KR20180030898A - Gdf15의 활성 감소용 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GDF15의 활성 감소용 제제에 관한 것이며, 특히 GDF15의 상승된 또는 원치않는 수준과 관련된 병태를 치료 또는 예방하기 위한 상기 제제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 GDF15가 수용체 CLPTM1 및 QRFPR에 결합한다는 발견에 기반되고 수용체에 결합할 수 있는 그리고 GDF15와 수용체 사이 상호작용을 억제시킬 수 있는 결합제의 형태로의 상기 용도를 위한 제제를 제공한다. 추가로, 제제는 GDF15에 결합할 수 있고 수용체와의 이의 상호작용을 억제시킬 수 있는 수용체로부터 유래된 폴리펩타이드를 포함한다. 이들의 상호작용 또는 효과 검출에 기반된 진단 방법, 및 CLPTM1의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖도록 변형된 세포독성 면역 세포가 또한 제공된다.

Description

GDF15의 활성 감소용 제제

본 발명은, 대상체에서 사용되어 이로써 바디에서 증가된, 과도한 또는 원치않는 GDF15 수준 및/또는 활성과 관련된 병태와 싸울 수 있는 (즉 치료 또는 예방할 수 있는) 치료제를 포함하는, GDF15의 활성 감소용 제제에 관한 것이다. 본 발명은 바디에서 GDF15에 대하여 2 상이한 수용체의 발견에 기반되고 따라서, 신규한 GDF15-수용체의 이러한 확인에 기반되며, 본 발명은 더 구체적으로, 이의 수용체에 결합으로부터 GDF15 예방 및/또는 달리 수용체의 한쪽 또는 양쪽에서 GDF15의 효과 (즉 GDF15의 결합의 효과) 억제에 사용하기 위한, GDF15 수용체를 결합시키는, GDF15, 및 항체, 또는 다른 친화도 결합 시약에 수용체의 단편을 제공한다.

대식세포 억제성 사이토카인 1 (MIC1)로서 또한 공지된, 성장 및 분화 인자 15 (GDF15)는 TGF-β 상과의 구성원이고, TGF-β 상과의 다른 구성원과 상대적으로 낮은 (24%) 서열 상동성을 갖는다. GDF15의 상승된 수준은 암, 신경성 식욕부진, 골다공증, 신장 장애, 폐 동맥 고혈압, 및 심혈관 질환에, 그리고 또한 악액질에 그리고 더욱 일반적으로 식욕의 상실 또는 억제에 연루되어 있다. GDF15는 임의의 원인에 의한 사망률에 대하여 마커이다.

GDF15는 하기에서 과발현된다는 것이 또한 밝혀졌다: 겸상 세포 질환, 철분 과부하 장애 예컨대 선천성 구상적혈구증, 선천성 적혈구생성이상 빈혈 1형 (Tamary et al. 2008. Blood 112, 5241-5244) 및 2형, 지중해빈혈 (Tanno et al. 2007. Nat Med 13, 1096-1101), 윤상철아구를 동반한 난치성 빈혈 (RARS) (Ramirez et al. 2009. Br J Haematol 144, 251-262), 및 피루베이트 키나제 결핍 (Finkenstedt et al. 2009. Br J Haematol. 144, 789-793).

GDF15가 1997년에 최초로 클로닝된 동안, GDF15의 수용체(들)은 지금까지 달성하기 힘들게 남아있다.

GDF15는 종양 병리학에서 이중 역할을 갖는다: 리간드는 초기 종양에서 세포자멸사를 유도하지만, 전립선, 유방, 위 (Kim et al., 2008. Carcinogenesis 29, 704-712), 결장직장 암, 및 교모세포종 (Albertoni et al., 2002. Oncogene 21, 4212-4219)를 포함하는, 말기 단계 암에서 다량으로 분비된다. 말기 단계 질환에서, GDF15는 종양 전이에 기여하고 전이성 전립선 암에서 골 참여에 대하여 가장 중요한 바이오마커이다 (Selander et al., 2007. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16, 532-537; Wakchoure et al., 2009. Prostate 69, 652-661).

문헌에서 증거는 전립선 암 세포 침윤 골의 하위집단에서 현저하게 상승된 수준과 함께, 전이의 부위에 좌우되는 GDF15 발현의 상향조절을 기재한다. GDF15는 양쪽 파골세포 및 골아세포에 영향을 주는 것으로 또한 공지된다 (Wakchoure et al. 2009. Prostate 69, 652-661).

GDF 15는 또한 악액질, 만성 병으로 인한 바디의 소모에서 역할을 갖고, 특히 말기 단계 암에서 악액질 및 식욕 상실에 연루되어 있다. 식욕 자극제는 말기 단계 암을 가진 환자에서 식욕 상실을 보상하는데 통상적으로 사용되지만, 아직까지 GDF15의 분자 기전을 표적하는데 임상적으로 이용가능한 제제는 현재 없다. 따라서, 종양-유도된 악액질은 반전시키기 어렵다. 최근 추정은 암에서 치명적 결과의 최대 25%가 악액질때문일 수 있다는 것을 보여준다.

GDF15는 시상하부 회로상의 작용에 의한 중추신경 시스템 기전을 통해 악액질에서 이의 효과를 발휘한다고 여겨진다. GDF15의 전신 투여는 시상하부의 궁상 핵에서, 핵심 식욕-자극 펩타이드인, NPY의 발현에서 감소, 그리고 식욕 α-MSH의 억제제의 전구체인, POMC의 발현에서 증가를 일으키는 것으로 밝혀졌다. 궁상 핵은 섭식 행동을 조절하고, 혈액-뇌 장벽 (BBB)이 전신 인자에 허용되는, 최후야에 인접하게 위치한다. 따라서, GDF15의 상승된 수준은 식욕의 억제와 관련된 것으로 밝혀졌다. 추가적으로, 진전된 전립선 암을 가진 환자에서 체중 감소의 정도는 6-개월 기간 동안 GDF15의 혈청 수준과 상관관계가 있지만 악액질에서 연루된 다른 인자, 예컨대 TNF-a,IL-6 또는 IL-8의 혈청 수준은 아니다.

US 2009/000481에서 Breit은, GDF15이 과발현되는 암 또는 다른 병태와 관련된 감소된 식욕 및/또는 체중 감소 치료를 위하여 항-GDF15 항체 또는 이들의 단편을 포함하는, 식욕 또는 체중 조절의 수단으로서 바디에서 GDF15의 양 또는 활성을 증가 또는 감소시키는 GDF15 (MIC-1) 조절제의 용도를 제안한다. GDF15의 이들, 및 다른, 생리적 및 병리적 역할이 지금까지 설명되어 있는 동안, 이러한 생리적으로 중요한 단백질에 대하여 수용체 (또는 수용체들)의 동일성은 달성하기 힘들게 남아있다. 본 발명자들은 탠덤 친화도 정제 (TAP) 검정을 이용하여 GDF15에 대하여 2개의 별도의 및 구조적으로 관련없는 수용체를 확인하였고, 이들 발견에 기반하여, GFD15 효과 감소용 신규한 치료제를 제안한다.

2 GDF15 수용체는 본원에서 확인되어 있다: 피로글루타밀화된 RF아미드 펩타이드 수용체 (QRFPR) 및 구순열 및 입천장 막관통 단백질 1 (CLPTM1).

식욕유발 뉴로펩타이드 QRFP 수용체 또는 G-단백질 커플링된 수용체 103 (GPR103)으로서 또한 공지된, QRFPR은 N-말단 세포외 도메인 및 3 추가 세포외 도메인 (또는 루프)를 포함하는 7-막관통 G-단백질 커플링된 단백질 수용체이다. 인간 QRFPR의 아미노산 서열은 서열 번호1에서 보여진다. QRFPR의 국소해부학의 인실리코 예측은 QRFPR (ECD1)의 세포외 N-말단 도메인이 잔기 1-46 (서열 번호 3)을 포함하고; 세포외 도메인 2 (ECD2; 루프 1)이 잔기 103-120 (서열 번호 4)를 포함하고; 세포외 도메인 3 (ECD3; 루프 2)가 잔기 184-212(서열 번호5)를 포함하고; 세포외 도메인 4 (ECD 4; 루프 3)이 잔기 293-311(서열 번호 12)를 포함한다는 것을 시사한다. QRFPR은 시상하부의 궁상 핵에서 고도로 발현되는 식욕유발, 또는 식욕 자극, 수용체이다 (Bruzzone et al., 2007. J Comp Neurol 503, 573-591; Ukena et al. 2013. Gen Comp Endocrinol 190, 42-46). QRFPR에 리간드 RF아미드 43의 결합은 식욕-자극 펩타이드 NPY의 발현을 유도하고, 섭식 행동을 자극하고 혈압을 조절하는, POMC 발현 (식욕 억제제)를 억제시킨다 (Takayasu et al., 2006. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 7438-7443). RF아민 43 및 GDF15는 따라서 NPY 및 POMC의 발현에서 그리고 따라서 식욕의 조절에서 반대 역할을 한다. GDF15가, 내인성 효능적 리간드의 효과를 길항하는, 상기 수용체에서 길항제로서 작용할 수 있는 본 발명에 근거를 이루는, 아래 더 상세히 보고된, 발견은 감소된 식욕/악액질과 증가된 GDF15 수준의 공지된 회합과 따라서 일치한다.

우리는 GDF15 및 QRFPR의 상호작용이 섭식 행동의 음성 조절에 관한 연루로 QRFPR의 식욕-자극 기능을 방해한다는 것을 제안한다. 이것은 그 다음, GDF15 및 QRFPR의 상호작용을 방해하는 제제가 식욕 억제 및/또는 체중 감소, 예컨대 악액질과 관련된 병태를 치료 또는 예방하기 위해 치료적으로 사용될 수 있는, 본 발명에 근거를 이루는 제안으로 이어진다.

식욕 조절에 더하여, QRFPR 수용체는 골 형성 (Baribault et al., 2006. Mol Cell Biol 26, 709-717)을 조절한다. QRFPR 녹아웃 마우스는 야위고 골량에서 손실을 표시한다. 또한, 파골세포의 수는 감소된다. QRFPR은, 특히 골아세포를 포함하는, 골의 세포에서 발현되는 것으로 공지되고 우리는 QRFPR이 수많은 상이한 기본적인 골 암, 및 2차 골 미세전이 양쪽에서 상향조절되는 것을 보여주었다. 따라서, 우리는 이제 추가로 GDF15와 QRFPR 사이 상호작용이 기본적인 골 암, 및 골에 다른 암 (예를 들면 전립선 암)의 전이 둘 모두를 포함하는, 골의 장애에서, 또는 골을 연루시키는 장애에서 중요할 수 있다는 것 그리고 상기 상호작용에서 방해하는 제제가 상기 병태를 치료 또는 예방하기 위해 신규한 치료 양식을 나타낸다는 것을 제안한다.

본 발명으로 이어지는 작업에서 우리는 GDF15가 QRFPR에 결합할 수 있고 이중 기전에 의해 세포 표면에서 이의 발현 수준에서의 감소를 일으킬 수 있다는 것을 보여주었다. GDF15는 프로테아좀에 의해 수용체 내재화 및 열화를 유도하고, 또한 QRFPR 양성 엑소좀의 분비에 의해 세포 표면으로부터 수용체의 발산을 유도한다. 이론에 의한 구속됨 없이, GDF15와 QRFPR 사이 상호작용이 세포 표면에서 이용가능한 QRFPR의 수준 하향-조절을 통해 QRFPR의 활성을 방해한다고 생각된다. GDF15와 QRFPR 사이 상호작용 차단은 따라서 GDF15의 상승된 수준과 관련된 병리학, 예컨대 상기 논의된 것에 대하여 가능한 치료로서 제안된다.

GDF15에 대하여 확인된 제2 수용체는 CLPTM1이다 (인간내 상기 수용체의 아미노산 서열은 서열 번호2에서 보여진다). CLPTM1은 ~350 아미노산 세포외 도메인을 가진 막관통 단백질이다 (인간 CLPTM1의 ECD의 아미노산 서열은 서열 번호14에서 보여지고 (서열 번호:1의 아미노산 2-354를 나타내는) 353 아미노산을 갖는다). CLPTM1은 흔치않은 발현 패턴을 갖고, 예를 들면, 면역 시스템의 세포에서 발현된다. 특히, CLPTM1은 자연 살해 세포 (NK-세포) 및 대식세포에서 발현되는 것으로 공지되고, 우리는 추가로 면역 시스템의 다른 세포, 예컨대 림프구의 다양한 부류, 특히 T-림프구의 다양한 부류에 의해 발현될 수 있고; CD3-CD45+ 비-T-세포의 특정한 서브셋이 할 수 있는 바와 같이, CD4+, CD8+ T-세포의 특정한 하위-세트가 CLPTM1을 발현시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서, CLPTM1은 다양한 면역 세포에 의해 발현될 수 있다.

QRFPR과 달리, CLPTM1에 결합하는 GDF15는 세포 표면으로부터 수용체의 손실을 초래하지 않는다. 오히려, GDF15에 의한 NK-92 세포의 자극은 CLPTM1로 TGFbRI (ALK5) 및 TGFbRII의 공-국재화를 유도하기 위해 본 발명에 근거를 이루는 작업에서 밝혀졌고, GSK3b의 인산화를 초래한다. GDF15는 이전에 GSK3 인산화와 관련되어 왔고, 인산화된 (9/21) GSK3B는 선천성 면역 시스템의 세포의 감소된 활성화 및 세포독성과 관련된다. CLPTM1이 GDF15으로 자극시 TGBb 수용체 복합체와 회합한다는 관찰은 따라서 GDF15가 NK 세포 세포독성을 어떻게 감소시키는지를 설명한다. 이것은, 다양한 면역 세포 상에서 발현될 수 있는, 특히 CLPTM1을 포함하는, 이의 수용체와 GDF15의 상호작용 억제에 의해, GDF15의 면역억제 효과가 감소될 수 있다는 제안을 지지한다.

정상 생리학에서, GDF15의 높은 수준은 태반 세포에 의해 분비된다. 우리는 GDF15가 태반에서의 면역 조절, 태반 세포에 대한 면역 반응의 다운-조절 및 면역 공격으로부터 태반의 보호에서 생리적 역할을 할 수 있다고 믿는다. 양쪽 대식세포 및 자연 살해 세포 (NK-세포)는 태반의 "외래" 세포에 대한 심각한 위협을 제기하고 국소적으로 억제되어야 한다. GDF15는, 세포의 부근에서 잠재적 GDF15의 풀을 창출하는, 그것을 분비시키는 세포의 세포외 매트릭스의 성분과 회합할 수 있다고 여겨지는, 프로-펩타이드 프로-GDF15를 포함하는 미가공된 형태로 분비될 수 있다. 우리는 태반의 세포의 표면에서 GDF15의 높은 국소 농도가 대식세포 및 NK-세포 그리고 잠재적으로 다른 GDF15 반응성 면역 세포 모두의 활성을 감소시키는 잠재력을 갖는다는 것을 제안한다. 중요하게는, 우리는 추가로 GDF15가 암에 의한 면역 회피에서 유사한 역할을 할 수 있다고 믿는다. 다수의 종양은, 태반에서와 유사한 방식으로, 전이의 부위에서 그리고 종양 기질에서 GDF15의 국소 농도를 효과적으로 증가시키는, GDF15를 분비한다. QRFPR 및/또는 CLPTM1 표적화에 의해 종양은 NK, 대식세포 및/또는 다른 면역 세포의 활성을 감소시킬 수 있고 이로써 세포 면역 반응으로부터 자신을 보호할 수 있다. 우리는 이제 따라서, 암의 면역 회피, 또는 암에 의해 유도된 면역 내성 억제에서, 특히 전이에서 GDF15와 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1 사이 상호작용을 억제시키는 제제에 대하여 추가 유용성, 뿐만 아니라 GDF15-유도된 면역 억제의 저해에서 더욱 일반적인 유용성을 제안한다.

특히, 우리는 QRFPR의 제3 및 제4 세포외 도메인 (ECDs) (QRFPR의 루프 2 및 루프 3) 둘 모두로부터 펩타이드가 GDF15에 결합할 수 있다는 것을 아래 실시예에서 보여준다. 우리는 따라서 QRFPR내 GDF15 결합 부위가, 내인성 효능적 리간드용 결합 부위와 상이하다고 여겨지는, 양쪽 ECD3 (서열 번호5) 및 ECD4 (서열 번호 12)에 위치한다는 것을 제안한다. 이들 단백질 루프 각각은 ~20 아미노산을 포함하고, GDF15는 상기 수용체에 결합하는 경우 동시에 이들 루프의 모두에 결합한다고 생각된다. 아래 실시예에서 보고된 연구는 추가로 이들 루프의 아미노산 서열과 고도의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 펩타이드가 세포 표면으로부터 QRFPR의 GDF15-유도된 손실 예방에서 효과적이면서 또한 이의 원상태 리간드에 의해 활성화되는 QRFPR의 능력을 아끼는 것을 입증하여, 이들 펩타이드가 GDF15에 결합에 의해 GDF15-QRFPR 상호작용을 구체적으로 차단시킬 수 있다는 것을 나타낸다. QRFPR의 세포외 도메인 3 및 4 (루프 2 및 3)으로부터 유래된 펩타이드는 따라서 GDF15와 이의 수용체 사이 상호작용 차단을 위하여 유망한 잠재적인 치료제를 나타낸다. 더욱이, QRFPR의 세포외 도메인을 결합시키는 항체는 또한, 수용체 활성 영향 없이, 세포 표면으로부터 QRFPR의 GDF15-유도된 손실을 예방할 수 있는 것으로 아래 실시예에서 보여져서, 따라서 GDF15-QRFPR 상호작용 차단을 위하여 잠재적인 추가의 또는 대안적인 제제를 제공한다. 따라서, QRFPR의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 제제는 GDF15와 이의 상호작용 차단을 위하여 추가 잠재적인 치료제를 나타낸다.

CLPTM1 (서열 번호14)의 세포외 도메인의 영역을 포함하는 펩타이드는 '풀-다운' 검정에서 GDF15와 상호작용하는 것으로, 그리고 QRFPR의 영역을 포함하는 펩타이드보다 더 높은 친화도로 GDF15에 결합하는 것으로 아래 실시예에서 보여진다. CLPTM1의 세포외 도메인의 영역을 포함하는 펩타이드는 따라서 GDF15와 이의 수용체 사이 상호작용 차단을 위하여 추가 치료제를 나타낸다. 실시예는 또한 CLPTM1의 세포외 도메인에 결합하는 항체의 사전-인큐베이션이 GSK3b 인산화를 억제시킬 수 있다는 것을 입증하여, CLPTM1에 결합하는 GDF15-CLPTM1 상호작용을 구체적으로 차단하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다. CLPTM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 제제는 GDF15와 이의 상호작용 차단을 위하여 추가 잠재적인 치료제를 나타낸다.

그러므로 GDF15가, 골 발생에서, 악액질, 암 구성 및 전이, 그리고 본원에서 확인된 2 수용체를 통해 적어도 부분적으로 감소된 면역 기능을 포함하는, 이의 생리적 효과를 발휘할 수 있다는 것이 분명하다. 그러므로, 상기 지시된 의료 병태, 또는 상승된 또는 원치않는 GDF15 수준과 관련된 사실상 임의의 병태를 치료 또는 예방하기 위해, 특히 GDF15의 수준이 상승된 경우, GDF15와 이들 수용체 사이 상호작용을 차단하는 것이 바람직할 것이다. 본 발명은 이런 필요성을 다루고 따라서 GDF15와 이의 수용체 사이 상호작용, 또는 상호작용의 효과를 억제시키는 치료제의 제공에 관한 것이다.

치료제의 제1 부류는 본 명세서에서 확인된 GDF15 수용체의 리간드 결합 도메인에 기반되는 폴리펩타이드이다. 이들 폴리펩타이드는 '유인' 수용체 분자 ("유인 펩타이드")로서 작용하고, 순환에서 자유롭게 GDF15에 결합할 수 있거나, ECM 및/또는 기질에 관련되고, 수용체에 결합을 예방한다. 치료제의 제2 부류는 GDF15 수용체의 세포외 도메인에 결합하는, 그리고 이로써 수용체에 GDF15의 결합을 억제시키는 작용을 하고, 그러므로 GDF15와 이의 수용체 사이 상호작용을 차단하는, 또는 달리 수용체의 한쪽 또는 양쪽에서 GDF15의 효과를 억제시키는 결합제이다.

따라서, 제1 측면에서 본 발명은 GDF15에 결합할 수 있고 수용체-QRFPR 및/또는 CLPTM1과 이의 상호작용을 억제시킬 수 있는 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 상기 폴리펩타이드는:

(i) 서열 번호:5 (QRFPR의 세포외 도메인 3), 서열 번호:12 (QRFPR의 세포외 도메인 4) 또는 서열 번호:14 (CLPTM1의 세포외 도메인)에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열 번호:5, 12 또는 14와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나 포함하거나;

(ii) 서열 번호:5, 12 또는 14의 일부이거나 상기를 포함하고, 상기 일부는 서열 번호:5, 12 또는 14의 적어도 6 연속 아미노산을 포함하거나;

(iii) 서열 번호:5, 12 또는 14의 적어도 6 연속 아미노산에 대응하는 적어도 6 아미노산을 포함하고 서열 번호:5, 12 또는 14에서 동등 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는다.

그 자체로 청구된 본 발명의 폴리펩타이드는 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체 자체를 포함하지 않는다 (더욱 특히 임의의 원상태 또는 야생형 전장 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체는 임의의 종으로부터 제외된다). 따라서, 폴리펩타이드는 서열 번호:1 또는 2로 구성되는, 또는 상기를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 번호:1 또는 2의 동족체 또는 오쏘로그인 전장 (즉 온전한 또는 전체) 원상태 또는 야생형 QRFPR 또는 CLPTM1, 즉 임의의 다른 종으로부터 수용체를 나타내는 아미노산 서열로 구성되는 또는 상기를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하지도 않는다. 따라서, 그 자체로 청구된 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호:287 또는 서열 번호:288로 구성되지 않거나 상기를 포함하지 않는다. 아래 논의된 바와 같이, 특정한 구현예에서, 그 자체로 청구된 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호: 번호:243-249 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드가 아니다.

이와 관련하여 서열 번호: 243-245는, WO 01/87930의 서열 번호: 2, 4 및 5로서 개시된 경우 개별 세포외 도메인보다 더 큰, QRFPR 수용체의 단편을 나타낸다 (즉 이들은 QRFPR의 ECD3 또는 ECD4를 포함하는 수용체 단편을 나타낸다). 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 QRFPR의 ECD3 또는 ECD4보다 더 큰 또는 CLPTM1의 ECD보다 더 큰 수용체 단편을 포함하지 않는다 (아래 추가로 논의된 바와 같이, CLPTM1의 ECD는, 예를 들면 서열 번호: 2 또는 서열 번호:315에서 나타낸 바와 같이, N-말단 메티오닌을 포함할 수 있거나 아닐 수 있다). WO 01/87930은 QRFPR에 대응하기 위해 적어도 일 구현예에서 나타나는 수용체 일명 "갈라닌-유사 GCPR (G-단백질 커플링된 수용체)"에 관한 것으로 - 상기 문헌은 수용체에 갈라닌의 결합의 조절에 집중되고 GDF15와 수용체의 임의의 상호작용은 개시하지 않는다. 서열 번호: 246-249는 WO 2005/124342에서 확인된 2 상이한 GPR103 수용체 서열 (QRFPR은 GPR103으로서 또한 공지된다)의 단편, 또는 상기로부터 유래된 폴리펩타이드이고 WO 2005/124342의 서열 번호: 409, 411, 422 및 426 각각에 대응한다. 본원의 서열 번호; 287 및 288은 WO 2005/124342에서 서열 번호: 106 및 107 각각으로서 확인된 GPR103 수용체 서열에 대응한다. 상기 문헌은, 많은 다른 것들 중에, 연골세포내 연골 합성을 유도하는 화합물을 확인하기 위한 스크린에서, 수용체 서열 이용에 관한 것이다. GDF15와 GPR103/QRFPR의 임의의 상호작용의 개시내용은 상기 문헌에서 없다. 그러므로 전체 또는 완전한 세포외 도메인, 및 QRFPR의 세포외 도메인 3 및 4 (ECD3 또는 4)의 또는 CLPTM1의 ECD의 단편, 또는 일부 뿐만 아니라, 폴리펩타이드가 QRFPR의 ECD3 또는 4 혹은 CLPTM1의 ECD, 또는 이의 일부에 기반되거나, 상기로부터 유래되는, 그러나 예를 들면 1종 이상의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 원상태 분자의 서열에 관하여 변형되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있거나 상기를 포함할 수 있다는 것이 보여질 것이다. 따라서 ECD 또는 이의 일부의 원상태 서열에 관하여 변이체 또는 변형된 서열을 가질 수 있는 기능적으로 동등한 분자는 포함된다. 기능적으로 동등한 이라는 것은 폴리펩타이드가 GDF15에 결합하는 능력을 보유하고 수용체와 이의 상호작용을 억제시키는 것을 의미한다.

특히, 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 6 아미노산을 포함할 수 있고 서열 번호: 5, 12 또는 14 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 일부로 구성될 수 있거나 상기를 포함할 수 있고, 상기 일부는 서열 번호: 5, 12 또는 14 중 어느 하나, 또는 상기 일부와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 일부, 또는 적어도 6 연속 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 서열 번호: 5, 12 또는 14 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 일부는 적어도 6 연속 아미노산을 포함하고 서열 번호: 5, 12 또는 14에 관하여 적어도 2 연속 또는 비-연속 아미노산의 결실을 포함한다. 유사하게, 서열 번호: 5, 12 또는 14 중 어느 하나와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 일부인 폴리펩타이드는 서열 번호: 5, 12 또는 14에 대응하는 기능적으로 동등한 변이체 서열에 관하여 적어도 2 연속 또는 비-연속 아미노산의 결실 및 적어도 6 연속 아미노산을 포함할 수 있다.

따라서 서열 번호: 5, 12 또는 14의 일부는, 아래 추가로 기재된 바와 같이 확인될 수 있고, 본 발명에 따라 폴리펩타이드로서 또는 상기에서 사용될 수 있거나, 본 발명의 폴리펩타이드는, 예를 들어 아래 확인된 바와 같이 임의의 상기 일부와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다.

서열 번호:5, 12 또는 14 중 어느 하나의 일부를 나타내는, 대표적인 또는 예시적인 서열은 아래 열거되고, 예를 들어 서열 번호:6 내지 9 및 11 (서열 번호 5; QRFPR의 ECD3), 서열 번호 13 (서열 번호 12의 C-말단 일부; QRFPR의 ECD4) 및 서열 번호:15 내지 18 (서열 번호 14의 일부, CLPTM1의 ECD)를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호:5, 12 또는 14의 일부를 나타내는 상기 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 추가 구현예에서 본 발명의 폴리펩타이드는, 아래 열거된 바와 같이, 예를 들어 표 1에서 또는 아래 임의의 실시예에서, 서열 번호:5, 12 또는 14의 일부를 나타내는 임의의 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다.

본 발명의 추가 측면은 요법에서 사용하기 위한 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1에 결합할 수 있는 결합제를 제공하고, 여기서 상기 결합제는 GDF15와 상기 수용체 사이 상호작용을 억제시킬 수 있다.

특히 폴리펩타이드 및/또는 결합제는 GDF15의 상승된 또는 원치않는 수준과 관련된 병태의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것이다.

상기 병태는 아래 더 상세히 기재되지만, 바람직한 특정 구현예에서 암, 악액질, 면역억제, 및 골 장애를 포함한다.

결합제는 임의의 단백질성 또는 비-단백질성 분자일 수 있지만, 아래 추가로 논의된 바와 같이, 바람직하게는 항체일 것이다.

바람직한 구현예에서, 결합제는 본 명세서에서 한정된 바와 같이 본 발명의 폴리펩타이드에 결합하지 않는다. 추가 바람직한 구현예에서 결합제는 추가적으로 또는 대안적으로 수용체에 내인성 효능적 리간드의 결합을 억제시키지 않고, 특히 여기서 상기 수용체는 QRFPR이다.

본 발명의 더욱 추가 측면은 GDF15의 상승된 또는 원치않는 수준과 관련된 병태의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위하여 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 결합제의 용도를 제공한다.

본 발명에 있어서, 적어도 1종의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께, 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 결합제를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다.

본 발명의 또 다른 추가 측면은 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 폴리펩타이드 및 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 결합제를 포함하는 키트를 제공한다.

키트의 성분은 약제학적 전달을 위하여 (즉 치료 용도를 위하여) 제공, 또는 제형화될 수 있고 따라서 폴리펩타이드 또는 결합제 및 1종 이상의 약제학적으로-허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약제학적 조성물의 제공될 수 있다. 성분은, 순차, 또는 동시를 포함하는, 분리 투여를 위하여 제형화 또는 제공될 수 있다. 키트는 GDF15의 또는 원치않는 수준과 관련된 병태의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.

따라서 본 발명의 또 다른 측면은 GDF15의 또는 원치않는 수준과 관련된 병태의 치료 또는 예방에서 분리, 순차 또는 동시 사용을 위하여 조합된 제제로서 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 폴리펩타이드 및 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 결합제를 포함하는 생성물을 제공한다.

GDF15의 상승된 또는 원치않는 수준과 관련된 병태의 치료 또는 예방의 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 결합제의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 비-의료 용도를 가질 수 있고 따라서 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 GDF15의 상호작용 억제의 비-치료 방법이 본 발명의 추가 측면을 형성한다. 그와 같은 방법은 본 발명에 따른 수용체 그리고 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및/또는 결합제와 GDF15를 포함하는 세포 또는 무세포 시스템의 접촉을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 측면에서 본 발명은 시험관내 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 GDF15의 상호작용 억제를 위하여 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 앞에 정의된 바와 같이 본 발명의 결합제의 용도를 제공한다.

용어 "폴리펩타이드"는, 예를 들면 단백질/펩타이드/폴리펩타이드 일부가 있는 한, 다른 화학기 또는 모이어티를 포함할 수 있는 임의의 단백질성 분자를 포함하는, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 분자를 포함하기 위해 본 명세서에서 광범위하게 사용된다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 6 아미노산 잔기를 포함한다.

용어 "억제하다"는 감소 뿐만 아니라 예방을 포함하고, 따라서 언급된 활성 또는 특성, 예를 들면 본 명세서에서 논의된 수용체, 또는 임의의 치료제, 생물학적 또는 생리적 효과 또는 활성의 임의의 하나 또는 모두와 GDF15의 상호작용 감소, 감축 또는 저하에서 임의의 효과를 포함한다. 따라서, 대안적으로 표현하면, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 결합제는 수용체의 임의의 하나 또는 모두와 GDF15의 상호작용을 차단할 수 있지만, 이것은 수용체 결합 및/또는 기능의 완전한 차단을 필연적으로 수반하거나 요구하지 않고, 단지 감소이다. 대표적인 예의 방식으로, 수용체에 GDF15의 결합, 및/또는 상기 결합에서 비롯한 또는 상기에 의해 유도된 또는 자극된 수용체 기능의 임의의 효과 또는 측면은 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 결합제의 부재하에 보여진 결합 및/또는 수용체 활성 또는 기능에 비교하여 20, 30, 40, 50, 60 또는 70 % 이상만큼 감소될 수 있다. 따라서, 수용체에 GDF15의 결합이 억제되든 아니든, 수용체에서 GDF15의 효과가 억제될 수 있다는 것이 보여질 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 수용체와 GDF15의 상호작용, 또는 상호작용의 효과를, 수용체에 GDF15의 결합 억제와 무관하게, 억제시킬 수 있다.

용어 "상호작용"은 수용체 중 하나 또는 모두에 GDF15의 결합, 및/또는 수용체에서 수용체 활성 또는 임의의 효과의 자극 또는 유도를 포함한다. 따라서, 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 GDF15의 상호작용 억제는, 필연적으로, 상기에서 나타낸 바와 같이, 수용체에 GDF15의 결합 억제 없이, 수용체에 GDF15의 결합의 (즉 상기로부터 비롯한) 효과 억제를 포함한다.

수용체에 GDF15의 결합은, 아래 실시예에서 기재된 바와 같이 결합 검정을 포함하는, 문헌에서 널리 기재되고 보고된 바와 같이 공지된 리간드 결합 검정을 이용하여 평가 또는 결정될 수 있다. 수용체에 관한 GDF15의 효과, 또는 더욱 특히 수용체에 GDF15 결합에 관한 본 발명의 폴리펩타이드 또는 결합제의 효과는 수용체에 본 발명의 GDF15 및/또는 폴리펩타이드 또는 결합제의 결합에서 비롯한 또는 상기에 의해 유도된 또는 자극된 임의의 효과 결정 또는 평가에 의해 평가 또는 결정될 수 있다. 따라서 예를 들어, QRFPR에 GDF15의 결합은 세포 표면으로부터 수용체의 발산 및/또는 내재화 또는 수용체를 유발시킬 수 있고 - 상기 효과는 예를 들면 엑소좀 및/또는 엑소좀내 수용체의 존재 및/또는 양 결정에 의해, 예를 들면 아래 실시예에서 기재된 바와 같이 QRFPR-양성 엑소좀 또는 엔도좀의 존재 또는 양 결정에 의해 평가 또는 결정될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 결합제는 상기 QRFPR-양성 엔도좀 또는 엑소좀에서의 감소를 유발시킬 수 있다.

