TWI417300B - 與肝細胞生長因子結合之人化單株抗體類 - Google Patents

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Description

與肝細胞生長因子結合之人化單株抗體類 政府利益聲明
本申請案所描述之研究有部分由美國國家衛生研究院2R44CA101283－02經費補助。美國政府對此發明享有特定權利。
本發明大致上關於單株抗體(mAb)之組合物及供發展新穎生物製品之重組DNA技術，更具體地舉例說明，本發明關於產製結合並中和肝細胞生長因子之人化單株抗體。
人肝細胞生長因子(HGF)係一種由間質細胞生產之多功能性異二聚體多肽。HGF經證實具有刺激血管新生、形態發育及細胞移動(motogenesis)以及令多種類型細胞生長及分散之能力(Bussolino et al.,J.Cell.Biol.119：629，1992；Zarnegar and Michalopoulos,J.Cell.Biol.129：1177,1995；Matsumoto et al.,Ciba.Found.symp.212：198,1997；Birchmeier and Gherardi,Trends Cell.Biol.8：404,1998；Xin et al.Am.J.Pathol.158：1111，2001)。HGF之多重作用係透過其受體(一種由原癌基因cMet編碼之跨膜酪胺酸激酶)媒介。除了調節多種正常細胞功能之外，HGF及其受體c－Met被發現與腫瘤發生、侵入及轉移有關(Jeffers et al.,J.MOl.Med.74：505,1996；Comoglio and Trusolino,J.Clin.Invest.109：857,2002)。HGF/c－Met共同表現(通常過度表現)於多種人實質腫瘤上，包括源自肺、結腸、直腸、胃、腎、卵巢、皮膚、多發性骨髓瘤及甲狀腺組織之腫瘤(Prat et al.,Int.J.Cancer 49：323,1991；Chan et al.,Oncogene 2：593,1988；Weidner et al.,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229,1993；Derksen et al.,Blood 99：1405,2002)。HGF作為這些腫瘤之自分泌(autocrine)(Rong et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4731,1994；Koochekpour et al.,Cancer Res.57：5391,1997)及旁分泌(paracrine)生長因子(Weidner et al.,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229,1993)及抗細胞凋亡調節劑(Gao et al.,J.Biol.Chem.276：47257,2001)。
HGF係大小為102千道爾頓之蛋白質，其與胞漿素原(plasminogen)及其他凝血酵素具有序列及結構上之類似性(Nakamura et al.,Nature 342：440,1989；Weldner et al.,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229,1993)。人HGF經合成為728個胺基酸之前驅物(前原HGF(preproHGF))，該前驅物經胞內分解成不活化之單鏈形式(原HGF(proHGF))(Nakamura et al.,Nature 342：440,1989；Rosen et al.,J.Cell.Biol.127：1783,1994)。當胞外分泌時，原HGF被分解以產生具生物活性之雙硫鍵連接之異二聚體分子，其由α－次單位及β－次單位組成(Nakamura et al.,Nature 342：440,1989；Naldini et al.,EMBO J.11：4825,1992)。α－次單位包含440個殘基(69千道爾頓且經糖基化)，其由N端髮夾結構域及4個環餅(kringle)結構域構成。β－次單位包含234個殘基(34千道爾頓)且具有無溶蛋白活性之類絲胺酸蛋白酶結構域。HGF有二個獨特之細胞專一性結合位置：高親和性(Kd＝2×10－10 莫耳)之cMet受體結合位置及低親和性之(Kd＝10－9 莫耳)之硫酸乙醯肝素蛋白多糖(HSPG)結合位置，它們位於細胞表面及胞外基質中(Naldini et al.,Oncogene 6：501,1991；Bardelli et al.,J.Biotechnol.37：109,1994；Sakata et al.,J.Biol.Chem.,272：9457,1997)。
cMet受體係第四型蛋白酪胺酸激酶受體家族之成員。全長cMet基因經選殖及確認為cMet原癌基因(Cooper et al.,Nature 311：29,1984；Park et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6379,1987)。NK2(包含α－次單位之N端及前2個環餅結構域之蛋白質)足以與cMet結合並活化移動之信號梯瀑(cascade)，然而細胞分裂(mitogenic)反應需要由全長蛋白質活化(Weidner et al.,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229,1993)。HSPG藉由與HGF之N端交互反應以結合HGF。
已有報告指出HGF/cMet對癌症發展的幾個面向有關鍵影響，諸如腫瘤發生、侵入、轉移、調節細胞凋亡及血管新生。科學家進行一些不同方向的研究以得到有效之拮抗分子：截短之HGF蛋白質(諸如NK1(N端結構域加上環餅結構域；Lokker et al.,J.Biol.Chem.268：17145,1993)、NK2(N端結構域加上環餅結構域1及2；Chan et al.,Science 254：1382,1991)及NK4(N端結構域加上4個環餅結構域；Kuba et al.,Cancer Res.60：6737,2000))、抗cMet單株抗體類(Dodge,Master’s Thesis,San Francisco State University,1998)及抗HGF單株抗體類(Cao et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：7443,2001，其以參照方式納入此處)。
