WO2017039358A1 - 종양 투과성 펩타이드와 향-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

종양 투과성 펩타이드와 향-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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이영민
정혜윤
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강재훈
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Definitions

  • compositions for the prevention and treatment of cancer or neovascular Guam disease comprising a fusion protein, a fusion of a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cancer or angiogenesis-related diseases comprising a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenesis agent. Is not only effective in inhibiting angiogenesis due to improved tumor permeability and cancer targeting effect of anti-angiogenic agents, but also for cancers that exhibit resistance or no response by enhancing the efficacy of anti-angiogenic agents.
  • the present invention relates to a therapeutic use of cancer or angiogenesis-related diseases of a fusion protein that may have a therapeutic effect.
  • Angiogenesis refers to the process of forming new capillaries from existing microvascular vessels and is known to play an important role in the developmental process, wound healing, and the female reproductive cycle through normal physiology.
  • diseases caused by pathological growth that is not controlled autonomously, for example abnormally excessive angiogenesis can lead to cancer growth and metastasis, diabetic retinopathy, and age-related macular lesions. It is known to play a decisive role in diseases such as ager elated macular degeneration, rheumatoid arthritis, endometriosis, psoriasis or chronic inflammation.
  • Unstable angiogenesis is the cause of coronary artery disease, stroke, myocardiac infarction, ulcers or delayed wound healing. have.
  • cancer is caused by the action of some carcinogens on the cells of the body. By regular division, it means a disease in which the cell itself proliferates without any control that constitutes the body.
  • malignant tumor or malignant neoplasm because it invades surrounding tissues and causes disorder by distant metastasis to other organs through blood vessels, lymphatic vessels, etc. It is called.
  • Treatment methods vary depending on the type of cancer, but surgery, chemotherapy, radiation therapy, cancer cell target therapy, immunotherapy, high temperature heat therapy, stem cell transplantation, and photodynamic therapy are generally used.
  • Angiogenesis is a process in which new blood vessels are formed from existing blood vessels, which is necessary for the developmental stage and the division and growth of normal cells and tissues as well as the division and growth of cancer cells.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • Anti-VEGF monoclonal antibody bevacizumab Avast in
  • 5-f luorouraci l 5-f luorouraci l
  • EMA 5-f luorouraci l
  • It has been approved as a primary or secondary therapy, and hundreds of clinical trials have since been recognized as a variety of cancer treatments including metastatic kidney cancer, metastatic non-small cell cancer, advanced glioblastoma and metastatic breast cancer.
  • Anti-VEGF agents may target cancers with active neovascularization, but dose-dependent side effects occur in the kidneys and stomach because they affect not only cancer but other organs with high levels of VEGF.
  • angiogenesis may include other growth factors such as f ibroblast growth factor (FGF), notch ligand / receptor system, placenta growth factor (PIGF), and platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB).
  • FGF f ibroblast growth factor
  • PIGF placenta growth factor
  • PDGF-BB platelet-derived growth factor-BB
  • Anti-VEGF agents such as Avast in, have high anti-cancer activity by inhibiting angiogenesis by blocking signal transduction by VEGF-A, and thus are not applicable alone or in combination to various cancers, including metastatic cancers that are difficult to treat. Possible effective preparations. Nevertheless, the efficacy in clinical practice is lower than expected and its use is limited due to resistance and side effects due to mechanism of action and dosage. Therefore, the disadvantages of such anti-VEGF preparations, such as Avast in, is required to develop a new formulation that can overcome the efficacy.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating cancer or angiogenesis-related diseases comprising a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent.
  • It is also an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating cancer or angiogenesis-related diseases comprising a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis, comprising a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent.
  • Another object of the present invention is to administer an effective amount of a composition consisting of an active ingredient of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent to an individual in need thereof. It is to provide a method for treating a disease.
  • Another object of the present invention is to provide tumor-penetrating peptides and anti-angiogenesis (anti- Angiogenesi s) provides a method for inhibiting cancer metastasis, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising a fusion protein fused to an agent.
  • Another object of the present invention is to inhibit cancer metastasis, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising an active ingredient of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-neoplastic 3 ⁇ 4-producing agent.
  • Another object of the present invention is to administer a cancer metastasis, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition consisting essentially of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent. It is to provide a way to suppress.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer or angiogenesis-related diseases comprising a fusion protein in which a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenesis agent are fused. to provide.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer or angiogenesis-related diseases comprising a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer or angiogenesis-related diseases consisting essentially of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis, comprising a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenes agent as an active ingredient. .
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising a fusion protein fused to a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis consisting essentially of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent.
  • a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis consisting essentially of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent.
  • a use of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent to prepare an agent for treating cancer or angiogenesis-related diseases.
  • an effective amount of a composition comprising a fusion protein in which a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent is fused is administered to an individual in need thereof. It provides a method of treating cancer or angiogenesis-related diseases, characterized in that.
  • cancer or a fusion protein in which a tumor-penetrating peptide and an anti-neovascular agent are fused to an individual in need thereof by administering an effective amount of a composition consisting of an active ingredient. It provides a method for treating angiogenesis-related diseases.
  • an effective amount of a composition consisting essentially of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-neovascular product is administered to an individual in need thereof.
  • a fusion protein in which a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic (anti-angiogenes i s) agent are fused to prepare an agent for inhibiting cancer metastasis.
  • an effective amount of a composition comprising a fusion protein in which a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent is fused is administered to an individual in need thereof. It provides a method for inhibiting cancer metastasis, characterized in that.
  • cancer metastasis comprising administering to the subject in need thereof an effective amount of a composition consisting of a fusion protein composed of a tumor-penetrating peptide and an anti-neovascular product. It provides a way to suppress.
  • a composition consisting essentially of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-neovascular product is an active ingredient.
  • a method of inhibiting cancer metastasis is provided by administering an effective amount of to an individual in need thereof.
  • the present invention will be described in detail.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer or angiogenesis-related diseases, comprising a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer or angiogenesis-related diseases comprising a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenesis agent.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating cancer or angiogenesis-related diseases consisting essentially of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent.
  • Vascular endothelial growth factor -A (VEGF-A) is well known to induce blood ejection (extravasat ion). This is another name, also called Vascular Permeability Factor. This action is known to be due to binding to vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR2).
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor
  • mutant experiments of vascular endothelial growth factor -A failed to bind vascular endothelial growth factor receptor. This is an example of how this is being promoted.
  • Neuropilins are described by Takagi et al. , (1987) and Fuj i sawa et al. (1989) was first discovered in the Xenopus nervous system.
  • Neurophylline is a transmembrane glycoprotein, and there are two forms of NRP1 and NRP2.
  • Neurophilin acts as a coreceptor of VEGF receptors (VEGFRs) by binding VEGF family ligands.
  • NRP1 acts as a co-receptor of VEGFR1, VEGFR2, and VEGFR3, and binds to various VEGF ligands to enhance the binding force between ligand and receptor. It has been revealed that VEGF165 by NRP1 changes the binding capacity of VEGFR2 (Soker et al., 1998 . NRP2, on the other hand, acts as a co-receptor of VEGFR2 and VEGFR3, contributing to lymphangiogenes and cell adhesion.
  • NRP1 / NRP2 acts as a co-receptor of Plexin fami ly receptors and binds to the secreted semaphoran family of three ligands (class 3 semaphorins: Sema3A, Sema3B, Sema3C, Sema3D, Sema3E, Sema3F, and Sema3G).
  • NRP1 acts as a co-receptor with VEGFR-2, increasing cell migration and angiogenesis in endothelial cells, and is a major factor in blood vessel development, including peri cyte involved in the vascular reconstruction process surrounding blood vessels. It also increases the expression of vascular endothel ial (VE) -cadher in and epithelium-speci fic cel l adhesion molecules (E—cadher in) to maintain adherent junct ions between cells and cells.
  • VE vascular endothel ial
  • E—cadher in epithelium-speci fic cel l adhesion molecules
  • NRP1 is highly expressed in various cancer cell lines such as lung, breast, prostate, pancreas and large intestine.NRP1 expression is high in advanced colorectal carcinoma patients. The relationship with cancer metastasis is also clinically revealed.
  • the "tumor permeability" is specifically recognized by the tissues overexpressing NRP, or accumulate, or widen the cell gap of vascular endothelial cells to promote the out-of-vascular outflow of the drug, and the barrier for water-soluble molecules ⁇ (barr ier Means that the corneal cell gap, which is a tissue that plays a role, is one of the characteristics that promotes the distribution of drugs in the tissue.
  • Angiogenesis requires not only simple growth of vascular endothelial cells, but also a variety of complex processes, including basement membrane penetration, migration and differentiation of endothelial cells, and capillary formation. Many promoters and inhibitors that regulate angiogenesis have been reported.
  • VEGF vascular endothel ial growth factor
  • angiopoiet ins proteins of angiopoiet ins have been newly isolated and purified, and are known to play an important role in the formation of neovascular structure.
  • Angiopoiet ins (ANG) proteins are classified into Ang- ⁇ and Ang-2, which bind to Tie_2 receptors that are specific to endothelial cells.
  • Ang-1 is involved in the differentiation and stabilization of endothelial cells
  • Ang-2 binds to Ti e-2 receptors and inhibits Ang-1 binding, resulting in destabilization and vascular regression of endothelial cells. Bring it.
  • angiogenesis may include placenta growth factor (PIGF), fibroblast growth factor (FGF), platelet-derived growth factor (PDGF), hepatocyte growth factor (HGF), TGFC transforming growth factor (IGF), and insul ins —
  • PIGF placenta growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • IGF TGFC transforming growth factor
  • insul ins a growth factor
  • ligands including l ike growth factor, Ephr in, Inter leukin, and BMP (bone morphogenetic protein), are known to be promoted by activating a series of receptors.
  • anti-angiogenesis refers to a molecule that interferes with the interaction between angiogenesis-related molecules and natural receptors, for example, an interaction between VEGF and VEGF receptors by binding to VEGF or VEGF receptors. It includes molecules that prevent or otherwise inhibit.
  • VEGF antagonists include anti-VEGF antibodies, anti-VEGF receptor antibodies and VEGF receptor-based chimeric molecules. Also included are molecules that bind to PDGF, P1GF, FGF, TGF, ANG, HGF, IGF, Ephr in A, Interleukin, BMP and their respective receptors to prevent or otherwise interfere with each other.
  • fusion refers to the integration of two molecules having different or identical functions or structures, and may be fusion by any physical, chemical or biological method in which a tumor-penetrating peptide can bind to an anti-angiogenic agent. have.
  • the fusion is wind Or a linker peptide, which may be, for example, an antibody
  • anti-angiogenic agents inhibit neovascularization by blocking signal transduction related to angiogenesis, and thus have high anti-cancer activity. Therefore, anti-angiogenic agents may be applied alone or in combination therapy to various carcinomas including metastatic cancers that are difficult to treat. Possible effective drug. Nevertheless, the effects in clinical practice are lower than expected and their use is limited because of their resistance and adverse effects due to mechanisms of action and dosage.
  • Anti-VEGF Avast in (bevaci horri horriouslyab), which is the most representative of these anti-angiogenic agents, is not a cancer-targeted drug unlike other antibody drugs, It is known that side effects occur because it is possible to distribute not only high cancer tissue but also other tissues with high VEGF concentration. Since the fusion protein of the present invention targets NRP that is widely distributed in cancer by fusing tumor-penetrating peptides specifically targeting NRP to anti-angiogenic agents, cancer specificity of anti-angiogenic agents Increasing its effectiveness can reduce dose-dependent side effects as well as increase patient comfort with a reduced dose.
  • NRP1 acts as a co-receptor with VEGFR-1, -2 and binds to other growth factors such as VEGF-B, C, D, E and PDGF in addition to VEGF-A, thereby fusion to the fusion protein of the present invention.
  • the angiogenesis inhibitory effect of the anti-angiogenic agent may be enhanced.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition, characterized in that the cancer or angiogenesis-related disease is resistant or non-responsive to an anti-angiogenic agent. The resistance or no response generally means no therapeutic effect at drug concentrations exhibiting a therapeutic effect.
  • neovascularization involves a single signal because other growth factors such as FGF, notch 1 igand / receptor system, P1GF and PDGF-BB are involved.
  • angiogenesis may continue to occur through other mechanisms. Therefore, it is estimated that many patients are not resistant to anti-angiogenic agents or develop resistance by repeated administration, and thus no clear effect is seen. More specifically, the use of anti-VEGF agents during antiangiogenic angiogenesis is exemplified. Angiogenesis occurs when blood vessels grow through cell division and growth when VEGF levels are high, then normalizes or reconstructs as VEGF levels decrease and PDGF levels rise.
  • the normalization process involves reducing the number and size of immature blood vessels, as well as reducing blood vessel pressure by interstitial fluid as the pericyte covers the blood vessels.
  • VEGF levels are lowered by the use of anti-VEGF agents such as Avast in
  • blood vessels increase per icyte coverage through normalization and thus weaken the penetration of drugs into cancer tissues.
  • Avast in and docetaxel are applied to patients with NSCLC. Reduced penetration into cancer has been reported with co-administration. This not only means that there is a limit in the combination of anti-VEGF agents such as Avast in with other drugs, and it is believed that this may be a cause of resistance of anti-VEGF agents.
  • the fusion protein of the present invention is not only an anti-angiogenic agent but also a tumor-penetrating peptide that can act by directly binding to NRP, and NRP is involved in the reconstruction of blood vessels through per icyte associat ion.
  • NRP is involved in the reconstruction of blood vessels through per icyte associat ion.
  • NRP1 regulates the expression of VE-cadherin and E-cadherin, which are involved in the maintenance of junct ions between cells, and the fusion protein of the present invention inhibits it, thereby loosening the intercellular spacing, and thus concomitant with conventional drugs such as antibody therapy.
  • Increasing the penetration of cells into cancerous masses can enhance the efficacy of the drug.
  • the inventors have found that the formulation of anti -VEGF Avast in TPPll-fusion protein to C-stage the end of Avast in a fusion of Avast in-A22p TPP11 fusion protein and a fusion of the tissue P A22-permeable peptide was prepared to evaluate various physiological activities.
  • the fusion protein according to the present invention (i) has a very good binding capacity for NRP1 and VEGF (Example 2), (ii) compared with wild type Avast in and the ability to target cancer in tissues The penetration was significantly improved (Example 3), (iii) and it was shown to significantly reduce the peri cyte coverage, which is presumed to be the resistance mechanism of anti-VEGF preparations (Example 4), (iv). Showed antitumor activity (Example 5).
  • the fusion protein of the present invention exhibits excellent physiological activity as described above because the anti-VEGF agent and the tumor-penetrating peptide act synergistically by acting on VEGF and NRP1, respectively.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain the fusion protein alone or be formulated in a suitable form with a pharmaceutically acceptable carrier, and may further contain an excipient or diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may further include, for example, carriers for oral administration or carriers for parenteral administration. Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, and the like. In addition, it may include various drug delivery materials used for oral administration of peptide preparations.
  • carriers for parenteral administration may include water, suitable oils, saline, aqueous glucose, glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspension agent, and the like in addition to the above components.
  • composition of the present invention may be administered to any mammal, including humans. For example, it can be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural cardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a preparation for oral or parenteral administration according to the route of administration as described above.
  • compositions of the present invention are formulated using methods known in the art as powders, granules, tablets, pills, sugar tablets, capsules, liquids, gels, syrups, sulfates, suspensions, and the like. Can be converted.
  • oral formulations can be obtained in tablets or dragees by combining the active ingredient with a solid brother and then grinding it, adding suitable auxiliaries and processing it into a granular mixture.
  • excipients include sugars, including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol xili, erythri and maltitol, and starches including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch dung.
  • Layer presuppositions such as' cellose, gelatin, polyvinylpyridone, and the like, including cellulose, cellulose, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose and hydroxypropyl methyl-selrose and the like.
  • crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate and the like may optionally be added as a disintegrant.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a perfume, an emulsifier, a preservative, and the like.
  • Formulations for parenteral administration may be formulated by methods known in the art in the form of injections, creams, lotions, external ointments, oils, humectants, gels, aerosols and nasal inhalants. These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publing Company, East on, PA, 1995, a prescription generally known in all pharmaceutical chemistries.
