BRPI0709932A2 - anticorpo monoclonal humanizado, região variável de cadeia pesada de anticorpo monoclonal humanizado, linha de células, composição farmacêutica, método de tratar cáncer em uma paciente, e, uso de um anticorpo monoclonal - Google Patents

Abstract

<B>ANTICORPO MONOCLONAL HUMANIZADO, REGIAO VARIáVEL DE CADEIA PESADA DE ANTICORPO MONOCLONAL HUMANIZADO, LINHA DE CéLULAS, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, MéTODO DE TRATAR CáNCER EM UM PACIENTE, E, USO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL<D>A presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal neutralizador humanizado para fator de crescimento de hepatócitos, uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo, e métodos de tratamento compreendendo administrar uma composição farmacêutica do tipo referido a um paciente.

Description

A O MONOCLONAL HUMANIZADO, REGIÃO VARIÁVELDE CADEIA PESADA DE ANTICORPO MONOCLONALHUMANIZADO, LINHA DE CÉLULAS, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAR CÂNCER EM UMPACIENTE, E, USO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL"

Referência cruzada com pedido relacionado

O presente pedido é um não-provisional de USSN 60/788.243depositado em 01 de abril de 2006, que é incorporado aqui integralmente porreferência para todos os fins.

Declaração de interesse governamental

O trabalho descrito neste pedido foi patrocinado, em parte,pela concessão 2R44CA101283-02 dos Institutos Nacionais da Saúde[National Institutes of Health]. O governo dos E.U.A. pode possuirdeterminados direitos nesta invenção.

Campo da invenção

A presente invenção refere-se, de uma maneira geral, àcombinação de anticorpo monoclonal (mAB) e tecnologias de DNArecombinante para desenvolver biologias inéditas, e, mais particularmente,por exemplo, à produção de anticorpos monoclonais humanizados que seligam a, e neutralizam o Fator de Crescimento de Hepatócitos.

Fundamentos da invenção

O Fator de Crescimento de Hepatócitos (HGF, HepatocyteGrowth Factor) humano é um polipeptídeo heterodimérico multifuncionalproduzido por células mesenquimais. Mostrou-se que o HGF estimula aangiogênese, morfogênese e motogênese, e também o crescimento edisseminação de vários tipos de células (Bussolino et al., J. Cell. Biol. 119:629, 1992; Zarnegar e Michalopoulos, J. Cell. Biol. 129:1177, 1995;Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier e Gherardi,Trends Cell. Biol. 8:404, 1998; Xin et al. Am. J. Pathol. 158:1111, 2001). Asatividades pleiotrópicas do HGF são mediadas através de seu receptor, umatirosina quinase de transmembrana codificada pelo proto-oncogene cMet.Adicionalmente à regulação de uma variedade de funções celulares normais,mostrou-se que HGF e seu receptor c-Met estão envolvidos na iniciação,invasão e metástase de tumores (Jeffers et al., J. Mol. Med. 74:505, 1996;Comoglio e Trusolino, J. Clin. Invest. 109:857, 2002). HGF/cMet sãocoexpressos, freqüentemente super-expressos, em diversos tumores sólidoshumanos, incluindo tumores derivados do pulmão, colo, reto, estômago, rim,ovário, pele, mieloma múltiplo e tecido da tireóide (Prat et al., Int. J. Câncer49:323, 1991; Chan et al., Oncogene 2:593, 1988; Weidner et al., Am. J.Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993; Derksen et al., Blood 99:1405, 2002). OHGF atua como um fator de crescimento autócrino (Rong et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 91 :4731, 1994; Koochekpour et al., Câncer Res. 57:5391,1997) e parácrino (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229,1993) e regulador anti-apoptótico (Gao et al., J. Biol. Chem. 276:47257,2001) para estes tumores.

HGF é uma proteína de 102 kDa com similaridade deseqüência e estrutural ao plasminogênio e outras enzimas da coagulação dosangue (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Weidner et al., Am. J. Respir.Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993). O HGF humano é sintetizado como umprecurso de 728 aminoácidos (preproHGF), que sofre clivagem intracelularpara uma forma de cadeia simples, nativa (proHGF) (Nakamura et al., Nature342:440, 1989; Rosen et al., J. Cell. Biol. 127:1783, 1994). Quando dasecreção extracelular, proHGF é clivado dando a molécula heterodiméricaligada a dissulfeto biologicamente ativa constituída de uma subunidade α e deuma subunidade β (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Naldini et al.,EMBO J. 11 :4825, 1992). A subunidade α contém 440 radicais (69 kDa comglicosilação), consistindo do domínio de grampo-de-cabelo N-terminal equatro domínios kringle. A subunidade β contém 234 radicais (34 kDa) eapresenta um domínio parecido com serina protease, que não apresentaatividade proteolítica. HGF possui dois sítios de ligação específicos únicospara células: um sítio de ligação de alta afinidade (Kd = 2x IO"10 M) para oreceptor cMet, e um sítio de ligação de baixa afinidade (Kd = IO"9 M) paraproteoglicanos de sulfato de heparina (HSPG, heparin sulfate proteoglycans),que estão presentes sobre a superfície da célula e matriz extracelular (Naldiniet al., Oncogene 6:501, 1991; Bardelli et al., J. Biotechnol. 37:109, 1994;Sakata et al., J. Biol. Chem., 272:9457, 1997).

O receptor de cMet é um membro da família de receptores de proteína tirosina quinase de classe IV. O gene cMet de comprimento pleno foiclonado e identificado como o proto-oncogene cMet (Cooper et al., Nature311:29, 1984; Park et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:6379, 1987). NK2(uma proteína que compreende a ponta N e primeiros dois domínios kringleda subunidade a) é suficiente para a ligação a cMet e ativação da cascata de sinais para motilidade, contudo a proteína de comprimento pleno é necessáriapara a resposta mitogênica (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.8:229, 1993). HSPG liga-se ao HGF por meio de interação com a ponta N doHGF.

Reportou-se que HGF/cMet desempenham papéis importantes em vários aspectos do desenvolvimento do câncer, como iniciação de tumor,invasão, metástase, regulação de apoptose e angiogênese. Diversasabordagens diferentes foram investigadas para se obter uma moléculaantagonista eficaz: proteínas de HGF truncadas, como NKl (domínio N-terminal mais domínio kringle 1; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268:17145, 1993), NK2 (domínio N-terminal mais domínios kringle 1 e 2; Chan et al.,Science 254:1382, 1991) e NK4 (domínio N-terminal mais quatro domínioskringle; Kuba et al., Câncer Res. 60:6737, 2000), mAbs anti-cMet (Dodge,Master's Thesis [tese de mestrado], San Francisco State University, 1998) emAbs anti-HGF (Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001, que éincorporada aqui por referência).

NKl e NK2 podem competir eficazmente pela ligação do HGFa seu receptor, mas reportou-se que apresentam atividades agonistas parciaisin vitro (Cioce et al., J. Biol. Chem. 271:13110, 1996; Schwall et al., J. CellBiol. 133:709, 1996), ao invés de atividades puramente antagonistas,conforme desejado. Mais recentemente, Kuba et al., Câncer Res. 60:6737,2000, reportaram que NK4 poderia inibir facilmente o crescimento primário ea metástase de LLC de tumor de pulmão murino em um modelo decamundongo nu por meio de infusão contínua de NK4. No entanto, o fato deque NK4 precisou ser administrado continuamente para se obter uma inibiçãoparcial do crescimento de tumores primários indica uma meia-vidapotencialmente curta da molécula de NK4 e/ou falta de potência.

Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:7443, 2001,reportaram que a administração de um coquetel de três mAbs anti-HGF, queforam selecionados com base em sua capacidade de inibir a atividade dedisseminação do HGF in vitro, foi capaz de inibir o crescimento de tumoreshumanos no modelo de xenoenxerto em camundongo nu. Eles postularam queforam necessários três mAbs que reconhecem três diferentes sítios de ligaçãono HGF para inibir as bioatividades do HGF in vivo: dois mAbs inibiram aligação do HGF a cMet e um mAb inibiu a ligação do HGF à heparina.

Recentemente reportou-se acerca de mAbs humanos que seligam individualmente e neutralizam o HGF desenvolvido usando-setecnologia transgênica em camundongos (Burgess et al., WO 2005/017107A2e Burgess et al., Câncer Res 66:1721, 2006, cada uma incorporada aqui porreferência para todos os fins). No entanto, destes, pelo menos o mAb 2.12.1,que aparentemente foi o mais potente em modelos de xenoenxerto de tumor,ainda assim não inibiu a angiogênese. Desenvolveu-se um mAb decamundongo L2G7 que neutraliza todas as atividades biológicas testadas doHGF incluindo angiogênese (Pedido de patente USSN 10/917.915 depositadoem 13 de agosto de 2004, e Kim et al. Clin Câncer Res 12:1292, 2006, cadaum dos quais incorporado aqui por referência para todos os fins).