수용체 활성의 임의의 다른 측면은 또한 본 발명의 폴리펩타이드 또는 결합제의 존재 또는 부재 그리고 GDF15의 존재하에 평가 또는 결정될 수 있고, 예를 들면 GDF15의 면역억제 효과의 감소는 수용체를 발현하는 면역 세포 (예를 들면 NK 세포 또는 대식세포)에 의해 나타난 세포-매개된 세포독성의 정도 또는 양 결정에 의해 평가 또는 결정될 수 있다. 대안적으로, GDF15에 의한 수용체 자극에서 비롯한 신호전달의 다른 측면, 예를 들면 GSK3b 인산화는 본 발명의 결합제 또는 폴리펩타이드의 존재 또는 부재하에 평가 및 비교될 수 있다.

용어 "치료하는"은 병태를 앓고 있는 또는 상기를 갖는 대상체의 임상 상태 또는 병태의 개선 또는 완화의 임의의 측면을 포함하기 위해 본 명세서에서 광범위하게 사용된다. 따라서, 병태의 완전한 치유는 요구되지 않고 "치료하는"은 병태의 임의의 측면, 파라미터 또는 증상의 개선을 포함한다.

유사하게, 용어 "예방하는"은 병태, 또는 병태의 개시 또는 진행 감소 또는 지연의 임의의 측면을 포함하기 위해 본 명세서에서 광범위하게 사용된다. 따라서 예방하는은 병태의 발생의 완전한 또는 절대적인 예방을 요구하지 않고 병태의 임의의 측면, 증상 또는 파라미터의 진행 또는 개시 지연 또는 둔화를 포함할 수 있다. 증상, 파라미터 또는 측면의 중증도는 감소될 수 있고/있거나 발생에 있어서 지연될 수 있다. 특정한 구현예에서, 예방하는은 암의 전이, 더욱 특히 골에 암의 전이 예방 (또는 감소)를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서 병태의 1종 이상의 증상 또는 측면의 진행 또는 발생은 발생으로부터 지연, 또는 감소 또는 사실상 예방될 수 있고, 예를 들면 만성적 병태 또는 병 (예를 들면 암, 또는 염증성 병태 예를 들면 류마티스성 관절염)을 앓고 있는 대상체에서 악액질은 발생으로부터 예방될 수 있거나 중증도에 있어서 지연 및/또는 감소될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 수용체의 세포외 도메인(들) (ECDs)에 기반하고 원상태 ECDs의 서열 변이체, 뿐만 아니라 (ECDs의 일부의 서열 변이체를 포함하는) 이들의 단편을 포함할 수 있다.

따라서, 대안적으로 한정하여, 본 발명의 폴리펩타이드는 GDF15에 결합할 수 있고 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 이의 상호작용을 억제시킬 수 있는 폴리펩타이드일 수 있고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 하기 서열을 갖거나 포함한다:

(a) X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X_{9 ;} (식 I)

여기서:

X₁은 방향족 아미노산이고;

X₂는 지방족 아미노산이고;

X₅는 염기성 아미노산이고;

X₃, X₄, X_6, X_7, X₈ 및 X₉는 독립적으로 임의의 아미노산 (서열 번호:337)일 수 있음; 또는

(b) X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀ (식 II)

여기서

X₁은 산성 아미노산, 예를 들면 D 또는 E이고;

X₂는 염기성 아미노산 예를 들면 K, R 또는 H, 바람직하게는 K 또는 R이고;

X₃은 산성 아미노산, 예를 들면 D 또는 E이고;

X₄는 방향족 아미노산, 예를 들면 F, W 또는 Y이고;

X₅는 산성 아미노산, 예를 들면 D 또는 E이고;

X₆은 산성 아미노산, 예를 들면 D 또는 E이고;

X₇은 지방족 아미노산, 예를 들면 L, V, I, A 또는 M, 바람직하게는 L, V 또는 I이고;

X₈은 A, S 또는 T이고;

X₉는 지방족 아미노산, 예를 들면 L, V, I, A 또는 M, 바람직하게는 L, V 또는 I이고;

X₁₀은 방향족 아미노산, 예를 들면 R, K 또는 H, 바람직하게는 R 또는 K (서열 번호:404)임.

방향족 아미노산은 독립적으로 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 티로신 (Y), tert.-부틸글리신, 사이클로헥실알라닌, tert .-부틸페닐알라닌, 바이페닐알라닌 및 트리 tert.-부틸트립토판으로부터 선택될 수 있다.

염기성 아미노산은 독립적으로 라이신 (K), 아르기닌 (R), 히스티딘 (H), 오르니틴 (Orn), 메틸라이신 (MeK) 및 아세틸라이신 (AcK)로부터 선택될 수 있다.

지방족 아미노산은 독립적으로 류신 (L), 이소류신 (I), 발린 (V), 알라닌 (A) 메티오닌 (M) 및 노르류신 (Nor)로부터 선택될 수 있다.

더욱 특정한 구현예에서, 식 I의 폴리펩타이드에서

X₁은 F, W 또는 Y이고;

X₂는 L, V, I, A 또는 M, 바람직하게는 L, V 또는 I이고;

X₅는 K, R 또는 H, 바람직하게는 K 또는 R (서열 번호:338)이다.

추가적으로 또는 대안적으로 식 I의 폴리펩타이드에서

X₃은 방향족 아미노산, 바람직하게는 F, W 또는 Y이고/이거나;

X₄ 는 산성 아미노산, 바람직하게는 E 또는 D (서열 번호:339-344)이다.

또한, 식 I의 폴리펩타이드에서 추가적으로 또는 대안적으로

X₆은 산성 아미노산, 바람직하게는 E 또는 D이고/이거나;

X₇은 염기성 아미노산, 바람직하게는 K, R 또는 H, 더 바람직하게는 K 또는 R (서열 번호:345-369)이다.

또한, 식 I의 폴리펩타이드에서 추가적으로 또는 대안적으로

X₈은 지방족 아미노산, 바람직하게는 L, V, I, A 또는 M, 더 바람직하게는 L, V 또는 I이고/이거나;

X₉는 임의의 아미노산, 바람직하게는 C (서열 번호:370-402)이다.

특정한 구현예에서, 식 I의 폴리펩타이드는 서열 X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉ (서열 번호:403)을 가질 수 있거나 포함할 수 있고, 여기서:

X₁은 F, W 또는 Y이고;

X₂는 L, V 또는 I이고;

X₃은 F, W 또는 Y이고;

X₄는 D 또는 E이고;

X₅는 K, R 또는 H이고;

X₆은 D 또는 E이고;

X₇은 K, R 또는 H이고;

X₈은 L, V 또는 I이고;

X₉는 C이다.

추가 구현예에서 식 I의 폴리펩타이드에서 서열 X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉는 1 내지 10 아미노산의 한면 또는 양면에서 측접될 수 있고, 바람직하게는 여기서 상기 측접하는 아미노산 서열은 α-나선 또는 β-시트를 형성할 수 있는 아미노산을 포함한다.

식 I의 폴리펩타이드의 그와 같은 대표적인 구현예에서, 잔기 X₁은 α-나선을 형성할 수 있는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열에 의해 측접되고/되거나 잔기 X₉는 β-시트를 형성할 수 있는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열에 의해 측접되고, 바람직하게는 여기서 X₉는 C에 의해 측접된다.

식 II의 특정한 구현예에서 X₁은 D 또는 E이고; X₂는 K, R 또는 H이고; X₃은 D 또는 E이고; X₄는 F, W 또는 Y이고; X₅는 D 또는 E이고; X₆은 D 또는 E이고; X₇은 L, V 또는 I이고; X₈은 A, S 또는 T이고; X₉는 L, V 또는 I이고; X₁₀은 R, K 또는 H (서열 번호:405)이다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 임의의 측면의 특정한 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열 번호:210 (FLYEK)에서 제시된 바와 같은 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 임의의 측면의 추가 구현예에서, 폴리펩타이드는 (서열 번호:1 WTS의 잔기 255-257에 대응하는) 서열 번호 211에서 제시된 바와 같은 서열인 잔기를 포함할 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 대표적인 구현예에서 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호, 5, 12 또는 14의 ECD 서열 중 어느 하나의 일부를 나타내는 또는 상기에 대응하는 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 그와 같은 서열은, 예를 들어 QRFPR의 ECD3으로부터 유래된 서열을 나타내는, 서열 번호:11, 서열 번호 7 또는 서열 번호:6, 8, 또는 9 중 어느 하나; QRFPR의 ECD4로부터 유래된 서열을 나타내는, 서열 번호 13; CLPTM1의 ECD로부터 유래된 서열을 나타내는, 서열 번호:17, 서열 번호 18, 서열 번호:15 (YISEHEH), 또는 서열 번호: 16 (LFWEQH)를 포함하는, 서열 번호 5, 12 또는 14의 아미노산 서열 중 어느 하나의 일부와 적어도 75% 서열 동일성을 가질 수 있다.

추가 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호:15 (YISEHEH)에서 제시된 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열 번호:16 (LFWEQH)에서 제시된 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 다른 대표적인 폴리펩타이드는 아래 표 1에서 제시된 아미노산 서열, 또는 임의의 상기 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는, 해당하는 경우, 임의의 상기 서열의 일부인 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있고, 여기서 상기 일부는 적어도 6 연속 아미노산을 포함한다.

서열 번호	폴리펩타이드 서열
서열 번호:20	QQLEIKYDFLYEKEHICCLEEWTSPVHQ
서열 번호:21	QQLEIKYDFLYEKEHICCLEEWTSPVH
서열 번호:22	QQLEIKYDFLYEKEHICCLEEWTSPV
서열 번호:23	QQLEIKYDFLYEKEHICCLEEWTSP
서열 번호:24	QQLEIKYDFLYEKEHICCLEEWTS
서열 번호:25	QQLEIKYDFLYEKEHICCLEEWT
서열 번호:26	QQLEIKYDFLYEKEHICCLEEW
서열 번호:27	QQLEIKYDFLYEKEHICCLEE
서열 번호:28	QQLEIKYDFLYEKEHICCLE
서열 번호:29	QQLEIKYDFLYEKEHICCL
서열 번호:30	QQLEIKYDFLYEKEHICC
서열 번호:31	QQLEIKYDFLYEKEHIC
서열 번호:32	QLEIKYDFLYEKEHICC
서열 번호:33	LEIKYDFLYEKEHICCL
서열 번호:34	EIKYDFLYEKEHICCLE
서열 번호:35	IKYDFLYEKEHICCLEE
서열 번호:36	KYDFLYEKEHICCLEEW
서열 번호:37	YDFLYEKEHICCLEEWT
서열 번호:38	DFLYEKEHICCLEEWTS
서열 번호:39	QLEIKYDFLYEKEHI
서열 번호:40	LEIKYDFLYEKEHIC
서열 번호:41	EIKYDFLYEKEHICC
서열 번호:42	IKYDFLYEKEHICCL
서열 번호:43	KYDFLYEKEHICCLE
서열 번호:44	YDFLYEKEHICCLEE
서열 번호:45	DFLYEKEHICCLEEW
서열 번호:46	QLEIKYDFLYEKEHIC
서열 번호:47	LEIKYDFLYEKEHIC
서열 번호:48	EIKYDFLYEKEHIC
서열 번호:49	IKYDFLYEKEHIC
서열 번호:50	KYDFLYEKEHIC
서열 번호:51	YDFLYEKEHIC
서열 번호:52	DFLYEKEHIC
서열 번호:53	QLEIKYDFLYEKEHICCLEEWTSPVHQK
서열 번호:54	LEIKYDFLYEKEHICCLEEWTSPVHQK
서열 번호:55	EIKYDFLYEKEHICCLEEWTSPVHQK
서열 번호:56	IKYDFLYEKEHICCLEEWTSPVHQK
서열 번호:57	KYDFLYEKEHICCLEEWTSPVHQK
서열 번호:58	YDFLYEKEHICCLEEWTSPVHQK
서열 번호:59	DFLYEKEHICCLEEWTSPVHQK
서열 번호:60	FLYEKEHICCLEEWTSPVHQK
서열 번호:61	DFLYEKEHICCLEEWTSPVHQ
서열 번호:62	YDFLYEKEHICCLEEWTSPVH
서열 번호:63	KYDFLYEKEHICCLEEWTSPV
서열 번호:64	IKYDFLYEKEHICCLEEWTSP
서열 번호:65	EIKYDFLYEKEHICCLEEWTS
서열 번호:66	LEIKYDFLYEKEHICCLEEWT
서열 번호:67	QLEIKYDFLYEKEHICCLEEW
서열 번호:68	FLYEKEHICCLEEWTSPVHQ
서열 번호:69	FLYEKEHICCLEEWTSPVH
서열 번호:70	FLYEKEHICCLEEWTSPV
서열 번호:71	FLYEKEHICCLEEWTSP
서열 번호:72	FLYEKEHICCLEEWTS
서열 번호:73	FLYEKEHICCLEEWT
서열 번호:74	FLYEKEHICCLEEW
서열 번호:75	FLYEKEHICCLEE
서열 번호:76	FLYEKEHICCLE
서열 번호:77	FLYEKEHICCL
서열 번호:78	FLYEKEHICC
서열 번호:79	MMIEYSNFEKEYDDVTIK
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본 발명은 따라서 GDF15와 이의 수용체 사이 상호작용 차단에 의해 대상체에서 GDF15의 활성, 또는 효과를 감소시킬 수 있는 치료제 (결합제 및 폴리펩타이드)를 제공한다. 그와 같은 제제는 GDF15 수용체 QRFPR 또는 CLPTM1의 세포외 도메인의 부분, 특히 가용성 부분, 또는 ECDs 또는 이들의 부분에서 기반된, 또는 상기로부터 유래된 폴리펩타이드, 및 이들 GDF15 수용체 중 하나의 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 결합제로 구성되는 군으로부터 선택된다.

QRFPR 또는 CLPTM1의 세포외 도메인의 부분과 고도의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드는 GDF15 수용체의 세포외 도메인'에 기반된' 또는 '상기로부터 유래된'다거나 '상기에 기반된' 또는 '상기로부터 유래된' 서열을 갖거나 포함한다고 할 수 있다. 그와 같은 폴리펩타이드는 따라서 ECD 또는 이의 일부에 대응하는, 그러나 서열 번호 5,12 또는 14에서 제시된 바와 같은 원상태 인간 ECD 서열에 비교된 경우, 일부 서열 변동 또는 변형을 포함하는 서열을 포함할 수 있거나 가질 수 있다. "대응하는" 서열은 따라서 서열 번호 5, 12, 또는 14의 ECD 내에 함유된 서열과 상관될 수 있거나, 상기로 정렬될 수 있지만 (즉 상기 서열의 일부와 또는 상기로), 상기 서열에 관하여 1 초과 서열 변동을 함유할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 다른 종에서 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체로부터 수득된 또는 유래된, 변이체, 또는 동족체를 포함할 수 있다. 따라서 폴리펩타이드는 다른 종, 특히 다른 포유동물 종, 예를 들면 개 또는 마우스에서 동등한 또는 대응하는 수용체의 ECDs로부터 유래될 수 있거나 상기에 기반될 수 있다.

본 발명에서 확인된 수용체 모두는 막관통 단백질이고, 따라서 본 발명의 다양한 측면의 바람직한 구현예에서 본 명세서에서 기재된 폴리펩타이드는 단백질의 세포외 도메인 또는 도메인의 세포외 일부 또는 부분을 나타내거나 포함한다. 따라서, 폴리펩타이드는 바람직하게는 전장 단백질이 아니거나, 상기를 포함하지 않고, 특히 전장 야생형 또는 원상태 수용체 단백질이 아니거나, 상기를 포함하지 않고, 예를 들면 폴리펩타이드는 서열 번호:1 또는 2에서 제시된 서열, 또는 또 다른 종, 예를 들면 마우스 또는 랫트 등으로부터 동등한 서열을 갖지 않는다 (상기로 구성되지 않는다). 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열 번호:287 또는 서열 번호:288에서 제시된 서열을 갖지 않거나, 상기를 포함하지 않는다

바람직한 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 각각의 수용체 단백질의 세포외 도메인의 일부를 형성하지 않는 수용체로부터 유래된 또는 수득된 아미노산 서열 (즉 수용체 서열에 대응하는 아미노산 서열), 즉 각각의 수용체 단백질의 막관통 및/또는 세포내 도메인을 형성하는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 구체적으로, 바람직한 구현예에서, QRFPR로부터 유래된 폴리펩타이드는 QRFPR의 세포외 도메인에 잔기 (아미노산 서열) N-말단 및/또는 C-말단, 또는 이의 일부, 및 특히 QRFPR의 ECDs 3 및/또는 4에 잔기 (아미노산 서열) N-말단 및/또는 C-말단 (즉 서열 번호:5 및 12에 의해 표시되는 서열에 N-말단 또는 C-말단인 서열 번호:1 이내 잔기/서열 또는 이의 일부)를 포함하지 않을 수 있고, CLPTM1로부터 유래된 폴리펩타이드는 CLPTM1의 세포외 도메인에 잔기 (아미노산 서열) C-말단, 또는 이의 일부 (즉 서열 번호:14에 의해 표시되는 서열에 C-말단인 서열 번호:2 이내 잔기/서열 또는 이의 일부)를 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 (QRFPR로부터 유래된 폴리펩타이드에 대하여) 서열 번호:1의 아미노산 1-183, 213-292 또는 312-431을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 (CLPTM1로부터 유래된 폴리펩타이드에 대하여) 서열 번호:2의 아미노산 355-669를 포함하지 않는다.

본 발명의 임의의 다양한 측면의 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 전체 원상태 세포외 도메인을 나타내는 아미노산 서열로 구성되지 않는다. 즉, 상기 구현예에서 폴리펩타이드는 QRFPR의 ECD3 및 ECD4, 또는 CLPTM1의 ECD로 구성되지 않는다. 따라서 하나의 상기 구현예에서 폴리펩타이드는 서열 번호: 5, 12, 또는 14 중 어느 하나의 서열로 구성되지 않는다. 다른 구현예에서 폴리펩타이드는, QRFPR 또는 CLPTM1 서열로부터 유래되지 않는, 또는 상기에 대응하지 않는 1종 이상의 추가의 아미노산 서열과 함께 전체 원상태 세포외 도메인을 포함할 수 있고, 다시 말해서 폴리펩타이드는 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체로부터 서열이 아닌, 또는 더욱 특히 원상태 수용체에서 각각의 ECDs를 측접하는, 또는 상기에 바로 인접한 1종 이상의 아미노산 서열과 함께 QRFPR의 ECD3 또는 ECD4 및/또는 CLPTM1의 ECD (또는 사실상 임의의 상기 ECD의 일부)로 구성될 수 있다. 추가의 아미노산 서열은 이런 점에서 2 이상의 아미노산을 포함할 수 있다, 상기 구현예에서 폴리펩타이드가, QRFPR의 ECD3 및/또는 ECD4 또는 이의 일부 및/또는 CLPTM1의 ECD 또는 이의 일부로부터 유래된 또는 상기에 대응하는 서열이 아닌, 원상태/야생형 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체로부터 유래된 또는 상기에 대응하는 임의의 아미노산 서열을 함유하지 않는 것이 보여질 것이다.

따라서, 상기 폴리펩타이드가 더 긴 아미노산 서열의 일부로서 ECD 또는 이의 일부를 포함하는, 특정 구현예에서, ECD 또는 이의 일부의 서열은 "비-원상태" 서열 맥락에서 포함될 수 있고; 즉 ECD 또는 이의 일부에 대응하는 아미노산 서열의 한면 또는 양면에서 측접하는 서열은 ECD 또는 이의 일부가 수득된 또는 유래된, 또는 (예를 들면 서열 번호1 (전장 QRFPR) 또는 CLPTM1 (전장 CLPTM1)에서) 대응하는 원상태 전장 수용체에서 ECD의 서열 또는 이의 일부 (예를 들면 서열 번호:5, 12 또는 14 또는 이의 일부)를 측접하는 서열이 아니다. 따라서, 특정 구현예에서, 서열 번호:5 또는 12 (에 N-말단 및/또는 C-말단)을 측접하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 연속 아미노산은 서열 번호:1로부터가 아니다. 특정 다른 구현예에서, 서열 번호:14에 (C-말단) 측접하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 연속 아미노산은 서열 번호:2로부터가 아니다. 측접하는 아미노산이 서열 번호:1내 서열 번호:5, 12, 또는 서열 번호:2내 서열 번호:14에 의해 한정된 세포외 도메인에 바로 인접한 것임이 상기에 의해 이해될 것이다.

본 발명의 임의의 다양한 측면의 더욱 추가 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 QRFPR의 ECD3 및/또는 ECD4의 일부 및/또는 CLPTM1의 ECD일 수 있거나 (즉 상기로 구성될 수 있거나) 상기를 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서 그와 같은 일부는 ECD로부터 적어도 2 연속 또는 비-연속 아미노산의 결실을 나타낼 수 있다. 따라서, 대표적인 구현예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 (연속 또는 비-연속일 수 있는) 1 초과 (즉 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상)의 결실을 가진 서열 번호:5, 12 또는 14에 대응하는, 또는 상기에 의해 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있거나 상기를 포함할 수 있다. 다시 말해서, 결실된 아미노산은 서열 번호: 5, 12 또는 14의 N-말단 및/또는 C-말단에서 발견될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 서열은 임의의 서열 번호:243-249가 아니다. 또 다른 추가 구현예에서, 폴리펩타이드 서열은 서열 번호:287 또는 서열 번호:288이 아니다.

따라서, 하나의 특정한 구현예에서 본 발명은 GDF15에 결합할 수 있고 수용체-QRFPR 및/또는 CLPTM1과 이의 상호작용을 억제시킬 수 있는 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 상기 폴리펩타이드는:

(i) 서열 번호:5 (QRFPR의 세포외 도메인 3), 서열 번호:12 (QRFPR의 세포외 도메인 4) 또는 서열 번호:14 (CLPTM1의 세포외 도메인)에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 여기서 상기 아미노산 서열은 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체에서 상기 아미노산 서열을 측접하는 아미노산 서열에 의해 한쪽 또는 양쪽 단부에서 측접되지 않거나, 서열 번호: 5, 12, 또는 14의 상기 아미노산 서열이 아니지만 서열 번호:5, 12, 또는 14와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 선택적으로 아미노산 서열은 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체에서 상기 아미노산 서열을 측접하는 아미노산 서열에 의해 한쪽 또는 양쪽 단부에 측접되지 않거나;

(ii) 서열 번호:5, 12, 또는 14의 일부이거나 상기를 포함하고, 상기 일부가 서열 번호:5, 12, 또는 14의 적어도 6 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 (i) 서열 번호:5, 12, 또는 14의 적어도 2 연속 또는 비-연속 아미노산이 결실되고/되거나 (ii) 상기 일부가 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체에서 상기 아미노산 서열을 측접하는 아미노산 서열에 의해 한쪽 또는 양쪽 단부에서 측접되지 않거나;

(iii) 서열 번호:5, 12, 또는 14의 적어도 6 연속 아미노산에 대응하는 적어도 6 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 서열 번호:5, 12, 또는 14내 동등 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖고, 여기서 (i) 서열 번호:5, 12, 또는 14의 적어도 2 연속 또는 비-연속 아미노산이 결실되고/되거나 (ii) 서열 번호:5, 12, 또는 14에 대응하는 아미노산 서열이 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체에서 상기 아미노산 서열을 측접하는 아미노산 서열에 의해 한쪽 또는 양쪽 단부에서 측접되지 않는다.

상기 언급된 바와 같이, QRFPR의 세포외 도메인 3 및 4로부터 유래된 서열을 포함하는 펩타이드는 시험관내 GDF15와 상호작용하는 것으로 밝혀졌고, 상기 펩타이드가 GDF15에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, QRFPR 및 GDF15의 상호작용을 차단할 수 있다는 것을 나타내는 데이터는 아래 실시예에서 제공된다.

상기 식 I 또는 식 II에서 제시된 바와 같은 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드는 QRFPR 각각의 ECD3 및 ECD4로부터 유래된 또는 상기에 기반된 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, GDF15는 동시에 QRFPR의 양쪽 세포외 도메인 3 및 4에 결합하는 것으로 밝혀졌다. GDF15에 대하여 QRFPR에서 결합 부위는 따라서 QRFPR의 양쪽 세포외 도메인 3 및 4의 부분을 포함한다고 생각된다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는, 서열 번호 5, 6 내지 9, 또는 11 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 제1 서열, 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호:12 또는 13에서 제시된 바와 같은 제2 서열 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, QRFPR의 양쪽 세포외 도메인 3 및 4로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 추가 특정한 구현예에서 상기 제1 및 제2 서열은 링커에 의해 분리된다. 이들은 어느 한 순서로 존재할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열 번호:178 또는 179에서 제시된 바와 같은 제1 서열, 및 서열 번호:12에서 제시된 바와 같은 제2 서열을 포함할 수 있다.

GDF15는 QRFPR을 함유하는 엑소좀의 발산 유도에 의해, 또는 QRFPR의 내재화 유도에 의해 세포 표면에서 QRFPR의 발현을 하향-조절하는 작용을 한다. 그러나, QRFPR은 효능적 효과를 갖고 QRFPR을 통해 신호전달을 유도하는 다른 리간드 (예를 들어 P518 및 RF-아미드 43)을 갖는다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, QRFPR의 세포외 도메인으로부터 유래된 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드는 QRFPR 효능제에 결합하지 않을 것이고, QRFPR을 통한 신호전달을 활성화하기 위해 QRFPR 효능제의 능력을 감소시키지 않을 것이다.

CLPTM1의 세포외 도메인으로부터 유래된 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 또한 GDF15와 상호작용하는 것으로 밝혀졌고, GDF15와 이의 수용체 사이 상호작용을 차단하는데 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서 그와 같은 폴리펩타이드는 서열 번호17 또는 18에서 제시된 바와 같은 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. QRFPR과 유사하게, 수용체 CLPTM1이 GDF15에 대하여 2 결합 부위를 포함할 수 있다는 것, 즉 GDF15가 CLPTM1 수용체, 또는 더욱 특히 이들의 ECD 내에 적어도 2 접점을 가질 수 있다고 여겨진다. 특히, 우리는 현재, 아래 실시예에서 보고된 우리의 연구에 기반하여, GDF15에 대하여 2 결합 부위, 또는 접점이, 서열 번호 14의 아미노산 108 내지 138 (인간 CLPTM1의 ECD)를 나타내는, 서열 번호17에 위치할 수 있다는 것을 믿는다. 이들은, 이들 결합 부위의 일부를 나타내거나 포함하거나 구성하는, 서열 번호:15 (YISEHEH) 및 16 (LFWEQH)로서 제공된다. 본 발명의 대표적인 폴리펩타이드는 이들 서열의 한쪽 또는 모두에 대응하는, 또는 상기에 기반된 또는 상기로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 모든 결합 부위를 포함하는 대표적인 폴리펩타이드는 서열 번호 18 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함한다. 본 발명의 대표적인 폴리펩타이드는 또한, 하나의 추정 결합 부위를 포함하는, 서열 번호:14의 아미노산 123 내지 138을 나타내는, 서열 번호:18에서 제시된 바와 같은 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.

추가 실험은 GDF15가 CLPTM1에서 다른 또는 추가의 결합 부위를 가질 수 있다는 것을 제안하였다 (참조 예를 들면 실시예 19). 따라서, 1종의 상기 추가의 결합 부위는 서열 번호:200 (YFNDYWNLQ)에 의해 표시될 수 있거나 상기를 포함할 수 있다. 본 발명의 대표적인 폴리펩타이드는 상기 서열에 대응하는, 또는 상기에 기반된 또는 상기로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 대표적인 폴리펩타이드는 따라서 서열 번호 200, 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함하고, 예를 들어 폴리펩타이드는 서열 번호; 201 내지 209 중 어느 하나, 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다.

일 구현예에서, CLPTM1로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드는 CLPTM1에 내인성 리간드의 결합을 억제시키지 않고/않거나, 내인성 리간드에 의한 수용체 활성화 또는 자극을 억제시키지 않는다. 그러나, 다른 구현예에서 결합 및/또는 내인성 리간드에 의한 수용체 활성화 또는 자극이 바람직하거나 유리할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 폴리펩타이드는, 본 명세서에서 기재된 임의의 상기 서열을 포함하는, CLPTM1로부터 수득된 또는 유래된 아미노산 서열 및 본 명세서에서 기재된 임의의 상기 서열을 포함하는, QRFPR로부터 수득된 또는 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명이 상이한 수용체, 및/또는 상이한 ECDs로부터 수득 또는 유래될 수 있고 상이한 크기를 가질 수 있는 그리고 GDF15에 대하여 1종 이상의 결합 부위를 함유할 수 있는 일정 범위의 상이한 폴리펩타이드를 제공하는 것이 보여질 것이다. 따라서 상이한 폴리펩타이드의 레퍼토리, 또는 패널, 또는 라이브러리, 또는 세트는 제공될 수 있다. 상이한 폴리펩타이드는 GDF15에 대하여 이의 친화도에서 상이할 수 있고, 예를 들면 GDF15에 대하여 차이가 나는 결합 활성을 제공하기 위해 선택에 따라 사용될 수 있다. 이들은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 상이한 폴리펩타이드는 요법을 확장되게, 또는 계속되게 할 수 있고, 예를 들어 치료받고 있는 대상체가 특정한 폴리펩타이드에 면역 반응을 발생시키면, 또 다른 것은 사용하기 위하여 선택될 수 있다. 폴리펩타이드는 더 큰 치료 효과를 제공하기 위해 조합으로 사용될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 최소의 6 아미노산을 포함한다. 그러나, 더 긴 폴리펩타이드는 유익하게는 더 높은 친화도로 GDF15에 결합할 수 있고, 따라서 폴리펩타이드는 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19 이상 아미노산을 포함할 수 있거나 포함한다.

예를 들어, QRFRPR (서열 번호 5)의 ECD3으로부터 유래된 또는 수득된 폴리펩타이드에 관하여, 이들은 6 내지 29 아미노산, 예를 들면 6 내지 28 아미노산, 예를 들면 6, 7, 8, 9 또는 10 중 어느 하나, 내지 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 또는 18 중 어느 하나, 예를 들어 서열 번호5로부터 또는 상기에 대응하는 아미노산 또는 이의 일부를 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열 번호:5의 27 이하 아미노산이거나 상기를 포함한다.

QRFPR의 ECD3의 세포외 도메인의 짧은 부분이 용액에서 GDF15에 결합할 수 있었다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다 (참조 실시예 16). 마우스 QRFPR로부터 ECD3의 15 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 가요성 링커를 가진 Fc 융합 단백질로서 제공되었고 (서열 번호:184) 풀-다운 검정에서 GDF15에 양호하게 결합하는 것으로 밝혀졌다 (참조 서열 번호:240). 상기 폴리펩타이드는 서열 번호:176에서 제시된 서열을 갖는 인간 QRFPR로부터 서열에 대응한다. 마우스 서열은 인간 서열과 고도로 상동성이고, 서열 번호:176 (인간)의 제2 위치에서 글루타민 잔기보다는, 서열 번호:184 (마우스)의 제2 위치에서 아르기닌 잔기를 갖는다는 점에서만 상이하다. 상기 서열로부터 유래된 또는 상기와 밀접하게 관련된 서열을 갖는 폴리펩타이드는 특히 관심이다. 13-18 아미노산을 포함하는 상기 서열에 밀접하게 관련된 폴리펩타이드는 그러므로 본 발명의 특히 바람직한 구현예를 나타낸다. 특히, 서열 번호:30, 31, 32, 39, 46, 47 또는 175-189 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드는 본 발명의 다양한 측면의 바람직한 폴리펩타이드를 나타낸다.

상기 언급된 바와 같이, ECD3으로부터 유래된 그와 같은 아미노산 서열은 QRFPR의 ECD4로부터 서열과 조합될 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드는 서열 번호:12 또는 13에서 제시된 바와 같은 제2 서열, 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열과 함께 상기 단락에서 한정된 바와 같은 상기 ECD3-유래된 서열인 제1 서열을 포함할 수 있다. 제1 및 제2 서열은, 선택적으로 링커 또는 스페이서 서열을 통해, 어느 한쪽 순서로 연결될 수 있거나, 이들은, 아래 더 상세히 기재된 바와 같이, 이종이량체, 예를 들면 Fc 융합 단백질 이종이량체로서 조합으로 제공될 수 있다.

QRFPR (서열 번호 12)의 ECD4로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드는 6 내지 19 아미노산, 예를 들면, 6 내지 18, 또는 6, 7, 8 또는 9 중 어느 하나 내지 19, 18, 17, 16 또는 15 중 어느 하나, 예를 들어 서열 번호12 또는 이의 일부로부터 또는 상기에 대응하는 아미노산을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열 번호:12의 17 이하 아미노산이거나 상기를 포함한다.

CLPTM1 (서열 번호 14)의 ECD로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드는 6 내지 354 아미노산, 예를 들면 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20 중 어느 하나 내지 354, 353, 350, 320, 300, 280, 260, 250, 240, 220, 200, 180, 160, 150, 140, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 또는 20 중 어느 하나, 예를 들어 서열 번호14 또는 이의 일부로부터 또는 상기에 대응하는 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 서열 번호 14로부터 수득된 또는 유래된, 또는 이들의 일부에 대응하는 6, 7, 8 또는 9 내지 50, 45, 40, 35, 또는 30 아미노산 또는 초과를 가질 수 있거나 포함할 수 있다.

