MXPA06011822A - Anticuerpos monoclonales al factor de crecimiento de hepatocito. - Google Patents

Abstract

La presente invencion es concerniente con un anticuerpo monoclonal neutralizante al factor de crecimiento de hepatocito, una composicion farmaceutica que comprende el mismo y metodos de tratamiento que comprenden administrar tal composicion farmaceutica a un paciente, tal como para inhibir glioblastoma.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES AL FACTOR DE CRECIMIENTO DE HEPATOCITO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en general con la combinación de anticuerpo monoclonal (mAb) y tecnologías de ADN recombinantes para desarrollar nuevos compuestos biológicos y más en particular, por ejemplo a la producción de anticuerpos monoclonales que se enlazan a y neutralizan el factor de crecimiento de hepatocito.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En factor de crecimiento de hepatocito humano (HGF) es un polipéptido heterodimérico multifuncional producido por células mesenquimales . Se ha demostrado que el HGF estimula la angiogénesis, morfogénesis y mitogenesis, también como el crecimiento y dispersión de varios tipos de células (Bussolino et al., J. Cell. Biol. 119:629, 1992; Zarnegar and Michalopoulos, J. Cell. Bio. 129:1177, 1995; Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier y Gherardi, Trends Cell. Biol. 8:404, 1998; Xin et al. Am. J. Pathol. 158:1111, 2001) . Las actividades pleiotrópicas de HGF son moderadas por medio de su receptor, una tirosina quinasa de transmembrana codificada por el proto-oncogen cMet . Además de regular una variedad de funciones celulares normales el HGF y su receptor c-Met han demostrado estar involucrados en el inicio, invasión y metástasis de tumores (Jeffers et al., J. Mol. Med. 74:505, 1996; Comoglio y Trusolino, J. Clin. Invest. 109:857, 2002). HGF/cMet son co-expresados, frecuentemente sobreexpresados sobre varios tumores sólidos humanos en los que se incluyen tumores derivado de pulmón, colon, recto, estómago, riñon, ovario, piel, mieloma múltiple y tejido tiroides (Prat et al., Int. J. Cáncer 49:323, 1991; Chan et al., Oncogen 2:593, 1988, Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993; Der sen et al., Blood 99:1405, 2002). HGF actúa como un factor de crecimiento autocrino (Rong et al., Proc. Nacional. Acad. Sci. EUA 91:4731, 1994; Koochekpour et al., Cáncer Res. 57:5391; 1997) y paracrino (Weidner et al., A . J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993) y regulador anti-apoptótico (Gao et al., J. Biol. Chem. 276:47257, 2001) para estos tumores. HGF es una proteína de 102 kDa con secuencia y similaridad estructural al plasminógeno y otras enzimas de la coagulación de la sangre (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia) (Figura 1) . El HGF humano es sintetizado como un precursor de 728 aminoácidos (preproHGF) , que sufre escisión intracelular a una forma de una sola cadena inactiva (proHGF) (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Rosen et al., J. Cell.

Biol. 127:1783, 1994). En la secreción extracelular, el proHGF es escindido para producir la molécula heterodimérica disulfuro-enlazada biológicamente activa compuesta de una a- subunidad y ß-subunidad (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Naldini et al., EMBO J. 11:4825, 1992). La a-subunidad contiene 440 residuos (69 kDa con glicosilación), que consiste del dominio de horquilla N-terminal y cuatro dominios kringle. La ß-subunidad contiene 234 residuos (34 kDa) y tiene un dominio semejante a serina proteasa, que carece de actividad proteolítica. La escisión de HGF es requerida para la activación del receptor, pero no para el enlace del receptor (Hartmann et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EÜA B9: 11574, 1992; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268:17145, 1992). HGF contiene 4 sitios de N-glicosilación supuestos, 1 en la a-subunidad y 3 en la ß-subunidad. El HGF tiene dos sitios de enlace específico de célula únicos: un sitio de enlace de alta afinidad (Kd = 2 x "10 M) para el receptor cMet y un sitio de enlace de baja afinidad (Kd = 10-9 M) para proteoglicanes de sulfato heparina (HSPG) , que están presentes sobre la superficie celular y matriz extracelular (Naldini et al., Oncogene 6:501, 1991; Bardelli et al., J. Biotechnol. 37:109, 1994; Sakata et al., J.

Biol. Chem., 272:9457, 199). NK2 (una proteína que abarca el N-término y primeros dos dominios kringle de la a-subunidad) es suficiente para el enlace a cMet y activación de la cascada de señal para mobilidad, sin embargo la proteína de plena longitud es requerida para la respuesta mitogénica (Weidner et al., Am.

J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993). HSPG se enlace al HGF al interactuar con el término N de HGF (Aoya a, et al., Biochem. 36:10286, 1997; Sakata, et al., J. Biol. Chem. 272:9457, 1997). Las funciones postuladas para la interacción HSPG-HGF incluyen la mejora de la biodisponibilidad de HGF, actividad biológica y oligomerización (Bardelli, et al., J. Biotechnol. 37:109,1994; Zioncheck et al., J. Biol. Chem. 270:16871, 1995) . cMet es un elemento de la familia de receptor de proteína tirosina quinasa clase IV. El gen cMet de plena longitud fue clonado e identificado como el proto-oncógeno cMet (Cooper, et al., Nature 311:29, 1984; Park et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. EÜA 84:6379, 1987). El receptor cMet es sintetizado inicialmente como un precursor de una sola cadena, parcialmente glicosilado, pl70(MET> (figura 1) (Park et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EÜA 84:6379, 1987; Giordano et al., Nature 339:155, 1989; Giordano et al., Oncogene 4:1383, 1989; Bardelli et al., J. Biotechnol. 37:109, 1994). Después de la glicosilación adicional, la proteína es escindida proteolíticamente a una proteína madura de 190 kDa heterodimérica (1385 aminoácidos) , que consiste de la a-subunidad de 50 kDa (residuos 1-307) y la ß-subunidad de 145 kDa. El dominio de tirosina quinasa citoplásmica de la ß-subunidad está involucrado en la transducción de señal. Varios procedimientos diferentes han sido investigados para obtener una molécula antagónica de la interacción HGF/cMet: proteínas HGF truncadas tales como NK1 (dominio N terminal más dominio kringle 1; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268:17145, 1993), NK2 (dominio N terminal más dominios kringle 1 y 2; Chan et al., Science 254:1382, 1991) y NK4 (dominio N-terminal más cuatro dominios kringle; Kuba et al., Cáncer Res. 60:6737, 2000), mAbs anti-cMet (Dodge, Master' s Thesis, San Francisco State üniversity, 1998 y mAbs anti-HGF (Cao et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 98:7443, 2001, que es incorporado en la presente por referencia) . NK1 y NK2 pueden competir efectivamente con el enlace de HGF a su receptor, pero han demostrado tener actividades agonistas parciales in vitro (Cioce et al., J. Biol. Chem. 271:13110, 1996; Sch all et al., J. Cell. Biol. 133:709, 1996), en lugar de actividades puramente antagonistas como se desea. Más recientemente, Kuba et al., Cáncer Res. 60:6737, 2000, demostraron que NK4 podría inhibir parcialmente el crecimiento primario (figura 2) y metástasis de tumor de pulmón murino LLC en un modelo de ratón desnudo mediante infusión continua de NK4. El hecho que NK4 se tiene que administrar continuamente para obtener una inhibición de crecimiento parcial de tumores primarios indica una vida media potencialmente corta de la molécula NK4 y/o carencia de potencia. En comparación con NK4, el procedimiento de utilizar anticuerpos se beneficiará de su farmacocinética favorable y la posibilidad de obtener anticuerpos con potencia mucho más alta.