Assim, há uma necessidade de um anticorpo monoclonalhumanizado que bloqueie a atividade biológica do HGF in vitro e in vivo. Apresente invenção preenche esta e outras necessidades.

Sumário da invenção reivindicada

Em uma concretização, a invenção proporciona um mAbneutralizador humanizado para Fator de Crescimento de Hepatócitos (HGF)humano. O mAb inibe pelo menos uma e, de preferência, várias ou todas asatividades biológicas do HGF incluindo ligação a seu receptor cMet, induçãode disseminação de células, como células de rim canino Madin-Darby,indução da proliferação de células enodoteliais de pulmão de mink Mv 1 Lue/ou hepatócitos e/ou HUVEC, e estimulação de angiogênese. Um mAb anti-HGF humanizado preferido inibe, mais preferivelmente inibe completamente,o crescimento de um xenoenxerto de tumor humano em um camundongo. Emuma concretização preferida, o mAb humanizado é um mAb L2G7humanizado. Em uma concretização particularmente preferida, as regiõesvariáveis de cadeia pesada e leve do mAb apresentam as seqüênciasmostradas nas linhas marcadas HuL2G7 na Fig. 2A e Fig. 2Brespectivamente, ou seqüências que são pelo menos 90 % ou mais idênticas àsmesmas. Em outra concretização, a invenção proporciona um anticorpomonoclonal (mAB) humanizado que se liga a, e neutraliza o Fator deCrescimento de Hepatócitos (HGF) humano, sendo que o anticorpohumanizado compreende cadeias pesada e leve humanizadas. A cadeia pesadahumanizada compreende CDRs de L2G7 e uma estrutura de região variávelde cadeia pesada humana, desde que pelo menos uma posição da estrutura deregião variável de cadeia pesada humana selecionada do grupo que consistede H29, H30, H48, H66, H67, H71, H94 seja ocupada pelo aminoácido queocupa a posição correspondente na cadeia pesada de L2G7. A cadeia levehumanizada compreende CDRs de L2G7 e uma estrutura de região variávelde cadeia leve humana, desde que pelo menos uma posição selecionada dogrupo que consiste de L3 e L60 seja ocupada pelo aminoácido que ocupa aposição correspondente na cadeia leve de L2G7.

Linhas de células que produzem referidos anticorposhumanizados também são proporcionadas. Em outra concretização,proporciona-se uma composição farmacêutica compreendendo um mAbL2G7 humanizado. Em uma terceira concretização, a composiçãofarmacêutica é administrada a um paciente (tipicamente um paciente humano)para tratar câncer ou outra doença.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1. Seqüências de aminoácidos das regiões variáveis decadeia pesada (A) e de cadeia leve (B) maduras de L2G7 traduzidas doscDNAs clonados. As CDRs são sublinhadas. Usa-se o sistema de numeraçãoKabat.

Figura 2. Seqüências de aminoácidos das regiões variáveismaduras de cadeia pesada (A) e de cadeia leve (B) de HuL2G7 são mostradasalinhadas com L2G7 e regiões V receptoras. As CDRs são sublinhadas nasseqüências de L2G7, e os aminoácidos substituídos por aminoácidos de L2G7de camundongo são sublinhados nas seqüências de HuL2G7, com oaminoácido inicial Hl E duplamente sublinhado. Usa-se o sistema denumeração Kabat.

Figura 3. Seqüências de aminoácidos de toda a cadeia pesada(A) e a cadeia leve (B) de HuL2G7. Os primeiros aminoácidos das cadeiaspesada e leve maduras (i.e., após clivagem das seqüências-sinal) encontram-sesublinhados duplamente e marcados com o número 1; estes aminoácidostambém são os primeiros aminoácidos das regiões V maduras. Na cadeiapesada, os primeiros aminoácidos das regiões CHI, dobradiça, CH2 e CH3encontram-se sublinhados, e, na cadeia leve, o primeiro aminoácido da regiãoCk encontra-se sublinhado.

Figura 4. Ensaio de ligação competitiva de HuL2G7, ChL2G7e L2G7 quanto à ligação ao HGF.

Figura 5. Capacidade relativa de HuL2G7, ChL2G7 e L2G7para bloquear a ligação do HGF t Met.

Figura 6. Capacidade relativa de HuL2G7 e L2G7 em inibir aproliferação de células Mv 1 Lu induzida com HGF.

Figura 7. Efeito do tratamento com mAb de HuL2G7 ou L2G7ou controle de PBS sobre o crescimento de enxertos exógenos subcutâneos deU87 nos grupos de camundongos NIH III Bege/Nus. A seta indica quando asinjeções começaram, e barras de erro apresentam erro padrão da média [EPMou s.e.m.,]. Os símbolos para L2G7 e HuL2G7 se superpõem e não podem serdiferenciados na figura.

Figura 8. Efeito de quatro níveis diferentes de doses deHuL2G7 sobre o crescimento de enxertos exógenos subcutâneos de U87 emgrupos de camundongos NIH III Bege/Nus. A seta indica quando as injeçõescomeçaram, e barras de erro mostram s.e.m.Descrição detalhada das concretizações preferidas

A invenção proporciona anticorpos monoclonais anti-HGFneutralizadores humanizados, composições farmacêuticas compreendendo osmesmos, e métodos de usar os mesmos para o tratamento de doença.1. Anticorpos

Anticorpos são moléculas complexas muito grandes (pesomolecular de -150.000 ou cerca de 1320 aminoácidos) com estrutura internaintrincada. Uma molécula de anticorpo natural contém dois pares idênticos decadeias de polipeptídeos, sendo que cada par apresenta uma cadeia leve e umacadeia pesada; de modo que a unidade estrutural fundamental de um anticorpoé um tetrâmero. Cada cadeia leve e cadeia pesada consiste, por sua vez, deduas regiões: uma região variável ("V") envolvida na ligação do antígeno-alvo, e uma região constante ("C") que interage com outros componentes dosistema imune. As regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesadadobradas juntas em espaço 3-dimensional para formar uma região variávelque se liga ao antígeno (por exemplo, um receptor sobre a superfície de umacélula). Em cada região variável de cadeia leve ou de cadeia pesada, há trêssegmentos curtos (com, em média, 10 aminoácidos de comprimento)denominados de regiões determinadoras de complementaridade ("CDRs"). Asseis CDRs em um domínio variável de anticorpo (três da cadeia leve e três dacadeia pesada) são dobradas conjuntamente em espaço 3-D para formar oefetivo sítio de ligação de anticorpo que se fixa no antígeno-alvo. A posição eo comprimento das CDRs foram definidas precisamente. Ver Kabat, E. et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest [Seqüências de proteínas deinteresse imunológico], U.S. Department of Health and Human Services,1983, 1987, que são incorporadas aqui por referência. A parte de uma regiãovariável não contida nas CDRs é denominada de estrutura, que forma oambiente para as CDRs. Em cada cadeia, as três CDRs encontram-seinterdispersadas com quatro seções de estrutura, nesta ordem: FRl, CDRl,FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesada e levemaduras de imunoglobulinas são designadas Hx e Lx respectivamente, sendoque χ é um número que indica a posição de um aminoácido de acordo com oesquema de Kabat, op. cit. Kabat lista muitas seqüências de aminoácidos comrelação a anticorpos para cada subgrupo, e lista o aminoácido que ocorre commaior freqüência para cada posição de radical naquele subgrupo para geraruma seqüência de consenso. Kabat usa um método para atribuir um númerode radical a cada aminoácido em uma seqüência listada, e este método paraatribuir números de radicais tornou-se um padrão neste campo. O esquema deKabat pode ser estendido a outros anticorpos não incluídos neste compêndiomediante alinhamento do anticorpo em questão com uma das seqüências deconsenso em Kabat com referência a aminoácidos conservados. O uso dosistema de numeração de Kabat identifica facilmente aminoácidos emposições equivalentes em diferentes anticorpos. Por exemplo, um aminoácidona posição L50 de um anticorpo humano ocupa a posição equivalente a umaposição de aminoácido L50 de um anticorpo de camundongo. Além disso,quaisquer duas seqüências de anticorpos podem ser alinhadas de forma única,por exemplo, para determinar o percentual de identidade, mediante o uso dosistema de numeração de Kabat de forma que cada aminoácido em umaseqüência de anticorpos é alinhado com o aminoácido na outra seqüência quetem o mesmo número Kabat. Após o alinhamento, se uma região doanticorpo-objeto (p. ex., toda a região variável madura de uma cadeia pesadaou de uma cadeia leve) for comparada com a mesma região de um anticorpode referência, o percentual de identidade de seqüências entre as regiões deanticorpo sujeito e de referência é o número de posições ocupadas pelomesmo aminoácido, tanto na região de anticorpo do sujeito como na dereferência, dividido pelo número total de posições alinhadas das duas regiões,sem contar os intervalos, multiplicado por 100 para conversão a umpercentual.

