JP2018529716A - 癌幹細胞を阻害する組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、概して、癌の治療に有用な組成物及び方法を提供する。より具体的には、本方法及び組成物は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を検出し、定量化し、阻害し、死滅させ、分化させ、又は除去するために使用することができ、ＣＳＣに関連する癌、特にＬＯＸ１を発現する癌及びＣＳＣの治療において使用することができる。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１５年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２３５，１４４号明細書の利益を主張するものであり、この仮特許出願は参照により全体として本明細書に援用される。
電子的に提出された配列表の参照
本願は、「Ｌｏｘ１−２００ＷＯ１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ」と題される２０１６年９月２８日に作成されたサイズ５０，０６５バイトのテキストファイルとしてコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）で本願と共に提出される配列表を参照により援用する。
ある種の癌（例えば、小児白血病、ホジキン病及び精巣癌）との闘いにおいて幾つもの有効な治療が実現されており、早期発見及び予防に関する患者教育が進んでいる点である種の一般的な癌（例えば、乳癌、前立腺癌）の死亡率は低下しているが、多くの進行型の癌を有する患者の生存率は数十年にわたり大きくは変化していない。そのため、癌はなおも米国で２番目に多い死亡原因となっている。
癌幹細胞（ＣＳＣ）は、その名称が含意するとおり、多能性及び無制限の自己複製という幹細胞様の特性を有する一部の癌細胞である。このように、この部分的細胞集団は腫瘍形成及びその環境への適応に関与していると考えられる。幾つかの種類のエビデンスから、現在、ＣＳＣは、特に残存疾患が最小限の例で、癌の薬剤耐性、転移、及び再燃に関与している可能性が高いことが示唆されている。実際、最近の臨床エビデンスにより、ＣＳＣシグネチャを持つ細胞では標準ケア療法後に生き残る乳癌細胞の割合が高まることが示された（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。同様の研究において、５ｑ欠失ＭＤＳを有する患者もまた、臨床的及び細胞遺伝学的寛解が見られているにも関わらず、その骨髄に残留する悪性幹細胞集団を有することが分かった（Ｔｅｈｒａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。多くの臨床徴候において、現在、初期の治療応答にも関わらず、特徴的な一部の抵抗性癌細胞の保持が再燃及び潜在的に転移につながり得ると考えられている。
癌幹細胞は初めて同定されて以来、多くの腫瘍型で発見され、検証されてきた。当初ＣＳＣがＡＭＬモデルで同定された後（Ｌａｐｉｄｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、ＣＳＣは幾つもの血液系及び固形腫瘍の悪性病変で発見され、検証された。固形腫瘍におけるＣＳＣの最初のエビデンスは乳癌から得られ、ここでＣＳＣはＣＤ４４＋／ＣＤ２４−表面マーカー表現型を持つことが分かった（Ａｌ−Ｈａｊｊ ｅｔ ａｌ．，２００３）。膵癌におけるＣＳＣもまた十分に特徴付けられている。様々な報告によって膵癌ＣＳＣはＥｐｃａｍ＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２４＋（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）又はＣＤ１３３＋（Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）のいずれかであることが同定されているが、他にも、三重陽性Ｅｐｃａｍ＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２４＋シグネチャがＣＳＣの腫瘍形成表現型で最良にトラッキングすることが報告されている（ｖａｎ Ｖｌｅｒｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。諸報告で結腸直腸癌におけるＣＳＣが同定されており、腸腫瘍及び結腸直腸腫瘍については、諸研究がマウスにおいて幹細胞起源を同定している（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。それにも関わらず、この分野の技術水準ではヒトＣＳＣの表面マーカー表現型に関して意見の一致が見られていない。ＣＤ６６（Ｇｅｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、ＬＧＲ５（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、並びにＣＤ４４及びＣＤ１３３（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）など、多くの表面マーカーが報告されているが、この分野には、これらの表面マーカー表現型のいずれかがヒトＣＳＣに関する一致した意見を表し得るという強固な確証がなく、ＣＳＣの存在の同定には非付着性スフェア成長（例えば腫瘍スフェア）などの他の技法が一般に利用されることにつながっている。
従来の及び新規開発中の抗癌療法（例えば、化学療法、放射線照射、手術）は腫瘍を縮小させるその能力に基づき評価されるが、これらの療法は癌幹細胞の阻害又は死滅に有効でないこともあり、癌の再発及び抵抗性を招き得る。更に、癌幹細胞は転移に関係するため、癌幹細胞を阻害しない又は死滅させない療法は、長期にわたる疾患治療又は患者生存に有効でないこともある。従って、ＣＳＣ集団を標的化して除去する能力を有する新薬を同定し、開発することが決定的に重要であり、このように任意の奏効する対癌療法の重要な要素として薬物が出始めている。最近の研究では、初期の治療介入成功後もなお、ＣＳＣが癌の化学療法抵抗性、転移、及び最終的に再燃に関与することが示されている。ＣＳＣは胚性幹細胞の多能性をドライブするのと同じ主要な自己複製経路によってドライブされるが、ＣＳＣ活性をドライブする他の細胞経路に関する知識は未だ限られている。
従って、癌の腫瘍形成能を低下させ、及び癌細胞、特に癌幹細胞を阻害し又は死滅させる（例えばアポトーシス又は分化を誘導する）方法を含め、癌の治療に向けた更なる組成物及び方法が利用可能であれば、より多くの治療選択肢が得られるとともに、疾患の寛解及び／又は患者のクオリティ・オブ・ライフの向上など、より良好な臨床転帰となる可能性が広がり得る。
一態様において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖を阻害する方法に関し、この方法は、ＣＳＣの増殖を阻害し及び／又はその生存を低下させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬にＣＳＣを接触させるステップを含む。
ある態様において、本開示は、以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法に関し、この方法は、治療抵抗性癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）を阻害し又は死滅させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、治療抵抗性癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）の分化を誘導するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含み得る。
ある態様において、本開示は、以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法に関し、この方法は、治療抵抗性癌を治療するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む。
ある態様において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを標的化して阻害する又は死滅させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を治療を必要としている対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）の分化を誘導するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含み得る。
ある態様において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法に関し、この方法は、癌を治療するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を治療を必要としている対象に投与するステップを含む。
ある態様において、本開示は、再発癌又は再燃癌を有する対象の癌を治療する方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、再発癌又は再燃癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）の分化を誘導するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含み得る。
ある態様において、本開示は、再発癌又は再燃癌を有する対象の癌を治療する方法に関し、この方法は、癌を治療するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む。
一態様において、本開示は、癌の再発又は再燃を予防する方法に関し、この方法は、癌の再発又は再燃を予防するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を癌の再発又は再燃の予防を必要としている対象に投与するステップを含む。
更なる態様において、本開示は、癌を有する対象の癌の再燃リスクを低下させる方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させて、それによって対象の癌の再燃リスクを低下させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）の分化を誘導して癌の再燃又は再発リスクを低下させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含み得る。
別の態様において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を除去する方法に関し、この方法は、ＣＳＣを除去するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬にＣＳＣを接触させるステップを含む。
ある態様において、本開示は、癌細胞集団中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の数を選択的に減少させる方法に関し、この方法は、癌細胞集団におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に癌細胞集団を接触させるステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、癌細胞集団における癌幹細胞（ＣＳＣ）の分化を誘導してＣＳＣの数を減少させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含み得る。
更なる態様において、本開示は、腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法を提供し、この方法は、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に腫瘍を接触させるステップを含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法を提供し、この方法は、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を患者に投与するステップを含む。
別の態様において、本開示は、腫瘍のサイズを低下させる方法を提供し、この方法は、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に腫瘍を接触させるステップを含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍のサイズを低下させる方法に関し、この方法は、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を患者に投与するステップを含む。
別の態様において、本開示は、腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防する方法を提供し、この方法は、腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に腫瘍を接触させるステップを含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防する方法に関し、この方法は、腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を患者に投与するステップを含む。
別の態様において、本開示は、化学療法を必要としている患者の化学療法関連心毒性を阻害し、低下させ、又は予防する方法を提供し、この方法は、化学療法関連心毒性を阻害し、低下させ、又は予防するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を患者に投与するステップを含む。一実施形態において、化学療法はドキソルビシンなどのアントラサイクリンである。一実施形態において、ＬＯＸ１阻害薬はＬＯＸ１抗体である。
本開示はまた、治療用組成物及び医薬組成物を含めた、組成物におけるＬＯＸ１阻害薬、又はその組み合わせの１つ以上の使用にも関する。実施形態において、本使用及び組成物は、本明細書に開示される様々な方法を提供するのに有効な量の１つ又は複数の阻害薬を含む。実施形態において、１つ以上の使用は、本明細書に記載される腫瘍、癌幹細胞、及び／又は癌のうちの１つ以上を治療する（例えば、死滅させ、除去し、阻害し、細胞増殖の進行及び／又は進行速度を低下させ、病状の進行及び／又は進行速度を低下させ、自己複製能及び拡大能を低下させる（例えば分化を誘導する））ための医薬の製造への使用に関する。
別の態様において、本開示は、癌細胞を含む試料中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在を診断、予測、定量化、同定、及び／又は検出する方法を提供し、ここでこの方法は、
ＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列に結合する薬剤に試料を接触させるステップ；
薬剤とＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列との間の結合の存在又は非存在を検出するステップ；及び
薬剤とＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列との間の結合の検出に基づき試料中のＣＳＣの存在を同定するステップ、を含む。
この態様の実施形態において、本方法は、
試料中のＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列の量を定量化するステップ；
ＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列の量をＬＯＸ１核酸又はＬＯＸ１アミノ酸の基準レベルと比較するステップ；及び／又は
検出された量が基準レベルよりも多い場合に試料中のＣＳＣの存在を同定するステップ、のうちの１つ以上を更に含み得る。
更に別の実施形態において、本方法は、検出可能部分を含む薬剤を含み得る。一部の実施形態において、本薬剤は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＬＯＸ１核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）の少なくとも一部分にハイブリダイズする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、本薬剤は、ＬＯＸ１アミノ酸配列の少なくとも一部分に特異的に結合する抗体を含み得る。
上記の態様の様々な実施形態において、本方法は、ＬＯＸ１を発現する腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団に関する。更なる実施形態において、腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団はスフェア形成ＣＳＣを含み得る。
上記の態様の様々な実施形態において、本方法は、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、副腎癌、白血病、黒色腫、骨髄腫、前立腺癌、甲状腺癌、及び乳癌から選択される腫瘍及び／又は癌に関する。
本明細書に記載される態様及び実施形態は、ＬＯＸ１阻害薬、ＬＯＸ１阻害薬の組み合わせ、及び／又は他の癌療法薬を含む方法に関する。一部の実施形態において阻害薬には、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、ＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。
上記の態様及び実施形態はまた、血管新生、腫瘍発生、及び癌に関係する疾患を治療又は管理するための追加的な療法を更に含む方法、使用、及び組成物であって、例えば、化学療法、放射線療法、免疫療法、又は当該技術分野において公知の任意の他の活性薬剤若しくは療法などの治療レジメンを含み得る方法、使用、及び組成物にも関する。
当業者には、以下の説明及び例示的描写を考察することにより他の態様が明らかとなるであろう。
本開示を説明するため、図面に本開示の特定の態様が示される。しかしながら、本開示は図面に示される態様の正確な構成及び機器に限定されない。
図１Ａ〜図１Ｃは、膵臓ＰＤＸモデルからのＣＳＣのエンリッチメントを示す。（Ａ）後期転移性膵癌に由来する３つの膵臓ＰＤＸモデルのＨ＆Ｅ染色。（Ｂ）Ａに示されるＰＤＸモデルから生成された腫瘍スフェア。（Ｃ）４日目に、膵臓ＣＳＣの指標となる表面マーカーの両方（ＣＤ２４及びＣＤ４４）並びにＣＳＣ状態を維持すると同定された遺伝子（ＥＺＨ２、ＢＭＩ１、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇ）の発現に関して腫瘍スフェアを分析した。 図２は、ＣＳＣの阻害能を有するＤＡＲＰｉｎの同定に用いられる一般化したスクリーニングカスケード戦略を示す。初めにネガティブ選択を用いて目的外のタンパク質を除去し、続いて膵臓ＰＤＸモデルから生成されたＣＳＣ腫瘍スフェアに関してポジティブ選択を行った。ＣＳＣに結合し、及び正常細胞に結合しないＤＡＲＰｉｎの特異性を確認し、それらのＤＡＲＰｉｎについて、そのＣＳＣ阻害能力をアッセイで試験し、１つ又は複数のＤＡＲＰｉｎ標的を同定する。 図３Ａ〜図３Ｂは、ＤＡＲＰｉｎ（ＳＴＥＭ０２６８）が膵臓ＣＳＣに結合するが、正常細胞には結合しないことを示す。（Ａ）ＳＴＥＭ０２６８は、ＦＡＣＳで単離した（ＣＤ２４＋、ＣＤ４４＋、ＥｐＣＡＭ＋によって選別した）膵臓ＣＳＣに結合するが（右側のパネル）、正常膵上皮細胞には結合しない（左側のパネル）。挿入図は、ＦＭＡＴによって結合を分析した細胞の更に明るい明視野像を示す。 （Ｂ）レーン１は抗ＥｐＣＡＭであり；レーン２は抗ＭＨＣ１−ＡＦ４８８であり；レーン３は細胞＋生死判別色素であり；レーン４はＥ−３−５であり；レーン５はＤＡＲＰｉｎ ＳＴＥＭ ０２６８であり；レーン６は非染色細胞である。ＳＴＥＭ０２６８は正常気管支上皮又は結腸上皮細胞に結合せず、及び腎上皮細胞に最小限の結合を示す。 図４Ａ〜図４Ｃは、ＳＴＥＭ０２６８が膵癌細胞に結合し、ＣＳＣでエンリッチされることを示す。ＳＴＥＭ０２６８は２つの対照ＤＡＲＰｉｎ−Ｆｃと比較したときＰＤＸモデルＰＡ−０１６５（Ａ）及びＰＡ−０１４３（Ｂ）に結合する。しかしながら、ＳＴＥＭ０２６８は全腫瘍細胞にある程度の結合を呈するが、ＣＳＣには大幅に増加した結合を呈する（Ｃ）。 図５Ａ〜図５Ｃは、ＳＴＥＭ０２６８が膵臓ＣＳＣを阻害することを示す。ＳＴＥＭ０２６８は、ＰＡ−０１４３（Ａ）及びＰＡ−０１６５（Ｂ）の両方でスフェア形成の阻害を示す。ＳＴＥＭ０２６８はまた、ＥＺＨ２ｈｉｇｈ細胞の数によって計測したときＨＰＡＣ細胞株のＣＳＣも阻害する（対照＝無関係のＤＡＲＰｉｎ対照）。図５Ａ及び図５Ｃに示す実験はまた、陽性対照としてサリノマイシン（１μＭ）も使用した。 図６Ａ〜図６Ｃは、ＳＴＥＭ０２６８の標的としてのＬＯＸ１を同定する実験を示す。（Ａ）種々のタンパク質を過剰発現するＨＥＫ２９３のＦＡＣＳ分析。中央のパネルは、ＳＴＥＭ０２６８のＬＯＸ１発現細胞への結合を示す。対照には、プラスミド無し及びＦｃγＲ２ｂを過剰発現する細胞（「Ｆｃｇｒ２ｂ」）が含まれた。非標的タンパク質（Ｓ１ＰＲ２及びＢＭＰＲ１Ａ）を発現するＨＥＫ２９３細胞へのＳＴＥＭ０２６８結合の例が示される。（Ｂ）フラグタグ付加組換えヒトＬＯＸ１によるＥＬＩＳＡがＳＴＥＭ０２６８の結合を示す。対照には、ヒトタンパク質に結合しない２つのＤＡＲＰｉｎ−Ｆｃ（対照１及び２）並びに抗ＦＬＡＧ抗体及び二次抗体単独が含まれる。（Ｃ）ＳＴＥＭ０２６８の組換えヒトＬＯＸ１へのＯｃｔｅｔ結合。 図７Ａ〜図７Ｃは、複数のモデルにおけるＬＯＸ１阻害薬によるＣＳＣの阻害を実証する。（Ａ）図５Ａ及び図５Ｂで利用した膵臓ＰＤＸモデルにおけるＤＡＲＰｉｎ ＳＴＥＭ０２６８と比較したときのＬＯＸ１モノクローナル抗体、ＬＸ５１４０１１０によるＣＳＣの同程度の阻害レベル。ＬＸ５１４０１１０は更なる膵細胞株（Ｂ）、並びに結腸直腸細胞株（Ｃ）のＣＳＣを阻害する。 図８Ａ〜図８Ｂは、膵癌におけるＬＸ５１４０１１０によるインビボでのＣＳＣの阻害を示す。（Ａ）ＬＸ５１４０１１０は、予想どおり、腫瘍モデル内のＣＳＣのごく一部を特異的に標的化したとき、ＰＡ０１４３の成長の中程度の低下につながる。Ｐ＜０．０００１ チューキーの多重比較検定、媒体及びＩｇＧ１治療アームのいずれかと比較したときのＬＸ５１４０１１０。（Ｂ）ＬＸ５１４０１１０による治療後、ＰＡ０１４３のＣＳＣは低下する。 図９Ａ〜図９Ｂは、ＬＸ５１４０１１０とゲムシタビンとの組み合わせがＣＳＣの阻害能を有することを実証する。（Ａ）Ｐａｎ０２．１３膵細胞株の成長がゲムシタビン（ＧＥＭ）によって阻害される。（Ｂ）ゲムシタビンによるＰａｎ０２．１３の処理はＰａｎ０２．１３におけるＣＳＣの増加につながり、これはＬＸ５１４０１１０によって逆転させることができるが、非特異的対照ＩｇＧ１によってはできない。 図１０Ａ〜図１０Ｂは、ドキソルビシンがＬＯＸ１発現を増加させ得ることを示す。（Ａ）ドキソルビシンで処理したヒト大動脈内皮細胞はＬＯＸ１の発現の増加を示す。対照として酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）を使用した。（Ｂ）ドキソルビシンで処理した心筋細胞もまた、ＬＯＸ１発現の増加を示す。 図１１Ａ〜図１１Ｂは、ドキソルビシンによって誘発される心筋細胞損傷及びＬＸ５１４０１１０がその損傷を逆転させる能力を示す。（Ａ）ドキソルビシン（ＤＯＸ）で処理した心筋細胞はカルシウムレベルが増加し、心筋細胞機能障害を示す。これらのレベルはＬＸ５１４０１１０によって逆転する。（Ｂ）ＤＯＸにより処理した心筋細胞は生存率の低下を示し、一方、ＬＸ５１４０１１０で前処理したものは細胞生存率の増加を示す。
本明細書に記載される発明は、初めて、レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体−１（ＬＯＸ１）がＣＳＣに過剰発現し、ＣＳＣにおける機能的に関連性のある治療標的であることを実証する。諸報告で幾つかの癌におけるＬＯＸ１発現の可能性が言及されているが、癌、癌転移の治療、特にＣＳＣの阻害に向けた新規の予期せぬ方法をもたらすような、任意のＣＳＣ表現型に至るまでＬＯＸ１の発現及び機能を同定した報告はない。本明細書に開示される特定の態様及び非限定的な実施形態に示されるとおり、ＬＯＸ１活性を標的化して阻害する本新規方法は、ＣＳＣ表現型を有する細胞を含み及びそれを呈する癌に対して有用且つ有効である。一部の例示的な実施形態において、本明細書に開示される方法及び薬剤は、例えば、膵癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、及び乳癌を含めた、ＬＯＸ１を発現するＣＳＣ細胞を含む癌のターゲティングに使用し得る。従って、本開示は、癌に罹患している患者の様々な癌の阻害及び／又は治療並びにクオリティ・オブ・ライフの向上に用いることのできる、ＣＳＣを阻害する方法及び薬剤を含む新規ターゲティング戦略を提供する。
