JP2012521754A - インターフェロン−アルファ及び細胞質残留性細胞膜透過ペプチドを含むIFN−α融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、細胞膜結合及び肝移動特性を有するペプチドであるCTPをヒトIFN−αに遺伝的に融合して細胞膜結合能力及び抗ウイルス活性が向上し、細胞核への移動は抑制され、肝移動能力、肝滞留特性、及び肝組織浸透特性に優れた効果を有する融合タンパク質である。これにより、低用量で各種のウイルス性感染等を含む肝疾患の予防又は治療に効果的なタンパク質医薬品の開発が可能となる。
【選択図】図12
Description
ヒト由来のインターフェロン−アルファ(Interferon−α,IFN−α)遺伝子は大腸菌でよく発現されない相当数のコドンを含んでおり、変形せずに使用する場合IFNタンパク質の発現率が非常に低いものと知られている。特に、AGG/AGA、CUA、AUA、CCA又はCCCのようなコドンクラスターは大腸菌で発現されるタンパク質の量と質をいずれも低下させるものと報告されている(2、3)。
IFN、これのN−末端又はC−末端にCTPペプチドが融合されたIFNのDNAを得るために、下記表2のプライマーを用いて上記表1のヒトIFN遺伝子のオリゴマーを鋳型としてSOEing PCRを実施した(6)。:
ヒト由来の遺伝子を変形せずに大腸菌で発現する場合、発現量が非常に少ない問題点があった。これを解決するために、大腸菌のコドン使用頻度が考慮された合成遺伝子を得るために2段階の反応を実施した。まず、上記表1の6個のオリゴマーを同量ずつ交ぜてpfu DNAポリメラーゼ及びdNTPミクスチャーを添加した後、60℃で30分間反応させてコドン使用頻度によって合成された、ヒトIFN−α遺伝子の鋳型を作製した。この鋳型にCFN−4及びCFN−3プライマーでPCRを実施して、図1のようなヒトIFN−αの遺伝子を得た(配列表の第27配列)。このようにして得られた約0.55kbのPCR結果物を図4のレーン3に示す。
IFN−αのN−末端にCTPペプチドを付着するために3段階の反応を実施した。まず、上記表1の6個のオリゴマーを同量ずつ交ぜてpfu DNAポリメラーゼ及びdNTPミクスチャーを添加した後、60℃で30分間反応させてコドン使用頻度によって合成されたヒトIFN−α遺伝子の鋳型を作製した。この鋳型にCFN−1及びCFN−3プライマーで1次PCRを実施した後、更にこれを鋳型としてCFN−2及びCFN−3プライマーで2次PCRを実施して、図2のようなアミノ酸配列を有するN−末端にCTPが融合されたヒトIFN−αの遺伝子を得た(配列表の第29配列)。このようにして得られた約0.58kbのPCR結果物を図4のレーン1に示す。
上記実施例2−2のN−末端CTP融合IFNと同一の方法でヒトIFN−α遺伝子の鋳型を作製し、これにCFN−4及びCFN−5プライマーで1次PCRを実施した後、
CFN−4及びCFN−6プライマーで2次PCRを実施して、図3のようなアミノ酸配列を有するC−末端にCTPが融合されたヒトIFN−αの遺伝子を合成した(配列表の第31配列)。このようにして得られた約0.58kbのPCR結果物を図4のレーン2に示す。
PCRを通じて確保された3種類(sIFN、CTP−sIFN、及びsIFN−CTP)の遺伝子を大腸菌で発現するために、図5aのような過程を経て大腸菌発現ベクターであるpET−21bベクター(Novagen)にそれぞれクローニングを実施して、pIFN、pNIFN、及びpCIFNの3個の発現ベクターを製造した。まず、それぞれのPCR産物をpGEM−Tベクターにクローニングして塩基配列を分析し、所望のアミノ酸配列が変形されずに合成された3種類の組み換えpGEM−Tベクター(sIFN/pGEM−T、CTP−sIFN/pGEM−T及びsIFN−CTP/pGEM−T)を得た。このような組み換えpGEM−TベクターからPCR時にプライマーに含ませておいた制限酵素セットを用いてインサート(insert)を得て、これらをpET−21bベクターに導入して最終3種類の発現ベクター(pIFN、pNIFN、及びpCIFN)を完成した(図5b)。
pET−21bベクター(Novagen)を用いてそれぞれ構成された発現ベクターを発現用大腸菌であるE.coli BL21(DE3)(Novagen)に形質転換させ、3種類の生産菌株(E.coli BL21(DE3)/pIFN、pNIFN、及びpCIFN)を作製し、これらをLB培地で600nm波長の吸光度が0.4になるまで培養した。次に、0.4mM(mmol/L)のIPTGを添加してさらに4時間培養してSDS−PAGE及びウエスタンブロッティングを通じて正常なIFN及びCTP−融合IFNが生成されることを確認した(図6)。
上記IFN及びCTP−融合IFNを大量確保するために、5L醗酵槽を用いた大量培養及び精製を実施した。
