KR101516289B1 - 간세포 성장 인자에 대한 사람화된 모노클로날 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간세포 성장 인자에 대한 사람화된 중화 모노클로날 항체, 이를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이러한 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

간세포 성장 인자에 대한 사람화된 모노클로날 항체{HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODIES TO HEPATOCYTE GROWTH FACTOR}

본 발명은 일반적으로 신규한 생물학을 개발하기 위한 모노클로날 항체(mAb) 및 재조합 DNA 기술의 조합에 관한 것이고, 보다 특히, 예를 들어 간세포 성장 인자에 결합되어 이를 중화시키는 사람화된 모노클로날 항체의 생성에 관한 것이다.

사람 간세포 성장 인자(HGF)는 중간엽 세포에 의해 생성되는 다작용성 헤테로이량체 폴리펩티드이다. HGF는 혈관형성, 형태발생 및 모토게네시스(motogenesis)를 자극할 뿐만 아니라 다양한 세포 유형의 성장 및 산란을 자극하는 것으로 나타났다 (Bussolino et al., J. Cell. Biol. 119: 629, 1992; Zarnegar and Michalopoulos, J. Cell. Biol. 129:1177, 1995; Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier and Gherardi, Trends Cell. Biol. 8:404, 1998; Xin et al. Am. J. Pathol. 158:1111, 2001). HGF의 다면발현 활성은 원발암유전자 cMet에 의해 엔코딩된 트랜스막 티오신 키나아제인 이의 수용체를 통해 매개된다. HGF 및 이의 수용체 c-Met는 다양한 정상적인 세포 기능을 조절하는 것에 추가하여 종양의 개시, 침습 및 전이에 관여하는 것으로 나타났다 (Jeffers et al., J. Mol. Med. 74:505, 1996; Comoglio and Trusolino, J. Clin. Invest. 109:857, 2002). HGF/cMet는 폐, 결장, 직장, 위, 신장, 난소, 피부, 다발골수종 및 갑상선 조직으로부터 유래된 종양을 포함하는 다양한 사람 고형종양에서 함께 발현되고, 종종 과-발현된다 (Prat et al., Int. J. Cancer 49:323, 1991; Chan et al., Oncogene 2:593, 1988; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993; Derksen et al., Blood 99:1405, 2002). HGF는 이러한 종양에 대하여 자가분비(autocrine) (Rong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4731, 1994; Koochekpour et al., Cancer Res. 57:5391, 1997) 및 주변분비(paracrine) 성장 인자 (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993) 및 항-아폽토틱 조절제(Gao et al., J. Biol. Chem. 276:47257, 2001)로서 작용한다.

HGF는 혈액 응고의 다른 효소 및 플라스미노겐과 서열 및 구조적 유사성을 지니는 102 kDa 단백질이다 (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993). 사람 HGF는 728개 아미노산의 전구체 (프리프로HGF)로서 합성되며, 이것은 비활성 단일 사슬 형태(프로HGF)로 세포내 절단된다 (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Rosen et al., J. Cell. Biol. 127:1783, 1994). 세포외 분비시에, 프로HGF는 절단되어 α-서브유닛 및 β-서브유닛을 포함하는 생물학적으로 활성인 디설파이드-결합된 헤테로이량체 분자를 생성한다 (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Naldini et al., EMBO J. 11: 4825, 1992). α-서브유닛은 N-말단 헤어핀(hairpin) 도메인 및 4개의 크링글(kringle) 도메인으로 구성된, 440개의 잔기를 함유한다 (글리코실화로 69 kDa). β-서브유닛은 234개 잔기(34 kDa)를 함유하며 단백질분해 활성이 결여된 세린 프로테아제-유사 도메인을 지닌다. HGF는 2개의 독특한 세포 특이적 결합 부위인, cMet 수용체에 대한 고 친화력 (Kd = 2 x 10^-10 M) 결합 부위 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)에 대한 저 친화력 (Kd = 10^-9 M) 결합 부위를 지니며, 이러한 부위들은 세포 표면과 세포외 매트릭스 상에 존재한다 (Naldini et al., Oncogene 6:501, 1991; Bardelli et al., J. Biotechnol. 37:109, 1994; Sakata et al., J. Biol. Chem., 272:9457, 1997).

cMet 수용체는 클래스 IV 단백질 티로신 키나아제 수용체 패밀리의 멤버이다. 전장 cMet 유전자는 cMet 원발암유전자로서 클로닝되고 동정되었다 (Cooper et al., Nature 311: 29, 1984; Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6379, 1987). NK2 (α-서브유닛의 N-말단과 처음 두 크링글 도메인을 포함하는 단백질)는 cMet로의 결합과 운동성을 위한 시그널 캐스캐이드의 활성화에 충분하나, 분열촉진 반응을 위해서는 전장 단백질이 요구된다 (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. MoI. Biol. 8:229, 1993). HSPG는 HGF의 N-말단과 상호작용함에 의해 HGF에 결합된다.

HGF/cMet는 종양 개시, 침습, 전이, 아폽토시스의 조절 및 혈관형성과 같은 암 발생의 여러 측면에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 여러 상이한 접근법이 효과적인 길항 분자를 수득하기 위해 조사되어 왔다: 트렁케이션된 HGF 단백질, 예컨대 NK1 (N 말단 도메인 + 크링글 도메인 1; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268:17145, 1993), NK2 (N 말단 도메인 + 크링글 도메인 1 및 2; Chan et al., Science 254:1382, 1991) 및 NK4 (N-말단 도메인 + 4개의 크링글 도메인; Kuba et al., Cancer Res. 60:6737, 2000), 항-cMet mAb들 (Dodge, Master's Thesis, San Francisco State University, 1998) 및 항-HGF mAb들 (Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001, 본원에 참조로서 포함됨).

NK1 및 NK2는 HGF의 이의 수용체에 대한 결합과 효과적으로 경쟁할 수 있으나, 요망되는 순수한 길항 활성이 아닌 시험관내에서 부분적인 효능 활성을 지니는 것으로 보고되었다 (Cioce et al., J. Biol. Chem. 271:13110, 1996; Schwall et al., J. Cell Biol. 133:709, 1996). 보다 최근에, 문헌[Kuba et al., Cancer Res. 60:6737, 2000]에서는, NK4가 NK4의 지속적인 주입에 의해 누드 마우스 모델에서 뮤린 폐 종양 LLC의 일차 성장 및 전이를 부분적으로 억제할 수 있었다고 보고되었다. 그러나, NK4가 일차 종양의 부분적인 성장 억제를 달성하기 위해 지속적으로 투여되어야 한다는 사실은 NK4 분자의 잠재적으로 짧은 반감기 및/또는 효능의 부족을 나타낸다.

문헌[Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001]에서는, 시험관내에서 HGF의 산란 활성을 억제하는 능력에 기초하여 선택된 3개의 항-HGF mAb들의 칵테일을 투여하여 이종이식편 누드 마우스 모델에서 사람 종양의 성장을 억제할 수 있었다고 보고되었다. 이것은, 생체내에서 HGF의 생체활성을 억제하기 위해 HGF 상에서 3개의 상이한 결합 부위를 인식하는 3개의 mAb들이 요구됨을 가정하며, 두 mAb는 cMet에 대한 HGF의 결합을 억제하였고 한 mAb는 헤파린에 대한 HGF의 결합을 억제하였다.

최근, 유전자이식 마우스 기술을 이용하여 개발된 HGF에 개별적으로 결합되어 이를 중화시키는 사람 mAb가 보고되었다 (Burgess et al., WO 2005/017107A2 and Burgess et al., Cancer Res 66:1721, 2006, 각각 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다). 그러나, 이 중에서 적어도 종양 이종이식편 모델에서 명백히 가장 효능이 컸던 2.12.1 mAb도 혈관형성을 억제하지 않았다. 혈관형성을 포함하는 HGF의 모든 시험된 생물학적 활성을 중화시키는 마우스 mAb L2G7이 개발되었다 (Patent application USSN 10/917,915 filed August 13, 2004, and Kim et al. Clin Cancer Res 12:1292, 2006, 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다).

따라서, 시험관내 및 생체내에서 HGF의 생물학적 활성을 차단하는 사람화된 모노클로날 항체에 대한 요구가 있다. 본 발명은 이러한 요구 및 기타 요구를 충족한다.