  • the total effective amount of the composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose, or may be administered by a long term administered multiple dose protocol in a fraction ionated treatment protocol. have.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the extent of the disease.
  • the preferred total dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be about 0.01 g to 10,000 mg, most preferably 0.1 / zg to l.OOmg per kg of patient body weight per day.
  • the dosage of the pharmaceutical composition is effective for the patient in consideration of various factors such as the age, weight, health condition, sex, severity of the disease, diet and excretion rate, as well as the formulation method, route of administration and frequency of treatment. Since the amount is determined, those of ordinary skill in the art, in light of this point, will determine the appropriate effective dosage of the composition of the present invention. You can decide.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited to its formulation, route of administration and method of administration as long as the effect of the present invention is shown.
  • the present invention also provides an anti-angiogenic agent comprising an anti-vascular endothelial growth factor (anti-VEGF) agent, an anti-PDGF agent, an anti-P1GF agent, an anti-FGF agent, an anti-TGF agent, an anti-ANG agent.
  • anti-VEGF anti-vascular endothelial growth factor
  • the anti-vascular endothelial growth factor (anti-VEGF) preparations include bevacizumab, ranibizumab, r84 (PLoS One. 2010 Aug 6; 5 (8)), applicator (af l ibercept), Conbercept, CTOKW02005056764A2), DOM15-10-1KW02008149147A2), DOM15-26-593 (W02008149143A2), PRS-050 (PLoS One. 2013 Dec 13; 8 (12)), CT- 322CBMC Cancer 2008, 8: 352), ESBA903 (Eur J Pharm Biopharm.
  • anti-VEGF anti-vascular endothelial growth factor
  • EPI-0030 W02011023130A1
  • antibody-fused antibody with anti-VEGF antibody It may be selected from the group consisting of ant ibody-drug conjugates (ADCs), including biosimilars and variants thereof. More preferably, it may be, but is not limited to, ranibizumab, bevacizumab, appliverscept, and convert.
  • ADCs ant ibody-drug conjugates
  • biosimilar which is equivalent to the quality, efficacy and safety, mimics an expired patented original biologic already developed / sold using biotechnology such as genetic recombination and cell culture technology. Means a proven generic drug.
  • the variant includes all similar sequences that include one or more mutations at amino acid positions that retain the essential physiological activity of the anti-vascular endothelial growth factor agent while not affecting this activity. That is, the anti- listed above It may be a functional variant that is at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 903 ⁇ 4 and most preferably at least 95% identical to the amino acid sequence of the vascular endothelial growth factor preparation.
  • the "antagonist of the receptor” means that one or more biological activities of the receptors for VEGF, PDGF, PIGF, FGF, TGF, ANG, HGF, IGF, AL 1, ephr in A and Inter leukin Means an antibody.
  • Such antibodies may exhibit a function of inhibiting molecular biological signaling for angiogenesis by interfering with binding of the receptor to the ligand.
  • the antibody may be composed of polyclonal antibody, monoclonal antibody, chimeric antibody, humanized antibody, Fv-fragment, Fab-fragment, F (ab ') 2-fragment and scFv fragment. ) Is not only in the form of a whole ant ibody, but also includes functional fragments of antibody molecules.
  • the angiogenesis-related disease refers to a disease caused by the formation of blood vessels in which capillaries extend in the form of vascular endothelial cells invading tissues from existing blood vessels, and non-limiting examples thereof are rheumatoid Arthritis, psoriasis, inflammation, endometriosis and hemangiomas.
  • the cancer is squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma of the lung, peritoneal cancer, skin cancer, skin or intraocular myeloma, rectal cancer, anal muscle cancer, esophageal cancer, small intestine cancer , Endocrine adenocarcinoma, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, hepatocellular carcinoma, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, liver tumor, breast cancer, Colon cancer, colon cancer, endometrium or uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, vulva cancer, thyroid cancer, liver cancer and head and neck cancer may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition characterized in that the tissue-penetrating peptide binds to both neurophylline l (NRPl) and neurophyllin 2 (NRP2) or specifically to neuropilin 1 only.
  • the peptide that binds to both neurophylline 1 and neurophylline 2 of the tissue-penetrating peptide is any one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 4
  • a peptide comprising an amino acid sequence and specifically binding to neuropilin 1 may be characterized by including any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5-7.
  • the tissue-permeable peptide represented by the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 4 is a peptide capable of binding to both neurophylline 1 and 2, and the binding site amino acid sequence of the VEGF 165 ligand that binds to the blb2 domain of neurophylline And peptides designed based on the similarity of their C-terminal sequences by analyzing the length and analyzing the nucleotide sequences of the purine C-terminal sequences of semaphorin 3A and semaphorin 3F known to bind neuropilins.
  • the tissue-permeable peptide represented by the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 7 is a peptide that binds only to neurophylline 1 without binding to neurophylline 2, and the present inventors of the heavy chain variable region (Fc) By designing a peptide library fused at the C-terminus (Carboxy terminus), expressing it on the surface of the yeast cell to construct an Fc-fusion peptide library, and selecting a clone that selectively binds to the bl domain of neurophylline 1 Derived peptides were isolated and identified.
  • Fc heavy chain variable region
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 7 is as follows:
  • the fusion protein may be characterized in that the tissue-penetrating peptide and the anti-VEGF agent are fused through a linker, and the linker peptide is composed of 1 to 100 amino acids. It may be, preferably consisting of 4 to 20, more preferably 4 to 15 amino acids.
  • the linker peptide may be composed of glycine (serine), serine (ser ine) or alanine (al anine), preferably, the sequence of the linker peptide is an amino acid sequence of (GA) n or (GGGGS) ra It can be made (wherein n and m are each independently an integer from 1 to 20), more preferably may be composed of the amino acid sequence of GAGA or (GGGGS) 3.
  • the linker used an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (GGGGSGGGGSGGGGS).
  • the fusion protein is a fusion protein fused with Avast in and a tissue-permeable peptide
  • the heavy chain has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or 10
  • the light chain has a amino acid sequence of SEQ ID NO: 11
  • the fusion protein may be an fusion protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 in the heavy chain and a light chain of the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising a fusion protein in which a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent are fused.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis, comprising a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent. All.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis consisting essentially of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent.
  • Cancer metastasis is when cancer cells spread from one primary cancer to another, forming new cancers. Since metastasis is a life-threatening phenomenon in various cancer patients, preventing or controlling metastasis is an important goal of cancer research. If the diagnosis is made early in the absence of metastasis, surgery, chemotherapy or radiation therapy is effective, but if the metastasis is made at diagnosis, the effectiveness of these treatments is reduced. In addition, metastasis was not confirmed at diagnosis, but metastasis is often confirmed during and after treatment.
  • Metastasis consists of successive stages of invasion, intravasat ions, arrests, extravasat ions, and colonization, through which primary organs It starts at and eventually forms cancer in other organs.
  • Penetration the first stage of metastasis, involves changes in the interaction of cancer cells with intercellular or extracellular matrix, degradation of surrounding tissues, and migration of cancer cells into tissues.
  • the fusion protein Avast in-A22p
  • the fusion protein according to the present invention inhibits the signal transduction by other growth factors in addition to VEGF-A, it is judged to have an excellent metastasis inhibitory effect on tumor cells that are resistant to Avast in.
  • PDGF binds to PDGF receptors in cancer cells
  • the phosphorylation of pl30cas protein is increased and migrat ion and invasion of cancer cells are promoted.1
  • Avast in was treated, the phosphorylation of pl30cas protein was not changed. It was confirmed that in-A22p was inhibited to the control level by treatment.
  • the fusion protein according to the present invention not only inhibits VEGF but also binds to NRP1 to inhibit signal transduction by PDGF, thereby inhibiting migrat ion and invasion of tumor cells by PDGF. In addition, it can be judged to have an effective metastasis inhibitory effect even against tumor cells resistant to anti-VEGF agents. Therefore, in the present invention, the cancer may be characterized in that it is resistant to or anti-angiogenic agent.
  • the present invention provides the use of a fusion protein in which a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent are fused to prepare an agent for treating cancer or angiogenesis-related diseases.
  • the present invention provides a method for treating cancer or angiogenesis-related diseases, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent. To provide.
  • the present invention provides a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent to an individual in need thereof, an effective amount of a composition consisting of an active ingredient.
  • the present invention relates to a cancer or angiogenesis method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition consisting essentially of a fusion protein in which a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent are fused.
  • the present invention provides a use of a fusion protein in which a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent are fused to prepare an agent for inhibiting cancer metastasis.
  • the present invention provides a method for inhibiting cancer metastasis, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising a fusion protein fused to a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent. .
  • the present invention also provides a method for inhibiting cancer metastasis, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising an active ingredient of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent. to provide.
  • the present invention is to inhibit the cancer metastasis, characterized by administering to the subject in need thereof an effective amount of a composition consisting essentially of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent
  • a composition consisting essentially of a fusion protein fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-angiogenic agent
  • the term 'oil amount' of the present invention when administered to a subject, refers to an amount that shows an effect of improving, treating, preventing, detecting, diagnosing or inhibiting cancer metastasis, or reducing cancer or angiogenesis-related diseases. It may be an animal, preferably a mammal, especially an animal including a human, or may be a cell, tissue, organ or the like derived from the animal. The subject may be a patient in need of the effect.
  • the term 'treatment' of the present invention broadly refers to improving symptoms of cancer or angiogenesis-related diseases or cancer or angiogenesis-related diseases, which are intended to cure, substantially prevent, or ameliorate such diseases. May include, but is not limited to, alleviating, healing or preventing one or most of the symptoms resulting from cancer or angiogenesis-related diseases.
  • the term 'compr i sing' of the present invention is used in the same way as 'containing' or 'characteristic', and in the composition or method, additional component elements or method steps not mentioned, etc. Does not exclude The term 'consisting of' means to exclude additional elements, steps or components, etc., unless otherwise noted.
  • the term 'essent ial ly consist ing of' means to include, in the scope of a composition or method, a component element or step described, as well as a component element or step that does not substantially affect its basic properties, and the like. it means.
  • the pharmaceutical composition for the treatment of cancer or angiogenesis-related diseases comprising a fusion protein fused with a tissue-penetrating peptide of the present invention and an anti-angiogenesis agent is an tumor-permeable agent of an anti-angiogenic agent.
  • Improved, cancer-targeting effects and excellent therapeutic effects at low doses can alleviate the side effects of anti-angiogenic agents, and by simultaneously binding to angiogenic vascular growth factor and NRP1 It can also show excellent therapeutic effects in cancers or angiogenesis-related diseases that are resistant to anti-angiogenic agents.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a fusion protein (Avastin-A22p) fused with a tumor-penetrating peptide and an anti-vascular endothelial growth factor.
  • Figure 2 shows the results of confirming the fusion protein fused to the tumor-penetrating peptides and the anti-vascular endothelial growth factor by SDS-PAGE (Lane 1: Avastin, Lane 2: Avast in-A22p, Lane 3: Avastin-TPPll).
  • Figure 3 shows the result of confirming the fusion protein (Avastin-A22p) fused with tumor-penetrating peptides and anti-vascular endothelial growth factor by SE-HPLC (A: Avastin, B: Avast in-A22p).
  • A Avastin
  • B Avast in-A22p
  • 4 is a result of evaluating the binding strength of Avastin-A22p with NRP1 or VEGF (A: binding strength with NRP1, B: binding strength with VEGF).
  • FIG. 5 shows the results of observing protein distribution in cancer tissues by fluorescence microscopy after 3 hours, 8 hours, and 16 hours after the administration of Avast in and Avastin-A22p to SW620 xenograft animal model (Veh: saline administration group).
  • Figure 6 shows the results of evaluating the change of pericyte coverage in cancer cells when Avastin-A22p treatment (PECAM1: vascular staining, NG2: pericyte staining)
  • FIG. 7 shows the results of evaluating the anticancer efficacy of Avastin-A22p in the SW620 xenograft animal model.
  • FIG. 8 shows the results of migGF treatment of HCT116 / bev cells showing resistance to Avastin, followed by induction of migration by luM treatment of Avastin or Avast in-A22p, respectively (A: micrograph, B : The result of graph quantifying the results of microscopy).
  • Avastin-A22p inhibits PDGF-induced signaling, and treated U87MG cells with 25 ⁇ g / ml of Avast in and Avastin-A22p and 50 ng / tnl after 30 minutes. It was the result of checking the protein phosphorylation of pl30cas (A: Western blotting, B: Western blotting graph, A22p + P: Avast in-A22p 25ug / ml + PDGF 50ng / ml, P: PDGF 50ng / ml, C: control, A + P: Avastin 25ug / ml + PDGF 50ng / ml).
  • Figure 11 shows the result of confirming the fusion protein fusion of tumor-penetrating peptides and anti-vascular endothelial growth factor by SE-HPLC (A: Avast in (V) -A22p, B: Avast in-A22p).
  • Avastin (V) -A22p shows the ratio of Avastin (V) -A22p to NRP1 or VEGF with Avastin-A22p.
  • the results of the evaluation were as follows: A: binding strength with NRP1, B: binding strength with YEGF.
  • TPP Avast in-tissue Permeable Peptide
  • tissue permeability can bind both neurophylline l (NRPl) and 2 to the C-terminus of Avast in or specifically bind to neurophylline 1 in order to increase the efficacy and overcome resistance of Avast in, an anti-VEGF agent.
  • the peptide (TPP) was intended to be fused, and the amino acid sequence of TPP is shown in Table 1 below.
  • TPP having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4 in the sequence list of Table 1 is capable of binding to both neurophylline 1 and 2, TPP having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 to 7 specifically specific to neurophylline 1 Combination is possible.
  • FIG. 1 A schematic diagram of a fusion protein in which TPP is fused to Avast in is shown in FIG. 1.
  • the heavy chain is SEQ ID NO: 13
  • the light chain is a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, iii. Drugbank. obtained from com and used in this experiment.
  • A22p a TPP having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the TPPs shown in Table 1, is a modification of the C-terminal sites of VEGF 165 and semaphorin 3-series ligands of intrinsi cl igand of T.
  • TPP (A22p) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • TPP TPPll having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • A22p having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • TPP TPPll having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • the marker marker DHFR gene was inserted into the K-) vector and the heavy and light chains of Avast ⁇ - ⁇ 22 ⁇ and Avast in-TPPll were cloned with restriction enzymes Not l and BamHI, respectively.
  • the plasmid encoding the protein fused with the heavy chain constant region of the antibody constructed above and the peptide binding to NRP1 in CHO DG44 cells and the plasmid encoding the light chain protein were expressed using Neon TM eletroporesi s. . T25 i lask was inoculated with 3X10 6 eel Is transfected with each plasmid and incubated at 37 ° C.
  • Proteins fused with purified antibody heavy chain constant regions and peptides specifically binding to selected NRP1 were quantified using absorbance and extinction coefficient at the corrected 280nm wavelength. Proteins fused with purified antibody heavy chain constant regions and peptides that specifically bind to selected NRP1 were analyzed in 10% SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions.
  • Each protein was purified from the culture solution recovered from cell lines expressing Avast in, Avast in-A22p, and Avast in-TPPll, and isolated by SDS-PAGE.
  • the Avast in-A22p and the Avast in-TPPll normally form antibodies, and the peptides are fused to the Avast in under the reducing conditions, so that the size of the Avast in-A22p and the Avast in-TPPll is larger than that of the Avast in in the reducing conditions.
  • the expression of Avast in-A22p and Avast in-TPPll at similar levels showed that TPP fusion did not significantly affect antibody expression.
  • HPLC High performance ipid chr Tiatography
  • Avastin-tissue permeable peptide (TPP) assembly protein The N-terminus of Avastin-A22p, the fusion protein prepared in Example 1, removes VEGF as in Avastin, and A-22p at C-terminus is Avastin-A22p and NRP1 and VEGF binding ability were evaluated to assess whether double binding of NRP1 could block related signal transduction.
  • the binding capacity of the purified Avastin-A22P to the neuropilin 1 blb2 domain (Neuropil in l-blb2 domain) was confirmed by ELISA (Enzyme Linked I unosorbent Assay).
