように、ＶＥＧＦに皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−ＶＥＧＦもＶＥＧＦと同等レベルの細胞増殖効果を有していることを確認した。

これにより、ＶＥＧＦに皮膚透過促進用ペプチドが融合されてもＶＥＧＦの皮膚のしわ及び弾力性改善効能をそのまま有していることが認められる。

実施例３−３−３：毛包幹細胞増殖効能の検証
上記実施例２−３で合成されたＴ−ＶＥＧＦをＶＥＧＦと比較して皮膚細胞の増殖に及ぼす効果を検証した。

具体的には、皮膚毛乳頭細胞（dermal papilla cell）を９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養してウェル（ｗｅｌｌ）当たり６，０００個の細胞数を示す培養物を得た。上記培養物をＰＢＳで洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。さらにＰＢＳで洗浄を行った後、１ｎｇ／ｍｌのＴ−ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦが含まれている無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。培養物を得てＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて、細胞増殖量の差を定量分析した。この時、対照群としては、Ｔ−ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦが含まれていない無血清ＤＭＥＭ培地で培養した結果物を使用した（表１１）。

上記表１１に示すように、ＶＥＧＦに皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−ＶＥＧＦもＶＥＧＦと同等レベルの細胞増殖効果を有していることを確認した。

これにより、ＶＥＧＦに皮膚透過促進用ペプチドが融合されてもＶＥＧＦの脱毛改善効能をそのまま有していることが認められる。

実施例３−３−４：皮膚透過性の検証
上記実施例２−３で合成された融合タンパク質のＴ−ＶＥＧＦをＶＥＧＦと比較して皮膚透過性を検証した。

具体的には、Ｆｒａｎｚ ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌ（Ｓｔａｎｄａｒｄ直径９ｍｍ、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ５ｍｌ、Ｐｅｒｍｅｇｅａｒ）の上段と下段との間に豚皮（０．７ｍｍの厚さ、Ｍｅｄｉｋｉｎｅｔｉｃｓ）を装着し、１％ＢＳＡと０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl）を準備した後、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの上段（Donor chamber）にはＴＢＳを５００μｌ加え、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの下段（Receiver chamber）にはＴＢＳを５ｍｌ加えた。

続いて、２μｇのＶＥＧＦまたはＴ−ＶＥＧＦを上段に加え、１６時間反応させた後、下段に存在するＶＥＧＦまたはＴ−ＶＥＧＦの濃度をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量分析し、ＶＥＧＦの含量に対するＴ−ＶＥＧＦの量の相対的な含量を透過量として算出した（表１２）。

上記表１２に示すように、Ｔ−ＶＥＧＦの場合、ＶＥＧＦより皮膚透過性が約３倍に増加することを確認した。

これにより、本発明のＴ−ＶＥＧＦ融合タンパク質を使用すると、皮膚透過性が顕著に増加することが認められる。

実施例３−３−５：皮膚残留性の検証
上記実施例２−３で合成された融合タンパク質のＴ−ＶＥＧＦをＶＥＧＦと比較して皮膚残留性を検証した。

具体的には、実施例３−３−４での実験後に残った豚皮を回収した後、液体窒素冷凍後粉砕し、これに含まれているＶＥＧＦまたはＴ−ＶＥＧＦの含量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量分析した。また、ＶＥＧＦの含量に対するＴ−ＶＥＧＦの量の相対的な含量を残留量として算出した（表１３）。

上記表１３に示すように、Ｔ−ＶＥＧＦの場合、ＶＥＧＦより皮膚残留性が約１００倍に増加することを確認した。

これにより、本発明のＴ−ＶＥＧＦ融合タンパク質を使用すると、皮膚残留性が顕著に増加することが認められる。

実施例３−４：インスリン様成長因子−１融合タンパク質（Ｔ−ＩＧＦ−１）の効果検証
上記実施例２−４で製造したＴ−ＩＧＦ−１の皮膚改善用途を確認するために下記のように皮膚弾力性の改善、皮膚しわの改善、脱毛の改善、皮膚透過性、皮膚残留性の効果を確認する実験を行った。