NK1及NK2可與HGF有效競爭與受體之結合，但有報告指出它們在活體外具有部分協同作用(Cioce et al.,J.Biol.Chem.271：13110,1996；Schwall et al.,J.Cell Biol.133：709,1996)，而非所欲之純然拮抗作用。最近，Kuba et al.,Cancer Res.60：6737,2000指出在連續輸注NK4之裸鼠模式中，NK4可部分抑制鼠肺癌LLC之原發性生長及轉移。然而，必須連續投服NK4以獲得部分抑制原發性腫瘤生長之事實，顯示NK4分子之半衰期可能過短及/或缺乏強度(potency)。
Cao et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：7443,2001指出投服三種抗HGF單株抗體之雞尾酒療法可抑制異種移植裸鼠模式中人腫瘤之生長，該單株抗體之選擇係根據彼等於活體外抑制HGF之分散活性之能力。他們假設辨識HGF上三個不同結合位置之三種單株抗體係抑制HGF於活體內之生物活性所需：二個單株抗體抑制HGF與cMet之結合及一個單株抗體抑制HGF與肝素之結合。
最近，利用轉殖鼠技術所發展之個別與HGF結合並中和之人單株抗體類已被報導(Burgess et al.,WO2005/017107A2及Burgess et al.,Cancer Res 66：1721,2006，各以參照方式納入此處以符合所有目的)。然而，其中至少2.12.1單株抗體(其明顯地為腫瘤異種移植模式中效價最強者)仍然無法抑制血管新生。鼠單株抗體L2G7已被發展出來，其中和HGF之所有測試之生物活性包括血管新生(2004年8月13日提出之專利申請案USSN10/917915，及Kim et al.Clin Cancer Res 12：1292,2006，各以參照方式納入此處以符合所有目的)。
因此，阻斷HGF活體外及活體內之生物活性之人化單株抗體是有其需要的。本發明實現此需要及其他需要。
 發明摘要
在一實施態樣中，本發明提供一種與人肝細胞生長因子(HGF)結合之人化單株抗體(mAb)。該單株抗體抑制至少一種且較佳為數種或所有HGF之生物活性，包括與其受體cMet結合、誘發細胞分散諸如Madin－Darby犬腎細胞、誘發Mv 1 Lu鼬肺上皮細胞及/或肝細胞及/或人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增生，及刺激血管新生。較佳之人化抗HGF單株抗體抑制(最適宜為完全抑制)人腫瘤異種移植物於鼠體內生長。在較佳之實施態樣中，該人化單株抗體係人化L2G7單株抗體。在特別適宜之實施態樣中，該單株抗體之重鏈及輕鏈變異區分別具有圖2A及2B中標示HuL2G7之序列，或與該些序列具有至少90%或更高一致性者。在另一實施態樣中，本發明提供一種結合並中和人肝細胞生長因子(HGF)之人化單株抗體(mAb)，該人化抗體包含人化重鏈及輕鏈。該人化重鏈包含源自L2G7之CDRs及人重鏈變異區構架，唯其人重鏈變異區構架之至少一個選自H29、H30、H48、H66、H67、H71及H94之位置係由佔據L2G7重鏈的對應位置上之胺基酸所佔據。該人化輕鏈包含源自L2G7之CDRs及人輕鏈變異區構架，唯其至少一個選自L3或L60之位置係由佔據L2G7輕鏈的對應位置上之胺基酸所佔據。
本發明亦提供產製這類人化抗體之細胞系。在另一實施態樣中，本發明提供包含人化L2G7單株抗體之藥學組成物。在第三個實施態樣中，該藥學組成物被投服至病患(特別是人類病患)以治療癌症或其他疾病。
本發明之詳細說明
本發明提供人化之中和性抗HGF單株抗體類、包含彼等之藥學組成物、及利用彼等以供治療疾病之方法。
1.抗體
抗體係非常大且複雜之分子(分子量約150000或約1320個胺基酸)，其具有複雜之內部構造。天然抗體分子包含二對完全相同之多肽鏈，每對具有一條輕鏈及一條重鏈；因此抗體之基本結構單位為四聚體。每條輕鏈及重鏈分別由二個區域組成：與目標抗原結合有關之變異區(V)，及與免疫系統其他成份交互作用之固定區(C)。輕鏈及重鏈變異區在三維空間中一起摺疊以形成與抗原(例如在細胞表面之受體)結合之變異區。在每個輕鏈或重鏈之變異區內，有三個稱為互補決定區(CDRs)之短片段(平均長度為10個胺基酸)。在抗體變異結構域中之6個CDRs(3個源自輕鏈及3個源自重鏈)在三維空間中一起摺疊以形成鎖定目標抗原之真正抗體結合位置。這些CDRs之位置及長度已被明確地定義。參見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1983,1987，其以參照方式納入本文。不包含在CDRs內之變異區部分被稱為構架，其形成CDRs之環境。在每條鏈中，3個CDRs以下列順序散佈於4個構架區中：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
源自免疫球蛋白之成熟重鏈及輕鏈之變異區的胺基酸分別以Hx及Lx表示，其中x係根據Kabat系統(上述文獻)標示胺基酸位置之數字。Kabat列出每個次群抗體的許多胺基酸序列，並列出該次群中每個殘基位置最常出現的胺基酸以產生共同序列。Kabat使用的方法是分配殘基編號給序列表中的每個胺基酸，且這種分配殘基編號之方法成為該領域之標準。Kabat系統可擴展至其他不包含在其數據庫中之抗體，藉由參照保留性胺基酸以比對有疑問之抗體與Kabat之共同序列之一。使用Kabat編號系統可輕易辨識不同抗體中相等位置上之胺基酸。舉例來說，人抗體L50位置之胺基酸佔據等同於鼠抗體胺基酸位置L50之位置。另外，任二個抗體序列均可被獨特地比對以決定例如一致性百分比，其藉由使用Kabat編號系統以使一抗體序列中之每個胺基酸與另一序列中具有相同Kabat編號之胺基酸進行排比。經排比後，如果主題抗體區域(例如重鏈或輕鏈之完整成熟變異區)係與參考抗體之相同區域比較，主題及參考抗體區域之間之序列一致性百分比係主題及參考抗體區域中被相同胺基酸佔據之位置數目除以該二區域排比位置之總數，缺口不予計算，再乘以100以轉換成百分比。