Como otro procedimiento, Dodge (Master' s Thesis, San Francisco State University, 1998) generó anticuerpos (mAbs) monoclonales anti-cMet antagónicos, ün mAb, 5D5, exhibió fuerte actividad antagónica en ELISA, pero indujo una respuesta proliferativa de cMet que expresa células BAF-3, supuestamente debido a la dimerización de los receptores de membrana. Prat et al., J. Cell. Sci. 111:237, 1998, también reportaron tales actividades antagonistas de mAbs anti-cMet. Zaceólo et al., Eur. J. Immunol 27:618, 1997, usaron métodos de exhibición de fago para desarrollar fragmentos de Fab humanos contra factor de crecimiento de hepatocitos de ratón y humanos. Estos fragmentos Fab no tuvieron ningún efecto sobre la actividad de HGF cuando se usaron solos. Cuando uno de los fragmentos de Fab HGF anti-humano fue combinado con un anticuerpo que se enlazó al fragmento Fab por sí mismo, mejoró realmente la actividad de HGF en un análisis biológico. Cao et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EÜA 98:7443, 2001 demostraron que la administración de un cóctel de tres mAbs anti-HGF, los cuales fueron seleccionados en base a su capacidad para inhibir la actividad de dispersión de HGF in vitro, fueron aptos de inhibir el crecimiento de tumores humanos en el modelo de ratón desnudo de xenoinjerto (figura 3) . Postularon que tres mAbs que reconocen tres diferentes sitios de enlace sobre HGF eran requeridos para inhibir las bioactividades de HGF in vivo: dos mAbs inhibieron el enlace de HGF a cMet y un m?b inhibió el enlace de HGF a heparina. Sin embargo, no es práctico por razones comerciales y regulatorias desarrollar un fármaco que combine tres nuevos mAbs, por ejemplo debido a que alguna actividad clínica de cada anticuerpo necesitaría ser demostrada independientemente. Así, hay la necesidad de un solo anticuerpo monoclonal que bloquee la actividad biológica de HGF in vitro e in vivo. La presente invención satisface esta y otras necesidades .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la invención proporciona un mAb neutralizante al factor de crecimiento de hapatocito humano (HGF) . El mAb inhibe por lo menos una y preferiblemente varias o todas las actividades biológicas de HGF en las que se incluyen enlace a su receptor cMet, induciendo la dispersión de células tales como células de riñon canino Madin-Darby, inducir la proliferación de células epiteliales de chango 4MBr-5 y/o hepatocitos y/o HUVEC, e inducir angiogénesis. El mAb anti-HGF puede inhibir tal actividad cuando es usado como un solo agente. ün mAb anti-HGF preferido, inhibe de preferencia completamente, el crecimiento de un gen de injerto de tumor humano en un ratón. Preferiblemente, el mAb de la invención es quimérico, humanizado, semejante a humano o humano. Anticuerpos ejemplares son L2G7 y sus formas quiméricas y humanizadas.

También se proporcionan líneas celulares que producen tales anticuerpos. En otra modalidad, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-HGF neutralizante, por ejemplo L2G7 quimérico o humanizado. En una tercera modalidad, la composición farmacéutica es administrada a un paciente para tratar cáncer u otra enfermedad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra modelos esquemáticos de HGF y cMet . La figura 2 es una gráfica que muestra que NK4 inhibe parcialmente el crecimiento primario de tumor de pulmón murino LLC en ratones desnudos (de Kuba et al., Cáncer Res. 60; 6737, 2000) . NK4 fue sometido a infusión continuamente durante 14 días a partir del cuatro día después del implante del tumor s.c. en ratones desnudos. La figura 3 es una gráfica que muestra que un cóctel de tres mAbs anti-HGF se requiere para inhibir el crecimiento de células U-118 de tumor de cerebro humano en ratones desnudos (de Cao et al-, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 98:7443, 2001) . Células de tumor ü-118 fueron inyectadas s.c. a ratones desnudos. A partir del día 1 mAbs anti-HGF A-l, -5 y -7 o mAbs 7-2 y 3 fueron administrados a 200 µg/inyección, dos veces/semana durante 10 semanas. La figura 4 muestra la determinación de epítopos de enlace relativos de mAbs L1H4, L2C7, L2G7 utilizando ELISA de enlace competitivo. Las placas fueron recubiertas con HGF recombinante (rHGF) , bloqueado con leche descremada e incubadas con concentración subóptima de mAbs biotinilados en presencia de cantidades en exceso lOOx de mAbs sin marcar. El mAb biotinilado enlazado fue detectado mediante la adición de HRP-Estrepavidina . La figura 5 muestra el enlace de mAbs anti-HGFG a rHGF, tal como se determina en un ELISA de enlace de HGF directo. La placa fue recubierta con el sobrenadante de Hl-Fll que contiene rHGF, bloqueado con 2% de leche descremada e incubado con mAbs, seguido por la adición de HRP-GaMIgG (como se describe en los ejemplos) . La figura 6 muestra las capacidades de mAbs de anti-HGF para capturar rHGF-Bandera en solución. mAbs anti-HGF fueron capturados en una placa de ELISA recubierta con IgG anti-ratón de cabra. Luego las placas fueron bloqueadas con 2% de leche descremada incubadas con rHGF-Bandera, seguida por anti-Bandera HRP-M2 (como se describe en los ejemplos) . La figura 7 muestra la inhibición del enlace rHGF- Bandera a cMet-Fc mediante Abs anti-HGF en una ELISA de captura. cMet-Fc capturado sobre placa recubierta con IgG antihumano de cabra es incubado con HGF-Bandera pre-incubado con/sin mA s. El rHGF-Bandera enlazado fue detectado mediante la adición de mAb anti-Bandera HRP-M2 (como se describe en los ejemplos) . La figura 8 muestra la neutralización de la dispersión de MDCK inducida por HGF mediante L2G7 de mAb anti- HGF. (A) Control sin ningún tratamiento. (B) rHGF+IgG. (C) rHGF+mAb L2G7. Células MDCK fueron incubadas con una dilución 1:20 del sobrenadante de cultivo Hl-Fll (~ 3 µg/ml de HGF) en presencia de 10 µg/ml de mAbs. Las fotografías fueron tomadas a una amplificación de lOOx. La figura 9 muestra la inhibición de proliferación inducida por HGF de células Mv LU mediante m?b de L2G7. El exceso molar de mAb con respecto a HGF es mostrado es mostrado en el eje horizontal y el cpm x 10"2 incorporado es mostrado en el eje vertical. Los puntos de datos fueron obtenidos por triplicado. La figura 10 muestra la inhibición de proliferación inducida por HGF de HUVEC mediante mAb de L2G7 y anticuerpo de ratón de control (mlgG) . Los puntos de datos fueron obtenidos por triplicado. La figura 11 muestra el efecto sobre la proliferación inducida por HGF de células de tumor de colon HCT 116 mediante anticuerpos L2G7 y L1H4. Los puntos de datos fueron obtenidos por triplicado. La figura 12 muestra el efecto del tratamiento con mAb L2G7 o PBS (control) sobre el crecimiento de tumores U-118 en grupos de ratones NIH III Beige/desnudos (n=6) . Las flechas indican cuando comienzan las inyecciones. (A) Tamaño de tumor contra el día a partir del implante de tumor. (B) Masa del tumor al final del experimento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona anticuerpos monoclonales anti-HGF neutralizantes, composiciones farmacéuticas que los comprenden y métodos de uso de los mismos para el tratamiento de enfermedades. 1. Anticuerpos Los anticuerpos son moléculas complejas muy grandes (peso molecular de ~150,000 o aproximadamente 1320 aminoácidos) con estructura interna intrincada, una molécula de anticuerpo natural contiene dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada. Cada cadena ligera y cadena pesada a su vez consiste de dos regiones: una región variable ("V") involucrada en el enlace del antígeno objetivo y una región constante ("C") que interactúa con otros componentes del sistema inmune. Las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada se pliegan conjuntamente en el espacio tridimensional para formar una región variable que enlaza el antígeno (por ejemplo, un receptor sobre la superficie de una célula) . Dentro de cada región variable de cadena ligera o cadena pesada, hay tres segmentos cortos (en promedio de 10 aminoácidos de longitud) llamadas las regiones que determinan la complementariedad ("CDR") . Los seis CDR en un dominio variable de anticuerpo (tres de la cadena ligera y tres de la cadena pesada) se pliegan conjuntamente en un espacio tridimensional para formar el sitio de enlace de anticuerpo real que se fija sobre el antígeno de anticuerpo. La posición y longitud de las CDR han sido definidas de manera precisa. Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987. La parte de una región variable no contenida en las CDR es llamada la estructura, que forma el ambiente para las CDR. Un anticuerpo monoclonal ( Ab) es una sola especie molecular de anticuerpo y por consiguiente no abarca anticuerpos policlonales producidos al inyectar un animal (tal como un roedor, conejo o cabra) con un antígeno y extraer el suero del animal. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo diseñado genéticamente (monoclonal) en el cual las CDR de un anticuerpo de ratón ("anticuerpo donador") , que puede también ser de rata, hámster u otra especie similar) son injertadas sobre un anticuerpo humano ("anticuerpo aceptor") . Los anticuerpos humanizados pueden también ser elaborados con menos que las CDR completas de un anticuerpo de ratón (por ejemplo, Pascalis et al., J. Immunol . 169:3076, 2002). Así, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene CDR de un anticuerpo donador y estructura de región variable y regiones constantes de un anticuerpo humano. Así, comúnmente un anticuerpo humanizado comprende (i) una cadena ligera que comprende 3 CDR de un anticuerpo de ratón, por ejemplo L2G7, una estructura de región variable de un anticuerpo humano y una región constante humana y (ii) una cadena pesada que comprende tres CDR de un anticuerpo de ratón, por ejemplo L2G7, una estructura de región variable de un anticuerpo humano y una región constante humana. Además, con el fin de retener alta afinidad de enlace, por lo menos uno de dos elementos estructurales adicionales pueden ser usados. Véase patente estadounidense No. 5,530,101 y 5,585,089, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia, que proporcionan instrucciones detalladas para la construcción de anticuerpos humanizados . En el primer elemento estructural, la estructura de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado es escogida para tener identidad de secuencia máxima (entre 65% y 95%) con la estructura de la región variable de cadena pesada del anticuerpo donador, al seleccionar apropiadamente el anticuerpo aceptor de entre los muchos anticuerpos humanos conocidos. La identidad de secuencia es determinada cuando las secuencias de anticuerpo que son comparadas son alineadas de acuerdo con la convención de numeración de Kabat. En segundo elemento estructural, al construir el anticuerpo humanizado, aminoácidos seleccionados en la estructura del anticuerpo aceptor humano (fuera de las CDR) son reemplazadas con aminoácidos correspondientes del anticuerpo donador, de acuerdo con reglas especificadas. Específicamente, los aminoácidos a ser reemplazados en la estructura son escogidos en base a su capacidad para interactuar con las CDR. Por ejemplo, los aminoácidos reemplazados pueden estar adyacentes a una CDR en la secuencia de anticuerpo donador o dentro de 4-6 ángstroms de una CDR en el anticuerpo humanizado como se mide en el espacio tridimensional. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el cual la región variable de un anticuerpo de ratón (u otro roedor) es combinada con la región constante de un anticuerpo humano; su construcción por medio de ingeniería genética es bien conocida. Tales anticuerpos retienen la especificidad de enlace del anticuerpo de ratón, en tanto que son aproximadamente dos tercios humanos. La proporción de secuencia no humana presente en anticuerpos de ratón, quiméricos y humanizados sugiere que la inmunogenicidad de anticuerpos quiméricos es intermedia entre anticuerpos de ratón y humanizados. Otros tipos de anticuerpos diseñados genéticamente que pueden tener inmunogenicidad traducida en relación con los anticuerpos de ratón incluyen anticuerpos humanos elaborados utilizando métodos de exhibición de fago (Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/001047; Winter, WO 92/20791; y Winter, FEBS Lett. 23:92, 1998, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia) o utilizando animales transgénicos (Lonberg et al., WO 93/12227; Kucherlapati WO 91/10741, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia) . Como se usa en la presente, el término anticuerpo "semejante a humano" se refiere a un Mab en el cual una porción sustancial de la secuencia de aminoácidos de una o ambas cadenas (por ejemplo, aproximadamente 50% o más) ser origina de genes de inmunoglobulina humanos. De aquí, los anticuerpos semejantes a humanos abarcan pero no están limitados a anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos. Como se usa en la presente, un anticuerpo de "inmunogenicidad reducida" es uno que se espera que tenga significativamente menos inmunogenicidad de un anticuerpo de ratón cuando es administrado a pacientes humanos. Tales anticuerpos abarcan anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos, también como anticuerpos elaborados al reemplazar aminoácidos específicos en anticuerpos de ratón que pueden contribuir a epítopos de célula B o T, por ejemplo residuos expuestos (Padlan, Mol. Immunol . 28:489, 1991). Como se usa en la presente, un anticuerpo "diseñado genéticamente" es uno para el cual los genes han sido construidos o puestos en un ambiente no natural (por ejemplo, genes humanos en un ratón o en un bacteriófago) con la ayuda de técnicas de ADN recombinantes y por consiguiente por ejemplo no abarcaría un mAb de ratón elaborado con tecnología de hibridoma convencional . El epítopo de un mAb es la región de su antígeno al cual el mAb se enlaza. Dos anticuerpos se enlazan al mismo o epítopo translapante si cada uno inhibe competitivamente (bloquea) el enlace del otro al antígeno. Esto es, un exceso lx, 5x, lOx, 20x ó lOOx de un anticuerpo inhibe el enlace del otro por al menos 50%, pero preferiblemente 75%, 90% o aún 99%, tal como se mide en un análisis de enlace competitivo en comparación con un control que carece del anticuerpo competente (véase, por ejemplo Junghans et al., Cáncer Res. 50:1495, 1990, que es incorporado en la presente por referencia) . Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan el enlace de un anticuerpo reducen o eliminan el enlace de otro. Dos anticuerpos tienen epítopos translapantes si algunas mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan el enlace de un anticuerpo reducen o eliminan el enlace del otro. 2. Anticuerpos anti-HGF Neutralizantes Un anticuerpo monoclonal (mAb) que enlaza HGF (esto es, un mAb anti-HGF) se dice que neutraliza HGF o es neutralizante, si el enlace inhibe parcial o completamente una o más actividades biológicas de HGF (esto es, cuando el mAb es usado como un solo agente) . De entre las propiedades biológicas de HGF que un anticuerpo neutralizante puede inhibir están la capacidad del HGF para enlazarse a su receptor cMet, provocar la dispersión de ciertas líneas celulares tales como células de riñon canino Madin-Darby (MDCK) ; estimular la proliferación (esto es, ser mitogénicas para) ciertas células en las que se incluyen hepatocitos, células epiteliales de chango 4MBr-5 y varias células de tumor humano o estimular la angiogénesis, por ejemplo tal como se mide mediante estimulación de proliferación de célula endotelial vascular humana (HÜVEC) o formación de tubo o mediante inducción de vasos sanguíneos cuando es aplicado a la membrana corialantoica embriónica de pollo (CAM) .