実施例３−４−１：皮膚バリア強化効能の検定
上記実施例２−４で合成されたＴ−ＩＧＦ−１をＩＧＦ−１と比較して角質細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の成長に及ぼす効果を検証した。

具体的には、皮膚角質細胞を９６ウェルプレートで一日間培養してウェル（well）当たり６，０００個の細胞数を示す培養物を得た。上記培養物をＰＢＳで洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。さらにＰＢＳで洗浄を行った後、１００ｎｇ／ｍｌのＴ−ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１が含まれている無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。

培養物を得てＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて細胞増殖量の差を定量分析した。この時、対照群としては、Ｔ−ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１が含まれていない無血清ＤＭＥＭ培地で培養した結果物を使用した（表１４）。

上記表１４に示すように、ＩＧＦ−１に、皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−ＩＧＦ−１もＩＧＦ−１と同等レベルの皮膚しわ弾力性改善効能を有していることを確認した。

実施例３−４−２：毛包幹細胞増殖効能の検証
上記実施例２−４で合成されたＴ−ＩＧＦ−１をＩＧＦ−１と比較して皮膚細胞の増殖に及ぼす効果を検証した。

具体的には、皮膚毛乳頭細胞（dermal papilla cell）を９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養してウェル（ｗｅｌｌ）当たり６，０００個の細胞数を示す培養物を得た。上記培養物をＰＢＳで洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。さらにＰＢＳで洗浄を行った後、１ｎｇ／ｍｌのＴ−ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１が含まれている無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。培養物を得てＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて、細胞増殖量の差を定量分析した。この時、対照群としては、Ｔ−ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１が含まれていない無血清ＤＭＥＭ培地で培養した結果物を使用した（表１５）。

上記表１５に示すように、ＩＧＦ−１に、皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−ＩＧＦ−１もＩＧＦ−１と同等レベルの細胞増殖効果を有していることを確認した。

これにより、ＩＧＦ−１に、皮膚透過促進用ペプチドが融合されてもＩＧＦ−１の脱毛改善効能をそのまま有していることが認められる。

実施例３−４−３：皮膚透過性の検証
上記実施例２−４で合成された融合タンパク質のＴ−ＩＧＦ−１をＩＧＦ−１と比較して皮膚透過性を検証した。

具体的には、Ｆｒａｎｚ ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌ（Ｓｔａｎｄａｒｄ直径９ｍｍ、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ５ｍｌ、Ｐｅｒｍｅｇｅａｒ）の上段と下段との間に豚皮（０．７ｍｍの厚さ、Ｍｅｄｉｋｉｎｅｔｉｃｓ）を装着し、１％ＢＳＡと０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を準備した後、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの上段（Donor chamber）にはＴＢＳを５００μｌ加え、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの下段（Receiver chamber）にはＴＢＳを５ｍｌ加えた。続いて、２μｇのＩＧＦ−１またはＴ−ＩＧＦ−１を上段に加え、１６時間反応させた後、下段に存在するＩＧＦ−１またはＴ−ＩＧＦ−１の濃度をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を利用して定量分析し、ＩＧＦ−１の含量に対するＴ−ＩＧＦ−１の量の相対的な含量を透過量として算出した（表１６）。

上記表１６に示すように、Ｔ−ＩＧＦ−１の場合、ＩＧＦ−１より皮膚透過性が約３倍に増加することを確認した。

これにより、本発明のＴ−ＩＧＦ−１融合タンパク質を使用すると、皮膚透過性が顕著に増加することが認められる。

実施例３−４−４：皮膚残留性の検証
上記実施例２−４で合成された融合タンパク質のＴ−ＩＧＦ−１をＩＧＦ−１と比較して皮膚残留性を検証した。

具体的には、実施例３−４−４での実験後に残った豚皮を回収した後、液体窒素冷凍後粉砕し、これに含まれているＩＧＦ−１またはＴ−ＩＧＦ−１の含量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を利用して定量分析した。また、ＩＧＦ−１の含量に対するＴ−ＩＧＦ−１の量の相対的な含量を残留量として算出した（表１７）。