일 구체예에서, 본 발명은 사람 간세포 성장 인자(HGF)에 대한 사람화된 중화 mAb를 제공한다. 이 mAb는 HGF의 이의 수용체 cMet에 대한 결합, 마딘-다비(Madin-Darby) 개속 신장 세포와 같은 세포의 산란 유도, Mv 1 Lu 밍크 폐 상피 세포 및/또는 간세포 및/또는 HUVEC의 증식 유도, 및 혈관형성의 자극을 포함하는 HGF의 적어도 하나, 바람직하게는 여러 개 또는 모든 생물학적 활성을 억제한다. 바람직한 사람화된 항-HGF mAb는 마우스에서 사람 종양 이종이식편의 성장을 억제하고, 가장 바람직하게는 완전히 억제한다. 바람직한 구체예에서, 사람화된 mAb는 사람화된 L2G7 mAb이다. 특히 바람직한 구체예에서, mAb의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 도 2A 및 도 2B에서 HuL2G7로 표시된 줄에 도시된 서열을 지니거나, 이들과 적어도 90% 이상 동일한 서열을 지닌다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람 간세포 성장 인자(HGF)에 결합되어 이를 중화시키는 사람화된 모노클로날 항체(mAb)를 제공하고, 사람화된 항체는 사람화된 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 사람화된 중쇄는 L2G7로부터의 CDR과, H29, H30, H48, H66, H67, H71, H94로 구성된 군으로부터 선택된 사람 중쇄 가변 영역 프레임워크의 적어도 한 위치가 L2G7 중쇄에서의 상응하는 위치를 차지하는 아미노산에 의해 점유되는 것을 조건으로 사람 중쇄 가변 영역 프레임워크를 포함한다. 사람화된 경쇄는 L2G7로부터의 CDR과, L3 및 L60으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한 위치가 L2G7 경쇄에서의 상응하는 위치를 차지하는 아미노산에 의해 점유되는 것을 조건으로 사람 경쇄 가변 영역 프레임워크를 포함한다.

이러한 사람화된 항체를 생성하는 세포주도 제공된다. 또 다른 구체예에서, 사람화된 L2G7 mAb를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 세 번째 구체예에서, 약제학적 조성물을 환자(통상적으로 사람 환자)에게 투여하여 암 또는 기타 질병을 치료한다.

도면의 간단한 설명

도 1. 클로닝된 cDNA로부터 번역된 L2G7 성숙한 중쇄 (A) 및 경쇄 (B) 가변 영역의 아미노산 서열. CDR을 밑줄로 표시한다. 카바트(Kabat) 넘버링 시스템을 이용한다.

도 2. L2G7 및 억셉터 V 영역과 정렬된 HuL2G7 중쇄 (A) 및 경쇄 (B) 성숙한 가변 영역의 아미노산 서열이 도시된다. CDR을 L2G7 서열에서 밑줄로 표시하며, 개시 아미노산 H1E를 이중 밑줄로 표시하면서 마우스 L2G7 아미노산으로 치환된 아미노산을 HuL2G7 서열에서 밑줄로 표시한다. 카바트 넘버링 시스템을 이용한다.

도 3. 전체 HuL2G7 중쇄 (A) 및 경쇄 (B)의 아미노산 서열. 성숙한 중쇄 및 경쇄의 첫 번째 아미노산 (즉 시그널 서열의 절단 후)을 이중 밑줄로 표시하며 1번으로 표시한다; 이들 아미노산은 성숙한 V 영역의 첫 번째 아미노산이기도 하다. 중쇄에서, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 첫 번째 아미노산을 밑줄로 표시하고, 경쇄에서, C_κ 영역의 첫 번째 아미노산을 밑줄로 표시한다.

도 4. HGF와의 결합에 대한 HuL2G7, ChL2G7 및 L2G7의 경쟁적 결합 검정.

도 5. Met로의 HGF의 결합을 차단하는 HuL2G7, ChL2G7 및 L2G7의 상대적인 능력.

도 6. Mv 1 Lu 세포의 HGF-유도된 증식을 억제하는 HuL2G7 및 L2G7의 상대적인 능력.

도 7. NIH III 베이지/누드 마우스의 그룹에서 U87 피하 이종이식편의 성장에 대한 HuL2G7 또는 L2G7 mAb 또는 PBS 대조군을 이용한 치료 효과. 화살표는 주입이 개시된 때를 나타내고, 에러 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다 (s.e.m). L2G7 및 HuL2G7에 대한 부호가 겹쳐져서 도면에서 분간될 수 없다.

도 8. NIH III 베이지/누드 마우스의 그룹에서 U87 피하 이종이식편의 성장에 대한 HuL2G7의 네 상이한 용량 수준의 효과. 화살표는 주입이 개시된 때를 나타내고, 에러 바는 s.e.m을 나타낸다.

바람직한 구체예의 상세한 설명

본 발명은 사람화된 중화 항-HGF 모노클로날 항체, 이를 포함하는 약제학적 조성물, 및 질병을 치료하기 위해 이를 이용하는 방법을 제공한다.

1. 항체

항체는 복잡한 내부 구조를 지니는 매우 크고 복잡한 분자이다 (분자량 ~150,000 또는 약 1320개 아미노산). 자연의 항체 분자는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍을 함유하고, 각 쌍은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄를 지니므로 항체의 근본적인 구조적 유닛은 사량체이다. 차례로 각 경쇄와 중쇄는 2개의 영역으로 구성되는데 가변("V") 영역은 표적 항원에 결합하는데 관여하고 불변 ("C") 영역은 면역 시스템의 다른 성분들과 상호작용한다. 경쇄와 중쇄 가변 영역은 3차원 공간에서 함께 폴딩되어 (fold up) 항원 (예를 들어, 세포 표면상에 있는 수용체)에 결합되는 가변 영역을 형성한다. 각 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 내에, 상보성 결정 영역("CDR")이라 불리는 3개의 짧은 세그먼트 (길이가 평균 10개 아미노산임)가 존재한다. 항체 가변 도메인에 있는 6개의 CDR (3개는 경쇄로부터 온 것이고 3개는 중쇄로부터 온 것이다)이 3차원 공간에서 함께 폴딩되어 표적 항원으로 고정되는 실질적인 항체 결합 부위를 형성한다. CDR의 위치 및 길이는 정확하게 규정되어 있다. 참조 문헌[[Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987, 이는 본원에 참조로서 포함된다]. CDR에 함유되지 않는 가변 영역의 일부를 프레임워크라 부르며, 이는 CDR을 위한 환경을 형성한다. 각 사슬에서, 3개의 CDR이 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 4개의 프레임워크 섹션에 산재된다.

면역글로불린의 성숙한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로부터의 아미노산을 각각 Hx 및 Lx라고 명명하며, 여기서 x는 앞서 말한 카바트의 도표에 따른 아미노산의 위치를 나타내는 번호이다. 카바트는 각 서브그룹에 대하여 항체에 대한 수많은 아미노산 서열을 나열하고 그러한 서브그룹에서 각 잔기 위치에 대해 가장 일반적으로 발생하는 아미노산을 나열하여 컨센서스 서열을 생성한다. 카바트는 나열된 서열에서 잔기 번호를 각 아미노산에 할당하는 방법을 이용하며 잔기 번호를 할당하기 위한 이러한 방법은 당 분야에서 기준이 되었다. 카바트의 도표는 보존된 아미노산을 참조하여 당해 항체를 카바트의 컨센서스 서열 중 하나와 정렬시킴에 의해 그의 일람표에 포함되지 않은 다른 항체까지 확대될 수 있다. 카바트 넘버링 시스템을 이용하여 상이한 항체의 동등한 위치에 있는 아미노산을 용이하게 확인한다. 예를 들어, 사람 항체의 L50 위치에 있는 아미노산은 마우스 항체의 아미노산 위치 L50과 동등한 위치를 점유한다. 더욱이, 임의의 두 항체 서열은 독특하게 정렬될 수 있어서, 예를 들어 카바트 넘버링 시스템을 이용함에 의해 동일성 퍼센트를 결정할 수 있고, 이에 따라 한 항체 서열의 각 아미노산은 동일한 카바트 번호를 지니는 다른 서열에 있는 아미노산과 정렬된다. 정렬 후, 당해 항체 영역(예컨대, 중쇄 또는 경쇄의 성숙한 전체 가변 영역)을 참조 항체의 동일한 영역과 비교하는 경우, 당해 항체 영역과 참조 항체 영역간의 서열 동일성 비율은 당해 항체 영역 및 참조 항체 영역 둘 모두에서 동일한 아미노산에 의해 점유된 위치의 갯수를 두 영역의 정렬된 위치들의 총 수로 나눈 다음 (갭은 세지 않는다) 100을 곱하여 백분율로 전환시킨 것이다.