서열 번호:17에서 제시된 서열에 대응하는 CLPTM1의 세포외 도메인의 31 아미노산 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 용액에서 GDF15에 결합할 수 있다는 것 (참조 실시예 16) 그리고 CD14+ 면역 세포에서 CLPTM1 활성에 관한 GDF15의 효과를 차단할 수 있다는 것 (참조 실시예 17)이 밝혀졌다. GGGGS 링커 서열의 삼중 반복부를 포함하는 가요성 링커로 Fc에 연결된 CLPTM1로부터 유래된 상기 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 제공되었다 (참조 서열 번호:241). 서열 번호: 17의 서열, 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 6 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호: 17의 일부인 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 그러므로 본 발명의 다양한 측면의 바람직한 폴리펩타이드이다.

CLPTM1로부터 유래된 수많은 폴리펩타이드에 GDF15의 결합은 실시예 18에 있어서 ELISA 검정에서 시험되었다 (참조 도 32). 수많은 폴리펩타이드는 GDF15에 결합한다는 것이 밝혀졌고, 따라서 이들은 본 발명의 바람직한 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 따라서, 서열 번호:258, 259, 261, 262, 269, 270, 297, 298, 301, 302, 308, 309 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 서열, 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드는 본 발명의 다양한 측면의 바람직한 폴리펩타이드를 나타낸다.

특히, 서열 번호: 270 (즉 서열 GDYYPIIYFNDYWNLQKDYYG) 또는 서열 번호: 309 (즉 서열 GDYYPIIYFNDYWNLQKDYY, 즉 CLPTM1의 원상태 ECD에서 존재하지 않는 C-말단 G 잔기가 부족한 서열 번호: 270)에서 제시된 아미노산 서열 (예를 들면 적어도 6 연속 아미노산을 포함하는 이들의 일부 또는 상기와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열)을 갖거나 포함하는, 또는 상기에 기반된 또는 상기로부터 유래된 폴리펩타이드는 바람직하다. 예를 들어 폴리펩타이드는 서열 번호: 270 또는 309의 서열 또는 적어도 6 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호: 270 또는 309의 일부인 서열, 또는 서열 번호: 270 또는 309와 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 또 다른 구현예에서 폴리펩타이드는 융합 파트너를 가질 수 없지만, 노출된 폴리펩타이드일 수 있거나, 폴리펩타이드는 또 다른 모이어티에 접합될 수 있고, 예를 들면 비-펩타이드 기반 폴리머는 예컨대 아래 추가로 기재된다. 예를 들어 폴리펩타이드는 적어도 서열 DYYPII (서열 번호:326)을 포함하는 서열 번호:270 또는 309의 일부를 포함할 수 있다.

폴리펩타이드가 CLPTM1의 세포외 도메인으로부터 수득 또는 유래되는 본 발명의 특정 구현예에서, 예를 들면 원상태 또는 내인성 CLPTM1 시작 코돈이 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에서 제공되는 경우, 폴리펩타이드는 CLPTM1 유전자에 의해 암호화된 원상태 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는, 그러므로, 서열 번호:1에서 제시된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 137, 138, 139, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 288, 290, 300, 320, 340, 350 또는 354를 포함할 수 있다. 따라서, 추가 구현예에서 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌과 함께 서열 번호:14에 대응하는 아미노산 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 그와 같은 폴리펩타이드는 서열 번호:315에 의해 표시된다. 따라서, 서열 번호14가 본 명세서에서, 예를 들어 서열 번호:14 또는 이의 일부를 포함하는 폴리펩타이드에 관하여 참조되는 경우, 그와 같은 참조는 서열 번호 315에 대한 참조로 대체 또는 보충될 수 있다. 다시 말해서, 본 명세서에서 서열 번호 14에 대한 임의의 참조는 또한 서열 번호:315에 대한 참조를 포함하도록 취득될 수 있다.

사실상, 본 발명의 폴리펩타이드는 사이에 대응하는 그리고 상기 포함된 임의의 정수를 포함하는 범위 내에, 또는 상기 임의의 범위 내에 위치한 길이를 포함할 수 있거나 가질 수 있다. 더욱이, 아래 더 상세히 기재될 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는, QRFPR 및/또는 CLPTM1로부터 수득된 또는 유래된 펩타이드 서열에 부착된 또는 커플링된 1종 이상의 다른 아미노산 서열을 포함하는, 융합 형태로 또는 다른 연신된 또는 확장된 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 특정한 구현예에서, 폴리펩타이드는 QRFPR 및/또는 CLPTM1의 전체 세포외 도메인의 모두 또는 실질적으로 모두를 포함할 수 있다.

폴리펩타이드가 GDF와 이의 수용체 사이 상호작용을 차단할 수 있기 위해, 상기 폴리펩타이드가 GDF15에 결합할 수 있다는 것이 필요하다. 이론에 의한 구속됨 없이, QRFPR 및 CLPTM1에 대하여 GDF15상의 결합 부위가 (어느 한쪽 완전히 또는 부분적으로) 중첩하고 있다고 여기지고 따라서 GDF15에 결합하는 이들 수용체의 어느 한쪽의 세포외 도메인으로부터 유래된 폴리펩타이드가 어느 한쪽 수용체에 GDF15의 결합을 차단할 수 있다고 생각된다. 다시 말해서, GDF15에 결합하는 QRFPR의 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드는 어느 한쪽 QRFPR 또는 CLPTM1에 결합하는 GDF15를 예방할 수 있을 것이고, GDF15에 결합하는 CLPTM1의 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드는 어느 한쪽 QRFPR 또는 CLPTM1에 결합하는 GDF15를 예방할 수 있을 것이다.

이것은, QRFPR의 ECD3과 CLPTM1의 ECD 사이 서열 유사성의 면적이 있다는 것을 보여주는, 아래 실시예 20에서 보고된, 추가 작업에 의해 지지된다. ECD4와 일부 서열 유사성은 또한 지지된다. 흥미롭게도, 이들은 2 수용체가 비교된 경우 배경을 넘어 유사성의 영역 뿐이고, GDF15 결합을 매개하는, 부위, 또는 영역에서이다.

본 발명의 폴리펩타이드는 가용성 형태로, 예를 들면 가용성 폴리펩타이드, 또는 가용화 그룹 및/또는 모이어티로 제공되는 펩타이드로서 제공될 수 있다.

폴리펩타이드는 단량체성, 또는 이량체성 또는 더 높은 다량체성 형태로 제공될 수 있고, 즉 본 명세서에서 기재된 또는 한정된 임의의 폴리펩타이드의 이량체 또는 더 높은 다량체일 수 있거나 더 포함할 수 있다. 아래 실시예에서 제공된 데이터는 폴리펩타이드가 어느 한쪽 단량체성 또는 이량체성 형태로 활성을 가질 수 있다는 것을 보여준다. GDF15는 이량체로서 존재하고, 따라서 이량체성 형태로 폴리펩타이드 제공에 이점일 수 있다.

이량체 또는 더 높은 다량체는, 당해 기술에 공지된 기술에 따라, 임의의 편리한 방식으로 형성될 수 있다. 예를 들어 이량체는 융합 단백질의 형성 동안 자발적으로 형성할 수 있거나, 이들은 조작될 수 있다.

추가 모이어티를 가진 융합 단백질 또는 작제물 또는 콘주게이트의 형태로 폴리펩타이드를 제공하는 것이 유리할 수 있거나 바람직할 수 있다.

특정 구현예에서, 폴리펩타이드는, 이의 약력학적 특성을 개선하기 위해, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 또는 다당류를 포함하는, 천연 또는 합성 폴리머에 접합 또는 연결될 수 있다. 다양한 구현예에서 폴리펩타이드는, 그러므로, 이의 전체 개시내용이 이로써 참고로 편입되는, Strohl. 2015. BioDrugs 29, 215-239에 기재된 바와 같이 선형 또는 분지형-사슬 모노메톡시 폴리-에틸렌 글리콜 (PEG; 페길화), 하이알루론산, 덱스트란 또는 덱스트린, 호모-아미노산 폴리머 (HAP; HAP화), 프롤린-알라닌-세린 폴리머 (PAS; PAS화) 또는 엘라스틴-유사 펩타이드 (ELP; ELP화)에 접합될 수 있다. 사실상, 치료 단백질로 사용하기 위한 당해 기술에 공지된 임의의 공지된 융합 또는 콘주게이션 파트너는 사용될 수 있다.

본 발명의 임의의 폴리펩타이드는, 예를 들어 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 및/또는 폴리펩타이드에 추가 기능성을 부여하기 위해, 융합 단백질 또는 키메라 단백질로서 제공될 수 있다. 용어 "융합 단백질"은 2 이상의 상이한 공급원으로부터 폴리펩타이드 서열을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 지칭한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 알부민, 피브리노겐, 글루타티온 S-전달효소, 트랜스페린, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘-유사 단백질, 또는 면역글로불린, 또는 이의 일부와, 특히 면역글로불린 (예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 부분, 또는 (예를 들면 Fc-융합 단백질로서) 이의 일부와 조합으로 융합 단백질로서 제공될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질 내에, 본 발명의 폴리펩타이드는 융합 단백질의 N-말단에서, 또는 융합 단백질의 C-말단에서 위치할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 융합 단백질에서, 예를 들면 융합 단백질의 루프 또는 다른 표면 양상 내에서 내부적으로 위치할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 면역글로불린의 Fc 영역과 조합으로 융합 단백질로서 제공될 수 있고, 즉 Fc-융합 단백질로서 제공될 수 있다. Fc-융합 단백질은 이량체를 형성하고, 따라서 상기 구현예에서 본 발명의 폴리 펩타이드의 2 카피는 단일 독립체로서 제공될 수 있다. 그와 같은 구현예에서 이량체는 본 발명의 2 동일한 폴리펩타이드를 포함하는 동종이량체일 수 있거나, 본 발명의 2 비-동일한 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체로서 제공될 수 있다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, QRFPR의 제3 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 2 동일한 폴리펩타이드를 포함하는 동종이량체일 수 있거나, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 QRFPR의 제4 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 2 동일한 폴리펩타이드를 포함하는 동종이량체일 수 있다. Fc-융합 단백질은 또한, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, QRFPR의 제3 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 2 상이한 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체일 수 있거나, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, QRFPR의 제4 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 2 상이한 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체일 수 있다. 특정한 구현예에서, Fc-융합 단백질은, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, QRFPR의 제3 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 제1 폴리펩타이드, 및 QRFPR의 제4 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 제2 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체일 수 있다. Fc-융합 단백질은 또한, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, CLPTM1로부터 유래된 2 동일한 폴리펩타이드를 포함하는 동종이량체일 수 있거나, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 CLPTM1로부터 유래된 2 상이한 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체일 수 있다. 특정한 구현예에서, Fc-융합 단백질은 서열 번호:15의 서열 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제1 펩타이드 그리고 서열 번호:16의 서열 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 펩타이드를 포함하는 이종이량체일 수 있다.

단량체 및 이량체 뿐만 아니라, 더 높은 다량체 형태, 예를 들면 삼량체 이상으로 Fc 융합은 또한 공지되고, 본 발명에 따라 포함된다.

Fc-융합 단백질은 면역원성인 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 다시 말해서, Fc-융합 단백질은 면역 반응, 예를 들면 선천성 면역 시스템의 세포에 의한 반응을 유도하는 것으로 공지되는 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, Fc-융합 단백질은 면역원성일 수 있다. 특정한 구현예에서, 면역원성 서열은 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC) 및/또는 항체 의존적 세포 매개된 식균작용 (ADCP)를 유도할 수 있다. 면역원성 Fc-태그 서열의 예는 당해 기술에 공지되어 있다 (참조 예를 들면 Lazaret al. 2006. PNAS 103, 4005-4010); Shields et al. 2001. J. Biol. Chem. 276, 6591-6604; 및 Stewart et al. 2011. Protein Engineering, Design and Selection 24, 671-678). 그와 같은 용도에 제한되지 않아도, 상기 면역원성 Fc-융합 단백질은 GDF15를 과발현하는, 그리고 이의 세포 표면에 근접한 GDF15의 고농도를 갖는 암의 치료에서 특정한 유용성일 수 있다. 그와 같은 Fc 융합 단백질은 암의 부위에 대상체의 면역 시스템의 세포를 동원하기 위해, 그리고 GDF15와 이의 수용체 사이 상호작용의 단순 차단에 더하여 면역 반응을 유도하기 위해 작용할 수 있다.

그러나, 면역 반응 유도 없이, Fc-융합 단백질이 최소 면역원성 활성을 포함하는 것, 즉 GDF15 (및 따라서 격리제)에 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 추가 구현예에서, Fc-융합 단백질은 면역원성이 아니다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드는 비스포스포네이트와 콘주게이트로서 제공될 수 있다. 이론에 의한 구속됨 없이, 그와 같은 작제물이 골에서 풍부 (즉 축적하는 것)에 관한 것일 수 있다고 여겨진다. 그와 같은 축적은, 암에 있어서 골의 참여 억제에서 특정한 이점일 수 있는, 골에서 이의 수용체와 GDF15의 상호작용 예방에서 특정한 이점을 가질 수 있다.

본 발명에서 고려된 임의의 융합 단백질 또는 콘주게이트에서, 연결될 수 있는 QRFPR 또는 CLPTM1로부터 유래된 폴리펩타이드는 링커 서열 또는 링커 또는 스페이서 그룹에 의해 이의 N-말단에서 및/또는 이의 C-말단에서 콘주게이트 또는 융합 파트너이다. 폴리펩타이드/펩타이드 기반 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질에 대하여 링커는 편리하게 펩타이드/폴리펩타이드 링커일 것이고, 이들 다수는 당해 기술에서 공지되고 기재된다. 링커는 (가요성 링커 서열 모티프의 반복부를 포함할 수 있는) 가요성 링커 서열일 수 있다. 당해 기술에서 공지된 전형적인 링커는 작은 비-극성 (예를 들면 글리신) 또는 극성 (예를 들면 세린 또는 트레오닌) 잔기가 풍부하고, 통상적으로 글리신 및 세린 잔기 (GS)의 스트레치로 구성된다. 통상적으로 사용된 링커는, n의 카피 수가 조정될 수 있는 ((GGGGS)_n으로서) 링커에서 반복 단위로서 제공될 수 있는, (GGGGS) 링커 (서열 번호:242)이다. 그와 같은 링커는 삼중 반복부 (즉 (GGGGS)₃)으로서 실시예 16의 융합 단백질 작제물에서 사용된다.

비-폴리펩타이드/펩타이드 폴리머 (예컨대 PEG 또는 다당류 등)과 또는 다른 콘주게이트 파트너와 콘주게이트에 대하여, 본 발명의 폴리펩타이드는 임의의 공지된 또는 요망된 커플링 화학 또는 링커/커플링 그룹을 이용하여 다른 모이어티 (콘주게이트 파트너)에 커플링 또는 연결 (접합)될 수 있다. 다양한 이들은 당해 기술에서 기재된다.

더욱 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 환형 펩타이드로서 제공될 수 있다. 환형 펩타이드는, 이들이 단백질분해에 전형적으로 고도로 저항성임에 따라, 단백질 또는 펩타이드-기반 치료제의 경구 투여에서 특정한 유용성이고, 따라서 소화관에서 단백분해 효소에 의해 파괴되지 않는다. 그러나, 환형 펩타이드는 또한 전형적으로 구조적으로-관련된 선형 펩타이드와 비교된 경우 증가된 혈청 반감기를 나타낸다.

GDF15 수용체의 세포외 도메인용 야생형 서열에 비하여 1종 이상의 아미노산 치환을 포함하지만, GDF15에 결합하는 능력을 보유하는 폴리펩타이드는 본 명세서에서 기재된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 원상태 단백질에서 발견된 서열의 동등한 부문의 것과 고도의 서열 동일성을 가질 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 75% 서열 동일성을 갖고 바람직하게는 원상태 단백질에서 발견된 서열의 동등한 부문의 것과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 것이다. 그러나, 본 발명의 특정한 측면에서 GDF15에 결합에 의해 GDF15 및 이의 수용체의 상호작용을 차단하는데 사용되는 폴리펩타이드는 원상태 단백질에서 발견된 서열의 동등한 부문의 것과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 이론에 의한 구속됨 없이, 비-원상태 서열을 갖는 폴리펩타이드가 대상체의 면역 시스템에 의해 '외래'로서 인식될 수 있음에 따라, 그와 같은 폴리펩타이드가 원상태 단백질에 비하여 1종 이상의 치환을 갖는 폴리펩타이드보다 덜한 면역 반응을 유발시킬 수 있다는 것 (즉 덜한 면역원성일 수 있다는 것)이 가능하다.

서열 동일성은 당해 기술에서 공지된 및 쉽게 이용가능한 방법 및 소프트웨어에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 따라서, 서열 동일성은 임의의 편리한 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 서열 사이 서열 동일성의 정도를 결정하기 위하여, 서열의 다중 정렬을 만드는 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 Clustal W (Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680)은 유용하다. ALIGN (Myers et al., (1988) CABIOS, 4: 11-17), FASTA (Pearson et al., (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol., 183: 63-98), BLAST 및 갭핑된 BLAST (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402) 같은, 서열의 쌍을 비교하고 정렬하는 프로그램은 이러한 목적을 위해 또한 유용하고, 디폴트 셋팅을 이용하여 사용될 수 있다. 더욱이, 유럽 생물정보 연구소에서 달리(Dali) 서버는 단백질 서열의 구조-기반 정렬을 제공한다 (Holm (1993) J. Mol. Biol., 233: 123-38; Holm (1995) Trends Biochem. Sci., 20: 478-480; Holm (1998) Nucleic Acid Res., 26: 316-9). 다중 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 표준 BLAST 파라미터를 이용하여 결정될 수 있다 (이용가능한 모든 유기체, 매트릭스 Blosum 62, 갭 비용: 실재 11, 확장 1 이용). 대안적으로, 하기 프로그램 및 파라미터는 사용될 수 있다: 프로그램: Align Plus 4, 버전 4.10 (Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite). DNA 비교: 전반적인 비교, 표준 선형 평점 매트릭스, 미스매치 패널티 = 2, 개방 갭 페널티 = 4, 확장 갭 페널티 = 1. 아미노산 비교: 전반적인 비교, BLOSUM 62 평점 매트릭스. 본 명세서에서 한정된 바와 같은 자연 발생 폴리펩타이드 서열의 변이체는 예를 들면 당해 기술, 예를 들어 표준 돌연변이유발 기술 예컨대 부위-관련된 또는 랜덤 돌연변이유발에 공지되어 있는 표준 분자 생물학 기술 이용 (예를 들면 유전자 셔플링 또는 오류 유발 PCR 이용)에 의해 합성으로 생성될 수 있다. 그와 같은 돌연변이유발 기술은 개선된 또는 상이한 결합 및/또는 억제 특성을 갖는 폴리펩타이드를 개발하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 한정된 바와 같은 폴리펩타이드의 유도체는 또한 사용될 수 있다. 유도체는 상기에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 또는 대신에 자연 발생 아미노산이 아미노산의 구조적 유사체를 함유하는 이들의 변이체를 의미한다. 유도화 또는 변형 (예를 들면 폴리펩타이드에서 아미노산의 표지화, 당화, 메틸화)는 또한 폴리펩타이드의 기능이 부정적으로 영향받지 않는 한 발생할 수 있다.

"구조적 유사체"는, 비-표준 아미노산을 의미한다. 사용될 수 있는 상기 비-표준 또는 구조적 유사체 아미노산의 예는 D 아미노산, 아미드 등배체 (예컨대 N-메틸 아미드, 레트로역(retro-inverse) 아미드, 티오아미드, 티오에스테르, 포스포네이트, 케토메틸렌, 하이드록시메틸렌, 플루오로비닐, (E)-비닐, 메틸렌아미노, 메틸렌티오 또는 알칸), L-N 메틸아미노산, D-β 메틸아미노산, 또는 D-N-메틸아미노산이다.

폴리펩타이드가 원상태 단백질의 서열에 비하여 아미노산 치환을 포함하는 경우, 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있다. 용어 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산이 유사한 물리화학 특성을 갖는 아미노산, 즉 동일한 부류/그룹의 아미노산으로 대체 (치환)되는 임의의 아미노산 치환을 지칭한다. 예를 들면, 작은 잔기 글리신 (G), 알라닌 (A) 세린 (S) 또는 트레오닌 (T); 소수성 또는 지방족 잔기 류신 (L), 이소류신 (I); 발린 (V) 또는 메티오닌 (M); 친수성 잔기 아스파라긴 (N) 및 글루타민 (Q); 산성 잔기 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E); 양성으로-충전된 (염기성) 잔기 아르기닌 (R), 라이신 (K) 또는 히스티딘 (H); 또는 방향족 잔기 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W)는 GDF15에 결합하는 폴리펩타이드의 능력의 실질적으로 변경 없이 상호교환적으로 치환될 수 있다.

제제의 제2 부류는 GDF15와 이의 수용체 사이 상호작용을 차단하는데 사용될 수 있는 그리고 GDF15 수용체에 결합할 수 있는 결합제를 포함한다. 그와 같은 결합제는 수용체의 세포외 도메인에 결합 그리고 상기 수용체에 결합으로부터 GDF15 예방에 의해, 또는 수용체에서 GDF15 결합의 효과 억제 또는 감소에 의해 GDF15와 이의 수용체 사이 상호작용을 감소시키는데 사용될 수 있다 (상기 언급된 바와 같이, 이것은 필연적으로 GDF15 결합의 예방을 포함하지 않을 수 있다).

상기 결합제가 수용체에서 GDF15의 결합이나, 효과 또는 활성을 억제, 또는 감소시키는 작용을 하기 때문에 이들은, 적어도 수용체에서 리간드 GDF15의 효과에 관하여, 수용체 길항제로서 보여질 수 있다. 그와 같은 길항제는 부분적인 길항제를 포함하였다 (즉 결합제는 GDF15에 관하여 요망된 길항적 효과를 가질 수 있지만, 또한 수용체에서 다른 효과/다른 리간드에 관하여 수용체에서 효능적 활성을 나타낼 수 있다).

일 구현예에서, 제제는 QRFPR의 세포외 도메인에 결합할 수 있고 GDF15에 결합하는 QRFPR의 능력, 및/또는 수용체에서 이의 효과를 발휘하는 GDF15의 능력을 감소시킬 수 있다. QRFPR은 상기에 논의된 바와 같이 4 세포외 도메인을 포함한다. 결합제는, GDF15 결합 부위에 직접적으로 결합 (및 따라서 QRFPR에 결합으로부터 GDF15 차단)에 의해, 또는 수용체에 결합으로부터 GDF15를 입체적으로 예방 또는 방해하는 GDF15 결합 부위에 충분한 근접하여 결합에 의해 GDF15의 결합을 예방하는 방식으로 임의의 이들 도메인 결합에 의해 GDF15와 QRFPR 사이 상호작용을 차단할 수 있다.

특정한 구현예에서, 결합제는 GDF15와 상호작용하는 것으로 밝혀진 QRFPR의 동일한 영역 (리간드 결합 부위)에, 즉 QRFPR의 제3 및 제4 세포외 도메인의 한쪽 또는 양쪽에 결합할 수 있다. 따라서 일 구현예에서, 제제는 QRFPR의 제3 세포외 도메인에 (즉 서열 번호:5에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에), 또는 QRFPR의 제4 세포외 도메인에 (즉 서열 번호:12에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에), 또는 QRFPR의 제3 및 제4 세포외 도메인 둘 모두에 (즉 서열 번호:5에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 그리고 서열 번호:6에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에, 또는 더욱 특히 양쪽 서열 번호 5 및 12를 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 추가 구현예에서, 제제는 QRFPR의 제3 및/또는 제4 세포외 도메인의 부분에 결합할 수 있을 뿐이다.

추가 구현예에서, 결합제는 GDF15 결합 부위에 결합하지 않을 수 있다. 상기 구현예에서 제제는 상호작용의 입체적으로 방해에 의해 GDF15와 QRFPR 사이 상호작용을 차단할 수 있다. 따라서, 결합제는 QRFPR의 제1 및/또는 제2 세포외 도메인에 결합에 의해 QRFPR에 GDF15의 결합을 예방할 수 있다. 일 구현예에서, 제제는 QRFPR의 제1 세포외 도메인에 (즉 서열 번호:3에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에) 결합할 수 있다. 추가 구현예에서, 결합제는 QRFPR의 제2 세포외 도메인에 (즉 서열 번호:4에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에) 결합할 수 있다. 더욱 또 다른 구현예에서, 결합제는 QRFPR의 제1 및 제2 세포외 도메인 둘 모두에 (즉 서열 번호:3에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 그리고 서열 번호:4에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 또는 양쪽 서열 번호 3 및 4를 포함하는 폴리펩타이드에) 결합할 수 있다.

대안적인 구현예에서, 제제는 CLPTM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있고, GDF15에 결합하는 CLPTM1의 능력, 및/또는 수용체에서 이의 효과를 발휘하는 GDF15의 능력을 감소시킬 수 있다. 따라서, 제1 구현예에서 제제는 서열 번호:14에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 특정한 구현예에서, 제제는 서열 번호:17에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 추가 구현예에서, 제제는 서열 번호:18에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 더욱 또 다른 구현예에서, 제제는 서열 번호:15에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드 및/또는 서열 번호:16에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제제는 서열 번호:200에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.

아래 실시예 19는 상기 수용체에 대한 길항제 활성을 입증하는 항-CLPTM1 항체를 위하여 CLPTM1 (서열 번호:14)의 ECD에서 결합 부위의 설명을 기재한다. 상기 항체의 공통 분모는 서열 번호:2의 위치 98-100에서 PKD (서열 번호: 322)인 것으로 지시된다. 따라서, 또 추가의 구현예에서, 제제는 서열 PKD (서열 번호:322)를 갖거나 포함하는 폴리펩타이드, 예를 들면 서열 번호:212 (PKDT)에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖거나 포함하는, 또는 서열 번호:213-239 중 어느 하나 또는 서열 번호: 275 내지 278 중 어느 하나를 갖거나 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 제2 에피토프는 또한 실시예 19에서 확인된다. 따라서, 더욱 추가 구현예에서 제제는 서열 번호:280-286 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.

본 발명의 결합제는 QRFPR에, 및 특히 QRFPR 및/또는 CLPTM1의 세포외 도메인에 결합하는 능력을 갖는 임의의 제제, 예를 들면 임의의 화합물, 분자 또는 독립체일 수 있다. 특히 결합제는 특이적으로 QRFPR 및/또는 CLPTM1 (또는 이들의 세포외 도메인)에 결합할 수 있다. 결합은 구체적으로 제제가 비-표적 분자에 결합과 구별하는 방식으로 QRFPR 및/또는 CLPTM1 (또는 이들의 세포외 도메인)에 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 비-표적 분자에 결합은 QRFPR 및/또는 CLPTM1에 결합과 비교된 경우 무시할만한 할 수 있거나 실질적으로 감소될 수 있다. 결합제는 따라서 QRFPR 및/또는 CLPTM1에 대하여 결합 친화도를 갖는 임의의 제제 즉 QRFPR 및/또는 CLPTM1에 대하여, 또는 더욱 특히 이들의 세포외 도메인에 대하여 친화도 결합 파트너일 수 있다.

본 발명의 결합제는 따라서 단백질 또는 폴리펩타이드 예컨대 항체 또는 이들의 단편 또는 유도체, 파아지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이 또는 임의의 다른 펩타이드 디스플레이 시스템으로부터 조합으로 유래된 폴리펩타이드, GDF15의 비-효능적 단편 (예를 들면 GDF15의 부분을 포함하는 폴리펩타이드), 또는 핵산 분자, 예컨대 압타머, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 결합제는 단백질, 바람직하게는 항체 또는 이들의 유도체 또는 단편이다. 다양한 항체-유사 분자, 예를 들면 아피바디 및 상기 동종은 또한 당해 기술에서 공지되고 기재된다.

바람직한 구현예에서, 결합제는 항체이다. 항체는 임의의 편리한 또는 요망된 종, 부류 또는 하위유형일 수 있다. 더욱이, 항체는 천연, 유도체화된 또는 합성일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 따라서 항체 분자 및 항체 단편의 모든 유형을 포함한다.

더욱 특히 본 발명에 따른 "항체"는 하기를 포함한다:

(a) 임의의 동물 예를 들면 종래에 사용된 임의의 동물 예를 들면 양, 토끼, 염소, 또는 마우스 또는 계란 노른자로부터 유래된 면역글로불린의 임의의 다양한 부류 또는 하위부류 예를 들면 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE;

(b) 단클론성 또는 다클론성 항체;

(c) 온전한 항체 또는 단클론성 또는 다클론성 항체의 단편, 단편은, 온전한 항체에서 중쇄 성분을 연결하는 디설파이드 결합의 환원성 절단에 의해 수득된 소위 "절반 분자" 단편인, 항체의 결합 영역을 함유하는 것 예를 들면 Fc 부분이 결여된 단편 (예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv)이다. Fv는 2 쇄로서 표현된 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 함유하는 단편으로서 한정될 수 있음;

(d) 단클론성 항체, 항체의 단편, 인간화된 항체, 키메라 항체, 또는 합성으로 제조된 또는 변경된 항체-유사 구조를 포함하는, 재조합 DNA 또는 다른 합성 기술에 의해 생산된 또는 변형된 항체. 항체 예를 들면 단일 쇄 항체의 기능성 유도체 또는 "동등물"이 또한 포함된다.

단일 쇄 항체는, 융합된 단일 쇄 분자로서 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된, 경쇄의 가변 영역, 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전적으로 조작된 분자로서 한정될 수 있다.

상기 항체 단편 및 합성 및 유도체화된 항체의 제조 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 항체의 상보성 결정 영역 (CDRs) 또는 초가변 영역을 함유하는 항체 단편은 또한 포함된다. 이들은 항원 결합 부위의 형성에 기여하는 3차원 루프 구조를 형성하는 항체의 경쇄 및 중쇄상에서 아미노산 서열을 포함하는 영역으로서 한정될 수 있다. CDRs는 CDR-그라프팅된 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "CDR 그라프팅된"은 경 및/또는 가변 도메인에서 1종 이상의 서열의 적어도 일부가 소정의 항원에 대하여 상이한 결합 특이성을 갖는 항체로부터 CDR 서열의 유사한 일부에 의해 대체되어 있는 아미노산 서열을 갖는 항체를 한정한다. 당해 분야의 숙련가는 당해 기술에서 잘 알려진 방법을 이용하여 상기 CDR 그라프팅된 항체를 쉽게 생산할 수 있다.

키메라 항체는 상이한 종으로부터 유래된 항체의 일정한 영역과 하나의 종의 항-수용체 항체의 가변 도메인의 배합에 의해 제조될 수 있다. 상기 기술은 치료 용도를 위하여 항체를 인간화하는데 사용될 수 있다.

단클론성 항체 그리고 이의 단편 및 유도체는 본 발명에 따라 바람직한 항체이다.

바람직하게는 항체는 인간화된 또는 키메라 항체, 즉 인간 GDF15 수용체를 인식하는 결합 도메인 (예를 들면 상보성 결정 영역 (CDR)) 그리고 인간에 있어서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 이의 유사성을 증가시키기 위해 변형되어 있는 고정된 (예를 들면 Fc) 도메인을 포함하기 위해 변형 또는 창출되어 있는 항체일 수 있다. 특정한 측면에서, 인간화된 또는 키메라 단클론성 항체는 IgG4 하위유형일 수 있다. 상기 유형의 변형은 최소 면역원성 효과를 갖는 항체를 제공하기 위해 바람직하다.

또 다른 바람직한 구현예에서 항체는 인간 항체일 수 있다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자를 발현하기 위해 변형되어 있을 수 있는 트랜스제닉 마우스 또는 다른 트랜스제닉 동물을 사용하여 제조될 수 있다. 이들은 또한 파아지 디스플레이로부터 수득될 수 있거나 사실상 이들은 인간 대상체, 즉 항-수용체 항체가 천연적으로 실재하거나 존재하는 (즉 항체 생산을 위하여 대상체를 면역화시킬 필요 없는) 인간 대상체, 예를 들어 인간 자기-면역 대상체로부터 단리될 수 있다.

QRFPR 또는 CLPTM1에 결합하는 항체는 보고되어 있고 상업적으로 입수가능하다 (참조 예를 들어 아래 실시예에서). 하나의 상기 예는 Bioss Antibodies (USA)로부터 이용가능한 항-CLPTM1 항체 bs-8018R이다. 더욱이, 수용체에 대한 항체는 공지된 및 일상적 기술을 사용하여 쉽게 제조될 수 있다. 이의 항원내 항체의 결합 부위 (결합하는 모이어티)의 결정 방법은 또한 일상적이고 (참조 또한 아래 실시예) QRFPR 또는 CLPTM1내 항체 결합 부위, 또는 에피토프를 결정하는 것이 쉽게 가능하다.

상기 언급된 바와 같이 본 발명의 폴리펩타이드 및 결합제는 조성물, 및 특히 상승된 GDF15와 관련된 병태의 치료 또는 예방에서, 사용될 수 있는, 또는 사용하기 위하여 제공될 수 있는 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 그와 같은 조성물은 본 발명의 1종 이상의 폴리펩타이드 및/또는 1종 이상의 결합제를 포함할 수 있거나 상기로 구성될 수 있다. 폴리펩타이드 및 결합제는 함께 또는 공동으로 (즉 조합 요법으로서) 사용하기 위한 단일 조성물에서 또는 별도의 조성물에서 함께 제공될 수 있다. 폴리펩타이드 및 결합제는 순차적으로 또는 동시에 또는 실질적으로 동시에 투여 또는 사용될 수 있다. 따라서 상이한 폴리펩타이드 및 결합제 성분은 실질적으로 동일한 시간에 함께 또는 개별적으로 투여 또는 사용될 수 있거나, 개별적으로, 상이한 시간 또는 시간 간격에서 개별적으로 각각 투여 또는 사용될 수 있다.

