MX2008012619A - Anticuerpos monoclonales humanizados para el factor de crecimiento del hepatocito. - Google Patents

Abstract

La presente invención se dirige hacia un anticuerpo monoclonal humanizado neutralizador del factor de crecimiento del hepatocito, una composición farmacéutica que lo incluye, y los métodos de tratamiento que incluyen la administración de tal composición farmacéutica a un paciente.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANIZADOS PARA EL FACTOR DE CRECIMIENTO DEL HEPATOCITO Referencia Cruzada a las Solicitudes Relacionadas La presente solicitud es no-provisional de la solitud USSN 60/788,243 presentada el 1ro de Abril del 2006, la cual se incorpora aquí a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Estado del Interés del Gobierno El trabajo descrito en esta solicitud fue constituido en parte por Grant 2R44CA101283-02 de los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno de los E.U. puede tener ciertos derechos en esta invención.

Campo de la Invención La presente invención se refiere de manera general a la combinación del anticuerpo monoclonal (mAb, por sus siglas en inglés) y las tecnologías de recombinación de ADN para desarrollar agentes biológicos, y de manera más particular, por ejemplo, para producir anticuerpos monoclonales humanizados que se enlazan y neutralizan al Factor de Crecimiento del Hepatocito.

Antecedentes de la Invención El Factor de Crecimiento del Hepatocito Humano (HGF, por sus siglas en inglés) es un polipéptido heterodimérico multifuncional producido por las células mesenquimales. El HGF ha mostrado que estimula la angiogénesis , morfogénesis y motogénesis, asi como también el crecimiento y dispersión de varios tipos de células (Bussolino et al., J. Cell. Biol. 119: 629, 1992; Zarnegar y Michalopoulos, J. Cell. Biol. 129:1177, 1995; Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier y Gherardi, Trends Cell. Biol. 8:404, 1998; Xin et al. Am. J. Pathol. 158:1111, 2001). Las actividades pleiotrópicas del HGF son mediadas a través de su receptor, una tirosina cinasa de transmembrana codificada por medio del c-Met proto-oncógeno . Además de regular una variedad de funciones celulares normales, el HGF y su receptor c-Met han mostrado que se encuentran implicados en la iniciación, invasión y metástasis de los tumores (Jeffers et al., J. Mol. Med. 74:505, 1996; Comoglio y Trusolino, J. Clin. Invest. 109:857, 2002). Los HGF/c-Met son co-expresados , a menudo sobre-expresados, en varios tumores humanos sólidos incluyendo los tumores derivados del pulmón, colon, recto, estómago, riñon, ovarios, piel, varios mielomas y tejido tiroidal (Prat et al., Int. J. Cáncer 49:323, 1991; Chan et al., Oncogene 2:593, 1988; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993; Derksen et al., Blood 99:1405, 2002) . El HGF actúa como un factor de crecimiento autocrino (Rong et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 91:4731, 1994; Koochekpour et al., Cáncer Res. 57:5391, 1997) y paracrino (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol . 8:229, 1993) y regulador ant i-apoptót ico (Gao et al., J. Biol. Chem. 276:47257, 2001) para estos tumores. El HGF es una proteina de 102 kDa con secuencia y estructura similares a la plasminogena y otras enzimas de la coagulación sanguínea (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993) . El HGF humano es sintetizado como un precursor 728 de aminoácido (preproHGF, por sus siglas en inglés), que experimenta una segmentación intracelular hacia una forma de cadena única inactiva (proHGF, por sus siglas en inglés) (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Rosen et al., J. Cell. Biol. 127:1783, 1994) . En la secreción extracelular , la proHGF es segmentada para producir la molécula heterodimérica unida a un disulfuro, activa biológicamente, compuesta de una subunidad a y una subunidad ß (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Naldini et al., EMBO J. 11:4825, 1992) . La subunidad contiene 440 residuos (69 kDa con glicosilación) , que consisten en el dominio N-terminal horquilla y cuatro dominios kringle. La subunidad ß contiene 234 residuos (34 kDa) y tiene un dominio tipo proteasa de serina, que carece de actividad proteolít ica . El HGF tiene dos sitios específicos de enlace celular únicos: un sitio de alta afinidad de enlace (Kd = 2 x 10~10 M) para el receptor del c-Met y un sitio de baja afinidad de enlace (Kd = 10"9 M) para los proteoglicanos de sulfato de heparina (HSPG, por sus siglas en inglés), que se encuentran presentes en la superficie de la célula y la matriz extracelular (Naldini et al., Oncogene 6:501, 1991; Bardelli et al., J. Biotechnol . 37:109, 1994; Sakata et al., J. Biol. Chem. , 272:9457, 1997) .

El receptor c-Met es un miembro de la familia de receptores de las proteína t irosina-cinasa de clase IV. El gen c-Met de longitud completa fue clonado e identificado como el proto-oncógeno c-Met (Cooper et al., Nature 311:29, 1984; Park et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:6379, 1987) . La NK2 (una proteína que abarca la terminal N y los dos primeros dominios kringle de la subunidad a) es suficiente para enlazar el c-Met con la activación de la caída de señalización para la motilidad, sin embargo, la longitud total de la proteína se requiere para la respuesta mitogenética (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993) . El HSPG enlaza al HGF al interactuar con la terminal N del HGF. El HGF/c-Met ha sido reportado juega un papel importante en varios aspectos del desarrollo del cáncer como la iniciación del tumor, la invasión, la metástasis, la regulación de la apoptosis y la angiogénesis . Varias propuestas diferentes han sido investigadas para obtener una molécula antagonista efectiva: proteínas de HGF truncadas como la NKl (dominio de terminal N más dominio kringle 1 ; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268:17145, 1993), NK2 (dominio de terminal N más dominios kringle 1 y 2; Chan et al., Science 254:1382, 1991) y N 4 (dominio de terminal N más cuatro dominios kringle; Kuba et al., Cáncer Res. 60:6737, 2000), mAbs anti-c-Met (Dodge, Master's Thesis, San Francisco State University, 1998) y mAbs anti-HGF (Cao et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001, que se incorpora aquí a manera de referencia) . NKl y NK2 pueden competir de manera efectiva con el enlace del HGF con su receptor, pero ha sido reportado que tiene actividades antagonistas parciales in vitro (Cioce et al., J. Biol. Chem. 271:12110, 1996; Schwall et al., J. Cell Biol. 133:709, 1996), en lugar de solamente actividades antagonistas exclusivas. De manera más reciente, Kuba et al., Cáncer Res. 60:6737, 2000, reportó que la NK4 podría inhibir parcialmente el crecimiento primario y la metástasis del tumor murino de pulmón LLC en un modelo de ratón desnudo por medio de la infusión continua de NK4. Sin embargo, el hecho de que la NK4 tenía que ser administrada de manera continua para obtener una inhibición parcial del crecimiento de tumores primarios indica un periodo de vida potencialmente corto de la molécula de la NK4 y/o la carencia de potencia.

Cao et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001, reportó que la administración de un coctel de tres mAbs anti-HGF, que se seleccionaron en base a su habilidad de inhibir la actividad de dispersión del HGF in vitro, fue capaz de inhibir el crecimiento de tumores humanos en el modelo del xenoinjerto de ratón desnudo. Ellos postularon que se requirieron tres mAbs que reconocieron tres sitios diferentes de enlace en el HGF para inhibir las bioact ividades del HGF in vivo: dos mAbs inhibieron el enlace del HGF con el c-Met y un mAb inhibió el enlace del HGF con la heparina. Recientemente, han sido reportados los mAbs humanos que se enlazan individualmente y neutralizan el HGF desarrollado usando tecnología de ratón transgénico (Burgess et al., WO 2005/017107A2 y Burgess et Al., Cáncer Res 66:1721, 2006, cada uno de los cuales se incorpora aquí a manera de referencia para todos los propósitos) . Sin embargo, de estos por lo menos el mAb 2.12.1, que aparentemente fue el más potente en los modelos de xenoinjerto del tumor, no inhibió la angiogénesis . Un mAb L2G7 de ratón ha sido desarrollado, el cual neutraliza todas las actividades biológicas probadas del HGF incluyendo la angiogénesis (Solicitud de Patente USSN 10/917,915, presentada el 13 de Agosto del 2004, y Kim et al., Clin Cáncer Res 12:1292, 2006, cada una de las cuales se incorpora aquí a manera de referencia para todos los propósitos) .

De este modo, existe la necesidad de un anticuerpo monoclonal humanizado que bloquee la actividad biológica del HGF in vitro e in vivo. La presente invención cubre esta y otras necesidades.