ＬＯＸ１は、ジスルフィド結合したＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＬＯＸ１は、初めは酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）の主要な受容体として同定された（Ｋｕｍｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。この受容体は、短いＮ末端細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、ネックドメイン及びＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）からなり、ＣＴＬＤの構造は解かれている（Ｏｈｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５））。加えて、ＬＯＸ１はネックドメインでタンパク質分解によって切断され、可溶性ＬＯＸ１（ｓＬＯＸ１）を放出し得る。ＬＯＸ１はクラスＥスカベンジャー受容体であり、ｏｘＬＤＬ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ホスファチジルセリン、終末糖化産物（ＡＧＥ）、スモールデンスリポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）、酸化ＨＤＬ、Ｎ４−オキソノナノイルリジン（ＯＮＬ）、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、血小板、白血球及びアポトーシス細胞を含めた複数のリガンドに結合する。これらのリガンドの多く、特にｏｘＬＤＬは、アテローム性動脈硬化症に関連付けられている。ＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及びＮＦκＢを含めて、複数のシグナル伝達経路がＬＯＸ１活性化に関連付けられている。例えば、Ｔａｙｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．４３（７）：７４０−５（２０１３）を参照のこと。
前臨床エビデンスによれば、ＬＯＸ１は、血管機能不全、プラーク進展、破裂及び血栓症、アテローム性動脈硬化症及び炎症状態の促進に関係している。例えば、Ｕｌｒｉｃｈ−Ｍｅｒｚｅｎｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）を参照のこと。例えば、ＬＯＸ１ノックアウトマウスではアテローム性大動脈硬化症が軽減され、且つ血管壁コラーゲン沈着が減少しており（Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，（２００７））、一方、ＬＯＸ１の過剰発現によりアテローム性動脈硬化プラークの形成が増加し（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，（２００５）；及びＷｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１１））、ここでＬＯＸ１発現は不安定プラークの肩に観察され、マクロファージ集積、アポトーシス、及びＭＭＰ−９発現が付随した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０））。中和ＬＯＸ１抗体によってアセチルコリン誘導性冠細動脈拡張が回復し（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，（２００７））、ラットにおけるバルーン傷害後の内膜肥厚が減少した（Ｈｉｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，（２００６））。ヒトにおけるＬＯＸ１発現は構成的でないが、炎症促進性刺激によって動的に誘導することが可能である。アテローム性動脈硬化プラークでは、ＬＯＸ１は内皮細胞、平滑筋細胞及びマクロファージに発現する。興味深いことに、血清中ｓＬＯＸ１が急性冠症候群（ＡＣＳ）患者におけるプラークの不安定性及び破裂の診断指標となること（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０））；ＡＣＳの再発又は死亡の予測指標となること（Ｋｕｍｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）が提案されており；及び複合病変数の増加に関連付けられている（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１１））。
上記に加えて、ＬＯＸ１は、前立腺癌などの幾つかの癌型において発現が増加することが示されている（Ｆａｎｇｎｉｎｇ Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５））。また、高いタンパク質発現レベルが、高い体重指数と併せて、扁平上皮非小細胞肺癌における予後不良の予測となり得ることも報告されている（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１５））。ＬＯＸ１はまた、ＮＦ−ｋＢの活性化を通じた正常乳房上皮細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）の腫瘍原性細胞株への変換に関与することも報告されており、細胞増殖及び遊走における何らかの関与が推測される（Ｋｈａｉｄａｋｏｖ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）及びＨｉｒｓｈ ＨＡ ｅｔ ａｌ．（２０１０））。これらの報告は、幾つかの癌でＬＯＸ１が役割を果たし得る可能性について考察しているが、本明細書に提供される開示は、ＬＯＸ１がＣＳＣ生物学において役割を果たしていることの初めてのエビデンスであると考えられる。
本開示は、ＣＳＣに対する新規標的としてのＬＯＸ１の同定についての説明及び概要を含む。本明細書において言及されるとき、関連性のあるＣＳＣ標的としてのＬＯＸ１の決定は、膵癌から得られた患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルの表現型選択及び分析を取り入れた例示的な例によって考察される。ＰＤＸモデルにおいて腫瘍スフェアの生成によってＣＳＣをエンリッチし、及び実施例で考察するスクリーニング過程を通じ、ＬＯＸ１の阻害薬を利用してＣＳＣを阻害する（例えば、増殖を阻害し、分化を誘導し、ＣＳＣアポトーシスを誘導し、又は他の方法でＣＳＣ増殖を死滅させ若しくはその進行を遅らせる）ことができる。
従って、ＬＯＸ１はＣＳＣの成長及び活性において役割を果たし、これはＣＳＣ生物学にとって完全に新規である。本開示は、ＣＳＣ、例えば膵癌モデルに由来するＣＳＣなどがＬＯＸ１を発現し、次にはＬＯＸ１がＣＳＣ自己複製及び増殖に影響を及ぼし得ることを実証する例示的な実施形態を提供する。ＬＯＸ１活性をＬＯＸ１阻害薬、例えばモノクローナル抗体などで中和することを含む戦略は、ＣＳＣ阻害に有意な効果をもたらすことができ、ＬＯＸ１を標的化して腫瘍中のＣＳＣを減少させる療法の多大な可能性を裏付ける。
本開示の更に詳細な説明を続ける前に、本開示は具体的な組成物又は方法ステップに限定されず、従って異なり得ることが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象が含まれることに留意しなければならない。更に、これらの用語並びに用語「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に使用することができる。
更に、「及び／又は」は、２つの指定される特徴又は構成要素の各々の、他方を伴う又は伴わない具体的な開示と解釈されなければならない。従って、用語「及び／又は」は、「Ａ及び／又はＢ」などの表現で用いられるとき、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「及び／又は」は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの表現で用いられるとき、以下の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）の各々を包含することが意図される。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓが、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭語、及び記号は、その国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に指示されない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載する。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体として参照することにより有され得る本開示の様々な態様の限定ではない。従って、以下に直ちに定義する用語は、本明細書を全体として参照することによってより完全に定義される。
態様が「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を伴い記載される場合は常に、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／又は「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の用語で記載される他の点では類似の態様もまた提供される。
用語「約」及び「近似的に」は、本発明との関連において、当業者が問題の特徴の技術的効果がなおも確保されると理解するであろう精度の幅を指す。この用語は、典型的には、指示される数値からの約±１０％、又は約±５％の偏差を包含する。
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、好ましくは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７の数学的アルゴリズムを用いて達成される。かかるアルゴリズムは、例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトで利用可能なＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｐプログラムに組み込まれている。パーセント同一性の決定は、好ましくはＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｐプログラムの標準パラメータで実施される。
アミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨するその一般的に知られる三文字記号又は一文字記号によって参照され得る。同様に、ヌクレオチドは、その一般的に認められた一文字コードによって参照され得る。
用語「ＬＯＸ１」及び「レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体１」は、本明細書では同義的に使用され、ＬＯＸ１及び／又はＬＯＸ１の生物学的に活性な断片を指す。３つのｈＬＯＸ１アイソフォームのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００２５３４．１、ＮＰ＿００１１６６１０３．１、及びＮＰ＿００１１６６１０４．１（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）にて提供される。
用語「阻害する」、「遮断する」、「低減する」、及び「抑制する」は、本明細書では同義的に使用され、活性の完全な遮断を含めた、生物学的活性の統計的に有意な任意の低下を指す。例えば、「阻害」は、ＬＯＸ１生物学的活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の低下を指し得る。従って、例えば、細胞表面ＬＯＸ１を発現する細胞（例えば、ＣＳＣ）における且つＬＯＸ１リガンド（例えば、ｏｘＬＤＬ、ＣＲＰ及びＡＧＥ）の存在下でのＬＯＸ１媒介性シグナル伝達経路に対する効果を記述するために用語「阻害」又は「抑制」が適用されるとき、これらの用語は、ＬＯＸ１結合タンパク質、例えば抗ＬＯＸ１抗体が、細胞におけるＬＯＸ１媒介性の誘導シグナル伝達を統計的に有意なレベルで（例えば、０．０５以下のｐ値で）低下させる能力を指す。更なる態様において、ＬＯＸ１媒介生物学的活性の阻害又は遮断はプログラム細胞死（即ちアポトーシス）をもたらす。更なる実施形態において、ＬＯＸ１媒介生物学的活性の阻害又は遮断は細胞（例えばＣＳＣ）の分化をもたらす。
本明細書で同義的に使用されるとおりの用語「抗体」又は「免疫グロブリン」には、全抗体及びその任意の抗原結合断片又は単鎖が含まれる。典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互に接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含む。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略する）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略する）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣｌを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＷ）と呼ばれるより保存された領域が間に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｉｔｙ）領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順番、即ち、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４に並んだ３つのＣＤＲと４つのＦＷとを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンが免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた宿主組織又は因子に結合するのを媒介することができる。本開示の例示的抗体には、典型的な抗体、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせ（例えばｓｃＦｖが典型的な抗体の重鎖及び／又は軽鎖のいずれかのＮ末端に（例えばペプチド結合を介するか、又は化学的リンカーを介して）共有結合的に連結しているか、又は典型的な抗体の重鎖及び／又は軽鎖にインターカレートしている）が含まれる。
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位によってタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又は前述の組み合わせなどの標的を認識してそれに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指し得る。用語「抗体」には、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、又はその抗体断片が含まれる。
用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片など）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、少なくとも２つのインタクトな抗体から作成される二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を、その抗体が所望の生物学的活性を呈する限りにおいて包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと称されるそれらの重鎖定常ドメインのアイデンティティに基づき、５つの主要な免疫グロブリンクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のいずれかであり得る。異なる免疫グロブリンクラスは異なる周知のサブユニット構造及び三次元配置を有する。抗体はネイキッドであっても、又は毒素、放射性同位元素等の他の分子とコンジュゲートしていてもよい。
用語「生殖細胞系列化」は、抗体中の特定の位置にあるアミノ酸を、生殖細胞系列に見られるのと同じ位置に存在するそれらのアミノ酸に復帰突然変異させることを意味する。
用語「抗原結合抗体断片」又は「ＬＯＸ１結合抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分を指し、且つインタクトな抗体の相補性決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体（例えば、ＳｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。本開示は、ＬＯＸ１結合抗体断片であって、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、又は一本鎖抗体分子である抗体断片を更に提供する。
「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均一な抗体集団を指す。これはポリクローナル抗体と対照的であり、ポリクローナル抗体は典型的には、種々の抗原決定基に対する種々の抗体を含む。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトな及び完全長のモノクローナル抗体、並びに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ｓｃＦｖ）突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子の両方を包含する。更に、「モノクローナル抗体」は、限定はされないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物によることを含め、幾つもの方法で作製されたかかる抗体を指す。
用語「ヒト化抗体」は、最小限の非ヒト（例えばマウス）配列を含むように操作された、非ヒト（例えばマウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はハムスター）のＣＤＲの残基によって相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が置き換えられているヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＷ）残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種の抗体の対応する残基に置き換えられる。
ヒト化抗体は、Ｆｖフレームワーク領域内及び／又は置き換えられた非ヒト残基の範囲内のいずれかにおける更なる残基の置換によって更に修飾することにより、抗体の特異性、親和性、及び／又は能力を精緻化し、最適化することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有する少なくとも１つ、典型的には２つ又は３つの可変ドメインの実質的に全てを含む一方で、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含み得る。ヒト化抗体の作成に用いられる方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書又は同第５，６３９，６４１号明細書に記載されている。
抗体の「可変領域」は、単独の、或いは組み合わせでの、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＷ）からなる。各鎖のＣＤＲはＦＷ領域によって且つ他方の鎖のＣＤＲと近接して一体に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するには少なくとも２つの技法がある：（１）異種間配列多様性に基づく手法（即ち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））；及び（２）抗原抗体複合体の結晶学的調査に基づく手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７））。加えて、当該技術分野では、ＣＤＲの決定にこれらの２つの手法の組み合わせが時に用いられることもある。
Ｋａｂａｔ付番方式は、概して、可変ドメインの残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）を参照するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ），国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）（本明細書において参照により援用される））。Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置の付番は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ），国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体編集物の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用される付番方式を指す。この付番方式を使用すると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＷ又はＣＤＲの短縮、又はそこへの挿入に対応するより少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによるときの残基５２ａ）及び重鎖ＦＷ残基８２の後ろに挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによるときの残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。
所与の抗体について、Ｋａｂａｔの残基付番は、相同性領域において抗体の配列を「標準」Ｋａｂａｔ付番配列とアラインメントすることにより決定し得る。代わりにＣｈｏｔｈｉａは、構造ループの位置を参照する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ付番規則を用いて付番したとき、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端はループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４の間で変わる（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームがＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を置くためである；３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、このループは３２で終わる；３５Ａのみが存在する場合、このループは３３で終わる；３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、このループは３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の妥協案に相当し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェアに用いられている。
ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）もまた、ＣＤＲを含めた免疫グロブリン可変領域用の付番方式を提供している。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３）（本明細書において参照により援用される）を参照のこと。ＩＭＧＴ付番方式は、５，０００個を超える配列のアラインメント、構造データ、及び超可変ループの特徴付けに基づいたもので、あらゆる種の可変領域及びＣＤＲ領域の容易な比較が可能である。ＩＭＧＴ付番スキーマによれば、ＶＨ−ＣＤＲ１は２６〜３５位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ２は５１〜５７位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ３は９３〜１０２位にあり、ＶＬ−ＣＤＲ１は２７〜３２位にあり、ＶＬ−ＣＤＲ２は５０〜５２位にあり、及びＶＬ−ＣＤＲ３は８９〜９７位にある。
本明細書全体を通じて用いられるとおり、記載されるＶＨ ＣＤＲ配列は古典的Ｋａｂａｔ付番位置に対応し、即ちＫａｂａｔ ＶＨ−ＣＤＲ１は３１〜３５位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ２は５０〜６５位にあり、及びＶＨ−ＣＤＲ３は９５〜１０２位にある。ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３もまた古典的Ｋａｂａｔ付番位置、即ち、それぞれ２４〜３４位、５０〜５６位及び８９〜９７位に対応する。
用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体、又は当該技術分野において公知の任意の技法を用いて作製された、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、インタクトな又は完全長の抗体、その断片、及び／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えばマウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体などが含まれる。