上記表１７に示すように、Ｔ−ＩＧＦ−１の場合、ＩＧＦ−１より皮膚残留性が約１００倍に増加することを確認した。

これにより、本発明の融合タンパク質を使用すると、皮膚残留性が顕著に増加することが認められる。

実施例３−５：角質細胞成長因子融合タンパク質（Ｔ−ＫＧＦ）の効果検証
上記実施例２−５で製造したＴ−ＫＧＦの皮膚改善用途を確認するために下記のように皮膚弾力性の改善、皮膚しわの改善、脱毛の改善、皮膚透過性、皮膚残留性の効果を確認する実験を行った。

実施例３−５−１：皮膚バリア強化効能の検定
上記実施例２−５で合成されたＴ−ＫＧＦをＫＧＦと比較して角質細胞の成長に及ぼす効果を検証した。

具体的には、皮膚角質細胞（Keratinocyte）を９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養してウェル（ｗｅｌｌ）当たり６，０００個の細胞数を示す培養物を得た。

上記培養物をＰＢＳで洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。さらにＰＢＳで洗浄を行った後、１００ｎｇ／ｍｌのＴ−ＫＧＦまたはＫＧＦが含まれている無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。培養物を得てＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて細胞増殖量の差を定量分析した。この時、対照群としては、Ｔ−ＫＧＦまたはＫＧＦが含まれていない無血清ＤＭＥＭ培地で培養した結果物を使用した（表１８）。

上記表１８に示すように、ＫＧＦに皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−ＫＧＦもＫＧＦと同等レベルの細胞の成長効果を有していることを確認した。

これにより、ＫＧＦに皮膚透過促進用ペプチドが融合されてもＫＧＦの皮膚のしわ及び弾力性改善効能をそのまま有していることが認められる。

実施例３−５−２：毛包幹細胞増殖効能の検証
上記実施例２−５で合成されたＴ−ＫＧＦをＫＧＦと比較して皮膚細胞の増殖に及ぼす効果を検証した。

具体的には、皮膚毛乳頭細胞（dermal papilla cell）を９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養してウェル（ｗｅｌｌ）当たり６，０００個の細胞数を示す培養物を得た。上記培養物をＰＢＳで洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。さらにＰＢＳで洗浄を行った後、１０ｎｇ／ｍｌのＴ−ＫＧＦまたはＫＧＦが含まれている無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。培養物を得てＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて、細胞増殖量の差を定量分析した。この時、対照群としては、Ｔ−ＫＧＦまたはＫＧＦが含まれていない無血清ＤＭＥＭ培地で培養した結果物を使用した（表１９）。

上記表１９に示すように、ＫＧＦの皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−ＫＧＦもＫＧＦと同等レベルの細胞増殖効果を有していることを確認した。

これにより、ＫＧＦに皮膚透過促進用ペプチドが融合されてもＫＧＦの脱毛改善効能をそのまま有していることが認められる。

実施例３−５−３：皮膚透過性の検証
上記実施例２−５で合成された融合タンパク質のＴ−ＫＧＦをＫＧＦと比較して皮膚透過性を検証した。

具体的には、Ｆｒａｎｚ ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌ（Ｓｔａｎｄａｒｄ直径９ｍｍ、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ５ｍｌ、Ｐｅｒｍｅｇｅａｒ）の上段と下段との間に豚皮（０．７ｍｍの厚さ、Ｍｅｄｉｋｉｎｅｔｉｃｓ）を装着し、１％ＢＳＡと０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を準備した後、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの上段（Ｄｏｎｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ）にはＴＢＳを５００μｌ加え、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの下段（Receiver chamber）にはＴＢＳを５ｍｌ加えた。続いて、２μｇのＫＧＦまたはＴ−ＫＧＦを上段に加え、１６時間反応させた後、下段に存在するＫＧＦまたはＴ−ＫＧＦの濃度をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量分析し、ＫＧＦの含量に対するＴ−ＫＧＦの量の相対的な含量を透過量として算出した（表２０）。