Breve Descripción de la Invención En una modalidad, la invención proporciona un mAb humanizado neutralizador del Factor de Crecimiento del Hepatocito (HGF, por sus siglas en inglés) humano. El mAb inhibe por lo menos una, y preferentemente varias o todas, las actividades biológicas del HGF incluyendo el enlace con su receptor c-Met, la inducción de la dispersión de las células tales como las células Madin-Darby de riñon canino, la inducción de la proliferación de las células epiteliales de pulmón de visón Mv 1 Lu y/o los hepatocitos y/o las HUVEC, y la estimulación de la angiogénesis . Un mAb anti-HGF humanizado preferido inhibe, de manera más preferible inhibe completamente, el crecimiento de un xenoinjerto de tumor humano en un ratón. En una modalidad preferida, el mAb humanizado es un mAb L2G7 humanizado. En una modalidad especialmente preferida, las regiones variables de cadena pesada y ligera del mAb tienen las secuencias mostradas en las lineas etiquetadas como HuL2G7 en la Figura 2A y la Figura 2B, respectivamente, o las secuencias que son por lo menos 90% o más idénticas a ellas. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado (mAb) que enlaza y neutraliza al Factor de Crecimiento del Hepatocito (HGF, por sus siglas en inglés) humano, incluyendo el anticuerpo humanizado las cadenas pesada y ligera humanizadas. La cadena pesada humanizada incluye CDRs del L2G7 y un marco abierto de lectura de la región variable de la cadena pesada humana provista de modo que por lo menos una posición del marco abierto de lectura de la región de la cadena pesada humana, seleccionada del grupo que consiste de H29, H30, H48, H66, H67, H71, H94, es ocupada por el aminoácido que ocupa la posición correspondiente en la cadena pesada del L2G7. La cadena ligera humanizada incluye CDRs del L2G7 y un marco abierto de lectura de la región variable de la cadena ligera humana provista de modo que por lo menos una posición seleccionada del grupo que consiste de L3 y L60, es ocupada por el aminoácido que ocupa la posición correspondiente en la cadena ligera del L2G7. También se proporcionan las lineas celulares que producen tales anticuerpos humanizados. En otra modalidad, se proporciona una composición farmacéutica que incluye un mAb L2G7 humanizado. En una tercera modalidad, la composición farmacéutica se administra a un paciente (un paciente humano típicamente) para tratar el cáncer u otra enfermedad.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1A Y IB. Secuencias del aminoácido de las regiones variables de cadena pesada (A) y cadena ligera (B) maduras L2G7 transferidas de los cADNs clonados. Los CDRs se subrayan. Se usa el sistema de numeración Kabat . Figura 2A Y 2B. Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (A) y cadena ligera (B) maduras HuL2G7 que se muestran alineadas con las regiones del L2G7 y el aceptor V. Los CDRs se subrayan en las secuencias del L2G7, y los aminoácidos sustituidos con aminoácidos L2G7 de ratón en las secuencias HuL2G7, con el aminoácido H1E inicial con subrayado doble. Figura 3A Y 3B. Secuencias de aminoácidos de la totalidad de la cadena pesada (A) y la cadena ligera (B) HuL2G7. Los primeros aminoácidos de las cadenas maduras pesada y ligera (es decir, después de la segmentación de las secuencias de señalización) se subrayan doblemente y se etiquetan con el número 1; estos aminoácidos también son los primeros aminoácidos de las regiones maduras V. En la cadena pesada, se subrayan los primeros aminoácidos de las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3, y en la cadena ligera, se subraya el primer aminoácido de la región Ck. Figura 4. Una prueba competitiva de enlace del HuL2G7, ChL2G7 y L2G7 para enlazar el HGF. Figura 5. La habilidad relativa del HuL2G7, ChL2G7 y L2G7 para bloquear el enlace del HGF con el Met .

Figura 6. La habilidad relativa del HuL2G7 y L2G7 para inhibir la proliferación del HGF inducido de las células Mv 1 Lu. Figura 7. El efecto del tratamiento con el mAb del HuL2G7 o L2G7 o el control PBS sobre el crecimiento de los xenoinjertos subcutáneos U87 en los grupos de ratones NIH III beige/desnudos . La flecha indica cuándo comienzan las inyecciones, y las barras de error muestran el error estándar del significado (s.e.m.) . Los símbolos para el L2G7 y el HuL2G7 se sobreponen y no pueden distinguirse en la Figura. Figura 8. El efecto de cuatro niveles diferentes de dosis del HuL2G7 de los xenoinjertos subcutáneos U87 en los grupos de ratones NIH III beige/desnudos. La flecha indica cuándo comienzan las inyecciones, y las barras de error muestran el s.e.m.