  • Herceptin-A22p was used as a positive control and Avastin (Roche co., Swiss) was used as a negative control.
  • the blb2 domain (273-586) of target molecule neurophylline 1 was bound to 96 well Maxibinding Immuno plates (SPL Life sciences., Korea) at 37 ° C for 2 hours at ig per well for 2 hours at 0.1% PBST (0.1% Tween20, P H 7.4, 137 mM NaCl ⁇ 2.7 mM C1, 10 mM Na 2 HP0 4 , 2 mM K3 ⁇ 4P0 4 ).
  • Avastin-A22p As a positive control Herceptin-A22p, as a negative control Avastin (Roche co., Swiss) the use and diluted Avastin-A22p as experiment with 0.1% PBST be a 50nM, 25nM, 12.5nM, 6.25nM 37 ° C for each concentration After treatment for 1 hour at and washed three times for 1 minute with 0.1% PBST.
  • HRP conjugated anti-kappa light chain antibody (Horseradish peroxidase—conjugated ant i -human kappa light chain mAb, SIGMA-ALDRICH co., USA) was diluted 100, 000 times in 0.1% PBST containing 5% skim milk. 30 min treatment at 37 ° C. Then washed 5 times with 0.1% PBST for 1 minute.
  • TMB HRP colorimetric substrate (Surmodics co., USA) was treated and reacted at room temperature for 10 minutes, and then treated with IN HC1 (stop buffer) of eastern blood and absorbance was measured at 450 nm.
  • Avastin-A22p neurophilin 1 blb2 domain was confirmed.
  • Purified Avastin-A22p Recombinant human VEGF 165 (R & D systems co. China's binding capacity was confirmed by ELISA. Avast in was used as a positive control and HCT-A22p was used as a negative control.
  • the target molecule Recombinant human VEGF 165 was bound to 96 wel l Maxibinding Immuno plates at 0.2 ° C. for 2 h at 37 ° C. for 2 hours and then washed three times with 0.1% PBST for 1 min.
  • the reaction was treated with a ⁇ 1 ⁇ HRP colorimetric substrate at room temperature for 10 minutes, and then treated with IN HC1 of eastern blood, and the absorbance was measured at 450 nm.
  • the resulting ELISA results confirmed the binding capacity of the purified Avast in-A22p to Recombinant human VEGF 165. The results for this are shown in FIG. 4.
  • Avast in-A22p binds to NRP1 at the same level as HCT-A22p used as a control, and VEGF also binds at the same level as Avast in.
  • Avast in is not a drug that is specifically targeted for cancer, so it can be distributed not only in high doses but also in other tissues with high VEGF levels in addition to cancer tissues.
  • Avast in-A22p targets NRP1 present in the neovascularization of cancer tissues and masses to determine whether the distribution in cancer cells is superior to Avast in.
  • the extracted tumor was cut to a thickness of 8 um by using a paraf f in sect ion method, the primary antibody NG2 antibody (Cel l Signaling technology, USA) and Alexa (red fluorescence) Peripheral cells were stained with secondary antibody bound to Li fe Technologies) and Alexa® 488 (Green fluorescence, Li fe Technologies), which recognizes IgG, was used to observe Avast in and Avast in_A22p in tissues. Bound antibody was used. The results for this are shown in FIG. 5.
  • Avast in-A22p had a higher concentration in cancer tissue than Avast in from 3 hours after administration, and a greater amount of protein was distributed among cells away from blood vessels over time.
  • the angiogenesis in the tumor mass was also effectively reduced.
  • Avast in-A22p can be expected to have better cancer targeting ability and tissue penetration than Avast in.
  • VEGF-A Unlike Avast in, not only VEGF-A but also VEGF-B, VEGF-C, P1GF Inhibition of various neovascularization factors such as angiogenesis could be judged more effectively.
  • Angiogenesis is normalized or reconstructed when VEGF levels are high, blood vessels grow through cell division and growth, and then VEGF levels are lowered and PDGF levels are elevated.
  • the normalization process includes reducing the number and size of immature blood vessels and reducing blood vessel pressure caused by interstitial fluid by pericyte covering the blood vessels.
  • VEGF levels are lowered by the administration of Avast in, blood vessels increase per icyte coverage through normalization and thus weaken the invasion of the drug into cancer tissues.
  • Avast in and docetaxel are combined with non-small cell lung cancer, A decrease in drug infiltration has been reported (Arjaans et al., 2013). This not only means that there is a limit to the co-administration of Avast in with other drugs, but it is also believed to be a cause of Avast in resistance.
  • Fan et al reported that continuous treatment of Avast in for 3 months in primary or metastatic colorectal cancer cell lines resulted in the formation of cell lines specific for Avast in both cell lines. Because of its increased mobility, xenograft was found to be more metastasized than conventional cancer cells. These Avast in adaptive cell lines are highly expressed in VEGFR1 and NRP1, and are transformed into cells that secrete various neovascularization factors such as VEGF-B, VEGF-C, and P1GF, as well as VEGF-A. (Fan et al., 2011).
  • Avast in-A22p or Avast in-TPPll which binds to NRP1 and inhibits the signaling of various neovascularization factors in addition to VEGF-A, has been shown to It was determined that the growth and metastasis of resistant cell lines could be effectively inhibited.
  • the combination of anti-NRP1 antibody and VEGF inhibitor in combination with anti-NRP1 antibody reduces pericyte coverage of blood vessels by directly regulating the normalization of blood vessels and may be directly related to the improvement of anti-cancer efficacy.
  • the present inventors conducted a test to compare the change of per icyte coverage in cancer tissues in a xenograft model administered with Avast in and Avast in-A22p by light microscope. To determine the angiogenesis and inhibitory effect of Avast in-A23 ⁇ 4 on the angiogenesis and hemagglutinin stabilization in mouse models, the Avast in-A22p and Avast in were isolated after implanting SW620 into nude mice.
  • SW620 cells were injected into Balb / c nude mice, and when the tumor volume reached about 250 mm 3 , PBS, Avast in and Avast in-A22p were intravenously injected at 5 mg / kg, respectively. After 16 hours each, tumors were removed from the mice and immunohistochemistry experiments were performed. The isolated tumors were cut to 8 um thickness by paraffin sectioning and stained vascular cells with a secondary antibody combined with a primary antibody, PECAMl (Sigma) and Alexa® 488, which recognized it, and a NG2 primary antibody. Peripheral cells were stained with a secondary antibody bound to the antibody and Alexa®594. The results for this are shown in FIG. 6.
  • SW620 xenograft model which is a colorectal cancer cell line.
  • SW620 cell line is a tumor cell line with 45% RGI against VEGF. This animal experiment was performed for the purpose of evaluating anticancer efficacy against common tumors.
  • Avast in-A22p was equivalent to or more potent than Avast in (results not shown) .
  • Avast in 5mg / kg and Avast in in Balb / c-nude mice implanted with SW620 cells -A22p 0.5, 1.25, 2.5 mg / kg were administered intravenously for 5 weeks twice a week. The results for this are shown in FIG. 7.
  • Avast in-A22p exhibits the same anticancer effect even at a quarter dose of Avast in is thought to be a result of blocking NRP1 signaling by A22p, which may reduce the potential for side effects through reduced doses even in clinical applications. You can say that.
  • NRP1 acts as a co-receptor with VEGFR1, VEGFR3, C-met, and PDGFR to affect signal transduction.
  • the present inventors attempted to determine whether A22p fused with Avast in competitively inhibits binding with other angiogenic factors that bind to NRP1.
  • HCT116 / bev has higher expression levels of VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, and P1GF than HCT116, the parent cell, and the ability of cel l migrat ion and metastasis to outperform parent cells (Fan et al., 2011). If in_A22p inhibited migrat ions of HCT116 / bev cells, it could be determined that the resistance to Avast in could be overcome and the potential for increased efficacy. Specific test methods are as follows.
  • HCT116 and HCT116 / bev cells were divided into 6-wel l folates each with 4 x lo wel l and cultured for 2 days. Thereafter, a cross-shaped blank was made in each wel l, and the medium was removed and VEGF was added to 50ng / ml in MEM-alpha medium containing 1% FBS. Avast in and Avast in-A22p were treated to luM, respectively. Blanks were taken immediately after treatment with the drug (0 hour), and the same location was taken at 48-hour intervals. The shooting result is calculated using the Image J program to calculate the area of blank spaces. Inversely, the degree of cell migration was quantified to compare the cell migration inhibition of Avast in—A22p and Avast in. The results for this are shown in FIG. 8.
  • HCT116 increased migrat ion from 51.7% to 67.4% by VEGF and decreased to 61.2% and 61.7%, respectively, when treated with Avast in and Avast in-A22p.
  • HCT116 / bev cells were 65.3% more aggressive than HCT116 in the VEGF-treated group and increased to 72.9% in the VEGF-treated group.
  • migrat ion There was no difference in migrat ion by 74.1% by Avast in, but 66.2% by Avast in-A22p treatment was found to inhibit migrat ion to the same level as the group without VEGF treatment.
  • HCT116 / bev increased migrat ion with or without VEGF-A compared to HCT116 / bev apoptotic HCT116, indicating that HCT116 / bev increased VEGF-A as well as other growth factors depending on other growth factors.
  • Avast in treatment did not inhibit this, but Avast in-A22p treatment reduced migrat ion to the level without VEGF-A treatment.
  • Avast in-A22p inhibits signal transduction by other growth factors in addition to VEGF-A and thus may contribute to overcoming resistance by Avast in.
  • VEGF-A by inhibiting other signal transfer as well as enhance the anti-cancer "effect potential resistance occurs it suggests that even lower.
  • NRP1 acts as a co-receptor for PDGF receptors, enhancing signal transduction by PDGF.
  • the binding of PDGF to these receptors in cancer cells is known to increase pl30cas protein phosphorylation, thereby promoting cancer cell migrat ion and invasion.
  • the inventors tried to determine whether A22p fused with Avast in inhibits PDGF signal transduction by binding to NRP1.
  • U87MG cells were treated with 25 ⁇ g / ml of Avast in and Avast in-A22p, and then treated with 50 ng / ml of PDGF after 30 minutes. After 5 minutes, proteins were extracted and pl30cas phosphorylation was compared using ant i-phospho-pl30 ant ibody and ant i-pl30cas ant ibody. The results are shown in FIG. 9.
  • pl30cas phosphorylation was increased by PDGF, and there was no difference in Avast in treatment, but it was confirmed that phosphorylation was suppressed to vehicle level in the Avast in-A22p treatment group.
  • Avast in-A22p not only removes VEGF-A but also binds to NRP1 and thus inhibits signal transduction by PDGF and can increase anticancer effect by inhibiting migrat ion and invasion by PDGF.
  • Avast in (V) tissue-penetrating peptide
  • a fusion protein fused with TPP (A22p) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at the C-terminus of Avast in (V) and a cell line producing the same were prepared.
  • PCDNA3 The marker marker DHFR was inserted into the K-) vector and the Avast in (V) -A22p heavy and light chains were cloned with restriction enzymes Not l and BamHI, respectively.
  • the plasmid encoding the protein fused with the heavy chain constant region of the antibody constructed above to the CHO DG44 cells and the peptide binding to NRP1 and the plasmid encoding the light chain protein were expressed using Neon TM eletroporesis.
  • T25 f lask was inoculated with 3 ⁇ 10 6 cel ls transfected with each Fulamid and incubated at 37 ° C. After obtaining stable cel l using a screening marker, the bioreactor was incubated with serum-free SFM4CH0 (Hyclone) for 7 days in a suspended state at 100 rpm, 37 ° C, pH7.2, and 50% D0 2. . Supernatants were separated from cells by centrifugation and sterilized using a 0.22 ym filter. A culture of Avast in (V) -A22p was recovered and each protein was purified by reference to standard protocols.
  • SFM4CH0 Hyclone
  • the purification column was layered with Protein A resin (MabselectSure resin) (GE healthcare) on an XK16 / 20 column (MabselectSure resin) (GE heal thcare) and applied a linear velocity of 200 cm / h.
  • 1 L of antibody was applied to the Protein A column, and the 15-fold volume of the column was washed with PBSCpH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM C1, 10 mM Na 2 HP0 4 , 2 mM K3 ⁇ 4PO 4 ).
  • Antibody fractions were filtered with a 0.2um filter (Mi ll ipore), concentrated at 3, 500 rpm for 10 minutes using an am i con (30 li CO) concentrator (Mi U ipore), and PBS containing 10% glycerol (pH 7.4).
  • Am i con (30 li CO) concentrator Mi U ipore
  • PBS containing 10% glycerol pH 7.4
  • Avast in (V) -A22p Each protein was purified from the culture solution recovered from cell lines expressing Avast in (V) -A22p and Avast in-A22p, and isolated by SDS-PAGE. In FIG. 10, it was confirmed that Avast in (V) -A22p normally formed an antibody and had a molecular weight similar to that of Avast in-A22p.
  • Avast in (V) -A22p purified in FIG. 11 was analyzed using SE-HPLC. It was confirmed that the purity of Avast in (V) -A22p (FIG. 11A) was more than 97% and the same as that of Avast in-A22p (FIG. 11B).
  • the present inventors prepared an Avast in (V) -A22p fusion protein in which fusion of A22p, which is TPP having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, to Avast in (V) below Activity was evaluated.
  • NRP1 and VEGF binding capacity of the Avast in (V) -tissue permeable peptide (TPP) combination protein Avast in (V) -A22p the fusion protein produced in Example 8, is used for the conventional Avast in-A22p and N-terminus.
  • VEGF was removed in the same manner, and ⁇ -terminal was evaluated for NRP1 and VEGF binding ability of Avast in (V) -A22p to evaluate whether double binding of NRP1 and related signaling could be blocked.
  • Avast in (V) -A22p was confirmed by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Avast in-A22p was used as a positive control.
  • the blb2 domain (273—586) of target molecule neurophylline 1 was bound to 96 wel l Maxibinding Immuno plates (SPL Li fe sciences., Korea) at 37 ° C. for 2 hours at lyg per wel for 2 hours and then 0.1% PBST. (0.1% Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HP0 4 , 2 raM K3 ⁇ 4P0 4 ) for 1 minute
  • TMB HRP colorimetric substrate (Surmodi cs co., USA) was treated and reacted at room temperature for 10 minutes, and then treated with IN HC1 (stop buffer) of eastern blood and absorbance was measured at 450 nm.
  • the resultant ELISA confirmed the binding capacity of the blb2 domain of neurofilin 1 expressed and purified by Avast in (V) -A22p.
  • the binding capacity of purified Avast in (V) -A22p to Recombinant human VEGF 165 was confirmed by ELISA.
  • Avast in-A22p was used as a positive control.
  • the target molecule Recombinant human VEGF 165 was bound to 96 wel l Maxibinding Immuno plates at 0.2 ° C. for 2 h at 37 ° C. for 2 hours and then washed three times with 0.1% PBST for 1 min. Combine for 1 hour in 0.1% PBST with 5% skim milk Washed three times for 1 minute with 0.1% PBST.
  • Avast in (V) -A22p was diluted to 0.1% PBST to 6.25nM, 3.12nM, and 1.56nM, and treated at 37 ° C for 1 hour at each concentration, and washed three times with 0.1% PBST for 1 minute.
  • HRP conjugated ant i-kappa light chain antibody was diluted 100, 000 times in 5% skim milk containing 0.1% PBST and treated at 37 ° C for 30 minutes. Then rinse five times for 1 minute with 0.1% PBST. For color development, the reaction was treated with TMB HRP color imetric substrate for 10 minutes at room temperature, and then treated with IN HC1 of eastern blood, and the absorbance was measured at 450 nm. Through the obtained ELISA results, the binding ability of the purified Avast in (V) —A22p to Recombinant human VEGF 165 was confirmed. The results are shown in FIG. 12.
  • Avast in (V) -A22p bound to NRP1 at the same level as Avast in-A22p used as a control (FIG. 12A) and confirmed to bind to VEGF at the same level as Avast in-A22p as well. (FIG. 12B).
  • the pharmaceutical composition for treating cancer or angiogenesis-related diseases comprising a fusion protein fused with a tissue-penetrating peptide of the present invention and an anti-angiogenesis agent is an tumor-permeable agent of the anti-angiogenesis agent.