그와 같은 조성물 또는 조합 (예를 들면 상기에 기재된 바와 같은 키트 또는 조합된 생성물)은 QRFRP의 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드 및 QRFPR의 세포외 도메인에 결합하는 결합제를 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 조성물 또는 조합은 QRFPR의 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드 및 CLPTM1의 세포외 도메인에 결합하는 결합제를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조성물 또는 조합은 CLPTM1의 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드 및 QRFPR의 세포외 도메인에 결합하는 결합제를 포함할 수 있다. 또 추가의 구현예에서, 조성물 또는 조합은 CLPTM1의 세포외 도메인으로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드 및 CLPTM1의 세포외 도메인에 결합하는 결합제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물, 키트 또는 조합된 생성물이 GDF15 수용체로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드 및 동일한 수용체에 결합하는 결합제를 포함할 수 있다는 것이 분명할 것이다. 이 경우에, 결합제 및 폴리펩타이드가 서로에 대해서 결합하고 따라서 이의 수용체를 가진 GDF15와 상호작용을 차단할 수 없음에 따라, 결합제가 동일한 수용체로부터 유래된 폴리펩타이드에 결합하지 않는 것이 일반적으로 바람직하다. 이것은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 일 구현예에서, 결합제는 GDF15 결합에 직접적으로 관여되지 않는 (그리고 따라서 상기에 논의된 바와 같이 입체 장애를 통해 간접적으로 GDF15 결합을 차단할 수 있는) GDF15 수용체의 부분에 결합할 수 있고, 폴리펩타이드는 GDF15에 결합하는 GDF15 수용체의 부분으로부터 유래될 수 있다. 추가 구현예에서, 결합제는 GDF15 결합에 관여되는 GDF15 수용체의 부분에 결합할 수 있고, 폴리펩타이드는 GDF15 수용체의 상이한 부분으로부터 유래될 수 있다. 예로써, 결합제는 QRFPR의 제4 세포외 도메인에 결합할 수 있고, 폴리펩타이드는 QRFPR의 제3 세포외 도메인으로부터 유래될 수 있다. 더욱 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는, GDF15에 결합하는 이의 능력을 손상시키지 않는, 그러나 결합제에 결합으로부터 예방하는, 서열 변형, 예를 들면 보존적 치환을 포함할 수 있다. 그러나, 숙련가는 특정한 결합제가 특정한 폴리펩타이드에 결합하는지를 확립하기 간단할 것이라는 것, 그리고 상기 조합이 회피될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

따라서, 예로써, 서로 방해 없이, 동일한 수용체로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드와 함께 동일한 대상체에서 그와 같은 항체가 사용되도록 하는, GDF15에 대하여 수용체에서 결합 부위에 관하여 에피토프 쉬프트를 입증하는 항체는 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드에 결합하지 않는, 또는 적어도 공동으로 사용되는 폴리펩타이드에 결합하지 않는 결합제의 이점은 양쪽 성분이 함께 사용될 수 있고, 유익하게는 GDF15, 예를 들면 순환에서 자유로운, 또는 종양의 근접한 부위에서 위치한 GDF15에, 그리고 GDF15가 유해한 또는 원치않는 효과를 행사하기 위해 결합할 수 있는 수용체에 모두 결합하는, 상보적 효과를 수득하는데 사용될 수 있다는 점이다.

이전에 언급된 바와 같이, 몇몇의 질환, 장애 및 병태는 GDF15의 증가된 수준과 관련된다. GDF15의 그와 같은 증가된 수준은 바디의 조직 또는 기관에서 또는 순환에서 검출가능할 수 있다. GDF15는 또한 종양의 부위 또는 부근에서 국소적으로 증가할 수 있고, 예를 들어 종양의 기질 또는 세포외 매트릭스 내 또는 주위에서 축적할 수 있다.

GDF15의 상승된 수준과 관련된 병태는, 순환에서 및/또는 국소적으로, 예를 들면 암 (예를 들어 종양) 또는 다른 손상 또는 장애의 부위, 또는 부근에서 (예를 들면 염증의 부위에서 포함하여, GDF15의 수준이 증가되는 임의의 병태, 질환 또는 장애일 수 있다. 예를 들면, GDF15가 암 (예를 들면 종양)의 부위에서 국소적으로 증가되는 경우, 증가는 예컨대 GDF15의 순환 수준에 관한 주목할 만한 효과를 갖는 것이 아닐 수 있지만, GDF15의 국소 농도 또는 양은 (예를 들어 종양의 미세환경에서) 증가될 수 있다. 따라서 GDF15의 수준은 문제의 병태 없이 대상체 예를 들면 건강한 대상체에 비하여, 또는 병태가 존재하지 않거나, 존재하지 않았던 대상체의 바디에서 부위 또는 위치에 비하여 증가될 수 있다.

GDF15의 상승된 수준과 관련된 병태는 따라서 GDF15의 수준이, 순환에서 또는 국소적으로 바디에서 임의의 부위에서든, 비정상적인 임의의 병태를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서 GDF15의 수준이 원치않는, 예를 들면 대상체에 해로운 또는 유해한 효과를 초래하는 임의의 병태가 또한 포함된다. 추가로, GDF15의 활성이 증가되거나 원치않는 임의의 병태가 포함된다.

그와 같은 병태는 증가된 또는 상승된 GDF15 수준과 관련된 것으로 공지되는 상기 언급된 임의의 병태를 포함할 수 있다. 따라서, 병태는 특히, 임의의 원인과 관련된 또는 상기로부터 발생하는 악액질을 포함하는, 악액질을 포함할 수 있다. 악액질은, 염증성 병태 예컨대 울혈성 심장기능상실, 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 만성적 폐쇄성 폐 고혈압, 만성 신장 질환, 낭포성 섬유증, 다발성 경화증, 운동 뉴런 질환, 파킨슨병, 치매, HIV/AIDS, 류마티스성 관절염, 또는 예를 들면 낭창, 다발성 경화증 또는 강직 척추염을 포함하는, 임의의 다른 염증성 또는 자가면역 병태를 포함하는, 임의의 만성 또는 장기간 병태로부터 발생할 수 있다.

특정한 구현예에서 악액질은 암-유도된다.

더욱 일반적으로 병태는 원치않는 또는 과도한 체중 감소, 또는 식욕 억제 및/또는 체중 감소와 관련된 또는 상기로부터 발생하는 임의의 병태일 수 있다. 체중 감소는 환자에 유해한 정도, 즉 임상적으로 상당한 체중 감소일 수 있다. 예는 식욕부진 악액질을 포함하고, 체중 감소 또는 식욕 억제는 GDF15의 상승된 순환 수준과 관련될 수 있다. 악액질, 체중 감소 또는 식욕 억제에 관하여, 결합제는 특히 수용체 QRFPR에 대한 결합제일 수 있다. 폴리펩타이드는 본 발명의 임의의 폴리펩타이드일 수 있지만, 특히 QRFPR로부터 유래된 또는 수득된 폴리펩타이드일 수 있다.

추가 병태는 암, 골 장애, 심혈관 질환, 예를 들어 만성 폐 장애를 포함하는 폐 장애, 예를 들면 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 동맥 고혈압 및 신장 장애 또는 질환을 포함한다.

수많은 혈액 및 철분 과부하 장애는 또한 상승된 GDF15와 관련되어 있고, 따라서 그와 같은 병태는 또한 겸상 세포 질환, 선천성 구상적혈구증, 선천성 적혈구생성이상 빈혈 유형 I 및 II, 지중해빈혈, 윤상철아구를 동반한 난치성 빈혈 (RARS), 및 피루베이트 키나제 결핍을 포함할 수 있다.

암은 본 발명에 따라 특정한 관심의 병태를 나타낸다. 암의 부위에서 순환하는 또는 국소적이든, 상승된 GDF15 수준은 광범위한 상이한 암에 대하여 좋지 못한 예측을 표시하는 것으로 공지되고, 많은 암은 GDF15를 과발현하고 분비하는 것으로 공지된다. 예를 들어, 전립선 암 (Karan et al. Cancer Res 2009;69(1):2-5), 다발성 골수종 (Tanno et al. Blood. 2014 Jan 30;123(5):725-33), 흑색종 (Boyle et al. J Invest Dermatol. 2009 Feb;129(2):383-91), 결장직장 암 (Barderas et al. Mol Cell Proteomics. 2013 Jun;12(6):1602-20), 위 암 (Baek et al. Clin Chim Acta. 2009 Mar;401(1-2):128-33), 유방 암 (Kim et al. Carcinogenesis. 2008 Apr;29(4):704-12), 난소 암 (Chudecka-Gtaz et al. Onco Targets Ther. 2015 Feb 23;8:471-85), 자궁내막 암 (Alonso-Alconada et al. Mol Cancer. 2014; 13: 223), 경구 편평상피 암종 (Urakawa et al. Lab Invest. 2015 May;95(5):491-503), 췌장 암 (Wang et al. BMC Cancer. 2014 Aug 8;14:578), 폐 암 (Kadara et al. Cancer Biol Ther. 2006 May;5(5):518-22), 경구 암 (Schiegnitz et al. J Oral Pathol Med. 2015 Apr 16), 식도 암 (Fisher et al. Br J Cancer. 2015 Apr 14;112(8):1384-91), 고환 암 (Altena et al. PLoS One. 2015 Jan 15;10(1):e0115372) 및 간 암 (Si et al. PLoS One. 2011;6(5):e19967)은 상승된 GDF15 수준과 관련된다. 이의 수용체에 결합하기 위해 GDF15의 활성을 감소시킬 수 있는 제제는 따라서 종양학의 분야에서 매력적인 가능한 요법을 나타낼 것이다.

특히 GDF15와 CLPTM1 사이 상호작용이, 특히 GDF15의 상승된 수준과 관련되는 면역 기능의 조절에 관하여, 많은 상이한 암의 병리학에서 특정한 유의성일 수 있다고 생각된다. 그러나, 특정 암에서, 특히 골 암 또는 골에 다른 암의 전이에서, GDF15와 QRFPR 사이 상호작용이 유의성일 수 있다.

용어 "암"은, 양쪽 고형 및 비-고형 종양, 예를 들면 조혈 암을 포함하는, 임의의 악성, 비-악성 또는 전-악성 신생물을 포함하는 것으로 본 명세서에서 광범위하게 사용된다. 바디의 임의의 조직 또는 세포의 암을 포함하는, 임의의 공지된 암, 그리고 비제한적으로 상기 열거된 것을 포함하는, 상이한 암 유형이 예상된다. 특정 구현예에서, 그러나, 암은 직장, 결장, 또는 전립선 암이 아니다 (또는 전립선 또는 직장 암이 아니다). 또 다른 구현예에서 임의의 1종 이상의 유방, 자궁경부, 또는 자궁내막 암이 아니거나, 신경아교종, 유잉 육종 이외의 육종, 중피종 또는 혈액 세포 암이 아니다. 다른 구현예에서 상기 암은 포함된다. 우리 데이터는 유잉 육종이 GDF15의 높은 수준과 관련되는 것을 보여주는 것 같다 (참조 도 25). 상기 논의된 임의의 조합을 포함하여, 본 발명의 임의의 폴리펩타이드 및/또는 결합제는 사용될 수 있다. 따라서 폴리펩타이드는 QRFPR 및/또는 CLPTM1로부터 유래 또는 수득될 수 있고, 임의의 상기 폴리펩타이드는 임의의 결합제, 즉 QRFPR 및/또는 CLPTM1에 대한 결합제와 공동으로 사용될 수 있지만, 바람직한 특정 구현예에서 결합제는 CLPTM1에 결합할 수 있다.

특정한 구현예에서, 폴리펩타이드는 QRFPR로부터 수득 또는 유래될 수 있고 CLPTM1에 대한 결합제와 공동으로 사용될 수 있다. 대안적으로, CLPTM1로부터 수득된 또는 유래된 폴리펩타이드는 CLPTM1에 대한 결합제와 공동으로 사용될 수 있다.

암은 1차 또는 2차 암, 즉 미세전이를 포함하는, 바디에서 2차 부위에 전이되는 암일 수 있다.

암은 전립선 암, 방광 암, 다발성 골수종, 흑색종, 결장직장 암 (결장 암 및 직장 암 포함), 신장 암, 위 암, 유방 암, 난소 암, 자궁내막 암, 경구 편평상피 암종, 췌장 암, 폐 암, 경구 암, 식도 암, 고환 암 또는 간 암일 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 우리는 특히 QRFPR이, 양쪽 1차 암 및 전이, 특히 골에 전립선 암의 전이를 포함하는, 골의, 또는 상기에 연루된 다양한 암에서 발현될 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서, 암은 특히 골에 연루하는 암, 예를 들면 유잉 육종, 골육종, 또는 다발성 골수종, 또는 골에 2차 전립선 또는 다른 암 전이 또는 골 암일 수 있다

GDF15는 수많은 상이한 면역 세포, 예를 들어 자연 살해 세포 (NK-세포), 대식세포 및/또는 수지상 세포에 의해 제공된 면역 반응을 하향-조절할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, CLPTM1은, CD4 및 CD8 양성 T-림프구, CD14 양성 단핵구/대식세포, CD11c 양성 수지상 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는, 다양한 면역 세포에 의해 발현되는 것으로 나타났다. 본 발명에 근거를 이루는 작업에서 우리는 따라서 T-세포 및/또는 다른 림프구 하위-세트가 CLPTM1을 발현할 수 있다는 것을 보여주었다.

흥미롭게도, 다수의 CD14 양성 세포 (단핵구/대식세포)는 CLPTM1에 대하여 현저하게 양성이었다. GDF15는 대식세포 활성화를 억제하는 것으로 이전에 보고되어 있고, 대식세포 억제성 사이토카인 1 (MIC1)로서 또한 공지된다. GDF15에 의한 CLPTM1의 자극은 GSK3B의 증가된 인산화 및 감소된 면역 기능을 초래한다. CLPTM1의 GDF15 자극은 또한 본 발명으로 향하는 작업에서 NKG2D의 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌고, CLPTM1 결합제 (항체)를 이용하여 CLPTM1에 GDF15의 접근성 차단이 NKG2D의 수준이 감소되었던 정도로 감소되었다는 것이 밝혀졌다. NKG2D는 양쪽 NK-세포 및 T-세포에서 발현된다. NKG2D는 세포용해 기능, 예컨대 페르포린 및 그란자임 B 방출에 대하여 핵심 효과기 단백질이다. GDF15가 세포독성 세포내 NKG2D 수준을 감소시키는 (따라서 세포용해 기능 예컨대 페르포린 및 그란자임을 파괴하는) 것으로 나타남에 따라, 우리는 종양 유래된 GDF15가 세포용해 작용을 매개하기 위해 면역 효과기 세포 예컨대 NKG2D 양성 NK 및 T-세포의 수용력을 감소시키는 면역-종양학 적용에서 CLPTM1 결합제가 특정한 유용성일 수 있다는 것을 예상한다. 추가적으로, 우리는 TGFb 수용체 복합체 (TGFB1(ALK5)/TGFBRII)에 CLPTM1의 GDF15-유도된 근접의 억제가 면역 세포에 억제성인 상기 복합체를 통해 다운스트림 신호전달을 차단하기 위해 이로울 수 있다는 것을 예상한다.

종양 기질에서 또는 (미세전이를 포함하는) 전이의 부위에서 상승된 GDF15 수준은 암 세포에 의한 면역 시스템의 회피에 상당한 기전을 제공한다고 여겨된다. 본 발명의 결합제 및/또는 폴리펩타이드는 그러므로 GDF15의 면역억제 효과 예방 또는 감소에 유용성을 가질 수 있다.

따라서, 더욱 일반적으로 본 발명의 치료제는 GDF15에 의해 야기된 또는 상기에서 비롯한 면역억제, 또는 GDF15의 상승된 수준과 관련된 면역억제를 저해하는데 사용될 수 있다.

상기 면역억제는 특히 세포-매개된 세포독성 면역 반응의 억제일 수 있다. 따라서 면역억제는 1종 이상의 면역 세포, 예를 들면 대식세포, NK 세포, 수지상 세포, 중성구, 및/또는 T-세포의 감소된 활성에서 비롯한 면역억제일 수 있다.

더 구체적으로 면역억제는 암의 문맥에서 즉 암과 관련된 면역억제일 수 있다. 면역억제는 GDF15의 증가된 순환 수준, 또는 바람직한 특정 구현예에서, 암, 예를 들면 종양의 부위에서 GDF15의 상승된 국소 농도 때문일 수 있다.

특히, 본 발명의 결합제 및 폴리펩타이드는 암 세포에 의한 면역 회피 억제에서, 또는 암 세포에 의해 유도된 면역 내성 억제에서 유용성일 수 있다. GDF15와 QRFPR 또는 CLPTM1, 특히 CLPTM1 사이 상호작용을 차단하는 본 발명의 치료제는 암 세포에 의한 면역 회피 억제에서 유용성일 수 있다. 따라서, CLPTM1 및/또는 QRFPR로부터 수득된 또는 유래된 펩타이드, 및 CLPTM1 및/또는 QRFPR, 특히 CLPTM1에 결합할 수 있는 결합제는 이와 관련하여 특정한 유용성일 수 있다. 논의된 바와 같이 본 명세서에서 논의된 치료제의 임의의 조합은 사용될 수 있다.

면역 회피 억제에 의해, 본 발명의 치료제는 암을 공격하기 위해 대상체의 바디를 도울 수 있다. 따라서, 본 발명은 암에 대한 바디에서 면역 반응 촉진시킴 (또는 용이하게 함 또는 증가시킴 또는 어떤 식으로든 가능하게 함 또는 일조함)으로써 대상체의 바디에서 암의 감소 또는 무효화에 일조할 수 있다.

일 특정한 측면에서 치료제는 암의 확산 또는 전이를 억제시키는데 사용될 수 있다. 이것은 미세전이의 발생 억제, 또는 미세전이의 성장 또는 확산 억제를 포함할 수 있다. 전이는 바디의 임의의 일부에 임의의 암일 수 있다. 특정한 구현예에서 예를 들어 골에 포함하여, 전립선, 유방 또는 폐 암의 전이일 수 있다.

암의 치료에서 본 발명의 치료제는 다른 항-암 요법과, 예를 들면, 다른 면역치료적 또는 면역종양 제제 또는 화학치료제를 포함하는, 다른 항-암 제제와 조합 또는 공동으로 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 제제는 세포-기반 암 요법, 예를 들면 입양 세포 이식 요법과 및/또는 항체-기반 요법과 공동으로 사용될 수 있다.

특정한 구현예에서, 본 발명의 제제는 입양 세포 이식 요법, 일부 구현예에서 키메라 항원 수용체 (CAR)을 발현하도록 변형될 수 있는, 특히 NK-세포 또는 T-세포, 또는 암 세포의 표면에서 존재하는 항원에 대하여 특이성을 갖는, (즉 원상태 또는 이종성 포함) T-세포 수용체를 발현하도록 변형된 또는 발현하는 T-세포와 공동으로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 예를 들면 유전자 녹아웃, 유전자 녹다운 또는 유전자 결실에 의해, 변형되어 있지 않은 세포와 비교된 CLPTM1의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖도록 변형되는 세포독성 면역 세포를 제공한다.

따라서, 유전자 (즉 CLPTM1 단백질을 암호화하는 세포에서 서열)은 발현된 CLPTM1 단백질의 양, 예를 들어세포 표면에서 CLPTM1 수용체의 양, 및/또는 수용체 단백질의 활성을 감소시키도록 변형될 수 있다. 따라서, 수용체 단백질은 불활성화될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 원상태 뉴클레오타이드 서열 예를 들면 원상태 CLPTM1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 의한 유전자 서열 변형 및/또는 상기의 삽입 또는 대체/치환을 포함할 수 있다. 이것은 당해 기술에서 공지된 바와 같이 표준 돌연변이유발 기술 및/또는 상동성 치환에 의해 달성될 수 있다.

특정한 구현예에서, 세포는 T-세포 수용체를 발현하도록 변형된 또는 발현하는 T-세포 또는 CAR을 발현하도록 변형된 T-세포일 수 있다. 추가 구현예에서, 세포는, CAR을 발현하도록 선택적으로 변형된, NK 세포일 수 있다. 상기 변형된 세포는 암의 치료에서 또는 특정한 유용성일 수 있고, 따라서 일 구현예에서, 세포는 암 세포의 표면에서 항원에 대한 특이성을 갖는 CAR 또는 TCR을 포함할 것이다. 요법, 특히 암 요법에서 상기 세포의 용도, 뿐만 아니라 암 치료에서 분리, 순차 또는 동시 사용을 위하여, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 결합제인, 상기 세포 및 치료제를 포함하는 제제 (예를 들면 키트) 또는 조합된 생성물이 또한 제공된다. 따라서 암을 치료하는 본 발명의 방법, 또는 용도는 대상체 (특히 이를 필요로 하는 대상체)에 상기 변형된 세포독성 면역 세포 (즉 상기와 함께, 또는 조합으로 또는 공동으로) 및 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 결합제 투여를 포함할 수 있다. 세포 및 치료제 (폴리펩타이드 및/또는 결합제)는, 상기에 논의된 바와 같이, 예를 들면 별도의 제형으로, 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 키트는, 위에서 기재된 바와 같이, 폴리펩타이드 및/또는 결합제, 및 변형된 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 제제는 또한 면역 체크포인트를 표적하는 면역치료제, 즉 암의 치료에서 면역 체크포인트 억제제와 공동으로 사용될 수 있다. 체크포인트 단백질은 세포가 건강한 그리고 세포가 파괴되어야 하는 면역 시스템에 지시함으로써 체크로 면역 시스템을 유지시킨다. 체크포인트 단백질은 T-세포 활성화 예방에 의해 면역 시스템에서 "브레이크"로서 작용한다. 세포가 이의 표면에서 충분한 체크포인트 단백질을 갖지 않는다면 면역 시스템에 의해 파괴될 수 있다. 암 세포의 경우에서, 세포가 암성인 분자 신호전달이 있는 동안, 세포 표면에서 충분한 체크포인트 단백질이 있다면, 세포는 면역 반응을 모면할 수 있고, 체크포인트 단백질이 일부 암 면역요법에서 성공의 부족에 기여한다는 것이 추측되어 있다.

체크포인트 단백질의 최상의 공지된 예는 (프로그래밍된 사망 리간드 1용) PD-L1이다. PD-L1용 수용체는 PD-1이다. PD-L1은 건강한 세포 공격으로부터 T-세포를 예방한다. 암 세포는 보호성 기전으로서 PD-L1을 상향조절할 수 있다. PD-L1이 T-세포의 표면에서 PD-1 수용체를 활성화시키는 경우, T-세포는 자신을 파괴하도록 신호전달된다. T-세포가 암 세포를 선택적으로 공격하도록 프로그래밍되면, T-세포의 그 세트는 파괴될 것이고 암은 만연한다.

또 다른 체크포인트 단백질은 세포독성 T-림프구 항원-4, 또는 CTLA4이다. 일단 세포독성 T 세포가 활성이게 되면 항원-제시 세포에서 이의 상호간에 공유된 리간드, B7-1 및 B7-2를 위하여 공통자극 분자 CD28와 경쟁하는, 이의 표면에서 CTLA4를 발현시킨다. 상기 밸런스는 체크로 세포독성 활성을 유지하고, 그 동안 T 세포 기능을 자기-제한된 방식으로 진행시킨다.

다른 체크포인트 단백질은 하기를 포함한다: 공동자극 체크포인트 단백질인 CD-137 (4-1BB); 내성 T 세포에서 PD-1로 공발현된 CD4-관련된 억제성 수용체인, 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3, CD223); B7 상과 단백질 B7-H3 및 B7-H4; T 세포 단백질 TIM3; 및 세포 물질의 붕괴의 청소능 그리고 가공 동안 달리 발생할 과잉의 면역 활성화를 억제하는, 세포자멸사 동안 외부 구성원 표면에 전위되는 정상 세포내 인지질인 포스파티딜세린 (PS). PS의 외재화는 간접적으로 대식세포를 자극시켜, 수지상 세포( ell ) 항원 제시의 억제를 초래한다. PD-L1 같이, 외재화된 PS는 일부 종양 세포 및 종양-유래된 미세소포에 의해 비정상적으로 발현된다. 따라서, PS는 적응성 종양 면역력을 예방하기 위해 종양에 의해 개척되는 것으로 여겨진다.

임의의 이들 체크포인트 단백질을 표적 또는 억제할 수 있는 면역치료제는 "체크포인트 억제제"로서 공지된다.

(면역 체크포인트 조절물질, 또는 CPMs로서 또한 공지된) 체크포인트 억제제는 체크포인트 단백질의 유효성을 줄이도록 설계된다. 이상적으로 CPM은 그 동일한 시스템이 건강한 조직을 공격하도록 유발시킴 없이 면역 시스템에 암을 노출시켜야 한다.

몇몇의 체크포인트 억제제, 예를 들어 이로써 참고로 편입되는, Creelan (2014) Cancer Control 21:80-89에서 기재된 억제제는 공지되고, 암의 치료에서 본 발명의 제제와 공동으로 사용될 수 있다.

체크포인트 억제제의 예는 하기를 포함한다: 트레멜리무맙 (CP-675,206), CTLA-4에 대한 고 친화도를 가진 인간 IgG2 단클론성 항체; 이필리무맙 (MDX-010), CTLA-4에 대한 인간 IgG1 단클론성 항체; 니볼루맙 (BMS-936558), 본질적으로 검출가능한 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC)이 부족한 인간 단클론성 항-PD1 IgG4 항체; MK-3475 (예전에 람브롤리주맙), Fc-매개된 ADCC를 예방하도록 설계된 C228P에서 돌연변이를 함유하는 인간화된 IgG4 항-PD-1 항체; 우렐루맙 (BMS-663513), 완전 인간 IgG4 단클론성 항-CD137 항체; 항-LAG-3 단클론성 항체 (BMS-986016); 및 바비툭시맙 (키메라 3G4), PS에 대한 키메라 IgG3 항체. 이들 체크포인트 억제제 모두는 본 발명에서 사용될 수 있다.

대안적인 전략은 종양 세포 표면에서 PD-1용 리간드인, PD-L1을 억제하는 것이고, 그러므로 PD-L1의 억제제는 또한 본 발명의 제제, 예를 들어, MPDL3280A (RG7446), 인간 IgG1-카파 항-PD-L1 단클론성 항체와 공동으로 사용될 수 있다. MEDI4736은 또 다른 IgG1-카파 PD-L1 억제제이다.

또 다른 대안적인 접근법은, B7-DC-Fc 융합 단백질을 이용하여, PD-1 수용체를 경쟁적으로 차단하는 것이고, 상기 융합 단백질은 또한 그러므로 본 발명에서 사용될 수 있다.

추가 대안적인 접근법에서 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체에 대한 항체는 면역치료제로서 사용될 수 있다. 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR)은 NK 세포독성 활성을 하향조절하는 NK 세포에서 수용체이다. HLA 부류 I 대립유전자-특이적인 KIR 수용체는 세포용해 (CD56dimCD16+) NK 세포에서 발현되고, 반면에 CD56brightCD16- NK 서브셋은 이들 KIRs이 부족하다. 이들 라인을 따라, 억제성 KIRs는 종양주위 NK 세포 침윤물에서 선택적으로 발현되는 것 같고 따라서, PD-L1과 유사한, 종양에 의해 감금된 체크포인트 경로인 것 같다. 이와 같이, 항체를 이용한 특이적인 KIRs의 억제는 NK 세포의 지속된 생체내 활성화를 유발시킬 수 있다. 예를 들어, 리릴루맙 (IPH2102)는 KIR에 대한 완전 인간 단클론성 항체이고 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

암 항원을 인식하고 상기에 결합하는 임의의 적합한 항체는 또한 본 발명의 제제와 공동으로 사용될 수 있다. 치료 항체용 암 항원, 또는 표적의 예는 하기를 포함한다: 많은 "CD" 단백질, 예컨대 CD52, CD47, CD30, CD33, CD20, CD152 및 CD279; 성장 인자 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 성장 인자 수용체 예컨대 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 또는 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2).

상기 항원 또는 표적에 결합하는 몇몇의 항체는 공지되고 암의 치료를 위하여 승인되어 있고, 임의의 이들 항체는 본 발명의 제제와 공동으로 사용될 수 있다. 바람직한 항체는 고형 종양, 및 특히 변경된 ECM을 가진 것, 예컨대 유방, 난소 및 췌장 암 치료에서 유용성을 갖는 것이다.

공지된 및 승인된 항체는 하기를 포함한다: 알렘투주맙, 베바시주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 젬투주맙 오조가마이신, 헤르셉틴, 이브리투모맙 티욱세탄, 이필리무맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙 및 트라스투주맙.

알렘투주맙은 플루다라빈-불응성 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 피부 T-세포 림프종, 주변 T-세포 림프종 및 T-세포 전림프구성 백혈병의 치료를 위하여 지시된 항-CD52 인간화된 IgG1 단클론성 항체이다.

베바시주맙 (아바스틴)은 (접미사 없이 통상적으로 VEGF로서 지칭된) 혈관 내피 성장 인자-A (VEGF-A)에 결합하는 인간화된 IgG1 단클론성 항체이다. 베바시주맙은 VEGF에 결합하고 상기를 물리적으로 차단하여, 종양 혈관화에 대하여 결과를 갖는 수용체 활성화를 예방한다. 베바시주맙은 결장 암, 신장 암, 폐 암, 난소 암, 교모세포종 및 유방 암에 대하여 허가된다.

브렌툭시맙 베도틴은 호지킨 림프종 및 역형성 큰 세포 림프종 (ALCL)의 치료에서 사용된 제2 세대 키메라 IgG1 항체 약물 콘주게이트이다. 미세소관 붕괴에 의한 세포 분할을 예방하는 약물인, 모노메틸 아우리스타틴 E에 접합된 항체이다. 항체는 호지킨 림프종 및 ALCL 세포의 표면에서 고도로 발현되는 것으로 종종 발견된, CD30에 결합하고, 그 다음 약물이 항체로부터 탈착되고 이의 세포 효과를 발휘하는 경우 내재화된다. 세포 분할 예방은 프로그래밍된 세포 사망의 유도에 의해 암 세포를 사멸시킨다.

세툭시맙 (어비툭스)는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 세포외 도메인 (세포 외부 수용체의 일부)를 표적하는 키메라 IgG1 단클론성 항체이다. 결장직장 암 및 두경부 암의 치료에서 사용된다. 일단 리간드가 세포의 표면에서 EGFR에 결합하면, 신호전달 경로는 악성 특징과 관련되는 세포 내부에서 활성화된다. 이들은 암 세포 증식, 침습, 분화 및 암 줄기 세포 재생을 유발시키는 PI3K/AKT 및 KRAS/BRAF/MEK/ERK 경로를 포함한다. 세툭시맙은 리간드 결합을 경쟁적으로 억제시킴으로써 기능하여, 이로써 EGFR 활성화 및 차후의 세포 신호전달을 예방한다.

젬투주맙 오조가마이신은 세포독성 칼리키아마이신 유도체에 화학적으로 연결된 IgG4 항-CD33 항체의 "면역-콘주게이트"이고, 급성 골수 백혈병 (AML)의 치료를 위하여 사용될 수 있다.

이브리투모맙 티욱세탄 (제발린)은 방사선동위원소 이트륨-90 (90Y)를 결합시키는 킬레이트제에 화학적으로 연결된 쥣과 항-CD20 항체이다. B-세포의 종양인, 비-호지킨 림프종의 특이적 유형, 여포성 림프종을 치료하는데 사용된다.

이필리무맙 (예르보이)은 T-세포의 활성화를 부정적으로 조절하는데 역할을 갖는 표면 단백질 CTLA4를 결합하는 인간 IgG1 항체이다. CTLA4는 체크포인트 억제제의 문맥에서 아래 논의된다.

니모투주맙은 키메라 인간-마우스 항-EGFR 단클론성 항체이고 두경부내 편평상피 세포 암종 (SCCHN)에 대하여 승인되어 있다.

오파투무맙은 CD20에 결합하는 제2 세대 인간 IgG1 항체이다. CLL의 암성 세포가 일반적으로 CD20-발현 B-세포임에 따라 만성 림프구성 백혈병 (CLL)의 치료에서 사용된다. CD20 단백질의 큰 루프에 결합하는, 리툭시맙과 달리, 오파투무맙은 별도의 작은 루프에 결합한다.

파니투무맙 (벡티빅스)는 EGF 수용체에 결합하는 인간 IgG2 항체이다. 세툭시맙처럼, 수용체와 이의 리간드 사이 상호작용을 차단시킴으로써 수용체에 의한 세포 신호전달을 예방한다. 결장직장 암의 치료에서 사용된다.

리툭시맙은, 이의 모 항체 이브리투모맙으로부터 개발된, CD20에 대하여 특이적인 키메라 단클론성 IgG1 항체이다. 이브리투모맙과 같이, 리툭시맙은 B-세포상에서 존재하는 CD20을 표적한다. 이러한 이유로 암성 B-세포로부터 형성되는 특정 유형의 악성종양 치료에서 효과적이다. 이들은 공격성 및 무통성 림프종 예컨대 미만성 큰 B-세포 림프종 및 여포성 림프종, 및 백혈병 예컨대 B-세포 만성 림프구성 백혈병을 포함한다.

토시투모맙은 비-호지킨 림프종의 치료를 위하여 승인되었던 "벡사르"로서 공지된 방사성 요오드 131에 공유결합된 쥣과 IgG2a 항-CD20 항체이었지만, 시장에서 자발적으로 철수되었다.