單株抗體(mAb)係單一分子種類之抗體，因此不包含以抗原注射動物(諸如鼠、兔或羊)及自動物抽取血清所產製之多株抗體。人化抗體係經基因工程建構之(單株)抗體，其中源自鼠抗體(捐贈者抗體，其亦可為鼠、倉鼠或其他類似物種)之CDRs被移植至人抗體(接受者抗體)。人化抗體亦可利用源自鼠抗體之不完整CDRs產製(例如Pascalis et al.,J.Immunol.169：3076,2002)。最常見之情形為源自捐贈者抗體之第一個重鏈超變異環H1(如Chothia & Lesk,J.Mol.Biol.196：901－917,1987所定義)亦被轉移至人化抗體。因此，人化抗體係具有源自捐贈者抗體之CDRs及源自人抗體之變異區構架及固定區之抗體。輕鏈及重鏈接受者構架可能源自相同或不同之人抗體且可能各自為二或多個人抗體構架之組合物；或反之可能是一組人構架區(例如Kabat et al於上述文獻所定義之人抗體次群)之共同序列，也就是在每個位置上具有該組中最常發生之胺基酸之序列。此外，要維持高結合親和性，可採用二種額外之結構元件之至少一種。參見Queen et al.，美國專利5530101及5585089號，各以參照方式納入本文，其提供建構人化抗體之詳細說明。
在第一個結構元件中，藉由自許多已知之人抗體中適當地篩選接受者抗體，以選擇與捐贈者抗體之重鏈變異區構架具有高度序列一致性(至少65%)之人化抗體之重鏈變異區構架。在第二個結構元件中，在建構人化抗體時，人接受者抗體之構架區中(CDRs外)被選擇之胺基酸根據特定規則以源自捐贈者抗體之對應胺基酸取代。具體地說，構架區中將被取代之胺基酸通常根據它們與CDRs交互作用之能力選擇。舉例來說，被取代之胺基酸與捐贈者抗體序列中之CDR相鄰或位於以三維空間測量之人化抗體CDR之4至6埃內。
另一方面，由於人化單株抗體必須源自非人捐贈者單株抗體，因此人化單株抗體並不包含藉由自人分離編碼變異區之核酸及利用噬菌體展示法篩選這些核酸(參見例如Dower et al.,WO91/17271；McCafferty et al.,WO92/001047；Winter,WO92/20791；及Winter,FEBS Lett.23：92,1998)或藉由使用轉殖鼠(參見例如Lonberg et al.,WO93/12227；Kucherlapati WO91/10741及Burgess et al.WO2005/027107A2)所產製之實質上之人單株抗體。
單株抗體之抗原決定部位係該單株抗體與其抗原結合之區域。若二抗體互相競爭性抑制(阻斷)彼此與抗原之結合，則它們與相同或重疊之抗原決定部位結合。也就是在競爭性結合試驗中，多1倍、5倍、10倍、20倍或100倍之抗體抑制另一抗體至少50%但較佳為75%、90%或甚至99%之結合(參見例如Junghans et al.,Cancer Res.50：1495，1990)。或者，若抗原中所有降低或消除抗體結合之胺基酸突變降低或消除另一抗體之結合，則該二抗體具有相同之抗原決定部位。若某些降低或消除抗體結合之胺基酸突變降低或消除另一抗體之結合，則該二抗體具有重疊之抗原決定部位。
2.人化之中和性抗HGF抗體
與HGF結合之單株抗體(mAb)(也就是抗HGF mAb)被稱為中和HGF或具有中和性，若該結合部分或完全抑制HGF之一或多種生物活性(當該mAb被當作單一藥劑使用)。可能被中和抗體抑制之HGF生物活性為HGF與其cMet受體結合之能力；造成特定細胞系分散之能力諸如Madin－Darby犬腎(MDCK)細胞；刺激特定細胞增生(也就是細胞分裂)之能力包括肝細胞、Mv 1 Lu鼬肺上皮細胞及/或多種人腫瘤細胞；或刺激血管新生之能力，例如藉由測量其刺激人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)之增生或管形成，或藉由置於雞胚絨毛尿囊膜(CAM)誘導血管時測量。本發明之抗體適宜地與人HGF結合，也就是與由GenBank序列登錄號D90334所編碼之蛋白質結合。
本發明之人化中和單株抗體於例如0.01、0.1、0.5、1、2、5、10、20或50微克/毫升之濃度下，將以約至少50%但較佳75%、更佳90%或95%或甚至99%且最佳約100%(實質上完全)之程度抑制HGF之生物功能(例如刺激增生或分散)，其藉實施例所描述或該領域已知之方法測定。抑制程度通常在所使用之HGF之量剛好足以完全剌激生物活性或為0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、3或10微克/毫升時測量。當抗體對HGF之莫耳比為0.1×、0.5×、1×、2×、3×、5×或10×，較佳為達到至少25%、50%、75%、90%或95%或實質上完全之抑制。最佳之該單株抗體中和不光一種而是好幾種上述之生物活性；就此處之目的而言，中和HGF之所有生物活性之抗HGF單株抗體將被稱為「完全中和」，且這類單株抗體最為適宜。本發明之單株抗體適宜地與HGF專一性結合，這表示它們不會或僅以相較之下極低之程度與和HGF相關之蛋白質如纖維細胞生長因子(FGF)及血管內皮生長因子(VEGF)結合。本發明之單株抗體通常具有至少107 /莫耳、但較佳108 /莫耳或更高、且最佳109 /莫耳或更高、或甚至1010 /莫耳或更高之對HGF之結合親和力(Ka)。
本發明之人化單株抗體包括以天然四聚體形式(2條輕鏈及2條重鏈)存在之抗HGF抗體且可以是任何已知之IgG、IgA、IgM、IgD或IgE型及其亞型(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，且可能包含kappa或lambda輕鏈。本發明之單株抗體亦包括抗體片段，諸如Fv、Fab及F(ab’)2 ；雙官能性雜交抗體(例如Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17：105,1987)、單鏈抗體(Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879,1988；Bird et al.,Science 242：423,1988)；及具有修飾固定區之抗體(例如美國專利5624821號)。單株抗體之CDRs來源可能為動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠或雞)來源，或可能為經基因工程建構之CDRs。囓齒類單株抗體利用該領域熟知之標準方法製備，其包含以HGF及適當載劑進行多次腹腔注射、靜脈注射或注射足墊之免疫，接著摘取脾臟或淋巴結細胞並與適當之永久細胞系融合，然後篩選生產與HGF結合之抗體之雜交瘤。