  • Improved, cancer-targeting effects and excellent therapeutic effects at low doses can alleviate the side effects of anti-angiogenic agents.

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Abstract

본 발명은 조직 투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (항 -VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생관련 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 발명으로, 보다 구체적으로 본 발명은 항 -혈관 내피세포성장인자 제제의 조직 투과성이 개선되고 암 타겟팅 효과가 발휘되어 신생혈관형성 저해 효과가 우수할 뿐만 아니라, 항 -VEGF 제제에 내성 또는 무반응을 나타내는 암에 대해서도 치료효과를 나타낼 수 있는 융합단백질의 암 또는 혈관신생관련 질환의 치료용도에 관한 발명이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합닸백질을 유효 성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생괌련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
【기술분야】
본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenesis) 제제 가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생관련 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 발명으로， 보다 구체적으로 본 발명은 항-신생혈관생성 제제 의 종양 투과성이 개선되고 암 타겟팅 효과가 발휘되어 신생혈관형성 저해 효과가 우수할 뿐만 아니라， 항-신생혈관생성 제제의 효능을 증진시켜 내성 또는 무반응을 나타내는 암에 대해서도 치료효과를 나타낼 수 있는 융합단백질의 암 또는 혈관신 생관련 질환의 치료 용도에 관한 발명이다.
【배경기술】
본 출원은 2015년 9월 1일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0123878호 를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 혈관신생 (Angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형 성되는 과정을 의미하며， 정상적인 생리작용으로 발생과정과 상처치유 (wound healing), 여성의 생식 사이클에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한， 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있는데, 예를 들어 비정상적으로 과도한 혈관신생은 암의 성장과 전이 (metastasis), 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy), 연령관련 황반변성 (ager elated macular degeneration), 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 자궁내막증， 건선 (psoriasis) 또는 만성 염증 (chronic inf la誦 at ion)과 같은 질환 에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 반면에， 불층분한 혈관신생은 관상 동맥 질환 (coronary artery disease) , 뇌졸중 (stroke), 심근경색 (myocardiac infarction), 궤양 (ulcer) 또는 상처치유의 지연 (delayed wound healing) 등의 원 인이 되고 있다. 상기한 질환들 중 암은 육체를 이루는 세포에 어떤 발암인자가 작용하여 불 규칙하게 분열함으로써， 그 세포 자체가 육체를 구성하는 제어로부터 벗어나 무계 획적으로 증식하게 되는 질병을 의미한다. 나아가 주위에 있는 조직을 침해하고 혈 관， 림프관 등을 통하여 다른 장기로 원격전이하여 장애를 일으키고， 그대로 방치 하면 생명을 빼앗기는 병태이기 때문에 악성종양 또는 악성신생물이라고도 하며， 그 세포를 암세포， 악성세포라고 한다. 암의 종류에 따라 치료 방법이 다양하나 일반적으로 수술， 세포 사멸을 유발 하는 화학적 요법， 방사선 치료 요법， 암세포 표적 치료， 면역치료， 고온열치료, 줄기세포 이식, 광선역학요법 등이 사용되고 있다. 근래에는 정상 세포 파꾀로 인 한 부작용을 최소화하면서 약물의 효능을 높이기 위해 표적 치료를 많이 시행하고 있고 그 종류에는 암 특이적인 성장을 저해하는 신호전달차단제, 암 세포로의 산소 및 영양 공급을 차단하기 위한 신생혈관형성 저해제, 세포 사멸 유도제, ¾역력 증 강제 등이 있다. 신생혈관형성 (angiogenesis)은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정으로 발생ᅳ발달 단계와 정상 세포와 조직의 분열과 성장뿐만 아니라 암세포의 분열과 성장에도 필요한 과정 중 하나이다.
혈관 내피세포 성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)는 혈관 형성에 관여하는 여러 성장 인자 중 하나이며 이들 중 VEGF-A의 역할이 중요하다고 알려져 있다. VEGF-A를 특이적으로 저해함으로써 ^생혈관형성을 억제하는 항 VEGF 단클론 항체 bevacizumab (Avast in)은 2004년과 2005년에 각각 FDA와 EMA에서 5-f luorouraci l과 병용요법으로 전이성 대장암의 1차 또는 2차 치료제로 허가 받았 으며， 그 뒤로도 수백 건의 임상 시험을 통해 전이성 신장암， 전이성 비소세포암, 진행성 교모세포종과 전이성 유방암 등 다양한 암 치료제로 숭인받았다.
Avast in과 같은 항 -VEGF 제제들은 신생혈관형성이 활발하게 일어나는 암으로 표적할 수 있으나， 암 뿐만 아니라 VEGF 농도가 높은 타 장기에도 영향을 주기 때 문에 신장과 위 등에서 부작용이 용량 의존적으로 나타난다. 한편， 신생혈관형성에는 VEGF-A외에도 f ibroblast growth factor (FGF) , notch l igand/receptor system, placenta growth factor (PIGF) , platelet-der ived growth factor-BB (PDGF-BB) 등 다른 성장인자와 신호 전달 기작이 관여하기 때문 에 상기 Avast in과 같은 항 -VEGF제제들에 의해 VEGF-A가 차단되더라도 다른 기전을 통한 보상이 가능하다ᅳ 따라서 많은 환자들이 Avast in과 같은 항 -VEGF 제제에 무반 웅이거나 반복적인 Avast in 투여에 의해 내성이 발생되어 뚜렷한 효과를 볼 수 없 는 것으로 추정된다.
Avast in과 같은 항 -VEGF 제제들은 VEGF-A에 의한 신호 전달을 차단함으로써 신생혈관형성을 저해하여 높은 항암 활성을 갖고 있기 때문에 치료가 어려운 전이 성 암을 포함한 다양한 암종에 단독 혹은 병용요법으로 적용이 가능한 효과적인 제 제이다. 그럼에도 블구하고 작용기전과 투여용량에 기인한 내성 및 부작용 때문에 임상에서의 효과가 기대보다 낮고 사용이 제한적이다. 따라서 이러한 Avast in과 같 은 항 -VEGF 제제들의 단점은 극복하고 효능을 높일 수 있는 새로운 제제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에 본 발명자들은 항-신생혈관생성 제제에 뉴로필린 수용체 (NRP)을 타겟 팅하는 종양 투과성 펩타이드 (TPP, tumor penetrat ing pept ide)를 융합한 융합단백 질이 항-신생혈관생성 제제의 종양 투과성을 증가시킬 뿐만 아니라, TPP에 의한 암 타겟팅 효과가 발휘되어 높은 투여 용량의 감소에 의한 환자 편의성 증가 뿐만 아 니라 용량 의존적 부작용도 줄일 수 있고， 항-신생혈관생성 제제의 지속적인 사용 에 의한 혈관주변 미세 환경 변화에서 유래하는 내성을 극복할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 - angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신 생 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융 합된 융합단백질을 유효성분으로 구성되는 암 또는 혈관신생 관련 질환 치료용 약 학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융 합된 융합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성되는 암 또는 혈관신생 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈 ¾생성 (항 - angiogenes i s) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제 가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 구성되는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제 가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성되는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 암또는 혈관신생 관련 질환 치료용 제제를 제조하기 위한 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenesi s) 제제가 융합된 융합단백질의 용도를 제공하는 것이다/ 본 발명의 다른 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 - angiogenesi s) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효 량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 또는 혈관신생 관 련 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제 가융합된 융합단백질을 유효성분으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하 는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 또는 혈관신생 관련 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제 가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성되는 조성물의 유효량을 이 를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 의 치료방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 암 전이 억제용 제제를 제조하기 위한 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angi ogenesis) 제제가 융합된 융합단백질의 용도 를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항- angiogenesi s) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효 량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈 ¾생성 제제 가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하 는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 억제하는 방법을 제공하는 것이 다.
또한 본 발명의 다른 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제 가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성되는 조성물의 유효량을 이 를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈 관생성 (항 -angiogenesi s) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 구성되는 암 또는 혈관 신생 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성되는 암또는 혈관신생 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenes i s) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포 함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 종양 투과성 펩타이 드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 구성되는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 종양 투과성 펩타이 드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성 되는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 암또는 혈¾신생 관련 질환 치료용 제제를 제조하기 위한 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angi ogenes i s) 제쎄가 융합된 융합단백질의 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 종양 투과성 펩타이드와 항—신생혈 관생성 (항 -angiogenesi s) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 조 성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 또는 혈관신생 관련 질환의 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 종양 투과성 펩타이드와 항-신 생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 또는 혈관신생 관련 질 환의 치료방법을 제공함다.
또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 종양 투과성 펩타이드와 항―신 생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성되는 조성물 의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 또는 혈관 신생 관련 질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 암 전이 억제용 제제를 제조하기 위 한 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenes i s) 제제가 융합된 융 합단백질의 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈 관생성 (항 -angiogenesi s) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 조 성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 종양 투과성 펩타이드와 항-신 생혈관생성 제제가욥합된 융합단백질을 유효성분으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 종양 투과성 펩타이드와 항-신 생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성되는 조성물 의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 억 제하는 방법을 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenesi s) 제제 가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 치료 용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 구성되는 암 또는 혈관신생 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenesi s) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성되는 암 또는 혈관신생 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 혈관내피세포 성장인자 -A(VEGF-A)는 혈액의 분출 (일혈, Extravasat ion)을 유도하는 것으로 잘 알려져 있다. 이는 다른 이름으로 혈관투과성인자 (Vascular permeabi l i ty factor)로도 불린다. 이 작용은 혈관내피세포 성장인자 수용체 (VEGFR2)와 결합으로 인한 현상으로 알려져 있는데, 흥미롭게도 혈관 내피세포 성 장인자 -A의 돌연변이 실험에서 혈관내피세포 성장인자 수용체에 결합하지 못하더라 도， 혈관투과성이 증진되는 사례를 보여주었다. 이는 혈관내피세포 성장인자 -A의 또 다른 수용체가 존재함을 제시하였다 (Stacker et al . 1999) . 뉴로필린은 Takagi et al . , (1987)과 Fuj i sawa et al . , (1989)에 의해 처음 으로 Xenopus nervous system에서 발견되었다. 뉴로필린은 막투과성 당단백질 ( transmembrane glycoprotein)로서, NRP1 및 NRP2의 두 가지 형태가 있다. 뉴로필 린은 VEGF 패밀리 리간드 결합에 의해 VEGFRs (VEGF receptors)들의 공수용체 (coreceptor)로 작용한다. 특히 NRP1은 VEGFR1 , VEGFR2， VEGFR3의 공수용체로 작용 하여 다양한 VEGF 리간드와 결합함으로써 리간드와 수용체간의 결합력을 강화시킨 다는 것이 NRP1에 의한 VEGF165가 VEGFR2의 결합력 변화를 통해 밝혀졌다 (Soker et al . , 1998) . 반면 NRP2는 VEGFR2, VEGFR3의 공수용체로 작용하여 림프관 형성 ( lymphangiogenesi s) 및 세포부착 (adhesion)에 기여한다. 또한 NRP1/NRP2 (NRPl/2)는 Plexin fami ly receptors의 공수용체로 작용하여 분비된 세마포란 3계 열 리간드 (class 3 semaphorins ： Sema3A , Sema3B , Sema3C , Sema3D, Sema3E , Sema3F, Sema3G) 리간드와 결합한다.
NRP1은 VEGFR-2와 co-receptor로 작용하여 내피세포에서 세포 이동과 혈관신 생을 증가시키고 per i cyte가 혈관을 둘러싸는 혈관 재건축 과정에 관여하는 등 혈 관 발달에 주요한 인자이다. 또한 vascular endothel ial (VE)-cadher in과 epi thel ium-speci f i c cel l adhesion molecule (E—cadher in)의 발현을 증가시켜 세 포와 세포 사이의 adherent junct ion을 유지시키는 역할을 한다. 특히 NRP1은 폐， 유방, 전립선， 췌장과 대장 등 다양한 암 세포주에서 고발현되며， advanced colorectal carcinoma 환자 중 NRP1의 발현이 높으면 림프절이나 간으로의 전이 가 능성이 높고 생존률이 짧은 것으로 알려져 있는 등 NRP1과 암 전이와의 관련성이 임상적으로도 밝혀져 있다. 본 발명에서 상기 "종양 투과성" 이란 NRP를 과발현하는 조직을 특이적으로 인식하여*축적되거나， 혈관내피세포의 세포간극을 넓혀 약물의 혈관밖 유출을 촉진 시키고， 수용성 분자에 대한 장^ (barr ier) 역할을 하는 조직인 각막세포간극을 조 절하여 약물의 조직 내 분포를 촉진하는 특성 중 어느하나의 특성을 갖는 것을 의 미한다. 신생혈관생성 (angiogenesis)는 단순한 혈관내피세포의 성장 뿐 아니라 내피 세포의 기저막 (basement membrane) 침투, 이동 (migrat ion)과 분화 그리고 모세혈 관 형성 등 다양하고 복잡한 일련의 과정이 필요하다. 혈관형성과정을 조절하는 많 은 촉진 인자와 억제 인자들이 보고 되었다. 또한， 신생혈관 형성을 위해서는 조직 분해효소의 활성화 등이 필요하며， 이러한 일련의 과정은 암 세포의 침투 ( invasion) 과정과 매우 유사하다. 가장 잘 알려진 혈관형성 촉진인자는 혈관 내피세포 성장인자 (vascular endothel ial growth factor , VEGF)이다. VEGF는 32-44 kDa의 크기로 거의 모든 세 포에서 분비되며， 종양의 침투성과 깊은 관계가 있다 (Takahashi et al . , 1995) . VEGF는 일찍이 혈관유출인자 (vascular permeabl i ty factor)로 알려졌으며， 히스타 민 보다 50, 000배 이상의 강력한 혈액 유출 효과를 나타내었다 (Senger et al . , 1983) . 이러한 혈액 유출에 대한 특성은 혈액내의 단백질을 혈관 밖으로 이동시켜 새로운 혈관이 형성되는데 도움을 준다.