Descripción Detallada de la Invención La invención proporciona anticuerpos monoclonales humanizados neutralizadores anti-HGF, composiciones farmacéuticas que los incluyen, y métodos de uso de éstos para el tratamiento de la enfermedad. 1. Anticuerpos Los anticuerpos son moléculas muy grandes y complejas (peso molecular de alrededor de -150,000 o alrededor de 1320 aminoácidos) con una estructura interna intrincada. Una molécula natural de anticuerpo contiene dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos , teniendo cada par una cadena pesada y una cadena ligera; de este modo la unidad fundamental de la estructura de un anticuerpo es un tetrámero. Cada cadena ligera y cada cadena pesada consiste en cambio de dos regiones: una región variable ("V") , implicada en el enlace del antigeno objetivo, y una región constante ("C"), que interactúa con otros componentes del sistema inmune. Las regiones de las cadenas ligera y variable se doblan sobre si en un espacio tridimensional para formar una región variable que se enlaza al antigeno (por ejemplo, un receptor sobre la superficie de una célula) . Dentro de cada región variable de la cadena ligera o pesada, existen tres segmentos cortos (promediando 10 aminoácidos en longitud) , llamadas regiones de determinación de la complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) . Las seis CDRs en un dominio variable de anticuerpo (tres de la cadena ligera y tres de la cadena pesada) se doblan sobre si en un espacio 3D para formar el lugar actual de enlace del anticuerpo que se cierra sobre el antigeno objetivo. La posición y longitud de las CDRs han sido definidas de manera precisa. Ver Kabat et al., Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los E.U., 1983, 1987, que se incorpora aquí a manera de referencia. La parte de una región variable no contenida en las CDRs es llamada el marco abierto de lectura, el cual forma el medio ambiente para las CDRs. En cada cadena, las tres CDRs se dispersan de manera interna con cuatro secciones de marco abierto de lectura en este orden: FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3, FR4. Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas maduras pesada y ligera de inmunoglobulina son designadas como Hx y Lx respectivamente, donde x es un número que designa la posición de un aminoácido, en conformidad con el esquema de Kabat, op. cit. Kabat enlista muchas secuencias de aminoácidos para los anticuerpos para cada subgrupo, y enlista los aminoácidos que aparecen de manera más común para cada posición de residuo en este subgrupo para generar una secuencia de consenso. Kabat usa un método para asignar un número de residuo a cada aminoácido en una secuencia enlistada, y este método para asignar número de residuo se ha convertido en un estándar en el campo. El esquema de Kabat es extensible a otros anticuerpos no incluidos en su compendio al alinear el anticuerpo con relación a una de las secuencias de consenso en Kabat como referencia a los aminoácidos conservados. El uso de los sistemas numéricos de Kabat identifican fácilmente los aminoácidos en las posiciones equivalentes en los diferentes anticuerpos. Por ejemplo, un aminoácido en la posición L50 de un anticuerpo humano ocupa la posición equivalente a una posición L50 del aminoácido de un anticuerpo del ratón. Sin embargo, cualquiera de las dos secuencias de anticuerpos pueden ser alineadas de manera única, por ejemplo, para determinar el porcentaje de identidad, usando el sistema numérico de Kabat de modo que cada aminoácido en una secuencia del anticuerpo se alinee con el aminoácido en la otra secuencia que tiene el mismo número de Kabat. Después de la alineación, si una región del anticuerpo del sujeto (por ejemplo, toda la región variable madura de una cadena pesada o ligera) se compara con la misma región de un anticuerpo de referencia, el porcentaje de identidad de la secuencia entre las regiones del anticuerpo del sujeto y la referencia es el número de posiciones ocupadas por el mismo aminoácido en la región del anticuerpo del sujeto y de la referencia dividido por el número total de posiciones alineadas de las dos regiones, sin contar los espacios, multiplicado por 100 para convertirlo en porcentaj e . Un anticuerpo monoclonal (mAb, por sus siglas en inglés) es una especie molecular única de anticuerpo y por lo tanto no abarca los anticuerpos policlonales producidos al inyectar a un animal (tal como un roedor, conejo o cabra) un antigeno, y extraer suero del animal. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo con ingeniería genética (monoclonal) en el que las CDRs de un anticuerpo del ratón ("anticuerpo donador", que puede ser también una rata, hámster u otras especies similares) se injertan en un anticuerpo humano ("anticuerpo aceptor") . Los anticuerpos humanizados también pueden ser producidos con menos de las CDRs completas de un anticuerpo del ratón (por ejemplo, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002) . De manera más común el primer bucle híper-variable de cadena pesada Hl, como se define por Chothia & Lesk, J. Mol. Biol . 196:901-917, 1987, del anticuerpo donador,- también es transferido al anticuerpo humanizado. De este modo, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo con CDRs de un anticuerpo donador y marco abierto de lectura de la región variable y regiones constantes de los anticuerpos humanos. Los marcos abiertos de lectura de los aceptores de las cadenas pesada y ligera pueden ser de los mismos o diferentes anticuerpos humanos y pueden ser cada uno un compuesto de dos ó más marcos abiertos de lectura del anticuerpo humano; o ser alternativamente una secuencia de consenso de un grupo de marcos abiertos de lecturas humanos (por ejemplo, un subgrupo de anticuerpo humano como se define por Kabat et al., op. cit.) , es decir, una secuencia con el aminoácido que aparece de manera más común dentro del grupo de cada posición. Además, para retener una alta afinidad de enlace, pueden ser empleados por lo menos uno ó dos elementos estructurales adicionales. Ver, Queen et al., nos. de Patente de E.U. 5,530,101 y 5,585,089, cada una de las cuales se incorporan aquí a manera de referencia, las cuales proporcionan instrucciones detalladas para la construcción de los anticuerpos humanizados. En el primer elemento estructural, el marco abierto de lectura de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado se elige para tener una alta identidad de secuencia (por lo menos 65%) con el marco abierto de lectura de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo donador, al seleccionar de manera apropiada el anticuerpo aceptor de entre los muchos anticuerpos humanos conocidos. En el segundo elemento estructural, en la construcción del anticuerpo humanizado, los aminoácidos seleccionados en el marco abierto de lectura del anticuerpo aceptor humano (fuera de las CDRs) se reemplazan con los aminoácidos correspondientes del anticuerpo donador, en conformidad con las reglas especificadas. Concretamente, los aminoácidos que son reemplazados en el marco abierto de lectura se eligen de manera general en base a su habilidad para interactuar con las CDRs. Por ejemplo, los aminoácidos reemplazados pueden estar adyacentes a una CDR en la secuencia del anticuerpo donador o dentro de 4-6 angstroms de una CDR en el anticuerpo humanizado, mientras se mide en el espacio tridimensional. Por otra parte, puesto que los mAbs humanizados deben originarse con un mAb donador humano, los mAbs humanizados no abarcan mAbs esencialmente humanos hechos mediante el aislamiento de regiones variables que codifican ácidos nucleicos de un humano y su selección utilizando métodos de expresión fágica (ver, por ejemplo, Dower et al., W091/17271; McCafferty et al., WO92/001047; Winter, O92/20791; y inter, FEBS Lett. 23:92, 1998) o al usar ratones transgénicos (ver, por ejemplo, Lonberg et al., W093/12227; Kucherlapati WO91/10741, y Burgess et al. WO 2005/027107A2 ) . El epitope de un mAb es la región de su antigeno al cual se enlaza el mAb. Dos anticuerpos se enlazan al mismo epitope o al epitope sobrepuesto si cada uno inhibe (bloquea) completamente el enlace del otro con el antigeno. Esto es, un exceso de lx, 5x, ???, 20x ó lOOx de un anticuerpo inhibe el enlace del otro en por lo menos un 50%, pero preferentemente 75%, 90% o aún 99%, medido en una prueba competitiva de enlace (ver, por ejemplo, Junghans et ai., Cáncer Res. 50:1495, 1990) . Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epitope si todas las mutaciones del aminoácido en el antigeno que reducen o eliminan el enlace de un anticuerpo reducen o eliminan el enlace del otro. Dos anticuerpos tienen epitopes sobrepuestos si algunas mutaciones del aminoácido que reducen o eliminan el enlace de un anticuerpo reducen o eliminan el enlace del otro. 2. Anticuerpos anti-HGF humanizados neutrali zadores . Un anticuerpo monoclonal (mAb, por sus siglas en inglés) que se enlaza al HGF (es decir, un mAb anti-HGF) debe neutralizar al HGF, o estar neutralizándolo, si el enlace inhibe parcial o completamente una o más actividades biológicas del HGF (es decir, cuando el mAb se usa como un agente único) . Entre las propiedades biológicas del HGF que un anticuerpo neutralizador debe inhibir están la habilidad del HGF de enlazarse con su receptor c-Met, causar la dispersión de ciertas lineas celulares tales como las células de riñon canino Madin-Darby (MDCK, por sus siglas en inglés) ; estimular la proliferación (es decir, ser mitogénico) de ciertas células incluyendo los hepatocitos, las células epiteliales de pulmón de visón Mv 1 Lu, y varias células de tumores humanos; o estimular la angiogénesis , por ejemplo, como medida para la estimulación de la proliferación de la célula humana endotelial vascular umbilical (HUVEC, por sus siglas en inglés) o formación de tubo o por medio de la inducción de los vasos sanguíneos cuando se aplica a la membrana corioalantoica del embrión del pollo (CAM, por sus siglas en inglés) . Los anticuerpos de la invención se enlazan preferentemente con el HGF humano, es decir, con la proteína codificada por la secuencia del GenBank con el número de Ascensión D90334. Un mAb humanizado neutralizador de la invención en una concentración de, por ejemplo, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 ó 50 pg/ml inhibirá una función biológica del HGF (por ejemplo, la estimulación de la proliferación o dispersión) en alrededor de por lo menos un 50%, pero preferentemente un 75%, más preferentemente un 90% ó un 95% o aún un 99%, y de manera más preferible aproximadamente un 100% (esencialmente por completo) , como se probó con los métodos descritos más abajo en el título Ejemplos o con los conocidos en el arte. Típicamente, la extensión de la inhibición se mide cuando la cantidad de HGF usado es sólo suficiente para estimular completamente la actividad biológica, o es de 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 3, ó 10 g/ml. Preferentemente, se logrará por lo menos un 25%, 50%, 75%, 90%, ó 95% o la inhibición esencialmente completa cuando la relación molar del anticuerpo del HGF es de O.lx, 0.5x, lx, 2x, 3x, 5x, ó lOx. De manera más preferible, el mAb neutralizará no sólo una, sino varias de las actividades biológicas listadas anteriormente; para los propósitos descritos, un mAb anti-HGF que neutraliza todas las actividades biológicas del HGF será llamado "neutralizador total", y tales mAbs son los más preferidos. Los mAbs de la invención preferentemente se enlazan de manera especifica con el HGF, esto es, estos no se enlazarán, o se enlazarán a una extensión mucho menor, de proteínas que se relacionan con el HGF tales como el factor de crecimiento del fibroblasto (FGF, por sus siglas en inglés) y el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF, por sus siglas en inglés) . Los mAbs de la invención tienen comúnmente una afinidad de enlace (Ka) con el HGF de por lo menos 107 M"1, pero preferentemente de 108 M"1 ó más, y de manera más preferente de 109 M"1 ó más, o aún 1010 M"1 ó más. Los mAbs humanizados de la invención incluyen anticuerpos anti-HGF en su forma tetramérica natural (2 cadenas ligeras y 2 cadenas pesadas) y pueden ser de cualquiera de los isotipos conocidos IgG, IgA, IgM, IgD e IgE y sus subtipos, es decir, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 y pueden incluir una cadena ligera lambda o kappa. Los mAbs de la invención también incluyen fragmentos de anticuerpos tales como Fv, Fab y F(ab' )2' anticuerpos híbridos bifuncionales (por ejemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol . 17:105, 1987), anticuerpos de cadena única (Huston et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988) ; y anticuerpos con regiones constantes alteradas (por ejemplo, Patente de E.U. No. 5,624,821) . La fuente de las CDRs del mAb puede ser de origen animal (por ejemplo, de ratón, rata, hámster o pollo), o puede ser modificada con ingeniería genética. Los mAbs de roedor son producidos por métodos estándar bien conocidos en el arte, incluyendo la inmunización múltiple con HGF en un adyuvante apropiado i.p., i.v., o dentro de una almohadilla para cultivo, seguido de la extracción de células nodo de bazo o de glándula linfática y la fusión con una línea de células inmortalizadas apropiadas, y entonces la selección de la hibridoma que produce el anticuerpo que se enlaza al HGF. La invención proporciona formas humanizadas del mAb L2G7 de ratón. Las secuencias de las regiones variables maduras de la cadena pesada y ligera del mAb L2G7 de ratón se muestran en la Figura 1A y IB respectivamente. De este modo, las formas humanizadas del mAb L2G7 abarcan la mayoría o todos los aminoácidos de la CDR a partir de estas secuencias en los marcos abiertos de lectura humanos de la región variable (incluyendo los marcos abiertos de lectura humanos de secuencia única, compuesta o consensada) . Por ejemplo, algunos anticuerpos humanizados incluyen tres CDRs intactas de la cadena pesada del L2G7 y tres CDRs intactas de la cadena ligera. Otros anticuerpos humanizados incluyen por lo menos una CDR intacta de la cadena pesada del L2G7 y por lo menos una CDR intacta de la cadena ligera del L2G7. Algunos anticuerpos humanizados incluyen por lo menos una CDR en la cual algunos residuos son de la CDR correspondiente del L2G7 y los otros son de una CDR de un anticuerpo humano, preferentemente del mismo anticuerpo humano que suministra el marco abierto de lectura de la región variable que contiene la CDR. En algunos anticuerpos humanizados de la invención, por lo menos 1, 3, 5 ó todas las posiciones seleccionadas del grupo de H29, H30, H48, H66, H67, H71, H94, L3 y L60 se ocupan por un aminoácido presente en la posición correspondiente en la numeración de Kabat en el anticuerpo L2G7 de ratón. En los marcos abiertos de lectura de la región variable del aceptor humano usados en los Ejemplos, todas estas posiciones son ocupadas por residuos humanos que difieren del aminoácido presente en la posición correspondiente en el anticuerpo L2G7 de ratón. De este modo, es preferible sustituir todas o la mayoría de las posiciones seleccionadas del grupo. Sí se utilizan otros marcos de lectura abiertos humanos de la región variable, algunas de las posiciones pueden ser ocupadas por los aminoácidos que son los mismos en el marco abierto de lectura humano de la región variable y en el anticuerpo L2G7 de ratón. En conformidad, la sustitución no se realiza en tales posiciones, pero puede ser realizada en otras posiciones que difieren de entre el marco abierto de lectura humanos de la región variable y el anticuerpo L2G7 de ratón, en conformidad con las reglas de Queen, E.U. 5,530,101 y E.U. 5,585,089. A pesar de la elección del marco abierto de lectura humano de la región variable, la sustitución de otros aminoácidos además de aquellos especificados dentro del grupo anterior también es posible como se describe más adelante. Sin embargo, en general, ni el marco abierto de lectura de la región variable de la cadena pesada, ni el marco abierto de lectura de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado, incluye más de diez o doce sustituciones resultando en residuos no presentes en el marco abierto de lectura de la región variable del aceptor humano (incluyendo los marco abierto de lecturas humanos de la región variable de consenso y los marco abierto de lectura humanos de la región variable compuesta, como se describe anteriormente) . Cualquier región constante presente en los anticuerpos humanizados de la invención son humanos o esencialmente humanos, sin tener más de diez, y preferentemente dos ó menos sustituciones relativas a una región humana constante natural. Algunas sustituciones son benéficas en el aumento de la vida media de un anticuerpo y/o en su afinidad con el FcyRn, como se describe más adelante. Otras sustituciones, normalmente sustituciones conservativas, como se describe más adelante, tienen un efecto neutral.

