KR20160037951A - 약제로서 사용하기 위한 bag3 수용체 결합 분자들 - Google Patents

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비오유니베르사 에스.알.엘.
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Abstract

본 발명은 약제로서의, 특히 면역, 염증, 심혈관, 종양 및/또는 퇴행성의 질환의 치료에 사용하기 위한 BAG3 수용체-결합 분자들의 사용에 관한 것이다.

Description

약제로서 사용하기 위한 BAG3 수용체 결합 분자들{BAG3 RECEPTOR BINDING MOLECULES FOR USE AS A MEDICAMENT}
BAG3, 74 kDa 세포질 단백질은 BAG 도메인으로서 알려진 구조적 도메인(structural domain)을 통해 단백질 HSP70(Heat Shock Protein 70)의 ATP아제 도메인(ATPase domain)과 상호작용하는 코샤페로닌들(co-chaperonins)의 패밀리에 속한다. 더욱이, BAG3 단백질은 다른 단백질들에 중재 결합(mediate binding)할 수 있는, WW 도메인(Trp-Trp), 프롤린-풍부 영역(proline-rich region: PXXP), 및 2개의 보존된 모티프들 IPV(Ile-Pro-Val)를 포함한다. 어댑터(adapter)(많은 기능적 도메인들의 존재에 기인할 수 있는)로서 BAG3 단백질의 속성 때문에, 그와 같은 단백질은 그러므로, 다른 단백질들과 상호 작용할 수 있다. 인간들에 있어서, bag3 유전자 발현은 미오사이트들을 포함하는, 몇몇의 정상 세포들(normal cells)에서 구성요소이고, 그것의 돌연변이들은 골격 및 심장 근육들의 질환과 관련이 있다. 게다가, BAG3 단백질은 많은 유형의 원발 종양들 또는 종양 세포주들(림프 또는 골수성 백혈병, 신경모세포증, 췌장암, 갑상선암, 유방 및 전립선암, 흑색종, 골육종, 및 교모세포증, 및 신장, 결장, 및 난소의 종양들)로 발현된다. 정상 세포 유형들, 예컨대 백혈구들, 상피 및 신경교 세포들 및 망막의 세포들에 있어서, bag3 유전자 발현은 옥시던트들(oxidants), 고온들, 혈청의 부족, 중금속들, HIV-1 감염들 등과 같은 스트레스 작용제들에 의해 유도될 수 있다. 이들 데이터는 bag3 유전자 발현 조절이 스트레스에 대한 세포 반응에서 중요한 요소이고 BAG3 유전자 프로모터(gene promoter)에서 다양한 형태들의 세포 스트레스(cell stress)에서 활성화되는, HSF1(Heat Shock Transcription Factor 1)에 대해 반응하는 요소들의 존재와 상관된다는 것을 나타낸다(Franceschelli S., et al. J Cell Physiol 215 (2008) 575-577). 더욱이, 그것의 구조에서의 많은 단백질-단백질 상호작용 도메인들의 존재로 인해, BAG3 단백질은 상이한 분자 파트너들과 상호작용하는 상이한 유형들의 세포들에서 세포 수명에 영향을 준다. (A. Rosati et al. Biochim Biophys Acta. 2012; 1826:365-9).
BAG3 항세포 사멸 활성과 관련하여 보고된 첫 번째 메커니즘은 골육종 및 흑색종 세포들에서 확인되었고, 여기서 BAG3 단백질이 전사 인자 NF-kB 및 세포 수명의 활성화를 조절하는 것이 관찰되었다(Ammirante M. et al., Proc Natl Acad Sci USA 107 (2010) 7497-7502). 상이한 분자 메커니즘이 교모세포증 세포들에서 만들어졌고, 여기서 BAG3 단백질은 세포 기질에 BAX 단백질을 유지하기 위해 HSP70과 포지티브한 방식(positive way)으로 협력하고, 미토콘드리아로의 그것의 전위(translocation)를 방지한다(Festa M. et al., Am J Pathol 178 (2011) 2504-25). 끝으로, 일부 종양들에 있어서, BAG3은 세포 부착(cell adhesion)을 조절하는 단백질들을 조절하는 것을 보였다.
세포질 BAG3 단백질의 존재는 또한 많은 상이한 셀룰러 시스템들에 기재되어 있고 다양한 종양들뿐만 아니라 일반적으로 세포 수명과 관련된 질환들과 관련되어 있다.
BAG3 단백질이 특정 세포들에 의해, 특히 췌장 선암종 세포들 및 산화적 스트레스(oxidative stress)를 받을 때 카디오미오사이트들에 의해 분비될 수 있다는 것이 최근 입증되었다. (Rosati et al., Am J Pathol. 2012 Nov; 181(5): 1524-9; De Marco et al. Cell Death Dis. 2013; 4:e495.). 특허 출원 WO2011/067377은 용해 가능 BAG3 단백질을, 즉 상술한 단백질이 세포에서 분비되는 경우, 특정 병리 상태들(pathological conditions), 예컨대 심장 질환 및 췌장의 종양의 진단에 대해 매우 특이적인 혈청에서의 생화학 마커로서 기술하고 있다. 특히, 췌장 선암종으로 고통받는 환자들에서, 용해 가능 BAG3 농도가 건강한 개체들의 혈청에서보다 상당히 높은 일반적으로 10 ng/ml보다 높다는 것이 입증되었다. 더욱이, BAG3 단백질은 췌장 관세포암(pancreatic ductal adenocarcinoma: PDAC)을 앓는 346/346 환자들에서 발현되고 췌장의 종양의 세포들에 의해 방출되지만, 그와 같은 단백질은 주변의 종양이 아닌 조직들 또는 정상 췌장에서 발현된다는 것이 최근 보고되었고; 마찬가지로 BAG3의 발현 레벨은 환자 생존과 관련된다는 것이 보고되었다. 특히, 췌장에서의 종양 세포들에 의해 분비되는 BAG3 단백질은 대식세포들의 활성화를 유도하고, 그럼으로써, 종양성 증식을 도우며 심장에서, 허혈성 이벤트 후, 손상된 미오사이트들의 포식작용(phagocytosis) 및 괴사 심근을 흉터 조직으로 대체 및 결과적으로 조직 리모델링에 원인이 되는 분자의 생성을 유도한다는 것이 입증되었다.