Los anticuerpos de la invención se enlazan preferiblemente a HGF humano (esto es, a la proteína codificada por la secuencia de GenBank con el número de Acceso D90334 (incorporado por referencia) . ün mAb neutralizante de la invención a una concentración de por ejemplo 0.01, 0.1, 0.5, 1.2, 5, 10, 20, ó 50 µg/ml inhibirá una función biológica de HGF (por ejemplo, estimulación de proliferación o dispersión) por aproximadamente por lo menos 50%, pero preferiblemente 75%, más preferiblemente por 90% ó 95% o aún 99% y más de preferencia aproximadamente 100% (esencialmente por completo) tal como se analiza mediante los métodos descritos en los ejemplos o conocidos en el arte. La inhibición es considerada completa si el nivel de actividad está dentro del margen de error para un control negativo que carece de HGF. Comúnmente, la extensión de inhibición es medida cuando la cantidad de HGF usada es justo suficiente para simular plenamente la actividad biológica o es 0.05, 0.1, 0.5, 1, 3, ó 10 µg/ml. Preferiblemente, por lo menos 50%, 75%, 90% ó 95% o la inhibición esencialmente completa será obtenida cuando la proporción molar de anticuerpo a HGF es 0.5x, lx, 2x, 3x, 5x ó lOx. Preferiblemente, el mAb será neutralizante, esto es, inhibe la actividad biológica, cuando es usado como un solo agente, pero posiblemente 2 mAbs serán necesarios conjuntamente para dar la inhibición. Más preferiblemente, el mAb neutralizará no solo uno sino varias de las actividades biológicas enlistadas anteriormente; por propósitos de la presente, un mAb anti-HGF que es usado como un solo agente neutraliza todas las actividades biológicas de HGF será llamado "plenamente neutralizante" y tal mAb son más preferibles. Los mAbs de la invención serán preferiblemente específicos para HGF, esto es no ser enlazarán o solamente se enlazarán a una extensión mucho menor (por ejemplo Ka por lo menos diez veces menos) , proteínas que están relacionadas a HGF tales como factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . Los anticuerpos preferidos carecen de actividad agonista hacia HGF. Esto es, los anticuerpos bloquean la interacción de HGH con cMet sin estimular células que forman HGF directamente. Los mAbs de la invención tienen comúnmente una afinidad de enlace (K0) por HGF de por lo menos 107 M_1, pero preferiblemente 108 M_1 o más alto, y más preferiblemente 109 M-1 o más alto o aún 1010 M_1 o más alto. Los mAbs de la invención incluyen anticuerpos anti- HGF en su forma tetramérica natural (dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas) y pueden ser de cualquiera de los isotipos conocidos IgG, IgA, IgM, IgD e IgE y sus subtipos, por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 humanos y IgGl, IgG2, IgG2b y IgG3 de ratón. Los mAbs de la invención también se proponen incluir fragmentos de anticuerpos tales como Fv, Fab y F(ab')2; anticuerpos híbridos bifuncionales (por ejemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol . 17:105, 1987), anticuerpos de una sola cadena (Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EÜA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988); y anticuerpos con regiones constantes alteradas (por ejemplo, patente estadounidense No. 5,624,821). Los mAbs pueden ser de origen animal (por ejemplo, ratón, rata, hámster o pollo) , o pueden ser diseñados genéticamente. Los mAbs de roedor son fabricados mediante métodos estándar bien conocidos en el arte, que comprenden inmunización múltiple con HGF en adyuvante apropiado i.p., i.v., o a la pata, seguido por extracción de células del bazo o células del nodo linfático y fusión con una línea celular inmortalizada apropiada y luego selección de hibridomas que producen enlace de anticuerpo a HGF, por ejemplo véase Ejemplos. Los mAbs quiméricos y humanizados, elaborados por los métodos conocidos en la técnica mencionados supra, son modalidades preferidas de la invención. Los anticuerpos humanos elaborados por ejemplo mediante métodos de exhibición de fago o métodos de ratones transgénicos son también preferidos (véase, por ejemplo, Dower et al., McCafferty et al., Winter, Lonberg et al., Kucherlapati, supra). Más en general, anticuerpos de inmunogenicidad reducida y diseñados genéticamente semejantes a humanos como se definen en la presente son todos preferidos. Los mAbs anti-HGF neutralizantes mAbs L1H4, L2C7 y L2G7 descritos infra son ejemplos de la invención, L2G7 es un ejemplo preferido. Los mAbs neutralizantes con el mismo o un epítopo traslapante como cualquiera de estos mAbs, por ejemplo L2G7, proporcionan otros ejemplos. una forma quimérica o humanizada de L2G7 o con LGF es una modalidad especialmente preferida. ün mAb (en los que se incluyen anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos) que compite con L2G7 por el enlace a HGF y neutraliza HGF en por lo menos uno y preferiblemente todos los análisis in vitro o in vivo descritos en la presente es también preferido. Los mAbs que son 90%, 95%, 99% ó 100% idénticos (determinado al alinear secuencias de anticuerpo de acuerdo con la convención de Kabat) a L2G7 en secuencia de aminoácidos, por lo menos en las CDR están incluidos en la invención. Preferiblemente, tales anticuerpos difieren de L2G7 por un número pequeño de sustituciones de aminoácido funcionalmente inconsecuencial (por ejemplo, sustituciones conservadoras), cancelaciones o inserciones. Preferiblemente, tales anticuerpos retienen las propiedades funcionales de L2G7, esto es, tales anticuerpos neutralizan HGF en por lo menos uno y preferiblemente todos los análisis in vitro o in vivo descritos en la presente. Por propósitos de clasificar sustituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos pueden ser agrupados como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrofóbicas) : norleucina, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofílicas neutras) : cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales acidas) : asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas) : asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influencian la orientación de cadena) ; gly, pro; Grupo VI (cadenas laterales aromáticas) : trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras involucran sustituciones entre aminoácidos en la misma clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra. Los mAbs naturales de la invención pueden ser producidos a partir de sus hibridomas . Los mAbs diseñados genéticamente, por ejemplo mAbs quiméricos o humanizados, pueden ser expresados mediante una variedad de métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, genes que codifican sus regiones V de cadena ligera y pesada pueden ser sintetizados a partir de oligonucleótidos traslapantes e insertados conjuntamente con