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する１つの哺乳動物種（例えば、マウス、ラット等）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域が、当該の種における免疫応答の誘導を回避するため、別の種（通常はヒト）に由来する抗体の配列と相同である。
用語「ＴＭ」又は「ＴＭ突然変異体」は、その突然変異を有する抗体のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）の低下をもたらすＩｇＧ１定常領域における突然変異を指す。ＴＭ突然変異体は、ＩｇＧ１の重鎖に導入された、エフェクターヌルヒトＩｇＧ１をもたらす３つの突然変異Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓの組み合わせ（ＥＵ付番 Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ），国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を含む。
用語「ＹＴＥ」又は「ＹＴＥ突然変異体」は、ヒトＦｃＲｎとの結合の増加をもたらし、且つその突然変異を有する抗体の血清中半減期を改善するＩｇＧ１ Ｆｃにおける突然変異を指す。ＹＴＥ突然変異体は、ＩｇＧ１の重鎖に導入された、３つの突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅの組み合わせ（ＥＵ付番 Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ），国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を含む。米国特許第７，６５８，９２１号明細書（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。ＹＴＥ突然変異体は、野生型バージョンの同じ抗体と比較したとき抗体の血清中半減期が約４倍増加することが示されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４−２４（２００６））。米国特許第７，０８３，７８４号明細書（参照により全体として本明細書に援用される）も参照のこと。
用語「ＬＯＸ１結合タンパク質」、「抗ＬＯＸ１抗体」、又は「ＬＯＸ１に特異的に結合する抗体」は、抗体がＬＯＸ１の標的化において治療剤又は診断試薬として有用となるような十分な親和性でＬＯＸ１に結合する能力を有する抗ＬＯＸ１抗体などのＬＯＸ１結合タンパク質を指す。無関係の非ＬＯＸ１タンパク質に対する抗ＬＯＸ１抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（分析物として組換えＬＯＸ１を使用し且つリガンドとして抗体を使用するか、又はその逆）、結合平衡除外アッセイ（ＫＩＮＥＸＡ（登録商標））、又は当該技術分野において公知の他の結合アッセイによって計測するとき、ＬＯＸ１に対するこの抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、解離定数（ＫＤ）が≦１ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦１０ｐＭ、又は≦１ｐＭであるか、又は一部の例では、ＫＤが約１５０ｐＭ〜約６００ｐＭ又は約４００ｐＭ〜約６００ｐＭの完全長抗体又はＬＯＸ１結合抗体断片である。特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、解離定数（ＫＤ）が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦１０ｐＭ、≦１ｐＭ、又は≦０．１ｐＭであるか、又は一部の例では、ＫＤが約１５０ｐＭ〜約６００ｐＭの完全長抗体又はＬＯＸ１結合抗体断片である。
「アンタゴニスト」又は「遮断」ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１の生物学的活性を阻害し又は低下させるものである。一部の態様において、アンタゴニストＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１がｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ、及び／又はＣＲＰに結合する能力を阻害する。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１がｏｘＨＤＬ、ＨＳＰ６０、白血球及び／又は活性化血小板に結合する能力を阻害する。特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。望ましくは、ＬＯＸ１生物学的活性は１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は更には１００％低下する。詳細な態様では、ＬＯＸ１結合タンパク質は、完全長抗体又はＬＯＸ１結合抗体断片などの抗ＬＯＸ１抗体である。更なる態様において、抗ＬＯＸ１抗体はＬＯＸ１の生物学的活性を１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は更には１００％阻害し又は低下させる。
「結合親和性」は、概して、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。特に指示がない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、概して解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含めた、当該技術分野において公知の一般的な方法によって計測することができる。低親和性抗体は、概して抗原との結合が遅く、容易に解離する傾向があり、一方、高親和性抗体は、概して抗原と速やかに結合し、結合したまま長く留まる傾向がある。結合親和性を計測する種々の方法が当該技術分野において公知であり、本開示の目的上、そのいずれを用いてもよい。
「効力」は、通常は、特に指定されない限りｎＭ又はｐＭ単位のＩＣ５０値として表される。ＩＣ５０は抗体分子の阻害濃度中央値である。機能アッセイでは、ＩＣ５０は、生物学的反応をその最大値の５０％低下させる濃度である。リガンド結合試験では、ＩＣ５０は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％低下させる濃度である。ＩＣ５０は当該技術分野において公知の手段によって計算することができる。
参照抗体と比較したときの本明細書に開示されるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗体）の効力の向上倍数は、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、又は少なくとも約１８０倍又はそれ以上であり得る。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、分泌Ｉｇが特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合して、それらの細胞傷害性エフェクター細胞による抗原担持標的細胞への特異的結合及び続く細胞毒による標的細胞の死滅が可能となる形態の細胞傷害性を指す。標的細胞の表面に対する特異的高親和性ＩｇＧ抗体は細胞傷害性細胞を「武装」するものであり、かかる死滅に絶対的に必要である。標的細胞の溶解は細胞外であって、直接的な細胞間接触に必要であり、補体は関与しない。抗体に加えて、抗原担持標的細胞に特異的に結合する能力を有するＦｃ領域を含む他のタンパク質、具体的にはＦｃ融合タンパク質は、細胞媒介性細胞傷害性を達成可能であると考えられる。簡単にするため、Ｆｃ融合タンパク質の活性によって生じる細胞媒介性細胞傷害性は、本明細書ではＡＤＣＣ活性とも称される。
「単離されている」ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、その抗原結合断片、変異体、及び誘導体を含めたＬＯＸ１抗体）、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は、天然には見られない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物である。単離ポリペプチド（例えば、完全長抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片を含めた抗ＬＯＸ１抗体）、ポリヌクレオチド、ベクター、ポリヌクレオチド類、ベクター類、細胞又は組成物には、もはや天然に見られる形態ではなくなる程度まで精製されているものが含まれる。一部の態様において、単離されている抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は、実質的に純粋である。
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」は、診断、予後判定、又は治療が所望される任意の対象、特に哺乳類対象が意図される。哺乳類対象には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどを含めた、ヒト、家畜、農業動物、競技動物、及び動物園動物が含まれる。
Ａ．方法
本開示は、ＬＯＸ１阻害薬を取り入れた方法に関する幾つもの態様及び実施形態を提供する。本明細書で考察するとおり、これらの態様及び実施形態は、疾患の治療方法、予防方法、進行を阻害し及び／又は遅延させる方法、再燃及び／又は再発リスクの低減方法；特定の細胞集団を標的化し及び／又は死滅させる方法；分化を誘導し及び／又はＣＳＣの自己複製能及び拡大能を低下させる方法；病期を判定することを含め、特定の細胞集団及び／又は疾患を検出し、診断し、及び／又は定量化する方法、及び疾患のモニタリング及び／又は予後判定方法を含めた、疾患に関する様々な方法を包含する。
実施形態において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、ＣＳＣの増殖を阻害し及び／又は生存を低下させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬にＣＳＣを接触させるステップを含む。実施形態において、本方法は、ＬＯＸ１に選択的なＬＯＸ１阻害薬の有効量を投与するステップを含む。一部の実施形態において、阻害薬は、ＬＯＸ１生化学的カスケードを選択的に阻害する。用語「選択的」は、用語「阻害薬」又は「阻害する」に関連して使用されるとき、標的（例えばＬＯＸ１）に対する阻害活性が他の生体分子に対する阻害活性と比べて増加した化合物（例えば、本明細書に記載されるとおりの小分子又は生物学的分子）に関する。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
実施形態において、本開示は、以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法に関し、この方法は、治療抵抗性癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）を阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣにおける分化を誘導するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む。一実施形態において、以前の療法は、放射線照射、手術、免疫療法、化学療法、及び／又はチロシンキナーゼ阻害薬である。
更なる実施形態において、本開示は、以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法に関し、この方法は、治療抵抗性癌を治療するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む。一実施形態において、以前の療法は、放射線照射、手術、免疫療法、化学療法、及び／又はチロシンキナーゼ阻害薬である。
他の実施形態において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを標的化して阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣにおける分化を誘導するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を治療を必要としている対象に投与するステップを含む。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
他の実施形態において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法に関し、この方法は、癌を治療するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を治療を必要としている対象に投与するステップを含む。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
更なる実施形態において、本開示は、再発癌又は再燃癌を有する対象の癌を治療する方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣにおける分化を誘導するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
更なる実施形態において、本開示は、再発癌又は再燃癌を有する対象の癌を治療する方法に関し、この方法は、癌を治療するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
本開示の他の実施形態は、癌の再発又は再燃を予防する方法に関し、この方法は、癌の再発又は再燃を予防するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を癌の再発又は再燃の予防を必要としている対象に投与するステップを含む。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
更なる実施形態において、本開示は、癌を有する対象の癌の再燃リスクを低下させる方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣにおける分化を誘導し、それによって対象の癌の再燃リスクを低下させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
他の実施形態において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を除去する方法に関し、この方法は、ＣＳＣを除去するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬にＣＳＣを接触させるステップを含む。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
一部の実施形態において、本開示は、癌細胞集団中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の数を選択的に減少させる方法に関し、この方法は、癌細胞集団におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣにおける分化を誘導するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に癌細胞集団を接触させるステップを含む。従って、阻害薬は、ＣＳＣの更なる増殖を妨げるのに十分な量で治療を必要としている対象に投与されてもよく、及び／又は幾つものＣＳＣに接触させてもよい。一部の実施形態において、阻害薬は、ＣＳＣ集団に細胞死（アポトーシス）を誘導することによりＣＳＣの数を減少させるのに有効な量で投与されてもよい。更に他の実施形態において、阻害薬は、ＣＳＣ集団に細胞分化を誘導することによりＣＳＣの数を減少させるのに有効な量で投与されてもよい。従って、一部の実施形態において、１つ又は複数の阻害薬は、必ずしもＣＳＣにアポトーシスを誘導しないこともある量であるが、ＣＳＣが対象又は腫瘍形成組織において自己複製しＣＳＣ細胞集団を拡大する能力をＣＳＣの分化を誘導することにより低下させ又は調節解除するのに有効な量で提供される。阻害薬はまた、ＣＳＣニッチがもはやＣＳＣ及び／又は腫瘍組織再生を維持することができないようにＣＳＣ「ニッチ」を乱すのに有効な量で提供されてもよい。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
一部の実施形態において、本開示は、腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法を提供し、この方法は、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に腫瘍を接触させるステップを含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法を提供し、この方法は、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を患者に投与するステップを含む。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
更なる実施形態において、本開示は、腫瘍のサイズを低下させる方法を提供し、この方法は、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に腫瘍を接触させるステップを含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍のサイズを低下させる方法に関し、この方法は、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を患者に投与するステップを含む。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
一部の実施形態において、本開示は、腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防する方法を提供し、この方法は、腫瘍の侵襲性又は転移を予防し、低下させ、又は阻害するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に腫瘍を接触させるステップを含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防する方法を提供し、この方法は、腫瘍の侵襲性又は転移を予防し、低下させ、又は阻害するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を患者に投与するステップを含む。一実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。
本開示によって提供される実施形態において、本方法は、ＬＯＸ１を発現する腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団に関する。更なる実施形態において、腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団はスフェア形成ＣＳＣを含み得る。
上記の態様の様々な実施形態において、本方法は、対象を腫瘍疾患及び／又は癌疾患に関して治療することに関する。一部の実施形態において、癌は、消化器癌又は胃腸管癌（例えば、肛門癌；胆管癌；肝外胆管癌；虫垂癌；カルチノイド腫瘍、消化管癌；結腸癌；小児結腸直腸癌を含む結腸直腸癌；小児食道癌を含む食道癌；胆嚢癌；小児胃癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）（胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ））；成人（原発性）肝細胞癌及び小児肝細胞癌を含む肝細胞癌（例えば、肝細胞癌腫）；小児膵癌を含む膵癌；肉腫、横紋筋肉腫；膵島細胞膵癌；直腸癌；及び小腸癌）；肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ））；頭頸部癌（例えば、口唇・口腔癌；小児口腔癌を含む口腔癌；下咽頭癌；小児喉頭癌を含む喉頭癌；原発不明の頸部転移性扁平上皮癌；口腔癌；鼻腔・副鼻腔癌；小児鼻咽腔癌を含む鼻咽腔癌；中咽頭癌；副甲状腺癌；咽頭癌；小児唾液腺癌を含む唾液腺癌；咽喉癌；及び甲状腺癌）；及び乳癌から選択される。
上記で考察したとおり、概して「対象」には、ヒト及び非ヒト動物、特に哺乳類が含まれる。対象の治療方法に関する態様の特定の実施形態において、対象の非限定的な例としては、ヒト対象、例えば、障害、例えば癌などの本明細書に記載される障害を有するヒト患者、又は正常な対象が挙げられる。一部の実施形態において、「非ヒト」動物又は対象には、全ての脊椎動物、例えば、非哺乳類（ニワトリ、両生類、爬虫類など）及び哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、家畜化された及び／又は農業に有用な動物（ヒツジ、イヌ、ネコ、雌ウシ、ブタ等）、及びげっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）が含まれる。本明細書に開示される方法の特定の実施形態において、対象はヒト患者である。
「治療」又は「治療する」は、療法的治療及び予防的若しくは防御的手段の両方を指す。治療を必要としている対象には、既に障害を有する対象並びに障害に罹り易い対象又は障害を予防すべき対象が含まれる。治療を必要としている対象には、既に障害を有する対象並びに障害に罹り易い対象又は障害を予防すべき対象が含まれる。従って、疾患又は治療を必要としている対象に関連して使用されるとき、これらの用語には、限定はされないが、未治療の対象と比較したときの疾患の進行の停止又は遅延、疾患の寛解、症状の予防、疾患及び／又は症状の重症度の低減、又は疾患の長さの短縮が含まれる。実施形態において、本治療方法は治療下の特定の疾患の１つ以上の臨床徴候を抑えることができる。ＬＯＸ１を発現するＣＳＣ、並びに活性化ＬＯＸ１カスケードを有するＣＳＣに関連する疾患又は病態の治療方法に関する特定の実施形態は、ＬＯＸ１を阻害する化合物、並びにその医薬組成物の治療有効量の投与を含む。実施形態において、本治療方法は、ＬＯＸ１を発現するＣＳＣに関連する癌及びＣＳＣに関連する疾患及び／又は症状の更なる進行を防ぎ、疾患を消失させ、疾患及び／又は症状の更なる進行を遅延させ又は低減し、又は疾患及び／又は臨床症状を好転させる任意の方法に関し得る。
一部の実施形態において、本方法は、癌の進行を阻止し又は遅延させるのに十分な治療有効量の薬剤を含み得る。更なる実施形態において、治療有効量とは、対象のＣＳＣを含めた癌細胞の数を減少させる（即ち、癌細胞を死滅させ、及び／又は癌細胞の増殖を阻害し、及び／又はＣＳＣの分化を誘導する）のに十分な量である。対象の癌細胞の増殖及び癌の進行（例えば、腫瘍サイズ、細胞数、生化学的マーカー、二次徴候等）をモニタする方法は本明細書で考察され、当該技術分野において一般に公知の技法もまた含み得る。
本明細書で考察するとおり、一部の実施形態は、放射線照射、手術、免疫療法、又は他の化学療法と併せてＬＯＸ１阻害薬を投与するステップを含む治療方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用した治療有効量のＬＯＸ１阻害薬の投与を含む。多種多様な抗癌剤（即ち抗新生物剤）が当該技術分野において公知であり、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗薬、天然抗新生物剤、ホルモン性抗新生物剤、血管新生阻害薬、分化誘導試薬、化学療法薬、チロシンキナーゼ阻害薬、ＲＮＡ阻害薬、抗体又は免疫療法剤、遺伝子療法剤、小分子酵素阻害薬、生物学的反応修飾物質、抗転移剤が挙げられる。当該技術分野において一般に公知の化学療法剤を含めたかかる活性化合物の一部の非限定的な例としては、例えば、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）、シタラビン、デキサメタゾン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））、アルブミン結合パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、テモゾロミド、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソイド類（例えば、パクリタキセル）、トキソテール（ｔｏｘｏｔｅｒｅ）、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、メルファラン及び腫瘍に対するホルモン作用を調節し又は阻害するように作用するタモキシフェン及びオナプリストンなどの他の関連するナイトロジェンマスタード及びホルモン剤が挙げられる。
化学療法薬には多くの副作用があり、その１つが心臓毒性（心毒性とも称される）である。詳細には、化学療法薬は、心筋細胞死及び心不全につながり得る心臓損傷を引き起こすことが示されている。一実施形態において、本開示は、化学療法を必要としている患者の化学療法関連心毒性を阻害し、低下させ、又は予防する方法を提供し、この方法は、化学療法関連心毒性を阻害し、低下させ、又は予防するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を患者に投与するステップを含む。別の実施形態において、本開示は、化学療法を必要としている患者の心毒性を逆転させる方法を提供し、この方法は、化学療法関連心毒性を逆転させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を患者に投与するステップを含む。一実施形態において、化学療法はドキソルビシンなどのアントラサイクリンである。