모노클로날 항체(mAb)는 항체의 단일 분자 종이므로 동물(예컨대, 설치류, 토끼, 염소)에게 항원을 주사하고 동물로부터 혈청을 추출하여 생성된 폴리클로날 항체를 포함하지 않는다. 사람화된 항체는 유전적으로 공학처리된(모노클로날) 항체이고, 여기서 마우스 항체("공여체 항체", 래트, 햄스터 또는 다른 유사한 종일 수도 있다)로부터의 CDR이 사람 항체("억셉터 항체")로 그래프팅된다. 사람화된 항체는 마우스 항체로부터의 완전한 CDR 보다 작게 제조될 수도 있다 (예컨대, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002). 가장 일반적으로, 공여체 항체로부터의, 문헌[Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987]에 의해 정의된 첫 번째 중쇄 과가변 루프 H1도 사람화된 항체로 운반된다. 따라서, 사람화된 항체는 공여체 항체로부터의 CDR 및 사람 항체로부터의 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역을 지니는 항체이다. 경쇄 및 중쇄 억셉터 프레임워크는 동일하거나 상이한 사람 항체로부터 올 수 있고 각각 둘 이상의 사람 항체 프레임워크의 복합물일 수 있거나 대안적으로 사람 프레임워크 세트의 컨센서스 서열(예컨대, 상술한 카바트 등에 정의된 사람 항체의 서브그룹), 즉 세트의 각 위치에서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산을 지니는 서열일 수 있다. 또한, 고 결합 친화력을 보유하기 위해, 두 추가의 구조적 엘리먼트 중 하나 이상을 적용시킬 수 있다. 참조 문헌[Queen et al., US Patent Nos. 5,530,101 and 5,585,089, 각각은 본원에 참조로서 포함된다]은 사람화된 항체의 작제를 위한 상세한 지침을 제공한다.

첫 번째 구조적 엘리먼트에서, 사람화된 항체의 중쇄 가변 영역의 프레임워크는, 수많은 공지된 사람 항체 중에서 억셉터 항체를 적합하게 선택함에 의해, 공여체 항체의 중쇄 가변 영역의 프레임워크와 높은 서열 동일성 (65% 이상)을 지니도록 선택된다. 두 번째 구조적 엘리먼트에서, 사람화된 항체를 작제함에 있어서, 사람 억셉터 항체의 프레임워크 중의 선택된 아미노산을 (CDR 제외) 상세된 규정에 따라 공여체 항체로부터의 상응하는 아미노산으로 교체한다. 특히, 프레임워크에서 교체되어지는 아미노산은 일반적으로 CDR과 상호작용하는 이들의 능력에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 교체된 아미노산은 공여체 항체 서열 또는 3차원 공간에서 측정된 사람화된 항체의 CDR의 4-6 옹스트롬내에서 CDR에 인접할 수 있다.

반면, 사람화된 mAb가 비-사람 공여체 mAb에서 비롯되어야 하므로, 사람화된 mAb는, 사람으로부터의 가변 영역을 엔코딩하는 핵산을 단리시키고 파지 디스플레이 방법(참조, 예컨대 Dower et al., WO91/17271; McCafferty et al., WO92/001047; Winter, WO92/20791; and Winter, FEBS Lett. 23:92, 1998) 또는 유전자이식 마우스(참조, 예컨대 Lonberg et al., WO93/12227; Kucherlapati WO91/10741, and Burgess et al. WO 2005/027107A2)를 이용하여 이들을 선택함에 의해 제조된 사람 mAb를 본질적으로 포함하지 않는다.

mAb의 에피토프는 mAb가 결합되는 이의 항원 영역이다. 두 항체가 각각 경쟁적으로 항원에 대한 다른 하나의 결합을 억제(차단)하는 경우 두 항체는 동일하거나 중복된 에피토프에 결합된다. 즉, 1x, 5x, 10x, 20x 또는 100x를 초과하는 한 항체가 다른 항체의 결합을 경쟁적인 결합 검정으로 측정시 적어도 50%까지, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 억제한다 (참조, 예컨대 Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). 대안적으로, 두 항체는, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원에서의 모든 아미노산 돌연변이들이 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 동일한 에피토프를 지닌다. 두 항체는, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이들이 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 중복 에피토프를 지닌다.

2. 사람화된 중화 항-HGF 항체

HGF에 결합되는 모노클로날 항체(mAb)(즉, 항-HGF mAb)는, 결합이 HGF의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 억제할 때 (즉, mAb가 단일 작용제로서 이용될 때), HGF를 중화시킨다고 말하거나 중화성이라고 언급된다. 중화 항체가 억제할 수 있는 HGF의 생물학적 특성 중에는 HGF의 이의 cMet 수용체에 결합되는 능력, 마딘-다비 개속 신장(MDCK) 세포와 같은 특정 세포주의 산란을 야기하는 능력, 간세포, Mv 1 Lu 밍크 폐 상피 세포 및 다양한 사람 종양 세포를 포함하는 특정 세포의 증식을 자극하는(즉, 이들에 대해 분열촉진되는) 능력, 또는 혈관형성을 자극하는 능력이 있고, 예를 들어 닭 배아 융모막요막(CAM)에 적용될 때 사람 탯줄 혈관 내피 세포(HUVEC)의 증식의 자극 또는 관 형성에 의해서나 혈관의 유도에 의해 측정된다. 본 발명의 항체는 바람직하게 사람 HGF, 즉 수탁 번호 D90334의 GenBank 서열에 의해 엔코딩된 단백질에 결합된다.

본 발명의 사람화된 중화 mAb는, 예컨대 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 또는 50 ㎍/ml의 농도에서 HGF의 생물학적 기능(예컨대, 증식 또는 산란의 자극)을 하기 실시예에 기술되거나 당 분야에 공지된 방법에 의해 검정시, 적어도 약 50%까지, 바람직하게는 75%까지, 보다 바람직하게는 90% 또는 95% 또는 심지어 99%까지, 가장 바람직하게는 약 100%로 (본질적으로 완전히) 억제할 것이다. 통상적으로, 억제 정도는 사용된 HGF의 양이 생물학적 활성을 완전히 자극하기에만 충분하거나, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 3 또는 10 ㎍/ml일 때 측정된다. 바람직하게는, HGF에 대한 항체의 몰 비가 0.1x, 0.5x, 1x, 2x, 3x, 5x 또는 10x일 때, 적어도 25%, 50%, 75%, 90% 또는 95% 또는 본질적으로 완전한 억제가 달성될 것이다. 가장 바람직하게는, mAb가 상기 나열된 단 하나의 생물학적 활성만을 중화시키지 않고 수 개의 생물학적 활성을 중화시킬 것이고; 본원의 목적을 위해, HGF의 모든 생물학적 활성을 중화시키는 항-HGF mAb를 "완전히 중화성"이라 부를 것이고, 이러한 mAb가 가장 바람직하다. 본 발명의 mAb는 HGF에 특이적으로 결합하는 것이 바람직한데, 이것은 이들이 섬유모세포 성장 인자(FGF) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 같은 HGF와 관련된 단백질에 결합하지 않거나 매우 적은 정도로만 결합하는 것일 것이다. 본 발명의 mAb는 통상적으로 HGF에 대해 적어도 10⁷M^-1의 결합 친화력(K_a)을 지니며, 바람직하게는 10⁸M^-1이거나 이를 초과하고, 가장 바람직하게는 10⁹M^-1이거나 이를 초과하거나, 심지어 10¹⁰M^-1이거나 이를 초과한다.

본 발명의 사람화된 mAb는 항-HGF 항체를 이들의 천연 사량체 형태로 포함하고 (2개 경쇄 및 2개 중쇄) 임의의 공지된 이소형 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 및 이들의 서브타입, 즉 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 중 어느 것일 수 있고 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다. 본 발명의 mAb는 Fv, Fab and F(ab')₂와 같은 항체 단편; 이작용성 하이브리드 항체 (예컨대, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987), 단일-사슬 항체 (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988); 및 변경된 불변 영역을 지니는 항체 (예컨대, U.S.Patent No. 5,624,821)도 포함한다. mAb의 CDR의 공급원은 동물 (예컨대, 마우스, 래트, 햄스터 또는 닭) 오리진일 수 있거나, 이들은 유전적으로 공학처리될 수 있다. 설치류 mAb는, 적합한 애주번트중의 HGF를 이용하여 i.p., i.v. 또는 발바닥으로 다중 면역시키고, 비장 또는 림프절 세포를 추출하여 적합한 무한증식되는 세포주와 융합시킨 다음, HGF에 결합되는 항체를 생성하는 하이브리도마를 선택하는 것을 포함하는, 당 분야에 널리-공지된 표준 방법에 의해 제조된다.