Formas humanizadas ejemplificadas del L2G7 incluyen regiones variables maduras de cadenas pesada y ligera con las secuencias mostradas en las Figuras 2A y 2B respectivamente. Otras formas preferidas de L2G7 humanizados incluyen regiones variables maduras de cadenas pesada y ligera con secuencias idénticas en un 90%, 95%, 98% ó 99% a estas secuencias (cuando se alinean en conformidad con la numeración de Kabat, supra) , y/o difieren de estos por un número pequeño (implicando típicamente no más de 5 ó 10 aminoácidos) de las sustituciones, supresiones y/o inserciones inconsecuentes funcionalmente . Por ejemplo, el primer aminoácido de la cadena pesada puede ser Glu o Gln. Las sustituciones son usualmente conservativas, estos es que reemplazan un aminoácido con uno que es químicamente similar. Para propósitos de clasificar las sustituciones de aminoácidos como conservativas o no conservativas, los aminoácidos pueden ser agrupados de la siguiente manera: Grupo I (cadenas hidrofóbicas ) : Met, Ala, Val, Lau, lie; Grupo II (cadenas hidrofílicas neutrales) : Cys, Ser, Thr; Grupo III (cadenas acídicas) : Asp, Glu,; Grupo IV (cadenas básicas) : Asn, Gln, His, Lys, Arg; Grupo V (residuos que influencian la orientación de la cadena) : Gly, Pro; y Grupo VI (cadenas aromáticas) : Trp, Tyr, Phe . Las sustituciones conservativas son aquellas que implican sustituciones entre aminoácidos en el mismo grupo. Las sustituciones relacionadas con las regiones V en las Figuras 2A y 2B son evitadas preferentemente en las posiciones H29, H30, H48, H66, H67, H71, H94, L3 y L60, en las que los aminoácidos del L2G7 de ratón se incluyen debido a la interacción de estas posiciones con las CDRs, como se describe en los Ejemplos. Las sustituciones ocurren preferentemente en las posiciones del marco abierto de lectura de la región variable, pero también pueden ocurrir en las regiones de la CDR. Si una región de la CDR se sustituye, es preferible reemplazar un aminoácido de ratón con un aminoácido de la posición correspondiente (numeración de Kabat) de un anticuerpo humano, preferentemente el mismo anticuerpo humano que suministra los marcos abiertos de lectura de la región variable del aceptor.

Usualmente, los mAbs L2G7 humanizados son del isotipo IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 con una cadena ligera kappa . Un mAb IgGl con las regiones variables de las Figuras 2A y 2B respectivamente combinadas con toda la región humana constante kappa y gamma-1 se designan HuL2G7. Las cadenas completas pesada y ligera del HuL2G7 se muestran de manera correspondiente en las Figuras 3A y 3B. Sólo las partes maduras de estas secuencias que comienzan en las posiciones indicadas por el número 1 constituyen realmente el HuL2G7, mientras los péptidos precedentes de señalización se separan antes o durante la secreción del anticuerpo. Variantes del HuL2G7 que conservan características similares de enlace con el HuL2G7 pueden obtenerse por la mutagénesis seguida de la selección de la masa usando los métodos de expresión en fago descritos anteriormente. Las variantes son seleccionadas inicialmente para enlazar específicamente al HGF, opcionalmente en competencia con el HuL2G7 o el L2G7 de ratón. Las variantes con las mismas o similares características de enlace, como el anticuerpo ejemplificado, pueden entonces ser probadas funcionalmente . Los mAbs L2G7 humanizados preferidos son neutrali zadores o totalmente neut rali zadores del HGF como se define supra. Preferentemente, para algunas, la mayoría o todas las propiedades biológicas del HGF medidas (por ejemplo, el enlace con el Met, la estimulación de la proliferación de las Mv 1 Lu ó las células HUVEC) , la actividad de neutralización del mAb humanizado está dentro de 3 veces, más preferentemente de 2 veces ó 1.5 veces, y de manera más preferible es indistinguible (es decir, dentro del error experimental) de la actividad neutrali zadora del L2G7 por sí misma. Esto es, no más de 3 veces, 2 veces, 1.5 veces ó la misma cantidad de mAb humanizados, con respecto al L2G7, se necesitan para obtener la misma extensión de inhibición de la propiedad biológica (por ejemplo, medido por IC50's) . Preferentemente, la afinidad para el HGF de los mAbs humanizados también está dentro de 3 veces, 2 veces o es esencialmente indistinguible de aquel del L2G7. De manera similar, en los modelos de xenoinjerto de ratón (por ejemplo, usando una linea de célula humana de glioma tal como la U87), los mAbs humanizados preferentemente inhiben el crecimiento del tumor dentro de 3 veces, 2 veces o es indistinguible del mAb L2G7 de ratón. En efecto, preferentemente sólo una dosis de 40, 20 ó 10 pg de mAb humanizado administrada dos veces por semana inhibe completamente el crecimiento del xenoinjerto del tumor U87. Los mAbs humanizados pueden ser expresados por una variedad de métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, los genes que codifican sus regiones V de las cadenas pesada y ligera pueden ser los primeros sintetizados a partir de los oligonucleótidos sobrepuestos o por la mutagénesis de PCR de una variante antes preparada del gen deseado. Debido a la degeneración del código genético, una variedad de secuencias de ADN codifican cada secuencia de aminoácido del anticuerpo. Todas las secuencias de ADN que codifican los anticuerpos descritos en esta solicitud se incluyen de manera expresa en la invención. Como se halla hecho, los genes codifican los genes de las cadenas pesada y ligera del mAb humanizado y se insertan en conjunto con las regiones C dentro de los vectores de expresión (por ejemplo, disponibles de manera comercial de Invitrogen) que proporciona las regiones regulatorias necesarias, por ejemplo, promotores, resaltadores, sitios poli-A, etc. Se prefiere el uso del promotor-resaltador del CMV. Los genes para las regiones C están ampliamente disponibles ahora o pueden ser clonadas fácilmente por medio de PCR a partir del anticuerpo humano que produce células. Los genes de cadenas pesada y ligera pueden ser insertados juntos en un vector único o en vectores separados. Los vectores de expresión pueden entonces ser t ransfectados utilizando varios métodos conocidos en el arte tales como la lipofección o la electroporación en una variedad de lineas de células mamíferas tales como CHO o 293 o mielomas no productoras que incluyen Sp2/0 y NSO, y células que expresan los anticuerpos seleccionados por la selección antibiótica natural. Ver, por ejemplo, la Patente de E.U. No. 5,530,101. Mayores cantidades de anticuerpos pueden ser producidas al hacer crecer las células en bioreactores comercialmente disponibles. Una vez expresados, los mAbs humanizados de la invención pueden ser purificados en conformidad con procedimientos estándar del arte tales como la microf iltración, la ultraf iltración, la cromatografía por afinidad de la proteína A o G, la cromatografía por exclusión por tamaño, la cromatografía por intercambio de aniones, la cromatografía por intercambio de cationes y/u otras formas de cromatografía por afinidad en base a tintes orgánicos o parecidos. Se prefieren anticuerpos sustancialmente puros de por lo menos un 90 ó 95% de homogeneidad, para usos farmacéuticos se prefiere más un 98% ó 99% ó más de homogeneidad . 3. Métodos terapéuticos. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica que incluye los anticuerpos humanizados descritos aquí. Las formulaciones farmacéuticas de los anticuerpos contienen al mAb en un portador fisiológicamente aceptable, opcionalmente con excipientes o estabilizadores, en la forma de soluciones acuosas o liof ilizadas . Los portadores aceptables, excipientes o estabilizadores, no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato o acetato con un pH típicamente de 5.0 a 8.0, más a menudo de 6.0 a 7.0; sales tales como el cloruro de sodio, cloruro de potasio, etc. para hacer isotónicos; antioxidantes, preservadores polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas, polímeros hidrofílicos tales como el polisorbato 80, aminoácidos, carbohidratos, agentes quelantes, azúcares, y otros ingredientes estándar conocidos por aquellos con habilidad en el arte (ver, Remington's Pharmacuet ical Science 16th edition, Osol, A. Ed. 1980) . El mAb se encuentra presente de manera típica en una concentración de 1 - 100 mg/ml, por ejemplo, 10 mg/ml.