특허 출원 MI2013A000403은 또한 단일클론성 안티-BAG3 항체들의 사용을 통한 BAG3 단백질의 억제가 췌장의 종양들의 성장을 어떻게 손상시키는지에 대해 기술하고 있다. 실제로 단일클론성 안티-BAG3 항체를 통해 대식세포들에 대한 BAG3의 결합을 방해함으로써 대식세포들의 활성화 및 종양 성장이 억제된다. 안티-BAG3 항체들에 의한 치료는 췌장의 종양들의 관리를 위한 신규의, 더 효과적인 치료 도구를 나타낸다.
알려져 있는 것과 같이, 종양 질환을 위한 종래의 화학요법 치료들 및 코티코스테로이드들 또는 NSAIDs(nonsteroidal anti-inflammatory drugs)에 의한 염증 및 면역 질환의 치료들은 부작용들과 관련된 수많은 문제점을 제기하고 현재 그와 같은 질환들을 관리하는 최고의 수단이 아니다.
그러므로, 본 발명에 기재된 면역, 염증, 심장 및 신생물성 속성(neoplastic nature)의 질환의 관리에 사용되는, 종래의 일반적으로 알려진 치료법들에 비해, 매우 특이적이며, 부작용들이 거의 없거나 실제로 없다는 이점을 갖는 새롭고 개선된 치료법에 대한 분명한 요구가 있다.
발명의 개시
후속 연구들은 BAG3 단백질의 대식세포들(macrophages)의 표면에의 결합 및 대식세포들의 활성화에 원인이 되는, 대식세포들 상에 발현(express)되는 막 수용체들을 확인했다. 이러한 확인을 통해, BAG3 수용체-결합 분자들(BAG3 receptor-binding molecules), 예컨대 저분자들, 펩타이드들, 폴리펩타이드들, 항체들 및/또는 그것의 분절들(fragments)은 BAG3 단백질과 그것의 수용체 간의 결합을 특히 방해하도록 설계될 수 있다.
그러므로, BAG3 리간드의 그것의 수용체로의 그와 같은 선택적 차단은, 표적 세포들의 치료에서 얻어질 더 큰 유효성과, 종래의 비특이적인 치료들(non-specific treatments)의 부작용들의 감소를 가져오는 보다 큰 특이성(specificity)을 가능하게 한다.
그러므로, BAG3 수용체-결합 분자들의 사용을 통한, 표적 세포들의 표면상에 존재하는 BAG3 단백질의 막 수용체들에 대한 BAG3 단백질의 결합의 억제는 대식세포들의 활성을 억제하고 이러한 프로세스는 종양성 증식에 대한 BAG3의 긍정적 효과에 원인이 된다는 것이 놀랍게도 처음으로 입증되었다.
그러므로, BAG3 수용체-결합 분자들에 의한 치료는 종양 질환 및 대식세포들의 활성화와 관련된 다른 질환들, 예컨대 염증, 면역, 심장, 및 퇴행성의 질환들의 관리를 위한 신규의 개선된 치료 도구를 나타낸다.
본원의 발명자들에 의해 기술된 연구들을 통해 확인된 BAG3 단백질에 대한 특이 수용체(specific receptor)는 2개의 단백질, 즉 IFITM-2(Interferon-induced transmembrane protein 2) 및 NRP-1(Neuropilin-1)로 구성된다.
IFITM2는 인터페론에 의해 유도되고 바이러스성 감염의 조절에 관련된 막 단백질로서 기술되었다. 이때까지, 생리학적 리간드들에 대한 수용체로서의 그것의 역할은 알려져 있지 않았다. IFTM-2의 세포 바깥 부분(extra-cellular portion)은, PPxY 타입의 프롤린-풍부 모티프(UniProt accession number for human IFTM-2: Q01629; sequence from aa 16 to aa 19 PPNY)를 포함하고, 이것은 특히 BAG3 WW 도메인과의 결합 친화성을 갖는 사이트(site)로서 기술되어 있다(Ulbricht A. et al. Curr Biol. 2013; 23(5):430-5).
더욱이, IFITM-2의 세포 바깥 부분의 다른 추정되는 도메인들을 조사할 때, 2개의 SH3 도메인들이 확인되었다(www.expasy.org). SH3 도메인들은 BAG3 단백질의 프롤린-풍부 도메인들의 잠재적 인터랙터들(interactors)로서 확인되었다(A. Rosati et al. Biochim Biophys Acta., 2012; 1826:365-9)
NRP-1(Neuropilin-1)은 다양한 유형의 수용체의 비특이적인 체인(공동 수용체(co-receptor))으로서, 여기서 수용체는 예컨대 클래스 3 세마포린(class 3 semaphorin)에 대한 수용체, VEGF 패밀리(VEGF-A, B, C, D, 및 E)의 멤버들에 대한 수용체, 전환성장인자(transforming growth factor β1: TGF-β1), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor:HG), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor: PDGF), 및 섬유모세포성장인자들(fibroblast growth factors: FGFs)가 있다. 이들 수용체들에 있어서, NRP-1은 결합에 참여하고 신호 전달을 증폭한다.
VEGF-B 단백질이 VEGFR-1 수용체 및 그것의 공동 수용체에 결합할 때, NRP-1은 망막 및 뇌에서 세포자멸사(apoptosis)의 억제제로서 작용한다는 것이 WO2009/036149에 나타내어져 있다.
NRP-1 공동수용체에 대한 VEGF-A 단백질의 결합을 막는 것은, VEGFR2 수용체의 인산화(phosphorylation) 및 내피 세포들의 이동을 약화시키는 것이 또한 기술되어 있다(Jarvis A et al., J. of Medicinal Chemistry 53, p. 2215-2226 (2010). 그러므로, 그것이 상호작용하는 수용체에 따라, NRP-1 공동수용체는 혈관 신생(angiogenesis), 축삭 유도(axon guidance), 세포 수명, 세포자멸사, 세포 이동에서 다용도의 역할 및 세포 침범(cell invasion)에서 다용도의 역할을 한다.
특히, NRP-1이 세포 밖의 BAG3 단백질에 의해 활성화되는 신호를 통해 IFITM-2와 관련하여 공동-수용체 기능을 나타내는 경우, IL-6의 방출의 유도는 iNOS 및 COX-2와 같은 염증 프로세스의 활성화와 연관된 단백질들의 레벨 증가와 함께 대식세포들에서 관찰된다.