生産菌株E.coli BL21(DE3)/pIFN、pNIFN、及びpCIFNでインターフェロン(pIFN)又はCTP−融合インターフェロン(pNIFN又はpCIFN)を大量確保するために、5L醗酵槽(BioStat(登録商標)B,B.Braun Biotech International.)を用いて大量培養を実施した。まず、2xYT培地(トリプトン16g、酵母抽出物10g及びNaCl 5g/L)60mLにアンピシリン(ampicillin)を50μg/mLとなるように添加した後、それぞれの菌株を植菌して37℃で16時間培養した。この培養液を50μg/mLのアンピシリン(ampicillin)が添加された3LのTB醗酵槽培地(酵母抽出物24g、トリプトン12g、グリセロール0.4質量%、KH2PO4 2.31g又はK2HPO4 12.54g/L)に全部植菌して37℃で培養し、600nmで吸光度を測定して約3になったときに、最終濃度0.4mM(mmol/L)のIPTGを添加してタンパク質の発現を誘導した。次に、更に6時間培養して細胞を回収して発現をSDS−PAGEで確認した(図7)。
上記大量発現した培養液から細胞を回収して、TE緩衝液(50mM Tris−HCl、5mM EDTA、pH8.0)に再懸濁した後、ホモジナイザー(EmulsiFlex C−3,Avestin)を用いて細胞を破砕し遠心分離して不溶性の凝集体分画を回収した。これを1質量%のトリトン−X100で2回、また蒸溜水で2回洗浄して細菌破砕物が除去された凝集体を分離した。構造的に活性を有するIFN及びCTP−融合IFNを得るために、分離した凝集体を種類別に最適化された溶解化(solubilization)緩衝液にそれぞれ溶かし、これを更にそれぞれのリフォールディング緩衝液で撹拌してリフォールディングを実施した。各IFNの凝集体の溶解化(solubilization)及びリフォールディングに用いた緩衝液及び条件を下記表3に示す。:
上記方法によってリフォールディングを実施した後、構造的に正常リフォールディングされたIFN又はCTP−融合IFNを高純度で精製するために、陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを行った。分離しようとするタンパク質の等電点がIFNの場合に約6.0、CTP−融合IFNの場合に約9.2と予想されるので、それぞれこれより低いpHでCM−セファロース(sepharose)陽イオン交換基(Amersham Biosciences)に結合させた後、下記表4に示すpH及びNaCl濃度勾配で溶出してそれぞれの分画を得て、SDS−PAGEを通じてタンパク質溶出分画を決定した。確保された溶出分画からタンパク質マルチマーを除去し、緩衝液を入れ替えるために分子量5,000ダルトンのセントリコン(centricon)で濃縮した後、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施して高純度のタンパク質を最終確保した。
上記実施例5を通じて精製されたIFN及びCTP−融合IFNを用いて次のように生物学的活性を測定した。:
精製されたIFN及びCTP−融合IFNをFITC又はローダミン(rhodamine)蛍光物質で標識し、2日培養したHeLa(韓国細胞株銀行)又はHepG2細胞(韓国細胞株銀行)に最終濃度が5nM(nmol/L)〜10nM(nmol/L)となるように処理した後、その分布を共焦点走査顕微鏡(LSM 5 Exciter,Carl−Zeiss)を用いて観察した。
(1)IFN及びCTP−融合IFNのPEG化(PEGylation)
マウスの場合、タンパク質の分子量が30kDa以下と小さければ、腎クリアランス(renal clearance)機序により速やかに膀胱に排出され、タンパク質の血液内維持時間が短くなり肝移動特性を観察しにくい問題が発生し得る。したがって、このような問題点を克服して血液内維持時間を延長させて肝移動特性の観察を容易にするために、約20kDa前後のIFN及びCTP−融合IFNにPEG化を実施して分子量を最小40kDa以上に増加させようとした。
PEG化を通じて分子量を40kDa以上に増加させたIFN及びCTP−融合IFNを、Cy5.5蛍光物質で標識し、マウスの静脈に2nmol投与した後、約45分間経過後、投与タンパク質の体内分布をIVIS−200(Xenogen)を通じて、確認した。
マウス静脈にPEG化されたIFN及びCTP−融合インターフェロンを蛍光標識して投与した後、時間経過による肝での蛍光強度を測定することで投与タンパク質の相対濃度を決定した。
精製されたIFN及びCTP−融合IFNの抗ウイルス活性はMDBK(Madin−Darby Bovine Kidney)細胞(韓国細胞株銀行)にVSV(Vesicular stomatitis virus)(韓国細胞株銀行)を感染させたときに発生する細胞病変効果(cytopathic effect)を、これらタンパク質がどの程度緩和させることができるかを確認することで測定した。
既知のインターフェロン標準品との相対比較を通じて、精製インターフェロンの抗ウイルス活性を決定した。インターフェロンを20時間処理して反応を誘導した後、抗ウイルス活性を測定した結果、下記表5からわかるように、精製されたインターフェロンの活性は標準品対比97.7%で標準品と同等であり、非活性は約2.54×108IU/mgで国際基準(1.4×108IU/mg以上)を満たした。以後の活性測定では、標準品と同等な活性を有するものと判明された精製インターフェロンを新しい標準品とした。