regiones C disponibles a vectores de expresión (por ejemplo, disponibles comercialmente de Invitrogen) que proporcionan las regiones reguladoras necesarias, por ejemplo promotores, mejoradores, sitios poli A, etc. El uso del promotor-mej orador de CMV es preferido. Luego los vectores de expresión pueden ser transfectados utilizando varios métodos bien conocidos tales como lipofección o electroporación a una variedad de líneas celulares mamíferas tales como CHO o mielomas no productoras que incluyen Sp2/0 y NSO, y células que expresan los anticuerpos seleccionados mediante selección de anticuerpo apropiada. Véase, por ejemplo patente estadounidense No. 5,530,101. Cantidades más grandes de anticuerpo pueden ser producidas mediante cultivo de las células en bioreactores disponibles comercialmente. Una vez expresados, los mAbs u otros anticuerpos de la invención pueden ser purificados de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica tales como microfiltración, ultrafiltración, proteína A o cromatografía de afinidad G, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico y/u otras formas de cromatografía de afinidad' en base a tintes orgánicos o los semejantes. Anticuerpos sustancialmente puros de aproximadamente 90 ó 95% de homogeneidad son preferidos y 98% ó 99% o más homogeneidad son preferidos, para usos farmacéuticos . 3. Métodos Terapéuticos En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende los anticuerpos descritos en la presente. Esto es, los anticuerpos pueden ser usados en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de enfermedades. Formulaciones farmacéuticas (esto es, medicamentos) de los anticuerpos contienen el mAb en un portador aceptable fisiológicamente, opcionalmente con excipientes o estabilizadores, en forma de soluciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones usadas e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato, o acetato a un pH comúnmente de 5.0 a 8.0, más frecuentemente 6.0 a 7.0; sales tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, etc. para fabricar isotónicos; antioxidantes, conservadoras, polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas, polímeros hidrofóbicos tales como polysorbate 80, aminoácidos, carbohidratos, agentes quelantes, azúcares y otros ingredientes estándares conocidos para aquellos experimentados en el arte (Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. 1980) . El mAb está comúnmente presente a una concentración de 1-100 mg/ml, por ejemplo 10 mg/ml. Los anticuerpos de la invención están comúnmente sustancialmente puros de contaminante indeseable. Esto significa que el anticuerpo es comúnmente por lo menos aproximadamente 50% en peso/peso (peso/peso) puro, también como sustancialmente libre de proteínas y contaminantes interferentes . Preferiblemente, los anticuerpos son por lo menos 90%, 95% ó 99% puros peso/peso. Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral son usualmente estériles, sustancialmente isotónicas y preparadas de acuerdo con las prácticas de buena manufactura de la FDA o cuerpo similar. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un método de tratamiento de un paciente con una enfermedad utilizando un mAb anti-HGF en una formulación farmacéutica. El mAb preparado en una formulación farmacéutica puede ser administrado a un paciente mediante cualquier ruta apropiada, especialmente parenteral mediante infusión intravenosa o inyección de bolo, intramuscular o subcutáneamente. La infusión intravenosa puede ser dada en tanto como 15 minutos, pero más frecuentemente durante 30 minutos o más, 1, 2 o aún 3 horas. El mAb puede también ser inyectado directamente al sitio de la enfermedad (por ejemplo un tumor) o encapsulado en agentes portadores tales como liposomas. La dosis dada será suficiente para aliviar la condición que es tratada ("dosis terapéuticamente efectiva") y es probable que sea de 0.1 a 5 mg/kg de peso corporal, por ejemplo 1, 2, 3 ó 4 mg/kg, pero puede ser tan alta como 10 mg/kg o aún 15 ó 20 mg/kg. Una dosis unitaria fija puede también ser dada, por ejemplo 50, 100, 200, 500 ó 1000 mg o la dosis puede estar basada en el área superficial del paciente, por ejemplo 100 mg/m2. üsualmente entre 1 y 8 dosis (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) son administradas para tratar cáncer, pero 10, 20 o más dosis pueden ser administradas. El mAb puede ser administrado diariamente, bi-semanalmente, semanalmente, una semana si y otra semana no, mensualmente u en algún otro intervalo, dependiendo por ejemplo de la vida media del mAb, por 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 3-6 meses o más tiempo. Cursos repetidos de tratamiento son también posibles como lo es la administración crónica. Un régimen de una dosis e intervalos de administración que alivian o por lo menos que tiene parcialmente los síntomas de la enfermedad (bioquímica, histológica y/o clínica) , incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en desarrollo de la enfermedad es denominado como un régimen terapéuticamente efectivo. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden también ser usadas en profilaxis de un paciente en riesgo de cáncer. Tales pacientes incluyen aquellos que tienen susceptibilidad genética al cáncer, pacientes que han sufrido exposición a agentes carcinógenos, tales como radiación o toxinas y pacientes que han sufrido tratamiento previo para el cáncer y están en riesgo de recurrencia. Una dosis profiláctica es una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la severidad o retardar el inicio de la enfermedad, en los que se incluyen síntomas bioquímicos, histológicos y/o clínicos de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológico.s intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. La administración de una composición farmacéutica por una cantidad y a intervalos efectivos para efectuar uno o más de estos objetos es denominado como un régimen profilácticamente efectivo. Las enfermedades especialmente susceptibles a terapia con los mAbs anti-HGF de esta invención incluyen tumores sólidos conocidos o que se sospecha que requieren angiogénesis o que están asociados con niveles elevados de HGF, por ejemplo cáncer de ovarios, cáncer de pecho, cáncer de pulmón (de célula pequeña o de célula no pequeña) , cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer gástrico, cáncer de hígado, tumores de cabeza y cuello, melanoma, sarcomas y tumores de cerebro (por ejemplo glioblastomas) , de niños o adultos. El tratamiento puede también ser administrado a pacientes que tienen leucemias o linfornas . En una modalidad preferida, el mAb anti-HGF puede ser administrado junto con (esto es, antes, durante o después) otra terapia anti-cáncer.