그러므로, 특히 BAG3 수용체와의 특이적인 상호작용을 통해 BAG3 단백질이 대식세포들에 결합하는 것을 억제할 수 있는, 임의의 분자에 의한 치료는 대식세포들의 활성화를 특징으로 하는 질환들, 예컨대 종양 질환 및 염증, 면역, 심장, 또는 퇴행성의 질환들의 치료에 있어서 특히 유효하다는 것을 증명한다. 실제로, 이들 BAG3 수용체-결합 분자들은 높은 선택성 및 목표 지향적 방식으로 결합하며, 대식세포들에 의해 발현되는 수용체에 BAG3 단백질이 결합하는 것을 차단할 수 있고, 그러므로 BAG3 단백질과 관련된 병리 효과들(pathological effects)을 지연할 수 있다.
특히, 이러한 치료에서 앞에서 언급한 BAG3 수용체-결합 분자들의 이용은 BAG3 단백질의 과도한 발현(over-expression) 및 방출을 특징으로 하는 선택된 질환 상태들에 대해 더 특이적이고 또한 부작용들 면에서 덜 해로운 놀라운 이점을 가진다.
그러므로 본 발명의 일 실시예는 약제(medicament)로서 BAG3 수용체-결합 분자들(BAG3 receptor-binding molecules)의 사용이다.
그러므로 본 발명의 추가의 실시예는 대식세포들의 표면 상에 발현되는 BAG3 수용체-결합 분자들을 약제로서 사용하는 것이다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 상기 BAG3 수용체-결합 분자들은 IFITM-2 단백질, NRP-1 단백질 또는 둘 다에 결합하고; 바람직한 양상에 따르면, 그와 같은 결합 분자들은 IFITM-2 단백질에 결합한다.
본 발명에 따라 이용 가능한 상기 BAG3 수용체-결합 분자들은 저분자들, 펩타이드들, 폴리펩타이드들, 항체들 및/또는 그것의 분절들일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양상에 따르면, 상기 분자들 BAG3 수용체-결합 분자들은 그와 같은 분자들이 VEGF 패밀리 단백질들(VEGF family proteins)이 아니라는 사실을 특징으로 한다.
더욱 더 바람직하게는, 상기 BAG3 수용체-결합 분자들은 다클론성 또는 단일 클론성 항체들, 마우스 항체들(mouse antibodies), 인간화 항체들(humanized antibodies), 키메라 항체들, 재조합 항체들, 결합 항체들, scFv 분절들(디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)), Fab 분절들, 및 F(ab')2 분절들일 수 있다.
본 발명의 바람직한 양상에 있어서, 상기 항체들은 특정 BAG3 수용체 항체들, 바람직하게는 안티-IFITM-2 항체들 또는 안티-NRP-1 항체들, 및 더욱 바람직하게는 안티-IFITM-2 항체들로부터 선택될 수 있다.
용어 "저분자들(small molecules)"은 저 분자량을 갖는 일련의 작은 생물학적 활성 분자들, 예컨대 결합 라이브러리(combinatorial library)의 고속대량스크리닝(high throughput screening)에 의해 확인되는 분자들, 항체 분절들, 펩타이드들, 화학적으로 개질된 펩타이드들, 유기 분자들, 올리고머들, 및 핵산들의 분절들(예컨대 RNAi)로서, 이들은 적절히 확인되는 특정 병리 타겟(pathological target)에 결합할 수 있기 때문에 치료기능을 가진다. 저분자들의 일부 예들은 폐종양들을 갖는 환자들에서 EGFR을 억제하는, 알려진 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 억제제들(Gefitinib 및 Erlotinib), 또는 유방의 ERBB2-양성 종양들의 관리에 사용되는 단일 클론성 안티-ERBB2 항체(Trastuzumab), 및 수많은 다른 예들(Hoelder S et al., Molecular Oncology 6, p. 155-176 (2012)이다. VEGF-A NRP1의 수용체를 위한 리간드-특이적인 저분자의 확인의 일례는 문헌(Jarvis A et al., J of Medicinal Chemistry 53, p. 2215-2226 (2010))에 기술되어 있다.
용어 "다클론성 항체(polyclonal antibody)"는 상이한 플라즈마 세포들에 의해 생성되므로 유전적으로 상이하며 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 항체들의 혼합물을 말한다.
용어 "단일클론성 항체(monoclonal antibody)"는 단지 하나의 유형의 면역 세포(즉 세포 클론)로부터의 세포주들에 의해 생성되므로 모두 동일한 항체들의 세트를 말한다.
용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 기원의 항체를 말하고, 그것의 고변이부위(hypervariable region)는 비인간 단일 클론성 항체들의 비인간 단일 클론성 항체들의 상동 영역(homologous region)에 의해 대체되었다.
용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 상이한 항체들로부터 유도된 부분들을 포함하는 항체를 말한다.
용어 "재조합 항체(recominant antibody)"는 재조합 DNA 방법들을 이용하여 얻어진 항체를 말한다.
용어 "결합 항체(conjugated antibody)"는 약품들, 독소들, 방사성 물질들 또는 다른 제제들(agents)와 결합된 항체들을 말한다.
용어 "scFv 분절(scFv fragment)"(single chain variable fragment)은 오직 관련 항원과 결합할 수 있는 면역글로블린 분절들을 말한다. ScFv 분절들은 또한 펩타이드 연결체들(peptide linkers)을 이용하여 이합체(디아바디), 삼합체(트리아바디) 및 사합체(테트라바디)로 합성될 수 있다.
용어들 "Fab 분절(Fab fragment)"(fragment antigen-binding) 및 "Fab2 분절"은 인접한 중쇄(heavy chain)의 Fc 분절에 연결된 경쇄(light chain)로 구성되는 면역글로블린 분절들을 말하고 그와 같은 분절들은 일가 항체들(monovalent antibodies)이다. Fab 부분들이 쌍들로 되어 있을 때, 분절은 Fab2로 불린다.
본 발명의 추가의 목적은 대식세포들의 활성화를 포함하는 특별한 질환 상태의 치료에 앞에서 언급한 BAG3 수용체-결합 분자들의 사용이다. 그와 같은 질환 상태는 종양 질환, 염증 질환, 심장 질환, 면역 질환, 또는 퇴행성 질환으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 종양 질환은 췌장암으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 상기 염증 질환은 피부, 신경들, 뼈들, 혈관들, 및 결합 조직들의 염증과 관련된 질환, 및 더욱 바람직하게는 건선, 관절염, 신경염, 커넥티버티스(connectivitis)로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 상기 심장 질환은 협심증(angina pectoris), 심근경색증(myocardial infarction), 허혈(ischemia), 급성 관동맥 증후군(acute coronary syndrome), 및 급성 및 만성 심부전(cardiac failure)으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 상기 면역 질환은 자가면역 질환 예컨대 류마티스성 질환, 결합 조직 질환(connective tissue disease), 신경근 질환(neuromuscular disease), 내분비 질환(endocrine disease), 소화기 질환(gastrointestinal disease), 혈액 질환(blood disease), 피부 질환(skin disease), 및 혈관염(vasculitis), 및 더욱 바람직하게는, 류마티즘성 관절염, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 커넥티버티스(connectivitis), 홍반성 루프스(lupus erythematosus), 자궁내막증(endometriosis), 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 퇴행성 질환은 신경변성 질환(neurodegenerative disease) 및 근육 퇴행성 질환(muscular degenerative disease), 및 더욱 바람직하게는 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 및 근 이영양증(muscular dystrophy)으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 동시(simultaneous), 별개(separate), 또는 순차적 (sequential) 사용을 위한 복합제제(combined preparation)로서, 적어도 하나의 안티-BAG3 항체와 함께, 앞에서 언급한 BAG3 수용체-결합 분자들의 사용이다.