本發明提供人化形式之鼠L2G7單株抗體。鼠L2G7單株抗體之成熟重鏈及輕鏈之變異區的序列分別顯示於圖1A及1B。因此，人化形式之L2G7單株抗體在人變異區構架中(包括單一、複合或共同序列人構架)包含源自這些序列之大部分或所有的CDR胺基酸。舉例來說，某些人化抗體包括三個源自L2G7重鏈之完整CDRs及三個源自輕鏈之完整CDRs。其他人化抗體包括至少一個源自L2G7重鏈之完整CDR及至少一個源自L2G7輕鏈之完整CDR。有些人化抗體包括至少一個CDR，其中的一些殘基係源自L2G7之對應CDR，其餘則源自人抗體之CDR，較佳為與供應包含該CDR之變異區構架相同之人抗體。
在本發明之一些人化抗體類中，至少1、3、5個或所有選自H29、H30、H48、H66、H67、H71、H94、L3及L60之位置係由Kabat編號之鼠L2G7抗體的對應位置上之胺基酸所佔據。在實施例所使用之人接受者變異區構架中，所有這些位置係由與鼠L2G7抗體的對應位置上之胺基酸不同之人殘基所佔據。因此，較適宜為取代所有或大部分選自該群組之位置。如果使用其他人變異區構架，若干這些位置可能被人變異區構架及鼠L2G7抗體中相同之胺基酸佔據。因此，取代並不在這類位置進行，但是可在人變異區構架與鼠L2G7抗體相異之其他位置根據奎恩(Queen)之規則、US5530101及US5585089進行。不論人變異區構架之選擇為何，亦有可能如下述般取代其他除上述群組提及以外之胺基酸。然而，一般來說不論是人化抗體之重鏈變異區構架或輕鏈變異區構架均不包含超過10或12個導致不存在接受者人變異區構架中之殘基之取代(包括如上述之人共同變異區構架及複合人變異區構架)。
任何在本發明之人化抗體上之固定區係人或實質上為人之固定區，其具有不超過10個且較佳為2或更少之相對於天然人固定區之取代。有些取代如下述般有益地增加抗體之半衰期及/或其對FcγRn之親和力。其他取代(如下述通常為保留性取代)並不造成影響。
示範性人化形式之L2G7包括分別具有圖2A及2B所示序列之成熟重鏈及輕鏈變異區。其他較佳形式之人化L2G7包括與這些序列具有至少90%、95%、98%或99%一致性(根據Kabat編號系統比對，同上)，及/或與它們有少數(通常不超過5或10個胺基酸)功能性上不重要之取代、刪除及/或插入之差異的成熟鏈及輕鏈變異區。舉例來說，重鏈之第一個胺基酸可能是Glu或Gln。這些取代通常為保留性，也就是以化學上類似之胺基酸取代。為了區別胺基酸取代係保留性或非保留性，胺基酸被分成下列幾組：第一組(疏水性側鏈)：甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸；第二組(中性親水性側鏈)：半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸；第三組(酸性側鏈)：天冬胺酸、麩胺酸；第四組(鹼性側鏈)：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、離胺酸、精胺酸；第五組(影響鏈方向之殘基)：甘胺酸、脯胺酸；及第六組(芳香性側鏈)：色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸。保留性取代為該些以同組之胺基酸取代之取代。關於圖2A及2B中V區之取代適宜地避免發生在位置H29、H30、H48、H66、H67、H71、H94、L3及L60，由於這些位置與CDRs之交互作用因此在這些位置上包含源自鼠L2G7之胺基酸，如實施例中所討論。較佳之取代發生在變異區構架位置，但是亦可發生於CDR區域。如果CDR區被取代，較佳者為以源自人抗體之對應位置上(Kabat編號)之胺基酸取代鼠胺基酸，較佳為與供應接受者變異區構架相同之人抗體。
一般來說，人化L2G7單株抗體係屬具有kappa輕鏈之IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。具有分別與完整人gamma－1及kappa固定區組合之圖2A及2B之變異區的IgG1單株抗體被命名為HuL2G7。HuL2G7之完整重鏈及輕鏈分別顯示於圖3A及3B。只有從標示數字1之位置開始的序列成熟部分實際構成HuL2G7，因為之前的信號胜肽在抗體分泌前或分泌時被切掉。
保留與HuL2G7類似之結合特性的HuL2G7變異體可利用突變及隨後如上述使用噬菌體展示法經大量篩選而得到。先利用與HGF之專一性結合篩選變異體，視需要與HuL2G7或鼠L2G7競爭。具有與示範抗體相同或類似結合特性之變異體接著進行功能性測試。
較佳之人化L2G7單株抗體如上定義般中和或完全中和HGF。對於HGF被檢測之一些、大部分或所有生物活性而言(例如與Met結合、刺激Mv 1 Lu或HUVEC細胞增生)，人化單株抗體較佳之中和活性在L2G7本身之中和活性的3倍以內，更佳為2倍或1.5倍以內，且最佳為無差異(也就是在實驗誤差範圍內)。這表示需要相較於L2G7不超過3倍、2倍、1.5倍或等量之人化單株抗體以得到相同程度之生物活性抑制(例如以IC50’s檢測)。較佳之人化單株抗體對HGF之親和力相較於L2G7亦在其3倍、2倍以內或實質上無差異。同樣的在異種移植鼠模式中(例如使用人膠質瘤細胞系諸如U87)，人化單株抗體適宜地抑制腫瘤生長在鼠L2G7單株抗體組之3倍、2倍以內或無差異。實際上，只須40、20或甚至10微克劑量之人化單株抗體每週投服二次適宜地完全抑制U87腫瘤異種移植物之生長。
人化單株抗體類可利用許多該領域熟知之方法表現。舉例來說，編碼彼等之輕鏈及重鏈V區之基因可能先自重疊之寡核苷酸被合成或藉由先前製備之含所欲基因的變異體經PCR突變得到。由於基因密碼之簡併性，許多DNA序列編碼每個抗體之胺基酸序列。本申請案所描述之所有編碼抗體類之DNA序列被明示包含於本發明中。無論其製備方法為何，編碼人化單株抗體之輕鏈及重鏈基因之基因係與固定區一起被插入表現載體中(例如Invitrogen之商品)，該載體提供必要之調節區例如啟動子、增強子、聚腺苷位置等。較佳為利用CMV啟動子－增強子。固定區之基因目前可廣泛地取得或可輕易地自人抗體產製細胞中利用PCR選殖。輕鏈及重鏈基因可一起插入單一載體或插入不同載體中。接著利用各種該領域已知之方法諸如脂質體法或電穿孔法令表現載體轉染至多種哺乳類細胞系中諸如CHO或293或非分泌性骨髓瘤細胞包括Sp2/0及NS0，然後利用適當抗生素篩選選擇表現抗體之細胞。參見例如美國專利5530101號。較大量之抗體可利用令細胞生長於商業化之生物反應器中製備。