최근 angiopoiet ins류의 단백질이 새롭게 분리 정제되었으며, 신생혈관구조 형성에 중요한 작용을 하는 것으로 알려지고 있다. Angiopoiet ins (ANG) 단백질은 Ang-Ι과 Ang-2로 구분되며， 이들은 내피세포에 특이하게 존재하는 Tie_2 수용체와 결합한다. Ang-1은 내피 세포의 분화와 안정화에 관여하는 반면, Ang-2는 Ti e-2 수 용체에 결합하여 Ang-1의 결합을 억제함으로 내피세포의 비안정화 및 혈관퇴화 (vascular regression)의 결과를 가져온다. 암 조직에서 신생혈관 형성을 위해서 먼저 암세포가 기존의 혈관을 선택하여 혈관공용 (vascular coopt ion) , 그리고 혈 관퇴화 과정을 거치게 되는데 이때 Ang-2가 작용을 나타낸다 (Holash et al .， 1999) . 상기한 VEGF 및 ANG 이외에도 혈관신생과정에는 PIGF(placenta growth factor) , FGF(f ibroblast growth factor) , PDGF(platelet— derived growth factor ) , HGF(hepatocyte growth factor) , TGFCtransforming growth factor) , IGF( insul in— l ike growth factor) , Ephr in, Inter leukin 및 BMP (bone morphogenet i c protein)를 포함하는 다양한 리간드들이 일련의 수용체를 활성화시킴으로써 촉진되는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 상기 "항 -신생혈관생성" 은 신생혈관생성과 관련된 분자들과 천연 수용체 사이의 상호작용을 방해하는 분자， 예를 들면， VEGF 또는 VEGF 수용체 에 결합하여 VEGF와 VEGF 수용체 사이의 상호작용을 방지하거나 그렇지 않으면 저 지하는 분자를 포함한다. VEGF 길항제로는 항 -VEGF 항체， 항 -VEGF 수용체 항체 및 VEGF 수용체 -기반 키메라 분자가 포함된다. 또한 PDGF, P1GF, FGF, TGF, ANG, HGF, IGF, Ephr in A, Interleukin, BMP과 각각의 수용체가 결합하여 서로의 상호작용을 방지하거나 그렇지 않으면 저지하는 분자를 포함한다. 이들의 길항제로는 항 -PDGF, 항 -P1GF, 항 -FGF, 항 -TGF, 항 -ANG, 항 -HGF, 항 -IGF, 항 -Ephrin A, 항 -Inter leukin, 항 -BMP 항체와 각각의 수용체의 길항 항체 및 수용체 -기반 키메라 분자가 포함된 다. 본 발명에 있어서 "융합" 은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일 체화하는 것으로， 항-신생혈관생성 제제에 종양 투과성 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람 직하게는 링커 펩타이드에 의할 수 있으며， 이 링커 펩타이드는 예를 들면 항체의
Fc 단편의 C 말단에 결합할 수 있다. 한편, 항-신생혈관생성 제제는 신생혈관생성에 관련된 신호 전달을 차단함으 로써 신생혈관형성을 저해하여 높은 항암 활성을 갖고 있기 때문에 치료가 어려운 전이성 암을 포함한 다양한 암종에 단독 혹은 병용요법으로 적용이 가능한 효과적 인 약물이다. 그럼에도 불구하고 작용기전과 투여용량에 기인한 내성 및 부작용 때 문에 임상에서의 효과가 기대보다 낮고 사용이 제한적이다. 이러한 항—신생혈관생 성 제제들 중 가장 대표적인 약물인 항 -VEGF 제제， Avast in (물질명 bevaci zumab)은 다른 항체의약품과 달리 암 특이적으로 타게팅되는 약물이 아니므로 효능을 발휘하 기 위해 투여량이 높을 뿐만 아니라 암 조직 외 VEGF 농도가 높은 타 조직에서도 분포가 가능하므로 이로 인해 부작용이 발생하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 상기 융합단백질은 항-신생혈관생성 제제에 NRP을 특이적으로 타 겟팅하는 종양 투과성 펩타이드를 융합함으로써 암에 많이 분포되어 있는 NRP를 타 켓팅하기 때문에, 항-신생혈관생성 제제의 암 특이적 효과를 높여 투여 용량의 감 소에 의한 환자 편의성 증가뿐만 아니라 용량 의존적인 부작용도 줄일 수 있다. 또한, NRP1은 VEGFR-1 , -2와 co-receptor로 작용하면서 VEGF-A 이외에도 VEGF-B , C, D, E와 PDGF 등 다른 성장인자들과도 결합하기 때문에， 본 발명의 융합 단백질에 융합된 종양 투과성 펩타이드를 통해 상기 성장인자들과 NRP1과의 결합올 억제함으로써 항-신생혈관생성 제제에 의한 신생혈관형성 저해 효과가 상승될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 암 또는 혈관신생관련 질환은 항-신생혈관생성 제제에 내성 또는 무반응인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 내성 또는 무반응이란 일반적으로 치료 효과를 나타내는 약물 농도에서 치료효과를 나타내지 않는 것을 의미한다. 신생혈관형성에는 VEGF-A외에도 FGF, notch 1 igand/receptor system , P1GF, PDGF-BB 등 다른 성장인자와 신호 전달 기작이 관여하기 때문에 하나의 신호를 차 단하더라도 다른 기전을 통한 보상작용으로 혈관신생이 계속적으로 발생할 수 있 다. 따라서 많은 환자들이 항-신생혈관생성 제제에 불응하거나 반복적인 투여에 의 해 내성이 발생되어 뚜렷한 효과를 볼 수 없는 것으로 추정되고 있다. 보다 구체적으로， 항ᅳ신생혈관생성 중 항 -VEGF 제제의 사용을 예로 들 수 있 다. 신생혈관형성은 VEGF 농도가 높을 때 세포의 분열과 성장을 통해 혈관이 성장 하게 되고 이후 VEGF 농도가 낮아지고 PDGF 농도가 상승하면서 정상화 혹은 재건축 과정을 거치게 된다. 정상화 과정에는 미성숙 혈관의 수와 크기 감소와 더불어 주 피세포 (pericyte)가 혈관을 둘러쌈 (coverage)으로써 세포간질액에 의한 혈관 압력 을 감소시키는 단계가 포함된다 . Avast in과 같은 항 -VEGF제제 투여에 의해 VEGF 농 도가 낮아지면 혈관은 정상화 과정을 통해 per icyte coverage를 증가시키므로 약물 의 암 조직 내 침투가 약화되며， 실제 Avast in과 docetaxel을 비소세포폐암 환자에 게 병용투여 시 암으로의 침투량 감소가 보고되었다 . 이는 Avast in과 같은 항 -VEGF 제제와 타 약제와의 병용투여에 한계가 있음을 의미할 뿐만 아니라 항 -VEGF제제의 내성 발생의 원인이 될 것으로 판단되고 있다. 한편, 본 발명의 융합단백질은 항-신생혈관생성 제제뿐만 아니라 NRP에 직접 적으로 결합하여 작용할 수 있는 종양 투과성 펩타이드가 융합되어 있고, NRP는 per icyte associat ion을 통한 혈관의 재건축에 관여하므로 본 발명의 융합단백질 내 조직 투과성 펩타이드를 통해 이를 저해함으로써 신생혈관 발달을 직접적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 항-신생혈관생성 제제의 지속적인 사용에 의한 혈관 주변 미세 환경 변화에서 유래하는 내성을 극복할 수 있다.
더불어 NRP1은 세포 간 junct ion 유지에 관여하는 VE-cadherin과 E-cadherin 의 발현을 조절하는데, 본 발명의 융합단백질은 이를 저해함으로써 세포 사이 간격 을 느슨하게 하고 따라서 기존 항체치료제와 같은 병용투여 약물과 면역 세포의 암 종괴 내부로의 침투력을 상승시켜 약물의 효능을 증대시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 항 -VEGF제제인 Avast in의 C 말 단에 조직 투과성 펩타이드인 A22P를 융합한 Avast in-A22p 융합단백질과 TPP11을 융합한 Avast in-TPPll 융합단백질을 제작하여 다양한 생리학적 활성을 평가하였다. 구체적으로， 본 발명에 따른 융합단백질은 ( i ) NRP1 및 VEGF에 대한 결합능이 매우 우수하며 (실시예 2)， ( i i ) 야생형의 Avast in과 비교해 암 표적하는 능력과 조직 내 .침투력이 월등히 향상되었으며 (실시예 3)， ( i i i ) 항 -VEGF제제의 내성 발생기전으로 추정되는 per i cyte coverage를 현저히 감소시키는 것으로 나타났다 (실시예 4)， ( iv) 종양 동물모델에서도 우수한 항종양 활성을 나타내었고 (실시예 5) . 본 발명의 융합단백질이 상기한 바와 같은 우수한 생리학적 활성을 나타내는 것은 항 -VEGF제제와 종양 투과성 펩타이드가 VEGF와 NRP1에 각각 동시에 작용함으 로써 상승효과를 나타내었기 때문으로 판단된다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 융합단백질을 단독으로 함유하거나 약 학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으 로 허용되고 인간에게 투여될 때， 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르 기 반응 또는 이와 유사한 반웅을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대， 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여 용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 샐를로스 유 도체, 마그네슘 스테아레이트， 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아을러， 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또 한， 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수， 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안 정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸 -또는 프로필-파라벤 및 클 로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤 제， 감미제, 향미제， 유화제， 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적 으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있 다 (Remington' s Pharmaceut ical Sciences , 19th ed. , Mack . Publ i shing Company, Easton, PA, 1995) . 본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면， 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으 로는 이에 한정되지는 않으나， 정맥내, 근육내, 동맥내， 골수내, 경막내 심장내， 경피, 피하, 복강내， 비강내， 장관， 국소， 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당 의정제， 캡슐제， 액제, 겔제， 시럽제， 술러리제， 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부 형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 흔합물로 가공 함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈， 수크로즈, 솔비톨， 만니틀 자일리를， 에리스리를 및 말티톨 등을 포 함하는 당류와 옥수수 전분， 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 둥을 포함하는 전분 류， 셀를로즈,메틸 셀를로즈， 나트륨 카르복시메틸셀를로오즈 및 하이드록시프로필 메틸-셀를로즈 등을 포함하는'셀를로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피를리돈 등과 같은 층 전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알 긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가， 본 발명의 약학적 조성물은 항웅집제, 윤활제, 습윤제， 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제， 크림제, 로션제, 외용연고제， 오일 제， 보습제， 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문 헌 (Remington' s Pharmaceut ical Science , 19th ed. , Mack Publ i shing Company, East on, PA, 1995)에 기재되어 있다. 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (mult iple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방 법 (fract ionated treatment protocol )에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1kg 당 약 0.01 g 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1/zg 내지 l .OOOmg일 수 있다. 그러나 상기 약 학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연 령， 체중， 건강 상태, 성별， 질환의 중증도， 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고 려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결 정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명은 또한 상기 항—신생혈관생성 제제는 항 -혈관 내피세포 성장인자 (항 -VEGF) 제제, 항 -PDGF 제제， 항 -P1GF 제제， 항 -FGF 제제, 항 -TGF 제제, 항 -ANG 제 제, 항 -HGF 제제ᅳ 항 -IGF 제제， 항- 1( 3(:；^^ receptor-l ike kinase 1) 제제， 항 -Ephrin A 제제， 항 -Inter leukin 제제, 항 -BMHbone morphogenet ic protein) 제 제,
VEGF, PDGF, PIGF, FGF, TGF, ANG, HGF, insul in-l ike growth factor , ALK1, ephrin A 및 인터루킨 각각에 대한 수용체의 길항 항체，
및 상기 수용체 기반-키메라 분자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으 로 하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에서 상기 항 -혈관 내피세포 성장인자 (항 -VEGF) 제제는 베바시주맙 (bevacizumab) , 라니비주맙 (ranibizumab) , r84(PLoS One . 2010 Aug 6；5(8) ) , 아플 리버솁트 (af l ibercept) , 컨버셉트 (conbercept )， CTOKW02005056764A2) , DOM15-10- 1KW02008149147A2) , DOM15-26-593(W02008149143A2) , PRS-050(PLoS One . 2013 Dec 13；8(12) ) , CT-322CBMC Cancer 2008, 8:352)， ESBA903(Eur J Pharm Biopharm. 2015 Mar 14. pi i : S0939-641K 15)00089-2) , EPI-0030(W02011023130A1) 및 항 -VEGF 항체 와 약물이 융합된 항체 -약물융합체 (ADC, ant ibody-drug conjugate)로 이루어진 군 으로부터 선택될 수 있으며， 이들의 동등생물의약품 (biosimi lar) 및 변이체도 포함 하는 개념이다. 보다 바람직하게는 라니비주맙, 베바시주맙， 아플리버셉트， 컨버솁 트일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 동등생물의약품 (biosimi lar)이란， 유전자재조합 및 세포배양기술 등 생 명공학기술을 활용하여 이미 개발 /판매되고 있는 특허 만료된 오리지널 바이오 의 약품을 모방하여 품질， 효능 및 안전성의 측면에서 동등성을 입증한 복제 의약품을 의미한다. 상기 변이체란 상기 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제의 핵심적인 생리학적 활성은 그대로 보유하면서, 이러한 활성에는 영향을 주지 않는 아미노산 위치에서 하나 이상의 변이를 포함하는 모든 유사한 서열을 포함한다. 즉, 상기 나열한 항- 혈관 내피세포 성장인자 제제의 아미노산 서열과 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상， 보다 더 바람직하게는 90¾ 이상， 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 기능적 변이체일 수 있다. 본 발명에서 상기 "수용체의 길항 항체" 란 VEGF, PDGF, PIGF, FGF, TGF, ANG, HGF, IGF, AL 1 , ephr in A 및 Inter leukin에 대한 수용체의 하나 이상의 생물 학적 활성을 억제할 수 있는 항체를 의미한다. 이러한 항체는 상기 리간드에 대한 수용체의 결합을 방해함으로써 혈관의 신생을 위한 분자생물학적 신호전달을 저해 하는 기능을 나타낼 수 있다. 본 발명에서 상기 항체는 폴리클로날 항체， 모노클로 날 항체， 키메라 항체， 인간화된 항체， Fv-단편， Fab-단편， F(ab' )2-단편 및 scFv 단편으로 이루어질 수 있으며, 항체 (antibody)는 전체 항체 (whole ant ibody) 형 태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 본 발명에서 상기 혈관신생관련 질환은 기존의 혈관으로부터 혈관내피세포가 출아하여 조직에 침입하는 형태로 모세혈관이 뻗어나가는 맥관 형성으로 인해 발생 되는 질환을 의미하며， 이의 비제한적인 예시로는 류마티스성 관절염， 건선, 염증, 자궁내막증 및 혈관종을 들 수 있다. 본 발명에서 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암， 비소세포폐암, 폐의 선 암， 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암， 피부 또는 안구내 혹색종, 직장암, 항문부 근암， 식도암, 소장암, 내분비선암， 부갑상선암， 부신암， 연조직 육종， 요도암， 만 성 또는 급성 백혈병， 림프구 림프종， 간세포암， 위장암， 췌장암， 교아종， 경부암， 난소암， 간암， 방광암， 간종양， 유방암， 결장암, 대장암， 자궁내막 또는 자궁암， 침샘암， 신장암， 간암, 전립선암, 음문암， 갑상선암， 간암 및 두경부암으로 이루어 진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한， 상기 조직 투과성 펩타이드는 뉴로필린 l(NRPl) 및 뉴로필 린 2(NRP2)에 모두 결합하거나 또는 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합하는 것을 특 징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에서 상기 조직 투과성 펩타이드 중 뉴로필린 1 및 뉴로필린 2에 모 두 결합하는 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노삯 서열을 포함하며, 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합하는 펩타이드는 서열 번호 5 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 표시된 조직투과성 펩타이드는， 뉴로필린 1 및 2에 모두 결합할 수 있는 펩타이드 로 뉴로필린의 blb2 도메인에 결합하는 VEGF165리간드의 결합부위 아미노산 서열 및 길이를 분석하고, 뉴로필린에 결합한다고 알려진 세마포린 3A 및 세마포린 3F의 퓨 린 C-말단 서열 의 염기서열을 분석하여 이들의 C-말단의 서열이 유사함을 바탕으 로 설계된 펩타이드이다.
상기 서열번호 5 내지 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시 된 조직 투과성 펩타이드는 뉴로필린 2에는 결합하지 않고 뉴로필린 1에만 특이적 으로 결합하는 펩타이드로, 본 발명자들은 중쇄블변부위 (Fc)의 C-말단 (Carboxy- terminus)에 융합된 펩타이드 라이브러리를 디자인하여， 이를 효모세포표면에 발현 시켜 Fc-융합펩타이드 라이브러리를 구축한 후, 뉴로필린 1의 bl 도메인에 선택적으 로 결합하는 클론을 선별하여 도출된 펩타이드를 분리， 동정하였다. 한편， 상기 Fc-펩타이드 라이브러리에서 뉴로필린 1에 특이적이며 고친화도로 결합하는 펩타이 드를 분리하기 위해， 뉴로필린 1의 blb2 도메인 단백질을 이용하여 선별함과 동시에 뉴로필린 2 의 blb2 도메인 단백질을 경쟁자 (compet i tor)로 이용하여, 선별과정을 진행하여 펩타이드를 제작하였다. 본 발명에서 상기 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열은 다음과 같다:
TPP#I (서¾변 s i) HTPaNSNK HLQBNKKGRNRR
ΤΡΡ#2 (서열 3호 2) HTPGNSNK KHLQBNKKQRPRR
ΤΡΡ#3 (서 ¾ ¾ S 3) REAPGAPRSPBPQDQKKPRNRR
TPP#4 (서옐번: i: 4) REAPGAPRSPEPQDQKKPRPRR
TPP#5 (서열변호 5) HTPGNSNQFVLTSTRPPR
TPP#8 열번 J: 8) HTPQIATRTPR
TPP#7 (서열변호 7) HTPGNS PTRTPRR 본 발명에서 상기 융합단백질은 상기 조직 투과성 펩타이드와 항 -VEGF제제는 링커를 통해 융합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 링커 펩타이드는 1 내지 100 개의 아미노산으로 이루어질 수 있으며， 바람직하게는 4 내지 20개， 더욱 바람직하 게는 4 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한， 상기 링커 펩타이드는 글라이신 (glycine) , 세린 (ser ine) 또는 알라닌 (al anine)으로 구성될 수 있으며， 바람직하게는 상기 링커 펩타이드의 서열은 (GA)n 또는 (GGGGS)ra의 아미노산 서열 로 이루어진 것 (단， 상기 n 및 m은 각각 독립적으로 정수 1 내지 20이다)일 수 있 고， 더욱 바람직하게는 GAGA 또는 (GGGGS)3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 상기 링커는 서열번호 8 (GGGGSGGGGSGGGGS)로 표시되는 아 미노산 서열을 갖는 것을 이용하였다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면， 상기 융합단백질은 Avast in과 조직 투과성 펩타이드가 융합된 것으로 중쇄로는 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 갖고 경쇄로는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 융합단백질일 수 있다. 또한, 상기 융합단백질은 Avast in 변이체와 조직투과성 펩타이드가 융합된 것으로 중쇄로 는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고 경쇄로는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 융합단백질일 수 있다. 본 발명은 또한 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융 합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 또한 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합 된 융합단백질을 유효성분으로 구성되는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한 다.