Por ejemplo, el mAb anti-HGF puede ser administrado junto con cualquiera de uno o más de los fármacos quimioterapéuticos conocidos para aquellos de habilidad en el arte de oncología, por ejemplo taxol (paclitaxel) o sus derivados, compuestos de platino tales como carboplatina o cisplatina, antrociclinas tales como doxorubicina, agentes alquilantes tales como ciclofosfamida, anti-metabolitos tales como 5-fluorouracilo o etopósido. El mAb anti-HGF puede ser administrado en combinación con dos, tres o más de estos agentes en un régimen quimioterapéutico estándar, por ejemplo taxol y carboplatina, por ejemplo para cáncer de pecho y cáncer de ovario. Otros agentes con los cuales el mAb anti-HGF puede ser administrado incluyen compuestos biológicos tales como anticuerpos monoclonales, en los que se incluyen Herceptin™ contra el antígeno HER2, Avatin™ contra VEGF o anticuerpos al receptor EGF, también como fármacos anti-angiogénicos de molécula pequeña o fármacos antagonistas del receptor EGF. Además, el mAb anti-HGF puede ser usado junto con terapia de radiación o cirugía. El tratamiento (por ejemplo quimioterapia estándar) que incluye el anticuerpo mAb anti-HGF puede incrementar la sobrevivencia libre de avance promedio o tiempo de sobrevivencia global de pacientes con estos tumores (por ejemplo, de ovario, pecho, pulmón, páncreas, cerebro y colon, especialmente cuando es recaída o refractario) por al menos 30% ó 40%, pero preferiblemente 50%, 60% a 70% o aún 100% o más largo, en comparación con el mismo tratamiento (por ejemplo, quimioterapia) pero sin mAb anti-HGF. Además o alternativamente, el tratamiento (por ejemplo quimioterapia estándar) que incluye el m?b anti-HGF puede incrementar la velocidad de respuesta completa, velocidad de respuesta parcial o velocidad de respuesta objetivo (completa + parcial) de pacientes con estos tumores (por ejemplo de ovario, pecho, pulmón, páncreas, cerebro y colon, especialmente cuando es de recaída o refractaria) por al menos 30% o 40% pero preferiblemente 50%, 60% a 70% o aún 100% en comparación con el mismo tratamiento (por ejemplo quimioterapia) pero sin el mAb anti-HGF. Opcionalmente, el tratamiento puede inhibir la invasión de tumor o metástasis. Comúnmente, en un estudio clínico (por ejemplo, un estudio de fase Ii, fase II/III o fase III) , los incrementos mencionados anteriormente en sobrevivencia libre de avance promedio y/o velocidad de respuesta de los pacientes tratados con quimioterapia más el mAb anti-HGF, en relación con el grupo de control de pacientes que reciben quimioterapia sola (o más placebo) , será estadísticamente significativa, por ejemplo a 0 = 0.05 ó 0.01 ó aún nivel de 0.001. También se comprenderá por aquel de habilidad en el arte que la velocidad de respuesta completa y parcial son determinadas mediante criterios objetivos usados comúnmente en estudios clínicos para cáncer, por ejemplo como se enlista o aceptados por el Instituto Nacional de Cáncer y/o Administración de Alimentos y Fármacos. 4. Otros Métodos Los mAbs anti-HGF de la invención también encuentran uso en métodos de diagnóstico, prognosticos y de laboratorio. Pueden ser usados para medir el nivel de HGF en un tumor o en la circulación de un paciente con un tumor y por consiguiente para seguir y guiar el tratamiento del tumor. Por ejemplo, un tumor asociado con altos niveles de HGF sería especialmente susceptible a tratamiento con un mAb anti-HGF. En modalidades particulares, los mAbs pueden ser usados en un ELISA o prueba inmunológica para medir el nivel de HGF, por ejemplo en una muestra de biopsia de tumor o en un suero o en un sobrenadante de medios de células que segregan HGF en el cultivo celular. El uso de dos mAbs anti-HGF que se enlazan a diferentes epítopos (esto es, que no compiten por el enlace) serán especialmente útiles para desarrollar una ELISA de "emparedado" sensible para detectar HGF. Para varios análisis, el mAb puede ser marcado con moléculas fluorescentes, moléculas marcadas por centrifugación, enzimas o radioisótopos y pueden ser provistos en forma de equipo con todos los reactivos necesarios para efectuar el análisis en cuanto a HGF. En otros usos, los rnAbs anti-HGF serán usados para purificar HGF, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad.

EJEMPLOS 1. Generación de mAbs anti-HGF Para generar mAbs los cuales se enlazan a y bloquean las actividades de HGF humano, HGF humano recombinante (rHGF) fue producido primero en un sistema de expresión de mamífero. Los cADN que codifican eí HGF recombinante (rHGF) o péptido rHGF-Bandera (residuos de 8 aminoácidos de bandera anexado al término c de HGF) fueron construidos en un vector de expresión inducible pIND (No et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 93:3346, 1996) . Luego estos cADN fueron transfectados a células de fibroblasto de riñon humano EcR-293 (Invitrogen) utilizando el reactivo de transfección Fugene (Roche) . Líneas celulares estables, Hl-Fll y 24.1, que segregan HGF y HGF-Bandera respectivamente, fueron seleccionados en presencia de 600 µg/ml de G418 de 400 µg/ml de Zoecin (Invitrogen) . Hl-Fll y 24.1 fueron inducidos para segregar HGF y HGF-Bandera mediante tratamiento con 4 µM de Ponasterona A (Invitrogen) durante 4-5 días en DMEM libre de suero que contiene glutamina y antibióticos. Después que los segregados fueron separados mediante centrifugación a 15,000 rpm durante 30 minutos a 4°C, el HGF segregado al sobrenadante del cultivo fue concentrado a aproximadamente 100 veces utilizando un cartucho de ultrafiltración de membrana con un filtro de corte de peso molecular 50,000 [filtro YM-50 amicon Centripep seguido por filtro microcon YM-50 (Millipore) ] . Tal sobrenadante de cultivo HlFll concentrado contiene -100 µg/ml de HGF y -120 µg/ml de albúmina de suero bovino. Ratones Balb/c fueron inmunizados en cada pata trasera >10 veces a intervalos de una semana, con 1-2 µg de rHGF purificado (Pepro Tech) o 1-2 µg de rHGF más 1-2 µg de BSA (sobrenadante de cultivo Hl-Fll concentrado) resuspendido en MPL-TDM (Ribi Immunochem. Research) . Tres días después del refuerzo inicial, ees de nodo linfático popliteal fueron fusionadas con células de mieloma murino, P3X63AgU.l (ATCC CRL1597), utilizando 35% de polietilenglicol. Los hibridomas fueron seleccionados en media HAT como se describe (Chuntharapai y Kim, J. Immunol . 163:766, 1997, que es incorporado en la presente por referencia) . Diez días después de la fusión, los sobrenadantes de cultivo de hibridoma fueron seleccionados en un ELISA de enlace de HGF directo también como en un ELISA de captura de HGF-Bandera. El último análisis fue usado para confirmar adicionalmente la especificidad de los mAbs anti-HGF seleccionados utilizando el ELISA de enlace de HGF directo y para seleccionar mAbs que se pueden enlazar a HGF en fase de solución. El bloqueo de las actividades de mAbs seleccionados fue luego determinada en el ELISA de enlace de cMet-Fc HGF-Bandera y en el análisis de dispersión de MDCK como se describe (Jeffers et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 95:14417, 1998), Hibridomas seleccionados fueron clonados dos veces utilizando técnicas de dilución limitante. El isotipo de Abs fue determinado utilizando un equipo de isotipificación (Zymed) . Los ascites de mAbs seleccionados fueron criados y purificados utilizando el equipo de purificación I munoPure (A/G) IgG (Pierce) . También mAbs biotinilados fueron preparados utilizando EZ-sulfo-NHS-LC-Biotin de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por Pierce. Cada uno de los análisis a los que se hace referencia en la presente es descrito en más detalle a continuación. Para el ELISA de enlace de HF directo, placas de microtítulo (Maxisorb; Nunc) son recubiertas con 50 µl/cavidad de sobrenadantes de cultivo Hl-Fll que contienen rHGF, diluido en PBS a una proporción 1:2 de HGF/PBS, en toda la noche a 4°C. Después del lavado de la placa, los sitios de enlace no específicos son bloqueados con PBS que contiene 2% de leche descremada durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) . Después del lavado de la placa, 50 µl/cavidad de mAbs purificado o sobrenadantes de cultivo de hibridoma son agregados a cada cavidad durante 1 hora. Después del lavado, las placas son luego incubadas con 50 µl/cavidad de 1 µg/ml de IgG anti-ratón HRP-cabra (HRP-GaMIgG, Cappel) durante 1 hora. El HRP-GaMIgG enlazado es detectado mediante la adición del sustrato de tetrametilbenzidina (Sigma) . La reacción es detenida mediante la adición de 1N H2S04 y luego las placas son leídas a 450 nm utilizando un lector de placas de ELISA. Los lavados son efectuados 3 veces en solución reguladora del pH de lavado (PBS que contiene 0.05% de Tween 20) .