트라스투주맙 (헤르셉틴)은 표피 성장 인자 수용체 2 단백질 (HER2)에 대하여 특이적인 단클론성 IgG1 인간화된 항체이다. 1998년에 FDA-승인을 받았고, 유방 암의 치료를 위하여 임상적으로 사용된다. HER-2는 막관통 티로신 키나제의 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 계열의 구성원이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서 면역치료제, 및 따라서 항암제는, 바람직하게는 난소 암의 치료를 위하여 트라스투주맙이다.

대안적인 구현예에서 항체는 항-CD47 항체, 즉 CD47 신호전달을 차단하는 항체이다. 그와 같은 항체는 세포 및 마우스에 관한 실험실 시험에서 광범위한 암 및 종양의 성장을 제거 또는 억제하는 것으로 밝혀졌다. CD47은 많은 암 세포에서 그리고 많은 건강한 세포에서 존재한다.

추가 대안적인 구현예에서 항체는 암 세포의 표면에서 발견된 탄수화물 분자에 대한 항체이다. 예로써, 그와 같은 항체는 항-GD2 항체일 수 있다. GD2는 신경교세포종, 망막모세포종, 흑색종, 소세포 폐 암, 뇌 종양, 골육종, 횡문근육종, 유잉 육종, 지방육종, 섬유육종, 평활근육종 및 다른 연조직 육종을 포함하는 암 세포의 많은 유형의 표면에서 발견된 강글리오사이드이다. 정상 조직의 표면에서 일반적으로 발현되지 않아서, 종양 및 감소된 독성에 대한 특이적인 작용을 허용하기 위한 면역요법으로 양호한 표적을 만든다. 추가 구현예에서 치료제는 골 장애의 치료 또는 예방에서 사용될 수 있다. 그와 같은 장애는, 상기에 논의된 바와 같이 양쪽 신생물성 장애 (즉 골의 또는 골을 연루하는 암), 및 비-신생물성 장애를 포함하는, 골의 또는 골을 연루하는 임의의 장애를 포함할 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이 수용체 QRFPR은 골아세포에서 발현되는 것으로 나타났고 QRFPR의 녹아웃은 파골세포의 수에서의 감소와 관련된다. 유잉 및 골육종으로부터 임상 물질내 QRFPR 발현의 관찰에 따라 골육종 U2OS 세포내 QRFPR의 수준은 또한 본원에서 검출 및 정량화되어 있고, GDF15로 자극에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 바람직한 구현예에서 결합제는 QRFPR에 결합할 수 있다. 폴리펩타이드는 어느 한쪽 수용체로부터 수득 또는 유래될 수 있지만 일 구현예에서 QRFPR로부터 수득 또는 유래된다.

특히, 골 장애는 골 흡수, 예를 들면 증가된, 과도한 또는 원치않는 골 흡수와 관련된 장애일 수 있다. 일 구현예에서 골 장애는 골다공증, 특히 연령 관련 골다공증일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 골 장애는 골감소증일 수 있다. 대상체는 임의의 인간 또는 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물 동물 대상체일 수 있다. 특정한 구현예에서, 대상체는 인간이지만, 다른 구현예에서 가정용, 가축, 농장, 동물원, 야생, 실험실 또는 스포츠 (예를 들면 경주) 동물, 예를 들면 영장류, 개, 고양이, 쥣과, 돼지, 소, 말 등일 수 있다.

상기에 기재된 바와 같이, GDF15는 QRFPR 및 CLPTM1에 독립적으로 결합한다. GDF15는 프로테아좀에 엑소좀 발산 및 엔도좀 표적화를 통해 세포 표면으로부터 QRFPR의 손실을 유도하는 것으로 밝혀졌고, GDF15는 TGF-β 수용체 복합체를 통해 GSKB의 인산화를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 세포 표면으로부터 QRFPR의 손실 측정에 의해 또는 GSKB가 인산화되는 정도 측정에 의해, 각각의 이들 수용체에 관하여 GDF15의 '활성', 즉 세포에 노출되는 경우 이의 생물학적 기능에 GDF15가 영향을 미칠 수 있는 정도를 측정하는 것이 그러므로 가능하다. GDF15의 활성을 감소시키는 (즉 이의 생물학적 기능의 유효화 또는 발휘로부터 GDF15를 예방하는) 본 발명의 결합제 또는 폴리펩타이드의 능력은 따라서, 특정한 결합제 또는 펩타이드가 GDF15의 활성을 감소시킬 수 있는지 여부 측정에 의해, 결정될 수 있다. 본 발명의 결합제 또는 폴리펩타이드는 따라서 바람직하게는 GDF 수용체에 또는 GDF15에 결합할 수 있을 것이고, 실질적으로 GDF15의 활성을 억제 또는 폐지할 수 있을 것이고, 즉 결합제 또는 폴리펩타이드의 부재하에 GDF15의 활성의 수준에 비교된 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만으로 GDF15의 활성을 감소시킬 수 있을 것이다. 더 바람직하게는, 결합제 또는 폴리펩타이드는 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 미만으로 GDF15의 활성을 감소시킬 것이고, 즉 결합제 또는 폴리펩타이드는 바람직하게는 효과적으로 GDF15의 활성을 제거할 수 있다.

결합제 및 단백질 또는 펩타이드에 더하여, 치료 조성물은 임의의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 지칭된 바와 같이 "약제학적으로 허용가능한"은 조성물의 다른 성분과 양립가능한 뿐만 아니라 수령체에 생리적으로 허용가능한 성분을 지칭한다. 조성물의 성질 및 담체 또는 부형제 물질, 복용량 등은 선택 및 요망된 투여 경로, pH, 온도 등에 따라 일상적인 방식으로 선택될 수 있다.

치료제의 복용량은 또한 표준 임상 실시에 따라 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 0.1-10 mg/kg의 용량, 예컨대 0.1-0.5 mg/kg, 0.1-1 mg/kg, 0.1-2 mg/kg, 0.1-5 mg/kg, 0.5-1 mg/kg, 0.5-2 mg/kg, 0.5-5 mg/kg, 0.5-10 mg/kg, 1-2 mg/kg, 1-5 mg/kg, 1-10 mg/kg, 2-5 mg/kg, 2-10 mg/kg 또는 5-10 mg/kg의 용량은 질환 진행까지, 또는 허용될 수 없는 독성이 관측되는 때까지 매일, 매주, 또는 매 10 일, 2 주, 3 주 또는 매월 투여될 수 있다.

마찬가지로 치료제는 임의의 편리한 또는 요망된 방식으로, 예를 들면 비경구로 또는 비-비경구로, 예를 들어 장관 투여에 의해, 예를 들면 (제제의 성질 및/또는 제형에 좌우되는) 경구로, 또는 정맥내, 피하, 근육내, 복강내 주사 또는 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여는, 예를 들면 치료될 병태, 제제 및/또는 제형 등의 성질에 의존하여 전신 또는 국부일 수 있다. 따라서, 예를 들어 제제는, 예를 들면 암의 부위 또는 위치에, 예를 들면 주입 또는 직접적인 주사에 의해 국소적으로 전달될 수 있다.

GDF15와 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1 사이 상호작용, 또는 수용체의 하나 또는 모두에 GDF15의 결합의 효과는 검출될 수 있고 그와 같은 검출 방법은 본 명세서에서 개시된 치료적 또는 예방적 방법용 동반 진단을 기준으로서 사용될 수 있다.

따라서, 이들의 상호작용 및/또는 효과의 검출은 대상체가 본 발명에 따라 요법 또는 예방 (방지)가 필요할 수 있는 것, 또는 있는지 여부를 검출 또는 결정하는데 사용될 수 있거나, 예를 들면 치료의 과정 동안 또는 마지막에, 요법 또는 예방으로부터, 또는 상기를 모니터링 또는 평가하는데 이로울 수 있다. 따라서 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 GDF15의 상호작용의 존재, 또는 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1에서 GDF15의 검출가능한 효과의 존재는 본 발명에 따라 요법 또는 예방의 투여를 위하여, 또는 요법 또는 예방의 효과를 모니터링 또는 평가하기 위해 바이오마커, 예를 들면 예측의 바이오마커로서 사용될 수 있다. 또한, 이들의 상호작용 및/또는 효과 검출에 의해, 대상체가 상승된 GDF15 수준과 관련된 병태, 예를 들면, 기본적인 골 암 또는 골에 전이를 포함하는, 암, 특히 골 암을 갖는지가 결정 또는 검출될 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가 측면은, 특히 본 발명에 따른 치료제 (즉 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 GDF15의 상호작용을 억제시킬 수 있는 폴리펩타이드 및/또는 결합제, 예를 들면 본 명세서에서 한정된 바와 같은 제제)의 투여에 의해, 요법 또는 예방이 필요한 대상체의 검출 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에서 GDGF15와 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1 사이 상호작용 및/또는 그와 같은 상호작용의 효과 검출을 포함한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 치료제 (즉 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 GDF15의 상호작용을 억제시킬 수 있는 폴리펩타이드 및/또는 결합제, 예를 들면 본 명세서에서 한정된 바와 같은 제제)의 대상체에 투여에 의한 요법 또는 예방 방법의 평가 또는 모니터링 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에서 그와 같은 상호작용의 효과 검출 및/또는 모니터링을 포함한다.

더욱 추가 측면은 GDF15의 상승된 수준과 관련된 병태를 갖는, 또는 상기 발생의 위험에 처한 대상체의 검출 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 대상체에서 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 GDF15의 상호작용, 또는 상기 상호작용의 효과 검출을 포함한다.

이들의 상호작용 또는 효과는 생체내 (즉 대상체에서) 또는 시험관내 검출될 수 있다. 즉, 이들의 상호작용 또는 효과는 대상체의 바디에서 또는, 바람직하게는, 상기 대상체로부터 샘플에서 검출될 수 있다. 샘플은 임의의 적절한 임상 샘플일 수 있다. 더욱 특히 샘플은 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1을 발현하는 세포를 포함하는 샘플일 수 있다. 샘플은 따라서 대상체로부터 임의의 세포-함유 임상 샘플일 수 있다. 조직 또는 체액, 예를 들면 조직 생검 샘플, 혈액 또는 혈액-유래된 샘플 (예를 들면 혈장, 혈청, 또는 이들의 분획), 소변, CSF, 타액, 대변, 또는 면봉, 세정액 또는 세척액 등의 샘플일 수 있다.

상호작용은 2 이상의 결합 파트너 사이 결합 또는 상호작용 검출을 위하여 당해 기술에서 공지된 임의의 수단에 의해 검출될 수 있다. 따라서 상기 방법은 GDF15와 수용체 사이 결합 검출에 기반된 임의의 방법일 수 있다. 예를 들어 근접 검정-기반 방법, 및 특히 GDF15와 수용체 사이 항체-기반 결합 파트너 이용에 기반된 근접 검정일 수 있다. 근접 검정은 당해 기술에서 잘 알려지고 문헌에서 널리 기재된다. (예를 들면 중간체 피분석물-결합 항체 또는 피분석물용 다른 결합 파트너를 통해) 피분석물에 직접적으로 또는 간접적으로 결합할 수 있는 결합 파트너를 포함하는 각각의 근접 프로브의 쌍 (또는 초과) 그리고 프로브가 근접하여 결합되어 있는 경우 (예를 들면 상호작용 쌍의 파트너가 함께 상호작용 또는 결합하여 있는 경우) 검출가능한 신호를 생성하기 위해 다른 근접 프로브(들)의 핵산 도메인과 상호작용하는 핵산 도메인에 기반된 근접 검정은 개발되어 왔고 스웨덴, 웁살라의 Olink AB에 의해 상업화되어 있다. 근접 프로브의 핵산 도메인 사이 상호작용은 핵산 결찰 및/또는 확장 반응을 포함할 수 있고 결찰 및/또는 확장 생성물 검출에 의해 검출될 수 있다. 핵산 도메인 자체는 상호작용할 (예를 들면 함께 결찰될) 수 있거나, 이들은 1종 이상의 첨가된 올리고뉴클레오타이드로부터 결찰 및/또는 확장 생성물의 형성을 본뜰 수 있다. 세포 또는 조직 샘플에서 원 위치 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있는 원 위치 근접 결찰 검정 (PLA)이 특히 언급될 수 있다. 그와 같은 검정은 Olink AB에 의해 개발되어 있고 Duolink® 브랜드명하에 시판된다. 근접 검정은 US 6878515, US 7306904, WO 2007/107743, WO/EP2012/051474 및 WO2012/152942에 기재된다.

GDF15와 수용체 사이 결합의 추가 검출 방법은 면역검정, 그와 같은 효소-결합 면역검정 (ELISA), 방사선면역검정 (RIA) 또는 면역-PCR을 포함할 수 있다.

QRFPR 또는 CLPTM1에 결합하는 GDF의 다양한 효과는 상기 기재되고 임의의 이들은 검출될 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에서 QRFPR-양성 엑소좀의 생성은 검출될 수 있다. QRFPR-양성 엑소좀은, 예를 들어, 세포로부터 수득된 조건화된 배지에서, 예를 들면 웨스턴 블랏에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, QRFPR-양성 엑소좀은 현미경검사, 예를 들면 형광 또는 전자 현미경검사에 의해 검출될 수 있다. QRFPR-양성 엑소좀과 GDF15의 상호작용은 또한, 예를 들면 상기 언급된 임의의 근접-기반 검출 검정에 의해 검출될 수 있다. 특히, 원 위치 PLA는 사용될 수 있다. 추가 바람직한 구현예에서, GDF15에 의해 CLPTM1의 활성화를 통해 생성된, 인산화된 GSK3b는 검출될 수 있다. 일 구현예에서, 이것은, 예를 들면 GSK3b에 결합할 수 있는 제1 프로브 및 포스페이트 기에 결합할 수 있는 제2 프로브 이용에 의해 근접-기반 검출 검정을 이용하여 실시될 수 있다. 일 구현예에서, 검출은 PLA에 의해, 특히 원 위치 PLA에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은, 하기인, 하기 실시예 및 도를 통해 더욱 양호하게 이해될 수 있다:
도 1은 QRFPR을 포함하는 엑소좀이 GDF15에 노출된 세포에 의해 방출되는 것을 보여준다. A) GDF15에 노출된 MCF-7 유방 암 세포로부터 수득된 조건화된 배지로부터 수득된 엑소좀의 전자 현미경사진. B) MCF-7 세포로부터 조건화된 배지로부터 수득된 엑소좀의 웨스턴 블랏 - QRFPR은 49 kDa에서 단일 밴드로서 검출된다. GDF15에 노출된 세포는 GDF15에 노출되어 있지 않은 세포보다 조건화된 배지에서 QRFPR의 더 높은 수준을 보여주었다.
도 2는 세포 표면에서 GFD15-QRFPR 복합체를 입증한다. A-B) MCF-7 세포의 표면에서 GDF15-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출. A) 설린닥 설파이드에 노출 이후 세포. siRNA 대조군 (스크램블드 RNA)으로 처리된 세포. B) 세포에서 존재하는 QRFPR의 수준을 감소시키기 위해 QRFPR siRNA로 치료 및 설린닥 설파이드에 노출 이후 세포.
도 3은 GDF15 자극이 세포 표면에서 ACTRIIB-QRFPR 복합체의 수준을 감소시키는 것, 그리고 초기 엔도좀 항원 1 (EEA1)이 GDF15에 의해 QRFPR에 동원되는 것을 보여준다. A-B) MCF-7 세포의 표면에서 ACTRIIB-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출. 37℃에서 20 분 동안 GDF15로 세포의 자극은 복합체의 표면 수준을 감소시켰다. C-D) MCF-7 세포의 표면에서 QRFPR-EEA1 복합체의 원 위치 PLA 검출. 37℃에서 5 분 동안 GDF15로 세포의 자극은 QRFPR에 EEA1의 동원을 초래하였다.
도 4는 GDF15 자극이 세포 표면에서 CD9-QRFPR 복합체의 형성을 초래한다는 것을 보여준다. A-D) MCF-7 세포의 표면에서 CD9-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출. A) & C) 무첨가된 GDF15를 가진 음성 대조군 세포. B) & D) 37℃에서 30 분 동안 GDF15에 노출 이후 세포. CD9-QRFPR 복합체는 30 분 동안 GDF15로 자극된 세포에서 더 높은 수준으로 검출된다.
도 5는 GDF15 자극이 Rab11-QRFPR 이중-양성 엔도좀의 형성을 초래한다는 것을 보여준다. A-D) MCF-7 세포내 Rab11-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출. A) & C) 무첨가된 GDF15를 가진 음성 대조군 세포. B) & D) GDF15에 노출 이후 세포. Rab11-QRFPR 복합체는 GDF15로 자극된 세포에서 더 높은 수준으로 검출된다.
도 6은 GDF15 자극이 세포내 QRFPR의 수준을 감소시키고 프로테아좀 열화를 위하여 QRFPR을 표적한다는 것을 보여준다. A-D) 세포 표면에서 QRFPR의 검출. A) 무첨가된 GDF15를 가진 대조군 세포. B) GDF15 o/n에 노출 이후 세포. C) 프로테아좀 억제제 MG132 o/n으로 처리된 대조군 세포. D) 프로테아좀 억제제 MG132의 존재하에, GDF15에 노출 o/n 이후 세포. QRFPR의 수준은 MG132 (B)의 부재하에 GDF15에 노출 이후 감소되지만, QRFPR의 수준은 MG132의 존재하에 GDF15에 의해 영향받지 않아, GDF15에 의해 유도된 QRFPR의 열화가 차단된다.
도 7은 GDF15 자극이 Rab4-QRFPR 이중-양성 엔도좀의 형성을 초래한다는 것을 보여준다. A) GDF15에 세포의 노출 이후 Rab4-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출. B) 세포가 QRFPR의 세포외 도메인에 결합하는 항체로 사전-인큐베이션되었던, GDF15에 세포의 노출 이후 Rab4-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출. 차단 항체로 사전-인큐베이션된 세포에서 검출된 Rab4-QRFPR 복합체의 수준은 감소된다.
도 8은 QRFPR 및 CLPTM1로부터 유래된 펩타이드가 GDF15와 상호작용할 수 있다는 것을 보여준다. A) QRFPR 및 CLPTM1의 세포외 도메인으로부터 바이오틴-표지된 펩타이드는 스트렙타비딘-아가로스 비드에서 고정화되었고 광범위한 세정 이후 GDF15와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. B) QRFPR 및 CLPTM1의 세포외 도메인으로부터 유래된 펩타이드를 포함하는 GST 융합 단백질은 GDF15로 인큐베이션되었다. 이들 펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 GDF15와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다.
도 9는 QRFPR의 세포외 루프로부터 펩타이드가 QRFPR의 GDF15 매개된 엔도조말 축적을 차단하는데 충분하다는 것을 보여준다. A-D) GDF15에 MCF7 세포의 노출 이후 Rab11-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출. A) + Ctrl 펩타이드. B) + QRFPR 세포외 N-말단 펩타이드. C-D) +QRFPR 세포외 루프3 (도메인 4) 펩타이드. Rab11-QRFPR 복합체의 수준은 QRFPR의 세포외 루프3으로부터 펩타이드에 의해 감소된다. E) U2OS 골육종 세포에서 QRFPR의 원 위치 PLA 검출. QRFPR의 세포외 루프 3으로부터 펩타이드가 GDF15에 노출되어 있지 않은 대조군 세포와 동일한 수준으로 세포 표면에서 검출된 QRFPR의 수준을 회복할 수 있다는 것을 나타내는 막대 그래프.
도 10은 QRFPR의 세포외 루프로부터 펩타이드가, 이의 내인성 효능제 P518에 의한 QRFPR의 활성화에 영향 없이, 세포 표면에서 QRFPR 수준에 관해 GDF15의 효과를 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다. A-C) 세포 표면에서 QRFPR의 원 위치 검출. A) 무첨가된 GDF15를 가진 음성 대조군 세포. B) GDF15에 노출 이후 세포. C) QRFPR의 세포외 도메인 4로부터 유래된 GDF15 + 합성 펩타이드 GEKEYDDVTIK에 노출 이후 세포. 펩타이드는 세포 표면으로부터 QRFPR의 제거를 역전시켰다. D-F) 세포 표면에서 ACTRIIB의 원 위치 PLA 검출. D) 무첨가된 P518을 가진 대조군 세포. E) P518에 노출 이후 세포. F) 125 몰 과잉으로 QRFPR의 세포외 도메인 4로부터 유래된 P518 + 합성 펩타이드 GEKEYDDVTIK에 노출 이후 세포. 세포 표면에서 ACTRIIB의 수준을 증가시키는 P518의 능력은 펩타이드에 의해 영향받지 않았다.
도 11은 QRFPR의 세포외 도메인을 표적하는 항체가 GDF15-유도된 세포내이입을 예방할 수 있다는 것을 보여준다. A-C) Rab4-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출. A) 무첨가된 GDF15를 가진 음성 대조군 세포. B) GDF15에 노출 이후 세포. C) QRFPR의 세포외 도메인을 표적하는 항체로 사전-인큐베이션 이후 GDF15에 노출 이후 세포.
도 12는 펩타이드 어레이에서 결합을 측정하는 GDF15에 결합을 위하여 요구되는 QRFPR의 제3 세포외 도메인 내에서 잔기를 확인하기 위한 펩타이드 스크린의 조합된 결과를 보여준다. A) 고정화된 펩타이드에 GDF15의 결합의 결과. B) 펩타이드 어레이에서 시험된 펩타이드의 정렬. 밑줄친 잔기는 알라닌 또는 이중-치환 (AA)에 치환된 경우 결합에서의 감소를 나타낸다. 스크린에서 사용된 펩타이드용 서열식별번호가 보여진다.
도 13은 일련의 펩타이드에 항체의 결합 측정에 의해 QRFPR의 세포외 도메인을 표적하는 다클론성 항체의 에피토프의 확인을 보여준다. A) 고정화된 펩타이드에 pAb 결합의 결과. B) 리간드 결합 부위의 위치에 비하여 pAb의 에피토프를 나타내는 결합 결과의 요약. 항체 중 하나의 에피토프는 리간드 결합 부위와 양호하게 중첩한다. 스크린에서 사용된 아미노산의 서열은 실시예 8에서 보여진다.
도 14는 CLPTM1을 발현하는 NK 세포의 GDF15 치료가 CLPTM1-TGFBRI 복합체의 수준을 증가시킨다는 것을 보여준다. A-B) CLPTM1-TGFBRI 복합체의 원 위치 PLA 검출. A) 무첨가된 GDF15를 가진 음성 대조군 세포. B) GDF15에 노출 이후 세포. CLPTM1-TGFBR1 복합체의 수준은 GDF15에 반응하여 증가한다.
도 15는 CLPTM1을 발현하는 NK 세포의 GDF15 치료가 CLPTM1-TGFBRII 복합체의 수준을 증가시킨다는 것을 보여준다. A-B) CLPTM1-TGFBRII 복합체의 원 위치 PLA 검출. A) 무첨가된 GDF15를 가진 음성 대조군 세포. B) GDF15에 노출 이후 세포. CLPTM1-TGFBRII 복합체의 수준은 GDF15에 반응하여 증가한다.
도 16은 CLPTM1을 표적하는 단클론성 항체가 NK-세포에서 GDF15와 CLPTM1 사이 상호작용을 차단할 수 있다는 것을 보여준다. A-C) 한 쌍의 근접 프로브를 이용하는 인산화된 GSK3b (GSK3b-p(9/21)의 원 위치 PLA 검출 A) 무첨가된 GDF15를 가진 음성 대조군 세포. B) GDF15 및 대조군 항체에 노출 이후 세포. C) CLPTM1의 세포외 도메인을 표적하는 단클론성 항체로 사전-인큐베이션 이후 GDF15에 노출 이후 세포 D) 인산화된 GSKb (p-GSKb)의 수준을 나타내는 웨스턴 블랏. 레인 1 - 무 GDF15. 레인 2 - GDF15 stim+ ctrl ab. 레인 3 GDF15 stim + mAb 마우스 (원 위치 PLA 실험에서 사용된 항체). 마우스 mAb 항체는 GDF15에 노출된 세포에서 p-GSKb의 수준을 감소시킬 수 있다.
도 17은 펩타이드 어레이에서 결합을 측정하는 GDF15에 결합을 위하여 요구되는 CLPTM1의 세포외 도메인 내에서 잔기를 확인하기 위해 펩타이드 스크린의 조합된 결과를 보여준다. 고정화된 펩타이드에 GDF15의 결합의 결과는 보여진다.
도 18은 일련의 펩타이드에 항체의 결합을 측정함으로써 QRFPR의 세포외 도메인을 표적하는 단클론성 항체의 에피토프의 확인을 보여준다. A) 고정화된 펩타이드에 mAb 결합의 결과. B) 리간드 결합 부위의 위치에 비하여 mAb의 에피토프를 나타내는 결합 결과의 요약. 항체 중 하나의 에피토프는 리간드 결합 부위로 양호하게 중첩한다.
도 19는 면역 시스템의 세포가 CLPTM1을 발현한다는 것을 보여준다. A) SSC-A 및 Alexa-488 채널에서 유세포측정에 의해 검출된 CD4+ T-림프구. 좌측 - 아이소타입 대조군. 중간 - 0.3 μg 항-CLPTM1-Alexa. 우측 - 3 μg 항-CLPTM1-Alexa. B) SSC-A 및 Alexa-488 채널에서 유세포측정에 의해 검출된 CD8+ T-림프구. 좌측 - 아이소타입 대조군. 중간 - 0.3 μg 항-CLPTM1-Alexa. 우측 - 3 μg 항-CLPTM1-Alexa. C) SSC-A 및 Alexa-488 채널에서 유세포측정에 의해 검출된 CD45+/CD3+ (비-T-림프구). 좌측 - 아이소타입 대조군. 우측 - 항-CLPTM1-Alexa. CLPTM1 발현은 양쪽 CD4+ 및 CD8+ T-림프구에서 그리고 CD45+/CD3+ 비-T-세포에서 검출된다.
도 20은 면역 시스템의 세포가 CLPTM1을 발현한다는 것을 보여준다. A) SSC-A 및 Alexa-488 채널에서 유세포측정에 의해 검출된 CD14+ 단핵구/대식세포. 좌측 - 아이소타입 대조군. 중간 - 0.3 μg 항-CLPTM1-Alexa. 우측 - 3 μg 항-CLPTM1-Alexa B) SSC-A 및 Alexa-488 채널에서 유세포측정에 의해 검출된 CD11c+ 수지상 세포. 좌측 - 아이소타입 대조군. 중간 - 0.3 μg 항-CLPTM1-Alexa. 우측 - 3 μg 항-CLPTM1-Alexa.
도 21은 CLPTM1을 표적하는 단클론성 항체가 NK-세포에서 GDF15와 CLPTM1 사이 상호작용을 차단할 수 있고, GDF15에 의해 NKG2D의 하향-조절을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. A-B NK 세포에서 NKG2D의 검출. A) GDF15에 노출 이후 세포. B) CLPTM1의 세포외 도메인을 표적하는 항체로 사전-인큐베이션 이후 GDF15에 노출 이후 세포.
도 22는 CLPTM1-GDF15 복합체가 폐 편평상피 세포 암종 전이에서 발견된다는 것을 보여준다. CLPTM1과 GDF15 사이 상호작용은 화살표로 지시된다. 상기 상호작용은 면역 시스템의 CD3+ 세포로 공-국재화하는 것으로 밝혀져서, CLPTM1이 면역 기능 조절에서 중요할 수 있다는 것을 나타냈다.
도 23은 GDF15-QRFPR 복합체의 상승된 수준이 골에 전립선 암 미세전이에서 발견된다는 것을 보여준다. 골에 전립선 미세전이에서 GDF15-QRFPR 복합체의 원 위 치 PLA 검출은 특유의 서명이 골을 침윤하는 전립선 암 미세전이의 경계에서 발견된다는 것을 나타낸다.
도 24는 GDF15-QRFPR 복합체의 상승된 수준이 골육종 및 전립선 골 전이에서 발견된다는 것을 보여준다. A-B) 골의 전립선 미세전이에서 GDF15-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출은 GDF15-QRFPR 복합체의 상승된 수준이 골을 침윤하는 전립선 미세전이의 경계에서 발견된다는 것을 나타낸다. C) 1차 전립선 암에서 GDF15-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출. 1차 전립선 암에서 GDF15-QRFPR 복합체의 수준은 감소되었다. D) 1차 골육종에서 GDF15-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출은 GDF15-QRFPR 복합체의 상승된 수준이 1차 골 암에서 발견될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 25는 GDF15-QRFPR 복합체의 상승된 수준이 유잉 육종에서 발견된다는 것을 보여준다. A) 1차 골 암에서 GDF15-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출은 GDF15-QRFPR 복합체의 상승된 수준이 1차 골 암에서 발견될 수 있다는 것을 나타낸다. B) 유잉 육종에 인접한 조직 (QRFPR에 대하여 분석된 일부 (A)의 슬라이드)에서 GDF15-CLPTM1 복합체의 원 위치 검출. 복합체의 검출은 발견되지 않아, CLPTM1이 존재하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 26은 GDF15-QRFPR 복합체의 상승된 수준이 악성 골수종에서 발견된다는 것을 보여준다. A) 골수종에서 GDF15-QRFPR 복합체의 원 위치 PLA 검출은 GDF15-QRFPR 복합체의 상승된 수준이 골수종에서 발견될 수 있다는 것을 나타낸다. B) 골수종에 인접한 조직 (QRFPR에 대하여 분석된 일부 (A)의 슬라이드)에서 GDF15-CLPTM1 복합체의 원 위치 검출. 복합체의 검출은 발견되지 않아, CLPTM1이 존재하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 27은 QRFPR 및 CLPTM1로부터 유래된 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 융합 단백질이 엄격한 세정 조건을 가진 풀-다운 검정에서 GDF15와 상호작용한다는 것을 보여준다. AP5 - QRFPR 폴리펩타이드, AP2 -CLPTM1 폴리펩타이드, AP1 - 대조군 폴리펩타이드, AP0 - 음성 대조군.
도 28은 LPS-자극된 CD14+ 면역 세포에서 사이토카인의 분비에 관한 항-CLPTM1 항체의 효과를 보여준다. 사이토카인은 LPS의 존재하에 분비되고, 분비는 GDF15와 접촉된 세포에서 감소된다. 항-CLPTM1 항체는 IL12 (도 28a) 및 TNF (도 28b)를 분비하는 능력을 회복시킨다.
도 29는 LPS-자극된 CD14+ 면역 세포에서 사이토카인의 분비에 관한 CLPTM1 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 융합 단백질의 효과를 보여준다. 사이토카인은 LPS의 존재하에 분비되고, 분비는 GDF15와 접촉된 세포에서 감소된다. CLPTM1 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 융합 단백질은 IL12 (도 29a) 및 TNF (도 29b)를 분비하는 능력을 회복시킨다.
도 30은 LPS-자극된 CD14+ 면역 세포에서 IFNγ의 분비에 관한 CLPTM1 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 융합 단백질의 효과를 보여준다. 분비는 LPS의 존재 또는 부재하에 검출되지 않았지만, IFN γ는 IL12를 분비하는 능력을 회복시키는 CLPTM1 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 융합 단백질과 접촉된 세포에서 검출된다.
도 31은 CLPTM1 유래된 펩타이드에 GDF15의 결합을 보여준다. 서열 번호: 250-273에서 제시된 바와 같은 아미노산을 갖는 폴리펩타이드는 스트렙타비딘-코팅된 웰에서 고정화되었고 각각의 펩타이드에 GDF15의 결합은 측정되었다.
도 32는 CLPTM1에 관한 다클론성 토끼 항-CLPTM1 항체 (Bioss)의 에피토프의 맵핑을 보여준다. 2개의 별도의 에피토프는 확인되었다. 에피토프 1 확인은 도 33A에서 보여지고, 에피토프 2 확인은 도 33B에서 보여진다.

실시예

실시예 1 - 탠덤 친화도 정제-질량 분광법

우리는 동일한 친화도 태그를 가진 일련의 상이한 단백질을 이용하여 단백질-단백질 상호작용 포착 검정을 설계하였고, 상호작용하는 단백질에 대하여 스크리닝하기 위해 GDF15를 포함하였다. GDF15는, 다양한 암, 그리고 상호작용하는 단백질 및 수용체(들)에 관한 과학 문헌에서 갭을 포함하는, 인간 병리학에서 중요한 역할 때문에 패널에서 포함되도록 선택되었다.

다중 베이트 (bait) 단백질의 설계 및 작제

Bioinformatic (SSPRO, RASMOL) 분석은 베이트에서 소수성 아미노산의 존재 및 공지된 2차 구조 요소의 파괴 회피를 배제하기 위해 실시되었다. 베이트 삽입물은 플라스미드 DNA로부터 증폭된 PCR이었고 겐타마이신 선택을 허용하였던 진핵 발현 벡터 속에 삽입되었다.

발현 벡터는 세포를 형질감염시키는데 사용되었고 과발현 안정 세포주는, GDF15를 포함하는, 일련의 베이트 단백질에 대하여 병렬적으로 발생되었다.