「投与」又は「投与する」は、本明細書で使用されるとき、所望の効果を実現するため任意の適切な経路によって１つ又は複数の化合物を供給し、接触させ、及び／又は送達することを指す。投与には、限定はされないが、経口、舌下、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内又は脳内注射）、経皮、局所、頬側、直腸、腟内、経鼻、眼内、吸入を介する、及びインプラントが含まれ得る。
「共投与される」は、本明細書で使用されるとき、複数の化合物又は薬剤の同時の又は逐次的な投与を指す。第１の化合物又は薬剤が第２の化合物又は薬剤の投与の前に、それと同時に、又はその後に投与されてもよい。
「接触させる」は、「細胞を接触させる」のように本明細書で使用されるとき、細胞をインビトロ、エキソビボ、又はインビボ（即ち、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、及びイヌを含めた哺乳類などの対象の体内）で直接又は間接的に接触させることを指す。細胞を接触させること（これにはまた、阻害薬化合物と細胞を「反応させる」こと又はそれに細胞を「曝露する」ことも含まれ得る）は、化合物又は薬剤を対象に一般的に投与する結果又は細胞若しくは組織が入った容器又は細胞若しくは組織が入った流体に阻害薬を添加又は適用する結果として起こり得る。従って、細胞を阻害薬に接触させるとは、細胞（例えば、対象の局所領域又は全身（例えば、リンパ、循環等）にあるＣＳＣ細胞）を含む対象、組織、又は対象若しくは組織の領域への阻害薬の投与を指してもよく、標的細胞に物理的に接触しないこともあり得る。接触には、細胞、組織、哺乳類、対象、患者、又はヒトへの投与が包含される。更に、細胞を接触させることには、細胞培養物に薬剤を加えることが含まれる。他の好適な方法としては、本明細書で考察するとおりの又はその他当該技術分野において公知の適切な投与手順及び経路を用いて細胞、組織、哺乳類、対象、又は患者に薬剤を導入又は投与することが含まれ得る。
本開示はまた、治療用組成物及び医薬組成物を含めた、組成物におけるＬＯＸ１阻害薬、又は２つ以上のＬＯＸ１阻害薬の組み合わせの１つ以上の使用にも関する。実施形態において、本使用及び組成物は、本明細書に開示される様々な方法を提供するのに有効な量の１つ又は複数の阻害薬を含む。実施形態において、この１つ以上の使用は、本明細書に記載される腫瘍型、癌幹細胞、及び／又は癌の１つ以上を治療する（例えば、死滅させ、除去し、阻害し、細胞増殖の進行及び／又は進行速度を低下させ、細胞（ＣＳＣ）の自己複製能及び／又は拡大能を低下させ、病状の進行及び／又は進行速度を低下させる）ための医薬の製造への使用に関する。
検出方法
一部の態様及び実施形態において、本明細書に開示される方法は、癌幹細胞（ＣＳＣ）の検出、同定、及び／又は定量化に有用な１つ以上の方法を提供し、及び／又はそれを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＣＳＣを含む生体試料中のＬＯＸ１を検出し、同定し、及び／又はその量を定量化することを含む。一部の実施形態において、本方法は、癌細胞を含む試料中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在の診断、予測、定量化、同定、及び／又は検出を提供し、本方法は、
ＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列に結合する薬剤に試料を接触させるステップ；
薬剤とＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列との間の結合の存在又は非存在を検出するステップ；及び／又は
薬剤とＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列との間の結合の検出に基づき試料中のＣＳＣの存在を同定するステップ、
のうちの１つ以上を含み得る。
これらの方法において、ステップは単独で用いられても、又は任意の一連の互いとの又は当該技術分野において一般に公知の他の技法との組み合わせで用いられてもよい。この態様の一部の実施形態において、本方法は、
試料中のＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列の量を定量化するステップ；
ＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列の量をＬＯＸ１核酸又はＬＯＸ１アミノ酸の基準レベルと比較するステップ；及び／又は
検出された量が基準レベルよりも多い場合に試料中のＣＳＣの存在を同定するステップ、
のうちの１つ以上を更に含み得る。
一部の態様及び実施形態において、本明細書に開示される方法は、ＬＯＸ１陽性癌幹細胞（ＣＳＣ）の検出、同定、及び／又は定量化に有用な１つ以上の方法を提供し、及び／又はそれを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＣＳＣを含む生体試料中のＬＯＸ１陽性ＣＳＣを検出し、同定し、及び／又はその量を定量化することを含む。一部の実施形態において、本方法は、癌細胞を含む試料中のＬＯＸ１陽性癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在の診断、予測、定量化、同定、及び／又は検出を提供し、本方法は、
ＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列に結合する薬剤に試料を接触させるステップ；
薬剤とＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列との間の結合の存在又は非存在を検出するステップ；及び／又は
薬剤とＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列との間の結合の検出に基づき試料中のＬＯＸ１陽性ＣＳＣの存在を同定する工程、
のうちの１つ以上を含み得る。
更に別の実施形態において、本方法は、検出可能部分を含む薬剤を含み得る。一部の実施形態において、本薬剤は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＬＯＸ１核酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、本薬剤は、ＬＯＸ１アミノ酸配列の少なくとも一部分に特異的に結合する抗体を含み得る。
上記の態様の様々な実施形態において、本方法は、ＬＯＸ１を発現する腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団に関する。更なる実施形態において、腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団はスフェア形成ＣＳＣを含み得る。
試料中のＣＳＣの検出、同定、及び／又は定量化に有用な本明細書に記載される方法に加えて、これらの態様及び実施形態はまた、当業者に利用可能な任意の方法及び技法も含み得る。非限定的な例として、ＣＳＣは、特定のＣＳＣで発現する又はそれに特異的な細胞表面マーカーに基づくフローサイトメトリー；色素排除法によるサイドポピュレーション（ＳＰ）表現型の検出（例えば、Ｍｏｓｅｒｌｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００８）６８；５６５８−５６６８に開示されるとおり、ヘキスト３３３４２）；無血清培地中の浮遊スフェアとしての成長／増殖能力（例えば、本明細書並びにＲｙｂａｃｋ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２０１１）１８１３；６８３−６９４に開示される）；及び特定の酵素活性、例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性など、並びにポリコームヘテロクロマチンマーカー、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベル、及びｚｅｓｔｅ ２のポリコーム群タンパク質エンハンサー（ＥＺＨ２）を含めたポリコームマーカーレベルの決定を含む技法を用いて同定、検出、及び単離されてもよい。
一部の実施形態において、例えば、様々な系統（例えば、造血、乳腺、内皮、間葉、神経）の癌前駆細胞においてアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）の発現及び活性の上昇が報告されており、本明細書における様々な態様及び実施形態に関連して技法及び市販のキット（例えば、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（商標）、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し得る。同様に、現在、ＣＳＣの同定用にユニバーサルに発現する細胞表面マーカーはないが、複数の表面マーカーが、例えば、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ３２６を含め、ＣＳＣ及び関連する腫瘍型に関連付けられている（例えば、Ｘｉａ，Ｐ．，Ｃｕｒｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．（２０１４）Ｍａｒ；９（２）：１０２−１１；Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．，（２０１４）６１（５）：４８１−９０；Ｔｉｒｉｎｏ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，（２０１３）Ｊａｎ；２７（１）：１３−２４を参照のこと）。
一部の実施形態において、試料中のＣＳＣを検出又は同定する１つ以上のユニバーサルな表面マーカーがないため、検出、同定、及び／又は定量化する方法は、本明細書に開示されるような又はその他当該技術分野において公知のスフェア培養及び成長アッセイを含む細胞培養技法を含む。
Ｂ．阻害薬
本明細書に記載される方法、使用、及び組成物は、ＬＯＸ１の活性及び／又は発現を阻害し、下方制御し、又は消失させる能力を有する薬剤、又は１つ以上のかかる阻害薬剤の任意の組み合わせに関連する実施形態を含む。その薬剤が阻害機能を有する（例えば、ＬＯＸ１の発現及び／又は活性を阻害する）限り、阻害薬剤は任意の化合物クラスから選択することができる。例えば、阻害薬は、ＬＯＸ１を阻害するポリペプチド、ＬＯＸ１を阻害する小分子、ＬＯＸ１を阻害するポリヌクレオチド、ＬＯＸ１を阻害するアプタマー、ＬＯＸ１を阻害する抗体、又はＬＯＸ１を阻害するアンチセンス分子若しくはｓｉＲＮＡ分子からなる群から選択され得る。従って、阻害薬とは、本明細書で使用されるとき、ＬＯＸ１の発現及び／又は機能を低下させ、阻害し、下方制御し、又は消失させる任意の化合物、又はＬＯＸ１の発現又は機能を中和し、低下させ、又は阻害するのに好適な薬剤を指す。本明細書に記載される阻害薬は、例えばＬＯＸ１への結合を含め、任意の機構によって作用を及ぼし得る。結合すると、阻害薬は例えばＬＯＸ１と受容体又はリガンドとの相互作用を阻害し得るため、ＬＯＸ１が受容体を活性化させることができなくなり、又はリガンドによって活性化されることができなくなる。他の実施形態において、ＬＯＸ１の活性の阻害能を有する１つ又は複数の薬剤は走化活性を阻害してもよく、タンパク質を隔離してバイオアベイラビリティを低下させてもよく、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。
一部の実施形態において、阻害薬は、ＬＯＸ１への結合能を有するポリペプチド又は小分子であってもよく、当該技術分野においてルーチンの任意の技法（例えば、小規模化合物又はポリペプチドライブラリのスクリーニング）によって同定され得る。「小分子」は、本明細書で使用されるとき、概して、低分子量の小さい有機化合物を指す。小分子は、天然に存在することが知られていない合成化合物であっても、又は例えば細胞、植物、真菌、動物などの天然の供給源から単離された、若しくはそれに存在することが知られている天然に存在する化合物であってもよい。一部の実施形態において、小分子は分子量が５０００ダルトン未満、４０００ダルトン未満、３０００ダルトン未満、２０００ダルトン未満、１０００ダルトン未満、又は約８００ダルトン未満であり得る。かかる実施形態において、小分子は典型的には分子量が約１００ダルトンより大きい。
小分子又はポリペプチドがＬＯＸ１との結合能を有するかどうかは、任意のルーチンの技法又はアッセイ、並びに本明細書に記載される技法及びアッセイによって決定し得る。例えば、技法には、酵母２ハイブリッドアッセイ又は生化学アッセイ、例えば、プルダウンアッセイ、免疫共沈降アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、定量的放射性リガンド結合アッセイ、プラズモン共鳴アッセイ又は当該技術分野においてルーチンで用いられる任意の他の方法などが含まれ得る。典型的には、プルダウン又はプラズモン共鳴アッセイを用いる場合、タンパク質のうちの少なくとも１つをアフィニティータグ、例えば、ＨＩＳタグ、ＧＳＴタグ又は当該技術分野で一般的に用いられる他の検出可能部分に融合するか又は他の方法で連結させることが有用である。試験するポリペプチド又は任意の他の化合物がＬＯＸ１の活性の阻害能を有するかどうかは、膜結合型ポリペプチドの活性を計測することにより決定し得る。好適には、ポリペプチドはＬＯＸ１の活性の阻害能を有する。
実施形態において、阻害薬は、ＬＯＸ１に対して特異性を有するＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドアプタマーを指す「アプタマー」であってもよい。ポリヌクレオチドアプタマーは約１０〜約３００ヌクレオチド長の範囲に含まれる。典型的には、アプタマーは約３０〜約１００ヌクレオチド長の範囲であり、一部の実施形態では約１０〜６０ヌクレオチド長の範囲であり得る。アプタマーは、合成、組換え、及び精製方法を含め、任意の公知の方法によって調製することができ、単独で、又はＬＯＸ１に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用し得る。
本明細書において言及される方法の一部の詳細な実施形態において、阻害薬は、ＬＯＸ１に特異的に結合する抗体であってもよい。一部の実施形態において、抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、又は多特異性抗血清であってもよい。かかる実施形態において、抗体にはまた、上記で考察したとおりの、例えば、一本鎖抗体、ダイアボディ、ミニボディ、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃ（Ｆｖ））、ｓｃ（Ｆｖ）２抗体、Ｆａｂ断片、又はＦ（ａｂ’）２断片などを含めた抗体変異体又は断片も（その変異体又は断片がＬＯＸ１に対する特異的結合特性を保持している限り）含まれる。
例示的ＬＯＸ１結合タンパク質を以下の表１に提供し、これらは国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０７２６４４号明細書（参照により全体として本明細書に援用される）に記載される。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４の参照ＶＨ配列と比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するＶＨ配列を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は配列番号４のＶＨを含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３３の参照ＶＬ配列と比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するＶＬ配列を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は配列番号３３のＶＬを含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号２、５〜１２又は１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、及び配列番号３、１４〜１７又は１８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含むＶＨから選択されるＶＨ；及び配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号３２、３４、又は３５のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含むＶＬから選択される軽鎖ＶＬを含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
本方法はまた、本明細書に開示される参照ＶＨ及びＶＬ ＬＯＸ１結合タンパク質と比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を各々有するＶＨ及びＶＬ配列を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質に関する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４、１９〜２８、又は２９を含むＶＨ、及び配列番号３３、３６、又は３７を含むＶＬを有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで一組のＣＤＲは、（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号３０のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号３１のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号３２のアミノ酸配列を有する一組の参照ＣＤＲと同一であるか、又はそれと比べて合計１８個以下の（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個の）アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、一組のＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号３０のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号３１のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号３２のアミノ酸配列を有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
本方法はまた、本明細書に開示される参照ＶＨ配列と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は本明細書に開示される参照ＶＬ配列（例えば、表１に開示されるＶＨ及びＶＬ配列）と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質に関する。更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するＶＨ及び／又は配列番号３３と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を有するＶＬ；及び（ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を有するＶＬからなる群から選択されるＶＨ及びＶＬと少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｇ）配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｈ）配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｊ）配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｋ）配列番号４８のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６５のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｌ）配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６６のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｍ）配列番号５０のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｎ）配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６５のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｏ）配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｐ）配列番号５２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｑ）配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｒ）配列番号５３のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を有するＶＬ；及び（ｓ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を有するＶＬからなる群から選択されるＶＨ及びＶＬと少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するＶＨ及び少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、本明細書の方法は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質を含み得る。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号５〜１２又は１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３、１４〜１７又は１８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３、１４〜１７又は１８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号２、５〜１２又は１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３、１４〜１７又は１８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号２、５〜１２又は１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬＨ−ＣＤＲ３を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３及び配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３、アミノ酸配列配列番号３１を有するＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３２、３４、又は３５のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３、アミノ酸配列配列番号３１を有するＶＬ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３２、３４、又は３５のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３、アミノ酸配列配列番号３１を有するＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号１と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号２、５〜１２又は１３と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ２、又は配列番号３、１４〜１７又は１８と同一であるか、又はそれに対して合計１、２、３、４個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ３など、１、２、又は３個のＶＨ−ＣＤＲを含む。