經表現後，本發明之人化單株抗體根據該領域之標準程序純化，諸如微過濾法、超微過濾法、蛋白A或G親和性層析法、大小排除層析法、陰離子交換層析法、陽離子交換層析法及/或其他形式之根據有機染料或該類似物之親和性層析法。實質上之純抗體適用於醫藥用途，以具有至少約90%或95%之均質性為佳，且以98%或99%或更高之均質性為最佳。
3.治療方法
在較佳之實施態樣中，本發明提供一種包含此處所描述之人化抗體之藥學組成物。抗體之藥學組成物包含單株抗體及生理上可接受之載劑及視需要添加之賦形劑或穩定劑，其被製成冷凍乾燥或水狀溶液之形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在施用之劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括緩衝液諸如pH通常為5.0至8.0(最常見為6.0至7.0)之磷酸、檸檬酸或醋酸；鹽類諸如氯化鈉、氯化鉀等以調配成等張性；抗氧化劑、保存劑、低分子量多肽、蛋白質、親水性聚合物諸如聚山梨酯80、胺基酸、碳水化合物、螯合劑、糖類及熟習該項技藝者所熟知之其他標準成分(參見Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol.A.Ed.1980)。單株抗體通常以1至100毫克/毫升例如10毫克/毫升之濃度存在。
在其他較佳之實施態樣中，本發明提供一種利用含人化抗HGF單株抗體諸如人化L2G7(例如HuL2G7)之藥學調合物治療病患之方法。被調配成藥學調合物之單株抗體可經由任何適當途徑被投服至病患，特別是經靜脈輸注或快速推注、肌肉注射或皮下注射之非經口途徑。靜脈輸注可在短如15分鐘之內投予，但通常在30分鐘或在1、2或甚至3小時之內投予。單株抗體亦可被直接注射至疾病(例如腫瘤)部位，或被包覆在攜帶劑諸如脂質體中。所投服之劑量足以減輕被治療之狀況(「治療上有效之劑量」)且可能是0.1至5毫克/公斤體重(例如1、2、3或4毫克/公斤)，但也可能高達10毫克/公斤或甚至15或20毫克/公斤。亦可能給予固定之單位劑量，例如50、100、200、500或1000毫克，或該劑量可能根據病患之表面積計算例如100毫克/米2 。通常投服介於1至8劑(例如1、2、3、4、5、6、7或8劑)以治療癌症，但是也可能投服10、20或更多劑。單株抗體可根據例如單株抗體之半衰期以每天、每二週、每週、每隔一週、每月或以其他時間間隔投服達1週、2週、4週、8週、3至6個月或更久。亦可能重複治療療程以作為慢性投藥。
對本發明之人化抗HGF單株抗體(例如HuL2G7)治療特別有感受性之疾病包括被認為需要血管新生或與HGF濃度上升有關之實質腫瘤，例如卵巢癌、乳癌、肺癌(小細胞或非小細胞)、結腸癌、前列腺癌、胰癌、胃癌、肝癌、頭頸癌、兒童或成人之黑色素瘤及肉瘤及腦瘤。事實上，本發明之方法(尤其是人化L2G7單株抗體之全身性治療)特別適用於治療腦瘤包括腦膜瘤；膠質瘤包括室管瘤(ependymomas)、寡樹突膠質瘤(oligodendrogliomas)及所有種類之星狀細胞瘤(低惡度、分化不良性及多型性膠狀母細胞瘤(glioblastoma multiforme)或單純膠狀母細胞瘤)；髓母細胞瘤(medullablastomas)、神經節細胞膠質瘤(gangliogliomas)、神經鞘瘤(schwannomas)、脊索瘤(chordomas)；及主要為兒童之腦瘤包括原始性神經外胚瘤(primitive neuroectodermal tumors)。原發性腦瘤(也就是出現在腦部)及次發性或轉移性腦瘤均可利用本發明之方法治療。其它適合利用本發明之方法治療之疾病係該些與不當血管新生有關之疾病諸如糖尿病視網膜病變、老年性黃斑變性、類風濕性關節炎及乾癬。
在特別適宜之實施態樣中，人化抗HGF單株抗體(例如HuL2G7)係與其他抗癌療法一起(例如在之前、同時或之後)投服。舉例來說，單株抗體可能與熟習腫瘤學技藝者所熟知之任何一種或多種化學治療劑一起投服，例如烷化劑諸如卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、佳鉑帝(carboplatin)、奧沙利鉑(oxiplatin)、甲基苄肼(procarbazine)、及環磷醯胺(cyclophosphamide)；抗代謝劑諸如氟尿嘧啶(fluorouracil)、去氧氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、甲氨喋呤(methotrexate)及羥基脲(hydroxyurea)；天然產物包括植物鹼類及抗生素類諸如博來黴素(bleomycin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、伊達比星(idarubicin)、依托泊苷(etoposide)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、長春質鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)及汰癌勝(Taxol)(太平洋紫杉醇(paclitaxel))或相關化合物諸如泰索帝(Taxotere)；專門核准用於腦瘤之藥劑包括替莫唑胺(temozolomide)及含卡莫司汀(carmustine)之Gliadel薄片；及其他藥物包括依瑞替肯(irinotecan)及基立克(Gleevec)及所有列於WO2005/017017 A2(其以參照方式納入此處)之經核准及實驗性抗癌藥物。其他可與人化抗HGF單株抗體一起投服之藥劑包括生物劑諸如單株抗體類(包括針對HER2抗原之賀癌平(HerceptinTM )、針對VEGF之癌思停(AvastinTM )或針對EGF受體之抗體類，以及小分子抗血管新生劑或EGF受體拮抗劑。此外，人化抗HGF單株抗體可與放射線治療或手術一起使用。
包括人化抗HGF單株抗體(例如HuL2G7)之治療(例如標準化學治療)相較於相同但不含抗HGF單株抗體之治療(例如化學治療)可增加罹患這些腫瘤(例如卵巢癌、乳癌、肺癌、胰癌、腦癌及結腸癌，尤其是復發或頑固型)之病患至少30%或40%但較佳為增加50%、60%至70%或甚至100%或更長的中位數無惡化存活或整體存活時間。此外或反之，包括抗HGF單株抗體之治療(例如標準化學治療)相較於相同但不含抗HGF單株抗體之治療(例如化學治療)可增加罹患這些腫瘤(例如卵巢癌、乳癌、肺癌、胰癌、腦癌及結腸癌，尤其是復發或頑固型)之病患至少30%或40%但較佳為增加50%、60%至70%或甚至100%的完全反應率、部分反應率或客觀反應率(完全＋部分)。對於腦瘤諸如膠狀母細胞瘤，以單獨使用或與其他藥劑一起使用之人化抗HGF單株抗體治療適宜地提供至少5%或10%、更適宜地提供20%或25%或30%及最適宜地提供40%、50%或更高之部分、完全或客觀反應率。