Um anticorpo monoclonal (mAB) é uma espécie molecularsimples de anticorpo e, portanto, não compreende anticorpos policlonaisproduzidos injetando-se um animal (como um roedor, coelho ou cabra) comum antígeno, e extraindo-se soro do animal. Um anticorpo humanizado é umanticorpo (monoclonal) manipulado geneticamente em que as CDRs de umanticorpo de camundongo ("anticorpo doador", que também pode ser um rato,hâmster ou outra espécie similar) são enxertadas sobre um anticorpo humano("anticorpo receptor"). Anticorpos humanizados também podem serpreparados com CDRs menos completas de um anticorpo de camundongo (p.ex., Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002). Da forma mais comum, aprimeira alça Hl hipervariável de cadeia pesada, como definido por Chothia& Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987, do anticorpo do doador também étransferida ao anticorpo humanizado. Assim, um anticorpo humanizado é umanticorpo apresentando CDRs de um anticorpo doador e estruturas de regiãovariável e regiões constantes de anticorpos humanos. As estruturas dereceptor de cadeia leve e pesada podem ser dos mesmos anticorpos humanosou de anticorpos humanos diferentes, e podem ser um composto de duas oumais estruturas de anticorpo humano; ou, alternativamente, podem ser umaseqüência de consenso de um conjunto de estruturas humanas (p. ex., umsubgrupo de anticorpos humanos como definido em Kabat et al, op. cit.), i.e.,uma seqüência apresentando o aminoácido mais comumente ocorrente noconjunto, em cada posição. Adicionalmente, para conservar elevada atividadede ligação, é possível empregar pelo menos um dos elementos estruturaisadicionais. Ver, Queen et al., Patentes dos Estados Unidos nums. 5.530.101 e5.585.089, cada uma incorporada aqui por referência, que proporcionaminstruções detalhadas para a construção de anticorpos humanizados.

No primeiro elemento estrutural, a estrutura da região variávelde cadeia pesada do anticorpo humanizado é selecionada de forma aapresentar elevada identidade de seqüências (pelo menos 65 %) com aestrutura da região variável de cadeia pesada do anticorpo doador, medianteseleção apropriada do anticorpo aceptor dentre os muitos anticorpos humanosconhecidos. No segundo elemento, na construção do anticorpo humanizado,aminoácidos selecionados na estrutura do anticorpo aceptor humano (fora dasCDRs) são substituídos por aminoácidos correspondentes do anticorpodoador, de acordo com regras especificadas. Particularmente, os aminoácidosa serem substituídos na estrutura são selecionados geralmente com base emsua capacidade de interagir com as CDRs. Por exemplo, os aminoácidossubstituídos podem ser adjacentes a uma CDR na seqüência de anticorpodoador ou dentro de 4 a 6 angstroms de uma CDR no anticorpo humanizadoconforme medido em espaço 3-dimensional.Por outro lado, como mAbs humanizados se originam de ummAb doador não-humano, mAbs humanizados não compreendemsubstancialmente mAbs humanos preparados isolando-se ácidos nucleicos quecodificam regiões variáveis de um humano, e selecionando-se os mesmosusando métodos de apresentação de fago (ver, p. ex., Dower et al.,WO91/17271; McCafferty et al., WO92/001047; Winter, WO92/20791; eWinter, FEBS Lett. 23:92, 1998) ou com o uso de camundongos transgênicos(ver, p. ex., Lonberg et al., WO93/12227; Kucherlapati WO91/10741, eBurgess et al. WO 2005/027107A2).

O epítopo de um mAb é a região do seu antígeno a que o mAbse liga. Dois anticorpos ligam-se ao mesmo epítopo ou epítopo que sesobrepõe, se cada um inibir competitivamente (bloquear) a ligação do outroao antígeno. Ou seja, um excesso de lx, 5x, IOx, 20x ou IOOx de umanticorpo inibe a ligação do outro em pelo menos 50 %, mas, de preferência,em 75 %, 90 % ou mesmo 99 % conforme medido em um ensaio de ligaçãocompetitiva (ver, p. ex., Junghans et al., Câncer Res. 50:1495, 1990).Alternativamente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo se todas as mutaçõesde aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam ligação do anticorporeduzem ou eliminam ligação do outro. Dois anticorpos apresentam epítoposque se sobrepõem se algumas mutações de aminoácidos que reduzem oueliminam a ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem a ligação dooutro.

2. Anticorpos anti-HGF humanizados neutralizadoresAfirma-se que um anticorpo monoclonal (mAB) que se liga aoHGF (i.e., um mAb anti-HGF) neutraliza o HGF, ou é neutralizador, se aligação inibir parcialmente ou completamente uma ou mais atividadesbiológicas do HGF (i.e., quando o mAb é usado como um agente simples).Entre as propriedades biológicas do HGF que um anticorpo neutralizadorpode inibir encontram-se a capacidade do HGF ligar-se a seu receptor decMet, para causar a disseminação de determinadas linhas de células, comocélulas de rim canino Madin-Darby (MDCK); para estimular a proliferação de(i.e., ser mitogênico para) determinadas células, incluindo hepatócitos, célulasepiteliais de pulmão de mink Mv 1 Lu, e várias células de tumor humano; oupara estimular a angiogênese, por exemplo, conforme medido pelaestimulação da proliferação de células endoteliais vasculares umbilicaishumanas (HUVEC) ou formação de tubo ou por meio de indução de vasossangüíneos quando aplicado na membrana corioalantóica de embrião defrango (CAM). Anticorpos da invenção ligam-se, de preferência, a HGFhumano, i.e., à proteína codificada pela seqüência GenBank com número deacesso D90334.

Um mAb neutralizador humanizado da invenção, a umaconcentração de, p. ex., 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 ou 50 μg/ml inibirá umafunção biológica do HGF (p. ex., estimulação de proliferação oudisseminação) em cerca de pelo menos 50 %, mas, de preferência, em 75 %,mais preferivelmente em 90 % ou 95 % ou mesmo 99 %, e, da forma maispreferível, em aproximadamente 100 % (substancialmente completamente)como analisado por meio de métodos descritos sob os Exemplos ouconhecidos na arte. Tipicamente, mede-se a extensão da inibição quando aquantidade de HGF usada for apenas suficiente para estimular totalmente aatividade biológica, ou é 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 3 ou 10 μg/ml. Depreferência, pelo menos 25 %, 50 %, 75 %, 90 %, ou 95 % ou inibiçãosubstancialmente completa será obtida quando a relação molar de anticorpopara HGF de 0,lx, 0,5x, lx, 2x, 3x, 5x ou IOx. Da forma mais preferível, omAb neutralizará não só uma, mas várias das atividades biológicas listadasacima; para os fins aqui apresentados, um mAb anti-HGF que neutraliza todasas atividades biológicas do HGF será denominado "totalmente neutralizador",e referidos mAbs são mais preferíveis. De preferência, MAbs da invençãoligam-se especificamente ao HGF, ou seja, se ligarão, ou apenas em graumuito menor, a proteínas que são relacionadas com o HGF, como fator decrescimento de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento endotelial vascular(VEGF). MAbs da invenção apresentam tipicamente uma afinidade de ligação(Ka) por HGF de pelo menos 10⁷ M-¹, mas, de preferência, de 10⁸ M-1 oumais, e, da forma mais preferível, 1O M-1 ou mais, ou mesmo 1O¹⁰ M-1 oumais.

mAbs humanizados da invenção incluem anticorpos anti-HGFem sua forma tetramérica natural (2 cadeias leves e 2 cadeias pesadas) epodem ser de qualquer um dos isótipos conhecidos IgG, IgA, IgM, IgD e IgEe seus subtipos, i.e., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, e podem compreender umacadeia leve κ ou λ. Os mAbs da invenção também incluem fragmentos deanticorpos, como Fv, Fab e F(ab')2; anticorpos híbridos bifuncionais (p. ex.,Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987), anticorpos de cadeiasimples (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al.,Science 242:423, 1988); e anticorpos com regiões constantes alteradas (p. ex.,Patente dos Estados Unidos n° 5.624.821). A fonte das CDRs do mAb podeser de origem animal (p. ex., camundongo, rato, hâmster ou frangos), ou elapode ser manipulada geneticamente. mAbs de roedores podem ser preparadospor meio de métodos convencionais bem conhecidos na arte, compreendendoimunização múltipla com HGF em adjuvante apropriado i.p., i.v., ou naalmofada da pata, seguido de extração de células de nódulos linfáticos ou dobaço, e fusão com uma linhas de células imortalizada vantajosa, e, depois,seleção de hibridomas que produzem ligação de anticorpo a HGF.