본 발명은 마우스 L2G7 mAb의 사람화된 형태를 제공한다. 마우스 L2G7 mAb의 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열이 도 1A 및 1B에 각각 도시된다. 따라서, L2G7 mAb의 사람화된 형태는 사람 가변 영역 프레임워크 (단일, 복합 또는 컨센서스 서열 사람 프레임워크 포함)에 이들 서열로부터의 대부분 또는 모든 CDR 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 일부 사람화된 항체는 L2G7 중쇄로부터의 3개의 완전한 CDR 및 경쇄로부터의 3개의 완전한 CDR을 포함한다. 다른 사람화된 항체는 L2G7 중쇄로부터의 하나 이상의 완전한 CDR 및 L2G7 경쇄로부터의 하나 이상의 완전한 CDR을 포함한다. 일부 사람화된 항체는, 일부 잔기가 L2G7의 상응하는 CDR로부터 온 것이고 다른 것들은 사람 항체, 바람직하게는 CDR을 함유하는 가변 영역 프레임워크를 공급하는 동일한 사람 항체의 CDR로부터 온 것인 하나 이상의 CDR을 포함한다.

본 발명의 일부 사람화된 항체에서, H29, H30, H48, H66, H67, H71, H94, L3, 및 L60으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나, 3개, 5개 또는 모든 위치가 마우스 L2G7 항체에서 카바트 넘버링에 의한 상응하는 위치에 존재하는 아미노산에 의해 점유된다. 실시예에 사용된 사람 억셉터 가변 영역 프레임워크에서, 이들 위치 모두는 마우스 L2G7 항체에서의 상응하는 위치에 존재하는 아미노산과 상이한 사람 잔기에 의해 점유된다. 따라서, 상기 군으로부터 선택된 모든 또는 대부분의 위치가 치환되는 것이 바람직하다. 다른 사람 가변 영역 프레임워크를 이용하는 경우, 위치들 중 일부가 사람 가변 영역 프레임워크 및 마우스 L2G7 항체에서 동일한 아미노산에 의해 점유될 수 있다. 따라서, 치환은 이러한 위치에서 수행되는 것이 아니라 문헌[Queen, US 5,530,101 and US 5,585,089]의 규정에 따라 사람 가변 영역 프레임워크와 마우스 L2G7 항체간에 상이한 다른 위치에서 수행될 수 있다. 사람 가변 영역 프레임워크의 선택과 무관하게, 상기 군에 명시된 것들 외에 다른 아미노산의 치환도 하기 논의되는 대로 가능하다. 그러나, 일반적으로 사람화된 항체의 중쇄 가변 영역 프레임워크 뿐만 아니라 경쇄 가변 영역 프레임워크도 억셉터 사람 가변 영역 프레임워크에 존재하지 않는 잔기를 초래하는 10개 또는 12개를 초과하는 치환을 포함하지 않는다 (상기 논의된 사람 컨센서스 가변 영역 프레임워크 및 복합 사람 가변 영역 프레임워크 포함).

본 발명의 사람화된 항체에 존재하는 임의의 불변 영역은 천연의 사람 불변 영역에 비해 10개 이하의 치환, 바람직하게는 2개 또는 더 적은 치환을 지니면서 사람이거나 본질적으로 사람이다. 일부 치환은 하기 논의되는 대로, 항체의 반감기 및/또는 FcγRn에 대한 이의 친화력을 증가시키는데에 있어서 유리하다. 하기 논의되는 다른 치환, 일반적으로 보존적 치환은 효과에 무관하다.

예시된 사람화된 형태의 L2G7은 도 2A 및 2B에 각각 도시된 서열을 지니는 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 바람직한 형태의 사람화된 L2G7은 (상술한 카바트 넘버링에 따라 정렬시) 상기 서열과 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 지니는 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고/거나, 이들은 소수의 (통상적으로 5개 또는 10개를 넘지 않는 아미노산 포함) 기능적으로 중요하지 않은 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상기 서열과 다르다. 예를 들어, 중쇄의 첫 번째 아미노산은 Glu 또는 Gln일 수 있다. 치환은 일반적으로 아미노산을 화학적으로 유사한 것으로 교체하는 보존적인 것이다. 아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적인 것으로서 분류할 목적으로, 아미노산은 다음과 같이 분류될 수 있다: 그룹 I (소수성 측쇄): Met, Ala, Val, Leu, lie; 그룹 Il (중성 친수성 측쇄): Cys, Ser, Thr; 그룹 III (산성 측쇄): Asp, Glu; 그룹 IV (염기성 측쇄): Asn, Gln, His, Lys, Arg; 그룹 V (사슬 배향에 영향을 미치는 잔기): Gly, Pro; 및 그룹 Vl (방향족 측쇄): Trp, Tyr, Phe. 보존적 치환이란 동일한 그룹에서 아미노산간의 치환을 포함하는 것이다. 도 2A 및 2B에서 V 영역에 대한 치환은 위치 H29, H30, H48, H66, H67, H71, H94, L3, 및 L60에서 회피되는 것이 바람직하며, 실시예에서 논의되는 대로, 이 때 이러한 위치들과 CDR의 상호작용으로 인해 마우스 L2G7로부터의 아미노산이 포함되었다. 치환은 가변 영역 프레임워크 위치에서 일어나는 것이 바람직하나 CDR 영역에서도 일어날 수 있다. CDR 영역이 치환되는 경우, 마우스 아미노산을 사람 항체의 상응하는 위치(카바트 넘버링)로부터의 아미노산, 바람직하게는 억셉터 가변 영역 프레임워크를 공급하는 동일한 사람 항체로 교체하는 것이 바람직하다.

일반적으로, 사람화된 L2G7 mAb는 카파 경쇄를 지니는 IgGI, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형이다. 완전한 사람 감마-1 및 카파 불변 영역과 각각 조합된 도 2A 및 2B의 가변 영역을 지니는 IgG1 mAb를 HuL2G7라 명명한다. HuL2G7의 완전한 중쇄 및 경쇄를 도 3A 및 3B에 각각 도시한다. 번호 1로 표시된 위치에서 시작되는 이들 서열의 성숙한 부분만이 실제로 HuL2G7를 구성하는데, 이는 선행하는 시그널 펩티드가 항체 분비 전에 또는 동안에 절단되기 때문이다.

HuL2G7과 유사한 결합 특성을 보유하는 HuL2G7의 변이체가 돌연변이유발에 이어 상기 논의된 파지 디스플레이 방법을 이용한 질량 선택에 의해 수득될 수 있다. 변이체는 임의로 HuL2G7 또는 마우스 L2G7과의 경쟁에서 HGF에 대한 특이적 결합에 대해 초기에 선택된다. 이후에 예시된 항체와 동일하거나 유사한 결합 특성을 지니는 변이체를 기능적으로 시험할 수 있다.

바람직한 사람화된 L2G7 mAb는 상기 정의된 대로 HGF에 대해 중화성이거나 완전히 중화성이다. 바람직하게는, 측정된 HGF의 일부, 대부분 또는 모든 생물학적 성질에 대해 (예컨대, Met에 대한 결합, Mv 1 Lu 또는 HUVEC 세포의 증식 자극), 사람화된 mAb의 중화 활성은 L2G7 자체의 중화 활성으로부터 3배 이내, 보다 바람직하게는 2배 또는 1.5배 이내이고, 가장 바람직하게는 이와 구별할 수 없을 정도 (즉, 실험적 오차내)이다. 즉, 동일한 정도의 생물학적 성질의 억제를 달성 (예를 들어, IC50에 의해 측정됨)하기 위해 L2G7에 비해 3배 이하, 2배 이하, 1.5배 이하 또는 동일한 양의 사람화된 mAb가 요구된다. 바람직하게는 사람화된 mAb의 HGF에 대한 친화력이 또한 L2G7의 3배, 2배 이내이거나 본질적으로 이와 구별할 수 없을 정도이다. 유사하게, 이종이식편 마우스 모델에서 (예컨대, U87과 같은 사람 신경아교종 세포주 이용), 사람화된 mAb는 종양 성장을 마우스 L2G7 mAb의 3배, 2배 이내로 억제하거나 이와 구별할 수 없을 정도로 억제하는 것이 바람직하다. 실제로, 1주일에 2회 투여된 단지 40, 20 또는 심지어 10㎍ 용량의 사람화된 mAb가 바람직하게 U87 종양 이종이식편의 성장을 완전히 억제한다.