上記表２０に示すように、Ｔ−ＫＧＦの場合ＫＧＦより皮膚透過性が約３倍に増加することを確認した。

これにより、本発明のＴ−ＫＧＦ融合タンパク質を使用すると、皮膚透過性が顕著に増加することが認められる。

実施例３−５−４：皮膚残留性の検証
上記実施例２−５で合成された融合タンパク質のＴ−ＫＧＦをＫＧＦと比較して皮膚残留性を検証した。

具体的には、実施例３−５−３での実験後に残った豚皮を回収した後、液体窒素冷凍後粉砕し、これに含まれているＫＧＦまたはＴ−ＫＧＦの含量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量分析した。また、ＫＧＦの含量に対するＴ−ＫＧＦの量の相対的な含量を残留量として算出した（表２１）。

上記表２１に示すように、Ｔ−ＫＧＦの場合ＫＧＦより皮膚残留性が約１００倍に増加することを確認した。

これにより、本発明の融合タンパク質を使用すると、皮膚残留性が顕著に増加することが認められる。

実施例３−６：チモシンベータ４融合タンパク質（Ｔ−Ｔβ４）の効果検証
上記実施例２−６で製造したＴ−Ｔβ４の皮膚改善用途を確認するために下記のように皮膚弾力性の改善、皮膚しわの改善、脱毛の改善、皮膚透過性及び皮膚残留性の効果を確認する実験を行った。

実施例３−６−１：内皮細胞増殖効果の検定
上記実施例２−６で合成されたＴ−Ｔβ４をＴβ４と比較して内皮細胞増殖に及ぼす効果を検証した。

具体的には、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell）を９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養してウェル（ｗｅｌｌ）当たり５，０００個の細胞数を示す培養物を得た。上記培養物をＰＢＳで洗浄した後、無血清Ｍ１９９培地で１６時間培養した。さらにＰＢＳで洗浄を行った後、１００ｎｇ／ｍｌのＴ−Ｔβ４またはＴβ４が含まれている無血清Ｍ１９９培地で１日間培養した。培養物を得てＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて細胞増殖量の差を定量分析した。この時、対照群としては、Ｔ−Ｔβ４またはＴβ４が含まれていない無血清Ｍ１９９培地で培養した結果物を使用した（表２２）。

上記表２２に示すように、Ｔβ４の皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−Ｔβ４もＴβ４と同等レベルの細胞増殖効果を有していることを確認した。

これにより、Ｔβ４の皮膚透過促進用ペプチドが融合されてもＴβ４の皮膚のしわ及び弾力性改善効能をそのまま有していることが認められる。

実施例３−６−２：毛包幹細胞増殖効能の検証
上記実施例２−６で合成されたＴ−Ｔβ４をＴβ４と比較して皮膚細胞の増殖に及ぼす効果を検証した。

具体的には、皮膚毛乳頭細胞（dermal papilla cell）を９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養してウェル（ｗｅｌｌ）当たり６，０００個の細胞数を示す培養物を得た。上記培養物をＰＢＳで洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。さらにＰＢＳで洗浄を行った後、１０ｎｇ／ｍｌのＴ−Ｔβ４またはＴβ４が含まれている無血清ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。培養物を得てＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて細胞増殖量の差を定量分析した。この時、対照群としては、Ｔ−Ｔβ４またはＴβ４が含まれていない無血清ＤＭＥＭ培地で培養した結果物を使用した（表２３）。

上記表２３に示すように、Ｔβ４に皮膚透過促進用ペプチドが融合されたＴ−Ｔβ４もＴβ４と同等レベルの細胞増殖効果を有していることを確認した。

これにより、Ｔβ４の皮膚透過促進用ペプチドが融合されてもＴβ４の脱毛改善効能をそのまま有していることが認められる。

実施例３−６−３：皮膚透過性の検証
上記実施例２−６で合成された融合タンパク質のＴ−Ｔβ４をＴβ４と比較して皮膚透過性を検証した。

具体的には、Ｆｒａｎｚ ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌ（Ｓｔａｎｄａｒｄ直径９ｍｍ、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ５ｍｌ、Ｐｅｒｍｅｇｅａｒ）の上段と下段との間に豚皮（０．７ｍｍの厚さ、Ｍｅｄｉｋｉｎｅｔｉｃｓ）を装着し、１％ＢＳＡと０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を準備した後、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの上段（Donor chamber）にはＴＢＳを５００μｌ加え、上記Ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌの下段（Receiver chamber）にはＴＢＳを５ｍｌ加えた。続いて、２μｇのＴβ４またはＴ−Ｔβ４を上段に加え、１６時間反応させた後、下段に存在するＴβ４またはＴ−Ｔβ４の濃度をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量分析し、Ｔβ４の含量に対するＴ−Ｔβ４の量の相対的な含量を透過量として算出した（表２４）。