충분한 물질로 차후의 질량 분광분석법 분석을 하기 위하여 충분한 양 (10⁸ 세포)로 세포의 팽창 및 클론 선택 이후, 조건화된 배지는 벡터에서 프레임내 암호화된 태그에 대해 친화도 정제 처리되었다 (그리고 따라서, GDF15를 포함하는, 베이트 단백질에 융합으로서 표현되었다. 따라서, 베이트 단백질은, 정확한 폴딩의 개연성을 증가시키는, 진핵생물 숙주에서 발현되었다. 또한, 상기에 의해 작제된 "인공" 자가분비/주변분비 루프는 다양한 방식, 예컨대 태그된 베이트로 공-정제를 통해 후속적으로 포착된 수용체를 함유하는 엑소좀의 방출에서 베이트에 반응하기 위해 숙주 세포의 베이트 리간드 자극을 허용하였다.

요약하면, 별도의 배양물로부터 태그된 단백질 예컨대 GDF15는 친화도 매트릭스를 이용하여 포착되었고, 세제를 함유하고 염 농도를 증가시키는 완충액으로 광범위하게 세정된 다음 친화도 매트릭스로부터 용출되었고 질량 분광분석법 분석을 위하여 차후 가공되었다. GDF15에 결합되었던 단백질은 소화되었고, MS 분석에 적용되었다. 단백질은 MS 데이터를 바탕으로 확인되었다.

다중 실행은, 다양한 베이트로 실시되었다. 특이적인 베이트를 단지 다양화하는, 동일한 태그의 용도는 특이적인 베이트로 독특하게 공-정제하는 단백질의 확인을 허용한다. 소프트웨어 스크립트는 개별적인 베이트에 대하여 독특한 히트의 확인을 용이하게 하기 위해 기록되었다.

이들 다중 실행으로부터, 우리는 GDF15 베이트로 독특하게 공-정제하기 위해 QRFPR 및 CLPTM1을 확인하였다.

안정 세포주의 발생

안정 세포주는 수확 이전 확립되었고 팽창되었다. 세포는 무혈청 배지로 세정되었고, 무혈청 배지에서 20 시간 동안 성장하도록 한다.

단백질의 온-필터 트립신 소화

500 mL 샘플의 분취액은 3 kDa 필터 (Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 Wisniewski et al (Wisniewski et al., 2009)의 프로토콜에 따라 본질적으로 온-필터 소화되었다. 트립신 소화는 어둠 속에 밤새 37℃에서 수행되었다. 샘플은 그 다음 원심분리되어 여과물에서 트립신 펩타이드를 수집하였고 그 동안 보전물에서 미소화된 단백질 및 트립신을 보유하였다. 50% ACN, 1% HAc의 100 μl의 추가의 용적은 첨가되었고 필터는 10분 동안 회전되었고 제1 트립신 펩타이드 여과물로 풀링되었다. 마지막으로, 수집된 여과물은 Speedvac 시스템 ISS110 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 냉동건조되었고 nanoLC-MS/MS 확인에 앞서 10 μl 0.1% TFA에 재용해되었다.

단백질 확인용 나노 LC-MS/MS

단백질 확인 실험은 나노-전자분무 이온화 (ESI) 이온 공급원)이 구비된 7 T 하이브리드 LTQ FT 질량 분광분석기 (ThermoFisher Scientific, Bremen, Germany)를 이용하여 수행되었다. 온라인 nanoLC 분리는 Agilent 1100 나노유동 시스템 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)를 이용하여 수행되었다. 펩타이드 분리는 인하우스 팩킹된 15-cm 융합된 실리카 에미터 (75-μm 내부 직경, 375-μm 외부 직경)에서 수행되었다. 에미터는 50-60 바에서 작동된 가압된 팩킹 디바이스를 이용하여 역상, 완전 단부-캡핑된 Reprosil-Pur C₁₈-AQ 3 μm 수지 (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Germany)의 메탄올 슬러리로 팩킹되었다. 분리는 이동상 A (0.5% 아세트산을 가진 물) 및 B (89.5% 아세토니트릴, 10% 물, 및 0.5% 아세트산)으로 200 nL/분의 유동으로 수행되었다. 2% B 내지 50% B로부터 100-분 구배 그 다음 5분 동안 98% B로 세정 단계는 사용되었다.

베이트 단백질은, 친화도 태그 및 링커를 공유하는, 동일한 벡터 작제물로부터 생산되었다. 우리는 G418에 의해 선택된 안정 세포로부터 제조된 조건화된 배지에서 상호작용하는 단백질에 대하여 스크리닝하기 위해 이들 베이트를 사용하였고, 질량 분광분석법 (MS)를 통해 상호작용하는 단백질을 확인하였다. 각각의 베이트에 대하여 특이적이었던 히트별로 분류하기 위해 우리는 인하우스 소프트웨어; Data Drudger를 개발하였다. 상기 분석으로부터 우리는 GDF15가 베이트로서 사용되었던 경우만 QRFPR로부터 트립신 펩타이드를 확인하였다. 우리의 초기 TAP-MS 스크린에서, 제2 단백질은 또한 GDF15 베이트로 공-정제하는 것으로 밝혀졌다. 상기 단백질은 구순열 및 입천장 막관통 단백질 1 (CLPTM1)로서 확인되었다.

실시예 2 - 조건화된 배지로부터 QRFPR -함유 엑소좀의 정제.

엑소좀 단리

컨디셔닝된 세포 배양 배지는 세포를 펠렛화하기 위해 3,000 x g에서 5분 동안 그리고 그 다음 세포 및 세포 잔해를 추가로 제거하기 위해 10,000 x g에서 10분 동안 순차적으로 원심분리되었다. 상청액은 그 다음 0.45 μm 필터를 통해 여과되었고 그 다음 마지막으로 4℃에서 2시간 동안 100,000 x g에서 펠렛화되었다. 펠렛화된 엑소좀은 PBS에서 재현탁되었고 프로테아제 억제제 (완전한 미니, Roche)는 첨가되었다. 샘플은 그 다음 다른 곳에 기재된 바와 같이 추가 분석을 위하여 제조되었다.

전자 현미경검사에 의한 엑소좀 확인

펠렛화된 엑소좀은 20 메쉬 포름바/탄소 코팅된 구리 그리드 (polysciences, Inc.)상에 침착되었고 그 다음 Technai G2 (FEI)에서 80 kV로 투과 전자 현미경검사 (TEM)에 의해 분석되었다 (도 1a).

QRFPR 양성 엑소좀의 웨스턴 블랏 확인

초원심분리된 펠렛으로부터 물질은 80 분 동안 150 v로 12.5% SDS-PAGE 겔 (Biorad)상에 분리되었고, Immobilon K 막에 습성 전달되었고, 1시간 RT 동안 5% BSA로 차단되었고, 온화하게 진탕하면서 + 4에서 대응하는 QRFPR 항체 o/n으로 인큐베이션되었다. 막은 TBST로 세정되었고, 호스 래디시 페록시다아제에 접합된, 대응하는 2차 항체는 1시간 RT 동안 적용되었고, 막은 TBST로 세정되었고 ECL 검출 시약을 이용하여 발생되었다 (도 1b).

실시예 3 - 세포 표면에서 GDF15 - QRFPR의 검출

세포 표면에서 GDF15와 QRFPR 사이 복합체의 존재를 조사하기 위해, 우리는 원 위치 PLA를 이용하여 설린닥 설파이드 (내인성 GDF15의 소량을 증가시키기 위해 NSAID)로 처리된 MCF-7 세포를 분석하여 GDF15와 QRFPR 사이 상호작용을 검출하였다. 우리는 QRFPR용 siRNA (도 2b)로 또는 서열-스크램블드 대조군 siRNA (도 2a)로 처리되었던 MCF-7 세포에서 GDF15와 QRFPR 사이 근접 사건의 수준을 비교하였다. 우리는 QRFPR siRNA 처리된 세포에서 GDF15-QRFPR의 수준의 감소를 검출하였고, 따라서 상기 세포주에서 수용체의 존재 및 항체의 특이성을 입증하였다. 세포는 GDF15 치료에 앞서 혈청 부족하였다.

실시예 4 - GDF15 자극은 세포 표면에서 QRFPR의 수준을 감소시킨다

ACTRIIB - QRFPR 근접의 검출

(GDF15가 속하는) TGF-β 상과의 구성원은, 2개의 1형 및 2개의 2형 수용체로 구성되는, 헤테로사량체 수용체 복합체를 통해 신호전달한다. 2형 수용체는 리간드를 결합시키고 1형 수용체에 이들을 보여준다. 우리는 GDF15를 위하여 대응하는 2형 수용체 확인을 추구하였다.

TGFb 상과에 대하여 단지 5개의 공지된 2형 수용체가 있고 ACTRIIB가 그와 같은 대응하는 2형 수용체에 대하여 기준의 일부를 충족시킬 것이 초기에 가정되었다. ACTRIIB는 GDF8에 대하여 2형 수용체, GDF15에 계통발생적으로 가까운 TGFb 상과의 구성원이다. 추가적으로, ACTRIIB는 지방 대사에 관여되는 것으로 제안되어 있다. QRFPR은 지방세포에서 발현되는 것으로 기재되어 있다.

MCF7 세포는 GDF15 (Abcam 및 Biovision으로부터 구매된 E. 콜리로부터 유래된 재조합 또는 단리된 포유동물 공급원으로부터 GDF15)로 자극되었다. 검정은 GDF15의 활성 모니터링을 위하여 그리고 수용체(들)의 동력학 예컨대 리간드에 의한 QRFPR 조절을 조사하기 위해 개발되었다.

혈청-부족한 MCF7 세포는 GDF15로 처리되었고, 원 위치 PLA 검출 검정은 2 상이한 종으로부터 항체를 이용하여 ACTRIIB와 QRFPR 사이 상호작용을 검출하기 위해 개발되었고, 따라서 Duolink 2차 검출 시약의 사용을 허용하였다. QRFPR-ACTRIIB 복합체의 존재는 GDF15의 부재하에 검출되었다 (참조 도 3a, 화살표로 지시됨). 그러나, 초기에 놀랍게도, 수득된 신호는 잠시 자극 (20 분)에 의한 GDF15 치료로 감소되었고, GDF15에 의한 동적 조절을 시사하였다 (참조 도 3b). 흥미롭게도, 세포가 혈청으로부터 임의의 교란 효과를 피하기 위해 밤새 혈청 기아에 적용되었던 MCF7 세포를 이용하는 실험에서, 혈청-부족한 세포는 증가된 QRFPR 발현을 갖는 것으로 밝혀졌다.

GDF15 및 QRFPR이 2 다운스트림 표적, NPY 및 POMC에 관한 역효과를 갖는 것이 문헌으로부터 공지된다. 따라서, 이것은 GDF15가 QRFPR의 세포 표면 수준을 방해하는 것을 시사한다. QRFPR이 세포 표면으로부터 제거되었다면, NPY 및 POMC를 조절하기 위한 이의 친수성 효능적 펩타이드 리간드 (26RF아미드 및 QRFP)의 효과는 또한 억제될 것이다. 포유동물 대사에 집중하는 핵심 표적, 예컨대 NPY 및 POMC를 조절하는 GDF15의 능력, 그리고 악액질에서 이의 보고된 역할은 QRFPR의 GDF15 억제를 통해 설명될 것이다.

EEA1 - QRFPR 근접의 검출

QRFPR 내재화에 관한 GDF15의 역할을 조사하기 위해, 엔도좀 형성을 모니터링할 수 있는 일련의 원 위치 PLA 검정은 개발되었다.

초기 엔도좀 마커 1 (EEA1)은 급속 엔도좀 형성용 마커이고, 검정은 EEA1 및 QRFPR의 근접을 검출하기 위해 개발되었다. GDF15의 부재하에, 신호는 수득되지 않았다 (도 3c). 그러나, GDF15의 잠시 노출 (5 분)은, EEA1 및 QRFPR에 대한 항체를 이용하는 원 위치 PLA 검정 그 다음 Duolink 2차 프로브에 의해 측정된 바와 같이, EEA1과 QRFPR 사이 근접에 의해 생성된 RCA 생성물의 수를 증가시키기에 충분한 것으로 밝혀졌다 (참조 도 3d, 화살표로 지시됨).

우리는 또한 GDF15가 QRFPR 양성 엑소좀의 방출을 유도하였고, 따라서 GDF15가 QRFPR의 세포 표면 수준을 감소시킬 수 있는 2 방식인, 경로의 2기능을 시사하였다. 우리는 따라서 엔도좀 및 엑소좀 이동조절 모두에서 이중 역할을 갖는 것으로 공지된 마커를 편입하는 검정 개발을 추구하였다.

CD9- QRFPR 근접의 검출

테트라스파닌 CD9는 양쪽 엔도좀 이동조절에서 그리고 엑소좀 분비에서 이중 역할을 갖는다 (Mazurov et al.). 원 위치 PLA 검정은 CD9 및 QRFPR에 대해 항체를 이용하는 CD9 및 QRFPR의 근접을 검출하기 위해 개발되었다. GDF15의 부재하에, 단지 낮은 신호 수준이 관측된다 (도 4a 및 4C). 30 분 동안 GDF15로 자극은 CD9-QRFPR 복합체에 대하여 신호의 더 높은 수준을 초래하였고, 엔도좀 및 엑소좀의 형성을 나타내었다 (도 4b 및 4D).

RAB11 - QRFPR 근접의 검출

RAB11 단백질은 세포 표면으로 돌아가는 엔도좀 재순환용 마커이고, RAB11 경로는 엑소좀 어셈블리에서 또한 관여된다 (Savina et al., 2005; Savina et al., 2002). RAB11은 따라서 GDF15에 의해 유도된 세포 표면에서 QRFPR 감소에 관여되는 유망한 후보자인 것으로 여겨졌다

원 위치 PLA 검정은 RAB11 및 QRFPR의 근접을 검출하기 위해 개발되었다. GDF15의 부재하에, 단지 낮은 신호가 관측된다 (도 5a 및 5C). GDF15로 자극은 세포질에서 RAB11-QRFPR 이중 양성 엔도좀의 급속 검출을 초래하였다 (도 5b 및 5D).

프로테아좀 열화의 억제

QRFPR의 엔도좀 이동조절이 어셈블리 및 엑소좀의 차후의 발산을 초래하였는지, 또는 QRFPR이 프로테아좀 열화로 표적화되었는지 여부를 조사하기 위해, 세포가 장기적인 기간 동안 GDF15로 자극되었던 검정은 개발되었다.

GDF15 자극이 세포 표면에서 QRFPR의 감소된 수준을 초래하였다는 것이 이전의 실험에서 관측되어 있다. 그러나, 프로테오좀 억제제 MG132 (최종 농도 10 μM)에 의한 프로테오좀의 억제시, QRFPR의 수준은, MG132의 부재하에, GDF15의 동등량으로 처리된 세포에 비교하여 증가되었다. 도 6a는 GDF15의 부재하에 세포를 보여주고, 반면에 도 6b는 밤새 GDF15로 자극되어 있는, 및 세포 표면에서 QRFPR의 검출불가능한 수준을 갖는 세포를 보여준다. 도 6c는 프로테아좀 억제제 MG132에 노출되어 있는 대조군 세포를 보여주고, 도 6d는 프로테아좀 억제제 MG132에 노출되어 있는, 및 밤새 GDF15로 자극되어 있는 세포를 보여준다.

실험은 GDF15가 QRFPR의 프로테오좀 매개된 열화를 유도한다는 것을 입증한다. MG132의 부재하에, 18시간 동안 GDF15 치료는 QRFPR의 수준을 극적으로 감소시켰다 (도 6b). 상기 효과는 MG132로 처리되는 세포에서 보여지지 않는다 (도 6d).

RAB4 - QRFPR 근접의 검출

RAB11 양성 엔도좀은 또한 RAB4, 따라서 RAB4-RAB11 이중 양성 엔도좀의 존재를 편입하는 것으로 보고되어 있다. 검정은 RAB4 및 QRFPR에 대해 항체를 이용하는 RAB4-QRFPR의 근접을 검출하기 위해 개발되었다. GDF15의 부재하에, 신호는 RAB4-QRFPR에 대하여 관측되지 않았다 (참조 도 7a). RAB4-QRFPR 이중 양성 엔도좀의 형성은 GDF15 자극시 검출되었다 (참조 도 7b).

RAB4-RAB11 이중 양성 엔도좀은 공지된 엔도좀 형태이고, 우리는 따라서 2개의 독립적인 RAB 마커 (4 및 11)로 QRFPR 양성 엔도좀이 세포의 GDF15 노출 이후 형성되는 것을 입증한다.

QRFPR 양성 엔도좀의 형성은, 예를 들면 실시예 6에서, 다양한 GDF15 차단 제제의 효과를 측정하기 위한 검정에서 사용될 수 있다.

실시예 5 - 시험관내 상호작용 검정

GDF15와 상호작용하는 펩타이드를 추가로 특성규명하기 위해, 일련의 GST-융합 단백질 및 바이오티닐화된 펩타이드는 제조되었다. GDF15는 Biovision 및/또는 Abcam으로부터 수득되었다.

QRFPR 및 CLPTM1로부터 유래된 펩타이드를 이용하는 GDF15의 바이오틴 풀-다운

QRFPR 및 CLPTM1 단백질로부터 일련의 펩타이드는 설계되었다. 부가된 세포 배양 기반 검정 및 면역침강 실험에 대하여 모두 펩타이드를 이용하기 위해 N-말단 바이오틴은 각각의 펩타이드, 및 염화물로 변환된 반대 이온에 첨가되었다.

일련의 바이오티닐화된 펩타이드는 사용되었다 (도 8a). 레인 1: 대조군 비-바이오티닐화된; 레인 2: 바이오틴-GEIKYDFLYEKEHICCLEEWTS (서열 번호:10; QRFPR으로부터 세포외 도메인 3); 레인 3: 바이오틴-GIEYSNFEKEYDDVTIK (서열 번호:174; QRFPR로부터 세포외 도메인 4); 레인 4: 바이오틴-GALFWEQHDLVYGDWTS (서열 번호:19; CLPTM1의 세포외 도메인으로부터 펩타이드); 레인 5: 관련없는 단백질 (Ctrl)로부터 바이오틴-펩타이드 2개의 펩타이드는 GDF15 침전에서 다른 것보다 더욱 성공적이었다 (도 8a 레인 2 및 4).

펩타이드의 조합은 또한 사용되었다. 펩타이드는, 레인 1-5와 비교된 경우 각각의 펩타이드의 50 %를 초래하는, 레인 1-5에서와 동일한 총량으로, 1:1 비로 혼합되었다. 레인 6: QRFPR로부터 EC 도메인 3 & EC 도메인 4; 레인 7: QRFPR로부터 EC 도메인 4 & CLPTM1의 EC 도메인으로부터 펩타이드; 레인 8: QRFPR로부터 EC 도메인 3 & CLPTM1의 EC 도메인으로부터 펩타이드; 레인 9: Mw 마커; 레인 10: GDF15 (양성 대조군).

RAB11-QRFPR 엔도좀 및 풀-다운으로 우리의 이전의 실험은 세포외 루프 4가 또한 GDF15와 상호작용에서 참여할 수 있다는 것을 제안하였다. 따라서 QRFPR의 세포외 루프3 및 루프 4 모두가 GDF15와 접촉하는 것이 가능하다.

GST -융합 QRFPR 및 CLPTM1 단편의 생산

우리는 이전에 관측된 QRFPR 및 CLPTM1로부터 바이오티닐화된 펩타이드로 CLPTM1로부터 유래된 모티프를 가진 GDF15의 더 많은 유지를 가졌다.

우리는 그 다음 어느 한쪽 세포외 도메인 3, 4 (QRFPR) 또는 CLPTM1로부터 모티프에 대응하는 합성 혼성화된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 QRFPR 및 CLPTM1로부터 GDF15 결합 모티프를 조립하였다. 올리고뉴클레오타이드는 pGEX4T1 골격에서 삽입되었고, BL21DE3pLys 박테리아에서 발현되었고 정제되었다. 정확한 서열은 Sanger 서열분석에 의해 확인되었다.

우리는 그 다음 정제된 GST-융합 단백질을 동등량의 GDF15로 인큐베이션하였고 고 염 염 완충액을 포함하는 광범위한 세정에 피분석물을 적용시켰다.

바이오티닐화된 펩타이드를 이용하는 이전의 결과에 따라 우리는 GDF15와 CLPTM1 유래된 모티프 사이 더 강한 친화도를 관측하였다.

요약하면, 수용체의 선택된 단편은 합성 올리고머 (ultramers, IDT technologies), 제한 효소에 의해 소화된 측접하는 단부로부터 작제되었고, pGEX 4T-1 벡터 (Pharmacia Biotech)에서 삽입되었다. 작제물은 DH5 라이브러리 효율 박테리아 (Invitrogen)에서 클로닝되었다. 정확한 클론은 2 % 아가로스 겔에서 분석적 제한 소화 실행에 의해 확인되었고, 웁살라 서열분석 센터에서 Sanger 서열분석에 의해 입증되었다.

입증된 클론은 BL21pLYs 박테리아를 형질전환하는데 사용되었다. 단일 클론은 밤새 100 μg/ml로 암피실린으로 보충된 20 ml LB 배지에서 성장되었고 다음 날 100 ml로 팽창되었고 그 다음 0.1 mM IPTG로 3시간 동안 유도되었다. 박테리아 세포는 원심분리에 의해 펠렛화되었고, 초음파처리 및 트리톤 x-100 (1%)를 가진 PBS에 의해 용해되었다. 용해물은 원심분리에 의해 청소되었고, 상청액은 글루타티온 비드 (Pharmacia)로 밤새 인큐베이션되었다.

GDF15의 GST -풀다운

GST-융합 단백질의 동등량은 4℃에서 4시간 동안 엔드-오버-엔드 회전으로 PBST의 500 μl내 GDF15의 동등량으로 인큐베이션되었고 글루타티온 세파로오스 4B 비드 (GE healthcare)로 포착되었고, 그 다음 3개의 상이한 세정 용액 (PBST, 첨가된 200 mM NaCl을 가진 PBST, 및 세포 용해 완충액 (0.5 % 데옥시콜레이트, NP-40)으로 광범위하게 세정되었다. 비드는 SDS에서 비등 이전 튜브 벽에 미특이적 결합의 잔류를 피하기 위해 세정 동안 신규한 에펜도르프 튜브에 전달되었다.

PBS에서 최종 세정

물질은 5 분 동안 DDT로 보충된 SDS 장입 염료에서 비등에 의해 변성되었고, 그 다음 12 % 아크릴아미드 겔 (70 분 동안 120 V)에서 실행되었고 ECL 및 CCD 카메라 (Biorad)에 의해 분석되었다.

레인 3: GST-EIKYDFLYEKEHICCLEEWTS (서열 번호:7을 가진 GST-융합; QRFPR의 EC 도메인 3); 레인 4: GST-ALFWEQHDLVYGDWTS (서열 번호:18; CLPTM1의 EC 도메인으로부터 펩타이드). 레인 7: GST 대조군 (무 융합). 증가된 결합은 QRFPR의 세포외 도메인 3 및 CLPTM1의 세포외 도메인의 부분에 대응하는 펩타이드에 대하여 관측되었다 (도 8b, 레인 3 및 4).

실시예 6 - GDF15 - QRFPR 상호작용 차단

MCF7 및 U2OS 세포에서 펩타이드를 이용한 내재화 차단

우리는 GDF15의 활성이 다양한 제제에 의해 억제될 수 있는지를 조사하기 위한 방식으로서 상기 검정을 이용하여 선택한다. QRFPR의 세포외 루프 3으로부터 수용체 단편은 실질적으로 RAB11-QRFPR 이중 양성 엔도좀을 유도하는 GDF15의 능력을 감소시켰다 (참조 도 9). 반대로, 관련없는 단백질로부터 대조군 단편은 증가된 RAB11-QRFPR 이중 양성 엔도좀의 억제에 효과가 없다. RAB11/QRFPR 엔도좀의 GDF15-유도된 형성은 QRFPR 펩타이드에 의해 억제된다 (도 9a-D). GDF15의 마스터믹스(mastermix)의 동등량은 분주되었고 다양한 수용체 단편을 가진 PBS에서 사전-인큐베이션된 다음 세포에 첨가되었다. 순차적으로, 세포는 어느 한쪽 PBS, GDF15 또는 GDF15/QRFPR-유래된 펩타이드 혼합물로 처리되었다. 세포 표면에서 QRFPR의 수준은 U2OS 세포에서 GDF15만큼 감소되었지만, QRFPR 펩타이드에 의해 정상 수준으로 회복되었다 (도 9e)

P518 감염 없이 펩타이드를 이용한 내재화 차단

도 10a-10C는 GDF15가 세포 표면에서 QRFPR의 수준을 감소시키는 것, 그리고 상기 감소가 QRFPR의 세포외 루프 3 (세포외 도메인 4)로부터 유래된 펩타이드에 의해 역전될 수 있다는 것을 확인한다.

QRFPR 효능제 p518의 효과는 측정되었다. 요약하면, p518/QRFP-26은 Phoenix Peptides, CA로부터 구매되었고 제조자의 지침에 따라 가공되었다. 세포는 밤새 P518 자극에 앞서 혈청-부족하였다.

P518은 세포의 자극에 앞서 PBS에 용해된 어느 한쪽 PBS 또는 QRFPR 수용체 단편으로 혼합되었다.

우리는 p518 단독이 ACTRIIB의 수준을 증가시키는데 충분하였다는 것, 그리고 흥미롭게도, QRFPR 단편의 존재가 P518 유도된 ACTRIIB 수준의 수준을 감소시키지 않았다는 것을 실증하였다. 반대로, 우리는 p518로 모노-치료에 비교된, 양쪽 p518 및 QRFPR 수용체 단편으로 세포가 처리된 경우 ACTRIIB의 약간의 증가를 주목하였다 (참조 도 10 D-F).

따라서 우리는 QRFPR 수용체 단편이 QRFPR의 효능제, P518을 억제시키지 않는다는 것을 관측하지만, QRFPR 수준에 대하여 별도의 검정에서 실증된 QRFPR 수준에 관한 GDF15 효과를 감소시키는 수용력을 갖는다 (도 10 A-C).

이들 2 검정 이용에 의해 GDF15를 억제시키지만, 효능제 (p518)를 아끼는 선택적 억제제 (예컨대 p518을 방해하지 않는 에피토프에 관한 본 명세서에서 사용된 QRFPR 단편 또는 QRFPR 항체)를 검출 및 개발하는 것이 그러므로 가능하다.

rab4 엔도좀을 예방하는 항체

요약하면, 세포는 밤새 혈청 부족하게 되었고 그 다음 2시간 동안 QRFPR의 세포외 부분에 대한 차단 항체로 사전-인큐베이션된 다음 30 분 동안 GDF15 치료 (1μg/ml) 되었다. 형성된 RAB4-QRFPR 복합체의 수준은 PLA 시스템인 Duolink를 이용하여 형성된 RCA 생성물의 가시화에 의해 측정되었다 (참조 도 11). 차단 항체는 RAB4-QRFPR 엔도좀의 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 사용된 차단 항체는 QRFPR에서 GDF15 결합 부위와 중첩되도록 Pep-star 어레이에서 실증되었다.

상기 검정은 QRFPR을 향한 항체가 GDF15 매개된 엔도좀 형성을 억제시킬 수 있다는 것을 증명하기 위해 유용하였다.

ACTRIIB는 GDF15에 대하여 가능한 2형 수용체인지 여부의 가능성을 조사하기 위해 초기에 선택되었다. 이것은 GDF15가, ACTRIIB와 상호작용하는, GDF8에 밀접하게 관련된다는 사실에 기반되었다. QRFPR 및 ACTRIIB가 적어도 2 기전: (예를 들면 RAB4 및 11 엔도좀을 통한) 엔도좀 매개된 내재화 및 QRFPR의 엑소좀 발산에 의해, (근접 사건의 수에서 감소에 의해 확인된 바와 같이) 상호작용하였던 정도로 GDF15가 감소하였다는 것이 밝혀졌다.

놀랍게도, QRFPR (p518/26RFa(26-량체) 및 QRFP(43-량체)에 대하여 2 공지된 효능제가 ACTRIIB의 수준을 조절하기 위해 서로에 대해서 반대 방식으로 작용한다는 것이 밝혀졌다. 효능적 리간드의 결합을 아끼면서, 이것이 QRFPR의 GDF15 결합 부위용 선택적 억제제의 개발을 가능하게 하는데 유용한 신규한 검정을 제공할 수 있다는 것이 확인되었다.

바람직하게는, 그와 같은 결합제 (예를 들면 항체)는 GDF15 결합 부위를 중첩하는 에피토프에 직접적으로 결합에 의해, 또는 간접적으로 인접한 에피토프에 결합 및 예를 들면 입체 장애에 의한 결합 차단, 따라서 QRFPR에 GDF15의 접근 억제에 의해 QRFPR에 GDF15의 접근을 차단할 수 있다.

바람직하게는, 상기 결합제는 내인성 리간드에 결합에 의해 매개된 수용체의 효능적 기능을 방해하지 않는다. 본 명세서에서 제공된 상기 ACTRIIB 검정은 따라서 그와 같은 결합제가 리간드의 효능적 결합을 방해하는지를 결정되게 한다.

우리는 GDF15를 억제하는데 사용된 펩타이드가 QRFP를 방해하지 않는다는 것을 결정하기 위한 검정을 이용할 수 있었다. 따라서 QRFPR 효능제 및 길항제의 기능을 조정하기 위한 선택적 도구는 양쪽 ACTRIIB 검정 및 RAB11-QRFPR 엔도좀 검정을 이용함으로써 검출될 수 있다.

실시예 7 - 펩타이드 스크린

QRFPR의 제3 세포외 도메인 (세포외 루프 2)에서 존재하는 최소 에피토프 및 핵심 아미노산을 결정하기 위해 우리는 JPT peptides로부터 구매된, Pepstar 펩타이드 어레이를 설계하였다. 간단히 어레이는 15-량체로 분할된, QRFPR의 세포외 루프2의 완전 피복을 포함하였다. 상기 길이 (15-량체)의 펩타이드는 인자 예컨대 합성의 효율, 순도 및 FMOC 화학에 의한 수율에 기반된, 제조자에 의해 권고된 길이에 기반하여 선택되었다. 15-량체는 아미노산 분야, 단일 또는 이중 알라닌 스캔에 따라 다양하였다. 각각의 세트는 3중으로 분석되었다. GDF15는 PBS-T (0.05 % Tween-20)으로 희석되었고 +4 C에서 밤새 회전식 진탕기에서 온화한 진탕하에 인큐베이션되었다. 스카이 라인 회전식 진탕기 DOS-10L, ELMI에서 진탕하에 세정되었다.

GDF15에 대한 기본적인 항체는 선행 GDF15 인큐베이션을 가진 웰에 그리고 GDF15가 생략되어 있는 인접한 대조군 웰 (유일한 PBS-T)에 첨가되었고 회전식 진탕기에서 진탕하에 1시간 RT 동안 인큐베이션되었다. 반복된 세정 이후 형광단-접합된 2차 항체는 첨가되었고, 최종 세정 이후 어레이는 G2502 마이크로어레이 스캐너, Agilent Technologies에서 분석되었다. 기술 대조군 및 대조군 웰 (무 GDF15)로부터 형광 값은 공제되었고 3중으로 수득한 값은 Excel 및 Prism에서 분석되었다.

실험으로부터 우리는 GDF15와 QRFPR 사이 상호작용에 중요한 핵심 아미노산의 최소 세트를 결정할 수 있었다. 아미노산 분야 및 알라닌 스캔은 스트레치 FLYEKEHIC (서열 번호:11)은 GDF15 결합에 필수적이었다는 것을 드러냈다. (도 12) 추가의 스트레치는 또한 본원에서 열거되어 있음에 따라 GDF15를 유지할 수 있었다.

흥미롭게도, GPRs 예컨대 QRFPR는, 세포외 루프1에서 시스테인과 디설파이드 브릿지를 형성하는, 세포외 루프2(ECL2)에서 보존된 시스테인 잔기를 갖는다.

효능제 및 길항제 리간드의 결합은 보존된 디설파이드 결합 주위 ECL2에서 상이한 리드(lid) 형태를 유도한다 이들은 수용체의 상이한 기능성 상태를 생산하도록 제안되어 있다. 우리는 실험에서 GDF15가 품격있는 조절 기전을 형성하는, 상기 부위에서 정확하게 상호작용하는 수용력을 갖는다는 것을 실증하였다. 거기에서 정확하게 상호작용함으로써, GDF15는 QRFPR의 오릭소제닉(orixogenic) 기능을 길항하여, 이로써 호르몬 예컨대 NPY 및 POMC를 조절하는 핵심 대사의 수준을 조절한다. 우리는 이것이, 수많은 암 형태, 뿐만 아니라 다른 인간 장애에서 GDF15의 상승된 수준에 의해 유도된 골 대사의 방해 뿐만 아니라 악액질을 이해하는데 굉장한 중요한, 핵심 기전인 것 (그리고 FLYEKEHICC (서열 번호:78)이 코어 결합 부위인 것)을 시사한다. 우리는 따라서 QRFPR의 ECL2 (ECD3)에 결합하는, 또는 QRFPR을 결합시키는 GDF15의 능력을 차단하는 입체 장애에 인접한 및 상기에 의한 제제 예컨대 항체가 GDF15가 상승되는 장애용 치료제가 되는 잠재력을 갖는다는 것을 시사한다.

실시예 8 - 에피토프 맵핑

세포 배양 실험에서 사용된 항체의 에피토프를 결정하기 위해 우리는 다양한 수용체 결합 항체로 병렬 웰을 처리하였다. 도 14에서 GDF15 분석에서와 같은 실험 및 분석, 단, 항체는 1시간 동안 RT에서 인큐베이션되었다. 우리는 GDF15에 의해 사용된 에피토프에 중첩을 가진 항체를 확인할 수 있었다 (도 13). 아미노산 분야는 QQLEIK (서열 번호:335), 특히 K가 결합하기 위해 N-15 염소 ab에 필요하다는 것을 입증한다. N-15 ab는 추가로 (적색으로 마킹된) ala 스캔에 의해 드러난 바와 같이 FLYEK (서열 번호:210)이 필요하다. 따라서 ab는 부분적으로 리간드에 의해 점유된 부위를 중첩시킨다.