또한 본 발명은 또한 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합 된 융합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성되는 암 전이 억제용 약학적 조성물 을 제공한다. 암 전이는 원발성 암에서 암 세포가 타 장기로 퍼져 새로운 암을 형성하는 것이다. 전이는 다양한 암 환자에서 목숨을 위협하는 주요 현상이기에 전이를 예방 하거나 조절하는 것은 암 연구분야의 중요 목표이다. 전이가 되지 않은 초기에 진 단이 된 경우에는 수술， 항암치료, 또는 방사선 치료가 효과적이나 진단시에 전이 가 되어 있는 경우에는 이들 치료의 효과는 감소된다. 이뿐 아니라 진단시 전이를 확인하지 못하였으나 전이가 치료 중이나 후에 확인되는 경우도 종종 있다. 전이는 침투 ( invasion) , 혈관내 유입 ( intravasat ion) , 멈춤 (arrest ) , 혈 관외 배출 (extravasat ion) , 그리고, 집락화 (colonizat ion) 등의 연속적인 단계로 구성되어 있으며 이 과정을 통하여 원발성 장기에서 시작하여 최종적으로 다른 장 기에 암을 형성하게 된다. 첫 번째 단계인 침투는 전이의 시작 단계로 암 세포의 세포간 또는 세포외 기질과의 상호작용 변화， 주변 조직의 분해， 그리고 조직 내로 의 암 세포의 이동 등을 포함한다. 본 발명의 일실시예에서는 Avast in에 대해 내성을 나타내는 종양 세포주에 본 발명에 따른 융합단백질 (Avast in-A22p)을 처리한 결과， 종양 세포의 migrat ion 이 현저히 억제가 되는 것을 확인하였다. 이는， 본 발명에 따른 융합단백질이 VEGF-A 이외에도 다른 성장인자에 의한 신호 전달을 억제하기 때문에 Avast in에 대 해 내성을 나타내는 종양세포에 대해서도 우수한 전이 억제효과를 나타낸 것으로 판단된다. 한편, 암 세포에서 PDGF가 PDGF 수용체에 결합하면 pl30cas 단백질의 인산화 가 증가하면서 암세포의 migrat ion과 invasion이 촉진되는 것을 알려져 있는더 1 , Avast in을 처리했을 때에는 별다른 변화가 없던 pl30cas 단백질의 인산화가 Avast in-A22p를 처리에 의해 대조군 수준으로 억제되는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 융합단백질은 VEGF를 저해할 뿐만 아니라 NRP1에도 결합함으로써 PDGF 에 의한 신호 전달도 억제하여 PDGF에 의한 종양세포의 migrat ion과 invasion을 억 제하여 항 -VEGF 제제에 내성을 나타내는 종양세포에 대해서도 효과적 전이 억제 효과를 나타내는 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 상기 암은 항-신생혈관생성 제제에 내성 또는 무반웅인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명은 암 또는 혈관신생 관련 질환 치료용 제제를 제조하기 위한 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질의 용도를 제공한다. 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백 질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 또는 혈관신생 관련 질환의 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항—신생혈관생성 제제가 융합된 융 합단백질을 유효성분으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투 여하는 것을 특징으로 하는 암 또는 혈관신생 관련 질환의 치료방법을 제공한다. 또한 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융 합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하 는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 또는 혈관신생 관련 질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명은 암 전이 억제용 제제를 제조하기 위한 종양 투과성 펩타이드와 항 -신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질의 용도를 제공한다. 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백 질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융 합단백질을 유효성분으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투 여하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융 합단백질을 유효성분으로 필수적으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하 는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 억제하는 방법을 제공한다, 본 발명의 상기 '유 ¾량' 이란 개체에게 투여하였을 때， 암 또는 혈관신생 관련 질환의 개선， 치료, 예방， 검출， 진단 또는 암 전이 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며 , 상기 '개체' 란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자 (pat ient ) 일 수 있다.
본 발명의 상기 '치료' 는 암 또는 혈관신생 관련 질환 또는 암 또는 혈관 신생 관련 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고， 이는 이러한 질환 을 치유하거나， 실질적으로 예방하거나， 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며， 암 또는 혈관신생 관련 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나， 치유하거나 예방하는 것을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아 니다. 본 발명의 용어 '-을 포함하는 (compr i sing) ' 이란 '함유하는' 또는 '특징 으로 하는' 과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추 가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 '〜로 구성되는 (consist ing of )' 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 '필수적으로 구성되는 (essent ial ly consist ing of) ' 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.
【유리한 효과】
본 발명의 조직 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenesis) 제제 가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 치료 용 약학적 조성물은 항—신생혈관생성 제제의 종양 투과성이 개선되고, 암을 타겟팅 하는 효과를 발휘하여 적은 용량으로도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있어 항—신생 혈관생성 제제의 부작용을 경감시킬 수 있으며， 신생혈관생성 관¾ 성장 인자와 NRP1에 동시에 결합함으로써 항-신생혈관생성 제제에 내성을 나타내는 암 또는 혈 관신생 관련 질환에도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있다.
【도면의 간단한 설명】 도 i은 종양 투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자가 융합된 융합단 백질 (Avastin-A22p)의 모식도이다.
도 2는 종양 투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자가 융합된 융합단 백질을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다 (Lane 1： Avastin, Lane 2: Avast in-A22p, Lane 3： Avastin-TPPll).
도 3은 종양 투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자가 융합된 융합단 백질 (Avastin-A22p)을 SE-HPLC로 확인한 결과이다 (A: Avastin, B: Avast in-A22p) . 도 4는 Avastin-A22p의 NRP1 또는 VEGF와의 결합력을 평가한 결과이다 (A: NRP1과의 결합력, B: VEGF와의 결합력).
도 5는 Avast in과 Avastin-A22p를 SW620 xenograft 동물 모델에 투여한 후 3 시간, 8시간, 16시간 경과 후 형광현미경을 통해 암 조직에서의 단백질 분포를 관 찰한 결과이다 (Veh: saline투여군).
도 6은 Avastin-A22p를 처리 시 암세포 내 pericyte coverage의 변화를 평가 한 결과이다 (PECAM1: 혈관염색， NG2: pericyte 염색)
도 7은 SW620 xenograft 동물 모델에서 Avastin-A22p의 항암효능을 평가한 결과이다.
도 8은 Avastin에 대한 내성을 나타내는 HCT116/bev세포에 VEGF를 처리하여 migration을 유도한 후， Avastin 또는 Avast in-A22p를 각각 luM 처리하여 migration 억제 효과를 확인한 결과이다 (A: 현미경 관찰 사진， B: 현미경 관찰 결 과를 정량화 하여 그래프로 나타낸 결과).
도 9는 Avastin-A22p가 PDGF에 의한 신호전달을 억제하는지 여부를 확인하기 위해， U87MG세포에 Avast in과 Avastin-A22p를 각각 25ug/ml이 되도록 처리하고 30 분 뒤에 PDGF를 50ng/tnl이 되도록 처리한 후 pl30cas의 단백질 인산화 여부를 확인 한 결과이다 (A: 웨스턴 블로팅 결과, B: 웨스턴 블로팅 결과를 정량화한 그래프， A22p+P: Avast in-A22p 25ug/ml + PDGF 50ng/ml , P: PDGF 50ng/ml , C: 대조군， A+P: Avastin 25ug/ml + PDGF 50ng/ml).
도 10은 종양 투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자가 융합된 융합 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다 (Lane 1： Avast in(V)-A22p, Lane 2: Avast in- A22p) .
도 11은 종양 투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자가 융합된 융합 단백질을 SE-HPLC로 확인한 결과이다 (A: Avast in(V)-A22p, B: Avast in-A22p) .
도 12는 Avastin(V)-A22p의 NRP1또는 VEGF와의 결합력을 Avastin-A22p와 비 교하여 평가한 결과이다 (A: NRP1과의 결합력， B: YEGF와의 결합력) .
【발명의 실시를 위한 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
Avast in-조직 투과성 펩타이드 (TPP) 읍합 단백질의 제작
본 발명자들은 항 -VEGF 제제인 Avast in의 효능 증대 및 내성 극복을 위해 Avast in의 C-말단에 뉴로필린 l(NRPl) 및 2에 모두 결합하거나 뉴로필린 1에만 특 이적으로 결합할 수 있는 조직 투과성 펩타이드 (TPP)를 융합하고자 하였으며， TPP 의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1의 서열목록 중 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 TPP는 뉴로필린 1 및 2에 모두 결합이 가능하며 , 서열번호 5 내지 7의 아미노산 서열을 갖는 TPP는 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합 이 가능하다. Avast in에 TPP가 융합된 융합단백질의 모식도를 도 1에 나타내었다. 본 발명에서 사용한 Avast in은 중쇄는 서열번호 13， 경쇄는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로， 胃. Drugbank. com에서 입수하여 본 실험에 사용 하였다. 한편， 하기 표 1에 나타낸 TPP중 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 TPP인 A22p는 뉴로필린의 intrinsi c l igand인 VEGF165 및 세마포린 3계열 리간드들의 C 말 단 부위를 변형 (modi fy)한 것이고 TPP11은 뉴로필린 1의 blb2 도메인 단백질과 동시 에 뉴로필린 2 의 blb2 도메인 단백질을 경쟁자 (compet i tor)로 이용하여 뉴로필린 1 의 bl 도메인에 선택적으로 결합하는 클론으로부터 도출된 펩타이드를 분리 동정한 것으로서ᅳ 여기에 링커로 Avast in을 융합하여 뉴로필린 수용체에 bivalent로 작용 할 수 있도록 함으로써 VEGF와 Sema3A 리간드와 비슷한 친화력을 갖으면서도 조직 투과성을 가질 수 있게 design하였다.
【표 11
TPP서열정보 ΓΡΡ#1 (서열번호 1) HTPGNSNKWKHLQENKKGRNRR
ΓΡΡ#2 (서열번호 2) HTPGNSNKW HLQENKKGRPRR
ΓΡΡ#3 (서열번호 3) REAPGAPRSPEPQDQKKPRNRR
ΓΡΡ#4 (서열번호 4) REAPGAPRSPEPQDQKKPRPRR
ΓΡΡ#5 (서열번호 5) HTPGNSNQFVLTSTRPPR
ΤΡΡ#6 (서열번호 6) HTPGIATRTPR
ΤΡΡ#7 (서열번호 7) HTPGNSKPTRTPRR
구체적으로， Avast in의 C-말단에 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 TPP(A22p)와 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 TPP(TPPll)이 각각 융합된 융합단 백질 및 이를 생산하는 세포주를 하기 방법에 따라 제작하였다.
<1-1> 발현 백터의 제작 및 세포의 형질전환
PCDNA3. K-) 백터에 선별마커 DHFR 유전자를 삽입하고 Avast ίη-Α22ρ, Avast in-TPPll의 중쇄와 경쇄를 각각 제한효소 Not l과 BamHI으로 클로닝하였다. CHO DG44 세포에 상기 구축된 각각의 항체 중쇄불변부위와 NRP1에 결합하는 펩타이 드가 융합된 단백질을 인코딩하는 플라스미드와 경쇄사슬 단백질을 인코딩하는 플 라스미드를 Neon™ eletroporesi s를 이용하여 단백질을 발현시켰다. T25 i lask에 각 각의 플라스미드를 트랜스펙션 (transfect ion)한 3X106 eel Is을 접종하고 37°C에서 배양하였다. 선별 마커를 이용하여 stable cel l을 확보한 뒤 바이오리액터에서 무 혈청 SFM4CH0 (Hyclone)를 이용하여 부유상태로 7일간, 100 rpm, 37°C , pH7.2 , 50% (：02조건에서 배양하였다. 상등액은 원심분리를 이용하여 세포와 분리하고 0.22 μ ηι 필터를 이용하여 제균하였다.
<1-2>융합단백질의 정제
Avast in, Avast in-A22p와 Avast in-TPPll의 배양액을 회수하여 표준 프로토콜 을 참조하여 각각의 단백질을 정제하였다. 정제 컬럼은 단백질 A 레진 (MabselectSure resin) (GE healthcare)을 XK16/20 컬럼 (MabselectSure resin) (GE healthcare)에 20 mL 층진하여 200 cm/h의 선속도를 적용하였다. 단백질 A컬럼에 1L의 항체를 적용하： ϋ , 컬럼의 15배 부피를 PBS(pH 7.4, 137 raM NaCl , 2.7 mM KC1 , 10 mM Na2HP04, 2 mM K¾P04)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액 100 raL을 이용하 여 pH3.0에서 항체를 용리한다. UV흡광도 280 nm 파장에서 10 mAU~10 mAU까지 회수 된 단백질 60 mL을 1 M Tris 완충액 0.7 mL을 사용하여 pH 7.0으로 중화하였다. 항 체 분획은 0.2um 필터 (Mi l l ipore) 여과 후， ami con (30 匿 CO) 농축기 (Mi l 1 ipore) 를 사용하여 3 , 500rpm에서 10분씩 농축하고, 10% glycer이을 포함한 PBS(pH 7.4) 완층액으로 교환하였다. 정제된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결 합하는 펩타이드가 융합된 단백질은 보정된 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다. 정제된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합 하는 펩타이드가 융합된 단백질은 환원성 및 비환원성 조건으로 10% SDS-PAGE에서 분석하였다.
Avast in과 Avast in-A22p, Avast in-TPPll을 발현하는 세포주에서 회수한 배양 액에서 각각의 단백질을 정제하여 SDS-PAGE로 분리하였다. 도 2에서 Avast in-A22p 와 Avast in-TPPll이 정상적으로 항체를 형성하고 환원 조건에서 Avast in에 펩타이 드가 융합되어 환원 조건에서 Avast in에 비해 Avast in-A22p와 Avast in-TPPll의 크 기가 큼을 확인할 수 있었다. 또한 Avast in-A22p와 Avast in-TPPll이 유사한 수준으 로 발현됨에 따라 TPP 융합이 항체 발현에 큰 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있 었다.
Avast in-A22p 정제된 단백질의 순도를 확인하기 위해 HPLC (High performance l ipid chr이 Tiatography)분석을 수행하였다. Agi lent 1200 기기 (Agi lent) 를 이용하였으며， 크기 배제 컬럼 (Biosui te 250) (Waters)을 사용하였다.
구체적으로, 0.2 M 인산칼륨과 0.25 M 염화칼륨을 혼합한 완층용액 (pH 6.2) 을 이동상으로 사용하였고, 0.35 ml/min 유속으로 20분간 홀려주어 시행되었다. 머 무른 시간에 따라 단백질의 크기를 확인하고, 면적과 높이에 따라 순도를 확인하였 다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 정제한 Avast in-A22p의 순도를 SE— HPLC를 이용하 여 분석하였다 . Avast in-A22p의 순도가 97% 이상이고 Avast in에 비해 크기가 큼을 확인할 수 있었다. 본 발명자들은， 이하에서 Avastin에 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 TPP인 A22p를 융합한 Avast in-A22p 융합단백질을 제작하여 그 활성을 평가하였다.