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３０と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号３１と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＬ−ＣＤＲ２、又は配列番号３２、３４、又は３５と同一であるか、又はそれに対して合計１、２、３、４個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ３など、１、２、又は３個のＶＬ−ＣＤＲを含む。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４１の参照ＶＨ配列と比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するＶＨ配列を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４１のＶＨを含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号５８の参照ＶＬ配列と比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するＶＬ配列を含む。本開示はまた、ＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質を作製及び使用する方法も提供する。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は配列番号５８のＶＬを含む。本開示はまた、ＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質を作製及び使用する方法も提供する。
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号３９、４２又は４３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、及び配列番号４０、４４〜４６又は４７のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含むＶＨから選択されるＶＨ；及び配列番号５５又は５９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号５６又は６０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号５７、６１〜６３、又は６４のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含むＶＬから選択される軽鎖ＶＬを含む。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４１、４８〜５３、又は５４の配列を含むＶＨ、及び配列番号５８、６５〜６９、又は７０の配列を含むＶＬを有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで一組のＣＤＲは、（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号３８のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号３９のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号４４のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号５５のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号６０のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号６１のアミノ酸配列を有する一組の参照ＣＤＲと同一であるか、又はそれと比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで一組のＣＤＲは、（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号３８のアミノ酸配列を有し、（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号３９のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号４０のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号５５のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号５６のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号５７のアミノ酸配列を有する一組の参照ＣＤＲと同一であるか、又はそれと比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、一組のＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号３８のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号３９のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号４０のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号５５のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号５６のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号５７のアミノ酸配列を有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号４２又は４３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４０、４４〜４６、又は４７のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４０、４４〜４６、又は４７のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号３９、４２、又は４３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４０、４４〜４６、又は４７のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号３９、４２、又は４３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＶＬＨ−ＣＤＲ３を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３及び配列番号５６のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３、アミノ酸配列配列番号５６を有するＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号５５のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３、アミノ酸配列配列番号５６又は６０を有するＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号５５又は５９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３８と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号３９、４２又は４３と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ２、又は配列番号４０、４４〜４６又は４７と同一であるか、又はそれに対して合計１、２、３、４個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ３など、１、２、又は３個のＶＨ−ＣＤＲを含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号５５又は５９と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号５６又は６０と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＬ−ＣＤＲ２、又は配列番号５７、６１〜６３又は６４と同一であるか、又はそれに対して合計１、２、３、４個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ３など、１、２、又は３個のＶＬ−ＣＤＲを含む。本開示はまた、ＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質を作製及び使用する方法も提供する。
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、一組のＣＤＲ：表１に記載されるとおりのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ３及びＶＬ−ＣＤＲ３を含む。本開示はまた、ＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質を作製及び使用する方法も提供する。
一部の更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、表１に記載されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｇ Ｆ Ｄ Ｐ Ｅ Ｄ ＨＸ１ ＨＸ２ ＨＸ３ ＨＸ４ ＨＸ５ ＨＸ６ Ｑ Ｋ Ｆ Ｑ Ｇ（Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ ＨＸ１ ＨＸ２ ＨＸ３ ＨＸ４ ＨＸ５ ＨＸ６ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ）（式中、ＨＸ１はＧｌｙ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＰｈｅであり；ＨＸ２はＧｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、又はＡｌａであり；ＨＸ３はＴｈｒ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、又はＡｓｎであり；ＨＸ４はＩｌｅ、Ａｌａ、Ａｒｇ、又はＨｉｓであり；ＨＸ５はＴｙｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、又はＧｌｎであり、及びＨＸ６はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、又はＨｉｓである）のアミノ酸配列（配列番号７１）を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＨＸ７ ＨＸ８ Ｇ ＨＸ９ ＨＸ１０ ＨＸ１１ ＨＸ１２ Ｇ Ｖ Ｒ Ｇ Ｗ Ｄ Ｙ Ｙ Ｙ Ｇ Ｍ Ｄ Ｖ（ＨＸ７ ＨＸ８ Ｇｌｙ ＨＸ９ ＨＸ１０ ＨＸ１１ ＨＸ１２ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｒｐ）（式中、ＨＸ７はＰｒｏ、Ｓｅｒ、又はＶａｌであり；ＨＸ８はＡｓｎ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＡｓｐであり；ＨＸ９はＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｈｒであり；ＨＸ１０はＧｌｎ又はＨｉｓであり；ＨＸ１１はＧｌｙ又はＧｌｎであり；ＨＸ１２はＬｙｓ又はＧｌｙである）のアミノ酸配列（配列番号７２）を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
他の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｑ Ｓ Ｙ Ｄ Ｓ ＬＸ１ ＬＸ２ ＬＸ３ ＬＸ４ ＬＸ５ ＬＸ６（Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ ＬＸ１ ＬＸ２ ＬＸ３ ＬＸ４ ＬＸ５ ＬＸ６）（式中、ＬＸ１はＳｅｒ又はＭｅｔであり；ＬＸ２はＬｅｕ、Ｔｙｒ、又はＨｉｓであり；ＬＸ３はＳｅｒ又はＡｒｇであり；ＬＸ４はＧｌｙ、Ａｌａ、又はアミノ酸無しであり；ＬＸ５はＴｒｐ又はＰｈｅであり；及びＬＸ６はＶａｌ、Ｇｌｙ、又はＡｌａである）のアミノ酸配列（配列番号７３）を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１はアミノ酸配列：Ｅ Ｌ Ｓ Ｍ Ｈ（配列番号１）を含み；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２はアミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｄ Ｐ Ｅ Ｄ ＨＸ１ ＨＸ２ ＨＸ３ ＨＸ４ ＨＸ５ ＨＸ６ Ｑ Ｋ Ｆ Ｑ Ｇ（式中、ＨＸ１は、Ｇ、Ｗ、Ｙ及びＦからなる群から選択され、ＨＸ２は、Ｅ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ａ、及びＳからなる群から選択され、ＨＸ３は、Ｔ、Ｙ、Ｉ、及びＮからなる群から選択され、ＨＸ４は、Ｉ、Ａ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、ＨＸ５は、Ｙ、Ｖ、Ｔ、Ｌ及びＱからなる群から選択され、及びＨＸ６は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ及びＨからなる群から選択される）（配列番号７１）を含み；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３はアミノ酸配列：ＨＸ７ ＨＸ８ Ｇ ＨＸ９ ＨＸ１０ ＨＸ１１ ＨＸ１２ Ｇ Ｖ Ｒ Ｇ Ｗ Ｄ Ｙ Ｙ Ｙ Ｇ Ｍ Ｄ Ｖ（式中、ＨＸ７は、Ｐ、Ｓ及びＶからなる群から選択され、ＨＸ８は、Ｎ、Ｗ、Ｄ、及びＴからなる群から選択され、ＨＸ９は、Ｑ、Ｒ及びＴからなる群から選択され、ＨＸ１０は、Ｑ及びＨからなる群から選択され、ＨＸ１１は、Ｇ及びＱからなる群から選択され、及びＨＸ１２は、Ｋ及びＧからなる群から選択される）（配列番号７２）を含み；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１はアミノ酸配列：Ｔ Ｇ Ｓ Ｓ Ｓ Ｎ Ｉ Ｇ Ａ Ｇ Ｙ Ｄ Ｖ Ｈ（配列番号３０）を含み；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２はアミノ酸配列：Ｇ Ｎ Ｓ Ｎ Ｒ Ｐ Ｓ（配列番号３１）を含み；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３はアミノ酸配列：Ｑ Ｓ Ｙ Ｄ Ｓ ＬＸ１ ＬＸ２ ＬＸ３ ＬＸ４ ＬＸ５ ＬＸ６（式中、ＬＸ１は、Ｍ及びＳからなる群から選択され、ＬＸ２は、Ｌ、Ｙ及びＨからなる群から選択され、ＬＸ３は、Ｓ及びＲからなる群から選択され、ＬＸ４は、Ａ及びＧからなる群から選択されるか又は省略され（アミノ酸無し）、ＬＸ５は、Ｗ及びＦからなる群から選択され、及びＬＸ６は、Ｖ、Ｇ及びＡからなる群から選択される）（配列番号７３）を含む。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｇ ＨＸ１ Ｓ ＨＸ２ ＨＸ３ ＨＸ４ ＨＸ５ ＨＸ６ ＨＸ７ ＨＸ８ ＨＸ９ ＨＸ１０ Ｄ Ｓ Ｖ Ｋ Ｇ（Ｇｌｙ ＨＸ１ Ｓｅｒ ＨＸ２ ＨＸ３ ＨＸ４ ＨＸ５ ＨＸ６ ＨＸ７ ＨＸ８ ＨＸ９ ＨＸ１０ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ）（式中、ＨＸ１はＩｌｅ又はＶａｌであり；ＨＸ２はＴｒｐ又はＬｅｕであり；ＨＸ３はＡｓｎ又はＧｌｎであり；ＨＸ４はＳｅｒ又はＧｌｕであり；ＨＸ５はＧｌｙ、Ｌｅｕ、又はＰｒｏであり；ＨＸ６はＳｅｒ、Ｔｙｒ、又はＡｓｐであり；ＨＸ７はＩｌｅ、Ｔｈｒ、又はＡｒｇであり；ＨＸ８はＧｌｙ又はＴｙｒであり；ＨＸ９はＴｙｒ又はＭｅｔであり；及びＨＸ１０はＡｌａ又はＡｓｐである）のアミノ酸配列（配列番号７４）を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｅ Ｇ ＨＸ１１ Ｗ Ｎ Ｙ Ｄ Ａ ＨＸ１２ Ｄ ＨＸ１３（Ｇｌｕ Ｇｌｙ ＨＸ１１ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｌａ ＨＸ１２ Ａｓｐ ＨＸ１３）（式中、ＨＸ１１はＡｓｎ又はＳｅｒであり；ＨＸ１２はＰｈｅ又はＬｅｕであり；及びＨＸ１３はＩｌｅ又はＶａｌである）のアミノ酸配列（配列番号７５）を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｔ Ｇ Ｔ Ｓ ＬＸ１ Ｄ Ｖ Ｇ Ｇ Ｙ Ｎ Ｙ Ｖ Ｓ（Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ＬＸ１ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ）（式中、ＬＸ１はＳｅｒ又はＡｓｎである）のアミノ酸配列（配列番号７６）を有するＶＬ−ＣＤＲ１を含む。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｄ Ｖ Ｓ ＬＸ２ Ｒ Ｐ Ｓ（Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｘ４ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｓｅｒ）（式中、ＬＸ２はＡｓｎ又はＬｙｓである）のアミノ酸配列（配列番号７７）を有するＶＬ−ＣＤＲ２を含む。
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＸ３ ＬＸ４ ＬＸ５ ＬＸ６ ＬＸ７ ＬＸ８ Ｓ Ｔ Ｎ Ｗ Ｖ（ＬＸ３ ＬＸ４ ＬＸ５ ＬＸ６ ＬＸ７ ＬＸ８ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ）（式中、ＬＸ３はＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、又はＡｌａであり；ＬＸ４はＳｅｒ、Ｇｌｙ、又はＧｌｎであり；ＬＸ５はＴｙｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、又はＧｌｙであり；ＬＸ６はＴｈｒ又はＭｅｔであり；ＬＸ７はＳｅｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、又はＶａｌであり；及びＬＸ８はＳｅｒ又はＡｒｇである）のアミノ酸配列（配列番号７８）を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１はアミノ酸配列：Ｄ Ｙ Ａ Ｍ Ｈ（配列番号３８）を含み；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２はアミノ酸配列：Ｇ ＨＸ１ Ｓ ＨＸ２ ＨＸ３ ＨＸ４ ＨＸ５ ＨＸ６ ＨＸ７ ＨＸ８ ＨＸ９ ＨＸ１０ Ｄ Ｓ Ｖ Ｋ Ｇ（式中、ＨＸ１は、Ｉ及びＶからなる群から選択され、ＨＸ２は、Ｗ及びＬからなる群から選択され、ＨＸ３は、Ｎ及びＱからなる群から選択され、ＨＸ４は、Ｓ及びＥからなる群から選択され、ＨＸ５は、Ｇ、Ｌ及びＰからなる群から選択され、ＨＸ６は、Ｓ、Ｙ及びＤからなる群から選択され、ＨＸ７は、Ｉ、Ｔ及びＲからなる群から選択され、ＨＸ８は、Ｇ及びＹからなる群から選択され、ＨＸ９は、Ｍ及びＹからなる群から選択され、及びＨＸ１０は、Ａ及びＤからなる群から選択される）（配列番号７４）を含み；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３はアミノ酸配列：Ｅ Ｇ ＨＸ１１ Ｗ Ｎ Ｙ Ｄ Ａ ＨＸ１２ Ｄ ＨＸ１３（式中、ＨＸ１１は、Ｎ及びＳからなる群から選択され、ＨＸ１２は、Ｆ及びＬからなる群から選択され、及びＨＸ１３は、Ｉ及びＶからなる群から選択される）（配列番号７５）を含み；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１はアミノ酸配列：Ｔ Ｇ Ｔ Ｓ ＬＸ１ Ｄ Ｖ Ｇ Ｇ Ｙ Ｎ Ｙ Ｖ Ｓ（式中、ＬＸ１は、Ｎ及びＳからなる群から選択される）（配列番号７６）を含み；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２はアミノ酸配列：Ｄ Ｖ Ｓ ＬＸ２ Ｒ Ｐ Ｓ（式中、ＬＸ２は、Ｎ及びＫからなる群から選択される）（配列番号７７）を含み；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３はアミノ酸配列：ＬＸ３ ＬＸ４ ＬＸ５ ＬＸ６ ＬＸ７ ＬＸ８ Ｓ Ｔ Ｎ Ｗ Ｖ（式中、ＬＸ３は、Ｌ、Ｍ、Ａ及びＳからなる群から選択され、ＬＸ４は、Ｓ、Ｑ及びＧからなる群から選択され、ＬＸ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ及びＲからなる群から選択され、ＬＸ６は、Ｔ及びＭからなる群から選択され、ＬＸ７は、Ｓ、Ｗ、Ｇ及びＶからなる群から選択され、及びＬＸ８は、Ｓ及びＲからなる群から選択される）（配列番号７８）を含む。
一部の態様において、本明細書に開示されるＬＯＸ１結合タンパク質の一組のＣＤＲは、抗体フレームワーク領域又は当該技術分野において公知の他のタンパク質スキャフォールド内に提供される。例示的抗体フレームワーク領域としては、生殖細胞系列フレームワーク領域、例えば、重鎖の抗体フレームワーク領域についてＶＨ１−２４（ＤＰ−５）、ＪＨ６、ＶＨ３−０９（ＤＰ−３１）、及びＪＨ３、並びに軽鎖の抗体フレームワーク領域についてＶλ１ｅ（ＤＰＬ−８）、Ｖλ２ａ２（ＤＰＬ−１１）、及びＪＬ３及び／又は当業者に周知の任意の好適なフレームワーク領域が挙げられる。
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、生殖細胞系列フレームワークである重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）由来の１つ以上のフレームワーク領域を含有する。重鎖ドメインのフレームワーク領域は、ＶＨ１−２４（ＤＰ−５）、ＪＨ６、ＶＨ３−０９（ＤＰ−３１）、ＪＨ３フレームワーク及び／又は当該技術分野において周知の任意の好適なフレームワーク領域若しくはタンパク質スキャフォールドから選択され得る。軽鎖のフレームワーク領域は、Ｖλ１ｅ（ＤＰＬ−８）、Ｖλ２ａ２（ＤＰＬ−１１）、及びＪＬ３フレームワーク、及び／又は当該技術分野において周知の任意の好適なフレームワーク領域若しくはタンパク質スキャフォールドから選択され得る。１つ以上のＣＤＲが本明細書に開示されるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、表１に示されるＬＯＸ１結合タンパク質）から選ばれ、好適なフレームワーク及び／又はタンパク質スキャフォールドに組み込まれてもよい。
更なる態様において、本開示は、それぞれ配列番号４及び配列番号３３のＶＨ及びＶＬを含む抗体と同じＬＯＸ１エピトープに結合する単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。
他の態様において、本明細書に開示される方法は、配列番号４のＶＨ配列と配列番号３３のＶＬ配列とを含む抗体とＬＯＸ１への結合に関して競合又は交差競合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗体、例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）を含む。詳細な態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４のＶＨと配列番号３３のＶＬとを含む抗体がＬＯＸ１に結合するのを競合的に阻害することが可能である。
また、配列番号２９のＶＨと配列番号３３のＶＬとを含むＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ１抗体又はその断片）よりも高い親和性でＬＯＸ１に結合することのできるＬＯＸ１抗体（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体、及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質を含む方法も提供される。本開示はまた、ＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質を作製及び使用する方法も提供する。
更なる態様において、本方法は、それぞれ配列番号４１及び配列番号５８のＶＨ及びＶＬを含む抗体と同じＬＯＸ１エピトープに結合する単離ＬＯＸ１結合タンパク質を含む。
他の態様において、本方法は、配列番号４１のＶＨ配列と配列番号５８のＶＬ配列とを含む抗体とＬＯＸ１への結合に関して競合又は交差競合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗体、例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）を含む。詳細な態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４１のＶＨと配列番号５８のＶＬとを含む抗体がＬＯＸ１に結合するのを競合的に阻害することが可能である。
また、配列番号５４のＶＨ及び配列番号７０のＶＬを含む完全長抗体よりも高い親和性でＬＯＸ１に結合することのできるＬＯＸ１抗体（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体、及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質を含む方法も提供される。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