Para el análisis de ELISA de captura de HGF-Bandera, las placas de microtítulo son recubiertas con 50 µl/cavidad de 2 µg/ml de anticuerpo de cabra específicos a la porción Fe de IgG de ratón (GaMIgG-Fc) en PBS durante toda la noche a 4°C y bloqueados con 2% de leche descremada durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavado, las placas son incubadas con 50 µl/cavidad de mAbs purificado o sobrenadantes de cultivo de hibridoma durante 1 hora. Después del lavado, las placas son luego incubadas con 50 µl/cavidad de 24.1 células de sobrenadante de cultivo que contiene rHGF-Bandera. Después del lavado, las placas son luego incubadas con 50 µl/cavidad de mAbs anti-Bandera HRP-M2 (Invitrogen) en presencia de 15 µg/ml de IgG murino. El HRP-anti-Bandera M2 enlazado es detectado mediante la adición del sustrato como se describe anteriormente. Los lavados son efectuados 3 veces en solución reguladora del pH de lavado. Por lo menos tres Abs, designados L1H4, L2C7 y L2G7, obtenidos de hibridomas generados al inmunizar los ratones Balb/c con rHGF en sobrenadante de cultivo Hl-Fll concentrado como se describe anteriormente, mostraron enlace tanto en el análisis de ELISA de enlace rHGF directo y ELISA de captura de HGF-Bandera y fueron seleccionados para estudio adicional. Luego estos hibridomas fueron clonados dos veces, los aceptables fueron criados en ratón mediante métodos estándar y los mAbs fueron purificados utilizando una columna de proteína G/A. Sus isotipos fueron determinados utilizando un equipo de isotipificación (Zymed Lab) . El hibridoma L2G7 ha sido depositado el 29 de abril de 2003 con el American Type Culture Collection, P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, como número ATCC PTA-5162 bajo el tratado de Budapest. Este depósito será mantenido en un depósito autorizado y reemplazado en el caso de mutación no viabilidad o destrucción por un período de por lo menos 5 años después de la petición más reciente de liberación de una muestra fue recibida por el depósito, por un período de por lo menos 30 años después de la fecha de depósito o durante la vida en que se puede hacer cumplir de la patente relacionada, cualquier período que sea más largo. Todas las restricciones en cuanto a la disponibilidad al público de estas líneas celulares será retirada irrevocablemente en la expedición de una patente de la solicitud. Una vez que un solo mAb anti-humano-HGF arquetipo, por ejemplo L2G7, ha sido aislado que tiene las propiedades deseadas descritas en la presente o HGF neutralizante in vitro y/o que inhibe (por ejemplo completamente) el crecimiento de tumor in vivo, es directo generar otros mAbs con propiedades similares, al utilizar métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, los ratones pueden ser inmunizados con HGF como se describe anteriormente, los hibridomas producidos y los mAbs resultantes seleccionados en cuanto a capacidad para competir con el mAb arquetipo para el enlace a HGF. Alternativamente, el método de Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994, que es incorporado en la presente por referencia, puede ser usado para guiar la selección mAbs que tienen el mismo epítopo y por consiguiente propiedades similares al arquetipo mAb, por ejemplo L2G7. Utilizando exhibición de fago, primero la cadena pesada del anticuerpo arquetipo es apareada con un repertorio de cadenas ligeras (preferiblemente humanas) para seleccionar un mAb de enlace de HGF, y luego la nueva cadena ligera es apareada con un repertorio de cadenas pesadas (preferiblemente humana) para seleccionar un mAb de enlace de HGF (preferiblemente humano) que tiene el mismo epítopo como el mAb arquetipo . 2. Caracterización de mAbs anti-HGF In Vitro Los epítopos de enlace de los anticuerpos fueron caracterizados parcialmente mediante un ELISA de enlace competitivo en el cual un exceso lOOx de mAb sin marcar fue usado para competir con el enlace del mismo u otro mAb biotinilado en el ELISA de enlace de HGF. La figura 4 muestra que el enlace de los mAbs anti-HGF, L1H4 y L2G7, fue inhibido solamente por si mismos, sugiriendo que reconocen epítopos únicos. El enlace de L2C7 fue inhibido mediante L2G7 pero no por L1H4. Esto sugiere que el epítopo L2C7 pero no por L1H4. Esto sugiere que el epítopo L2C7 se superpone con aquel de L2G7 pero no de L1H . Sin embargo, L2C7 no fue apto de inhibir el enlace de L2G7, sugiriendo que los epítopos de L2C7 y L2G7 se superponen pero son distintos y/o la afinidad de L2C7 es mucho más baja que aquella de L2G7. Los epítopos de L1H4, L2C7 y L2G7 son designados respectivamente A, B y C. Las capacidades de enlace relativas de los tres mAbs anti-HGF fueron medida utilizando anticuerpos purificados en el ELISA de enlace de HGF directo, en el cual rHGF es enlazado primero a la placa. En este análisis, L2C7 y L2G7 se enlazan mejor- que L1H4 (figura 5) . La capacidad de los mAbs a enlazar rHGF-Bandera en solución fue también determinada, utilizando el ELISA de captura de HGF-Bandera. Todos los tres mAbs fueron aptos de capturar rHGF-Bandera en fase de solución pero el mAb L2G7 fue más efectivo que los otros (figura 6) . Estos resultados sugieren que el mAb L2G7 tiene la afinidad de enlace más alta a HGF entre los tres mAbs. Una de las actividades biológicas del HGF es la capacidad de enlazar a su receptor cMet, de tal manera que la capacidad de los mAbs anti-HGF para inhibir el enlace de HGF a cMet fue analizada. Para este análisis, cMet-Fc fue producido primero al transfectar células 293 de fibroblasto humano con residuos que codifican cADN 1-929 ECD de cmet enlazado con la porción Fe de IgGl de humano (residuos 216 a 446) como se describe por Mark et al., J. Biol. Chem. 267:26166, 1992 en el vector de expresión de exhibición p (Invitrogen) . Las placas de microtítulo fueron recubiertas con 50 µl/cavidad de 2 µg/ml de anticuerpos de cabra específicos a la porción de Fe de IgG humano (GaHIgG-Fc) en PBS durante toda la noche a 4°C y bloqueados con 2% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado de las placas, 50 µl de sobrenadante de cultivo de 293 transfectado con cMet-Fc cADN es agregado a cada cavidad durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado de las placas, 50 µl/cavidad de 24.1 sobrenadante de cultivo celular que contiene rHGF-Bandera, pre-incubado con varias concentraciones de mAbs, es agregado a cada cavidad durante 1 hora. Después del lavado, las placas son luego incubadas con 50 µl/cavidad de mAb anti-Bandera HRP-M2 (Invitrogen) . El HRP-anti-Bandera M2 enlazado es detectado por la adición célula sustrato como se describe anteriormente. Los lavados se llevan a cabo 3 veces en solución reguladora del pH de lavado. En este análisis de inhibición de enlace de HGF-Bandera/cMet-Fc, todos los tres mAbs demostraron algunos grados de inhibición en tanto que un anticuerpo de control Ig no (figura 7) . mAb L2G7 a > 1 µg/ml y mAb L1H4 a 50 µg/ml abolieron completamente el enlace