En otra modalidad preferida, la invención proporciona un método de tratar a un paciente con una enfermedad usando un mAb anti-HGF humanizado, tal como el L2G7 humanizado, por ejemplo, el HuL2G7, en una formulación farmacéutica. El mAb preparado en una formulación puede ser administrado a un paciente por medio de cualquier ruta apropiada especialmente de manera parental por una infusión intravenosa o una inyección en bolo, de manera intramuscular o subcutánea. La infusión intravenosa puede darse durante un periodo tan corto como 15 minutos, pero más a menudo durante 30 minutos, o aún durante 1, 2 ó 3 horas. El mAb también puede ser inyectado directamente en el lugar de la enfermedad (por ejemplo, un tumor) , o encapsulado dentro de agentes portadores tales como los liposomas. La dosis dada es suficiente para aliviar la condición a tratar ("dosis terapéutica efectiva") y es más probable que sea de 0.1 a 5 mg/kg de peso del cuerpo, por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4 mg/kg, pero puede ser tan alta como 10 mg/kg o aún 15 ó 20 mg/kg. Una unidad fija de dosis también puede ser administrada, por ejemplo, 50, 100, 200, 500 o 1000 mg, o la dosis puede estar basada en el área superficial del paciente, por ejemplo, 100 mg/m2. Usualmente entre 1 y 8 dosis (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) se administran para tratar el cáncer, pero 10, 20 o más dosis pueden ser administradas. El mAb puede ser administrado diariamente, dos veces por semana, semanalmente , quincenalmente, mensualmente o con algún otro intervalo, dependiendo, por ejemplo, de la vida media del mAb, durante 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 3-6 meses o más. También son posibles cursos repetidos de tratamiento, como la administración crónica. Las enfermedades especialmente susceptibles a la terapia con los mAbs de HGF humanizados de esta invención, por ejemplo, el HuL2G7, incluyen tumores sólidos que se cree requieren de la angiogénesis para ser asociados con niveles elevados del HGF, por ejemplo, cáncer de ovarios, de seno, de pulmón (de célula pequeña o de célula no pequeña) , de colon, de próstata, de páncreas, gástrico, del hígado, tumores en la cabeza-cuello, melanomas y sarcomas de niños o adultos, y tumores cerebrales. Claro está, los métodos de esta invención, especialmente el tratamiento sistémico con un mAb L2G7 humanizado, son especialmente aplicables para el tratamiento de tumores cerebrales que incluyen meningiomas ; gliomas que incluyen ependinomas, oligodendrogliomas , y todos los tipos de astrocitomas (de bajo grado, anaplásicos, y glioblastomas multiformes o glioblastomas simples); meduloblastomas , gangliogliomas , schwannomas, cordomas; y tumores cerebrales principalmente de niños que incluyen tumores neuroectodérmicos primitivos. Los tumores cerebrales primarios (es decir, los que nacen en el cerebro) y los tumores cerebrales secundarios o metastáticos pueden ser tratados por los métodos de la invención. Otras enfermedades apropiadas para el tratamiento con los métodos de la invención son aquellos asociados con la angiogénesis no deseada, tal como la retinopatia diabética, la degeneración macular relacionada con la edad, la artritis reumatoide y la psoriasis. En una modalidad especialmente preferida, el mAb anti-HGF humanizado, por ejemplo, el HuL2G7, se administra en conjunto con (es decir, antes, durante o después) otra terapia anticáncer. Por ejemplo, el mAb puede ser administrado en conjunto con cualquiera de una o más de las múltiples drogas quimioterapéuticas conocidas por aquellos con habilidad en el arte de la oncología, por ejemplo, agentes de alquilación, tales como la carmustina, clorambucilo, cisplatino, carboplatino, oxiplatino, procarbazina, y ciclofosfamida ; ant imetabolitos tales como el fluorouracilo, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, metotrexato e hidroxiurea ; productos naturales incluyendo los alcaloides y antibióticos botánicos tales como la bleomicina, doxorubicina , daunorubicina , idarubicina, etoposido, mitomicina, mitoxantrona , vinblastina, vincristina, y Taxol (paclitaxel) o compuestos relacionados tales como el Taxotere®; agentes aprobados específicamente para los tumores cerebrales que incluyen la temozolamida y obleas de Gliadel® que contienen carmustina; u otras drogas que incluyen irinotecan y Gleevec® y todos los agentes anticáncer aprobados y experimentales listados en el documento WO 2005/017107 A2 (que se incorpora aquí a manera de referencia) . Otros agentes con los cuales puede ser administrado el mAb anti-HGF humanizado incluyen agentes biológicos tales como los anticuerpos monoclonales , incluyendo el Herceptin® contra en antigeno HER2, el Avastin® contra el VEGF, o anticuerpos para el receptor del EGF. Asi como también las drogas anti-angiogénicas de molécula pequeña o antagonistas del receptor del EGF. Además, el mAb anti-HGF humanizado puede ser usado en conjunto con la terapia de radiación o la cirugía. El tratamiento (por ejemplo, la quimioterapia estándar) que incluye al anticuerpo mAb anti-HGF humanizado, por ejemplo, al HuL2G7, puede incrementar el tiempo medio de supervivencia sin progreso o el tiempo total de supervivencia de los pacientes con estos tumores (por ejemplo, de ovarios, de seno, de pulmón, de páncreas, de cerebro y de colon, especialmente cuando recaen o retraen) en por lo menos un 30% ó 40%, pero de manera preferida un 50%, 60% a 70% o aún 100% o más, en comparación con el mismo tratamiento (por ejemplo, quimioterapia), pero sin el mAb anti-HGF. Además o de manera alternativa, el tratamiento (por ejemplo, la quimioterapia estándar) que incluye el mAb anti-HGF puede incrementar la tasa total de respuesta, la tasa parcial de respuesta, o la tasa objetivo de respuesta (total + parcial), de los pacientes con estos tumores (por ejemplo, de ovario, de seno, de pulmón, de páncreas, de cerebro y de colon, especialmente cuando recaen o retraen) , en por lo menos un 30% ó 40%, pero preferentemente un 50%, 60% a 70% o aún en un 100%, en comparación con el mismo tratamiento (por ejemplo, quimioterapia), pero sin el mAb anti-HGF. Para los tumores cerebrales tales como los glioblastomas , el tratamiento con el mAb anti-HGF humanizado, sólo o en combinación con otros agentes, provee de manera preferida una tasa parcial, total u objeto de respuesta de por lo menos un 5% ó 10%, más preferentemente un 20% ó un 25% ó un 30% y de manera más preferida un 40%, un 50% ó más. Típicamente, en una prueba clínica (por ejemplo, una prueba de fase II, fase II/III o fase III), lo antes mencionado aumenta la supervivencia media sin progreso y/o la tasa de respuesta de los pacientes tratados con la terapia estándar más el mAb anti-HGF humanizado, por ejemplo, el HuL2G7, con relación al grupo de control de pacientes que reciben sólo la terapia estándar (o más un placebo) , que son estadísticamente significativos, por ejemplo en el nivel p = 0.05 ó 0.01 o aún 0.001. Las tasas totales y parciales de respuesta son determinadas por el criterio objetivo, usado comúnmente en pruebas clínicas para el cáncer, por ejemplo, como se enlistan o aceptan por el Instituto Nacional del Cáncer (de E.U.) y/o la Administración de Alimentos y Medicinas (de E.U.) . 4. Otros métodos Los mAbs anti-HGF humanizados de la invención también tienen uso en los métodos de diagnóstico, pronóstico y de laboratorio. Pueden ser usados para medir el nivel del HGF en un tumor o en la circulación de un paciente con un tumor, y por consiguiente en el seguimiento y manejo del tratamiento del tumor. Por ejemplo, un tumor asociado con altos niveles del HGF seria especialmente susceptible de ser tratado con un mAb anti-HGF humanizado. En modalidades particulares, los mAbs pueden ser usados en un ELISA o una prueba radio-inmunológica para medir el nivel del HGF, por ejemplo, en un espécimen de biopsia de tumor o en suero o en medios supernatátiles de las células que secretan el HGF en el cultivo celular. Para varias pruebas, el mAb anti-HGF puede ser etiquetado con moléculas fluorescentes, moléculas etiquetadas por giro, encimas o radioisotipos , y pueden ser provistos en forma de equipo con todos los reactivos necesarios para realizar la prueba del HGF. En otros usos, los mAbs anti-HGF se utilizan para purificar el HGF, por ejemplo, por afinidad cromatográfica .