一部の態様において、本明細書に記載の方法に組み込まれる抗ＬＯＸ１抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、又はそれらの任意の組み合わせである。一部の態様において、抗ＬＯＸ１抗体は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｄｓＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又はｓｃ（Ｆｖ）２断片である。
本開示は、種を超えてＬＯＸ１分子に結合することのできるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの単離抗ＬＯＸ１抗体）を含む方法を含む。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質はヒトＬＯＸ１（ｈＬＯＸ１）及びカニクイザルＬＯＸ１（ｃｙｎｏＬＯＸ１）に結合する。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質はヒトＬＯＸ１（ｈＬＯＸ１）及びウサギＬＯＸ１に結合する。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ｈＬＯＸ１、ｃｙｎｏＬＯＸ１及びウサギＬＯＸ１に結合する。本明細書に提供される特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体）はＬＯＸ１（例えば、ｈＬＯＸ１、ｃｙｎｏＬＯＸ１及び／又はウサギＬＯＸ１）に特異的に結合し、且つＣＬＥＣ−７Ａ、ＣＬＥＣ−１Ａ、ＣＬＥＣ−４Ｌ、ＣＬＥＣ−１Ｂ、ＳＲ−Ａ１及び／又はＳＲ−Ｂ３の１つ以上に結合しない。例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０７２６４４号明細書を参照のこと。
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、単離抗ＬＯＸ１抗体又はその（ｏｒ ｔｈｅｒｅｏｆ））はヒトＩｇＧ１ ＴＭ突然変異重鎖を更に含み、ここで重鎖可変領域（ＶＨ）は、参照アミノ酸配列の配列番号４、１９〜２８又は２９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％ ９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、単離抗ＬＯＸ１抗体又はその（ｏｒ ｔｈｅｒｅｏｆ））はヒトＩｇＧ１ ＴＭ突然変異重鎖を更に含み、ここで重鎖可変領域（ＶＨ）は、参照アミノ酸配列の配列番号４１、４８〜５３又は５４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％ ９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び任意選択で重鎖定常領域又はその断片に加えて、軽鎖定常領域又はその断片を含む。特定の態様において、軽鎖定常領域はκλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ定常領域又はヒトλ定常領域である。ある具体的な態様において、軽鎖定常領域はヒトκ定常領域である。
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）は、ヒトκ定常領域を含有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、例えばＶＬは、参照アミノ酸配列の配列番号３３、３６、又は３７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む。特定の態様において、本開示は、ヒトＩｇＧ１ ＴＭ突然変異重鎖及びヒトκ軽鎖を更に含むＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を提供し、ここで重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、それぞれ、配列番号４及び配列番号３３；配列番号２９及び配列番号３３；配列番号４１及び配列番号５８；又は配列番号５４及び配列番号７０を含む。
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）は、ヒトκ定常領域を更に含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、例えば軽鎖は、参照アミノ酸配列の配列番号５８、６５〜６９又は７０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含み得る。特定の態様において、本開示は、ヒトＩｇＧ１ ＴＭ突然変異重鎖及びヒトκ軽鎖を更に含むＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を提供し、ここで重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、それぞれ、配列番号４１及び配列番号５８、配列番号４８及び配列番号６５、配列番号４９及び配列番号６６、配列番号５０及び配列番号６７、又は配列番号５３及び配列番号５８を含む。
一部の態様において、本開示は、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などの単離ＬＯＸ１結合タンパク質を含む方法に関し、ここでＬＯＸ１結合タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する：（ａ）任意の好適なアッセイによって決定するとき、ＬＯＸ１に対するｏｘＬＤＬ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び／又は終末糖化産物（ＡＧＥ）の結合を低減し、又は阻害する；（ｂ）任意の好適なアッセイによって決定するとき、細胞表面ＬＯＸ１を発現する内皮細胞のＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素（ＮＯ）、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及び／又はＮＦκＢシグナル伝達を低下させ、又は阻害する；（ｃ）本明細書に開示されるアッセイを含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、細胞表面ＬＯＸ１を発現する内皮細胞のカスパーゼ−８、カスパーゼ−９、及び／又はＢＡＸ活性を低下させ、又は阻害する；（ｄ）任意の好適なアッセイによって決定するとき、一塩基変異多型Ｋ１６７Ｎを有するＬＯＸ１に結合する；（ｅ）任意の好適なアッセイによって決定するとき、ｏｘＬＤＬインターナリゼーションを低減し、又は阻害する；（ｆ）任意の好適なアッセイによって決定するとき、ｏｘＬＤＬ誘導性ＬＯＸ１シグナル伝達を低減し、又は阻害する；（ｇ）ＢＩＡＣＯＲＥ又はＫｉｎＥｘＡによって決定するとき約１５０ｐＭ〜約６００ｐＭ（例えば約４００ｐＭ）の解離定数（ＫＤ）でＬＯＸ１に結合する；（ｈ）ＢＩＡＣＯＲＥによって決定するとき約１×１０５Ｍ−１ｓ−１〜約６×１０６Ｍ−１ｓ−１（例えば約５×１０５Ｍ−１ｓ−１）のＫｏｎ速度でＬＯＸ１に結合する；及び（ｉ）ＢＩＡＣＯＲＥによって決定するとき約１×１０−４ｓ−１〜約３×１０−４ｓ−１（例えば約２．３×１０−４ｓ−１）のＫｏｆｆ速度でＬＯＸ１に結合する。
特定の実施形態において、上記に特定した特性に加えて、又はそれに代えて、ＬＯＸ１結合タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する：（ａ）ＣＳＣを死滅させる；（ｂ）ＣＳＣを除去する；（ｃ）ＣＳＣを阻害する；（ｄ）ＣＳＣ増殖の進行及び／又は進行速度を低下させる；（ｅ）ＣＳＣに関連する病状の進行及び／又は進行速度を低下させる；（ｆ）ＣＳＣの自己複製能及び拡大能を低下させる；及び／又は（ｇ）ＣＳＣ分化を誘導する。
特定の態様において、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１、例えば、ヒトＬＯＸ１（ｈＬＯＸ１）及び／又はカニクイザルＬＯＸ１（ｃｙｎｏＬＯＸ１）、及びその抗原断片に対し、例えばＫＩＮＥＸＡ（登録商標）又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき１０−６Ｍ未満、又は１０−７Ｍ未満、又は１０−８Ｍ未満、又は１０−９Ｍ未満、又は１０−１０Ｍ未満、又は１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、又は１０−１５Ｍ未満の解離定数又はＫＤで特異的に結合することができる。一態様において、抗ＬＯＸ１抗体はｈＬＯＸ１及びｃｙｎｏＬＯＸ１に対し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ未満のＫＤで結合することができる。
別の態様において、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１に対し、１×１０−３ｓ−１未満、又は２×１０−３ｓ−１未満のＫｏｆｆで結合することができる。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質はＬＯＸ１に対し、例えばＫＩＮＥＸＡ（登録商標）又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、又は１０−１０ｓ−１未満のＫｏｆｆで結合する。一態様において、抗ＬＯＸ１抗体はｈＬＯＸ１及びｃｙｎＬＯＸ１に対し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき１〜１０×１０−４ｓ−１のＫｏｆｆで結合することができる。
別の態様において、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１、例えばヒトＬＯＸ１（ｈ ＬＯＸ１）及び／又はカニクイザルＬＯＸ１に対し、例えばＫＩＮＥＸＡ（登録商標）又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、又は少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１、又は少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数又はｋｏｎ速度で結合することができる。一態様において、抗ＬＯＸ１抗体はｈＬＯＸ１及びｃｙｎＬＯＸ１に対し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき約１×１０５Ｍ−１ｓ−１〜約２０×１０５Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度で結合することができる。
上述のとおり、ＬＯＸ１と結合するＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列を含有するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）は、本明細書に示される配列（例えば、表１を参照）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し得る。一部の態様において、ＬＯＸ１と結合する１つ又は複数のＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、本明細書に示される配列と比べて１５個以下の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の）アミノ酸付加、置換（例えば保存的置換）又は欠失を含む。一部の態様において、ＬＯＸ１と結合する１つ又は複数のＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、本明細書に示される配列と比べて８個以下の（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８個の）アミノ酸付加、置換（例えば保存的置換）又は欠失を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１と結合するＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、本明細書に示される配列と比べて５個以下の（例えば、１、２、３、４又は５個の）アミノ酸付加、置換（例えば保存的置換）又は欠失を含む。あるＶＨ領域又はＶＬ領域と特定のパーセント類似性を有するか、又は１つ以上の置換、欠失及び／又は挿入（例えば保存的置換）を有するＶＨ及びＶＬ領域を含有するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）は、本明細書に記載されるＶＨ及び／又はＶＬ領域をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的又はＰＣＲ媒介性突然変異誘発）と、続くＬＯＸ１との結合に関するコードされた改変抗体の試験、及び任意選択で、本明細書に記載される機能アッセイ又は保持機能を試験するため常法で改良し得る当該技術分野において公知のアッセイを用いた保持機能に関する試験によって得ることができる。
抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質のＬＯＸ１に対する親和性又はアビディティは、当該技術分野において公知の任意の好適な方法、例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は動態学（例えば、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）解析）を用いて実験的に決定することができる。直接結合アッセイ並びに競合的結合アッセイフォーマットは、容易に用いることができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；及び本明細書に記載される方法を参照）。特定の抗体抗原相互作用についての計測される親和性は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）で計測された場合には変動し得る。従って、親和性及び他のＬＯＸ１結合パラメータ（例えば、ＫＤ又はＫｄ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の計測は、ＬＯＸ１結合タンパク質及びＬＯＸ１と、当該技術分野において公知のとおりの標準緩衝液との標準溶液で行われる。
本開示は、本明細書に記載されるとおりの（例えば、表１を参照）抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質を更に提供し、この抗体は異種薬剤にコンジュゲートされている。特定の態様において、薬剤は、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的反応修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体又は抗体断片、検出可能標識、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ヘテロコンジュゲートＬＯＸ１結合タンパク質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０７２６４４号明細書（参照により全体として本明細書に援用される）に詳細に考察されるとおり調製することができる。
特定の態様では、ＬＯＸ１結合タンパク質は抗ＬＯＸ１抗体でない。タンパク質標的に高親和性で結合する非抗体ポリペプチドを同定及び作製する種々の方法が当該技術分野において公知である。例えば、Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：２９５−３０４（２００７）、Ｈｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：１４−２７（２００６）、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：６５３−６５８（２００６）、Ｎｙｇｒｅｎ，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５：２６６８−７６（２００８）、及びＳｋｅｒｒａ，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５：２６７７−８３（２００８）（これらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。特定の態様では、ファージディスプレイ技術を用いてＬＯＸ１結合タンパク質を同定／作製することができる。特定の態様では、ポリペプチドは、アンキリン、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、及びチオレドキシンからなる群から選択されるタイプのタンパク質スキャフォールドを含む。
特定の態様において、本方法は、本明細書に開示される１つ以上のＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、表１を参照）と同じエピトープに結合するＬＯＸ１阻害薬（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗体を含むＬＯＸ１結合タンパク質）を含み得る。用語「エピトープ」は、本明細書で使用されるとき、本開示の抗体との結合能を有する標的タンパク質決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有する。立体エピトープと非立体エピトープとは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は失われるが、後者に対する結合は失われない点で区別される。かかる抗体は、標準的な抗原結合又は活性アッセイにおいて、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む抗体、及び／又は配列番号４１のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含む抗体と交差競合する能力（例えば、その結合を統計的に有意な形で競合的に阻害する能力）に基づき同定することができる。
ＬＯＸ１阻害薬を組み込む方法はまた、本明細書に開示される単離ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、表１を参照）と同じエピトープに結合する抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質も含む。
ある試験ＬＯＸ１結合タンパク質が、例えば、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む抗体及び／又は配列番号４１のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含む抗体の結合を阻害する能力から、その試験ＬＯＸ１結合タンパク質がＬＯＸ１との結合に関して当該の抗体と競合し得ることが実証される；かかるＬＯＸ１結合タンパク質は、非限定的な理論によれば、その競合相手のＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）とＬＯＸ１上の同じ又は関連する（例えば、構造的に類似した、又は空間的に近接した）エピトープに結合することができる。一態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む抗体とＬＯＸ１上の同じエピトープに結合する。別の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４１のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含む抗体とＬＯＸ１上の同じエピトープに結合する。
一態様において、本開示は、ＬＯＸ１との結合に関して配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む抗体と競合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗体）を提供する。別の態様において、本開示は、ＬＯＸ１との結合に関して配列番号４１のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含む抗体と競合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗体）を提供する。
他の実施形態において、阻害薬は、ＬＯＸ１ ｍＲＮＡの少なくとも一部分に相補的なポリヌクレオチドを含むアンチセンス分子であってもよい。一部の実施形態において、このアンチセンス分子は、細胞のｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法における使用に好適である。アンチセンス分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡとの両方、並びに化学的に修飾された核酸が含まれ得る。更に、一部の実施形態においてアンチセンス分子は一本鎖又は二本鎖であってもよい。アンチセンス分子は約１０〜約５００ヌクレオチドを含むことができ、一部の実施形態では、例えば、約１１〜約２００ヌクレオチド、約１２〜約１００ヌクレオチド、約１３〜約７５ヌクレオチド、約１４〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約４０ヌクレオチド、約１６〜約３０ヌクレオチド、又は約１７〜約２５ヌクレオチドの範囲の、任意の長さを有し得る。当業者は、これらの範囲が例示的実施形態を表すことを理解するであろう。
一部の実施形態において、阻害薬は、ＬＯＸ１の発現を低下させ又は阻害するｓｉＲＮＡ分子を含み得る。ｓｉＲＮＡ分子は、一部の実施形態では、ＬＯＸ１ ｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列を含み、且つタンパク質の発現を低下させ又は阻害するＲＮＡ干渉又は別のアンチセンス機構を誘導する一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり得る。ｓｉＲＮＡ分子は、そのｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を誘導してＬＯＸ１タンパク質の発現の低下又は阻害を生じさせることを可能にする任意の配列であってよい。ｓｉＲＮＡ分子は、一部の実施形態では、１０〜１００、１２〜８０、１４〜６０、１６〜５０、１７〜４０の長さを有し得る。好適にはｓｉＲＮＡは、１８〜３０ヌクレオチド、特定の実施形態では約１８〜約２６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
阻害性核酸分子を含む実施形態において、かかる阻害薬はストリンジェントな結合条件下で標的ＬＯＸ１核酸配列に結合することができる。用語「ストリンジェントな条件」、「ストリンジェントな結合条件」、又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ポリヌクレオチドが他の配列よりも検出可能に高い程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）で標的配列にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件の一つの非限定的な例としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ中６０℃〜６５℃での洗浄が行われるものが挙げられる。
ＬＯＸ１のポリヌクレオチド配列を所与とすれば、当該技術分野の標準的な技法を用いて阻害性核酸分子をモチーフを使用して設計し、阻害活性に有効であると予想され得る領域に標的化させることができる。
それに代えて又は加えて、ＬＯＸ１の活性を決定するのに適した、且つ当業者に利用可能な任意の更なる方法が用いられ得る。上記で考察したとおり、本明細書に記載される様々な態様及び実施形態において有用な阻害薬は、対照と比較したときＬＯＸ１の活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％阻害し得る。詳細な実施形態において、阻害薬は、ＬＯＸ１の活性を少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７０％阻害するのに有効である。他の実施形態において、阻害薬は、ＬＯＸ１の活性を少なくとも８５％〜約１００％、少なくとも９０％〜約１００％、少なくとも９５％〜約１００％、又は約１００％阻害し得る。
実施形態において、阻害薬は、腫瘍疾患及び／又は癌の治療又は予防に好適な１つ以上の更なる活性薬剤を含む組成物中に組み合わせてもよい。当該技術分野において一般に公知の化学療法剤を含めたかかる活性化合物の一部の非限定的な例、例えば、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）、シタラビン、デキサメタゾン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））、アルブミン結合パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、テモゾロミド、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソイド類（例えば、パクリタキセル）、トキソテール（ｔｏｘｏｔｅｒｅ）、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、メルファラン及び腫瘍に対するホルモン作用を調節し又は阻害するように作用するタモキシフェン及びオナプリストンなどの他の関連するナイトロジェンマスタード及びホルモン剤。