在臨床試驗中(例如第二期、第二/三期或第三期試驗)，前述以標準療法加人化抗HGF單株抗體(例如HuL2G7)治療之病患相較於僅接受標準療法(或加上安慰劑)之對照組病患的中位數無惡化存活及/或反應率增加通常具有統計上之顯著性，例如p＝0.05或0.01或甚至達0.001之水準。完全及部分反應率係由癌症臨床試驗所慣用之客觀標準決定，例如由國家癌症研究院及/或食品藥物管理局所表列或接受者。
4.其他方法
本發明之人化抗HGF單株抗體類亦被用於診斷、預後及實驗室方法。它們可被用於測量HGF於腫瘤病患之腫瘤或循環中之濃度，因此可被用來追蹤及引導腫瘤之治療。舉例來說，與高濃度之HGF有關之腫瘤將對人化抗HGF單株抗體之治療特別具有感受性。在特定實施態樣中，單株抗體類可被用於ELISA或放射性免疫試驗以測量HGF於例如腫瘤組織切片樣本或血清或HGF分泌性細胞之細胞培養的培養基上清液中之濃度。在不同之試驗中，抗HGF單株抗體可能經螢光分子、自旋標記分子類、酶類或放射性同位素標示，且可能以含有實施HGF試驗所需之所有必要試劑之套組形式提供。在其他用途中，抗HGF單株抗體類藉由例如親和性層析法被用於純化HGF。
 建構人化L2G7抗體
中和HGF所有被測試之生物活性之鼠抗HGF單株抗體L2G7之生產已經被描述(Kim et al.,US20050019327提出於2004年8月13日，及Kim et al.Clin Cancer Res 12：1292,2006)。人化L2G7的第一個步驟為選殖其輕鏈及重鏈基因，其實質上係根據Co et al.,J.Immunol.148：1149,1992之方法進行。簡單地說，利用RNeasy Mini Kit(Qiagen)自106 個L2G7(IgG2a,)雜交瘤細胞製備RNA，然後利用Stratagene公司之套組以隨機引子合成第一股cDNA並利用末端脫氧核苷轉移酶(Promega)加上脫氧鳥嘌呤核苷(dG)尾。利用高產量之聚合酶AccuPrime Pfx(Invitrogen)，以黏合dG尾之引子及黏合Cγ2a之N末端區之重鏈引子與黏合C之N末端區之輕鏈引子自cDNA分別放大重鏈及輕鏈之V區。利用雙脫氧終止法之自動定序儀，自PCR反應膠體純化適當大小之帶，並直接定序或經選殖然後定序。一條重鏈之cDNA序列被發現，其經轉譯後顯示於圖1A。二條不同之明顯非異常輕鏈cDNA序列被發現，但是經分離之L2G7輕鏈之N端胺基酸定序僅顯示其中的一條鏈，該經轉譯之胺基酸序列顯示於圖1B。
要表現L2G7之嵌合形式及之後的人化單株抗體，自商品化之載體及DNA片段建構與Co et al.,J.Immunol.148：1149,1992所描述之pVk及pVg1載體(其包含人及Cγ1 基因)類似之表現載體。然而，輕鏈載體以hyg 選擇標記取代gpt ，而重鏈載體以neo 選擇標記取代Dhfr 。將被選殖之VL 及VH 基因次選殖至這些載體之適當位置以產生嵌合性L2G7(chL2G7)單株抗體之輕鏈及重鏈基因的表現載體。chL2G7單株抗體被產製並顯示如L2G7般與HGF結合，唯其選殖正確之輕鏈及重鏈的V區。
要設計人化L2G7單株抗體，通常根據Queen et al.美國專利5530101及5585089號之方法。掃描美國國家生物技術資訊中心(NCBI)之人抗體序列資料庫，分別選用人VH 序列AAC18323及Vk 序列BAC01726以作為L2G7之VH 及VL 序列的接受者序列，因為它們具有特別高度之構架同源性(也就是序列一致性)。可得自國際性網站(http：//www.expasy.org/spdbv/)之電腦軟體Deep View Swiss－Pdb Viewer被用來建構L2G7變異區結構域之分子模型，其被用來找出L2G7構架中與CDRs足夠接近而可能與CDRs發生交互反應之胺基酸位置。要設計人化L2G7之重鏈及輕鏈的變異區，源自鼠L2G7單株抗體之CDRs首先在概念上被移植到接受者構架區。在電腦模式所建議之與CDRs顯著接觸(其可能係維持CDR構型所需)之構架位置上，源自鼠抗體之胺基酸被原始人構架胺基酸取代。對於被稱為HuL2G7之人L2G7單株抗體而言，此於Kabat編號之重鏈殘基29、30(位於Chothia超變異環H1內)、48、66、67、71及94及輕鏈殘基3及60上進行。此外，重鏈之胺基酸1被E(Glu)取代，因為此胺基酸比較不像Q(Gln)會在抗體蛋白質中進行衍生化。HuL2G7之重鏈及輕鏈的V區序列在圖2A及2B中顯示分別與L2G7及接受者之V區比對，該CDRs及經取代之胺基酸以劃線表示。
本發明亦提供變異之人化L2G7單株抗體，其成熟重鏈及輕鏈變異區與HuL2G7之序列間有少數(例如通常不超過1、2、3、5或10個)取代、刪除或插入之不同，通常發生在構架中但也可能在CDRs中。具體地說，只有上述之取代次群可發生於接受者構架中，或可發生額外之取代，例如鼠L2G7 VH 胺基酸69F可能取代接受者胺基酸69M。另一方面，VH 胺基酸1E可能被取代為Q。事實上，許多不與HuL2G7中之CDRs接觸之構架殘基可適應源自L2G7或其他鼠或人抗體的對應位置上之胺基酸取代，且甚至許多可能與CDR接觸之殘基或甚至在CDRs內之胺基酸亦可被取代。
最常發生在變異人化L2G7序列中之取代相對於被取代之HuL2G7胺基酸為保留性。HuL2G7中較佳之取代(不論是否為保留性)對該人化單株抗體之結合親和性或強度(也就是其中和HGF之生物活性之能力)並無顯著影響(例如該變異人化L2G7單株抗體於此處所描述之一些或所有試驗中之強度實質上與HuL2G7之強度相同，也就是在實驗誤差內)。該成熟變異輕鏈及重鏈的V區序列分別與HuL2G7之成熟輕鏈及重鏈的V區適宜地有至少90%、更適宜地有至少95%、及最適宜地有至少98%之一致性。反之，其他與L2G7之變異區有高度序列一致性之人抗體變異區亦適合提供該人化抗體構架，特別是源自人次群I之kappa V區及源自人次群I之重鏈V區，或這些次群之共同序列。