펩타이드 서열을 스크리닝하는 어레이
폴리펩타이드 서열	서열 번호:
QQLEIKYDFLYEKEH	176
QLEIKYDFLYEKEHI	39
LEIKYDFLYEKEHIC	40
EIKYDFLYEKEHICC	41
IKYDFLYEKEHICCL	42
KYDFLYEKEHICCLE	43
YDFLYEKEHICCLEE	44
DFLYEKEHICCLEEW	45
FLYEKEHICCLEEWT	73
LYEKEHICCLEEWTS	324
YEKEHICCLEEWTSP	325
EKEHICCLEEWTSPV	326
KEHICCLEEWTSPVH	327
EHICCLEEWTSPVHQ	328
HICCLEEWTSPVHQK	329

실시예 9 - GDF15 - CLPTM1

GDF15는 ALK5(TGFBRI) 키나제 도메인에 의해 매개된 표준적 (SMAD) 경로, 및 비-표준적 TGFβ 수용체 신호전달, 예컨대 GSK3b의 인산화 모두를 닮은 다운스트림 신호전달을 매개하는 것으로 문헌에서 보고되어 있다. CLPTM1이 이것에 관여되었는지를 조사하기 위해 우리는 CLPTM1 및 TGFβ 수용체 및 TGFβ 수용체의 성분 다운스트림 사이 동력학을 결정하는 일련의 원 위치 PLA 검정을 개발하였다. NK-92 세포는 핵에서 인산화된 SMAD 단백질 예컨대 SMAD2를 검출하기 위해 40 분 동안 GDF15로 처리되었다. 우리는 NK-92 세포에서 GDF15 자극시 c-말단 인산화된 SMAD 2를 검출하는데 실패하였다. TGFB1 자극으로 이전의 실험으로부터 우리는 검정 (pSMAD2)가 기능성이었다는 인식한다.

놀랍게도, 우리는 도 14에서 실증된 바와 같이 GDF15로 자극시 CLPTM1과 TGFBRI(ALK5) 사이 유도된 근접을 검출하였다.

TGFBRI가 대응하는 2형 수용체 TGFBRII와 독립적으로 CLPTM1로 국재화하였는지, 또는 TGFBRI-TGFBRII 이종복합체가 GDF15 자극시 CLPTM1과 관련하였는지는 공지되지 않았다. 이것을 결정하기 위해, 제2 원 위치 PLA 검정은, 또 다른 종으로부터 CLPTM1 항체와 함께 TGFBRII에 대한 항체를 이용하여, 개발되었다. 우리는 그 다음 GDF15 치료가 또한 TGFBRII에 CLPTM1 근접을 유도하였다는 것을 발견하였다. (도 15)

헤테로사량체 TGFBRI-TGFBRII 복합체의 화학양론 및 동력학에 관한 문헌에서 현행 가설은 세포 표면에서 2개의 대안적인 형태를 시사한다; 1) 리간드 자극시 2 TGFBRI 및 2 TGFBRII 수용체의 회합 (예를 들면 (TGFB1)), 또는 2) 기존의 헤테로사량체 복합체 (즉 리간드 결합 이전).

문헌에서 현행 가설은 상이한 바람직한 다운스트림 신호전달 경로를 시시하고, 여기에서 전자 (리간드 유도된 헤테로사량체)는 표준적 (SMAD) 경로를 더욱 지지하고 (리간드가 나타나고 기존의 헤테로사량체를 결합하는) 후자는 비-표준적 예컨대 비-SMAD 기질의 인산화를 지지한다.

SMAD2 인산화의 부재, 및 GDF15에 의해 개시된 비-표준적 다운스트림 신호전달에 관한 문헌에서 보고 그리고 수용체 모두가 GDF15 자극시 CLPTM1과 관련된다는 우리에 의한 발견에 기반하여 우리는 CLPTM1이 기존의 TGFBRI-TGFBRII 헤테로사량체 복합체에 GDF15 제시에 참여한다는 것을 가정하였다.

상기 이론을 시험하기 위해, CLPTM1 결합제를 이용하여 CLPTM1에 GDF 15 결합의 효과를 시험하는 검정은 개발되었다 (참조 실시예 10).

실시예 10 - GDF15 - CLPTM1 차단

TGFB 헤테로사량체 복합체를 통해 GDF15 유도된 다운스트림 신호전달 억제에 관한 CLPTM1을 결합하는 항체의 효과는 원 위치 PLA 검정에서 인산화된 GSK3b-pGSK3b(9/21) 검출에 의해 평가되었다. GSK3b의 인산화는 면역억제 효과를 유발 즉 면역 세포 기능을 억제하는 것으로 공지된다.

CLPTM1이 GDF15에 관여된다는 것을 입증하기 위해 그리고 차단 제제 예컨대 항체가 GDF15 유도된 다운스트림 신호전달을 감소시킬 수 있다는 것을 최초로 입증하기 위해 우리는 대조군 항체 또는 CLPTM1 항체의 존재하에 GDF15로 NK-92 세포를 처리하였다 (참조 도 16). 우리는 대조군 항체의 존재하에, GDF15가 (문헌에 따라) GSK3b의 9/21 인산화를 유도한다는 것을 입증한다. 그러나, CLPTM1 결합 항체는 GSK3b의 GDF15 유도된 인산화를 감소시킨다. 이론에 의한 구속됨 없이, 이것은 CLPTM1에 결합하는 항체가 GSK3b 인산화를 통해 GDF15의 면역억제 역할을 억제시킬 수 있다는 것을 시사할 것이다.

실시예 11 - 펩타이드 스크린

우리는, CLPTM1의 세포외 도메인으로부터 유래된 펩타이드를 이용하여, QRFPR에 대하여 실시예 7에서 기재된 바와 같이 CLPTM1에 GDF15의 결합을 조사하였다. 2 수용체 사이 BLAST 상동성으로부터 우리는 QRFPR (YISEHEH (서열 번호:15) 및 LFWEQH (서열 번호:16))에서 대응하는 아미노산 서열 세포외 루프 2를 가진 CLPTM1의 세포외 도메인에서 2개의 잠재 부위를 확인한다.

CLPTM1의 에피토프는 잠재적으로 더 큰 스트레치 그 다음 어레이에서 사용되었던 15-량체 펩타이드를 포함할 수 있고, 더 긴 펩타이드 스트레치 및 증가된 결합능 (사량체 및 이량체)으로 GST-융합 실험 및 바이오틴-펩타이드 모두는 (참조 실시예 5) 더 나은 GDF15 결합 그 다음 선형 15-량체를 제공한다.

어레이 실험으로부터 (도 17), CLPTM1로부터 몇몇의 펩타이드는 GDF15를 결합시키고 본원에서 열거된다.

CLPTM1 스크리닝 펩타이드
폴리펩타이드	서열 번호:
ISEHEHFTDFNATSA	330
SEHEHFTDFNATSAL	320
EHEHFTDFNATSALF	331
HEHFTDFNATSALFW	332
EHFTDFNATSALFWE	333
HFTDFNATSALFWEQ	334
FTDFNATSALFWEQH	149
TDFNATSALFWEQHD	135
DFNATSALFWEQHDL	171
FNATSALFWEQHDLV	170
NATSALFWEQHDLVY	169
ATSALFWEQHDLVYG	168
TSALFWEQHDLVYGD	167
SALFWEQHDLVYGDW	166
ALFWEQHDLVYGDWT	142

상대적으로 짧은 펩타이드의 확인, 및 특히 본 명세서에서 확인된 결합 모티프는 GDF15와 이의 수용체 사이 상호작용을 차단하는데 사용될 수 있는 치료 제품용 시작점을 제공한다. 특정한 구현예에 제한됨의 바람 없이, 잠재적인 GDF15 유인 펩타이드는 치료 용도를 위하여 환형 펩타이드 또는 Fc-융합물로서 제공될 수 있다.

실시예 12 - 에피토프 맵핑

우리는 본 연구에서 사용된 CLPTM1에 대한 항체가, 실시예 8에서 기재된 바와 같이, GDF15 결합 부위와 중첩하는 에피토프를 인식하였다는 것을 결정하였다 (참조 도 18).

CLPTM1 항체 에피토프 맵핑
폴리펩타이드	서열 번호:
YISEHEHFTDFNATS	102
ISEHEHFTDFNATSA	330
SEHEHFTDFNATSAL	320
EHEHFTDFNATSALF	331
HEHFTDFNATSALFW	332
EHFTDFNATSALFWE	333
HFTDFNATSALFWEQ	334
FTDFNATSALFWEQH	149
TDFNATSALFWEQHD	135
DFNATSALFWEQHDL	171
FNATSALFWEQHDLV	170
NATSALFWEQHDLVY	169
ATSALFWEQHDLVYG	168
TSALFWEQHDLVYGD	167
SALFWEQHDLVYGDW	166
ALFWEQHDLVYGDWT	142
LFWEQHDLVYGDWTS	125

우리는 CLPTM1의 GDF15 결합 부위 외부에서 결합하는 항체가 또한 입체 장애에 의해 CLPTM1에 결합하는 GDF15를 억제시킬 수 있고, 따라서 또한 CLPTM1 결합과 관련된 TGFb 수용체 복합체로 GDF15 매개된 혼선을 억제시키는 것이 바람직한 적용 예컨대 면역-종양학에서 유용할 수 있다는 것을 제안한다. GDF15의 면역억제 효과는 이로써 차단될 수 있다.

실시예 13 - 면역 세포에서 CLPTM1의 발현

CLPTM1이 인간 면역 세포에서 발현되는 정도를 조사하기 위해, 우리는 건강한 공여체 PBMC로부터 다양한 면역 세포 유형을 FACS-분류하였고, CD4+ 및 CD8+ T-림프구 및 CD45+ CD3+ 비-T-림프구 (도 19)에서, 그리고 CD11c+ 세포 (수지상), 및 CD14+ 세포 (단핵구/대식세포) (도 20)에서 CLPTM1 발현을 검출하였다.

CD4 및 CD8 T-림프구에서 우리는 CLPTM1의 높은 수준을 발현하는 세포의 서브셋을 검출하였다. CD14 양성 세포에서 우리는 CLPTM1의 전반적으로 다량을 검출하였다. (도 20).

건강한 공여체 PBMC 및 면역 세포 유형의 선택에서 사용된 FACS에 관한 통문 전략에 접근은 임상 면역학 유닛, KS, Stockholm을 통해 실시되었고 확립된 프로토콜을 따랐다.

CLPTM1이 면역 시스템의 세포에서 발현되었던 정도는 면역 시스템의 조절에서 광범위한 효과를 가질 수 있고, 광범위한 상이한 면역 반응 경로에서 면역 반응을 조절할 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 14 - GDF15에 의한 NKG2D의 하향-조절의 억제

TGFb 상과의 구성원, 예컨대 TGFb1 및 GDF15는 NKG2D, 예컨대 NK 및 T-세포를 발현하는 면역 세포의 세포용해 기능을 억제시키는 것으로 보고되어 있다.

NKG2D는 핵심 효과기 단백질 예컨대 페르포린 및 그란자임의 업스트림이고, TGFb1 및 GDF15는 상기 세포용해 단백질의 수준을 억제하는 것으로 보고되어 있다.

문헌, 면역 세포 예컨대 CD8+ T-림프구 및 NK-92 세포에서 CLPTM1의 발현, 그리고 (TGFB1이 신호전달하는 것을 통해) TGFBRI-TGFBRII에 CLPTM1의 GDF15 유도된 근접에 기반하여, 우리는 항체에 의한 CLPTM1의 봉쇄가 GDF15로 확장된 자극에 적용되어 있었던 NK-92 세포에서 면역 효과기 NKG2D의 수준에 영향을 줄 수 있는지를 조사하였다. 도 21a는 GDF15로 밤새 자극이 NK-92 세포에서 검출가능한 NKG2D의 낮은 수준을 초래한다는 것을 보여준다. NKG2D에서의 감소는 GDF15 자극에 앞서 CLPTM1 (항체)에 결합할 수 있는 결합제로 전처리되어 있었던 NK-92 세포에서 역전되었다 (도 21b). CLPTM1 항체는 그러므로 NK-92 세포에서 NKG2D의 수준을 증가시킬 수 있다. 우리는 이것이 이의 세포독성을 증가시킬 수 있다는 것을 제안한다.

실시예 15 - 암 징후

종양 미세환경에서 면역 세포내 CLPTM1 - GDF15의 검출

우리는, US Biomax로부터 구매된, 상업적으로 입수가능한 조직 마이크로 어레이를 이용하여 다양한 인간 암에서 2 수용체의 존재를 조사하였다.

도 22에서 여기 예시된, 일련의 인간 암에서 CLPTM1-GDF15 PLA 상호작용에 대하여 침윤성 세포 양성의 존재는 편평상피 폐 세포 암종으로부터 전이를 보여준다. FITC 표지된 CD3으로 대조염색에 의해 우리는 이중 양성 세포를 검출할 수 있었다. 그러나, 우리는 또한, 우리의 FACS 데이터에서 관측된 바와 같이 CLPTM1에 대하여 음성인 침윤성 세포의 집단을 가능하게는 나타내는, CD3+ CLPTM1-GDF15 음성 세포를 검출하였다.

추가적으로, 우리는 또한, 다른 면역 세포 예컨대 CD14+ 세포 (예를 들면 단핵구)를 나타낼 수 있었던, CLPTM1-GDF15 복합체를 보여주었던 CD3- 세포를 검출하였다. 조직의 복잡성 예컨대 상이한 침윤 면역 세포 유형으로 종양 전이가 다른 마커, 예컨대 CD14를 수반한 추가 연구를 보증한다.

GDF15-풍부 종양 미세환경에서 GDF15에 결합된 검출가능한 CLPTM1을 또한 입증하는 종양 침윤 CD3+ 세포의 존재는, CLPTM1에 GDF15 접근을 억제시키는, CLPTM1 결합제 (예컨대 항체)에 대한 잠재력을 시사한다. 그와 같은 생성물은 GDF15 유도된 면역-억제 감소에 유용할 수 있다.

골 암에서 QRFPR - GDF15의 검출

QRFPR을 위하여, 우리는 골에서 전립선 암 미세전이의 경계에서 QRFPR-GDF15를 검출하였다 (참조 도 23, 24A 및 24B) 신호의 낮은 수준은, 골에 전립선 암 전이에서 검출가능한 신호의 높은 수준과 비교하는, 기본적인 전립선 암에서 검출가능하였다 (참조 도 24c).

GDF15가 전립선으로부터 골 전이용 바이오마커로서 사용되는 경우, 이것은 특히 관심이다. 추가적으로, QRFPR은 골아세포에서 발현되는 것으로 공지되고 골 대사에서 관여된다. 따라서 QRFPR에 GDF15 접근을 차단할 수 있는 폴리펩타이드 또는 QRFPR 결합제 (예컨대 항체)는 전립선 암에서 골아세포 대사의 GDF15 유도된 조절장애 감소에 유용할 수 있다.

그와 같은 항체는, 특히 파골세포에서 작용하는, 현행 치료 레짐, 예컨대 비스포스포네이트로부터 개별적으로 골 대사의 조절장애의 측면을 치료하는데 사용된다면, 상기 장애에서 특별히 임상 가치가 있을 것이다.

QRFPR의 발현은 또한 1차 골 암: 유잉 육종 (도 25) 및 골육종 (도 24d)에서 발견되었다. 후자 발현은 U2OS 골육종 세포에서 QRFPR 염색의 우리 관찰, 및 U2OS 세포에서 QRFPR의 GDF15 조절에 따른다. 따라서, GDF15와 QRFPR 사이 상호작용을 차단하는 QRFPR 결합제 또는 폴리펩타이드는, 특히 파골세포에서 작용하는, 현행 치료 레짐, 예컨대 비스포스포네이트로부터 개별적으로 골 대사의 조절장애의 측면을 치료하는데 사용된다면, 상기 장애에서 임상 가치가 있을 수 있다.

마지막으로, QRFPR-GDF15 복합체는, 그와 같은 치료제에 대하여 가능한 추가 징후를 나타내는, 골수종에서 검출되었다 (도 26).

실시예 16 - GDF15로 QRFPR 및 CLPTM1 펩타이드의 상호작용 풀다운

20 μg Fc 융합 단백질 작제물은 PBST + 1 % BSAs에서 +4 C로 6시간 동안 혼합하면서 0.5 μg GDF15 및 단백질-G 비드로 인큐베이션되었다. 세정 6회: 3회 PBST, 튜브 교체, 2 세정 PBST+220 mM NaCl. 마지막 세정 PBS. 비드는 세정 사이 5 분 동안 500 g로 테이블탑 원심분리기 세트를 이용하여 수집되었다. 검출 물질은 4-12 % 구배 겔에서 장입되었고, 100 볼트에서 실행되었고, 터보 탱크 블랏 시스템을 이용하여 PVDF 막에 전달되었고, 1 hr RT 3% BSA를 가진 PBS에 의해 차단되었고, RD 시스템 단클론성 항-GDF15 항체로 밤새 인큐베이션되었다. 2차 항체: 마우스 HRP 1:2000은 검출에 사용되었다. 밴드의 크기는 인접한 레인에서 실행된 seeblue2 단백질 사다리 마커와 비교에 의해 추정되었다.

마우스로부터 서열을 편입하는 Fc-융합 단백질은 설계되었다:

(GGGGS) x 3은 가요성 링커 (서열 번호:242)로서 사용되었다.

AP5 (QRFPR 펩타이드)

Fc 마우스 IgG1-GGGGSGGGGSGGGGSQRLEIKYDFLYEKEH (서열 번호:240)

AP1 (대조군 단백질)

AAAQEADGARSAVVAAGGGSSGQVTSNGSIGRDPPAETQPQNPPAQPAPNAGGGGSGGGGSGGGGS-Fc 마우스 IgG1 (서열 번호:323)

AP2 (CLPTM1 펩타이드)

Fc 마우스 IgG1-GGGGSGGGGSGGGGSYISEHEHFTDFNATSALFWEQHDLVYGDWTS (서열 번호:241

AP0

음성 대조군

수용체로부터 단편은 GDF15와 직접적인 상호작용을 나타내는 어레이 데이터를 포함하는 이전의 결과에 기반하여 선택되었다. 어레이에서, 상호작용은 펩타이드 단량체와 리간드 사이이다. 엄격한 세정 조건을 수반한 풀다운 실험은, 도 27에서 나타낸 바와 같이, 수행되었고 GDF15 검출되었다.

논의: 광범위한 세정 이후, 우리는 QRFPR로부터 펩타이드를 포함하는 AP5 작제물 및 CLPTM1로부터 펩타이드를 포함하는 AP2 작제물이 GDF15를 풀다운할 수 있었다는 것을 주목하였다

결론: 우리는 GDF15가 모든 수용체에 대하여 친화도를 갖는다는 것, 그리고 상승된 GDF15가 병리적 역할을 갖는 장애에서 리간드 트랩으로서 치료 용도로 모든 작제물이 구상될 수 있다는 것을 보여주어 왔다. 데이터는 어레이 결과와 일치하고, 여기에서 예를 들어 AP1에서 폴리펩타이드는 GDF15와 상호작용하지 않았지만 AP2 서열은 하였다.

이론에 의한 구속됨 없이, 전장 CLPTM1 수용체는 더 높은 친화도를 제공하는 잠재력을 가질 수 있다.

실시예 17 - GDF15를 차단하는 항체 및 펩타이드

면역 세포에서 GDF15의 효과는 확립되었고, 상기 효과가 CLPTM1에 표적화된 항체에 의해, 그리고 CLPTM1의 세포외 도메인의 부분을 포함하는 Fc 융합 작제물에 의해 차단될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

LPS에서 GDF15의 존재 또는 부재하에 단리된 및 배양된 CD14+ 세포는 배양을 자극시켰다. TNF 및 IL12의 LPS 반응 분비가 GDF15로 인큐베이션된 세포에서 감소되었음에 따라, GDF15는 면역 억제성 효과를 실증하였다. 다클론성 토끼 항체 (Bioss Antibodies에 의해 공급된 bs-8018R)은 도 28에서 모든 사이토카인의 분비에서 증가에 의해 보여진 바와 같이 상기 면역 억제성 효과를 감소시켰다.

GDF15의 면역억제 효과의 유사한 역전은 또한 CLPTM1 (서열 번호:17)의 세포외 도메인으로부터 유래된 폴리펩타이드에 의해 실증되었다. 폴리펩타이드는 N-말단 링커 서열을 포함하는 Fc 융합물로서 제공되었고, 도 29에서 모든 사이토카인의 분비에서 증가에 의해 보여진 바와 같이, TNF 및 IL12에서 유사한 효과를 실증하였다. 이의 링커 서열을 포함하는 펩타이드의 서열은 서열 번호:241에서 보여진다.

CLPTM1 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 융합 단백질의 존재하에 LPS로 자극된 CD14+ 세포의 인큐베이션은 또한, 도 30에서 나타낸 바와 같이, 프로-염증성 단백질 IFNγ의 분비를 실증하였다.

물질 및 방법

말초 혈액 단핵 세포 ( PBMCs )의 단리

버피 코트 세포 현탁액 또는 헤파린처리된 혈액 샘플은 멸균된, 실온 PBS로 희석되었다. 말초 혈액 샘플은 1:1 희석되고, 반면에 버피 코트는 120 ml의 최종 용적으로 희석된다 (표준 버피 코트에서 이것은 1:1보다 약간 더 큰 희석을 초래할 것이다). 희석된 세포 현탁액은 Ficoll Paque PLUS상에 적층되었다. 하나의 버피로 4x15 ml 분취액이 사용된다 (30 mL의 희석된 세포 현탁액/튜브). 세포는 실온에서 30분 동안 400 xg로 원심분리되었고 신규한 50ml 튜브에 전달되었다. 세포는 1회 세정되었고 20 ml PBS에서 재현탁되었다.

CD14+ 세포 분획의 자기 분류

단핵 세포 현탁액은 원심분리에 의해 펠렛화되었다. 세포는 10⁸ 세포/ml의 농도로 줄기세포 완충액에서 재현탁되었고 둥근바닥 14 ml 튜브에 전달되었다. EasySep 양성 선택 칵테일은 100 μl/ml 세포로 첨가되었고, 부드러운 피펫팅에 의해 혼합되었고, 실온에서 15 분 동안 인큐베이션되었다. 50 μl EasySep 자기 나노입자 / 1 ml 세포는 첨가 및 혼합되었고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션되었다. 줄기세포 권고된 배지는 첨가되어 세포 현탁액을 5ml의 총 용적으로 만들고 부드럽게 피펫팅에 의해 혼합되었다. (캡 없이) 튜브는 자석에 배치되었고 5 분 동안 확보되었다. 5 분후 상청액은 버려졌다. CD14+ 표지된 세포는 튜브 내부에 남아있을 것이다. 튜브는 자석으로부터 제거되었고 가산 5ml 줄기세포 권고된 배지는 첨가되었고 부드럽게 피펫팅에 의해 혼합되었다. (캡 없이) 튜브는 자석에 배치되었고 5분 동안 확보되었다. 단계는 반복된 다음 세포는 5 ml 완전 RPMI 배지에서 재현탁되었다. 50 μl의 CD14+ 세포 현탁액은 제거되었고 카운트되어 트립판 블루 용액에서 희석 및 Fast Read 102 Counting Slides에 탑재 이후 총 세포 수를 결정하였다.

배양 셋업 및 자극

일 0

완전 RPMI 배지에서 0.833x106 세포/ml의 농도로 CD14+ 세포 현탁액 용적을 조정한다. 300 μl의 세포 현탁액은 48 웰 플레이트 웰에서 웰에 첨가되고 (0.25x10⁶ 세포 / 웰), 90 분 동안 인큐베이터에서 37 ℃에 부착하도록 되었다. 비-부착 세포는 배지의 부드럽게 피펫팅 이후 상청액의 제거에 의해 제거되었다. 세포는 300 μl 사전-가온된 완전 RPMI 배지로 1회 세정되었고 배지는 흡인 제거되었다. 300 μl 사전-가온된 완전 RPMI 배지는 각 웰에 첨가되었고 세포는 밤새 (20-24 h) 세포 인큐베이터에서 37℃에 인큐베이션되었다.

일 1

요망된 GDF15 조절 서브스턴스의 17X 모액은 완전 RPMI에서 희석되었다. (20 μl의 서브스턴스/웰 분석됨). 20 μl의 조절 서브스턴스 또는 배지/담체 (음성 대조군)은 각 웰에 첨가되었고 부드러운 피펫팅에 의해 혼합되었다. 세포는 30분 동안 세포 인큐베이터에서 37℃에 인큐베이션되었다. 17X GDF15 용액은 완전 RPMI에서 8.5 μg/ml의 농도 (배양액내 최종 농도 0.5 μg/ml)로 100 μg/ml 모액 희석에 의해 제조되었다. 20 μl의 희석된 GDF15는 웰당 첨가되었고, 밤새 (18-20 h) 세포 인큐베이터에서 37℃에 인큐베이션되었다.

일 2

18X LPS 용액은 완전 RPMI에서 18 ng/ml의 농도 (배양액내 최종 농도 1 μg/ml)로 LPS 모액 희석에 의해 제조되었다. 20 μl의 LPS 또는 배지 (음성 대조군)은 각 웰에 첨가되었고 부드러운 피펫팅에 의해 혼합되었다. 세포는 4시간 동안 세포 인큐베이터에서 37℃에 인큐베이션되었다. 각각의 웰로부터 200 μl의 상청액은 V-바닥 96-웰 플레이트에 전달되었다. 샘플은 임의의 세포 또는 잔해를 제거하기 위해 원심분리되었다. 상청액은 플라스틱 96-웰 PCR 플레이트에 전달되었다. TNF-α 분석에 즉시 진행하거나 부착 플라스틱 덮개로 웰을 덮고 추가 분석까지 -80℃에서 저장한다.

프로시크(Proseek) 검정

다중화된 근접 확장 검정을 이용하여 정량화된 세포 배양액으로부터 분비된 단백질, 프로시크 (Assarsson E et al PlosOne 2014) by Olink Proteomics AB (Uppsala Sweden). 데이터는 정규화된 단백질 발현 (NPX log2)으로서 나타난다. 종양학 v2 92-plex 패널은 실행되었다. 중요한 프로-염증성 마커 IL12, TNF, 및 IFNg로부터 데이터는 나타난다.

실시예 18 - CLPTM1 유래된 펩타이드에 결합하는 GDF15

물질 및 방법

CLPTM1로부터 바이오티닐화된 합성 펩타이드 단편 (JPT peptides, Germany)는 +4℃에 밤새 PBS내 1 μM로 스트렙타비딘 96 웰 플레이트 (#15500 Pierce)에서 고정화되었다. 플레이트는 0.05% Tween-20을 가진 300 μl PBS (세정 완충액)에서 4회 세정되었다. 플레이트는 PBS 1%BSA 및 0.05% Tween-20 (차단 완충액)으로 1.5 시간 동안 실온에서 차단되었고 그 다음 세정 완충액에서 4회 세정되었다. GDF15 리간드 (Abcam)은 차단 완충액에서 100 ng/ml로 첨가되었고 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션되었다. 플레이트는 그 다음 2X NaCl을 가진 세정 완충액에서 300 μl 8회 세정되었다. GDF15 항체는 1ug/ml (RnD 시스템 염소 다클론성)으로 첨가되었고 차단 완충액에서 1 시간 실온에서 인큐베이션된 다음 4x300μl 세정 완충액으로 세정되었다. HAF017 항-염소-HRP 항체는 첨가되었고 1 시간 동안 차단 완충액에서 인큐베이션된 다음 세정되었다. TMB 기질은 첨가되었고 H₂SO₄로 15 분후 중단되었다. OD 450-620은 ELISA 판독기로 측정되었다.

서열 번호:250-273에서 제시된 서열을 갖는 폴리펩타이드는 (도 31에서 좌측부터 우측까지 지시된 폴리펩타이드에 대응하는) GDF15에 대하여 평가되었다. 이들 단백질은 CLPTM1로부터 대응하는 서열에서 나타나지 않은 C-말단 글리신 잔기로 합성되었다. 각각의 폴리펩타이드에 대하여 측정된 신호는 도 31에서 보여진다. ELISA 판독에서 대략 0.1 OD 초과 또는 동등의 컷-오프는 고정화된 폴리펩타이드에 GDF15의 결합을 나타내는 (즉 서열 번호:258에서 제시된 서열을 갖는 폴리펩타이드에 결합하는 GDF15에 대하여 0.098 OD 값을 포함하는) 것으로 확인되었다. 하기 펩타이드는 GDF15에 결합 (서열 번호:2에 비하여 잔기 수)를 보여주었다:

GSIYIHVYFTKSGFHPDPRQG (162-181) (서열 번호:258)

KALYRRLATVHMSRMINKYKG (182-201) (서열 번호:259)

ITINIVDDHTPWVKGSVPPPG (242-260) (서열 번호:262)

LDQYVKFDAVSGDYYPIIYFG (262-280) (서열 번호:263)

YPINESLASLPLRVSFCPLSG (292-311) (서열 번호:269)

GDYYPIIYFNDYWNLQKDYYG (273-292) 서열 번호:270)

C-말단 글리신 잔기가 부족한 서열 번호:258, 259, 262, 263, 269 및 270에 대응하는 폴리펩타이드는 297, 298, 301, 302, 308 및 309, 각각이다. 그와 같은 폴리펩타이드 또는 이들의 일부, 또는 이들 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이들의 일부, 또는 밀접하게 관련된 서열은 본 발명에 따라 바람직한 폴리펩타이드 중 하나의 그룹을 나타낸다

실시예 19 - CLPTM1에서 ' Bioss ' pAb의 에피토프 맵핑

물질 및 방법

펩타이드 어레이

CLPTM1의 N-말단 aa 1-354 aa는, JPT peptide Technologies GmbH에 의해 생산된, 11 aa 중첩을 가진 86 특유의 15-량체 속에서 완전 피복으로 분할되었다. Bioss 8018R 다클론성 항체는 +4 C에서 1 μg/ml o/n으로 인큐베이션되었고, PBST에서 광범위하게 세정된 다음 1:60000 희석된 Alexa flour 647 (Thermo scientific) 토끼 IgG (H+L) 다클론성 2차 항체 (카탈로그#: A-21244)로 1 시간 RT 인큐베이션되었고 반복된 PBST 세정 이후 G2502 마이크로어레이 스캐너 (Agilent Technologies)를 이용하여 검출되었다. 사용된 폴리펩타이드 및 이의 서열 식별 참조 번호는 도 32에서 보여진다.

Bioss BS8018R에 대한 에피토프 1은, 상기 부위에 대하여 최고 결합 친화도를 입증하는, 어레이에서 최고 중앙 형광 강도 (MFI) (신호 강도)를 갖는다. 어레이 (서열 번호:274-279)에서 다양한 펩타이드에 항체의 결합은 도 32a에서 보여진다.

최소 공통 분무: PKD (서열 번호:322)

가장 유망한 측접 아미노산은 또한 하기 영역 내에 참여한다:

GGAPRVASRNLFPKDTLMNLHVYISEH (서열 번호:313).

약간 더 낮은 MFI가 표시된 에피토프 2는 아직 상기 항체에 대하여 친화도를 가진 제2 부위를 시사한다. 어레이 (서열 번호:280-286)에서 다양한 펩타이드에 항체의 결합은 도 32b에서 보여진다. 우리는 상기 부위가 MIC1에 대하여 결합 부위와 부분적으로 중첩하는 것을 주목하였다. 따라서 상기 결합 패턴을 가진 Bioss 항체는, 에피토프 2에 MIC1 결합에 대하여 직접적인 경쟁에 의해 또는 에피토프1에 결합을 통한 입체 장애에 의해, MIC에 대하여 길항제일 수 있다. 에피토프 2에 대한 영역은 하기 내에 있다: LDQYVKFDAVSGDYYPIIYFNDYWNLQKDYYPINE (서열 번호:314)

24 상이한 CLPTM1 유래된 펩타이드 (서열 번호:270)의 패널로부터 Mic1에 대하여 최고 친화도를 가진 CLPTM1로부터 폴리펩타이드는 따라서 Bioss 항체에 대하여 상기 에피토프를 충접하는 것 같다.

실시예 20 - CLPTM1과 QRFPR 사이 추정 보존된 서열

실시예 7 (참조 도 12)에서 그리고 풀-다운 검정에서 수행된 어레이 검정에서 GDF15에 대하여 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌던 QRFPR의 세포외 도메인으로부터 유래된 서열은 BLAST 정렬이 수행되었던 경우 CLPTM1의 세포외 도메인의 부분과 서열 동일성의 정도를 갖는 것으로 밝혀졌다.

스코어 예상 방법 동일성 양성 갭 프레임

16.5 1.5() 구성 매트릭스 5/15(33%) 9/15(60%) 0/15(0%)

비트(31) 조정

특징:

CLPTM1 123 LFWEQHDLVYGDWTS 137 (서열 번호:125)

L+ ++H +WTS

QRFPR 193 LYEKEHICCLEEWTS 207 (서열 번호:324)

스코어 예상 방법 동일성 양성 갭 프레임

13.1 1.6() 조성-기반 4/25(16%) 12/25(48%) 0/25(0%)

비트(22) 상태

특징:

CLPTM1 107 YISEHEHFTDFNATSALFWEQ 127 (서열 번호:96)

++ E EH ++ ++

QRFPR 192 FLYEKEHICCLEEWTSPVHQK 212 (서열 번호:60)

서열 번호: 324에서 나타낸 바와 같이 서열, 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 적어도 6 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호: 324의 일부인 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드는 본 발명에 따른 추가 예시적인 폴리펩타이드를 나타낸다.