EJEMPLO 1. Construcción de un anticuerpo humanizado L2G7 La generación del mAb L2G7 anti-HGF de ratón, que neutraliza todas las actividades biológicas probadas del HGF, ya ha sido descrito (Kim et al., US20050019327 , presentada el 13 de Agosto del 2004, y Kim et al. Clin. Cáncer Res. 12:1292, 2006) . El primer paso para humanizar el L2G7 fue clonar sus genes de cadena pesada y ligera, lo cual fue complementado esencialmente en conformidad con el método de Co et al., J. Immunol. 148:1149, 1992. Brevemente, se preparó ARN de 106 células de L2G7 (lgG2a, K) de hibridoma, usando un Mini Kit RNeasy (Qiagen) , seguido de una síntesis del primer filamento del cADN con cebadores aleatoriamente, utilizando un equipo de Stratagene y la adición de colas dG con deoxinucleotidil transferasa terminal (Promega) . Las regiones V de cadena pesada y ligera fueron amplificadas respectivamente a partir del cADN con una primera alineación con las colas dG y una alineación del cebador con la región N-terminal del Cy2 a para la cadena pesada y una alineación del cebador para la región N-terminal del CK para la cadena ligera, utilizando una polimerasa de alta fidelidad AccuPrime Pfx ( Invitrogen ) . Las bandas de tamaños apropiados fueron purificadas por gel, a partir de las reacciones PCR, y secuenciadas directamente o clonadas y entonces secuenciadas , usando el método de dideoxi de terminación con un secuenciador automatizado. Una secuencia de cADN única se encontró para la cadena pesada, que se muestra después del traslado en la Figura 1A. Se encontraron dos secuencias no aberrantes de cADN de cadena ligera, pero la secuenciación del aminoácido de la N-terminal de la cadena ligera aislada del L2G7 reveló sólo una de estas cadenas, siendo mostrada la secuencia de aminoácido trasladada en la Figura IB. Para expresar una forma quimérica del L2G7 y después el mAb humanizado, los vectores de expresión similares a los vectores pVk y pVgl descritos en Co et al., J. Immunol. 148:1149, 1992, que contiene los genes humanos CK y Cyi, se construyeron a partir de vectores comercialmente disponibles y fragmentos de ADN . Sin embargo, el vector de la cadena ligera tiene el marcador elegible hyg en lugar del gpt, y el vector de la cadena pesada tiene el marcador elegible neo en lugar del Dhfr. Los genes clonados VL y VH se sub-clonaron en los lugares apropiados de estos vectores para generar plásmidos de expresión para los genes de cadena pesada y ligera del mAb L2G7 quimérico (chL2G7) . El mAb chL2g7 fue producido y mostrado para enlazar al HGF, asi como lo hace el L2G7 también. Proporcionando que han sido clonadas regiones V de cadena pesada y ligera correctas. Para diseñar un mAb L2G7 humanizado, se siguieron de manera general los métodos de Queen et al., Patentes de E.U. Nos. 5, 530,101 y 5,585, 089. La base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés) de las secuencias del anticuerpo humano fueron escaneadas, y la secuencia VH AAC18323 humana y la secuencia BAC01726 humana se eligieron de manera correspondiente para servir como secuencias del aceptor para las secuencias VH y VL del L2G7, debido a que estas tienen una homología del marco abierto de lectura particularmente alta (es decir, la identidad de secuencia) con estas. Un programa computacional , Deep View Swiss-Pdb Viewer, disponible en la red mundial (http://www.expasy.org/spdbv) , se usó para construir un modelo molecular del dominio variable del L2G7, el cual fue usado para localizar los aminoácidos en el marco abierto de lectura del L2G7 que están lo suficientemente cerca a las CDRs para interactuar de manera potencial con estas. Para diseñar las regiones variables de cadena pesada y ligera del L2G7 humanizado, las CDRs el mAb L2G7 de ratón fueron injertadas primero de manera conceptual en las regiones del marco abierto de lectura del aceptor. En las posiciones del marco abierto de lectura donde el modelo computacional sugirió un contacto importante con las CDRs, las cuales pueden ser necesitadas para mantener la conformación de la CDR, los aminoácidos del anticuerpo de ratón fueron sustituidos por los aminoácidos de marco abierto de lecturas humanos originales. Para el mAb L2G7 humanizado, designado como HuL2G7, esto se realizó en los residuos 29, 30 (dentro del bucle de híper-variable de Chothia Hl), 48, 66, 67, 71 y 94 de la cadena pesada, y en los residuos 3 y 60 de la cadena ligera, usando la numeración de Kabat . Además, el aminoácido 1 de la cadena pesada se reemplazó con E (Glu) , debido a que este aminoácido es menos probable que Q (Gln) de experimentar la derivación en la proteina del anticuerpo. Las secuencias de la región V de la cadena pesada y ligera del HuL2G7 se mostraron alineadas hacia el L2G7 correspondiente y las regiones V del aceptor en las Figuras 2A y 2B, con las CDRs y los aminoácidos sustituidos realzados. La invención también proporciona mAbs L2G7 humanizados variantes cuyas regiones maduras variables de cadenas pesada y ligera difieren de las secuencias del HuL2G7 por un pequeño número (por ejemplo, típicamente no más de 1, 2, 3, 5 ó 10) de reemplazos, supresiones o inserciones, usualmente en el marco abierto de lectura, pero posiblemente en las CDRs. En particular, sólo un subgrupo de sustituciones descritas anteriormente pueden ser hechas en los marco abierto de lecturas del aceptor, o pueden realizarse sustituciones adicionales, por ejemplo, el aminoácido 69F VH del L2G7 de ratón puede reemplazar al aminoácido 69M del aceptor. Por otra parte, el aminoácido 1E VH puede ser Q en cambio. Claramente, muchos de los residuos del marco abierto de lectura que no están en contacto con las CDRs en el HuL2G7 pueden acomodar sustituciones de aminoácidos a partir de las posiciones correspondientes del L2G7 u otros anticuerpos humanos o de ratón, e inclusive muchos residuos potenciales en contacto con las CDRs también son de fácil sustitución e inclusive aminoácidos dentro de las CDRs. La mayoría de la veces los reemplazos hechos en las secuencias variantes del L2G7 humanizado son conservativas con respecto a los aminoácidos reemplazados del HuL2G7. Preferentemente, los reemplazos en el HuL2G7 (conservativas o no) , no tienen efecto sustancial en la afinidad o potencia de enlace del mAb humanizado, esto es, su habilidad para neutralizar las actividades biológicas del HGF (por ejemplo, la potencia en algunos o todas las pruebas descritas aquí del mAb variante del L2G7 humanizado es esencialmente la misma, es decir, dentro del error experimental, como aquel del HuL2G7) . Preferentemente, las secuencias de la región V variable madura de cadena pesada y ligera son idénticas por lo menos en un 90%, de manera más preferida por lo menos en un 95%, y de la manera más preferida por lo menos en un 98%, a las regiones maduras de cadena pesada y ligera del HuL2G7. De manera alternativa, otras regiones variables del anticuerpo humano con alta identidad de la secuencia con aquellas del L2G7 también son apropiadas para suministrar el marco abierto de lectura del anticuerpo humanizado, especialmente las regiones V kappa del subgrupo humano I y las regiones V de cadena pesada del subgrupo humano I, o las secuencias de consenso de estos subgrupos . El mAb HuL2G7 ejemplar, descrito en los Ejemplos a continuación, tiene regiones constantes K y yl y es, por lo tanto, un IgGl: las secuencia completas de los genes HuL2G7 de cadena pesada o ligera que incluyen péptidos de señalización se muestran en las Figuras 3A y 3B. (Por supuesto, los péptidos de señalización son separados y no son parte del HuL2G7) . Sin embargo, se entiende que los mAbs IgGl de otros alotipos (IgGl, K) son abarcados por la designación HuL2G7. Los mAbs humanizados de otros isotipos (por ejemplo, IgG2, IgG3 e IgG4) pueden ser producidos al combinar las regiones variables del HuL2G7 con las regiones constantes humanas apropiadas. Los reemplazos pueden ser hechos en las regiones constantes del HuL2G7 para reducir o incrementar la función del efector, tal como la citotoxicidad complementada-mediada o ADCC (ver, por ejemplo, inter et al., Patente de E.U. No. 5,624,821; Tso et al., Patente de E.U. No. 5,834,597; y Lazar et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 103:4005, 2006), o para prolongar la vida media en los humanos (ver, por ejemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004) . Específicamente, pero sin limitar, el HuL2G7 con mutaciones en la región constante del IgG, con un Gln en la posición 250 y/o un Leu en la posición 428, son modalidades de la presente invención. Habiendo diseñado el mAb HuL2G7, es decir, habiendo elegido las secuencias de aminoácido de sus regiones V de cadena pesada y ligera (Figura 2 y Figura 3) , las secuencias de ADN que codifican las regiones V (incluyendo péptidos de señalización) fueron elegidas de manera rutinaria por medio del código genético; las secuencias comenzaron con CTGGAGACCACC antes del codón inicializador ATG para proveer un sitio de restricción para la clonación y una señalización de la inicialización de la translación de Kozak. Estos genes fueron sintetizados de manera comercial por Genscript Corp. (Piscataway, NJ) . De manera alternativa, el método de Co et al., J. Immunol. 