A invenção proporciona formas humanizadas do mAb L2G7de camundongo. As seqüências das regiões variáveis de cadeia pesada e levemaduras do mAb L2G7 de camundongo são mostradas na Fig. 1A e 1B,respectivamente. Conseqüentemente, formas humanizadas do mAb L2G7compreendem a maior parte de todos os aminoácidos de CDR destasseqüências em estruturas de região variável humana (incluindo estruturas deseqüências humanas simples, compostas ou de consenso). Por exemplo,alguns anticorpos humanizados incluem três CDRs intactas da cadeia pesadade L2G7 e três CDRs intactas da cadeia leve. Outros anticorpos humanizadosincluem pelo menos uma CDR intacta da cadeia pesada de L2G7 e pelomenos uma CDR intacta da cadeia leve de L2G7. Alguns anticorposhumanizados incluem pelo menos uma CDR em que alguns radicais são daCDR correspondente de L2G7 e os outros são de uma CDR de um anticorpohumano, de preferência, o mesmo anticorpo humano que suprimentos daestrutura de região variável contendo a CDR.

Em alguns anticorpos humanizados da invenção, pelo menos1, 3, 5 ou todas as posições selecionadas do grupo H29, H30, H48, H66, H67,H71, H94, L3, e L60 são ocupadas por um aminoácido presente na posiçãocorrespondente de acordo com a numeração Kabat no anticorpo L2G7 decamundongo. Nas estruturas de região variável de aceptor humano usadas nosExemplos, todas estas posições são ocupadas por radicais humanos quediferem do aminoácido presente na posição correspondente no anticorpoL2G7 de camundongo. Assim, é preferível substituir todas ou quase todas asposições selecionadas do grupo. Caso se use outras estruturas de regiãovariável humana, algumas das posições podem ser ocupadas por aminoácidosque são os mesmos na estrutura de região variável humana e o anticorpoL2G7 de camundongo. Assim, não se realiza substituição nessas posições,mas pode ser realizada em outras posições que diferem quanto à estrutura deregião variável humana e anticorpo L2G7 de camundongo de acordo com asregras de Queen, US 5.530.101 e US 5.585.089. Independentemente daescolha da estrutura de região variável humana, também é possível asubstituição de outros aminoácidos além daqueles especificados no grupoacima como discutido abaixo. No entanto, em geral, nem a região variável decadeia pesada estrutura, nem a estrutura de região variável de cadeia leve doanticorpo humanizado inclui mais do que dez ou doze substituições,resultando em radicais não presentes na estrutura de região variável humanade aceptor (incluindo estruturas de região variável consenso humanas eestruturas de região variável humanas compostas, como discutido acima).

Quaisquer regiões constante presentes nos anticorposhumanizados da invenção são humanas ou substancialmente humanas,apresentando não mais do que dez, e, de preferência, duas ou menossubstituições relativas a uma região constante humana natural. Algumassubstituições são vantajosas para aumentar a meia-vida de um anticorpo e/ousua afinidade por FcyRn, como discutido abaixo. Outras substituições,usualmente substituições conservativas, como discutido abaixo, têm efeitoneutro.

Formas humanizadas exemplificadas de L2G7 incluem regiõesvariáveis de cadeia pesada e leve maduras apresentando as seqüênciasmostradas na Fig. 2A e 2B, respectivamente. Outras formas preferidas deL2G7 humanizado incluem regiões variáveis de cadeia pesada e leve madurasapresentando seqüências pelo menos 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % idênticas aestas seqüências (quando alinhadas de acordo com a numeração Kabat,acima), e/ou diferem das mesmas por um pequeno número (envolvendotipicamente não mais do que 5 ou 10 aminoácidos) de substituiçõesfuncionalmente inconseqüentes, deleções e/ou inserções. Por exemplo, oprimeiro aminoácido da cadeia pesada pode ser Glu ou Gln. As substituiçõessão usualmente conservativas, ou seja, substituem um aminoácido por um queé quimicamente similar. Para fins de classificar substituições de aminoácidoscomo conservativas ou não-conservativas, aminoácidos podem ser agrupadoscomo a seguir: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas): Met, Ala, Vai, Leu,lie; Grupo II (cadeias laterais hidrofílicas neutras): Cys, Ser, Thr; Grupo III(cadeias laterais ácidas): Asp, Glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): Asn,Gln, His, Lys, Arg; Grupo V (radicais que influenciam a orientação dacadeia): Gly, Pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): Trp, Tyr, Phe.Substituições conservativas são aquelas que envolvem substituições entreaminoácidos no mesmo grupo. Substituições relativas às regiões V na Fig. 2Ae 2B são evitadas, de preferência, nas posições H29, H30, H48, H66, H67,H71, H94, L3, e L60, onde aminoácidos de camundongo L2G7 foramincluídos devido à interação destas posições com CDRs, como discutido nosExemplos. Substituições ocorrem, de preferência, em posições de estrutura deregião variável, mas também podem ocorrer em regiões CDR. Se uma regiãoCDR for substituída, é preferível substituir um aminoácido de camundongopor um aminoácido da posição correspondente (numeração Kabat) de umanticorpo humano, de preferência, o mesmo anticorpo humano que supre asestruturas de região variável de aceptor.

Usualmente, os mAb L2G7 humanizados são de isótipo IgG1,IgG2, IgG3 ou IgG4 com uma cadeia leve κ. Um mAb de IgGl apresentandoas regiões variáveis da Fig. 2A e 2B combinadas respectivamente com regiãoconstante κ e gama-1 humana completa é denominado HuL2G7. As cadeiasleve e pesada completas de HuL2G7 são mostradas respectivamente na Fig.3A e 3B. Apenas as partes maduras destas seqüências começando nasposições indicadas pelo número 1 constituem eficazmente HuL2G7, porqueos peptídeos-sinal precedentes são removidos por clivagem antes ou durante asecreção do anticorpo.

Variantes de HuL2G7 que conservam características deligação similares a HuL2G7 podem ser obtidas por meio de mutagênese,seguida de seleção de massa usando-se os métodos de apresentação de fagodiscutidos acima. Variantes são selecionadas inicialmente quanto à ligaçãoespecífica ao HGF5 opcionalmente competindo com HuL2G7 ou L2G7 decamundongo. Variantes apresentando as mesmas características de ligação ououtras similares às do anticorpo exemplificado podem então ser testadasfuncionalmente.

mAb L2G7 humanizados preferidos são neutralizadores outotalmente neutralizadores contra HGF como definido acima. De preferência,no caso de algumas, da maioria ou de todas as propriedades biológicasmedidas do HGF (p. ex., ligação a Met, estimulação de proliferação de célulasMv 1 Lu ou HUVEC), a atividade neutralizadora do mAb humanizado é decerca de 3 vezes, mais preferivelmente de 2 vezes, ou de 1,5 vez, e, da formamais preferivelmente é indistinguível (i.e., dentro do erro experimental), comrelação à atividade neutralizadora do L2G7 propriamente dita. Ou seja, não épreciso mais do que 3 vezes, 2 vezes, 1,5 vez, ou a mesma quantidade demAb humanizado relativamente a L2G7 para se obter a mesma extensão deinibição da propriedade biológica (por exemplo, conforme medido com baseem IC50). De preferência, a afinidade por HGF dos mAbs humanizadostambém é de 3 vezes, 2 vezes, ou substancialmente indistinguível daquela deL2G7. De forma similar, em modelos de xenoenxerto de camundongo (p. ex.,usando-se uma linhas de células de glioma humano, como U87), os mAbshumanizados inibem, de preferência, crescimento do tumor a 3 vezes, 2 vezes,ou indistinguivelmente do mAb L2G7 de camundongo. Eficazmente, depreferência, apenas 40, 20 ou mesmo 10 μg de dose de mAb humanizadoadministrados duas vezes por semana inibem completamente o crescimentode enxertos exógenos de tumor U87.

mAbs humanizados podem ser expressos por uma variedadede métodos conhecidos na arte. Por exemplo, genes que codificam suasregiões V de cadeia leve e pesada podem ser sintetizadas primeiro deoligonucleotídeos que se sobrepõem ou por meio de mutagênese com PCR deuma variante preparada antes do gene desejado. Devido à degeneração docódigo genético, uma variedade de seqüências de DNA codifica cadaseqüência de aminoácidos de anticorpo. Todas as seqüências de DNA quecodificam os anticorpos descritos nesta pedido são incluídas expressamentena invenção. No entanto, os genes que codificam os genes de cadeia leve e decadeia pesada de mAb humanizado e inseridos em conjunto com regiões C emvetores de expressão (p. ex., comercialmente obteníveis da Invitrogen) queproporcionam as regiões reguladoras necessárias, p. ex., promotores,acentuadores, sítios de poli A, etc. Prefere-se o uso do promotor-acentuadorde CMV. Genes para regiões C encontram-se disponíveis agora ou podem serfacilmente clonados com PCR a partir de células humanas produtoras deanticorpos. Os genes de cadeia leve e de cadeia pesada podem ser inseridosconjuntamente em um vetor simples ou em vetores separados. Os vetores deexpressão podem, então, ser transferidos usando-se diversos métodosconhecidos na arte, como lipofecção ou electroporação em uma variedade delinhas de células mamíferas, como CHO ou 293 ou mielomas não-produtoresincluindo Sp2/0 e NSO, e células expressando os anticorpos selecionados pormeio de seleção apropriada com antibióticos. Ver, p. ex., Patente dos Estados

Unidos n° 5.530.101. E possível produzir quantidades maiores de anticorpodesenvolvendo-se as células em biorreatores comercialmente obteníveis.