본 발명의 바람직한 실시 예에 따르면, 적어도 하나의 안티-BAG3 항체와 함께 앞에서 언급한 BAG3 수용체-결합 분자들은 종양 질환, 염증 질환, 심장 질환, 면역 질환 또는 퇴행성 질환의 치료에 사용된다.
본 발명의 일 양상에 있어서, 상기 BAG3 수용체-결합 분자들은 인간들에 투여될 수 있다.
본 발명의 추가의 양상은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 적어도 하나의 BAG3 수용체-결합 분자를 포함하는 약학적 조성물을 달성하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 동시, 별개, 또는 순차적 사용을 위한 복합제제로서 적어도 하나의 BAG3 수용체-결합 분자 및 적어도 하나의 안티-BAG3 항체를 포함하는 약학적 조성물을 달성하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 약제로서 상기 조성물의 사용이다.
본 발명의 바람직한 실시예는 종양 질환, 염증 질환, 심장 질환, 면역 질환 또는 퇴행성 질환의 치료에 앞에서 언급한 조성물의 사용이다.
본 발명의 조성물은 경구 투여에 적합한 형태로 또는 비경구 또는 국소 투여에 적합한 형태로 형성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 경구 형태는 정제(tablet), 캡슐, 용액, 현탁액, 과립, 및 지성 캡슐(oily capsule)로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시예에 있어서, 국소 형태는 크림, 연고, 살브(salve), 용액, 현탁액, 점안약(eye drop), 페서리(pessary), 분무 용액(nebuliser solution), 스프레이, 분말, 또는 겔로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 비경구 형태는 수성 완충 용액(aqueous buffer solution) 또는 지성 현탁액(oily suspension)으로부터 선택된다.
상기 비경구 투여는 근육내, 정맥 주사, 피내, 피하, 복강내, 노드 내(intranodal), 또는 비장내 투여로부터 선택될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 인간들에 투여될 수 있다.
다음의 예들은 본 발명의 아무런 제한 없이 단지 본 발명의 더 나은 이해를 허용하기 위해 의도된다.
도 1. P1 : 500g(전체 세포들)에서의 원심 분리 후의 침전물들(pellets); P2: 15,000g(ER, 미토콘드리아, 핵)에서의 원심 분리 후의 침전물들; P3: 100,000g(플라즈마 막들)에서의 원심 분리 후의 침전물들; S3: 100,000g에서의 원심 분리 후의 상청액들(supernatants). 결과들은 BAG3 재조합 단백질의 존재를 강조하기 위해 사용된, HRP에 결합된 안티-펜타 His 항체(anti-penta His antibody)를 통해 획득되었다.
도 2. 도 2는 BAG3 재조합 단백질로 J774 세포들에 대한 처리가 없을 때, 안티-His 항체를 이용하여 단백질이 검출되지 않는 것을 나타낸다. J774 세포들을 갖는 rBAG3의 배양 후 준비된 가용성 플라즈마 막들로부터 BAG3을 포함하는 재조합 단백질 복합체들(protein complexes)의 정제는, 거절된(rejected) 샘플(FT)에서 rBAG3의 존재가 관찰되지 않았음을 나타내며, 마찬가지로 워시 프랙션들(wash fractions)에서 관찰되지 않았음을 나타낸다. 이것은 Ni-NTA 수지에 결합하는 특정 rBAG3을 확인하고 워싱 버퍼들의 엄중함(stringency)은 결합의 특수함을 보장하고 rBAG3이 250 mM 이미다졸 용액에 의해 제 1의 2개의 프랙션들에서 완전히 용리된다는 것을 확인한다. 용리 분류들에서 획득된 전체 단백질들은 TCA에 의한 석출 후 결정되었다.
범례(Legend). 수지에 결합된 FT 샘플; 5 mM 이미다졸을 갖는 W5-1 W5-2 워시 프랙션들. 10 mM 이미다졸을 갖는 W1O-1 W10-2 W10-3 워시 프랙션들; 250 mM 이미다졸을 갖는 E250-1, E250-2, E250-3 용리 프랙션들. 결과들은 BAG3 재조합 단백질의 존재를 강조하기 위해 사용되는 HRP에 결합된 안티-펜타 His 항체를 통해 획득되었다.
도 3. NRP-1 및 IFITM-2의 레벨들은 비특이적 siRNA (scrb) 또는 NRP-1- 또는 2-IFITM-특이적 siRNA로 감염된, J774 조절 세포들에서 웨스턴 블롯 기술(Western Blot technique)로 측정되었다.
도 4. 그래프들은 FITC에 결합된 BAG3 재조합 단백질로 배양된 세포들로부터의 유동 세포 분석법(flow cytometry)에 의해 획득된 형광 발광 포지티브 세포들(fluorescence-positive cells)의 백분율을 나타낸다. ctr 및 scrb 샘플들은 컨트롤 세포들(control cells) 또는 재조합 BAG3에 의해 결합된 비특이적 siRNA(scrb)에 의해 감염된 세포들의 백분율을 나타낸다. 이러한 백분율은 NRP-1- 또는 IFITM-2-특이적 siRNA들에 의한 또는 2개의 공동-감염된 siRNA들로 감염 이후에 감소되었다. 바들(bars)은 FITC에 결합된 BAG3와 결합하는데 포지티브(positive)를 보인 세포들의 백분율 + 표준 편차를 나타낸다. *** p<0.001 VS scrb.
도 5. 그래프들은 막 수용체들, NRP-1, IFITM-2, 또는 둘 다의 다운-조절(down-modulation)이 rBAG3 단백질에 의한 자극 이후, IL6의 방출에서 급격한 감소로 이어지는 것을 나타낸다.