148:1149, 1992, puede ser usado para sintetizar cada gen de la región V. Brevemente, se sintetizan dos pares de oligonucleótidos superpuestos en filamentos alternativos ( sintetizador de ADN de Applied Biosystems) , que en conjunto abarcan al gen entero. Los oligonucleótidos son de 110 a 140 bases de largo con la superposición de 15 bases. Fragmentos de ADN de doble filamento se sintetizan usando polimerasa de Klenow del par 5' y del par 3' de oligos, separadamente. El fragmento 5' de ADN es segmentado con las enzimas de restricción cortando el extremo 5' y el centro del gen de la región V. El fragmento 3' de ADN es segmentado con las enzimas de restricción cortando el centro y el extremo 3' del gen de la región V. Cada fragmento segmentado se inserta en un vector apropiado de clonado y se transforma en E. coli, y se secuencia ADN a partir de una cantidad de disociaciones para encontrar fragmentos que hayan corregido de manera completa las secuencias. Para cada gen, se realiza entonces una ligadura de 3 vías para insertar los fragmentos 5' y 3' correctos en el vector de expresión apropiado para formar el gen completo, secuencia del cual es verificada. Producir el mAb HuL2G7, se cultivaron las células 293-F epiteliales renales humanas (Invitrogen) en un medio de expresión FreeStyke 293 (medio FS ; Invitrogen) y re-suspendidas en un medio FS de 106 células /2 mi /macrowell. Los ADNs de vector de expresión de cadena pesada y ligera del HuL2G7 (1 pg de cada uno) se incubaron con 3 µ? de Fugene 6 (Roche) en 100 µ? de medio FS durante 30 minutos en RT; la mezcla entonces fue añadida a las células. Después de una incubación de 48 hrs . , las células transfectadas fueron cultivadas en presencia de 1 mg/ml de G418 para seleccionar las células que expresan el neo y entonces dispersarlas en placas de cultivo de tejido de 96 pozos (100 µ?/????) . Después de aproximadamente 2 semanas, cuando los pozos que contienen células viables se han hecho confluentes, fueron probados los supernatátiles cultivados a partir aquellos pozos en la presencia y cantidad del HuL2G7 por medio de ELISA. Las células transfectadas pueden encubrir un desbalance de cadenas pesada y ligera, de modo que se asegure que solo se mida el HuL2G7 completo, esta ELISA utiliza un Fe anti-humano de cabra como un agente de captura y un kappa anti-humano biotinilado como reactivo de detección. El mAb chL2G7 fue expresado de manera similar. Clones de las células que expresan niveles relativamente altos de ChL2G7 y HuL2G 7 fueron expandidos y desarrollados respectivamente en un medio FS . El anticuerpo fue purificado a partir del cultivo de supernatátiles usando la cromatografía de afinidad de proteína A y analizado en pureza por medio de la SDS-PAGE. 2. Propiedades del HuL2G7 Para comparar la afinidad de enlace del HuL2G7 con aquella del ChL2G7 y del L2G7, se realizó un experimento de enlace competitivo. Se cubrió una placa microtiter con 50 µ?/???? de 2 pg/ml de IgG-Fc (GahlgG-Fc) anti-humano de cabra en PBS durante 1 noche a 4 °C y bloqueada con 2% de BSA durante 1 hora en R . Después del lavado, la placa se incubó con 50 µ?/???? de mAb ChL2G7 (2 g/pozo) durante 1 hora en RT, seguido del lavado por 50 µ?/???? de IgG humano (10 µg/ml) durante 1 hora para reducir el antecedente. Después de los lavados, los pozos de la placa fueron incubados de manera separada durante 1 hora con 50 µ?/???? de varias concentraciones de HuL2G7, ChL2G7 o L2G7 purificados como competidor en conjunto con 50 µ?/???? de HGF-bandera (1 g/ml). Después del lavado, las placas fueron incubadas entonces con 50 µ?/???? de mAb anti-bandera HRP-M2 (Invitrogen) y el HRP-anti-bandera M2 unido fue detectado por la adición del substrato de tetrametilbencidina . La Figura 4 muestra que el HuL2G7, el ChL2G7 y el L2G7 compitieron esencialmente bien de manera equitativa con el L2G7 unido a la placa en el enlace del HGF-bandera soluble, indicando que estos tres mAbs tienen una afinidad muy similar. Una actividad biológica clave del HGF es la habilidad de enlazarse a su receptor c-Met, de modo que se comparó la habilidad de los mAbs HuL2G7, ChL2G7 y L2G7 de inhibir el enlace del HGF con el Met . Se uso el et en la forma de Met-Fc y HGF en la forma de HGF-bandera, que fueron preparados como se describe (solicitud de Patente USSN 10/917,915, presentada el 13 de Agosto del 2004, y Kim et al. Clin Cáncer Res 12:1292, 2006) . Se cubrió una placa microtiter con 50 µ?/???? de 2 pg/ml cada uno de los dos mAbs anti-Met (Galaxy Biotech) en PBS durante la noche a A °C (de manera alternativa, 2 g/ml de GahlgG-Fc pueden ser usados) y se bloqueó con 2% de BSA durante 1 hora a RT . Después del lavado de las placas, 50 µ?/???? de Met-Fc (1 pg/ml) se añadieron a cada pozo durante 1 hora a RT, seguido después del lavado de 50 µ?/???? de IgG humano (10 g/ml) durante 1 hora para reducir el fondo. Después de lavar los placas, se añadieron 50 µ?/???? de HGF-bandera (0.5 µg/ml) pre-incubado con varias concentraciones de mAbs para cada pozo durante 1 hora. Después del lavado, las placas fueron incubadas con 50 µ?/???? de mAb anti-bandera HRP-M2 ( Invitrogen ) , y la HRP-anti-bandera-M2 unida fue detectada por la adición del sustrato como se describe anteriormente. La Figura 5 muestra este enlace bloqueada igualmente bien del HuL2G7, del ChL2G7 y del L2G7, del HGF, con el Met, de modo que estos mAbs tienen una actividad muy similar en esta prueba. Otra actividad biológica importante del HGF es la habilidad de estimular la proliferación de ciertas células, incluyendo las células epiteliales de pulmón de visón Mv 1 Lu . Para comparar la habilidad del HuL2G7 y del L2G7 para neutralizar esta actividad del HGF, las células Mv 1 Lu (2 x 104 células/100 L/pozo) desarrolladas en DMEM, conteniendo 10% de FCS, fueron re-suspendidas en DMEM sin suero y estimuladas con 100 L/pozo de HGF (40 ng/mL) más el crecimiento transformador del factor-ß? (1 ng/mL, R&D Systems), para reducir el antecedente, y varias concentraciones de HuL2G7, de L2G7 o de anticuerpo humano irrelevante de control. El nivel de proliferación celular fue determinado por medio de la adición de WST-1 (Roche Applied Science) durante 14 horas. La Figura 6 muestra que el HuL2G7 y el L2G7 tuvieron una actividad igualmente inhibidora en esta prueba. En resumen, el HuL2G7 fue por lo menos igualmente activo que el L2G7 en todas las pruebas realizadas, y es por lo tanto totalmente neutralizador ; ninguna actividad del L2G7 fue perdida en el proceso de humani zación . 3. Habilidad del HuL2G7 para inhibir el crecimiento tumoral in vivo Ya se ha mostrado que el mAb L2G7 es capaz de inhibir completamente el crecimiento de los xenoinjertos de glioma U87 en los modelos de ratón desnudo (solicitud de Patente USSN 10/917,915, presentada el 13 de Agosto del 2004, y Kim et al. Clin Cáncer Res 12:1292, 2006) . Para verificar que el HuL2G7 también tiene esta habilidad, se uso el mismo procedimiento experimental. Brevemente, ratones hembra NIH III Xid/Beige/Desnudos de 4-6 semanas de edad (Charles River Laboratories) fueron inyectados s.c. con 107 células en 0.1 mi de PBS en las áreas dorsales. Cuando el tamaño del tumor alcanzó -50 mm3, los ratones fueron divididos aleatoriamente en grupos (n = 6 por grupo) e inyectados con 40 pg de HuL2G7, de L2G7 o de PBS de control i.p. dos veces por semana en un volumen de 0.1 mi de PBS. Los volúmenes de tumor fueron determinados semanalmente al medir dos dimensiones (longitud, a, y ancho, b) y se calculo el volumen como V = ab2/2. La Figura 7 muestra que el HuL2G7 y el L2G7 inhibieron el crecimiento del tumor de manera indistinguible en esta prueba. Para definir adicionalmente la habilidad del HuL2G7 para inhibir el crecimiento del xenoinjerto de tumor, se usaron cuatro diferentes dosis del mAb, 40 pg, 20 pg, 10 pg y 5 pg, en un experimento similar. La Figura 8 muestra que aún la dosis marcadamente baja de 10 pg dos veces por semana fueron capaz de inhibir completamente el crecimiento del tumor, mientras la dosis aún menor de 5 µq produjo una inhibición buena, pero incompleta. De manera similar, cuando se administro sistemáticamente, el HuL2G7 inhibió efectivamente el crecimiento de xenoinjertos U87 intracraniales . Aunque la invención ha sido descrita con relación a las modalidades preferidas actualmente, debe entenderse que varias modificaciones pueden hacerse sin alejarse de la invención . Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas se incorporan aquí a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos, con la misma extensión como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuese especifica e individualmente indicada para ser incorporada a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos. El hibridoma L2G7 ha sido depositado el 29 de Abril del 2003 con la American Type Culture Collection, P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, con el Número ATCC PTA-5162, bajo el Tratado de Budapest. Este depósito será mantenido en un depósito autorizado y reemplazado en la ocurrencia de una mutación, la no viabilidad o una destrucción, durante un periodo de por lo menos cinco años después de que la solicitud más reciente de liberación de una muestra fuese recibida por el depósito, durante un periodo de por lo menos treinta años después de la fecha del depósito, o durante el cumplimiento de la vida de la patente relacionada, cualquier periodo que sea el más largo. Todas las restricciones sobre la disponibilidad pública de estas lineas celulares serán removidas de manera irrevocable por la emisión de una patente de la solicitud.