Uma vez expressos, os mAbs humanizados da invenção podemser purificados de acordo com procedimentos convencionais da arte, comomicrofiltração, ultrafiltração, cromatografia de afinidade de proteína A ou G,cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca de ânion,cromatografia de troca de cátion e/ou outras formas de cromatografia deafinidade com base em corantes orgânicos ou análogos. Prefere-se anticorpossubstancialmente puros com, pelo menos, cerca de 90 ou 95 % dehomogeneidade, e prefere-se mais anticorpos com 98 % ou 99 % ou mais dehomogeneidade, para usos farmacêuticos.

3. Métodos terapêuticos

Em uma concretização preferida, a presente invençãoproporciona uma formulação farmacêutica compreendendo os anticorposhumanizados descritos aqui. Formulações farmacêuticas dos anticorposcontêm o mAb em um veículo fisiologicamente aceitável, opcionalmente comexcipientes ou estabilizantes, em forma de soluções liofilizadas ou aquosas.Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não-tóxicos pararecipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluemtamponadores, como fosfato, citrato, ou acetato a um pH de, tipicamente, 5,0a 8,0, o mais freqüentemente de 6,0 a 7,0; sal, como cloreto de sódio, cloreto de potássio, etc. para se obter isotonia; antioxidantes, conservantes,polipeptídeos com baixo peso molecular, proteínas, polímeros hidrofílicos,como polissorbato 80, aminoácidos, carboidratos, agentes quelantes, açúcares,e outros ingredientes conhecidos por aqueles versados na arte (verRemington's Pharmaceutical Science 16a edição, Osol, A. Ed. 1980). O mAbestá presente, tipicamente, numa concentração de 1 a 100 mg/ml, p. ex., de 10mg/ml.

Em outra concretização preferida, a invenção proporciona ummétodo de tratar um paciente com uma doença usando-se um mAb anti-HGFhumanizado, como L2G7 humanizado, p. ex., HuL2G7, em uma formulação farmacêutica. O mAb preparado em uma formulação farmacêutica pode seradministrado a um paciente por meio de qualquer via vantajosa,especificamente por via parenteral por meio de infusão intravenosa ou injeçãode bolo, intramuscularmente ou subcutaneamente. Infusão intravenosa podeser administrada ao longo de meros 15 minutos, porém, com mais freqüentemente, ao longo de 30 minutos, ou ao longo de 1, 2 ou mesmo de 3horas. O mAb também pode ser injetado diretamente no sítio de doença (p.ex., um tumor), ou encapsulado em agentes de suporte, como liposomas. Adose administrada é suficiente para aliviar a condição que está sendo tratada("dose terapeuticamente eficaz") e provavelmente é de 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal, por exemplo 1, 2, 3 ou 4 mg/kg, mas pode ser de até 10 mg/kg oumesmo de 15 ou 20 mg/kg. Também é possível administrar uma dose unitáriafixa, por exemplo, 50, 100, 200, 500 ou 1000 mg, ou a dose pode basear-se naárea de superfície do paciente, p. ex., 100 mg/m2.

Usualmente entre 1 e 8 doses, (p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8)são administradas para tratar câncer, mas é possível administrar 10, 20 oumais doses. O mAb pode ser administrado diariamente, a cada quinze dias,semanalmente, em semanas alternadas, mensalmente ou com algum outro tipode intervalo, dependendo, p. ex. da meia-vida do mAb, durante 1 semana, 2semanas, 4 semanas, 8 semanas, de 3 a 6 meses ou mais tempo. Também sãopossíveis cursos repetidos de tratamento, como no caso de administraçãocrônica.

Doenças particularmente suscetíveis a terapia com os mAbsanti-HGF humanizados desta invenção, p. ex., HuL2G7, incluem tumoressólidos que, acredita-se, requerem angiogênese, ou ser associados com níveiselevados de HGF, por exemplo câncer do ovário, câncer de mama, câncer depulmão, (de células pequenas ou de células não-pequenas), câncer do colo,câncer de próstata, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer do fígado,tumores da cabeça e pescoço, melanoma, e sarcomas de crianças e adultos, etumores do cérebro. Eficazmente, os métodos desta invenção, particularmentetratamento sistêmico com um mAb L2G7 humanizado, são particularmenteaplicáveis para o tratamento de tumores do cérebro incluindo meningiomas;gliomas incluindo ependimomas, oligodendrogliomas, e todos os tipos deastrocitomas (de grau baixo, anaplástico, e glioblastoma multiforme ousimplesmente glioblastoma); medulablastomas, gangliogliomas,schwannomas, cordomas; e tumores cerebrais primariamente de crianças,incluindo tumores neurectodérmicos primitivos. Tanto tumores cerebraisprimários (i.e., que ocorrem no cérebro) e tumores cerebrais secundários oumetastáticos podem ser tratados por meio dos métodos da invenção. Outrasdoenças vantajosas para serem tratadas por meio dos métodos da invenção sãoaquelas associadas com angiogênese indesejada, como retinopatia diabética,degeneração macular relacionada com a idade, artrite reumatóide e psoríase.

Em uma concretização particularmente preferida, o mAb anti-HGF humanizado, p. ex., HuL2G7, é administrado juntamente com (i.e.,antes, durante ou após) outra terapia anticâncer. Por exemplo, o mAb pode seradministrado juntamente com qualquer uma ou mais das drogasquimioterápicas conhecidas por aqueles com prática na arte da oncologia, porexemplo, agentes alquiladores, como carmustina, clorambucila, cisplatina,carboplatina, oxiplatina, procarbazina, e ciclofosfamida; antimetabólitos,como fluorouracila, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, metotrexato ehidroxiuréia; produtos naturais incluindo alcalóides de plantas e antibióticos,como bleomicina, doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, etoposida,mitomicina, mitoxantrona, vinblastina, vincristina, e Taxol (paclitaxel) oucompostos relacionados, como Taxotere®; agentes aprovadosespecificamente para tumores do cérebro incluindo temozolomida e wafer deGliadel® contendo carmustina; e outras drogas incluindo irinotecano eGleevec® e todos os agentes anticâncer aprovados e experimentais listados noWO 2005/017107 A2 (que é incorporado aqui por referência). Outros agentescom os quais o mAb anti-HGF humanizado administrado incluem biologias,como anticorpos monoclonais, incluindo Herceptina™ contra o antígeno deHER2, Avastina™ contra VEGF, ou anticorpos para o receptor de EGF, etambém drogas anti-angiogênicas de moléculas pequenas ou drogasantagonistas de receptor de EGF. Adicionalmente, o mAb anti-HGFhumanizado pode ser usado em conjunto com terapia de radiação e cirurgia.

Tratamento (p. ex., quimioterapia convencional) incluindo oanticorpo mAb anti-HGF humanizado, p. ex., HuL2G7, pode incrementar otempo de sobrevida médio isento de progressão ou o tempo de sobrevidaglobal de pacientes com estes tumores (p. ex., do ovário, mama, pulmão,pâncreas, cérebro e colo, especialmente quando recidivados ou refratários) empelo menos 30 % ou 40 %, mas, de preferência, em 50 %, 60 % a 70 % oumesmo 100 % ou durante mais tempo, em comparação com o mesmotratamento (p. ex., quimioterapia), mas sem mAb anti-HGF. Adicionalmenteou alternativamente, tratamento (p. ex., quimioterapia convencional)incluindo o mAb anti-HGF pode aumentar a taxa de resposta completa, taxade resposta parcial, ou taxa de resposta objetiva (completa + parcial) depacientes com estes tumores (p. ex., ovário, mama, pulmão, pâncreas, cérebroe colo, particularmente quando recidivados ou refratários) em pelo menos 30% ou 40 %, mas, de preferência, em 50 %, de 60 % a 70 % ou mesmo 100 %,em comparação com o mesmo tratamento (p. ex., quimioterapia), mas sem omAb anti-HGF. No caso de tumores do cérebro, como glioblastomas,tratamento com o mAb anti-HGF humanizado, sozinho ou em combinaçãocom outros agentes, de preferência, proporciona uma taxa de resposta parcial,completa ou objetiva de pelo menos 5 % ou 10 %, mais preferivelmente de 20% ou 25 % ou 30 %, e, da forma mais preferível, 40 %, 50 % ou mais.

Tipicamente, em um ensaio clínico (p. ex., um ensaio de faseII, fase II/III ou fase III), os aumentos previamente indicados de taxa médiade resposta e/ou de sobrevida livre de progressão dos pacientes tratados comterapia convencional mais o mAb anti-HGF humanizado, p. ex., HuL2G7,relativamente ao grupo de controle de pacientes que recebem terapiaconvencional apenas (ou acrescido de placebo), são estatisticamentesignificativos, por exemplo, no nível de ρ = 0,05 ou 0,01 ou mesmo 0,001. Astaxas de resposta completa e parcial são determinadas por critérios objetivoscomumente usados em ensaios clínicos para câncer, p. ex., como listado ouaceito pelo National Câncer Institute e/ou Food and Drug Administration.