下面實施例所討論之示範性單株抗體HuL2G7具有人κ及γ1之固定區，因此係屬IgG1：包括信號胜肽之HuL2G7的重鏈及輕鏈基因之完整序列顯示於圖3A及3B中(該信號胜肽當然會被切掉且不屬於HuL2G7的一部分)。然而應了解的是，其他(IgG1，κ)同種異型之IgG1單株抗體包含於HuL2G7之名稱中。其他同型(例如IgG2、IgG3及IgG4)之人化單株抗體可藉由組合該HuL2G7之變異區與適當之人固定區以製備。取代可發生於HuL2G7之固定區以減少或增加效應功能諸如補體媒介之細胞毒性或ADCC(參見例如Winter et al.，美國專利5624821號；Tso et al.，美國專利5834597號；及Lazar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：4005,2006)或延長在人體內之半衰期(參見例如Hinton et al.,J.Biol.Chem.279：6213,2004)。具體來說但無限制之意，在IgG固定區之位置250突變成Gln及/或位置428突變為Leu之HuL2G7為本發明之實施態樣。
HuL2G7單株抗體經設計後(也就是其輕鏈及重鏈之V區的胺基酸序列被選擇後(圖2及圖3))，透過基因密碼例行選擇編碼V區之DNA序列(包括信號胜肽)；該序列在起始ATG密碼子之前始於CTCGAGACCACC(SEQ ID NO：1)以提供用於選殖之限制酶位置及Kozak轉譯起始信號。這些基因由Genscript公司(Piscataway,NJ)商業化合成。或者，Co et al.,J.Immunol.148：1149,1992之方法可被用來合成各V區之基因。簡單地說，合成二對正反股上之重疊寡核苷酸(Applied Biosystems DNA合成儀)，它們一起包含整個基因。寡核苷酸為110至140個鹼基長，有15個鹼基重疊。雙股DNA片段利用Klenow聚合酶分別自5’對及自3’對之寡核苷酸合成。5’DNA片段以限制酶切割在V區基因之5’端及中央。3’DNA片段以限制酶切割在V區基因之中央及3’端。各切割片段被插入適當之選殖載體並轉殖至大腸桿菌，並將源自許多分離株之DNA定序以找出具有完全正確序列之片段。對各基因而言，接著進行3向接合將正確之5’及3’片段插入至適當的表現載體以形成完整基因，其序列經過確認。
要生產HuL2G7單株抗體，人腎上皮293－F細胞(Invitrogen)被培養於FreeStyle 293表現培養基中(FS medium；Invitrogen)，並以108 個細胞/2毫升/微量管(macrowell)再懸浮於FS培養基中。取HuL2G7輕鏈及重鏈表現載體DNAs(各1微克)與3微升之Fugene 6(Roche)一起於室溫下於100微升FS培養基中培養30分鐘；該混合物接著被加入細胞中。經過48小時之培養後，轉染細胞加入1毫克/毫升之G418培養以篩選出表現neo之細胞，接著分散至96孔組織培養盤中(100微升/孔)。經過大約2週後，當活細胞長滿孔洞後，以ELISA定性及定量測試該些孔洞之培養上清液中之HuL2G7。轉染細胞可能分泌不平衡的輕鏈及重鏈，因此要確定只測量完整之HuL2G7，此ELISA利用羊抗人Fc作為捕捉劑及生物素化抗人kappa作為偵測試劑。chL2G7單株抗體以類似方法表現。表現相對高量之ChL2G7及HuL2G7之細胞株分別被擴增及培養於FS培養基中。利用蛋白質A親和性層析法自培養上清液純化抗體，並利用SDS－PAGE分析其純度。
HuL2G7之性質
為了比較HuL2G7與ChL2G7及L2G7之結合親和力，進行競爭性結合試驗。在微滴定盤加入50微升/孔之2微克/毫升之羊抗人IgG－Fc(GαhIgG－Fc)於PBS中於4℃下反應隔夜，接著在室溫下以2% BSA阻斷處理1小時。清洗該盤後，以50微升/孔ChL2G7單株抗體(2微克/孔)在室溫下培養1小時，經清洗後以50微升/孔之人IgG(10微克/毫升)反應1小時以降低背景。清洗該盤後，孔洞以50微升/孔不同濃度之純化HuL2G7、ChL2G7或L2G7作為競爭者加上50微升/孔之HGF－Flag(1微克/毫升)分別培養1小時。清洗該盤後，接著以50微升/孔之HRP－M2抗Flag單株抗體(Invitrogen)培養，該結合之HRP－抗Flag M2藉由加入四甲基聯苯胺受質偵測。圖4顯示HuL2G7、ChL2G7及L2G7實質上與結合在盤上之L2G7有相同之與可溶性HGF－Flag結合之競爭力，這表示這三個單株抗體具有非常類似之親和力。
HGF的主要生物活性為與其受體cMet結合之能力，因此我們比較HuL2G7、ChL2G7及L2G7單株抗體抑制HGF與Met結合之能力。Met以Met－Fc之形式及HGF以HGF－Flag之形式被使用，它們的製備如先前所述(專利申請案USSN10/917915於2004年8月13日提出，及Kim et al。Clin Cancer Res 12：1292,2006)。在微滴定盤加入50微升/孔之各2微克/毫升之2種抗Met單株抗體(Galaxy Biotech)於PBS中於4℃下反應隔夜(或者使用2微克/毫升之GαhIgG－Fc)，接著在室溫下以2% BSA阻斷處理1小時。清洗該盤後，以50微升/孔之Met－Fc(1微克/毫升)加入各孔在室溫下培養1小時，經清洗後以50微升/孔之人IgG(10微克/毫升)反應1小時以降低背景。清洗該盤後，以各種濃度之單株抗體預培養之HGF－Flag(0.5微克/毫升)以50微升/孔之量加入各孔培養1小時。清洗該盤後，以50微升/孔之HRP－M2抗Flag單株抗體(Invitrogen)培養，且該結合之HRP－抗Flag M2如上述藉由加入受質偵測。圖5顯示HuL2G7、ChL2G7及L2G7相同地阻斷HGF與Met之結合，因此這些單株抗體在此試驗顯示非常類似之活性。
HGF之其他重要生物活性為剌激特定細胞增生之能力，包括Mv 1 Lu鼬肺上皮細胞。為了比較HuL2G7及L2G7中和HGF此活性之能力，生長於含10% FCS之DMEM中之Mv 1 Lu細胞(2×104 細胞/100微升/孔)被再懸浮於無血清DMEM中，並以100微升/孔之HGF(40奈克/毫升)加轉型生長因子－β1(1奈克/毫升，R&D Systems)刺激以降低背景及各種濃度之HuL2G7、L2G7或不相關之對照人抗體刺激。細胞增生之程度藉由添加WST－1(Roche Applied Science)反應14小時後測定。圖6顯示HuL2G7及L2G7在此試驗中具有相同之抑制活性。簡單地說，HuL2G7在所有進行之測試中至少顯示與L2G7相同之活性，因此係完全中和性：在人化過程中無喪失L2G7之活性。
HuL2G7於活體內抑制腫瘤生長之能力