N−末端CTP−融合IFN、PEG−IFN、及びPEG−N末端CTP融合IFNの抗ウイルス活性は、4時間インターフェロン反応を誘導した後、測定した(図10)。
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Claims (25)
- 細胞質残留性細胞膜透過ペプチド(cytoplasmic transduction peptide,CTP)に融合されたIFN(interferon)−αを含むことを特徴とするIFN−α融合タンパク質。
- CTPが、配列表の第13配列乃至第26配列から構成された群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項1に記載のIFN−α融合タンパク質。
- IFN−αが、IFN−α2bである請求項1に記載のIFN−α融合タンパク質。
- IFN−αが、配列表の第28配列のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のIFN−α融合タンパク質。
- CTPが、IFN−αのN−末端又はC−末端に融合される請求項1に記載のIFN−α融合タンパク質。
- CTPが、IFN−αのN−末端に連結される請求項5に記載のIFN−α融合タンパク質。
- CTPが、IFN−αのN−末端に連結される場合には、配列表の第30配列のアミノ酸配列を含む請求項5に記載のIFN−α融合タンパク質。
- CTPが、IFN−αのC−末端に連結される場合には、配列表の第32配列のアミノ酸配列を含む請求項5に記載のIFN−α融合タンパク質。
- ポリエチレングリコール(PEG)が更に結合される請求項1に記載のIFN−α融合タンパク質。
- PEGの分子量が、10kDa〜100kDaである請求項9に記載のIFN−α融合タンパク質。
- 請求項1から10のいずれかに記載のIFN−α融合タンパク質をコードすることを特徴とする核酸分子。
- 請求項11に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
- 請求項12に記載のベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
- 次のステップを含むことを特徴とするIFN−α融合タンパク質の製造方法:
(a)プロモーターに作動的に連結された請求項1から10のいずれかに記載のIFN−α融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターを製造するステップ;
(b)前記ステップ(a)の発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養するステップ;及び
(c)前記ステップ(b)の形質転換体培養液から前記IFN−α融合タンパク質を得るステップ。 - 次のステップを含むことを特徴とするIFN−α融合タンパク質の精製方法:
(a)プロモーターに作動的に連結された請求項1から10のいずれかに記載のIFN−α融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養するステップ;
(b)前記ステップ(a)の形質転換体培養液からIFN−α融合タンパク質凝集体(inclusion body)を得るステップ;及び
(c)前記ステップ(b)の凝集体をpH10〜pH12の溶解化(solubilization)緩衝液に溶解し、リフォールディング(refolding)緩衝液で4℃〜25℃及びpH8〜pH10の条件で撹拌するステップ。 - ステップ(c)の溶解化緩衝液が、tris−HCl、EDTA及び尿素を含み、リフォールディング緩衝液が、tris−HCl、EDTA、尿素、スクロース、並びに酸化及び還元グルタチオンから構成された群より選択される請求項15に記載の方法。
- (a)請求項1から10のいずれかに記載のIFN−α融合タンパク質の薬剤学的有効量;及び(b)薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とする肝疾患予防又は治療用の薬剤学的組成物。
- 肝疾患が、肝臓癌又は肝炎である請求項17に記載の薬剤学的組成物。
- 血管に投与される請求項17に記載の薬剤学的組成物。
- (a)請求項1から10のいずれかに記載のIFN−α融合タンパク質の薬剤学的有効量;及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を対象(subject)に投与するステップを含むことを特徴とする肝疾患予防又は治療方法。
- 肝疾患が、肝臓癌又は肝炎である請求項20に記載の方法。
- 薬剤学的組成物が、血管に投与される請求項20に記載の方法。
- 肝疾患予防又は治療用の薬剤学的組成物を製造するための請求項1から10のいずれかに記載のIFN−α融合タンパク質の用途。
- 肝疾患が、肝臓癌又は肝炎である請求項23に記載の用途。
- 薬剤学的組成物が、血管に投与される請求項23に記載の用途。
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