<110> Genagon Therapeutics AB <120> AGENTS FOR REDUCING THE ACTIVITY OF GDF15 <130> MPI18-001 <150> GB1512733.5 <151> 2015-07-20 <160> 405 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 431 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ala Leu Asn Ile Thr Pro Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Arg 1 5 10 15 Asp His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile Ala Leu Tyr Arg Leu Arg 20 25 30 Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Gly Arg Ala Lys Leu Ala Leu 35 40 45 Val Leu Thr Gly Val Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ala 50 55 60 Leu Val Phe Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met Arg Thr Val Thr 65 70 75 80 Asn Ile Phe Ile Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ile Thr Phe 85 90 95 Phe Cys Ile Pro Val Thr Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Asn Trp Leu 100 105 110 Gly Gly Ala Phe Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala 115 120 125 Val Val Thr Glu Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His 130 135 140 Gln Gly Leu Val His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Asn Arg 145 150 155 160 Arg Ala Phe Thr Met Leu Gly Val Val Trp Leu Val Ala Val Ile Val 165 170 175 Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe 180 185 190 Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro 195 200 205 Val His Gln Lys Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu 210 215 220 Leu Pro Leu Met Val Met Leu Ile Leu Tyr Ser Lys Ile Gly Tyr Glu 225 230 235 240 Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Gly Ser Val Leu Arg Thr Ile 245 250 255 His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val 260 265 270 Ile Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro 275 280 285 Phe His Val Val His Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu 290 295 300 Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Ile Phe Ala Ile Val Gln Ile Ile 305 310 315 320 Gly Phe Ser Asn Ser Ile Cys Asn Pro Ile Val Tyr Ala Phe Met Asn 325 330 335 Glu Asn Phe Lys Lys Asn Val Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys Ile Val 340 345 350 Asn Lys Thr Phe Ser Pro Ala Gln Arg His Gly Asn Ser Gly Ile Thr 355 360 365 Met Met Arg Lys Lys Ala Lys Phe Ser Leu Arg Glu Asn Pro Val Glu 370 375 380 Glu Thr Lys Gly Glu Ala Phe Ser Asp Gly Asn Ile Glu Val Lys Leu 385 390 395 400 Cys Glu Gln Thr Glu Glu Lys Lys Lys Leu Lys Arg His Leu Ala Leu 405 410 415 Phe Arg Ser Glu Leu Ala Glu Asn Ser Pro Leu Asp Ser Gly His 420 425 430 <210> 2 <211> 669 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala Ala Gln Glu Ala Asp Gly Ala Arg Ser Ala Val Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gln Val Thr Ser Asn Gly Ser Ile Gly 20 25 30 Arg Asp Pro Pro Ala Glu Thr Gln Pro Gln Asn Pro Pro Ala Gln Pro 35 40 45 Ala Pro Asn Ala Trp Gln Val Ile Lys Gly Val Leu Phe Arg Ile Phe 50 55 60 Ile Ile Trp Ala Ile Ser Ser Trp Phe Arg Arg Gly Pro Ala Pro Gln 65 70 75 80 Asp Gln Ala Gly Pro Gly Gly Ala Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu 85 90 95 Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile Ser Glu His 100 105 110 Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln 115 120 125 His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser Gly Glu Asn Ser Asp Gly 130 135 140 Cys Tyr Glu His Phe Ala Glu Leu Asp Ile Pro Gln Ser Val Gln Gln 145 150 155 160 Asn Gly Ser Ile Tyr Ile His Val Tyr Phe Thr Lys Ser Gly Phe His 165 170 175 Pro Asp Pro Arg Gln Lys Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Ala Thr Val His 180 185 190 Met Ser Arg Met Ile Asn Lys Tyr Lys Arg Arg Arg Phe Gln Lys Thr 195 200 205 Lys Asn Leu Leu Thr Gly Glu Thr Glu Ala Asp Pro Glu Met Ile Lys 210 215 220 Arg Ala Glu Asp Tyr Gly Pro Val Glu Val Ile Ser His Trp His Pro 225 230 235 240 Asn Ile Thr Ile Asn Ile Val Asp Asp His Thr Pro Trp Val Lys Gly 245 250 255 Ser Val Pro Pro Pro Leu Asp Gln Tyr Val Lys Phe Asp Ala Val Ser 260 265 270 Gly Asp Tyr Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln 275 280 285 Lys Asp Tyr Tyr Pro Ile Asn Glu Ser Leu Ala Ser Leu Pro Leu Arg 290 295 300 Val Ser Phe Cys Pro Leu Ser Leu Trp Arg Trp Gln Leu Tyr Ala Ala 305 310 315 320 Gln Ser Thr Lys Ser Pro Trp Asn Phe Leu Gly Asp Glu Leu Tyr Glu 325 330 335 Gln Ser Asp Glu Glu Gln Asp Ser Val Lys Val Ala Leu Leu Glu Thr 340 345 350 Asn Pro Tyr Leu Leu Ala Leu Thr Ile Ile Val Ser Ile Val His Ser 355 360 365 Val Phe Glu Phe Leu Ala Phe Lys Asn Asp Ile Gln Phe Trp Asn Ser 370 375 380 Arg Gln Ser Leu Glu Gly Leu Ser Val Arg Ser Val Phe Phe Gly Val 385 390 395 400 Phe Gln Ser Phe Val Val Leu Leu Tyr Ile Leu Asp Asn Glu Thr Asn 405 410 415 Phe Val Val Gln Val Ser Val Phe Ile Gly Val Leu Ile Asp Leu Trp 420 425 430 Lys Ile Thr Lys Val Met Asp Val Arg Leu Asp Arg Glu His Arg Val 435 440 445 Ala Gly Ile Phe Pro Arg Leu Ser Phe Lys Asp Lys Ser Thr Tyr Ile 450 455 460 Glu Ser Ser Thr Lys Val Tyr Asp Asp Met Ala Phe Arg Tyr Leu Ser 465 470 475 480 Trp Ile Leu Phe Pro Leu Leu Gly Cys Tyr Ala Val Tyr Ser Leu Leu 485 490 495 Tyr Leu Glu His Lys Gly Trp Tyr Ser Trp Val Leu Ser Met Leu Tyr 500 505 510 Gly Phe Leu Leu Thr Phe Gly Phe Ile Thr Met Thr Pro Gln Leu Phe 515 520 525 Ile Asn Tyr Lys Leu Lys Ser Val Ala His Leu Pro Trp Arg Met Leu 530 535 540 Thr Tyr Lys Ala Leu Asn Thr Phe Ile Asp Asp Leu Phe Ala Phe Val 545 550 555 560 Ile Lys Met Pro Val Met Tyr Arg Ile Gly Cys Leu Arg Asp Asp Val 565 570 575 Val Phe Phe Ile Tyr Leu Tyr Gln Arg Trp Ile Tyr Arg Val Asp Pro 580 585 590 Thr Arg Val Asn Glu Phe Gly Met Ser Gly Glu Asp Pro Thr Ala Ala 595 600 605 Ala Pro Val Ala Glu Val Pro Thr Ala Ala Gly Ala Leu Thr Pro Thr 610 615 620 Pro Ala Pro Thr Thr Thr Thr Ala Thr Arg Glu Glu Ala Ser Thr Ser 625 630 635 640 Leu Pro Thr Lys Pro Thr Gln Gly Ala Ser Ser Ala Ser Glu Pro Gln 645 650 655 Glu Ala Pro Pro Lys Pro Ala Glu Asp Lys Lys Lys Asp 660 665 <210> 3 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gln Ala Leu Asn Ile Thr Pro Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Arg 1 5 10 15 Asp His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile Ala Leu Tyr Arg Leu Arg 20 25 30 Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Gly Arg Ala Lys Leu 35 40 45 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Asn Trp Leu Gly Gly Ala Phe Ile Cys 1 5 10 15 Lys Met <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys 20 25 <210> 6 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu 1 5 10 15 Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys 20 25 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu 1 5 10 15 Glu Glu Trp Thr Ser 20 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys 1 5 10 15 Leu Glu Glu Trp Thr Ser 20 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 His Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val 1 5 10 15 Thr Ile Lys <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Lys Glu Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 353 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Ala Ala Gln Glu Ala Asp Gly Ala Arg Ser Ala Val Val Ala Ala 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gln Val Thr Ser Asn Gly Ser Ile Gly Arg 20 25 30 Asp Pro Pro Ala Glu Thr Gln Pro Gln Asn Pro Pro Ala Gln Pro Ala 35 40 45 Pro Asn Ala Trp Gln Val Ile Lys Gly Val Leu Phe Arg Ile Phe Ile 50 55 60 Ile Trp Ala Ile Ser Ser Trp Phe Arg Arg Gly Pro Ala Pro Gln Asp 65 70 75 80 Gln Ala Gly Pro Gly Gly Ala Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu Phe 85 90 95 Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile Ser Glu His Glu 100 105 110 His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln His 115 120 125 Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser Gly Glu Asn Ser Asp Gly Cys 130 135 140 Tyr Glu His Phe Ala Glu Leu Asp Ile Pro Gln Ser Val Gln Gln Asn 145 150 155 160 Gly Ser Ile Tyr Ile His Val Tyr Phe Thr Lys Ser Gly Phe His Pro 165 170 175 Asp Pro Arg Gln Lys Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Ala Thr Val His Met 180 185 190 Ser Arg Met Ile Asn Lys Tyr Lys Arg Arg Arg Phe Gln Lys Thr Lys 195 200 205 Asn Leu Leu Thr Gly Glu Thr Glu Ala Asp Pro Glu Met Ile Lys Arg 210 215 220 Ala Glu Asp Tyr Gly Pro Val Glu Val Ile Ser His Trp His Pro Asn 225 230 235 240 Ile Thr Ile Asn Ile Val Asp Asp His Thr Pro Trp Val Lys Gly Ser 245 250 255 Val Pro Pro Pro Leu Asp Gln Tyr Val Lys Phe Asp Ala Val Ser Gly 260 265 270 Asp Tyr Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln Lys 275 280 285 Asp Tyr Tyr Pro Ile Asn Glu Ser Leu Ala Ser Leu Pro Leu Arg Val 290 295 300 Ser Phe Cys Pro Leu Ser Leu Trp Arg Trp Gln Leu Tyr Ala Ala Gln 305 310 315 320 Ser Thr Lys Ser Pro Trp Asn Phe Leu Gly Asp Glu Leu Tyr Glu Gln 325 330 335 Ser Asp Glu Glu Gln Asp Ser Val Lys Val Ala Leu Leu Glu Thr Asn 340 345 350 Pro <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Tyr Ile Ser Glu His Glu His 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Leu Phe Trp Glu Gln His 1 5 <210> 17 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Tyr Ile Ser Glu His Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala 1 5 10 15 Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser 20 25 30 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser 1 5 10 15 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Ala Leu Phe Trp Glu Gln His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr 1 5 10 15 Ser <210> 20 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln 20 25 <210> 21 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His 20 25 <210> 22 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val 20 25 <210> 23 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro 20 25 <210> 24 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser 20 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr 20 <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys Leu Glu Glu Trp 20 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys Leu Glu Glu 20 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys Leu Glu 20 <210> 29 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys Leu <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys Cys <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 15 Cys <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys 1 5 10 15 Leu <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu 1 5 10 15 Glu <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu 1 5 10 15 Glu <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu 1 5 10 15 Trp <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp 1 5 10 15 Thr <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr 1 5 10 15 Ser <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp 1 5 10 15 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 15 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 <210> 53 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys 20 25 <210> 54 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys 1 5 10 15 Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys 20 25 <210> 55 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu 1 5 10 15 Glu Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys 20 25 <210> 56 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu 1 5 10 15 Glu Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys 20 25 <210> 57 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu 1 5 10 15 Trp Thr Ser Pro Val His Gln Lys 20 <210> 58 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp 1 5 10 15 Thr Ser Pro Val His Gln Lys 20 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr 1 5 10 15 Ser Pro Val His Gln Lys 20 <210> 60 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser 1 5 10 15 Pro Val His Gln Lys 20 <210> 61 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr 1 5 10 15 Ser Pro Val His Gln 20 <210> 62 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp 1 5 10 15 Thr Ser Pro Val His 20 <210> 63 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu 1 5 10 15 Trp Thr Ser Pro Val 20 <210> 64 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu 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Mus musculus <400> 182 Gln Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Cys <210> 183 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 183 Gln Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 <210> 184 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 184 Gln Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His 1 5 10 15 <210> 185 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 185 Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 15 Cys <210> 186 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 186 Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys 1 5 10 15 <210> 187 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 187 Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys 1 5 10 15 <210> 188 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 188 Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile 1 5 10 15 <210> 189 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 189 Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe Leu Tyr Glu Lys Glu 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<213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X can be any aromatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X can be any aliphatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X can be any aromatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> X can be any acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X can be any basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(9) <223> X can be any naturally occuring amino acid <400> 339 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 340 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X can be F, W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X can be L, V, I, A or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X can be any aromatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> X can be any acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X can be K, R or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(9) <223> X can be any naturally occuring amino acid <400> 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naturally occuring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> X can be any basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(9) <223> X can be any naturally occuring amino acid <400> 362 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 363 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X can be any aromatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X can be any aliphatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X can be any naturally occuring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> X can be any acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X can be any basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X can be any acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(9) <223> X can be any naturally occuring amino acid <400> 363 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 364 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X can be any aromatic amino acid <220> 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Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 399 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X can be F, W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X can be L, V, I, A or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X can be any aromatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> X can be any naturally occuring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X can be K, R or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X can be any acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> X can be any naturally occuring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X can be any aliphatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X can be any naturally occuring amino acid <400> 399 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 400 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X can be F, W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X can be L, V, I, A or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X can be any naturally occuring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> X can be any acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X can be K, R or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X can be any acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> X can be any naturally occuring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X can be any aliphatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X can be any naturally occuring amino acid <400> 400 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 401 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X can be F, W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X can be L, V, I, A or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X can be any aromatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> X can be any acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X can be K, R or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X can be any acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> X can be any naturally occuring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X can be any aliphatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X can be any naturally occuring amino acid <400> 401 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 402 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X can be F, W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X can be L, V, I, A or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X can be any aromatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> X can be any acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X can be K, R or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X can be any acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> X can be any basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X can be any aliphatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X can be any naturally occuring amino acid <400> 402 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 403 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X can be F, W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X can be L, V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X can be F, W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> X can be D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X can be K, R or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X can be D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> X can be K, R or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X can be L, V or I <400> 403 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 404 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X can be D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X can be K, R or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X can be D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> X can be F, W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X can be D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X can be D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> X can be L, V, I, A or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X can be A, S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X can be L, V, I, A or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> X can be R, K or H <400> 404 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 405 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X can be D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X can be K, R or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X can be D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> X can be F, W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X can be D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X can be D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> X can be L, V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X can be A, S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X can be L, V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> X can be R, K or H <400> 405 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

Claims (62)

1. 요법에서 사용하기 위한, 수용체 CLPTM1 및/또는 QRFPR에 결합할 수 있는 결합제로서, 상기 결합제가 GDF15와 상기 수용체 사이 상호작용을 억제시킬 수 있는, 결합제.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 결합제가 항체인, 결합제.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 항체가 다클론성 또는 단클론성 항체인, 결합제.
4. 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 또는 인간화된 항체, 또는 인간 항체인, 결합제.
5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제가 서열 번호: 15, 16, 17, 18, 200, 212, 213 내지 239, 275 내지 278, 280 내지 286 또는 322 중 어느 하나 이상에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 폴리펩타이드에 결합하는, 결합제.
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제가 청구항 7 내지 34 중 어느 한 항의 폴리펩타이드에 결합하지 않는, 결합제.
7. 요법에서 사용하기 위한 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 GDF15에 결합할 수 있고, 상기 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 이의 상호작용을 억제시킬 수 있으며, 그리고 하기인, 폴리펩타이드:
   (i) 서열 번호:5 (QRFPR의 세포외 도메인 3), 서열 번호:12 (QRFPR의 세포외 도메인 4) 또는 서열 번호:14 (CLPTM1의 세포외 도메인)에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열 번호:5, 12 또는 14와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나 포함하거나;
   (ii) 서열 번호:5, 12 또는 14의 일부이거나 상기를 포함하고, 상기 일부가 서열 번호:5, 12 또는 14의 적어도 6 연속 아미노산을 포함하거나;
   (iii) 서열 번호:5, 12 또는 14의 적어도 6 연속 아미노산에 대응하는 적어도 6 아미노산을 포함하고 서열 번호:5, 12 또는 14에서 상기 동등 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖고;
   상기 폴리펩타이드가 전장 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체의 아미노산 서열을 포함하지 않거나 상기로 구성되지 않고, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호: 243 내지 245의 어느 하나에서 제시된 상기 아미노산 서열로 구성되지 않는다.
8. GDF15에 결합할 수 있고 상기 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 이의 상호작용의 억제시킬 수 있는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 하기인, 폴리펩타이드:
   (i) 서열 번호:5 (QRFPR의 세포외 도메인 3), 서열 번호:12 (QRFPR의 세포외 도메인 4) 또는 서열 번호:14 (CLPTM1의 세포외 도메인)에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열 번호:5, 12 또는 14와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나 포함하거나;
   (ii) 서열 번호:5, 12 또는 14의 일부이거나 상기를 포함하고, 상기 일부가 서열 번호:5, 6 또는 9의 적어도 6 연속 아미노산을 포함하거나;
   (iii) 서열 번호:5, 12 또는 14의 적어도 6 연속 아미노산에 대응하는 적어도 6 아미노산을 포함하고 서열 번호:5, 12 또는 14에서 상기 동등 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖고;
   상기 폴리펩타이드가 전장 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체의 아미노산 서열을 포함하지 않거나 상기로 구성되지 않고, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호: 243 내지 249, 287 또는 288의 어느 하나에서 제시된 상기 아미노산 서열로 구성되지 않는다.
9. 청구항 8에 있어서, 요법에서 사용하기 위한, 폴리펩타이드.
10. 상기 폴리펩타이드가 서열 번호:5, 12, 14 또는 315의 어느 하나에서 제시된 상기 아미노산 서열로 구성되지 않는, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드.
11. 상기 폴리펩타이드가 하기인, 청구항 7, 9 또는 10의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8 또는 10의 폴리펩타이드:
    (i) 서열 번호:5 (QRFPR의 세포외 도메인 3), 서열 번호:12 (QRFPR의 세포외 도메인 4) 또는 서열 번호:14 (CLPTM1의 세포외 도메인) 또는 서열 번호:315 (N-말단 메티오닌을 가진 CLPTM1의 세포외 도메인)에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열은 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체에서 상기 아미노산 서열을 측접하는 아미노산 서열에 의해 한쪽 또는 양쪽 단부에서 측접되지 않거나, 서열 번호: 5, 12, 14, 또는 315의 상기 아미노산 서열이 아니지만 서열 번호:5, 12, 14, 또는 315와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 상기 아미노산 서열은 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체에서 상기 아미노산 서열을 측접하는 아미노산 서열에 의해 한쪽 또는 양쪽 단부에 측접되지 않거나; 또는
    (ii) 서열 번호:5, 12, 14 또는 315의 일부이거나 상기를 포함하고, 상기 일부가 서열 번호:5, 12, 14 또는 315의 적어도 6 연속 아미노산을 포함하되, (i) 서열 번호:5, 12, 14 또는 315의 적어도 2 연속 또는 비-연속 아미노산이 결실되고/되거나 (ii) 상기 일부가 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체에서 상기 아미노산 서열을 측접하는 아미노산 서열에 의해 한쪽 또는 양쪽 단부에서 측접되지 않거나; 또는
    (iii) 서열 번호:5, 12, 14 또는 315의 적어도 6 연속 아미노산에 대응하는 적어도 6 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 서열 번호:5, 12, 14 또는 315내 상기 동등 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖되, (i) 서열 번호:5, 12, 14 또는 315의 적어도 2 연속 또는 비-연속 아미노산이 결실되고/되거나 (ii) 서열 번호:5, 12, 14 또는 315에 대응하는 상기 아미노산 서열이 원상태 QRFPR 또는 CLPTM1 수용체에서 상기 아미노산 서열을 측접하는 아미노산 서열에 의해 한쪽 또는 양쪽 단부에서 측접되지 않는다.
12. 상기 폴리펩타이드가 서열 번호:5의 잔기 8 내지 13에 대응하는 상기 서열 FLYEK (서열 번호 210)을 포함하는, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10 또는 11의 폴리펩타이드 또는 청구항 10 또는 11의 사용을 위한 폴리펩타이드.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호:5의 잔기 3 내지 15에 대응하는 상기 서열 LEIKYDFLYEKEH (서열 번호:180)을 포함하는, 청구항 12의 폴리펩타이드 또는 청구항 12의 사용을 위한 폴리펩타이드.
14. 청구항 12 또는 13에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호 5의 잔기 22 내지 24에 대응하는 상기 서열 WTS (서열 번호 211)을 추가로 포함하는, 청구항 12 또는 13의 폴리펩타이드 또는 청구항 12 또는 13의 사용을 위한 폴리펩타이드.
15. 청구항 12 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호:11 (FLYEKEHIC)에서 제시된 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함하는, 청구항 12 내지 14 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 청구항 12 내지 14 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
16. 청구항 12 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호: 6, 7, 8 및 9로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열, 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함하는, 청구항 12 내지 15 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 청구항 12 내지 15 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
17. 서열 X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉를 포함하는, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10 또는 11의 폴리펩타이드 또는 청구항 10 또는 11의 사용을 위한 폴리펩타이드:
    상기 식 중,
    X₁이 방향족 아미노산이고;
    X₂가 지방족 아미노산이고;
    X₅가 염기성 아미노산이고; 그리고
    X₃, X₄, X₆, X₇, X₈ 및 X₉가 독립적으로 임의의 아미노산 (서열 번호:337)일 수 있다.
18. 청구항 17에 있어서,
    X₁이 F, W 또는 Y이고;
    X₂가 L, V, I, A 또는 M, 바람직하게는 L, V 또는 I이고;
    X₅가 K, R 또는 H, 바람직하게는 K 또는 R (서열 번호:338)인, 청구항 17의 폴리펩타이드 또는 청구항 17의 사용을 위한 폴리펩타이드.
19. 청구항 17 또는 청구항 18에 있어서,
    X₃이 방향족 아미노산, 바람직하게는 F, W 또는 Y이고/이거나;
    X₄가 산성 아미노산, 바람직하게는 E 또는 D (서열 번호:339 내지 344)인, 청구항 17 또는 18의 폴리펩타이드 또는 청구항 17 또는 18의 사용을 위한 폴리펩타이드.
20. 청구항 17 내지 19 중 어느 한 항에 있어서,
    X₆이 산성 아미노산, 바람직하게는 E 또는 D이고/이거나;
    X₇이 염기성 아미노산, 바람직하게는 K, R 또는 H, 더 바람직하게는 K 또는 R (서열 번호:345 내지 369)인, 청구항 17 내지 19 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 청구항 17 내지 19 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
21. 청구항 17 내지 20 중 어느 한 항에 있어서,
    X₈이 지방족 아미노산, 바람직하게는 L, V, I, A 또는 M, 더 바람직하게는 L, V 또는 I이고/이거나;
    X₉가 임의의 아미노산, 바람직하게는 C (서열 번호:370 내지 402)인, 청구항 17 내지 20 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 청구항 17 내지 20 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
22. 청구항 17 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 서열 X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉를 포함하는, 청구항 17 내지 21 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 청구항 17 내지 21 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드:
    상기 식 중,
    X₁이 F, W 또는 Y이고;
    X₂가 L, V 또는 I이고;
    X₃이 F, W 또는 Y이고;
    X₄가 D 또는 E이고;
    X₅가 K, R 또는 H이고;
    X₆이 D 또는 E이고;
    X₇이 K, R 또는 H이고;
    X₈이 L, V 또는 I이고; 그리고
    X₉가 C (서열 번호:403)이다.
23. 청구항 17 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉가 1 내지 10 아미노산에 의해 한면 또는 양면에 측접되고, 바람직하게는 상기 측접하는 아미노산 서열이 α-나선 또는 β-시트를 형성할 수 있는 아미노산을 포함하는, 청구항 17 내지 22 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 청구항 17 내지 22 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
24. 청구항 23에 있어서, 잔기 X₁이 α-나선을 형성할 수 있는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열에 의해 측접되고/되거나 잔기 X₉가 β-시트를 형성할 수 있는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열에 의해 측접되고, 바람직하게는 X₉가 C에 의해 측접되는, 청구항 23의 폴리펩타이드 또는 청구항 23의 사용을 위한 폴리펩타이드.
25. 서열 번호:13 (EKEYDDVTIK)에서 제시된 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함하는, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10 또는 11의 폴리펩타이드 또는 청구항 10 또는 11의 사용을 위한 폴리펩타이드.
26. 서열 X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀ (상기 식 중, X₁이 D 또는 E이고; X₂가 K, R 또는 H이고; X₃이 D 또는 E이고; X₄가 F, W 또는 Y이고; X₅가 D 또는 E이고; X₆이 D 또는 E이고; X₇이 L, V 또는 I이고; X₈이 A, S 또는 T이고; X₉가 L, V 또는 I이고; X₁₀이 R, K 또는 H (서열 번호:405)임)을 포함하는, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10, 11 또는 26 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 청구항 10, 11 또는 26 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
27. 서열 번호:15 (YISEHEH)에서 제시된 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함하고/하거나, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호:16 (LFWEQH)에서 제시된 바와 같은 서열, 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함하는, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10 또는 11의 폴리펩타이드 또는 청구항 10 또는 11의 사용을 위한 폴리펩타이드.
28. 상기 폴리펩타이드가 서열 번호:17에서 제시된 바와 같은 서열, 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 적어도 6 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호 17의 일부인 서열을 갖거나 포함하는, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10, 11 또는 27 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10, 11 또는 27 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
29. 상기 폴리펩타이드가 서열 번호:18의 서열 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함하는, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10, 11, 27 또는 28 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 청구항 10, 11, 27 또는 28 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
30. 서열 번호:258, 259, 262, 263, 269, 270, 297, 298, 301, 302, 308 또는 309 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열 또는 적어도 6 연속 아미노산을 포함하는 임의의 상기 서열의 일부인 서열을 갖거나 포함하는, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10 또는 11의 폴리펩타이드 또는 청구항 10 또는 11의 사용을 위한 폴리펩타이드.
31. 서열 번호:30, 31, 32, 39, 46, 47 또는 175 내지 189 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖거나 포함하는, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10 또는 11의 폴리펩타이드 또는 청구항 10 또는 11의 사용을 위한 폴리펩타이드.
32. 상기 폴리펩타이드가 이량체의 형태 또는 더 높은 다량체 형태인, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10 내지 31 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 청구항 10 내지 31 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
33. 융합 단백질로서 제공되는, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10 내지 32 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 청구항 10 내지 32 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
34. 청구항 33에 있어서, 상기 융합 단백질내 상기 융합 파트너가 알부민, 트랜스페린, Fc, 피브리노겐, 호모 아미노산 폴리머, 프롤린-알라닌-세린 폴리머, 또는 엘라스틴-유사 펩타이드이고, 상기 융합 파트너가 링커 서열에 의해 선택적으로 연결되는, 청구항 33의 폴리펩타이드 또는 청구항 33의 사용을 위한 폴리펩타이드.
35. 상기 폴리펩타이드가 환형 폴리펩타이드인, 청구항 7 또는 9의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 8의 폴리펩타이드, 또는 청구항 10 내지 32 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 청구항 10 내지 32 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
36. GDF15의 상승된 또는 원치않는 수준과 관련된 병태 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한, 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 결합제 및/또는 청구항 7, 8 또는 10 내지 35 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의, 용도.
37. 적어도 1종의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께, 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 결합제 및/또는 청구항 7, 8 또는 10 내지 35 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는, 약제학적 조성물.
38. GDF15의 상승된 또는 원치않는 수준과 관련된 병태의 치료 또는 예방에서 분리, 순차 또는 동시 사용을 위하여 조합된 제제로서 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 결합제 및 청구항 7, 8 또는 10 내지 35 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는, 생성물.
39. GDF15의 상승된 또는 원치않는 수준과 관련된 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 결합제 및/또는 청구항 7, 8 또는 10 내지 35 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
40. GDF15의 상승된 또는 원치않는 수준과 관련된 병태의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 사용을 위한 결합제 및/또는 청구항 7 또는 9 내지 35 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드, 또는 청구항 37의 약제학적 조성물.
41. 상기 병태가 암, 악액질, 골 장애, 심혈관 질환, 만성 폐 장애, 폐 동맥 고혈압, 신장 장애, 겸상 세포 질환, 선천성 구상적혈구증 또는 철분 과부하 장애의 1종 이상으로부터 선택되는, 청구항 39의 사용을 위한 결합제 및/또는 청구항 40의 사용을 위한 폴리펩타이드.
42. 청구항 40 또는 청구항 41에 있어서, GDF15의 상기 면역억제 효과 감소에 사용하기 위한, 청구항 40 또는 청구항 41의 사용을 위한 결합제 및/또는 청구항 40 또는 청구항 41의 사용을 위한 폴리펩타이드.
43. 청구항 40 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 암에서 전이 억제용, 특히 골의 참여 억제용을 포함하는, 암 세포에 의한 면역 회피 억제에 사용하기 위한, 청구항 40 내지 42 중 어느 한 항의 사용을 위한 결합제 및/또는 청구항 40 내지 42 중 어느 한 항의 사용을 위한 폴리펩타이드.
44. 청구항 41에 있어서, 상기 악액질이 암-유도되는, 청구항 41의 사용을 위한 결합제 및/또는 청구항 41의 사용을 위한 폴리펩타이드.
45. 시험관내 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 GDF15의 상호작용 억제를 위한, 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 결합제 및/또는 청구항 7, 8 또는 10 내지 35 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의, 용도.
46. 청구항 1 내지 8 또는 10 내지 35 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 및/또는 결합제인 치료제에 의해 요법 또는 예방이 필요한 대상체의 검출 방법으로서, 상기 방법이 GDF15와 상기 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1 사이 상호작용, 및/또는 상기 상호작용의 효과를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
47. 청구항 1 내지 8 또는 10 내지 35 중 어느 한 항의 결합제 및/또는 폴리펩타이드인 치료제의 대상체에 대한 투여에 의해 요법 또는 예방의 방법을 평가 또는 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법이 GDF15와 상기 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1 사이 상호작용, 및/또는 상기 상호작용의 효과를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
48. GDF15의 상승된 수준과 관련된 병태를 갖거나 상기 병태가 발병할 위험에 처한 대상체의 검출 방법으로서, 상기 방법이 상기 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1과 GDF15의 상호작용, 및/또는 상기 상호작용의 효과를 상기 대상체에서 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
49. 청구항 46 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, GDF15와 상기 수용체 QRFPR 및/또는 CLPTM1 사이의 상기 상호작용이 원 위치 근접 결찰 검정에 의해 검출되는, 방법.
50. 청구항 46 내지 48 중 어느 한 항에 있어서 상기 상호작용이 GDF15와 QRFPR 사이의 것이고, 그리고 상기 상호작용의 효과가 QRFPR-함유 엑소좀의 상승된 수준인, 방법.
51. 청구항 46 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상호작용이 GDF15와 CLPTM1 사이의 것이고, 그리고 상기 상호작용의 효과가 인산화된 GSK3b의 상승된 수준인, 방법.
52. 상기 세포가 변형되지 않은 세포와 비교된, CLPTM1의 감소된 수준 및/또는 이의 활성을 갖도록 변형되는, 세포독성 면역 세포.
53. 청구항 52에 있어서, 상기 세포가 암 세포의 표면에서 항원에 대한 특이성을 갖는 T-세포 수용체를 발현시키기 위해 발현하거나 변형된 세포독성 T-세포인, 세포.
54. 청구항 52에 있어서, 상기 세포가 암 세포의 표면에서 항원에 대한 특이성을 갖는 키메라 항원 수용체를 발현시키기 위해 변형된 세포독성 T-세포인, 세포.
55. 청구항 52에 있어서, 상기 세포가, 암 세포의 표면에서 항원에 대한 특이성을 갖는 키메라 항원 수용체를 발현시키기 위해 임의로 변형된, 자연 살해 세포 (NK-세포)인, 세포.
56. 청구항 52 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 유전자 암호화 CLPTM1의 녹아웃, 넉다운 또는 결실인, 세포.
57. 청구항 52 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 요법에서 사용하기 위한, 세포.
58. 청구항 57에 있어서, 암 요법에서 사용하기 위한, 사용하기 위한 세포
59. 암 요법에서 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 청구항 52 내지 56 중 어느 한 항의 세포의, 용도
60. 적어도 1종의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께, 청구항 52 내지 56 중 어느 한 항의 세포를 포함하는, 치료 조성물.
61. 청구항 52 내지 56 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
62. 암 치료에서 분리, 순차 또는 동시 사용을 위하여 조합된 제제로서, 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 결합제 및/또는 청구항 7, 8 또는 10 내지 35 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 및 청구항 52 내지 56 중 어느 한 항의 세포를 포함하는, 생성물.

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