도 6. 그래프는 IFITM-2 항체(Code H00010581M 14 Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)의 존재가 세포 표면(C)에 대한 BAG3-FITC의 결합에서 53.4% 감소로 이어지는 것을 나타낸다. ***p<0.001.
도 7. 도 1의 그래프는 100 ng/ml의 농도에서, 재조합 단백질은 컨트롤(p<O.001)에 비해 200%만큼 아질산염 생성을 증가시키고 그것의 활성도가 용량-의존적(dose-dependent)인 것을 나타낸다.
도 8. 형광 현미경 이미지들은 형광단(fluorophore)과의 재조합 단백질의 결합을 통해 J774 세포들의 세포 표면에 대한 BAG3 단백질의 결합을 나타낸다.
도 9. 형광 현미경 이미지들은 BAG3 단백질이 대식세포들의 표면에 결합하고, 심장 근육 세포들(HCM) 또는 췌장 선암종 세포들(PANC-1)에는 결합하지 않는 것을 입증한다.
도 10. 유동 세포 분석법 분석을 통해, FITC-BAG3가 J774 세포주의 대식세포들에 결합하는 것이 관찰되었다.
도 11. COX-2 및 iNOS 효소 레벨들이 rBAG3에 의한 세포들의 치료 후에 증가된 것을 도면에서 관찰될 수 있다.
도 12. BAG3은 아질산염(nitrite)의 방출을 유도한다는 것을 도면에서 관찰할 수 있다. 이것은, 대식세포들이 단백질과 결합으로 활성화되었다는 것을 확인해준다.
도 13. 이 도면은 BAG3가 인터류킨-6(interleukin-6: IL-6)의 방출을 유도하는 것을 보여준다. 이것은, 대식세포들이 단백질과 결합으로 활성화되었다는 것을 확인해준다.
예들
예 1. 막들( membranes )의 분별( fractionation ), BAG3 재조합 단백질( rBAG3 )을 포함하는 복합체들의 추출 및 가용화 ( extraction and solubilization ).
2천만개의 대식세포 세포들(J774 세포주)의 2개의 풀들(pools)이 30분 동안 얼음 상에서 해동되었다. 세포들은 pH 8.0에서 1X 프로테아제 억제제들(PIC 1X, Roche)의 용액을 포함하는, 10 ml의 차가운 PBS 1X에서 3번 세척되었다. 세포들은 이후 5 ml의 IX PBS에서 다시 현탁되었고 4℃에서 1시간 동안 25 g BAG3 재조합 단백질(1 pg/ml)로 배양되었다. 네거티브 컨트롤(negative control)에 사용된 세포들의 샘플은 BAG3 재조합 단백질 없이 동일한 조건들에서 배양되었다. 세포들은 나중에 초과의 단백질을 제거하기 위해 10 ml의 차가운 PBS 1X에서 2회 세척되었다. 최종 침전물들은 5 ml의 PBS 1X, PIC 1X, pH 8.0에서 다시 현탁되었고, 다운스(Dounce)를 이용하여 얼음 위에서 기계적으로 용해되었다. 막들은 순차 원심 분리들에 의해 다음과 같이: 4℃에서 5분 동안 500 g, 4℃에서 30분 동안 15,000 g, 및 4℃에서 1시간 동안 100,000 g에서 분별되었다. 플라즈마 막 프랙션(100,000g에서 원심 분리 후 획득된 침전물들)은 200 ㎕의 PBS 1X, PIC 1X, pH 8.0에 의해 다시 현탁되고 가용성(solubilized)으로 되었다.
샘플들은 4℃에서 1시간 동안 100,000 g에서 원심 분리되었다. 침전물들 및 상청액들은 2% SDS에 의해 변성(denatured)되었다. 단백질들은 SDS-PAGE로 분리되었고 PVDF 막 상에서 고정화되었다. HRP에 접합된 안티-펜타 His 항체는 이러한 태그(tag) 타입을 포함하는 BAG3 재조합 단백질의 존재를 강조하기 위해 사용되었다. 도 1은 rBAG3 재조합 단백질이 플라즈마 막 상에 존재하는 단백질 파트너들에 결합할 수 있다는 것을 확인한다.
예 2. 친화 크로마토그라피( affinity chromatography) 를 통한 BAG3 재조합 단백질( rBAG3 )을 포함하는 복합체들의 정제.
플라즈마 막의 프랙션(fraction)으로부터 획득된 단백질들은 pH 8.0에서, 0.2% DDM, PBS 1X, PIC 1X를 포함하는 200 ㎕의 용액의 첨가에 의해 희석되었고, 4℃에서 1시간 동안 400 ml의 투석 버퍼(0.1% DDM, PBS 1X, PIC 1X, 5 mM 이미다졸, pH 8.0)에서 Slide-A-Lyzer 투석 카세트(10,000 MWCO, 0.1-0.5 ml 용량, Pierce)에서 투석되었다. 버퍼를 변경한 후, 투석이 하룻밤 동안 수행되었다. 바인딩 버퍼(pH 8.0의 0.1 % DDM, PBS 1X, PIC 1X, 5 mM 이미다졸)에서 평형화된 25 ㎕의 Ni-NTA 수지가 투석된 샘플들에 첨가되었고, 4℃에서 교반에 의해 배양되었다. 10초 동안 1000 g에서의 원심 분리 후, 상청액들(supernatants)이 제거되었다. 수지들은 4볼륨의 바인딩 버퍼(100 ㎕)로 2번 세척되었고 4볼륨의 세척 버퍼(pH 8.0의 0.1 % DDM, PBS 1X, PIC 1X, 10 mM 이미다졸)에 의해 3회 세척되었다. 결합된 단백질들은 3x2 볼륨(50 ㎕)의 용리 버퍼(pH 8.0의 0.1 % DDM, PBS 1X, PIC 1X, 250 mM 이미다졸)에 의해 용리되었다. 정제로부터 획득된 각각의 프랙션(fraction)은 SDS-PAGE에 의해 분석되고 이후 PVDF 막 위로 이동된 다음 HRP에 결합된 안티-펜타 His 항체에 의한 면역 검출(immunodetection)이 수행되었다. 용리된 제 1 프랙션은 함께 그룹화되었고 트리클로로 아세트산(trichloroacetic acid: TCA)에 의해 농축되었다. 단백질들은 차가운 20% TCA로 얼음 위에서 2시간 동안 석출되었다. 원심 분리 후, 침전물들은 차가운 아세톤에 의해 3회 철저히 세척되었다. 최종 침전물들은 5 ㎕ 구아니딘 8 M, Tris-HCl 100 mM, pH 8.0에 의해 다시 현탁되었다. 이 버퍼는 모든 석출된 단백질들의 가용화를 허용하고 질량 분석과 호환 가능하다. 단백질 농도는 Nanodrop 2000 분광 광도계(ThermoScientific)에 의해 280 nm에서 흡광도를 측정하여 결정되었다.