Ｃ．医薬組成物及び製剤
一部の態様において、本開示は医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、ＬＯＸ１阻害薬、又は２つ以上のＬＯＸ１阻害薬の任意の組み合わせを含む組成物であってもよい。かかる医薬組成物はまた、薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物であってもよい。特定の態様において、本開示の医薬組成物は医薬として用いられる。
特定の態様において、本明細書に開示される阻害薬は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と共に医薬組成物として製剤化され得る。特定の態様において、かかる医薬組成物は、当該技術分野において公知の方法を用いた任意の１つ以上の投与経路によるヒト又は非ヒト動物への投与に好適である。当業者は理解するであろうとおり、投与の経路及び／又は方法は所望される結果に応じて異なり得る。用語「薬学的に許容可能な担体」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない１つ以上の非毒性物質を意味する。薬学的に許容可能な担体は、所望の又は必要な投与方法、溶解度及び／又は安定性に好適なものを選択することができる。
生体内投与に用いられる場合、本開示の製剤は無菌でなければならない。本開示の製剤は、滅菌ろ過、放射線照射等を含め、様々な滅菌方法によって滅菌され得る。一態様において、製剤は予め滅菌された０．２２ミクロンフィルタでろ過滅菌される。注射用の無菌組成物は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２１ｓｔｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）に記載されるとおりの従来の薬学実践に従い製剤化することができる。
この態様の実施形態において、治療用組成物は、経口、経鼻、肺内、局所（頬側及び舌下を含む）、直腸、腟内及び／又は非経口投与など、詳細な投与経路用に製剤化することができる。語句「非経口投与」及び「非経口的に投与される」は、本明細書で使用されるとき、経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与方法を指し、限定なしに、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。局所又は経皮投与に好適な本開示の製剤には、散剤、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。阻害薬及び他の活性分は無菌条件下で薬学的に許容可能な担体と混合され、及び必要となり得る任意の保存剤、緩衝剤、又は噴射剤と混合され得る（米国特許第７，３７８，１１０号明細書；同第７，２５８，８７３号明細書；同第７，１３５，１８０号明細書；米国特許出願公開第２００４−００４２９７２号明細書；及び同第２００４−００４２９７１号明細書）。
製剤は、好都合には単位投薬量形態で提供されてもよく、薬学の技術分野において公知の任意の方法により調製され得る。本開示の医薬組成物中における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって有毒でない、特定の患者、組成物、及び投与方法に所望される治療応答を実現するのに有効な活性成分の量（例えば「治療有効量」）が達成されるように様々であり得る。選択される投薬量レベルは、用いられる詳細な組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる詳細な化合物の排泄速度、治療継続期間、用いられる詳細な組成物と併用して用いられる他の薬物、化合物及び／又は物質、治療下の患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康及び前病歴、及び医学分野で周知の同様の要因を含め、種々の薬物動態学的要因に依存し得る。
本開示は、同様に、診断及び研究用途に好適な製剤もまた作製し得ることを企図する。かかる製剤中の活性薬剤の濃度並びに賦形剤の存在又は非存在は、詳細な適用及び使用目的に基づき選択することができる。
Ｄ．キット
本開示の別の態様は、キットに関する。一態様において、キットは、上記に記載したとおりの阻害薬、試薬、組成物、又は医薬組成物のいずれか、及び適切な使用又は投与を指示する説明書又はラベルを含む。任意選択で、キットはまた、１つ以上の容器及び／又はシリンジ又は送達若しくは使用を促進する他の装置も含み得る。本開示は、研究アッセイ、診断アッセイを実行するための、及び／又は治療有効量を投与するための構成要素の全部又は任意の一部がキットに含まれ得ることを企図する。同様に、キットは、例えばコンジュゲートの形成に好適な条件下で本開示の阻害薬と治療用又は診断用部分との間に共有結合を形成することによる、コンジュゲートの作製に関する説明書を含み得る。更なる例として、本開示の治療方法に用いられるキットは、１つ又は複数のＬＯＸ１阻害薬の医薬製剤を含有する溶液、又は１つ以上の阻害薬の凍結乾燥製剤、及びそれを必要としている患者への組成物の投与及び／又は凍結乾燥製品の再構成に関する説明書を含み得る。
本開示はまた、完成品の包装されラベルが付された医薬製品も包含する。この製品は、適切なベッセル又は容器、例えばガラスバイアル又はハーメチックに密閉される他の容器内にある適切な単位投薬形態を含む。非経口投与に好適な投薬形態の場合、活性成分は無菌であり、且つ粒子状物質不含溶液としての投与に好適である。特定の態様において、製剤はヒト又は動物への静脈内注入など、静脈内投与に好適である。
ある具体的な態様において、本開示の製剤は単回投与バイアルに滅菌液として製剤化される。例示的容器としては、限定はされないが、バイアル、ボトル、プレフィルドシリンジ、ＩＶバッグ、ブリスターパック（１つ以上の丸薬を含む）が挙げられる。任意選択で、かかる容器には、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する行政当局によって規定された形式の通知を関連付けることができ、この通知は、ヒトの診断及び／又は投与に関する製造、使用又は販売の当局による認可を反映するものである。
任意の医薬製品と同様に、包装材料及び容器は、保管及び輸送中の製品の安定性を保護するように設計される。更に、本開示の製品は、使用説明書又はその他の、問題の疾患又は障害を適切に予防又は治療する方法を医師、技師又は患者に助言する情報資料を含む。換言すれば、本製品は、限定はされないが、実際の用量、モニタリング手順等を含む投与レジメン、及び他のモニタリング情報を指示又は提案する説明手段を含む。
診断アッセイ用のキットは、本明細書に開示されるとおりのＬＯＸ１阻害薬を含有する溶液、又はそれに代えて又は加えて、ＬＯＸ１の存在の検出用試薬を含み得る。様々な試薬を当該技術分野において公知の及び本明細書に記載される方法により標識してもよく、限定はされないが、小分子蛍光タグなどの標識、ビオチン、ＧＦＰ又は他の蛍光タンパク質などのタンパク質、又はｈｉｓ又はｍｙｃなどのエピトープ配列が挙げられる。同様に、ＬＯＸ１の検出に使用する一次抗体がキットに含まれてもよい。一次抗体は、ＬＯＸ１上の配列に対するものか、又はＬＯＸ１を標識し得る標識、タグ、又はエピトープに対するものであり得る。次には一次抗体が検出用に標識されてもよく、又はシグナルの更なる増幅が望ましい場合には、同様にキットに含まれ得る二次抗体によって一次抗体が検出されてもよい。
研究用途のキットもまた企図される。かかるキットは、例えば、診断又は治療用途が意図されるキットに類似しているが、キット及びその使用が研究目的にのみ制限されることを明記するラベルを更に含み得る。
標識、コンジュゲート及び部分
本開示は、診断及び他のアッセイのため標識にコンジュゲートされ得る試薬を含む方法、組成物、及びキットに関し、ここで１つ以上の標的分子は、かかる１つ又は複数の標識された試薬によって結合及び検出され得る。標識としては、限定なしに、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素及び放射性同位元素が挙げられる。
特定の態様において、試薬はフルオロフォアにコンジュゲートされる。１つ又は複数の試薬に付加されるフルオロフォアの選択により、コンジュゲートされた分子の吸収及び蛍光発光特性が決まることになる。使用し得るフルオロフォア標識の物理的特性としては、限定はされないが、スペクトル特性（吸収、発光及びストークスシフト）、蛍光強度、寿命、分極及び光退色速度、又はこれらの組み合わせが挙げられる。これらの物理的特性は全て、あるフルオロフォアを別のフルオロフォアと区別するのに用いることができ、それによって多重化分析が可能となる。蛍光標識の他の好適な特性としては、例えば１つ又は複数の標的の標識が細胞又は生物（例えば、生きている動物）で実施される場合に、細胞透過性及び低毒性を挙げることができる。
特定の態様において、酵素が標識であり、試薬にコンジュゲートされる。酵素は、検出可能シグナルの増幅を達成してアッセイ感度の増加をもたらすことができるため、好適な標識であり得る。酵素それ自体は検出可能な反応を生じないが、それが適切な基質と接触したときに基質を分解する働きをし、変換された基質が蛍光、比色又は発光シグナルを生じることになる。標識試薬上の１つの酵素が複数の基質の検出可能シグナルへの変換をもたらすことができるため、酵素は検出可能シグナルを増幅する。酵素基質は、好ましい計測可能な産物、例えば比色、蛍光又は化学発光が得られるように選択される。かかる基質は当該技術分野において広範に用いられており、当業者に周知であり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのオキシドレダクターゼと３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）などの基質；酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼなどのホスファターゼ酵素と５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）などの基質；β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−グルコシダーゼなどのグリコシダーゼと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）などの基質が挙げられ；更なる酵素としては、それに対する好適な基質が公知のコリンエステラーゼ及びペプチダーゼなどのヒドロラーゼ、グルコースオキシダーゼ及びシトクロムオキシダーゼなどのオキシダーゼ、及びレダクターゼが挙げられる。
一部のアッセイには、化学発光を生じる酵素及びそれらの適切な基質が好適である。それらとしては、限定はされないが、天然及び組換え形態のルシフェラーゼ及びエクオリンが挙げられる。安定ジオキセタン、ルミノール、イソルミノール及びアクリジニウムエステル類を含有するものなど、ホスファターゼ、グリコシダーゼ及びオキシダーゼに対する化学発光生成基質が更に有用である。
別の態様において、ビオチンなどのハプテンもまた標識として利用される。ビオチンは、酵素系で検出可能シグナルを更に増幅する働きをすることができ、且つ単離目的のアフィニティークロマトグラフィーに使用されるタグとして働くことができるため、有用である。検出目的では、アビジン−ＨＲＰなど、ビオチンに親和性を有する酵素コンジュゲートが使用される。続いてペルオキシダーゼ基質を加えると、検出可能シグナルが生成される。
ハプテンにはまた、ホルモン、天然に存在する及び合成の薬物、汚染物質、アレルゲン、作用分子、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学的中間体、ヌクレオチドなども含まれる。
特定の態様において、蛍光タンパク質が標識として１つ又は複数の試薬にコンジュゲートされてもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びフィコビリタンパク質及びこれらの誘導体が挙げられる。蛍光タンパク質、特にフィコビリタンパク質は、タンデム色素で標識された標識試薬を作成するのに特に有用である。これらのタンデム色素には、より大きいストークスシフトを達成するため蛍光タンパク質及びフルオロフォアが含まれ、ここでは発光スペクトルが蛍光タンパク質の吸収スペクトルの波長から更にシフトする。
特定の態様において、標識は放射性同位元素である。好適な放射性物質の例としては、限定はされないが、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３５Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３ＳＭ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ，１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ及び９７Ｒｕが挙げられる。
一部の態様において、薬物又は毒素が１つ又は複数の試薬にコンジュゲートされる。例えば、試薬が細胞傷害性薬物にコンジュゲートされてもよい。この例では、試薬がＬＯＸ１、又はＬＯＸ１とリガンド又は受容体との間の複合体に結合してもよく、次に細胞に細胞傷害性薬物が送達される。一部の実施形態において、試薬コンジュゲートは細胞にインターナライズされることができ、これにより細胞傷害性薬物が細胞に放出される。当該技術分野において公知の任意の細胞傷害性薬物をコンジュゲートし得る。一部の抗体コンジュゲートはＦＤＡによって既に承認されており、又は／及び現在臨床試験が行われているところである。
上記に開示される態様及び実施形態の一部についての更なる説明を提供するため、以下の実施例を示す。これらの実施例は、いかなる形であれ、本開示の範囲又は添付の特許請求の範囲の広さを限定するものと解釈されてはならない。
実施例１：癌幹細胞エンリッチ細胞集団の作成
３つの患者由来異種移植片（ＰＤＸ）膵腫瘍を癌幹細胞（ＣＳＣ）の供給源としてスクリーニングに使用した。臨床で見られる患者集団をより良く代表するように後期転移性腫瘍を使用した。摘出した腫瘍を２ｍｍ３片に刻み、２００単位／ｍＬコラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、組織が完全に解離するまで１０〜１５分毎に機械的に破壊して解離した。次に細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、４０ミクロンセルストレーナに通過させた。解離した腫瘍細胞を超低付着性６ウェルプレートの間葉系幹細胞培地（ＭＳＣＧＭ、Ｌｏｎｚａ）にプレーティングすることによりＣＳＣをエンリッチした。細胞を４日間培養した後回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して解離して、Ｃｒｙｏｓｔａｒ ５培地に凍結した。細胞懸濁液を合わせてパニング及びスクリーニングに必要な８０００万細胞を得た。
膵臓ＰＤＸ由来癌幹細胞のエンリッチメント。ＣＳＣをエンリッチするため、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した３つの異なるモデルからの膵臓ＰＤＸ腫瘍（図１Ａ）を単細胞に解離し、非付着無血清培養条件でプレーティングした。この結果、先にＣＳＣについてのエンリッチメントが示された腫瘍スフェアが形成された（図１Ｂ）。ＣＳＣのエンリッチメントは遺伝子ＥＺＨ２、ＢＭＩ１、ＳＯＸ２、及びＮａｎｏｇ（これらは幹細胞生物学において重要な役割を果たすことが知られている）、並びに膵臓ＣＳＣの特徴付けに用いることのできる表面マーカーであるＣＤ２４及びＣＤ４４のｑＰＣＲによって決定した。図１Ｃは、プレーティング後４日目に収集したスフェアを全腫瘍細胞と比較したとき全ての幹細胞性遺伝子の遺伝子発現が４０〜３００倍増加していることを示す。次にスフェアを単細胞に解離して、設計されたアンキリンリピートタンパク質「ＤＡＲＰｉｎ」ライブラリ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ）を用いた表現型選択に使用した（実施例２を参照）。
ＣＳＣスフェア対全腫瘍細胞のｑＰＣＲ。プレーティング時、各解離したＰＤＸモデルの３００，０００細胞を「全腫瘍」集団として使用するため急速凍結した。４日間のインキュベーション後、８００ｒｐｍで遠心することによりスフェアを回収した。次にＡｃｃｕｔａｓｅを使用してスフェアを解離し、ＨＢＳＳで２回洗浄した。次に３０万個のＣＳＣスフェア細胞を全腫瘍との比較用に急速凍結した。凍結ペレットから製造者の指示に従いＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを調製した。ＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐを使用して定量化した。１０ｎｇのＲＮＡを含む反応物においてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＲＮＡを逆転写した。得られたｃＤＮＡを製造者の指示に従いＴａｑｍａｎ ＰｒｅＡｍｐマスターミックスキットを使用して増幅した。予備増幅後、反応物を１：２０希釈し、５μＬをＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲ反応（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に使用してＦａｓｔ ＤｘリアルタイムＰＣＲ機にかけた。
実施例２：癌幹細胞への結合が増強された結合剤の同定
ファージディスプレイ細胞パニングを実施して、エンリッチ膵臓ＣＳＣ集団に結合するＤＡＲＰｉｎを同定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓからライセンス提供されたＤＡＲＰｉｎライブラリで、３つのＰＤＸモデルから形成されたスフェア細胞に対するアフィニティ選択を行った（Ｌｌｏｙｄ Ｃ ｅｔ ａｌ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａ １０１１ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｂｒｏａｄ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２００９）。
膵臓ＣＳＣへの結合がエンリッチされたＤＡＲＰｉｎの同定。概略的なスクリーニングキャンペーンの概要を図２に示す。初めに、本発明者らが抗体の単離を所望しない組換えタンパク質に対してＤＡＲｐｉｎライブラリを選択的に除外した。除外後、膵臓ＰＤＸスフェアエンリッチＣＳＣをパニングに使用した。選択後、トリプシン、続いてＴＥＡを用いてＤＡＲＰｉｎを溶出した。溶出したＤＡＲＰｉｎを、膵臓ＰＤＸモデルＰＡ−０１６５から選別されたＣＳＣ（ＣＤ２４＋ＣＤ４４＋ＥｐＣＡＭ＋細胞）及び正常膵上皮細胞の両方への結合に関して評価した。ＳＴＥＭ０２６８は、蛍光定量的マイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ）によって決定するとき、ＰＡ−０１６５腫瘍からフローサイトメトリー選別によってエンリッチされたＣＳＣに結合したが、正常膵上皮細胞には結合しなかった（図３Ａ）。図３Ａの挿入図は細胞の明視野像を示す。ＤＡＲＰｉｎ（１０ｕｇ／ｍＬ）はまた、蛍光支援細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて他の正常上皮細胞株（気管支、結腸及び腎臓）への結合についてもスクリーニングした。ＳＴＥＭ０２６８は、腎上皮細胞への僅かな結合を示したが、気管支及び結腸上皮細胞には結合しなかった（図３Ｂ）。結合についてＦＡＣＳ分析によって更に調べ、ここではＳＴＥＭ０２６８がＰＡ−０１６５及びＰＡ−０１４３ ＰＤＸモデルの両方への結合を示し（それぞれ図４Ａ及び図４Ｂ）、及び標準的な組織培養条件下で成長した細胞と比較したとき、ＨＰＡＣ細胞株から生成されたスフェアへの結合の有意な増加を示した（図４Ｃ）。
ＤＡＲＰｉｎの膵腫瘍細胞、正常上皮細胞及びＣＳＣへの結合。膵癌細胞株はＡＴＣＣから購入した。正常膵上皮細胞はＣｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、製造者の指示に従い維持した。腎上皮細胞、ヘパトサイト、及び結腸上皮細胞は全てＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、製造者の指示に従い維持した。心筋細胞及びヒト気管支上皮細胞は両方ともにＰｒｏｍｏＣｅｌｌから購入し、製造者の指示に従い培養した。初めに細胞株を０．０５％トリプシンで剥がし、又は膵臓ＰＤＸ腫瘍塊を上記の記載と同じプロトコルに従い解離した。１×ＨＢＳＳ、２％ウシ血清アルブミン、及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡからなるフローサイトメトリー緩衝液で細胞を洗浄した。再懸濁した細胞をカウントし、９６ウェルＵ底プレートのウェルにウェル当たり２００，０００細胞以下の密度で移した。次に細胞を２ｕｇ／ｍＬのＤＡＲＰｉｎクローンと共に４℃で１時間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリー緩衝液で洗浄し、再懸濁した細胞をＡＰＣ−ヤギ抗ヒトＦｃ断片特異的二次抗体によって暗所下４℃で３０分間染色した。生死判別染色用にＤＡＰＩを含有するフローサイトメトリー緩衝液で細胞を洗浄して再懸濁した。試料をＬＳＲＩＩフローサイトメーターで読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
ＣＳＣに対するＤＡＲＰｉｎ活性のスクリーニング。選択に使用した膵臓ＰＤＸモデルのうちの１つ（ＰＡ−０１４３）を使用して、好ましい結合パターンを示すＤＡＲＰｉｎをそのスフェア形成阻害能に関してスクリーニングした。簡潔に言えば、腫瘍細胞を解離した後、５０ｕｇ／ｍＬ ＤＡＲＰｉｎを含むＭＳＣＧＭが入った９６ウェル超低付着性プレートにプレーティングした。ＤＡＲＰｉｎは全てトリプリケートで試験した。４日後、プレートを読み取り、未処理及び対照ＤＡＲＰｉｎ処理ウェルの平均値から少なくとも１標準偏差（ＳＤ）の阻害活性を示すものとして阻害性分子を同定した。ＣＳＣにおけるＥＺＨ２の発現に基づく第２のアッセイもまた実施した。本発明者らは、以前膵癌において、そのＥＺＨ２高発現及びリジン２７上のヒストン３のトリメチル化に基づきＣＳＣを同定し得ることを示している（Ｖａｎ Ｖｌｅｒｋｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．２０１３ ＥＺＨ２ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２（１）：４３−５２）。ＨＰＡＣ細胞を使用して、以前記載したとおりＥＺＨ２アッセイを、５０μｇ／ｍＬ ＤＡＲＰｉｎを組み込んで実施した。未処理及び対照ウェルの平均値から少なくとも１ＳＤを阻害するＤＡＲＰｉｎを陽性ヒットと見なした。
実施例３：癌幹細胞の阻害薬
ＳＴＥＭ０２６８は癌幹細胞を阻害する。ＳＴＥＭ０２６８がＣＳＣを阻害することが可能かどうかを決定するため、本発明者らは、それが膵臓ＰＤＸモデルの腫瘍スフェア形成を阻害する能力を試験した。簡潔に言えば、２００単位／ｍＬのコラゲナーゼＩＶを使用して細胞を解離し、プレーティングし、洗浄し、カウントし、及び３０，０００細胞／ｍＬでＭＳＣＧＭ（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁して、超低付着性６ウェルプレートにプレーティングした。適切なウェルに５０μｇ／ｍＬで抗体を加えた。４日間のインキュベーション後、スフェアを回収し、同じように解離及び再プレーティングして二次スフェアを生成させ、ＣＳＣの自己複製能を評価した。ＳＴＥＭ０２６８は未処理又は対照ＤＡＲＰｉｎ−Ｆｃモデルと比較したときＰＡ−０１４３で２７％の阻害を示し（図５Ａ）、及びＰＡ−０１６５モデルで２５％の阻害を示した（図５Ｂ）。ＳＴＥＭ０２６８がＥＺＨ２ｈｉｇｈ細胞の数（本発明者らは以前、これがＨＰＡＣ細胞株における膵臓ＣＳＣを特徴付けることを実証している（Ｖａｎ Ｖｌｅｒｋｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．２０１３））を減少させる能力もまた計測した。図５Ｃに示すとおり、ＳＴＥＭ０２６８はＤＡＲＰｉｎ−Ｆｃ対照と比較したときＥＺＨ２ｈｉｇｈ細胞を４３％減少させる（Ｐ＜０．００５）。これらの実験の両方でサリノマイシン（１μＭ）が陽性対照として働いた（Ｇｕｐｔａ ＰＢ ｅｔ ａｌ．２００９）。これらの実験は、まとめると、ＳＴＥＭ０２６８が膵臓ＰＤＸモデルのＣＳＣを阻害し得ることを実証している。
実施例４：癌幹細胞の阻害標的としてのＬＯＸ１の同定