上記表２４に示すように、Ｔ−Ｔβ４の場合Ｔβ４よりも、皮膚透過性が約３倍に増加することを確認した。

これにより、本発明のＴ−Ｔβ４融合タンパク質を使用すると、皮膚透過性が顕著に増加することが認められる。

実施例３−６−４：皮膚残留性の検証
上記実施例２−６で合成された融合タンパク質のＴ−Ｔβ４をＴβ４と比較して皮膚残留性を検証した。

具体的には、実施例３−６−３での実験後に残った豚皮を回収した後、液体窒素冷凍後粉砕し、これに含まれているＴβ４またはＴ−Ｔβ４の含量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量分析した。また、Ｔβ４の含量に対するＴ−Ｔβ４の量の相対的な含量を残留量として算出した（表２５）。

上記表２５に示すように、Ｔ−Ｔβ４の場合Ｔβ４より皮膚残留性が約１００倍に増加することを確認した。

これにより、本発明のＴ−Ｔβ４融合タンパク質を使用すると、皮膚残留性が顕著に増加することが認められる。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (16)

1. 配列番号１のアミノ酸配列を含む皮膚透過促進用ペプチド及び生理活性タンパク質を含む融合タンパク質。
2. 前記皮膚透過促進用ペプチドは、生理活性タンパク質のＮ末端に結合されたものである、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記生理活性タンパク質は、神経伝達物質放出調節ペプチド、血小板由来成長因子ａサブユニット（ＰＤＧＦａ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）及びチモシンベータ４（Ｔβ４）からなる群から選択されたいずれか一つである、請求項１に記載の融合タンパク質。
4. 前記神経伝達物質放出調節ペプチドは配列番号２〜４からなる群から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を含み、前記血小板由来成長因子ａサブユニット（ＰＤＧＦａ）は配列番号３５のアミノ酸配列を含み、内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）は配列番号３８のアミノ酸配列を含み、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）は配列番号４１のアミノ酸配列を含み、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、前記チモシンベータ４（Ｔβ４）は配列番号４７のアミノ酸配列を含むものである、請求項２に記載の融合タンパク質。
5. 前記神経伝達物質は、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミン、アセチルコリン、アドレナリン、ノルアドレナリン、ガンマアミノ酪酸、Ｌ−グルタミン酸、及びグリシンからなる群から選択されたいずれか一つ以上である、請求項４に記載の融合タンパク質。
6. 前記融合タンパク質は、配列番号３２〜３４、３６、３９、４２、４５、及び４８からなる群から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の融合タンパク質。
7. 前記融合タンパク質は、前記生理活性タンパク質の皮膚透過性及び皮膚残留性が増大したものである、請求項１に記載の融合タンパク質。
8. 前記融合タンパク質は、前記皮膚透過促進用ペプチド及び生理活性タンパク質との間にリンカーを含むものである、請求項１に記載の融合タンパク質。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
10. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む皮膚改善用化粧料組成物。
11. 前記皮膚の改善は、皮膚しわの改善または皮膚弾力性の増進である、請求項１０に記載の皮膚改善用化粧料組成物。
12. 請求項１０に記載の化粧料組成物を有効成分として含む皮膚改善用機能性化粧品。
13. 前記皮膚の改善は、皮膚しわの改善または皮膚弾力性の増進である、請求項１２に記載の皮膚改善用機能性化粧品。
14. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む脱毛改善用化粧料組成物。
15. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む皮膚改善用医薬部外品組成物。
16. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む脱毛改善用医薬部外品組成物。

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