4. Outros métodos

Os mAbs anti-HGF humanizados da invenção também podemser usados em métodos diagnósticos, prognósticos e de laboratório. Elespodem ser usados para medir o nível de HGF em um tumor ou na circulaçãode um paciente com um tumor, e, portanto, para acompanhar e guiartratamento do tumor. Por exemplo, um tumor associado com altos níveis deHGF poderia ser particularmente suscetível a tratamento com um mAb anti-HGF humanizado. Em concretizações particulares, os mAbs podem serusados em um ELISA ou ensaio rádio-imunológico para medir o nível deHGF, p. ex., em uma amostra de biópsia de tumor, ou no soro, ou emsobrenadante de meio de células secretadoras de HGF em cultura de células.Para diversos ensaios, o mAb anti-HGF pode ser marcado com moléculasfluorescentes, moléculas marcadas com rotação, enzimas ou radioisótopos, epode ser proporcionado em forma de um kit com todos os reagentesnecessários para realizar o ensaio para HGF. Em outros usos, os mAbs anti-HGF são usados para purificar HGF, p. ex., por meio de cromatografia deafinidade.

Exemplos

1. Construção de um anticorpo L2G7 humanizado

A geração do mAb anti-HGF L2G7 de camundongo, queneutraliza todas as atividades biológicas testadas do HGF, já foi descrito (Kimet al., US20050019327 depositado em 13 de agosto de 2004, e Kim et al. ClinCâncer Res 12:1292, 2006). A primeira etapa para humanizar L2G7 consistiuem clonar seus genes de cadeia leve e pesada, que foi realizadosubstancialmente de acordo com o método de Co et al., J. Immunol.148:1149, 1992. Em resumo, RNA foi preparado a partir de IO6 células dehibridoma de L2G7 (IgG2a, K) usando um kit RNeasy Mini Kit (Qiagen)seguido de síntese de cDNA de primeiro filamento com iniciadoresrandômicos usando-se um kit da Stratagene e adição de caudas dG comdesoxinucleotidil transferase terminal (Promega). As regiões ν de cadeiapesada e cadeia leve foram amplificadas respectivamente a partir do cDNAcom um iniciador que recombina às caudas dG e um iniciador que recombinaà região N-terminal de Cy2a para a cadeia pesada e um iniciador querecombina à região N-terminal de Ck para a cadeia leve, usando-se um fidelitypolymerase AccuPrime Pfx (Invitrogen). Bandas de tamanhos apropriadosforam purificadas com gel via reações PCR, e seqüenciadas diretamente, ouclonadas e, então, seqüenciadas, usando-se o método de terminação didesóxicom um seqüenciador automatizado. Encontrou-se uma única seqüência decDNA para a cadeia pesada, que é mostrada após tradução na Fig. IA.Encontrou-se duas seqüências de cDNA de cadeia leve diferentesaparentemente não-aberrantes, porém seqüenciamento de aminoácidos daponta N da cadeia leve de L2G7 isolada revelou apenas uma destas cadeias,sendo que sua seqüência de aminoácidos traduzida é mostrada na Fig. 1 B.

Para expressar uma forma quimérica de L2G7 e, mais tarde, omAb humanizado, vetores de expressão similares aos vetores pVk e pVgldescritos por Co et al., J. Immunol. 148:1149, 1992, que contêm os genes Ck eCy1 humanos, foram construídos a partir de fragmentos de DNA e vetorescomercialmente obteníveis. No entanto, o vetor de cadeia leve apresenta omarcador selecionável hyg em lugar de gpt, e o vetor de cadeia pesadaapresenta o marcador selecionável neo em lugar de Dhfr. Os genes Vl e Vhclonados foram subclonados nos sítios apropriados destes vetores para gerarplasmídeos de expressão para os genes de cadeia pesada e de cadeia leve domAb L2G7 quimérico (chL2G7). O mAb chL2G7 foi produzido, e mostrou-seque liga HGF e também L2G7, provando que se clonou regiões V de cadeialeve e de cadeia pesada corretas.

Para projetar um mAb L2G7 humanizado, seguiu-se de umamaneira geral os métodos de Queen et al., Patentes dos Estados Unidos nums.5.530.101 e 5.585.089. O banco de dados do Centro Nacional paraInformação de Biotecnologia (NCBI, National Center for BiotechnologyInformation) de seqüências de anticorpos humanos foi investigado, e aseqüência Vh humana AAC18323 e a seqüência Vk BACO1726 foramselecionadas, respectivamente, de forma a servir como seqüências aceptoraspara as seqüências Vh e Vl de L2G7 porque apresentam homologia deestrutura particularmente elevada (i.e., identidade de seqüência) com asmesmas. Usou-se um programa de computador, Deep View Swiss-PdbViewer, obtenível na rede mundial de computadores(http://www.expasy.org/spdbv/), para construir um modelo molecular dodomínio variável de L2G7, que foi usado para localizar os aminoácidos naestrutura de L2G7 que se encontram suficientemente próximos das CDRs parainteragir potencialmente com os mesmos. O design das regiões variáveis decadeia pesada e de cadeia leve do L2G7 humanizado, e as CDRs do mAb deL2G7 de camundongo foram enxertadas primeiro conceitualmente nas regiõesde estrutura de aceptor. Em posições da estrutura em que o modelo decomputador sugeriu significativo contato com as CDRs, que podem sernecessárias para manter a conformação de CDR, os aminoácidos do anticorpode camundongo foram substituídos pelos aminoácidos de estrutura humanaoriginal. Para o mAb L2G7 humanizado denominado HuL2G7, isto foirealizado nos radicais 29, 30 (na alça hipervariável de Chothia H1), 48, 66,67, 71 e 94 da cadeia pesada e nos radicais 3 e 60 da cadeia leve, usandonumeração Kabat. Adicionalmente, aminoácido 1 da cadeia pesada foisubstituída por E (Glu) porque este aminoácido é menos provável do que Q(Gln) a sofrer derivatização na proteína do anticorpo. As seqüências de regiãoV de cadeia pesada e cadeia leve de HuL2G7 são mostradas alinhadas contraas respectivas regiões V de L2G7 e aceptor na Fig. 2A e 2B, com as CDRs eos aminoácidos substituídos salientados.

A invenção também proporciona mAbs L2G7 varianteshumanizados cujas regiões variáveis de cadeia pesada e leve maduras diferemdas seqüências de HuL2G7 por um pequeno número (p. ex., tipicamente nãomaior do que 1, 2, 3, 5 ou 10) de substituições, deleções ou inserções,usualmente na estrutura, mas possivelmente nas CDRs. Em particular, apenasum subconjunto das substituições descritas acima pode ser realizado nasestruturas de aceptoras, ou é possível realizar substituiçãoadicional/substituições adicionais, p. ex., o aminoácido de VH de L2G7 decamundongo 69F pode substituir o aminoácido aceptor 69M. Por outro lado, oaminoácido de VH IE pode ser, ao invés, Q. Eficazmente, muitos dos radicaisde estrutura que não se encontram em contato com as CDRs no HuL2G7podem acomodar substituições de aminoácidos a partir das posiçõescorrespondentes de L2G7 ou outros anticorpos de camundongos ou humanos,e até mesmo muitos radicais de contato com CDR potencial também são passíveis de substituição, ou mesmo aminoácidos nas CDRs.

Mui freqüentemente as substituições feitas nas seqüênciasvariantes de L2G7 humanizado são conservativas com relação aosaminoácidos de HuL2G7 substituídos. De preferência, substituições emHuL2G7 (conservativas ou não) não exercem efeito substancial sobre a afinidade de ligação ou potência do mAb humanizado, ou seja, [sobre] suacapacidade de neutralizar as atividades biológicas do HGF (p. ex., a potênciaem alguns ou em todos os ensaios descritos aqui do mAb L2G7 humanizadovariante é substancialmente a mesma, i.e., dentro do erro experimental, que ado HuL2G7). De preferência, as seqüências de região variável de cadeia leve e cadeia pesada variante madura são pelo menos 90 %, mais preferivelmentepelo menos 95 %, e da forma mais preferível, pelo menos 98 % idênticas àsrespectivas regiões V de cadeia leve e de cadeia pesada maduras de HuL2G7.Alternativamente, outras regiões variáveis de anticorpo humano com elevadaidentidade de seqüências relativamente àquelas de L2G7 também são vantajosas para proporcionar a estrutura de anticorpo humanizado,particularmente regiões V κ do subgrupo I humano e regiões V de cadeiapesada do subgrupo I humano, ou seqüências consenso destes subgrupos.