<실시예 2>
Avastin-조직 투과성 펩타이드 (TPP)읍합 단백질의 NRP1및 VEGF결합능 상기 실시예 1에서 제작된 융합 단백질인 Avastin-A22p의 N-말단은 기존의 Avastin과 동일하게 VEGF를 제거하고， C-말단의 A22p는 NRP1과 결합하여 관련 신호 전달을 이중으로 차단할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 Avastin-A22p와 NRP1 및 VEGF 결합능을 평가하였다. 정제된 Avastin-A22P의 뉴로필린 1의 blb2 도메인 (Neuropil in l-blb2 domain)에 대한 결합능을 ELISA (Enzyme Linked I unosorbent Assay)에서 확인하 였다. 양성 대조군으로 Herceptin-A22p (HCT-A22p) , 음성 대조군으로 Avastin (Roche co., Swiss) 을 사용하였다. 표적분자 뉴로필린 1의 blb2 도메인 (273-586) 을 96 well Maxibinding Immuno 플레이트 (SPL Life sciences . , Korea)에 1개 well 당 ig씩 2시간 동안 37 °C 에서 결합시킨 후 0.1 % PBST (0.1 % Tween20, PH 7.4, 137 mM NaClᅳ 2.7 mM C1 , 10 mM Na2HP04, 2 mM K¾P04)로 1분간 3회 씻어내었 다. 5 % 스킴 밀크 (skim mi lk)가 포함된 0.1% PBST로 1시간 동안 결합한 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 양성 대조군으로 Herceptin-A22p, 음성 대조군으로 Avastin (Roche co. , swiss)을 사용하고 실험군으로 Avastin-A22p를 50nM, 25nM, 12.5nM, 6.25nM이 되게 0.1 % PBST로 희석하여 각 농도별로 37 ° C에서 1시간 처리 한 뒤 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어냉었다. HRP가 접합된 anti-kappa light chain 항체 (Horseradish peroxidase— conjugated ant i -human kappa light chain mAb, SIGMA-ALDRICH co., USA) 를 5 % 스킴 밀크가 포함된 0.1% PBST에 100, 000배 희석 하여 37°C에서 30분 처리하였다. 그 후 0.1 % PBST로 1분간 5회 씻어냈다. 발색을 위하여 TMB HRP colorimetric substrate (Surmodics co., USA)를 처리하여 상온에 서 10분간 반웅시킨 후 동부피의 IN HC1 (stop buffer)을 처리한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 얻어진 ELISA 결과를 통해 발현 정제한 Avastin— A22p의 뉴로 필린 1의 blb2도메인에 대한 결합능을 확인 하였다. 정제된 Avastin-A22p의 Recombinant human VEGF 165 (R&D systems co. China)에 대한 결합능을 ELISA에서 확인하였다. 양성 대조군으로 Avast in, 음성 대 조군으로 HCT-A22p를 사용 하였다. 표적분자 Recombinant human VEGF 165를 96 wel l Maxibinding Immuno 플레이트에 1개 wel l당 0.2 y g씩 2시간 동안 37 ° C 에서 결합시킨 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 5 % 스킴 밀크가 포함된 0. 1% PBST로 1시간 동안 결합한 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 양성 대조군으 로 Avast in, 음성 대조군으로 Hercept in-A22p를 사용 하고 실험군으로 Avast in- A22p를 1.5nM, 0.75nM, 0.35nM, 0.17nM이 되게 0.1 % PBST로 희석하여 각 농도별로 37 ° C에서 1시간 처리한 뒤 0.1 % PBST 로 1분간 3회 씻어내었다. HRP가 접합된 ant i -kappa l ight chain 항체를 0.1% PBST가 포함된 5 % 스킴 밀크에 100, 000배 회 석하여 37 ° C에서 30분 처리하였다. 그 후 0.1 % PBST로 1분간 5회 씻어낸다. 발색 을 위하여 Ί1Β HRP colorimetric substrate를 처리하여 상온에서 10분간 반웅시킨 후 동부피의 IN HC1을 처리한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 얻어진 ELISA 결과를 통해 발현 정제한 Avast in-A22p의 Recombinant human VEGF 165에 대한 결합 능을 확인 하였다. 이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이 , Avast in-A22p는 대조군으로 사용된 HCT-A22p와 동 둥한 수준으로 NRP1에 결합하였고 VEGF와도 Avast in과 동등한 수준으로 결합하는 것으로 확인되었다.
<실시예 3>
Avast in-A22D의 암 타겟팅 시험
Avast in은 다른 항체의약품과 달리 암 특이적으로 타게팅 되는 약물이 아니 므로 효능을 발휘하기 위해 투여량이 높을 뿐만 아니라 암 조직 외 VEGF 농도가 높 은 타 조직에서도 분포가 가능하므로 이로 인해 부작용이 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서 NRP1의 암 특이적 분포를 이용한다면 암 타케팅 효과를 높여 투여 용 량의 감소에 의한 환자 편의성 증가뿐만 아니라 용량 의존적인 부작용도 줄일 수 있을 것으로 예상되어, 본 발명자들은 Avast in-A22p가 암을 효과적으로 타겟팅할 수 있는지 여부를 평가하고자 하였다. 즉， Avast in-A22p가 암 조직 및 종괴 내부의 신생혈관에 존재하는 NRP1을 타 게팅함으로써 암 세포에서 분포가 Avast in 보다 우수한지 여부를 확인하기 위해 SW620을 nude 마우스에 이식하고 종양의 부피가 250mm3 정도가 되었을 때, 각각
PBS, Avast in-A22p 또는 Avast in를 각각 5mg/kg씩 정맥 투여한 후 3시간， 8시간, 16시간이 경과한 시점에서 종양을 적출하: a , 형광현미경으로 암 조직에서 단백질의 분포를 면역 조직화학 ( immunohistochemistry) 실험을 통해 확인하였다. 보다 구체적으로， 적출한 종양은 파라핀 절편 (paraf f in sect ion) 방법으로 8 um의 두께로 잘라, 1차 항체인 NG2항체 (Cel l Signal ing technology, USA)와 이를 인지하는 Alexa (적색형광， Li fe Technologies)이 결합된 2차 항체로 혈관주변세포 를 염색하였고， 조직 내에 분포되어 있는 Avast in과 Avast in_A22p을 관찰하기 위 해， IgG를 인식하는 Alexa®488(녹색형광， Li fe Technologies)이 결합된 항체를 사 용하였다. 이에 대한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Avast in-A22p는 투여 후 3시간부터 Avast in에 비 해 암 조직 내 농도가 높았으며， 시간이 지남에 따라 혈관에서 떨어진 세포 사이에 도 더 많은 양의 단백질이 분포되어 있었으며， 암종괴 내부의 혈관신생도 효과적으 로 감소시킴을 확인하였다. 본 현광현미경 관찰 결과 Avast in-A22p는 Avast in보다 암을 표적하는 능력과 조직 내 침투력이 우수할 것을 예상할 수 있으며, Avast in과 달리 VEGF-A 뿐만 아 니라 VEGF-B, VEGF-C, P1GF 등 다양한 신생혈관 생성인자들을 억제함에 의해 혈관 신생을 더 효과적으로 억제할 것으로 판단할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 낮은 투여 용량으로도 종양으로 표적이 가능하기 때문에 부작용을 줄일 수 있다. 또한 높은 침투력으로 인해 혈관과 근접한 암세포 뿐만 아니라 종괴 안쪽 암 조직에도 도달함으로써 이들 세포에서 분비되는 VEGF-A를 포함한 다양한 신생혈관 생성인자 들의 활성을 저해함으로써 세포 분열을 억제하고 이를 통해 항암 활성을 높일 수 있다고 예상해 볼 수 있었다. 결론적으로 본 결과를 통해 신생혈관 형성 인자들 중 VEGF-A에 대한 의존성 이 비교적 낮음으로써 발생하는 Avast in 불웅 환자의 치료에 Avast in-A22p의 적용 가능성을 확인할 수 있었다. <실시예 4>
Avast in-A22p7> pericyte cover age에 미치는 영향
신생혈관형성은 VEGF 농도가 높을 때 세포의 분열과 성장을 통해 혈관이 성 장하게 되고 이후 VEGF 농도가 낮아지고 PDGF 농도가 상승하면서 정상화 혹은 재건 축 과정을 거치게 된다. 정상화 과정에는 미성숙 혈관의 수와 크기 감소와 더불어 주피세포 (pericyte)가 혈관을 둘러쌈 (coverage)으로써 세포간질액에 의한 혈관 압 력을 감소시키는 단계가 포함된다 . Avast in 투여에 의해 VEGF 농도가 낮아지면 혈 관은 정상화 과정을 통해 per icyte coverage를 증가시키므로 약물의 암 조직 내 침 투가 약화되며, 실제 Avast in과 docetaxel을 비소세포폐암 환자에게 병용투여 시 암으로의 약물 침투량 감소가 보고되었다 (Arjaans et al . , 2013) . 이는 Avast in과 타 약제와의 병용투여에 한계가 있음을 의미할 뿐만 아니라 Avast in 내성 발생의 원인이 될 것으로 추정되고 있다.
Fan 등의 보고에 의하면 원발성 혹은 전이성 대장암 세포주에 각각 Avast in 을 3개월간 지속적으로 처리한 결과 두 세포주 모두에서 Avast in에 적웅한 세포주 들이 만들어 졌고， 이 세포주들의 세포성장은 기존 세포주와 동일하지만 세포의 이 동성이 증가되는 특성을 지녀 xenograft 시 기존 암세포에 비해 전이가 잘되는 것 으로 확인되었다. 이러한 Avast in 적응 세포주들은 VEGFR1과 NRP1이 특이적으로 고 발현 되며, VEGF-A 뿐만 아니라 VEGF-B, VEGF-C, P1GF 등 다양한 신생혈관 생성인 자들을 더 많이 분비하는 세포로 변형되어 Avast in에 내성을 보였다고 한다 (Fan et al . , 2011) .따라서 NRP1에 결합하여 VEGF-A 이외에도 다양한 신생혈관 생성인자들 의 신호전달을 저해할 수 있는 Avast in-A22p 혹은 Avast in-TPPll 처리 시 Avast in 에 내성을 보이는 세포주의 생장 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 판 단되었다.
또한 항 NRP1 항체와 VEGF 저해제의 병용 투여 시 항 NRP1 항체에 의한 혈관 의 pericyte coverage 감소가 혈관의 정상화를 조절하여 항암효능 증대와 직접적으 로 관련될 뿐만 아니라 내성극복과도 연관될 수 있다는 보고를 토대로， 본 발명자 들은 Avast in과 Avast in-A22p를 투여한 xenograft 모델에서 암조직 내 per icyte coverage의 변화를 현광현미경으로 비교하는 시험을 실시하였다. 마우스 모델에서 Avast in-A2¾의 신생혈관생성 및 혈괌안정화 억제능을 확 인하기 위하여， SW620을 nude 마우스에 이식한 뒤에 Avast in-A22p와 Avast in를 각 각 투여하고 형광현미경으로 암 조직에서 per i cyte coverage를 확인하였다. Balb/c 누드 마우스에 SW620 세포를 주입시켰고， 종양의 부피가 250mm3 정도가 되었을 때, 각각 PBS , Avast in , Avast in-A22p를 5mg/kg으로 정맥 주사하였다. 각각 16시간 후 마우스로부터 종양을 적출하여, 면역조직화학실험을 수행하였다. 적출한 종양은 파 라핀 절편 방법으로 8 um의 두께로 잘라， 1차 항체인 PECAMl(Sigma)와 이를 인지하 는 Alexa®488이 결합된 2차 항체로 혈관세포를 염색하였고， 1차 항체인 NG2항체와 이를 인지하는 Alexa®594이 결합된 2차 항체로 혈관주변세포를 염색하였다. 이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이， Avast in에 비해 Avast in-A22p 투여군에서 혈관 대 비 per i cyte coverage가 뚜렷하게 낮아짐을 확인하여 Avast in-A22p에 의한 항암효 과의 증진은 per i cyte cover age와 연관됨을 예상할 수 있었다, 이와 같은 결과는 Genet ech 사에서 개발했었던 항 -NRP1 항체와 Avast in을 병용 투여한 동물 시험 결 과와 일치하는 것으로 Avast in-A22p가 VEGF와 NRP1의 각각의 저해 효과가 독립적인 각각의 항체를 사용한 것과 유사한 수준임을 확인할 수 있는 결과이다. 즉， Avast in-A22p가 VEGF와 NRP1을 동시에 저해하는 이중항체 개념의 단백질임을 검증 할 수 있었다. 이러한 결과는 A22p에 의한 per i cyte coverage 감소를 통해 Avast in-A22p는 신생혈관형성 저해 효과 증대 및 Avast in의 지속적인 투여에서 발생하는 내성 극복 가능성이 있음을 암시한다고 할 수 있다.
<실시예 5>
Avast in-A22p 의 in w o항암 효능평가
Avast in-A22p의 항암 효능을 확인하기 위하여 대장암세포주인 SW620 xenograft 모델에서 Avast in과 비교 시험을 실시하였다. SW620 세포주는 VEGF에 대 한 RGI가 45%인 종양 세포주로 본 동물실험은 일반적인 종양에 대한 항암 효능평가 의 목적으로 수행하였다. 예비실험을 통해 Avast in-A22p는 Avast in 대비 동등 이상 의 효능을 나타냄을 확인하여 (결과 미도시)， 본 실험에서는 SW620 세포를 이식한 Balb/c-nude 마우스에 Avast in 5mg/kg와 Avast in-A22p 0.5 , 1.25 , 2.5mg/kg를 각각 1주에 2회씩 5주간 정맥 투여하였다. 이에 대한 결과를 도 7에-나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이， Avast in 5mg/kg투여군과 Avast in-A22p 1.25mg/kg 투여군의 암 성장 억제 효과가 유사한 수준임을 확인하였다. 즉 Avast in-A22p 융합 단백질은 Avast in의 1/4 용량으로도 동등한 정도의 항암 효능을 나타낼 수 있다는 것을 알수 있었다.
Avast in-A22p가 Avast in의 1/4 용량으로도 동일한 항암 효과를 나타내는 것 은 A22p에 의한 NRP1 신호 전달 차단의 결과로 생각되며, 이러한 결과는 임상 적용 시에도 투여 용량 감소를 통한 부작용 감소 가능성을 제시한다고 할 수 있다.
<실시예 6>
Avast in-A22p 의 내성세포주 migration 억제 확인 시험
Avast in의 내성 및 무반응의 원인 중 하나는 Avast in의 타겟인 VEGF-A외에도 FGF, notch 1 igand/receptor system, PIGF, PDGF-BB 등 다른 성장인자와 신호 전달 기작이 관여하기 때문이다. NRP1은 VEGF-A와 결합하는 VEGFR2외에도 VEGFR1, VEGFR3, C-met , PDGFR와도 co-receptor로 역할을 하여 신호 전달에 영향을 미친다 고 알려져 있다 . 본 발명자들은 Avast in과 융합된 A22p가 NRP1에 결합하는 다른 angiogenic factor와 경쟁적으로 결합을 저해하는지 확인하고자 하였다.
HCT116 세포에 Avast in을 지속적으로 처리하여 Avast in에 내성을 획득한 세 포주 HCT116/bev (L M El l is , MD anderson에서 제공)에 Avast in과 Avast in-A22p를 처리하여 각각의 migrat i on 억제능을 확인하였다. HCT116/bev는 모세포인 HCT116에 비해 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, P1GF의 발현량이 높고 cel l migrat ion과 metastasi s 능력이 모세포보다 뛰어나기 때문에 (Fan et al . , 2011)， Avast in_A22p가 HCT116/bev 세포의 migrat ion을 억제한다면 Avast in에 의한 내성을 극복하고 효능 증대 가능성을 확인할 수 있다고 판단하였다. 구체적인 시험방법은 다음과 같다.