Claims (28)

1. Reivindicaciones 1. Un anticuerpo monoclonal humanizado (mAb) caracterizado porque enlaza y neutraliza el Factor de Crecimiento del Hepatocito (HGF) humano.
2. 2. El mAb de la reivindicación 1, caracterizado porque es un mAb L2G7 humanizado.
3. 3. El mAb de la reivindicación 2, caracterizado porque inhibe el enlace del HGF con el Met en por lo menos un 50%.
4. 4. El mAb de la reivindicación 2, caracterizado porque inhibe la proliferación inducida por HGF en las células Mv 1
5. Lu. 5. El mAb de la reivindicación 2, caracterizado porque neutraliza todas las actividades biológicas del HGF.
6. 6. El mAb de la reivindicación 2, caracterizado porque inhibe el crecimiento de un xenoinjerto de tumor humano en un ratón .
7. 7. El mAb de la reivindicación 6, caracterizado porque inhibe completamente el crecimiento de un xenoinjerto de tumor humano en un ratón.
8. 8. Un mAb humanizado caracterizado porque su región variable de cadena pesada tiene la secuencia de la Figura 2A etiquetada como HuL2G7.
9. 9. Un mAb humanizado caracterizado porque incluye una región variable madura de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido de la Figura 2A etiquetada como HuL2G7, excepto que el primer aminoácido es reemplazado con Gln.
10. 10. Un mAb humanizado de la reivindicación 8, caracterizado porque incluye adicionalmente una región variable de cadena ligera madura que tiene la secuencia de aminoácido de la Figura 2B etiquetada como HuL2G7.
11. 11. Un mAb humanizado caracterizado porque incluye regiones variables maduras de cadena pesada y ligera que tienen secuencias de aminoácidos que son idénticas por lo menos en un 90% a aquellas de las Figura 2A etiquetadas como HuL2G7 y de la Figura 2B etiquetada como HuL2G7, respectivamente .
12. 12. Un mAb humanizado de la reivindicación 11, caracterizado porque sus secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera son idénticas por lo menos en un 95% a aquellas del mAb de la reivindicación 10.
13. 13. Un mAb humanizado de las reivindicaciones 11 ó 12, provisto que por lo menos una posición seleccionada del grupo que consiste de H29, H30, H48, H66, H67, H71, H94, L3 y L60 es ocupada por el aminoácido presente en la posición correspondiente en la numeración de Kabat en el L2G7 de ratón .
14. 14. El mAb humanizado de las reivindicaciones 11 ó 12, provisto que por lo menos tres posiciones seleccionadas de dicho grupo son ocupadas por el aminoácido presente en la posición correspondiente mediante la numeración de Kabat en el anticuerpo L2G7 de ratón.
15. 15. El mAb humanizado de las reivindicaciones 11 ó 12, provisto que todas las posiciones de dicho grupo son ocupadas por el aminoácido presente en la posición correspondiente mediante la numeración de Kabat en el anticuerpo L2G7 de ratón .
16. 16. El mAb humanizado de la reivindicación 15, provisto además que la posición Hl es ocupada por Glu.
17. 17. Un mAb humanizado de la reivindicación 10, caracterizado porque es del isotipo (IgGl, K) .
18. 18. Un mAb humanizado de la reivindicación 2, caracterizado porque neutraliza las actividades biológicas del HGF, asi como lo hace también el L2G7.
19. 19. Un anticuerpo monoclonal humanizado (mAb) que enlaza y neutraliza el Factor de Crecimiento del Hepatocito (HGF) , caracterizado porque el anticuerpo humanizado incluye cadenas pesada y ligera humanizadas, incluyendo la cadena pesada humanizada las CDRs del L2G7 y una marco abierto de lectura humano de la región variable de cadena pesada proporcionado de modo que por lo menos una posición del marco abierto de lectura humano de la región variable de cadena pesada, seleccionada del grupo que consiste de H29, H30, H48, H66, H67, H71, H94, es ocupada por el aminoácido que ocupa la posición correspondiente en la cadena pesada del L2G7 incluyendo la cadena ligera humanizada las CDRs del L2G7 y un marco abierto de lectura humano de la región variable de cadena ligera proporcionado de modo que por lo menos una posición seleccionada del grupo que consiste de L3 y L60 es ocupada por el aminoácido que ocupa la posición correspondiente en la cadena ligera del L2G7.
20. 20. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 19, caracterizado porque todos los aminoácidos del grupo que consiste de H29, H30, H48, H66, H67, H71 y H94, son ocupados por el aminoácido que ocupa la posición correspondiente en la cadena pesada del L2G7 y cada posición seleccionada del grupo que consiste de L3 y L60 es ocupada por el aminoácido que ocupa la posición correspondiente en la cadena ligera del L2G7.
21. 21. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 19, provisto además que la posición Hl está ocupada por Glu.
22. 22. Una linea celular caracterizada porque produce un mAb de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
23. 23. Una composición farmacéutica caracterizada porque incluye un mAb de cualquiera de las reivindicaciones precedentes .
24. 24. Un método para tratar el cáncer en un paciente caracterizado porque incluye la administración al paciente de una composición farmacéutica que incluye un mAb de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
25. 25. Un método de la reivindicación 24, caracterizado porque dicho cáncer es un glioblastoma .
26. 26. El uso de un mAb de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para la fabricación de un medicamento.
27. 27. El uso de la reivindicación 26, para el tratamiento del cáncer.
28. 28. El uso de la reivindicación 26, en donde el cáncer es un glioblastoma.