O mAb HuL2G7 exemplar discutido nos Exemplos abaixoapresenta regiões constantes humanas K e yl e é, portanto, uma IgGl: as seqüências completas dos genes de cadeia pesada e de cadeia leve de HuL2G7incluindo peptídios-sinal são mostradas na Fig. 3A e Fig. 3B. (Evidentemente,os peptídios-sinal são removidos por clivagem e não são parte do HuL2G7).No entanto, compreende-se que mAbs de IgGl de outros alótipos (IgG1, K)são abrangidos pela denominação HuL2G7. mAbs humanizados de outrosisótipos (ρ. ex., IgG2, IgG3 e IgG4) podem ser preparados combinando-se asregiões variáveis de HuL2G7 com as regiões constantes humanas apropriadas.É possível realizar substituições nas regiões constantes de HuL2G7 parareduzir ou incrementar função efetora, como citotoxicidade mediada comcomplemento ou ADCC (ver, p. ex., Winter et al., Patente dos Estados Unidosn° 5.624.821; Tso et al., Patente dos Estados Unidos n° 5.834.597; e Lazar etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103:4005, 2006), ou para prolongar a meia-vida em humanos (ver, p. ex., Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004).Especificamente, porém sem limitação, HuL2G7 apresentando mutações naregião constante de IgG para um Gln na posição 250 e/ou um Leu na posição428 são concretizações da presente invenção.

Tendo-se projetado o mAb HuL2G7, i.e., tendo-se selecionadoas seqüências de aminoácidos de suas regiões variáveis de cadeia leve e decadeia pesada (Fig. 2 e Fig. 3), seqüências de DNA codificando as regiões V(incluindo peptídios-sinal) foram selecionadas rotineiramente via o códigogenético; as seqüências começaram com CTCGAGACCACC antes do códoniniciador ATG para proporcionar um sítio de restrição para a clonagem, e umsinal de iniciação de tradução Kozak. Estes genes foram sintetizadoscomercialmente pela Genscript Corp. (Piscataway, NJ). Alternativamente, ométodo de Co et al., J. Immunol. 148:1149, 1992 pode ser usado parasintetizar cada gene de região V. Resumidamente, sintetiza-se dois pares deoligonucleotídeos que se sobrepõem sobre filamentos alternantes (com osintetizador de DNA da Applied Biosystems) que, em conjunto,compreendem o gene inteiro. Os oligonucleotídeos têm comprimentos de 110a 140 bases com 15 sobreposições de bases. Sintetiza-se fragmentos de DNAde filamento duplo usando polimerase de Klenow do par a 5' de oligos e,separadamente, do par a 3'. O fragmento de DNA a 5' é clivado com asenzimas de restrição cortando na ponta 5' e no centro do gene de região V. Ofragmento de DNA a 3' é clivado com as enzimas de restrição cortando nocentro e na ponta a 3' do gene de região V. Cada fragmento clivado é inseridoem um vetor de clonagem vantajoso e transformado em E. coli, e o DNA deuma quantidade de isolados é seqüenciado para se encontrar fragmentos queapresentam seqüências completamente corretas. Para cada gene, realiza-seentão uma ligação de 3 vias para inserir os fragmentos corretos a 5' e 3' novetor de expressão apropriado para formar o gene completo, cuja seqüência éverificada.

Para produzir o mAb HuL2G7, cultivou-se células epiteliaisrenais humanas 293-F (Invitrogen) em meio de expressão Freestyle 293 (meio FS; Invitrogen) e ressuspensas em meio FS a 10^6 células/2 ml/macropoço. OsDNAs de vetor de expressão de cadeia leve e de cadeia pesada de HuL2G7 (1μg de cada) foram incubados com 3 μl de Fugene 6 (Roche) em 100 μl demeio FS durante 30 min à temperatura ambiente; a mistura foi entãoadicionada às células. Após 48 h de incubação, células transfectadas foramcultivadas na presença de 1 mg/ml de G418 para selecionar células queexpressam neo e, então, espalhadas em placas de cultura de tecido de 96poços (100 μl/poço). Após aproximadamente 2 semanas, quando poçoscontendo células viáveis se tornaram confluentes, sobrenadantes de culturadaqueles poços foram testados quanto à presença e quantidade de HuL2G7por meio de ELISA. Células transfectadas podem secretar um desequilíbrio decadeias leve e pesada, de forma a assegurar que apenas HuL2G7 completoseja medido, este ELISA usa Fc anti-humano de cabra como um agente decaptura e κ anti-humano biotinilado como um reagente de detecção. O mAbchL2G7 foi expresso de forma similar. Clones de células expressando níveisrelativamente altos de ChL2G7 e HuL2G7 foram respectivamente expandidose desenvolvidos em meio FS. Anticorpo foi purificado a partir desobrenadantes de cultura usando cromatografia de afinidade de proteína A eanalisado quanto à pureza por meio de SDS-PAGE.2. Propriedades de HuL2G7Para comparar a afinidade de ligação de HuL2G7 com aquelade ChL2G7 e L2G7, realizou-se um experimento de ligação competitivo.Uma placa de microtitulação foi revestida com 50 μl/poço de 2 μg/ml de Fcde IgG anti-humano de cabra (GahlgG-Fc) em PBS de um dia para o outro a4°C e bloqueada com 2 % de BSA durante 1 h à temperatura ambiente. Apósa lavagem, a placa foi incubada com 50 μΐ/poço de mAb ChL2G7 (2 μg/poço)durante 1 h à temperatura ambiente, seguido, após a lavagem, de 50 μl/poçode IgG humana (10 μg/ml) durante 1 h para reduzir o fundo. Após a lavagem,poços da placa foram incubados separadamente durante 1 h com 50 μΐ/poçode várias concentrações de HuL2G7 purificado, ChL2G7 ou L2G7 comocompetidor, juntamente com 50 μΐ/poço de HGF-Flag (1 μg/ml). Após alavagem, as placas foram então incubadas com 50 μΐ/poço de mAb anti-FlagHRP-M2 (Invitrogen) e o M2 anti-Flag HRP ligado foi detectado por meio daadição de substrato de tetrametilbenzidina. A Fig. 4 mostra que HuL2G7,ChL2G7 e L2G7, em princípio, competiram igualmente bem com o L2G7ligado à placa pela ligação do HGF-Flag solúvel, indicando que estes trêsmAbs apresentam afinidade muito parecida.

Uma atividade biológica-chave do HGF é a capacidade deligar-se a seu receptor de cMet, de forma a comparar a capacidade dos mAbsHuL2G7, ChL2G7 e L2G7 em inibir a ligação do HGF a Met. Usou-se Metem forma de Met-Fcm e HGF em forma de HGF-Flag, que foram preparadascomo descrito (Pedido de patente USSN 10/917.915 depositado em 13 deagosto de 2004, e Kim et ai. Clin Câncer Res 12:1292, 2006). Uma placa demicrotitulação foi revestida com 50 μl/poço de 2 μg/ml de cada um dos doismAbs anti-Met (Galaxy Biotech) em PBS de um dia para o outro a 4°C(alternativamente, é possível usar 2 μg/ml de GahlgG-Fc) e bloqueada com 2% de BSA durante 1 h à temperatura ambiente. Após a lavagem das placas,adicionou-se 50 μl/poço de Met-Fc (1 μg/ml) em cada poço durante 1 h àtemperatura ambiente, seguido, após lavagem, de 50 μΐ/poço de IgG humana(10 µg/mL) durante 1 h para reduzir o fundo. Após a lavagem das placas, 50μΐ/poço de HGF-Flag (0,5 μg/ml) pré-incubados com diversas concentraçõesde mAbs foram adicionados em cada poço durante 1 h. Após a lavagem, asplacas foram incubadas com 50 μl/poço de mAb anti-Flag HRP-M2(Invitrogen), e o HRP-anti-Flag M2 ligado [foi] detectado com a adição dosubstrato como descrito acima. Fig. 5 mostra que HuL2G7, ChL2G7 e L2G7bloquearam igualmente a ligação do HGF a Met, de modo que estes mAbsapresentam atividade muito similar neste ensaio.

Outra atividade biológica importante do HGF é a capacidadede estimular a proliferação de determinadas células, incluindo célulasepiteliais de pulmão de mink Mv 1 Lu. Para comparar a capacidade deHuL2G7 e L2G7 de neutralizarem esta atividade do HGF, células Mv 1 Lu (2χ 1O4 células/100 μl/poço) desenvolvidas em DMEM contendo 10 % de FCSforam ressuspensos em DMEM livre de soro e estimuladas com 100 μl/poçode HGF (40 ng/ml) mais Fator de Crescimento Transformante β-1 (1 ng/ml,R&D Systems) para reduzir o fundo e diversas concentrações de HuL2G7,L2G7 ou anticorpo humano de controle irrelevante. O nível da proliferação decélulas foi determinada por meio da adição de WST-I (Roche AppliedScience) durante 14 horas. Fig. 6 mostra que HuL2G7 e L2G7 apresentaramatividade inibidora igual neste ensaio. Em resumo, HuL2G7 foi pelo menosigualmente tão ativo quanto L2G7 em todos os ensaios usados, e, portanto, étotalmente neutralizador: não se perdeu qualquer atividade de L2G7 noprocesso de humanização.