사람화된 mAb는 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 발현될 수 있다. 예를 들어 이들의 경쇄 및 중쇄 V 영역을 엔코딩하는 유전자를 먼저 중복 올리고누클레오티드로부터 또는 더 먼저 제조된 요망되는 유전자의 변이체의 PCR 돌연변이유발에 의해 합성할 수 있다. 유전자 코드의 퇴화로 인해, 다양한 DNA 서열이 각 항체 아미노산 서열을 엔코딩한다. 본 출원에 개시된 항체를 엔코딩하는 모든 DNA 서열이 본 발명에 분명히 포함된다. 그러나, 사람화된 mAb 경쇄 및 중쇄 유전자를 엔코딩하는 유전자를 제조하여 C 영역과 함께 프로모터, 인핸서, 폴리 A 부위 등과 같은 필수적인 조절 영역을 제공하는 발현 벡터(예컨대, Invitrogen으로부터 시판됨)로 삽입한다. CMV 프로모터-인핸서를 이용하는 것이 바람직하다. C 영역에 대한 유전자는 현재 널리 이용가능하거나 사람 항체를 생성하는 세포로부터 PCR에 의해 용이하게 클로닝될 수 있다. 경쇄 및 중쇄 유전자는 단일 벡터로 함께 삽입되거나 분리된 벡터로 삽입될 수 있다. 이후 발현 벡터를 리포펙틴 또는 일렉트로포레이션과 같은 당 분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 다양한 포유동물 세포주, 예컨대 CHO 또는 293 또는 Sp2/0 및 NS0을 포함하는 비-생성 골수종, 및 적합한 항생제 선택에 의해 선택된 항체를 발현시키는 세포로 트랜스펙션시킬 수 있다. 참조[예컨대, US Patent No. 5,530,101]. 시판되는 바이오반응기에서 세포를 성장시켜 더 많은 양의 항체를 생성시킬 수 있다.

일단 발현되면, 본 발명의 사람화된 mAb는 미세여과, 초여과, 단백질 A 또는 G 친화력 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 유기 염료에 기초한 다른 형태의 친화력 크로마토그래피 등과 같은 당 분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 실제로 동질성이 약 90% 또는 95% 이상인 순수한 항체가 바람직하고, 약제학적 용도를 위해 동질성이 98% 또는 99% 이상인 것이 바람직하다.

3. 치료 방법

바람직한 구체예에서, 본 발명은 본원에 개시된 사람화된 항체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 항체의 약제학적 제형은 냉동건조되거나 수용액의 형태로, 임의로 부형제 또는 안정화제와 함께 생리적으로 허용되는 담체 중에 mAb를 함유한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 적용되는 용량 및 농도에서 수용체에게 비독성이며, 통상적으로 5.0 내지 8.0, 가장 빈번하게 6.0 내지 7.0의 pH에서 포스페이트, 시트레이트 또는 아세테이트와 같은 완충액; 등장성이 되게 하는 염화나트륨, 염화칼륨 등과 같은 염; 항산화제, 보존제, 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 친수성 중합체, 예컨대 폴리소르베이트 80, 아미노산, 탄수화물, 킬레이팅제, 당, 및 당업자에게 공지된 다른 표준 성분들을 포함한다 (참조, Remington's Pharmaceutical Science 16^th edition, Osol, A. Ed. 1980). mAb는 통상적으로 1-100 mg/ml, 예컨대 10 mg/ml의 농도로 존재한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 약제학적 제형으로 사람화된 항-HGF mAb, 예컨대 사람화된 L2G7, 예컨대 HuL2G7을 이용하여 질병에 걸린 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 약제학적 제형으로 제조된 mAb는 환자에게 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있고, 특히 정맥내 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구적으로, 근내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 정맥내 주입은 15분 만큼 짧게 제공될 수 있으나, 보다 종종 30분 동안, 또는 1시간, 2시간 또는 심지어 3시간에 걸쳐 제공될 수 있다. mAb는 질병 (예컨대, 종양) 부위로 직접 주사될 수도 있거나, 리포솜과 같은 운반제로 캡슐화될 수 있다. 제공된 용량은 치료하려는 질환을 경감시키기에 충분하고 ("치료적 유효량") 체중 1kg에 대하여 0.1 내지 5 mg일 수 있고, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4 mg/kg이나, 10 mg/kg 또는 심지어 15 또는 20 mg/kg까지 높을 수 있다. 예를 들어, 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg의 고정된 단위 용량도 제공할 수 있거나, 용량은 100 mg/m²과 같이 환자의 표면적에 기초할 수 있다. 일반적으로, 1 내지 8회 용량 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)이 암을 치료하기 위해 투여되나, 10회, 20회 또는 이를 초과하는 용량이 제공될 수 있다. mAb는, 예컨대 mAb의 반감기에 따라서 매일, 주2회(biweekly), 매주, 격주, 매월 또는 몇몇 다른 간격으로 1주, 2주, 4주, 8주, 3-6개월 또는 이보다 길게 투여될 수 있다. 반복된 치료 방침도 가능하며, 이것은 만성 투여이다.

본 발명의 사람화된 항-HGF mAb, 예컨대 HuL2G7를 이용한 치료로 특히 영향받기 쉬운 질병으로는 혈관형성을 요구하거나 상승된 수준의 HGF와 관련된 것으로 여겨지는 고형암, 예를 들어 난소암, 유방암, 폐암 (소세포 또는 비소세포), 결장암, 전립선암, 췌장암, 위암, 간암, 두경부 종양, 소아 또는 성인의 흑색종 및 육종, 및 뇌종양이 있다. 실제로, 본 발명의 방법, 특히 사람화된 L2G7 mAb를 이용한 전신적 치료는 하기를 포함하는 뇌종양의 치료에 특히 적용될 수 있다: 수막종; 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종, 및 모든 유형의 별아교세포종(저급(low grade), 역형성, 및 다형성 아교모세포종 또는 단순 아교모세포종)을 포함하는 신경아교종; 속질모세포종, 신경절신경종, 신경집종, 척삭종; 및 원시 신경외배엽종양을 포함하는 주로 소아의 뇌종양. 일차 뇌종양(즉, 뇌에서 발생함) 및 이차 또는 전이 뇌종양 둘 모두가 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 본 발명의 방법에 의한 치료에 적합한 다른 질병으로는 요망되지 않는 혈관형성과 관련된 것들, 예컨대 당뇨성 망막병증, 연령-관련 황반 변성, 류마티스 관절염 및 건선이 있다.

특히 바람직한 구체예에서, 사람화된 항-HGF mAb, 예컨대 HuL2G7을 다른 항암 치료제와 함께 (즉, 이전, 동안, 이후) 투여한다. 예를 들어, mAb는 종양학 분야의 당업자에게 공지된 임의의 하나 이상의 화학치료 약물, 예를 들어 카르무스틴, 클로르암부실, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥시플라틴, 프로카르바진 및 시클로포스파미드와 같은 알킬화제; 플루오로우라실, 플록수리딘, 플루다라빈, 겜시타빈, 메토트렉세이트 및 히드록시우레아와 같은 항대사제; 식물 알칼로이드를 포함하는 천연 생성물 및 블레오마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 에토포시드, 미토마이신, 미토크산트론, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 탁솔(파클리탁셀)과 같은 항생제 또는 관련 화합물, 예컨대 탁소테레^®; 테모졸로미드 및 카르무스틴을 함유하는 글리아델(Gliadel^®) 웨이퍼를 포함하는 뇌종양에 대해 특히 허가된 작용제; 및 이리노테칸 및 글리벡(Gleevec^®) 및 허가된 모두를 포함하는 다른 약물 및 WO 2005/017107 A2(본원에 참조로서 포함됨)에 나열된 실험중인 항암제와 함께 투여될 수 있다. 사람화된 항-HGF mAb와 투여될 수 있는 다른 작용제로는 HER2 항원에 대한 헤르셉틴(Herceptin™), VEGF에 대한 아바스틴(Avastin™) 또는 EGF 수용체에 대한 항체를 포함하는 모노클로날 항체와 같은 생물학적 약제 뿐만 아니라 항-혈관형성원성인 소분자 또는 EGF 수용체 길항제 약물이 있다. 추가로, 사람화된 항-HGF mAb는 방사선 요법 또는 수술과 함께 이용될 수 있다.