도 2는 BAG3 재조합 단백질에 의한 J774 세포들의 처리가 존재하지 않을 때, 단백질이 안티-His 항체를 이용하여 검출되지 않는 것을 나타낸다. J774 세포들에 의한 rBAG3의 배양 후 제조된 가용성 플라즈마 막들로부터 BAG3를 포함하는 재조합 단백질 복합체들의 정제는 rBAG3의 존재가, 거절된 샘플(FT)에서 및 마찬가지로 워시 프랙션들에서 관찰되지 않는 것을 나타낸다. 이것은 Ni-NTA 수지에 결합하는 특정 rBAG3을 확인해주고, 세척 버퍼들의 엄중함은 결합의 특이성을 보장하고 rBAG3이 250 mM 이미다졸 용액에 의해 제 1의 2개의 프랙션들에서 완전히 용리되는 것을 확인해준다. 용리 프랙션들(elution fractions)에서 획득된 전체 단백질들은 TCA에 의한 석출 후 결정되었다.
예 3. BAG3 재조합 단백질을 포함하는 복합체 들의 LC- MSMS 분석.
55℃에서 45분 동안 15 mM DTT에 의한 환원 후, 3.5 μg 샘플이 실온에서 45 분 동안 50 mM 요오도아세트아미드(iodoacetamide)에 의해 알킬화되었다. 트립신 분해(Trypsin digestion)가 37℃에서 18시간 동안 수행되었다. 샘플은 이후 스피드-백(Speed-Vac)에 의해 건조되었고, 끝으로 10 ml 0.3% TFA에서 다시 현탁되었다. 샘플들은 0.05% TFA, 98/2 H20/ACN을 포함하는 용액으로, C18 capillary column Acclaim Pep Map 100(5 micron, 100A, 300 ㎛ x 5 ㎝, Dionex)을 이용하여 미리 농축된 후 분해(digestion)되었다. 펩타이드들은 이후 0.1 % 포름산 버퍼 10/80 H20/ACN, 0.1 %에 의해 C18 Acclaim PepMaplOO(3 ㎛, 100A, 75 ㎛ x 15 ㎝, Dionex)을 이용하여 분리되었다. 이중 질량 분석법(Tandem Mass Spectrometry: MSMS)이 LTQ Velos(Thermo Scientific)에 의해 수행되었다. 데이터는 스위스-프롯 데이터베이스(Swiss-Prot database)(UniProt B, vl 2/2012)를 이용하는 Proteome Discoverer 1.1(MASCOTTE algorithm, v2.2.4) 소프트웨어에 의해 분석되었다. 표 1은 rBAG3를 갖는 복합체에서 공동-정제된 플라즈마 막 단백질들을 나타낸다. 특히, 그와 같은 막들은 2개의 수용체 분자들: 인터페론-유도 막관통 단백질 2(IFITM-2) 및 뉴로필린-1(NRP-1)을 포함했다. 그러므로, 최초로, BAG3 플라즈마 막의 수용체들이 프로테오믹 접근법(proteomic approach)을 통해 확인되었다. 이러한 프로세스를 통해, 세포 밖의 BAG3과의 결합에 포함된 2개의 수용체들을 포함하는 9개의 새로운 BAG3 파트너들이 확인되었다. 식별된 파트너들은 다양한 생물학적 프로세스들 예컨대 막 리모델링, 세포자멸사, 및 면역계 발달 및 변화에 포함된다. 특히, IFITM-2 수용체는 세포자멸사 조절 프로세스들에 포함되고, NRP-1은 혈관 신생, 혈전 형성, 및 심장혈관계의 성장(development)의 역할을 한다.
표 1. rBAG3 을 갖는 복합체에서 공동-정제된 플라즈마 막 단백질들.
Gene name Access number
Adenylyl cyclase-associated protein 1 P40124
Clathrin heavy chain 1 Q68FD5
Constitutive coactivator of protein similar to PPAR gamma1 Q6A0A9
Glicoprotein-N-acetilgalattosamina3-betagalattosiltransferasi 1 Q9JJ06
D-D alpha chain, class I H2 histocompatibility antigen P01900
K-D alpha chain, class I H2 histocompatibility antigen P01902
Interferon 2-induced trans-membrane protein Q99J93
IIc low-affinity immunoglobulin receptor Fc region P08101
neuropilin 1 P97333
예 4. J774 세포들에서 NRP -1 및-2 IFITM 레벨들의 네거티브 조절(negative modulation).
J774 세포들은 40% 컨플루언스(confluence)에서 24-웰 플레이트(well plate)에서 시딩(seeding)되었고, 24시간 후 NRP-1 및 IFITM-2 레벨들을 네거티브하게 조절(negatively modulating)할 수 있는 특정 siRNA들을 이용하여 감염되었다. NRP-1 및 IFITM2를 위한 siRNA들이 Santa Cruz(Santa Cruz, CA, U.S.)로부터 획득되었고 100 nM의 최종 농도에서 Transfectin(BIORAD, Carlsbad, U.S.)에 의한 감염을 위해 사용되었다. 72시간 후, 세포들이 수확되어 용해되었다. 전체 단백질들은 이후 SDS-PAGE에서 분리에 의해 분석되었고 확인된 2개의 수용체들의 레벨들은 2개의 특정 항체들에 의한 웨스턴 블로팅 및 부합화(hybridization)에 의해 분석되었다. 도 3은 양 단백질들의 구성 발현(constitutive expression)을 나타내고 siRNA들이 이들의 발현을 네거티브하게 조절할 수 있다는 것을 나타낸다. GAPDH 단백질을 마킹할 수 있는 항체는 동일한 겔 로딩 조건들을 모니터하기 위해 사용되었다.
예 5. 표면 수용체를 통한 J774 세포들에 대한 BAG3 재조합 단백질의 결합.