3. Capacidade de HuL2G7 em inibir crescimento de tumor in vivoJá se mostrou que mAb L2G7 é capaz de inibir completamenteo crescimento de enxertos exógenos de glioma U87 em modelos decamundongo nus (Pedido de patente USSN 10/917.915 depositado em 13 deagosto de 2004, e Kim et al. Clin Câncer Res 12:1292, 2006). Para verificarque HuL2G7 também possui esta capacidade, usou-se o mesmo procedimentoexperimental. Em resumo, camundongos NIH III Xid/Bege/Nus fêmeas comde 4 a 6 semanas de vida (Charles River Laboratories) foram injetados s.c.com IO7 células em 0,1 ml de PBS nas áreas dorsais. Quando o tamanho dotumor atingiu -50 mm , os camundongos foram divididos randomicamenteem grupos (n = 6 por grupo) e injetados com 40 μg de HuL2G7, L2G7 oucontrole de PBS i.p. duas vezes por semana em um volume de 0,1 ml de PBS.Volumes de tumor foram determinados semanalmente medindo-se duasdimensões (comprimento, a, e largura, b) e calculando o volume como V =ab /2. A Fig. 7

mostra que HuL2G7 e L2G7 inibiram neste ensaio ocrescimento de tumor de maneira indistinguível. Para definir adicionalmente acapacidade de HuL2G7 de inibir o crescimento de enxertos exógenos detumor, usou-se quatro doses diferentes do mAb, 40 μg, 20 μg, 10 μg e 5 μg,em um experimento similar. A Fig. 8 mostra que mesmo a dose notavelmentebaixa de 10 μg duas vezes por semana foi capaz de inibir completamente ocrescimento do tumor, enquanto que a dose ainda menor de 5 μgproporcionou uma inibição boa, porém incompleta. De forma análoga, quandoadministrado sistemicamente, HuL2G7 inibe eficazmente o crescimento deenxertos exógenos intracranianos de U87.

Embora a invenção tenha sido descrita com referência àsconcretizações presentemente preferidas, deve-se compreender que é possívelrealizar várias modificações sem afastar-se da invenção.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes aquiindicados são incorporados aqui integralmente por referência para todos osfins na mesma medida como se cada publicação, patente e pedido de patenteindividual fosse indicado especificamente e individualmente integralmentepor referência para todos os fins.

O hibridoma de L2G7 foi depositado em 29 de abril de 2003junto à American Type Culture Collection, P.O. Box 1549 Manassas, VA20108, como número ATCC PTA-5162, sob as regras do Tratado deBudapeste. Este depósito será conservado em um repositório autorizado, eserá substituído em caso de mutação, não-viabilidade ou destruição duranteum período de pelo menos cinco anos após o recebimento, por parte dorepositório, do pedido mais recente de liberação de uma amostra, durante umperíodo de pelo menos trinta anos após a data do depósito, ou durante a vidalegal da patente relacionada, o que for mais longo. Todas as restriçõesrelativas à disponibilidade destas linhas de células ao público serão removidasirrevogavelmente após a concessão de uma patente a partir do pedido.

Claims (28)

1. Anticorpo monoclonal (mAB) humanizado, caracterizadopelo fato de que se liga a, e neutraliza Fator de Crescimento de Hepatócitos(HGF) humano.

2. Anticorpo monoclonal mAb de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que é um mAb L2G7 humanizado.

3. Anticorpo monoclonal mAb de acordo com a reivindicação-2, caracterizado pelo fato de que inibe ligação de HGF a Met em pelo menos-50%.

4. Anticorpo monoclonal mAb de acordo com a reivindicação-2, caracterizado pelo fato de que inibe proliferação de células Mv 1 Luinduzida com HGF.

5. Anticorpo monoclonal mAb de acordo com a reivindicação-2, caracterizado pelo fato de que neutraliza todas as atividades biológicas doHGF.

6. Anticorpo monoclonal mAb de acordo com a reivindicação-2, caracterizado pelo fato de que inibe o crescimento de um xenoenxerto detumor humano em um camundongo.

7. Anticorpo monoclonal mAb de acordo com a reivindicação-6, caracterizado pelo fato de que inibe completamente o crescimento de umxenoenxerto de tumor humano em um camundongo.

8. Região variável de cadeia pesada de anticorpo monoclonalmAb humanizado, caracterizada pelo fato de que tem a seqüência da Fig. 2Amarcada HuL2G7.

9. Anticorpo monoclonal mAb humanizado, caracterizado pelofato de que compreende uma região variável de cadeia pesada maduraapresentando a seqüência de aminoácidos da Fig. 2A marcada HuL2G7exceto que o primeiro aminoácido é substituído por Gln.

10. Anticorpo monoclonal mAb humanizado de acordo com areivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmenteuma região variável de cadeia leve madura apresentando a seqüência deaminoácidos da Fig. 2B marcada HuL2G7.

11. Anticorpo monoclonal mAb humanizado, caracterizadopelo fato de que compreende regiões variáveis de cadeia pesada e levemaduras apresentando seqüências de aminoácidos que são pelo menos 90 %idênticas àquelas da Fig. 2A marcada HuL2G7 e Fig. 2B marcada HuL2G7,respectivamente.

12. Anticorpo monoclonal mAb humanizado de acordo com areivindicação 11, caracterizado pelo fato de que suas seqüências de regiãovariável de cadeia leve e pesada são pelo menos 95 % idênticas àquelas domAb como definido na reivindicação 10.

13. Anticorpo monoclonal mAb humanizado de acordo com areivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que desde que pelo menosuma posição selecionada do grupo que consiste de H29, H30, H48, H66, H67,H71, H94, L3, e L60 seja ocupada pelo aminoácido presente na posiçãocorrespondente de acordo com a numeração Kabat no L2G7 de camundongo.

14. Anticorpo monoclonal mAb humanizado de acordo com areivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que desde que pelo menostrês posições selecionadas de referido grupo sejam ocupadas pelo aminoácidopresente na posição correspondente de acordo com a numeração Kabat noanticorpo L2G7 de camundongo.

15. Anticorpo monoclonal mAb humanizado de acordo com areivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que desde que todas asposições de referido grupo sejam ocupadas pelo aminoácido presente naposição correspondente de acordo com a numeração Kabat no anticorpo L2G7de camundongo.

16. Anticorpo monoclonal mAb humanizado de acordo com areivindicação 15, caracterizado adicionalmente pelo fato de que desde que aposição Hl seja ocupada por Glu.

17. Anticorpo monoclonal mAb humanizado de acordo com areivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é o isótipo (IgGl, K).

18. Anticorpo monoclonal mAb humanizado de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que neutraliza atividadesbiológicas do HGF5 como L2G7 o faz.

19. Anticorpo monoclonal (mAB) humanizado que se liga a, eneutraliza Fator de Crescimento de Hepatócitos (HGF) humano, caracterizadopelo fato de que o anticorpo humanizado compreende cadeias leve e pesadahumanizadas, sendo que a cadeia pesada humanizada compreende CDRs deL2G7 e uma estrutura de região variável de cadeia pesada humana, desde quepelo menos uma posição da estrutura de região variável de cadeia pesadahumana selecionada do grupo que consiste de H29, H30, H48, H66, H67,H71, H94 seja ocupada pelo aminoácido que ocupa a posição correspondentena cadeia pesada de L2G7; sendo que a cadeia leve humanizada compreendeCDRs de L2G7 e uma estrutura de região variável de cadeia leve humanadesde que pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste de L3 eL60 seja ocupada pelo aminoácido que ocupa a posição correspondente nacadeia leve de L2G7.

20. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que todos os aminoácidos do grupo que consiste deH29, H30, H48, H66, H67, H71 e H94 são ocupados pelo aminoácido queocupa a posição correspondente na cadeia pesada de L2G7 e cada posiçãoselecionada do grupo que consiste de L3 e L60 é ocupada pelo aminoácidoque ocupa a posição correspondente na cadeia leve de L2G7.

21. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 19,caracterizado adicionalmente pelo fato de que desde que a posição Hl sejaocupada por Glu.

22. Linha de células, caracterizada pelo fato de que produz ummAb como definido em qualquer reivindicação precedente.

23. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um mAb de qualquer reivindicação precedente.

24. Método de tratar câncer em um paciente, caracterizadopelo fato de que compreende administrar ao paciente uma composiçãofarmacêutica compreendendo um mAb como definido em qualquerreivindicação precedente.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que referido câncer é glioblastoma.

26. Uso de um anticorpo monoclonal mAb como definido emqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que é para afabricação de um medicamento.

27. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de que é para tratamento de câncer.

28. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de que o câncer é glioblastoma.