사람화된 항-HGF mAb 항체, 예컨대 HuL2G7을 포함하는 치료(예컨대, 표준 화학치료)는, 이러한 종양(예컨대, 특히 재발되거나 난치인 난소, 유방, 폐, 췌장, 뇌 및 결장)을 지니는 환자의 질병의 진행이 없는 생존기간의 정중값 또는 전체적인 생존 기간을 항-HGF mAb를 이용하지 않은 동일한 치료(예컨대, 화학치료)에 비해 적어도 30% 또는 40%까지, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 또는 이를 초과하도록 증가시킬 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항-HGF mAb를 포함하는 치료(예컨대, 표준 화학치료)는, 이러한 종양(예컨대, 특히 재발되거나 난치인 난소, 유방, 폐, 췌장, 뇌 및 결장)을 지니는 환자의 완전한 반응 속도, 부분적인 반응 속도, 또는 객관적인 반응 속도(완전+부분)를 항-HGF mAb를 이용하지 않은 동일한 치료(예컨대, 화학치료)에 비해 적어도 30% 또는 40%까지, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100%까지 증가시킬 수 있다. 아교모세포종과 같은 뇌종양의 경우, 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여 사람화된 항-HGF mAb를 이용하는 치료는 바람직하게 적어도 5% 또는 10%, 보다 바람직하게는 20% 또는 25% 또는 30%, 가장 바람직하게는 40%, 50% 또는 이를 초과하는 부분적인, 완전한 또는 객관적인 반응 속도를 제공한다.

통상적으로, 임상적 연구에서 (예컨대, II상, II/III상 또는 III상 시험), 표준 치료만(또는 플라세보에 더하여) 받은 환자의 대조군과 비교하여 표준 치료에 더하여 사람화된 항-HGF mAb, 예컨대 HuL2G7로 치료된 환자의 상기 언급된 질병의 진행이 없는 생존기간의 정중값 및/또는 반응 속도에서의 증가는, 예를 들어 p = 0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준에서 통계적으로 유의하다. 완전 및 부분적 반응 속도는, 예컨대 내셔널 캔서 인스티튜트 및/또는 식약청에 의해 열거되거나 허용된 대로, 암에 대한 임상적 연구에 일반적으로 사용되는 객관적인 기준에 의해 결정된다.

4. 기타 방법

본 발명의 사람화된 항-HGF mAb의 진단, 예후 및 실험실 방법에서의 용도가 발견된다. 이들은 종양 또는 종양을 지닌 환자의 순환에서 HGF의 수준을 측정하는데 이용될 수 있어서 종양에 따라서 치료를 가이드한다. 예를 들어, 높은 수준의 HGF와 관련된 종양은 사람화된 항-HGF mAb를 이용한 치료에 특히 영향을 받을 것이다. 특정 구체예에서, mAb는, 예컨대 종양 생검 표본 또는 혈청 또는 세포 배양액 중 HGF-분비 세포의 배지 상청액에서 HGF의 수준을 측정하기 위해 ELISA 또는 방사성면역검정에 이용될 수 있다. 다양한 검정을 위하여, 항-HGF mAb는 형광성 분자, 스핀-표지된 분자, 효소 또는 방사성동위원소로 표지될 수 있고, HGF에 대한 검정을 수행하기 위한 모든 시약을 지니는 키트의 형태로 제공될 수 있다. 다른 용도에서, 항-HGF mAb는, 예컨대 친화력 크로마토그래피에 의해 HGF를 정제하는데 이용된다.

1. 사람화된 L2G7 항체의 작제

HGF의 모든 시험된 생물학적 활성을 중화시키는 마우스 항-HGF mAb L2G7의 생성이 문헌[Kim et al., US20050019327 filed August 13, 2004, and Kim et al. Clin Cancer Res 12:1292, 2006]에 이미 개시되어 있다. L2G7을 사람화하는 첫 번째 단계는 이의 경쇄 및 중쇄 유전자를 클로닝하는 것인데, 이것은 본질적으로 문헌[Co et al., J. Immunol. 148:1149, 1992]의 방법에 따라 수행된다. 간단히 말해, 10⁶개 L2G7 (IgG2a, κ) 하이브리도마 세포로부터 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여 RNA를 제조하고 Stratagene으로부터의 키트를 이용하여 랜덤 프라이머로 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하고 말단 데옥시누클레오티딜 트랜스퍼라아제(Promega)로 dG 테일을 첨가하였다. V 영역의 중쇄 및 경쇄를, 고충실도 중합효소 AccuPrime Pfx (Invitrogen)을 이용하여, 중쇄에 대해 dG 테일에 대한 프라이머 어닐링 및 C_γ2a의 N-말단 영역에 대한 프라이머 어닐링, 및 경쇄에 대해 C_κ의 N-말단 영역에 대한 프라이머 어닐링으로 cDNA로부터 각각 증폭시켰다. 적합한 크기의 밴드를 PCR 반응으로부터 겔 정제하고, 자동화 서열화기를 이용한 디데옥시 말단화 방법을 이용하여, 직접 서열화하거나 클로닝시킨 다음 서열화하였다. 중쇄에 대해 단일 cDNA 서열이 발견되었으며, 이것을 번역 후 도 1A에 도시한다. 두 상이한, 명백하게 이상이 없는 경쇄 cDNA 서열을 발견하였으나, 단리된 L2G7 경쇄의 N-말단의 아미노산 서열화는 이들 사슬 중 하나만을 나타내었고, 이의 번역된 아미노산 서열을 도 1B에 도시한다.

L2G7 및 이후의 사람화된 mAb의 키메라 형태를 발현시키기 위해, 사람 C_κ 및 C_γ1 유전자를 함유하는, 문헌[Co et al., J. Immunol. 148:1149, 1992]에 개시된 pVk 및 pVg1 벡터와 유사한 발현 벡터를 시판되는 벡터 및 DNA 단편으로부터 작제하였다. 그러나, 경쇄 벡터는 gpt 대신 hyg 선택가능한 마커를 지니고, 중쇄 벡터는 Dhfr 대신 neo 선택가능한 마커를 지닌다. 클로닝된 V_L 및 V_H 유전자를 이들 벡터의 적합한 부위로 서브클로닝시켜 키메라 L2G7 (chL2G7) mAb 경쇄 및 중쇄 유전자에 대한 발현 벡터를 생성하였다. chL2G7 mAb가 생성되었고 이것은 L2G7과 마찬가지로 HGF에 결합되는 것으로 나타났으며, 이는 정확한 경쇄 및 중쇄 V 영역이 클로닝되었음을 입증한다.

사람화된 L2G7 mAb를 설계하기 위해, 일반적으로 문헌[Queen et al., US Patent Nos. 5,530,101 and 5,585,089]의 방법에 따른다. 사람 항체 서열의 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(NCBI) 데이터베이스를 조사하였고, L2G7 V_H 및 V_L 서열에 대한 억셉터 서열로서 기능하도록 사람 V_H 서열 AAC18323 및 V_κ 서열 BAC01726을 각각 선택하였는데, 이는 이들이 상기 서열과 특히 높은 프레임워크 상동성(즉, 서열 동일성)을 지니기 때문이다. 월드 와이드 웹상에서 이용가능한 (http://www.expasy.org/spdbv/) 컴퓨터 프로그램인 딥 뷰 스위스-피디비 뷰어(Deep View Swiss-Pdb Viewer)를 이용하여 L2G7 가변 도메인의 분자 모델을 작제하였고, 이것을 L2G7 프레임워크에서 아미노산의 위치를 정하는데 이용하였으며, 상기 아미노산은 CDR에 충분히 가까워서 이들과 상호작용이 가능하다. 사람화된 L2G7 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 설계하기 위해, 마우스 L2G7 mAb로부터의 CDR을 먼저 개념상 억셉터 프레임워크 영역으로 그래프팅하였다. 컴퓨터 모델이, CDR 구조를 유지하는데 요구될 수 있는, CDR과의 현저한 접촉을 제안하는 프레임워크 위치에서, 마우스 항체로부터의 아미노산을 원래 사람 프레임워크 아미노산으로 치환시켰다. 사람화된 L2G7 mAb 설계된 HuL2G7에 대하여, 이것은 중쇄의 잔기 29, 30 (코티아 과가변 루프 H1 내에서), 48, 66, 67, 71 및 94와, 경쇄의 잔기 3 및 60에서 카바트 넘버링을 이용하여 수행되었다. 추가로, 중쇄의 아미노산 1을 E(Glu)로 교체하였는데, 이는 이 아미노산이 항체 단백질에서의 유도체화를 Q(Gln) 보다 덜 경험할 것 같기 때문이다. HuL2G7의 중쇄 및 경쇄 V 영역 서열은 도 2A 및 2B에서 각기 L2G7 및 억셉터 V 영역에 대해 정렬된 채로 도시되며, CDR 및 치환된 아미노산은 강조된다.