J774 세포들은 예 4에 기술된 것과 같이, NRP-1 또는 IFITM-2 또는 둘 다의 레벨들을 네거티브하게 조절할 수 있는 특정 siRNA들에 의해 감염되었다. NRP-1 및 IFITM2 siRNA들은 Santa Cruz(Santa Cruz, CA, U.S.)로부터 획득되었고 100 nM의 최종 농도에서 Transfectin(BIORAD, Carlsbad, U.S.)에 의한 감염을 위해 사용되었다. 48시간 후, 세포들이 거두어 들여지고, 4℃에서 30분 동안 블록킹 버퍼(blocking buffer)(PBS 1X/FBS 5%)에 의해 배양되고, FITC 분자들(10 ㎍/백만개의 세포들)에 의해 유도(derivatized)된 BAG3 재조합 단백질이 나중에 4℃에서 30분 동안 첨가되었다. 그 후, 세포들은 PBS 1X/FBS 5%에 의해 2회 세척되었고, 1200 rpm에서 10분 동안 원심 분리되었고, PBS 1X에서 다시 현탁되었고 유동 세포 분석법으로 분석되었다. 도 4는 NRP-1, 또는 IFITM-2, 또는 둘 다의 네거티브 컨트롤은 그것에 의해 세포들에 대한 BAG3 재조합 단백질의 결합에서 급격한 감소를 가져오는 것을 나타낸다. 사용된 siRNA들이 확인된 2개의 특정 수용체들 중 하나의 레벨들을 네거티브하게 조절할 수 있을 때, 그것은 결합에서 대략 75%의 감소를 가져오고; 이러한 감소는 양 단백질들이 뮤트될(muted) 때 88%까지 이동한다.
이것은 수용체 체인들 모두가 BAG3와의 결합에 참여하고, 결합을 방지하기 위해 이들 중 하나를 뮤트(mute)하기에 충분하다는 것을 입증한다.
예 6. rBAG3 -유도된 인터류킨 6의 방출을 억제하는 NRP -1 및 IFITM -2의 다운-조절.
J774 세포들은 40%의 컨플루언스에서 24-웰 플레이트들에서 시딩되었다. 24시간 후, 이들은 뮤팅의 72시간 후 lOOnM의 최종 농도에서, NRP-1, IFITM2, 또는 둘 다를 위한 siRNA들에 의해 감염되었고, rBAG3 단백질(6 ㎍/ml)은 16시간 동안 배지에 첨가되었고 100 ㎕의 배양액이 ELISA를 통한 인터류킨 6 분석을 위해 수집되었다.
rBAG3 단백질은 대식세포들을 활성화하여, 증가된 IL-6 방출을 생성한다.
BAG3-특이적 IL-6 분비물(secretion)에 대한 영향은 NRP-1- 및 IFITM-2-수용체-특이적 siRNA들에 의한 감염된 세포들에서 급격히 억제된다는 것이 도 5에서 관찰될 수 있다. *** p<O.001 VS scrb.
이것은 양 수용체 체인들은 BAG3 작용에 관여한다는 것을 확인한다.
예 7. J774 세포들의 세포 표면에 대한 rBAG3 의 결합을 방지하는 안티 -IFITM-2 항체
이후 rBAG3 단백질의 결합이 BAG3과 그것의 수용체 사이에 배치된 분자들의 사용를 통해 억제될 수 있다는 것이 입증되었다.
J774.A1 세포들은 4℃에서 30분 동안 1 million/ml의 밀도로 블록킹 용액(PBS FBS 5%)에서 다시 현탁되었다. 샘플은 이후 3개의 앨리쿼트들(aliquots)로 분할되었고 A) 30분 동안 BAG3-FTTC(5 ㎍/백만개의 세포들); B) 30분 동안 마우스 IgG(150 ㎍/백만개의 세포들) 및 추가의 30분 동안 BAG3-FITC(5 ㎍/백만개의 세포들); C) 30분 동안 ab IFITM-2(150 ㎍/백만개의 세포들)(Novus Biologicals) 및 추가의 30분 동안 BAG3-FITC(0.5 ㎍/ml)에 의해 각각 배양되었다. 세포들은 이후 PBS/FBS 5%로 2회 세척되었고, 1200 rpm으로 10분 동안 원심 분리되었고, 300 ㎕ PBS에서 다시 현탁되었고, 유동 세포 분석법에 의해 분석되었다.
도 6에서 관찰될 수 있는 것과 같이, IFITM-2-특이적 단일 클론성 항체를 이용하여 BAG3과 IFITM-2 수용체 간의 상호작용의 사이트들을 점유함으로써, J774 세포들에 대한 BAG3의 결합의 매우 충분한 감소가 얻어진다.
IFITM2는 치료를 위해 특히 유용한 타겟을 구성하는 데, 그 이유는 그것이 BAG3에 대한 수용체의 구성에 들어가고 NRP-1을 포함하는 다른 수용체들의 구성에는 들어가지 않기 때문이다.
예 8. 용해 가능 BAG3 단백질의 기능 특징.
J774 세포들은 60% 컨플루언스에 플레이팅되었고 10, 30, 또는 100 ng/ml의 농도들에서 재조합 단백질에 의해 24시간 동안 배양되었다. 아질산염들 생성은 그리스 시약(Griess reagent)(1% 설파닐아미드, 0.1% 나프틸 에틸렌디아민, 5% 인산)을 이용하는 배지에서 증명되었고 550 nM에서 Beckman DU-62 분광 광도계를 이용하여 측정되었다.
BAG3 재조합 단백질이 이후 혈액 셀들과 관련하여 혈청에서 방출된 단백질의 가능한 역할을 결정하기 위해 대식세포 활성화 분석들에서 사용되었다. 이를 위해, J774 쥐과 단핵구 세포주(J774 murine monocyte cell line)는 포지티브 컨트롤(positive control)로서, 리포폴리사카린(lipopolysaccharide: LPS)과 같은 향염증성 작용제(pro-inflammatory agent)를 이용하여, 상이한 농도들로 BAG3 재조합 단백질에 의해 처리되었다. 단핵구들의 활성화는 아질산염들의 분석에 의해 측정되었다. (도 7).
J774 세포들의 세포 표면에 대한 BAG3 단백질의 결합이 이후 형광단과의 재조합 단백질의 결합을 통해 확인되었다(도 8). BAG3 재조합 단백질은 이후 SIGMA(FluoroTag Conjugation FITC kit)를 이용하여 FITC에 결합되었다. BSA-FITC(네거티브 컨트롤) 및 rBAG3-FITC의 동일 양들이 1시간 동안 배지에 첨가되었다. 세포들은 이후 3.7% 포름알데히드 용액에 의해 응고되었고 Zeiss LSM 공초점 현미경에 의해 분석되었다.
예 9. 스트레스에 의해 또는 대식세포들의 표면에 특히 결합하는 췌장의 종양 세포들에 의해 유도되는 심장 미오사이트들에 의해 분비되는 BAG3.