已經有研究顯示，L2G7單株抗體可完全抑制U87膠質瘤異種移植物於裸鼠動物模式之生長(專利申請案USSN10/917915於2004年8月13日提出，及Kim et al.Clin Cancer Res 12：1292，2006)。要證實HuL2G7也具有這種能力，我們採用相同的實驗流程。簡單地說，4至6週齡之NIH III Xid/Beige/Nude母鼠(Charles River Laboratories)以107 細胞於0.1毫升之PBS中經背側皮下注射。當腫瘤大小到達約50立方毫米，將鼠隨機分配至各組(n＝6/組)並腹腔注射40微克之HuL2G7、L2G7或對照劑PBS於0.1毫升體積之PBS中每週二次。每週測定腫瘤之體積，藉由測量二個尺寸(長度a及寬度b)及以V＝ab2 /2計算體積。圖7顯示HuL2G7及L2G7在此試驗中無差異地抑制腫瘤生長。為了進一步定義HuL2G7抑制腫瘤異種移植物生長之能力，在類似試驗中使用4個不同的單株抗體劑量(40微克、20微克、10微克及5微克)。圖8顯示甚至非常低之劑量10微克每週二次可完全抑制腫瘤生長，然而甚至更低之劑量5微克具有良好但不完全之抑制效果。同樣地，全身性投服HuL2G7如L2G7般有效地抑制腦內U87或其他異種移植物之生長。
雖然本發明參照目前較佳之實施態樣加以描述，應了解的是可以進行各種修飾而不偏離本發明。
所有被引述之公開文獻、專利及專利申請案以參照方式整體納入此處以適用所有目的，其程度與個別公開文獻、專利及專利申請案被特別且單獨標示被以參照方式整體納入以適用所有目的相同。
L2G7雜交瘤已經於2003年4月29日依布達佩斯條約寄存於美國菌種保存中心P.O.Box 1549 Manassas，VA 20108，ATCC編號PTA-5162。此寄存將被保持於授權之寄存機構且當發生突變、不存活或毀壞時予以更換，期間為寄存機構接獲最近一次要求釋出樣本之至少5年內、寄存日後至少30年內或在相關專利實施期間內，視較長者為準。所有關於這些細胞系之公眾取得限制將於自該申請案頒發專利時不可撤銷地取消。
圖1.自選殖之cDNAs所轉譯之L2G7成熟重鏈(A)(SEQ ID NO：2)及輕鏈(B)(SEQ ID NO：3)變異區之胺基酸序列。劃線處為CDRs。採用Kabat編號系統。
圖2. HuL2G7重鏈(A)(SEQ ID NO：5)及輕鏈(B)(SEQ ID NO：8)成熟變異區之胺基酸序列與L2G7(SEQ ID NO：4和7)及接受者之V區(SEQ ID NO：6和9)併排顯示。L2G7序列中之CDRs以劃線表示，且HuL2G7序列中經鼠L2G7胺基酸取代之胺基酸以劃線表示，其起始胺基酸 H1E劃雙線表示。採用Kabat編號系統。
圖3.整體HuL2G7重鏈(A)(SEQ ID NO：10)及輕鏈(B)(SEQ ID NO：11)之胺基酸序列。成熟重鏈及輕鏈之第一個胺基酸(也就是經切割信號序列後)以劃雙線表示且標示數字1；這些胺基酸亦為成熟V區之第一個胺基酸。重鏈中CH1、絞鏈區、CH2及CH3之第一個胺基酸被劃線，及輕鏈中Cκ區之第一個胺基酸被劃線。
圖4. HuL2G7、ChL2G7及L2G7與HGF結合之競爭結合試驗。
圖5. HuL2G7、ChL2G7及L2G7阻斷HGF與Met結合之相對能力。
圖6. HuL2G7及L2G7抑制HGF誘發之Mv 1 Lu細胞增生之相對能力。
圖7.以HuL2G7或L2G7單株抗體或PBS對照治療NIH III Beige/裸鼠中U87皮下異種移植物生長之效果。用箭頭表示注射開始，誤差線顯示平均值之標準誤(s.e.m)。L2G7及HuL2G7之圖標重疊，無法在圖中辨識。
圖8.四種不同之HuL2G7劑量對NIH III Beige/裸鼠中U87皮下異種移植物生長之影響。用箭頭表示注射開始，誤差線顯示平均值之標準誤。
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Claims (10)

  1. 一種人化單株抗體(mAb)，其包含成熟重鏈變異區和成熟輕鏈變異區，該成熟重鏈變異區具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列且該成熟輕鏈變異區具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
  2. 一種人化單株抗體，其包含成熟重鏈變異區和成熟輕鏈變異區，該成熟重鏈變異區具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列，惟該成熟重鏈變異區之第一個胺基酸係Gln，且該成熟輕鏈變異區具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
  3. 一種結合並中和人肝細胞生長因子(HGF)之人化單株抗體，其包含人化重鏈和輕鏈，該人化重鏈包含源自SEQ ID NO：4之多個CDR及人重鏈變異區構架，惟所有H29、H30、H48、H66、H67、H71及H94之位置係由SEQ ID NO：4的對應位置之胺基酸所佔據，且該人化輕鏈包含源自SEQ ID NO：7之多個CDR及人輕鏈變異區構架，惟L3和L60之位置係由佔據該SEQ ID NO：7的對應位置之胺基酸所佔據。
  4. 如申請專利範圍第3項之人化單株抗體，惟進一步位置H1係由Glu佔據。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之人化單株抗體，其係屬IgG1，κ同型。
  6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之人化單株抗體，其係如自寄存編號BCRC 960305之小鼠融合瘤所產製之單株抗體般中和人肝細胞生長因子(HGF)之生物活性。
  7. 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項之人化單株抗體於製造藥物之用途，該藥物係用於治療癌症。
  8. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該癌症係神經膠母細胞瘤。
  9. 一種細胞系，其產製如申請專利範圍第1至3項中任一項之人化單株抗體。
  10. 一種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第1至3項中任一項之人化單株抗體。
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