ＤＡＲＰｉｎ標的の同定。ＳＴＥＭ０２６８の標的を同定するため、本発明者らは、以前記載されたとおり（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ）、タンパク質過剰発現ＨＥＫ２９３細胞のライブラリをスクリーニングした。簡潔に言えば、４３１９個の哺乳類発現ベクター（各々がユニークな膜タンパク質をコードする）で構成されるプラスミドライブラリを個々にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＳＴＥＭ０２６８タンパク質を培養培地に希釈し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体と混合して、トランスフェクト細胞に加えた。細胞をタンパク質と共に３７℃で一晩インキュベートし、次に共焦点顕微鏡法によって結合を計測した。次に顕微鏡的陽性ヒットをＦＡＣＳによってスクリーニングした。図６Ａは、ＬＯＸ１を過剰発現する細胞へのＳＴＥＭ０２６８のＦＡＣＳ結合を示す。Ｆｃガンマ受容体２ｂ（Ｆｃｇｒ２ｂ）をＤＡＲＰｉｎ−Ｆｃへの結合の陽性対照として使用した。他の非標的タンパク質（Ｓ１ＰＲ２及びＢＭＰＲ１Ａ）へのＳＴＥＭ０２６８のＦＡＣｓ結合の例が示される。ＳＴＥＭ０２６８の標的についてのこの同定を確かめるため、フラグタグ付加組換えヒトＬＯＸ１（ｒｈＬＯＸ１）を使用してＥＬＩＳＡを実施した。ＳＴＥＭ０２６８は実にｒｈＬＯＸ１に結合した（図６Ｂ）。対照ＤＡＲＰｉｎ−Ｆｃはいずれも結合せず、及び抗ＦＬＡＧ抗体はまたフラグタグ付加ｒｈＬＯＸ１の検出能も有した。ＳＴＥＭ０２６８がＬＯＸ１に結合する能力は、Ｏｃｔｅｔ分析によって更に確認された（図６Ｃ）。
ＬＸ５１４０１１０は癌幹細胞を阻害する。ＬＯＸ１阻害薬がＣＳＣスフェア形成を阻害する能力を更に確かめるため、配列番号３３を含むＶＬと配列番号４を含むＶＨとを含むＬＯＸ１特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＬＸ５１４０１１０（例えば表１を参照）を、その膵臓ＰＤＸモデルにおけるスフェア形成の阻害能に関してＳＴＥＭ０２６８と比較した。ＬＸ５１４０１１０はＰＡ−０１６５及びＰＡ−０１４３モデルの両方でＳＴＥＭ０２６８と同程度にスフェア形成を阻害した（図７Ａ）。加えて、ＬＸ５１４０１１０は、複数の膵臓細胞株（図７Ｂ）及び結腸直腸細胞株（図７Ｃ）のＣＳＣを阻害する能力を有した。
ＰＡ−０１４３によるインビボ試験を実施して、ＬＸ５１４０１１０がインビボでＣＳＣを阻害する能力を決定した。ＰＡ−０１４３ ＰＤＸ腫瘍は、腫瘍断片を６〜８週齢ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）にトロカール移植することによって継代して成長させ、約３００ｍｍ３になった時点でマウスを無作為化し、３０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１ ｍＡｂ又はＬＸ５１４０１１０のいずれかを週２回、２週間にわたって皮下注射することにより治療した（図８Ａ）。ＬＸ５１４０１１１０単独は、媒体治療及び同様に３０ｍｇ／ｋｇで投与した対照非特異的ＩｇＧ１の両方と比較してＰＡ−０１４３モデルの腫瘍成長を僅かに低下させたが（Ｐ＜０．００１、チューキーの比較検定）、ＬＯＸ１は腫瘍のごく一部を占めるに過ぎないＣＳＣで主に発現すると思われるため、これは予想どおりであった。最終回の抗体投与の２４時間後、一部のマウスから腫瘍を摘出し、ＣＳＣの割合について分析した。ＬＸ５１４０１１０は媒体対照と比較したときＣＳＣの有意な減少を示した（図８Ｂ）。
ＬＸ５１４０１１０と化学療法との併用は抗腫瘍細胞有効性の改善をもたらす。化学療法及び更には一部の標的療法で腫瘍量の低下にも関わらずＣＳＣがエンリッチされ得ることを考えると、これらの薬剤と併用してＣＳＣ特異的標的療法を用いる併用手法は癌患者の治療に魅力的な手法となる。ＬＸ５１４０１１０はＣＳＣを特異的に標的化するため、本発明者らは、現行の膵癌に対する標準治療化学療法であるゲムシタビンとＬＸ５１４０１１０との併用効果に取り組むことにした。初めにゲムシタビンがＰａｎ０２．１３を阻害する能力を試験した。Ｐａｎ０２．１３細胞を組織培養被覆平底プレート（ｎ＝１０）に１００ｎｇ／ｍＬゲムシタビン有り及び無しの標準的な組織培養条件下でプレーティングした。１００ｎｇ／ｍＬで細胞数の有意な減少があった（図９Ａ、Ｐ＜０．００１ スチューデントの両側ｔ検定）。ＣＳＣに対する治療の効果を決定するため、Ｐａｎ０２．１３を標準的な組織培養条件で５０μｇ／ｍＬのＬＸ５１４０１１０又は対照抗体のいずれかにより及び１００ｎｇ／ｍＬのゲムシタビン（ＧＥＭ）有り又は無しで４日間処理し、次にＣＳＣの割合についてフローサイトメトリーで分析した。ＣＳＣ（ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ２４＋ＣＤ４４＋）の割合は各処理条件につき決定した。初めに細胞をスキャッタ及びＤＡＰＩを用いて単一生細胞についてゲーティングした。蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照をゲーティングに利用し、ＥｐＣＡＭ＋集団をＣＤ４４及びＣＤ２４発現について分析した。生細胞のＣＳＣ頻度を図９Ｂに報告する。これらの条件下及び時点で、ＬＸ５１４０１１０はＣＳＣの僅かな減少を示した。既報告のとおり、ゲムシタビンではＣＳＣがエンリッチされ、このエンリッチメントは非特異的ＩｇＧ１を含めることによる影響を受けなかった。しかしながら、ＬＸ５１４０１１０による処理はこの増加を阻害したのみならず、ＣＳＣの割合もまたベースラインレベルから僅かに低下させた（０．６２％対ゲムシタビン無しの対照ＩｇＧ１の０．８１％）。
ＬＯＸ１を阻害すると化学療法誘発性心筋細胞損傷を低減することができる。化学療法と抗ＣＳＣ標的療法との併用は臨床で有用であるものと見込まれるが、多くの化学療法が抗腫瘍活性に加えて意図せぬ有害な副作用を有することが知られている。かかる副作用の一つは、心筋細胞死及び心不全につながり得る心臓損傷である。ＬＯＸ１は、ドキソルビシン媒介心筋細胞損傷において主要な役割を果たすことが示されている（Ｓｐａｌｌａｒｏｓｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００５）３３５ １８８−１９６、Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １１（５）：ｅ０１５４９９４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５４９９４を参照）。初めに、本発明者らは、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）及び胚性幹細胞由来心筋細胞においてドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｏｂｕｃｉｎ）処理に応答したＬＯＸ１の発現を調べた。酸化ＬＤＬ（Ｏｘ−ＬＤＬ）はＬＯＸ１の従来のリガンドであり、ラット心筋細胞におけるＯｘ−ＬＤＬに応答したＬＯＸ１の増加がこれまでの報告によって示されているため（Ｓｐａｌｌａｒｏｓｓａ ｅｔ ａｌ．，（２００５））、これを対照として加えた。４０，０００細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、培地単独又は５μＭドキソルビシンを含有する培地で２４時間処理した。次に細胞を剥がし取り、プロテアーゼ阻害薬を含有する１×ＲＩＰＡ緩衝液によって氷上で１時間溶解させた。各試料にローディング緩衝液を加え、続いて９０℃で１０分間加熱した。４〜１２％ビス−トリスグラジエントゲルに各レーンにつき１２マイクロリットルの試料をロードした。ゲルをＭＯＰＳ緩衝液中２００Ｖで４０分間泳動させた。ｉＢｌｏｔを使用してタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。この膜をカゼイン溶液で一晩ブロックした。ＬＸ５１４０１１０をカゼインブロッキング緩衝液中１μｇ／ｍｌで膜に加え、室温で１時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴ緩衝液で３回、各５分間洗浄した。ＨＲＰにコンジュゲートした抗ヒトＦｃ抗体をカゼインブロッキング緩衝液中１：５０００希釈で加え、室温で１時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで２回、各１０分間洗浄した後、最後にＴＢＳ緩衝液で１５分間洗浄した。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ化学発光基質を１分間加えた。膜をフィルムに露光して現像した。図１０Ａに示すとおり、Ｏｘ−ＬＤＬ及びＤＯＸ処理ヒト大動脈内皮細胞の両方で（これらは化学療法剤が心臓で最初に遭遇するものである）ＬＯＸ１タンパク質が上方制御された。興味深いことに、本発明者らはまた、５μＭ ＤＯＸで処理した心筋細胞においてもＬＯＸ１発現の増加を検出した（図１０Ｂ）。
次に、本発明者らは、ＬＯＸ１の阻害がドキソルビシン媒介心筋細胞損傷を阻止することができるかどうかを決定しようと試みた。Ｃｙｔｉｖｉａ（商標）心筋細胞をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入し、製造者の指示に従い、但しウシフィブロネクチンをヒトフィブロネクチンに置き換えてプレーティングした。細胞を４日間付着させた後、培地を交換した。５〜７日目、培地を除去し、細胞を指示濃度のＬＸ５１４０１１０と共に４時間プレインキュベートした後、５μΜドキソルビシン（ＤＯＸ）を添加した。ＤＯＸの添加後、細胞を更に２４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、ＤＡＰＩ（１：４０００希釈の１ｍｇ／ｍＬ）、ＴＯＴＯ−３（培地１ｍＬ当たり１ｕＬの色素溶液）、及び５μＭ Ｆｌｕｏ−４で細胞を染色した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、次にＧＥ ＩＮ Ｃｅｌｌ ＡｎａｌｙｚｅｒのＩｍａｇｅでイメージングした。ＤＡＰＩ及びＴＯＴＯ−３色素を除く細胞数を取得することにより生存率を決定し、一方でＦｌｕｏ−４を用いてカルシウム濃度を決定した。心筋細胞はエンドトキシン誘発性心機能不全においてカルシウム負荷の増加を示すことが知られている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）４７：６６９−６７６）。図１１Ａに示すとおり、カルシウム濃度は、５μＭ ＤＯＸと共にインキュベートした心筋細胞で、心筋細胞機能障害を示す未処理対照と比較したとき約２．５倍増加した。（重要なことに、ＬＸ５１４０１１０はＤＯＸ処理の結果としてカルシウムの蓄積を阻害可能であった。更に、ＤＯＸは心筋細胞の生存率の低下をもたらし（図１１Ｂ）、これは、この場合もまたＬＯＸ１阻害薬ＬＸ５１４０１１０によって逆転した。
考察
上記の実施例のデータは、冠動脈及び循環の健康におけるその既知の役割に加えた、ＬＯＸ１のこれまで確認されたことのない予想外の機能を実証している。詳細には、本明細書に提供される研究は、癌に関連してＬＯＸ１がＣＳＣ機能において特異的な役割を有することを実証し、これはこれまでに報告されたことのない知見に相当する。例示的な実施例の幾つかにおいて、それらの結果は、膵癌及び結腸直腸癌モデルにおいてＬＯＸ１がＣＳＣに過剰発現し、且つＰＤＸモデルへのＬＯＸ１阻害薬（ＤＡＲＰｉｎ及びｍＡｂ）の外因性投与によってＣＳＣの直接的な阻害がもたらされたとおり、ＣＳＣ活性において機能的役割を有することを示している。更に、上記の実施例のデータは、ＬＯＸ１阻害薬が化学療法によって誘発されるＣＳＣの増加を阻害し、これらを併用した使用が魅力的な臨床パラダイムとなり得ることを示している。加えて、本発明者らは、上記の実施例において、ＬＯＸ１阻害薬がまた、化学療法の薬物で治療される患者にとって重大な問題である、化学療法によって誘発される心臓損傷も保護し得るというエビデンスを提供する。
多数の前臨床的及び臨床的エビデンスからは、癌治療におけるＣＳＣの重要な機能が指摘され、従ってこの腫瘍細胞集団を標的化する治療には高い価値があり得る。本明細書に記載される研究は、ＣＳＣ維持におけるＬＯＸ１の新規の重要な役割を指摘するだけに留まらず、ＬＯＸ１の中和がＣＳＣ機能を阻害する有用な戦略であり得ること、及びＬＯＸ１の遮断によるＣＳＣの阻害によって患者生命を改善するユニーク且つ有効な療法が実現し得ることを示唆している。
参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、各個別の刊行物又は特許が具体的且つ個別的に参照によって援用されることが示されたものとして本明細書によって全体として参照により援用される。
本開示の具体的な態様を考察したが、上記の明細書は例示であり、限定ではない。当業者には、本明細書及び以下の特許請求の範囲を考察すれば、本開示の多くの変形例が明らかになるであろう。本開示の完全な範囲は特許請求の範囲をその均等物の完全な範囲と共に、及び明細書をかかる変形例と共に参照することにより決定されるべきである。
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Claims (89)

  1. 癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖を阻害する方法であって、前記ＣＳＣの増殖を阻害し及び／又はその生存を低下させるのに有効な量のレクチン様酸化ＬＤＬ受容体１（ＬＯＸ１）の阻害薬に前記ＣＳＣを接触させるステップを含む方法。
  2. 前記ＣＳＣがＬＯＸ１を発現する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法であって、前記治療抵抗性癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）を阻害し又は死滅させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を前記対象に投与するステップを含む方法。
  7. 以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法であって、前記治療抵抗性癌を治療するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を前記対象に投与するステップを含む方法。
  8. 前記ＣＳＣがＬＯＸ１を発現する、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項６又は７に記載の方法。
  10. 前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法であって、前記癌における前記ＣＳＣを阻害し又は死滅させるのに有効な量の阻害薬ＬＯＸ１を治療を必要としている対象に投与するステップを含む方法。
  13. 癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法であって、前記癌を治療するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を治療を必要としている対象に投与するステップを含む方法。
  14. 前記ＣＳＣがＬＯＸ１を発現する、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
  16. 前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 再発（recurrence）癌又は再燃（relapsed）癌を有する対象の癌を治療する方法であって、前記癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む方法。
  19. 再発癌又は再燃癌を有する対象の癌を治療する方法であって、前記癌を治療するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を対象に投与するステップを含む方法。
  20. 前記ＣＳＣがＬＯＸ１を発現する、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
  22. 前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  24. 癌の再発又は再燃を予防する方法であって、癌の再発又は再燃を予防するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を癌の再発又は再燃の予防を必要としている対象に投与するステップを含む方法。
  25. 前記癌が癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ＣＳＣがＬＯＸ１を発現する、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 癌を有する対象の癌の再燃リスクを低下させる方法であって、前記癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を前記対象に投与し、それによって前記対象の癌の再燃リスクを低下させるステップを含む方法。
  31. 前記ＣＳＣがＬＯＸ１を発現する、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 癌幹細胞（ＣＳＣ）を除去する方法であって、ＬＯＸ１阻害薬に前記ＣＳＣを接触させるステップを含む方法。
  36. 前記ＣＳＣがＬＯＸ１を発現する、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣである、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 癌における癌幹細胞（ＣＳＣ）を阻害又は死滅させるのに有効な量の組成物におけるＬＯＸ１阻害薬の使用。
  41. 前記ＣＳＣがＬＯＸ１を発現する、請求項４０に記載の使用。
  42. 前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項４０に記載の使用。
  43. 前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の使用。
  44. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の使用。
  45. 癌細胞を含む試料中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在を決定する方法であって、
    ＬＯＸ１核酸配列又はＬＯＸ１アミノ酸配列に結合する薬剤に前記試料を接触させるステップ；
    前記薬剤と前記ＬＯＸ１核酸配列又は前記ＬＯＸ１アミノ酸配列との間の結合の存在又は非存在を検出するステップ；及び
    前記薬剤と前記ＬＯＸ１核酸配列又は前記ＬＯＸ１アミノ酸配列との間の結合の検出に基づき前記試料中の前記ＣＳＣの存在を同定するステップ、
    を含む方法。
  46. 前記試料中の前記ＬＯＸ１核酸配列又は前記ＬＯＸ１アミノ酸配列の量を定量化するステップ、前記ＬＯＸ１核酸配列又は前記ＬＯＸ１アミノ酸配列の量をＬＯＸ１核酸又はＬＯＸ１アミノ酸の基準レベルと比較するステップ、及び前記検出された量が前記基準レベルよりも多い場合に前記試料中の前記ＣＳＣの存在を同定するステップを更に含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記薬剤が検出可能部分を更に含む、請求項４５又は４６に記載の方法。
  48. 前記薬剤が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記ＬＯＸ１核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を含む、請求項４５又は４６に記載の方法。
  49. 前記薬剤が、前記ＬＯＸ１アミノ酸配列に特異的に結合する抗体を含む、請求項４５又は４６に記載の方法。
  50. 癌細胞集団中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の数を選択的に減少させる方法であって、前記癌細胞集団における前記ＣＳＣを阻害し又は死滅させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に前記癌細胞集団を接触させるステップを含む方法。
  51. 前記ＣＳＣがＬＯＸ１を発現する、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子阻害薬ＬＯＸ１、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法であって、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に前記腫瘍を接触させるステップを含む方法。
  56. 前記腫瘍がＬＯＸ１を発現する、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記腫瘍がスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記腫瘍が、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 腫瘍のサイズを低下させる方法であって、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に前記腫瘍を接触させるステップを含む方法。
  61. 前記腫瘍がＬＯＸ１を発現する、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記腫瘍がスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項６０に記載の方法。
  63. 前記腫瘍が、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 患者の腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法であって、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を前記患者に投与するステップを含む方法。
  66. 前記腫瘍がＬＯＸ１を発現する、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記腫瘍がスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項６５に記載の方法。
  68. 前記腫瘍が、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 患者の腫瘍のサイズを低下させる方法であって、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を前記患者に投与するステップを含む方法。
  71. 前記腫瘍がＬＯＸ１を発現する、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記腫瘍がスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項７０に記載の方法。
  73. 前記腫瘍が、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 患者の腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防する方法であって、腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を前記患者に投与するステップを含む方法。
  76. 前記腫瘍がＬＯＸ１を発現する、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記腫瘍がスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記腫瘍が、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項７５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. ＣＳＣにおける分化を誘導する方法であって、前記ＣＳＣにおける分化を誘導するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬に前記ＣＳＣを接触させるステップを含む方法。
  81. 前記ＣＳＣがＬＯＸ１を発現する、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌由来である、請求項８０〜８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記ＣＳＣにおける分化を誘導するステップが、ＣＳＣ集団を含む癌に罹患している対象で実施される、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項８０〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 化学療法を必要としている患者の化学療法関連心毒性を阻害し、低下させ、又は予防する方法であって、化学療法関連心毒性を阻害し、低下させ、又は予防するのに有効な量のＬＯＸ１阻害薬を前記患者に投与するステップを含む方法。
  87. 前記阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体、小分子ＬＯＸ１阻害薬、及びＬＯＸ１をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記化学療法がアントラサイクリンである、請求項８６又は８７に記載の方法。
  89. 前記ＬＯＸ１阻害薬が、ＬＯＸ１に結合する抗体である、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の方法。
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CIRCULATION, 2011, VOL.124, ABSTRACT 11713, JPN6020036531, ISSN: 0004354353 *

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