본 발명은 또한 변이체 사람화된 L2G7 mAb를 제공하며, 이의 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 영역은, 일반적으로 프레임워크에서, 그러나 가능하게는 CDR에서의 소수(예컨대, 통상적으로 1개, 2개, 3개, 5개 또는 10개 이하)의 교체, 결실 또는 삽입만큼 HuL2G7의 서열과 상이하다. 특히, 상기 개시된 치환의 서브세트만이 억셉터 프레임워크에서 수행될 수 있거나, 추가의 치환(들)이 수행될 수 있으며, 예컨대 마우스 L2G7 V_H 아미노산 69F가 억셉터 아미노산 69M을 대신할 수 있다. 반면, V_H 아미노산 1E가 Q를 대신할 수 있다. 실제로, HuL2G7에서 CDR과 접촉하지 않은 다수의 프레임워크 잔기가 L2G7 또는 다른 마우스 또는 사람 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산의 치환을 수용할 수 있고, 심지어 다수의 잠재적인 CDR-접촉 잔기도 치환 또는 CDR내 대등한(even) 아미노산으로 개정될 수 있다.

변이체 사람화된 L2G7 서열에서 이루어진 치환들은, 대단히 빈번하게, 교체되는 HuL2G7 아미노산에 대해 보존적이다. 바람직하게는 HuL2G7 (보존적이든 아니든)에서의 교체가 결합 친화력 또는 사람화된 mAb의 효능, 즉 HGF의 생물학적 활성을 중화시키는 이의 능력(예컨대, 본원에 개시된 일부 또는 모든 검정에서 변이체 사람화된 L2G7 mAb의 효능은 본질적으로, 즉 실험적 오차 내에서 HuL2G7의 효능과 동일하다)에 실질적인 효과를 미치지 않는다. 바람직하게는, 성숙한 변이체 경쇄 및 중쇄 V 영역 서열은 개별적인 HuL2G7 성숙한 경쇄 및 중쇄 V 영역과 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상 동일하다. 대안적으로, L2G7과 높은 서열 동일성을 지니는 다른 사람 항체 가변 영역도 사람화된 항체 프레임워크, 특히 사람 서브그룹 I로부터의 카파 V 영역 및 사람 서브그룹 I로부터의 중쇄 V 영역, 또는 이들 서브그룹의 컨센서스 서열을 제공하는데 적합하다.

하기 실시예에서 논의된 예시적인 mAb HuL2G7는 사람 κ 및 γ1 불변 영역을 지니므로 IgG1이다: 시그널 펩티드를 포함하는 HuL2G7 중쇄 및 경쇄 유전자의 완전한 서열이 도 3A 및 도 3B에 도시된다 (물론, 시그널 펩티드는 절단되며 HuL2G7의 일부가 아니다). 그러나, 다른 (IgG1, κ) 동종이형의 IgG1 mAb가 HuL2G7의 정의에 포함되는 것으로 이해된다. 다른 이소형(예컨대, IgG2, IgG3 및 IgG4)의 사람화된 mAb가, HuL2G7 가변 영역을 적합한 사람 불변 영역과 조합시킴에 의해 제조될 수 있다. HuL2G7 불변 영역에서 교체를 수행하여 보체-매개된 세포독성 또는 ADCC (참조, 예컨대 Winter et al., US Patent No. 5,624,821; Tso et al., US Patent No. 5,834,597; and Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006)와 같은 이펙터 기능을 감소 또는 증가시키거나, 사람에서의 반감기를 연장시킬 수 있다 (참조, 예컨대 Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). 제한적이진 않으나 구체적으로, IgG 불변 영역에서 위치 250에서 Gln으로의 돌연변이 및/또는 위치 428에서 Leu로의 돌연변이를 지니는 HuL2G7가 본 발명의 구체예이다.

HuL2G7 mAb가 설계되면, 즉 이의 경쇄 및 중쇄 V 영역의 아미노산 서열이 선택되면 (도 2 및 도 3), V 영역을 엔코딩하는 DNA 서열(시그널 펩티드 포함)을 유전자 코드를 통해 통례적으로 선택하였다; 개시 ATG 코돈 앞에 CTCGAGACCACC로 시작되는 서열은 클로닝 및 코작(Kozak) 번역 개시 시그널에 대한 제한 부위를 제공한다. 이러한 유전자는 Genscript Corp. (Piscataway, NJ)에 의해 상업적으로 합성된다. 대안적으로, 문헌[Co et al., J. Immunol. 148:1149, 1992]의 방법을 이용하여 각 V 영역 유전자를 합성할 수 있다. 간단히 말해, 교대되는 가닥상에 두 쌍의 중복 올리고누클레오티드를 합성하며 (Applied Biosystems DNA synthesizer), 이들은 함께 전체 유전자를 포함한다. 올리고누클레오티드는 15개-염기 중복(overlap)을 지니며 길이가 110 내지 140개 염기이다. 이중-가닥 DNA 단편을 올리고의 5' 페어 및 별도로 3' 페어로부터 클레노우(Klenow) 중합효소를 이용하여 합성한다. 5' DNA 단편을 V 영역 유전자의 중심과 5' 말단에서 절단하는 제한 효소로 절단한다. 3' DNA 단편을 V 영역 유전자의 3' 말단과 중심에서 절단하는 제한 효소로 절단한다. 각 절단된 단편을 적합한 클로닝 벡터로 삽입하고 대장균(E.coli)으로 형질변환시키고, 다수의 단리물로부터의 DNA를 서열화하여 완전히 정확한 서열을 지니는 단편을 찾았다. 각 유전자에 대하여, 3-원 라이게이션을 수행하여 정확한 5' 및 3' 단편을 적합한 발현 벡터로 삽입시켜 완전한 유전자를 형성하고, 이의 서열을 증명하였다.

HuL2G7 mAb를 생성하기 위해, 사람 신장 상피 293-F 세포 (Invitrogen)를 프리스타일(Freestyle) 293 발현 배지 (FS 배지; Invitrogen)에서 배양하고 FS 배지에 10⁶개 세포/2 ml/매크로웰에 재현탁시켰다. HuL2G7 경쇄 및 중쇄 발현 벡터 DNA (각 1㎍)를 3㎕의 퓨겐(Fugene) 6 (Roche)과 함께 100㎕의 FS 배지에서 30분 동안 RT에서 인큐베이션하였다; 이후 혼합물을 세포에 첨가하였다. 48시간 인큐베이션 후에, 트랜스펙션된 세포를 1mg/ml G418의 존재하에 배양시켜 neo를 발현시키는 세포에 대해 선택한 다음 96-웰 조직 배양 플레이트 (100㎕/웰)에 스프레딩하였다. 약 2주 후에, 성장할 수 있는 세포를 함유하는 웰이 컨플루언트(confluent)되었을 때, 이들 웰로부터의 배양 상청액을 HuL2G7의 존재 및 양에 대해 ELISA에 의해 시험하였다. 트랜스펙션된 세포는 경쇄 및 중쇄의 불균형을 분비할 수 있어서, 완전한 HuL2G7만이 측정되도록 보장하고, 이 ELISA는 포획제로서 염소 항-사람 Fc를 이용하고 검출 시약으로서 비오티닐화된 항-사람 카파를 이용한다. chL2G7 mAb를 유사하게 발현시켰다. 비교적 높은 수준의 ChL2G7 및 HuL2G7을 발현시키는 세포의 클론를 각각 증식시키고 FS 배지에서 성장시켰다. 항체를 단백질 A 친화력 크로마토그래피를 이용하여 배양 상청액으로부터 정제하고 SDS-PAGE에 의해 순도를 분석하였다.