플루오레세인이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate: FITC)에 결합된 BAG3 재조합 단백질을 이용하여, BAG3 단백질이 대식세포들의 표면과 결합하고 심장 근육 세포들(HCM) 또는 췌장 선암종 세포들(PANC-1)에는 결합하지 않는다는 것이 증명되었다. (도 9).
공초점 형광 현미경 분석(Confocal fluorescence microscopy analysis)은 PANC-1 세포들 및 HCM, J774 Al에 대한 rBAG3-FITC의 결합을 측정하기 위해 수행되었다. BAG3 재조합 단백질 및 BSA(bovine serum albumin)(SIGMA)는 제조업자의 인스트럭션에 따라 SIGMA(FluoroTag Conjugation FITC kit)를 이용하여 FITC에 결합되었다. rBAG3-FITC 및 BSA-FITC의 동일한 양들이 1시간 동안 0.1% NaN3이 존재할 3개의 세포주들에 첨가되었다. β-인테그린 단백질(β-integrin protein)이 포지티브 컨트롤로서 사용되었다. 형광은 Zeiss LSM 공초점 현미경을 이용하여 분석되었다.
예 10. FITC - BAG3 은 J774 세포주의 대식세포들을 결합한다.
J774 Al 세포들(lx106 cells/ml)은 상이한 농도들의 BAG3 FITC 단백질(7, 14, 및 70 nm)에 의해 배양되었다. FITC-BSA(70 nM)는 네거티브 컨트롤(회색)로서 사용되었다. 형광은 유동 세포 분석법에 의해 분석되었다. (도 10).
대식세포들에 BAG3 결합은 특히 BAG3-특이적 펩타이드들 또는 BAG3-특이적 F (ab ')2 항체들에 의해 억제될 수 있다(표 2). 특히, J774 세포들은 14 nM FITC-BAG3 단백질에 의해 및 625 nM BAG3-특이적 펩타이드들(펩타이드 1, 펩타이드 2, 펩타이드 3, 펩타이드 4, 또는 스크램블된 펩타이드)에 의해 또는 420 nM의 안티-BAG3 F(ab ') 항체들(쥐의 단일 클론성 항체들 AC1, AC2 및 토끼 TOS2에서 생성되는 다클론성 항체)에 의해 배양되었다. 토끼 또는 마우스 IgG의 분절들 F (ab ') 2가 네거티브 컨트롤로서 사용되었다.
표 2
Figure pct00001
예 11. iNOS 및 COX-2 발현에 대한 rBAG3 의 효과.
대식세포들에 대한 BAG3의 결합의 기능적 결과를 탐구하기 위해, 우리는 세포들에서 유도 가능한 일산화 질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 시클로-옥시게나제-2(cyclo-oxygenase-2: COX-2)에 대한 rBAG3 발현 효과를 시험했다. 80% 컨플루언스에서의 J774 세포들은 20시간 동안 조절 배양액, BSA, LPS 또는 rBAG3에 의해 배양되었다. 폴리믹신(Polymyxin)이 BAG3 재조합 단백질의 정제 후 여전히 존재하는 균체내 독소들(endotoxins)의 비특이적 효과들의 존재를 증명하기 위해 첨가되었다. COX-2 및 iNOS가 웨스턴 블로팅에 의해 세포 용해물들에서 분석되었다.
예 12. rBAG3 에 의해 배양된 J774 Al 대식세포들에 의한 아질산염 방출의 분석.
80% 컨플루언스에서의 J774 Al 세포들은 24시간 동안 조절 배양액, BSA, LPS, 또는 rBAG3에 의해 배양되었다. 각각의 샘플로부터의 100 pl 상청액이 100 pl 그리스 시약에 의해 배양되었고; 550 nm에서의 광학 밀도(OD550)는 Beckman DU62 분광 광도계에 의해 측정되었다. 아질산염 농도는 550 nm에서의 샘플의 OD와 표준 아질산 나트륨 곡선의 것을 비교하여 평가되었다(도 12).
예 13. rBAG3 에 의해 배양된 J774 Al 대식세포들에 의한 IL-6 방출의 분석.
80% 컨플루언스에서의 J774A.1 세포들은 5시간 동안 조절 배양액, BSA, LPS, 또는 BAG3에 의해 배양되었다. IL-6은 ELISA 시험을 이용하여 세포 배지에서 측정되었다. IL-6 농도는 샘플의 OD들과 표준 IL-6 재조합 곡선을 비교하여 평가되었다(도 13).

Claims (14)

  1. 약제로서 사용하기 위한 BAG3 수용체-결합 분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 수용체는 대식세포의 표면 위에서 발현되는 것을 특징으로 하는, BAG3 수용체-결합 분자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 분자는 IFITM-2 단백질, NRP-1 단백질 또는 둘 다에, 바람직하게는 IFITM-2 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는, BAG3 수용체-결합 분자.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 분자는 IFITM-2 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는, BAG3 수용체-결합 분자.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분자는 VEGF 패밀리 단백질이 아닌 것을 특징으로 하는, BAG3 수용체-결합 분자.
  6. 종양 질환, 염증 질환, 심혈관 질환, 면역 및/또는 퇴행성 질환의 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 BAG3 수용체-결합 분자.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 종양 질환은 췌장암인 것을 특징으로 하는, BAG3 수용체-결합 분자.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    저분자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 및/또는 그것의 분절로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 BAG3 수용체-결합 분자.
  9. 제 8 항에 있어서,
    다클론성 항체, 단일클론성 항체, 마우스 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 결합 항체, scFv 분절(디아바디, 트리아바디 및 테트라바디), Fab 분절 또는 F (ab ') 2 분절로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 BAG3 수용체-결합 분자.
  10. 제 9 항에 있어서,
    BAG3-수용체에 대한 특이 항체, 바람직하게는 안티-IFITM-2 항체 또는 안티-NRP-1 항체, 더욱 바람직하게는 안티-IFITM-2 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, BAG3 수용체-결합 분자.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료의 의도된 수용자(recipient)는 인간인 것을 특징으로 하는, BAG3 수용체-결합 분자.
  12. 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 적어도 하나의 BAG3 수용체-결합 분자를 포함하는, 약학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    동시, 별개 또는 순차적 사용을 위한 복합 제제(combined preparation)로서, 적어도 하나의 BAG3 수용체-결합 분자 및 적어도 하나의 안티-BAG3 항체를 포함하는, 약학적 조성물.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    경구, 비경구 또는 국소 투여에 적합한 형태로 조제되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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