HCT116과 HCT116/bev 세포를 각각 6-wel l 폴레이트에 4 x lo wel l개씩 분주 하고 2일 배양하였다. 그 후 각 wel l에 십자 모양의 공란을 만들었으며， 배지를 제 거하고 1% FBS가 첨가된 MEM-alpha 배지에 VEGF가 50ng/ml이 되도록 첨가하여 분주 하였다. Avast in과 Avast in-A22p는 각각 luM이 되도록 처리하였다. 공란은 약물을 처리하고 난 뒤 바로 촬영하였으며 (0시간)， 48시간부터 2시간 간격으로 동일한 위 치를 촬영하였다. 촬영 결과물은 Image J 프로그램을 통해 빈 공란의 넓이를 계산 하여 역으로 세포의 이동 정도를 정량화 하여 Avast in— A22p와 Avast in의 세포 이동 저해능을 비교하였다. 이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, HCT116는 VEGF에 의해 migrat ion이 51.7%에서 67.4%로 증가하였고 Avast in과 Avast in-A22p 처리 시 각각 61.2%, 61.7%로 동일한 수준으로 감소하였다. 이에 반해 HCT116/bev 세포는 VEGF를 처리하지 않은 군에서 도 65.3%로 HCT116보다 더 공격적임을 확인하였고 VEGF 처리 시 72.9%로 상승하였 다. Avast in에 의해서는 74.1%로 migrat ion에 차이가 없었으나 Avast in-A22p 처리 시에는 66.2%로 VEGF를 처리하지 않은 군과 동일한 수준으로 migrat ion이 억제됨을 확인하였다.
Avast in 적응세포주인 HCT116/bev가모세포인 HCT116에 비해 VEGF-A 첨가 유 무에 상관없이 migrat ion이 증가한 것은 HCT116/bev가 VEGF-A 뿐만 아니라 다른 성 장인자에 의존적인 migrat ion이 증가하였음을 보여주는 결과로, Avast in 처리시 이 를 억제하지 못하지만 Avast in-A22p 처리시에는 VEGF-A를 처리하지 않은 수준으로 migrat ion이 감소되었다. 이는 Avast in-A22p가 VEGF-A외에도 다른 성장인자에 의한 신호 전달을 억제한다는 것을 의미하며, 따라서 Avast in에 의한 내성 극복에 기여 할 수 있음을 의미한다. 또한 VEGF-A외에도 다른 신호 전달을 억제하여 항암'효과 를 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 내성발생 가능성도 낮출 수 있음을 암시한다.
<실시예 7>
Avast in-A22p 의 PDGF신호 전달 억제 확인 시험
NRP1은 PDGF 수용체의 co-receptor로 작용하여 PDGF에 의한 신호 전달을 강 화시킨다. 암 세포에서 PDGF가 이들의 수용체에 결합하면 pl30cas 단백질 인산화가 증가하면서 암세포의 migrat ion과 invasion이 촉진된다고 알려져 있다. 본 발명자 들은 Avast in과 융합된 A22p가 NRP1에 결합함으로써 PDGF의 신호 전달을 억제하는 지 확인하고자 하였다.
U87MG 세포에 Avast in과 Avast in-A22p를 각각 25ug/ml이 되도록 처리하고 30 분 뒤에 PDGF를 50ng/ml이 되도록 처리하였다. 5분 뒤에 단백질을 추출하고 ant i- phospho-pl30 ant ibody와 ant i-pl30cas ant ibody를 사용하여 pl30cas 인산화를 비 교하였다. 이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이， PDGF에 의해 pl30cas 인산화가 증가하였고， Avast in 처리 시에는 차이가 없으나， Avast in-A22p 처리군에서는 인산화가 vehicle 수준으로 억제됨을 확인할 수 있었다. 이는 Avast in-A22p가 VEGF-A를 제거할 뿐만 아니라 NRP1에도 결합함으로써 PDGF에 의한 신호 전달도 억제함을 의미하며 PDGF에 의한 migrat ion과 invasion을 억제함으로써 항암 효과를 증가시킬 수 있음을 의미한다.
<실시예 8>
Avast in 변이체 -조직 투과성 펩타이드 (TPP) 읍합 단백질의 계작
본 발명자들은 다른 항체의약품에서 많이 변형되는 서열을 포함하는 변이체 에 조직 투과성 펩타이드 (TPP)를 융합한 융합단백질에서도 그 특성이 유지되는 지 를 확인하기 위하여 Avast in의 아미노산 서열에서 362번째 및 364번째 아미노산이 변이된 Avast in 변이체 펩타이드 (이하 "Avast in(V) "라 함)의 C-말단에 뉴로필린 KNRP1) 및 2에 모두 결합하는 조직 투과성 펩타이드 (TPP)를 융합하고자 하였다. 구체적으로, Avast in(V)의 C-말단에 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖 는 TPP(A22p)가 각각 융합된 융합단백질 및 이를 생산하는 세포주를 제작하였다. PCDNA3. K-) 백터에 선별마커 DHFR 유전자를 삽입하고 Avast in(V)-A22p 중쇄와 경 쇄를 제한효소 Not l과 BamHI으로 각각 클로닝하였다. CHO DG44 세포에 상기 구축된 각각의 항체 중쇄불변부위와 NRP1에 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 인코딩 하는 플라스미드와 경쇄사슬 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 Neon™ eletroporesis를 이용하여 단백질을 발현시켰다. T25 f lask에 각각의 풀라스미드를 트랜스펙션 (transfect ion)한 3X106 cel ls을 접종하고 37°C에서 배양하였다. 선별 마 커를 이용하여 stable cel l을 확보한 뒤 바이오리액터에서 무혈청 SFM4CH0 (Hyclone)를 이용하여 부유상태로 7일간， 100 rpm, 37°C， pH7.2, 50% D02조건에서 배양하였다. 상등액은 원심분리를 이용하여 세포와 분리하고 0.22 y m 필터를 이용 하여 제균하였다. Avast in(V)-A22p의 배양액을 회수하여 표준 프로토콜을 참조하여 각각의 단 백질을 정제하였다. 정제 컬럼은 단백질 A 레진 (MabselectSure resin) (GE healthcare)을 XK16/20 컬럼 (MabselectSure resin)(GE heal thcare)에 20 mL 층진하 여 200 cm/h의 선속도를 적용하였다. 단백질 A컬럼에 1L의 항체를 적용하고, 컬럼 의 15배 부피를 PBSCpH 7.4, 137 mM NaCl , 2.7 mM C1 , 10 mM Na2HP04, 2 mM K¾P04) 로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액 100 mL을 이용하여 pH3.0에서 항체를 용리 한다. UV흡광도 280 nm 파장에서 10 raAU~10 mAU까지 회수된 단백질 60 mL을 1 M Tri s 완충액 0.7 mL을 사용하여 pH 7.0으로 중화하였다. 항체 분획은 0.2um 필터 (Mi l l ipore) 여과 후, am i con (30 丽 CO) 농축기 (Mi U ipore)를 사용하여 3 , 500rpm 에서 10분씩 농축하고， 10% glycer 을 포함한 PBS(pH 7.4) 완충액으로 교환하였 다. 정제된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질은 환원성 및 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 분석하였다.
Avast in(V)-A22p, Avast in-A22p를 발현하는 세포주에서 회수한 배양액에서 각각의 단백질을 정제하여 SDS-PAGE로 분리하였다. 도 10에서 Avast in(V)-A22p가 정상적으로 항체를 형성하고 Avast in-A22p와 유사한 분자량을 가짐을 확인할 수 있 었다.
Avast in(V)-A22p 정제된 단백질의 순도를 확인하기 위해 HPLC (High performance l ipid chromatography)분석을 수행하였다. Agi lent 1200 기기 (Agi lent) 를 이용하였으며， 크기 배제 컬럼 (Biosui te 250) (Waters)을 사용하였다.
구체적으로， 0.2 M 인산칼륨과 0.25 M 염화칼륨을 흔합한 완충용액 (pH 6.2) 을 이동상으로 사용하였고, 0.35 ml/min 유속으로 20분간 홀려주어 시행되었다. 머 무른 시간에 따라 단백질의 크기를 확인하고， 면적과 높이에 따라 순도를 확인하였 다. 도 11에서 정제한 Avast in(V)-A22p의 순도를 SE-HPLC를 이용하여 분석하였 다. Avast in(V)-A22p (도 11A)의 순도가 97% 이상이고 Avast in-A22p (도 11B)와 동일 함을 확인할 수 있었다. 본 발명자들은， 이하에서 Avast in(V)에 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노 산 서열을 갖는 TPP인 A22p를 융합한 Avast in(V)-A22p 융합단백질을 제작하여 그 활성을 평가하였다. <실시예 9>
Avast in(V)-조직 투과성 펩타이드 (TPP) 읍합 단백질의 NRP1 및 VEGF 결합능 상기 실시예 8에서 제작된 융합 단백질인 Avast in(V)-A22p이 Avast in-A22p와 N-말단은 기존의 Avast in과 동일하게 VEGF를 제거하고， Ο말단은 NRP1과 결합하여 관련 신호전달을 이중으로 차단할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 Avast in(V)- A22p의 NRP1 및 VEGF 결합능을 평가하였다. 정제된 Avast in(V)-A22p의 뉴로필린 1의 blb2 도메인 (Neuropi l in l-blb2 domain)에 대한 결합능을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)에서 확인하 였다. 양성 대조군으로 Avast in-A22p을 사용하였다. 표적분자 뉴로필린 1의 blb2 도메인 (273— 586) 을 96 wel l Maxibinding Immuno 플레이트 (SPL Li fe sciences . , Korea)에 1개 wel l당 l y g씩 2시간 동안 37 ° C 에서 결합시킨 후 0.1 % PBST (0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl , 2.7 mM KCl , 10 mM Na2HP04, 2 raM K¾P04)로 1분간
3희 씻어내었다. 5 % 스킴 밀크 (skim mi lk)가 포함된 0.1% PBST로 1시간 동안 결합 한 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 실험군으로 Avast in(V)-A22p를 50nM, 25nM, 12.5ηΜ 이 퇴게 0.1 % PBST로 회석하여 각 농도별로 37 ° C에서 1시간 처리한 뒤 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. HRP가 접합된 ant i-kappa l ight chain 항 체 (Horseradish per ox i dase-con j ugat ed ant i -human kappa l ight chain mAb, SIGMA-ALDRICH co. , USA) 를 5 % 스킴 밀크가 포함된 0. PBST에 100, 000배 희석 하여 3그 C에서 30분 처리하였다. 그후 0.1 % PBST로 1분간 5회 씻어냈다. 발색을 위하여 TMB HRP colorimetric substrate (Surmodi cs co. , USA)를 처리하여 상온에 서 10분간 반웅시킨 후 동부피의 IN HC1 (stop buffer)을 처리한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 얻어진 ELISA 결과를 통해 발현 정제한 Avast in(V)-A22p의 뉴로필린 1의 blb2 도메인에 대한 결합능을 확인 하였다. 정제된 Avast in(V)-A22p의 Recombinant human VEGF 165 (R&D systems co. , China)에 대한 결합능을 ELISA에서 확인하였다. 양성 대조군으로 Avast in-A22p를 사용 하였다. 표적분자 Recombinant human VEGF 165를 96 wel l Maxibinding Immuno 플레이트에 1개 wel l당 0.2 y g씩 2시간 동안 37 ° C 에서 결합시킨 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 5 % 스킴 밀크가 포함된 0.1% PBST로 1시간 동안 결합한 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 실험군으로 Avast in(V)-A22p를 6.25nM, 3.12nM, 1.56nM이 되게 0.1 % PBST로 희석하여 각 농도별로 37 ° C에서 1시간 처리 한 뒤 0.1 % PBST 로 1분간 3회 씻어내었다. HRP가 접합된 ant i-kappa l ight chain 항체를 0.1% PBST가 포함된 5 % 스킴 밀크에 100, 000배 희석하여 37 ° C에서 30분 처리하였다. 그 후 0.1 % PBST로 1분간 5회 씻어낸다. 발색을 위하여 TMB HRP color imetric substrate를 처리하여 상온에서 10분간 반웅시킨 후 동부피의 IN HC1 을 처리한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 얻어진 ELISA 결과를 통해 발현 정제한 Avast in(V)— A22p의 Recombinant human VEGF 165에 대한 결합능을 확인 하였 다. 이에 대한 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, Avast in(V)-A22p는 대조군으로 사용된 Avast in- A22p와 동등한 수준으로 NRP1에 결합하였고 (도 12A) VEGF와도 Avast in-A22p와 동등 한 수준으로 결합하는 것으로 확인되었다 (도 12B) .
【산업상 이용가능성】
본 발명의 조직 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenesis) 제제 가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 치료 용 약학적 조성물은 항-신생혈관생성 제제의 종양 투과성이 개선되고, 암을 타겟팅 하는 효과를 발휘하여 적은 용량으로도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있어 항 -신생 혈관생성 제제의 부작용을 경감시킬 수 있으며, 신생혈관생성과 관련된 성장 인자 와 NRP1에 동시에 결합함으로써 항-신생혈관생성 제제에 내성을 나타내는 암 또는 혈관신생 관련 질환에도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 암 또는 혈관신생 관련 질환은 항-신생혈관생성 제제 에 내성 또는 무반웅인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 3]
제 1항에 있어서, 상기 종양 투과성 펩타이드는 뉴로필린 KNRP1) 및 뉴로필 린 2(NRP2)에 모두 결합하거나 또는 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합하는 것을 특 징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 4]
제 3항에 있어서, 상기 종양 투과성 펩타이드 중 뉴로필린 1 및 뉴로필린 2에 모두 결합하는 펩타이드는 서열번호 1 내지 4 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하 나의 아미노산 서열을 포함하며， 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합하는 펩타이드는 서열번호 5 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하 는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 종양투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자는 링커 를 통해 융합된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 6】
제 5항에 있어서， 상기 링커는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 7】
제 1항에 있어서, 상기 융합단백질은 서열번호 9 , 10 및 12로 이루어진 군에 서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 8】
제 1항에 있어서， 상기 항-신생혈관생성 제제는 항 -혈관 내피세포 성장인자( 항 -VEGF) 제제， 항 -PDGF(platelet-der ived growth factor) 제제, 항— PlGF(placenta growth factor) 제제， 항 -FGF(f ibroblast growth factor) 제제, 항- TGF(transforming frowth factor) 제제， 항— ANG(angiopoiet in) 제제， 항- HGFChepatocyte growth factor) 제제， 항 -IGF(Insul in-1 ike growth factor) 제제， 항 -ALKKact ivin receptor-l ike kinase 1) 제제， 항 -Ephr in A 제제, 항- Inter leukin 제제 , 항一 BMP(bone morphogenet i c protein) 제제,
VEGF, PDGF, PIGF, FGF, TGF, ANG, HGF, IGF, ALK1 , ephrin A 또는
Inter leukin 각각에 대한 수용체의 길항 항체，
및 상기 수용체 기반-키메라 분자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으 로 하는 약학적 조성물.
【청구항 9】
제 8항에 있어서， 상기 항 -혈관 내피세포 성장인자 (항 -VEGF) 제제는 라니비주 맙 (ranibizumab) , 베바시주맙 (bevacizumab)， 아플리버셉트 (af l ibercept) , 컨버셉트 (Conbercept ) , 이들의 동등생물의약품 (biosimi lar) , 이들의 변이체 및 항체-약물융 합체 (ADC, Ant ibody Drug Conjugate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 10】
제 1항에 있어서， 상기 혈관신생관련 질환은 류마티스성 관절염, 건선, 염증， 자궁내막증 및 혈관종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 111
계 1항에 있어서， 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐 의 선암， 폐의 편평상피암， 복막암, 피부암， 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암， 항 문부근암, 식도암， 소장암， 내분비선암, 부갑상선암， 부신암， 연조직 육종, 요도 암, 만성 또는 급성 백혈병， 림프구 림프종， 간세포암, 위장암， 췌장암， 교아종， 경부암， 난소암, 간암， 방광암, 간종양， 유방암, 결장암， 대장암， 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암， 신장암， 간암， 전립선암, 음문암， 갑상선암, 간암 및 두경부암으 로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 12】
종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenesi s) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
【청구항 13】
제 12항에 있어서, 상기 암은 항-신생혈관생성 (항 -angiogenes is) 제제에 내 성 또는 무반웅인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 14]
암 또는 혈관신생 관련 질환 치료용 제제를 제조하기 위한 종양 투과성 펩타 이드와 항—신생혈관생성 (항— angiogenes i s) 제제가 융합된 융합단백질의 용도.
【청구항 151
종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenes i s) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 또는 혈관신생 관련 질환의 치료방법.
【청구항 16]
암 전이 억제용 제제를 제조하기 위한 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관 생성 (항 -angi ogenesi s) 제제가융합된 융합단백질의 용도.
【청구항 17】
종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항 -angiogenesi s) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 억제하는 방법 .
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