2. HuL2G7의 특성

HuL2G7의 결합 친화력을 ChL2G7 및 L2G7과 비교하기 위해, 경쟁적 결합 실험을 수행하였다. 마이크로역가 플레이트를 PBS 중 50 ㎕/웰의 2 ㎍/ml의 염소 항-사람 IgG-Fc (GαhlgG-Fc)로 밤새 4℃에서 코팅하고 2% BSA로 1시간 동안 RT에서 차단시켰다. 세척 후, 플레이트를 50 ㎕/웰의 ChL2G7 mAb (2 ㎍/웰)과 1시간 동안 RT에서 인큐베이션시킨 후, 50 ㎕/웰의 사람 IgG (10 ㎍/ml)에 의해 1시간 동안 세척시켜 백그라운드를 감소시켰다. 세척 후, 플레이트의 웰을 1시간 동안 50 ㎕/웰의 HGF-Flag (1 ㎍/ml)와 함께 경쟁자로서 50 ㎕/웰의 다양한 농도의 정제된 HuL2G7, ChL2G7 또는 L2G7과 함께 별도로 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 50 ㎕/웰의 HRP-M2 항-Flag mAb (Invitrogen)와 인큐베이션하고 결합된 HRP-항-Flag M2를 테트라메틸벤지딘 기질의 첨가에 의해 검출하였다. 도 4는 HuL2G7, ChL2G7 및 L2G7이 가용성 HGF-Flag와의 결합에 대해 플레이트에 결합된 L2G7과 본질적으로 매우 동등하게 경쟁하였음을 도시하며, 이것은, 이들 3개의 mAb가 매우 유사한 친화력을 지님을 나타낸다.

HGF의 중요한 생물학적 활성은 이의 수용체 cMet에 결합되는 능력이므로, Met에 대한 HGF의 결합을 억제하는 HuL2G7, ChL2G7 및 L2G7 mAb의 능력을 비교하였다. Met는 Met-Fc의 형태로 이용하고 HGF는 HGF-Flag의 형태로 이용하였으며, 이들은 문헌[Patent application USSN 10/917,915 filed August 13, 2004, and Kim et al. Clin Cancer Res 12:1292, 2006]에 개시된 대로 제조되었다. 미세역가 플레이트를 PBS 중 50㎕/웰의 2 ㎍/ml의 두 항-Met mAb (Galaxy Biotech) 각각으로 밤새 4℃에서 코팅시키고 (대안적으로 2 ㎍/ml의 GαhlgG-Fc가 이용될 수 있다) 2% BSA로 1시간 동안 실온에서 차단시켰다. 플레이트를 세척한 후, 50 ㎕/웰의 Met-Fc (1 ㎍/ml)를 각 웰에 1시간 동안 RT에서 첨가한 다음, 50 ㎕/웰의 사람 IgG (10 ㎍/ml)에 의해 1시간 동안 세척시켜 백그라운드를 감소시켰다. 플레이트를 세척한 후, 다양한 농도의 mAb와 미리 인큐베이션된 50 ㎕/웰의 HGF-Flag (0.5 ㎍ /ml)를 각 웰에 1시간 동안 첨가하였다. 세척 후, 플레이트를 50 ㎕/웰의 HRP-M2 항-Flag mAb (Invitrogen)와 함께 인큐베이션하고, 결합된 HRP-항-Flag M2를 상기 개시된 기질의 첨가에 의해 검출하였다. 도 5는 HuL2G7, ChL2G7 및 L2G7이 Met에 대한 HGF의 결합을 동등하게 잘 차단시켰음을 도시하며, 따라서 이들 mAb는 상기 검정에서 매우 유사한 활성을 지닌다.

HGF의 또 다른 중요한 생물학적 활성은 Mv 1 lu 밍크 폐 상피 세포를 포함하는 특정 세포의 증식을 자극하는 능력이다. HGF의 이러한 활성을 중화시키는 HuL2G7 및 L2G7의 능력을 비교하기 위해, 10% FCS를 함유하는 DMEM에서 성장시킨 Mv 1 Lu 세포 (2 x 10⁴개 세포/100㎕/웰)를 무-혈청 DMEM에 재현탁시키고, 백그라운드를 감소시키기 위한 100㎕/웰의 HGF (40 ng/ml)와 형질변환 성장 인자-β1 (1 ng/ml, R&D Systems) 및 다양한 농도의 HuL2G7, L2G7 또는 관련성이 없는 대조군 사람 항체로 자극하였다. 세포 증식 수준을 WST-1 (Roche Applied Science)를 14시간 동안 첨가시켜 측정하였다. 도 6은 HuL2G7 및 L2G7이 상기 검정에서 동등한 억제 활성을 지녔음을 도시한다. 요약해 보면, HuL2G7은 이용된 모든 검정에서 적어도 L2G7과 동등하게 활성이었으므로, 완전히 중화성이다; L2G7의 활성은 사람화 공정에서 손실되지 않았다.

3. 생체내에서 종양 성장을 억제하는 HuL2G7의 능력

L2G7 mAb가 누드 마우스 모델에서 U87 신경아교종 이종이식편의 성장을 완전히 억제할 수 있다는 것이 이미 밝혀졌다 (Patent application USSN 10/917,915 filed August 13, 2004, and Kim et al. Clin Cancer Res 12:1292, 2006). HuL2G7도 이러한 능력을 지님을 입증하기 위해, 동일한 실험 절차를 이용하였다. 간단히 말해, 암컷 4-6주령 NIH III Xid/베이지/누드 마우스 (Charles River Laboratories)에게 0.1 ml의 PBS 중 10⁷개 세포를 등쪽 영역에 s.c. 주사하였다. 종양 크기가 ~50 mm³에 도달하면, 마우스를 임의로 그룹으로 나누고 (그룹당 n=6) 40㎍의 HuL2G7, L2G7 또는 대조군 PBS를 0.1ml PBS의 부피로 매주 2회 i.p. 주사하였다. 두 치수(길이, a 및 깊이, b)를 측정하여 V=ab²/2로서 부피를 계산함에 의해 매주 종양 부피를 측정하였다. 도 7은, HuL2G7 및 L2G7이 상기 검정에서 구별할 수 없을 정도로 종양 성장을 억제하였음을 도시한다. 종양 이종이식편의 성장을 억제하는 HuL2G7의 능력을 추가로 정의하기 위해, 네 상이한 용량의 mAb, 40 ㎍, 20 ㎍, 10 ㎍ 및 5 ㎍을 유사한 실험에 이용하였다. 도 8은, 매주 2회의 심지어 현저히 낮은 용량인 10㎍이 종양 성장을 완전히 억제할 수 있는 한편, 심지어 더 낮은 용량인 5 ㎍이 양호하나 불완전한 억제를 제공하였음을 도시한다. 유사하게, 전신적으로 투여시 HuL2G7이 두개내 U87 이종이식편의 성장을 효과적으로 억제한다.

본 발명이 현재 바람직한 구체예를 참조로 하여 기술되었으나, 다양한 개질이 본 발명을 벗어나지 않으며 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.

인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은, 각 개개의 공개문헌, 특허 및 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 포함 된다고 언급된 것처럼, 동일한 한도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.

L2G7 하이브리도마는 부다페스트 조약하에 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108)에 ATCC 번호 PTA-5162로서 2003년 4월 29일에 기탁되었다. 이 기탁물은 공인된 기탁기관에서 보존될 것이고 샘플의 공개를 위한 가장 최근의 요청이 기탁기관에 수용된 후 적어도 5년의 기간 동안, 기탁일로부터 적어도 30년의 기간 동안 또는 관련 특허의 강제적인 존속기간 동안 중 가장 긴 기간 동안 돌연변이, 비생존 또는 파괴의 경우에 대체될 것이다. 대중에 대한 상기 세포주의 이용가능성에 대한 모든 제한은 출원으로부터 특허될 시에 변경없이 해제될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Galaxy Biotech LLC Kim, Kyung Jin Park, Hangil Wang, Lihong Vasquez, Maximiliano <120> Humanized Monoclonal Antibodies To Hepatocyte Growth Factor <130> 022382-000410US <140> US 11/731,774 <141> 2007-03-29 <150> US 60/788,243 <151> 2006-04-01 <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cloning restriction site <400> 1 ctcgagacca cc 12 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L2G7 mature heavy chain <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Asn 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly His Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Asp Tyr Trp Gly 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Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HuL2G7 heavy chain <400> 10 Met Asp Cys Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ser Gly Asn Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 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Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Tyr 100 105 110 Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 ?? ?? Footnote continued from previous page Footnote continued on next page ?? ?? 10

Claims (28)

1. 서열번호: 5의 서열을 지니는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8의 서열을 지니는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함하는 사람화된 모노클로날 항체(mAb).
2. 제 1항에 있어서, (IgG1, κ) 이소형인 사람화된 모노클로날 항체.
3. 중쇄 가변 영역의 첫 번째 아미노산이 Gln인 것 말고는, 서열번호: 5의 서열을 지니는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8의 서열을 지니는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함하는 사람화된 모노클로날 항체.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, L2G7과 마찬가지로 사람 간세포 성장 인자(HGF)의 생물학적 활성을 중화시키는 사람화된 모노클로날 항체
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 약제 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 암이 아교모세포종인 약제 조성물.
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