de rHGF-Bandera a cMet-Fc; mAb L2C7 aún a 50 µg/ml da solamente 85% de inhibición. De aquí, el mAb L2G7 fue mucho más potente para inhibir la interacción de rHGF-Bandera con cMet-Fc (y por consiguiente supuestamente HGF con su receptor cMet) que los otros anticuerpos, consistente con su afinidad supuestamente mayor por HGF. Puesto que la proteína receptora usada en el ELISA de enlace de cMet-Fc/HGF-Bandera es una proteína de receptor soluble, su conformación puede ser diferente de aquella del receptor enlazado de membrana natural. Además, el HGF se enlaza a HSPG además de cMet y es conocido que la interacción HSPG-HGF mejora varias actividades de HGF. Así, los mAbs que bloquean la interacción de HGF con cMet soluble puede no necesariamente tener la capacidad para neutralizar las bioactividades HGF sobre las células. Así, es importante confirmar adicionalmente las actividades de bloqueo de mAb en sistemas biológicos seleccionados. El HGF es conocido como un factor de dispersión potente. Así, la actividad neutralizadora de los mAbs anti-HGF fue también determinada utilizando el análisis de dispersión de riñon canino Madin-Darby (células MDCK obtenidas de ATCC) como se describe (Jeffers et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 95:14417, 1998). Células MDCK cultivadas en DMEM complementadas con 5% de FCS son depositadas a 103 células/100 µl/cavidad en presencia de concentraciones predeterminadas de rHGF con o sin mAbs en DMEM con 5% de FCS. Después de 2 días de incubación a 37 °C en 5% de C02, las células son luego lavadas en PBS, fijas en 2% de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de lavado en PBS, las células son teñidas con 0.5% de violeta cristal en 50% de etanol (volumen/volumen) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La actividad de dispersión es determinada mediante examen microscópico. El sobrenadante de cultivo del HGF que segrega clon Hl-Fll descrito anteriormente, fue usado como la fuente de HGF en el análisis de dispersión, una dispersión tan pequeña como de 1:80 del sobrenadante de cultivo Hl-Fll indujo la dispersión y crecimiento de células MDCK. Sin embargo, los análisis de dispersión se llevaron a cabo utilizando una dilución 1:20 de sobrenadante de cultivo Hl-Fll (-3 µg/ml) . MAb L2G7 aún a una proporción molar de 1:5 de HGF/mAb inhibió la dispersión inducida por HGF de MDCK por sí mismo (figura 8), demostrando conclusivamente que mAb L2G7 es ciertamente un mAb neutralizante. MAb L1H4 a > 20 µg/ml podría también neutralizar la dispersión de MDCK inducida por HGF, en tanto que mAb L2C7 aún a 20 µg/ml dio solo una actividad neutralizante parcial (datos no mostrados) . Las varias características de los tres anticuerpos anti-HGF determinadas en los análisis anteriores son resumidas en la Tabla 1. Tabla 1. Caracterización de mAbs a HGF El HGF es un miembro de la familia de factor de crecimiento de enlace de heparina que incluye el factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . También, el HGF tiene -40% de similaridad de secuencia global con el plasminógeno (Nakamura et al., Nature. 342:440; 1989) y comparte una estructura de dominio similar con la proteína que estimula el macrófago (MSF, Wang et al., Scand. J. Immunol . 56:545, 2002). Así, la especificidad de enlace de los anticuerpos anti-HGF debe ser determinada. El enlace de mAbs anti-HGF a estas proteínas relacionadas con HGF (disponibles de R&D Systems) analizado utilizando una ELISA de enlace directo similar a aquel para HGF descrito anteriormente. El mAb L2G7, mAb L2C7 y Ab L1H4 no ser enlazarán significativamente a estas proteínas, demostrando su especificidad por HGF. 3. Capacidad de los mAbs anti-HGF para Inhibir Actividades Biológicas que Promueven Tumor de HGF El HGF tiene una diversidad de actividades biológicas que lo hacen probable que desempeñe una función en el crecimiento e invasividad de ciertos tumores humanos. Una de tales actividades del HGF es como un mitógeno poderoso para hepatocitos y otras células epiteliales (Rubin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EÜA, 88:415, 1991). Así, para probar adicionalmente la actividad neutralizante de los mAbs anti-HGF, se determina los efectos de los Abs sobre la proliferación inducida por HGF de células epiteliales de chango 4MBr-5 (ATCC) o hepatocitos de rata. Los hepatocitos son aislados de acuerdo con un método descrito por Garrison y Haynes, J. Biol. Chem. 269:4264, 1985. Las células son resuspendidas a 5 x 104 células/ml en DMEM que contiene 5% de FCS y estimuladas con una concentración predeterminada de HGF con varias concentraciones de mAbs. Después de 2 1/2 días de incubación a 37 °C en 5% de C02, el nivel de proliferación celular se determina por la adición de 3H-timidina durante 4 horas . Las células son cosechadas utilizando un cosechador de células automatizado y el nivel de 3H-timidina incorporada es determinada en un contador centelleo. A concentración suficiente, el mAb L2G7 puede inhibir extensa o completamente la proliferación inducida por HGF de las células y los mAbs L2C7 y L1H4 inhiben por lo menos parcialmente la proliferación. Estos anticuerpos pueden también inhibir la proliferación inducida por HGF de otras líneas celulares epiteliales. Por ejemplo, la actividad inhibidora de L2G7 sobre la proliferación inducida por HGF de células Mv 1 Lu de pulmón de ink fue determinada (Borset et al., J. Immunol . Methods 189:59, 1996). Las células cultivadas en DMEM que contiene 10% de FCS son cosechadas mediante el tratamiento con EDTA/tirisina. Después del lavado, las células son resuspendidas a 5 x 104 células/ml en DMEM libre de suero con una concentración predeterminada (50 ng/ml) de HGF +/- varias concentraciones de mAb. Después de un día de incubación a 37 °C en 5% de C02, se determina el nivel de proliferación celular mediante la adición de 1 µCi de 3H-timidina por 24 horas adicionales. Las células son cosechadas sobre filtros de fibra de vidrio utilizando un cosechador de células automatizado y se determina el nivel de 3H-timidina incorporada sobre un contador de centelleo. La figura 9 muestra que la adición de una concentración molar 100 veces más alta de mAb L2G7 inhibe completamente la respuesta proliferante de células Mv 1 Lu. Por supuesto, L2G7 aún a una proporción moler triplicada de mAb a HGF mostró inhibición completa, en tanto que el IgG de control no mostró inhibición aún a un exceso molar de 100 veces. Se reporta también que el HGF es un factor de angiogénesis potente (Bussolino et al., J. Cell Biol. 119:629, 1992; Cherrington et al., Adv. Cáncer Res. 79:1, 2000), y la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, se cree que es esencial para el crecimiento de tumores. Por consiguiente, la capacidad de los mAbs anti-HGF para inhibir las propiedades angiogénicas de HGF es demostrada en tres análisis: (i) proliferación de células endoteliales vasculares humanas (HUVEC) , (ii) formación de tubo de HUVEC, y (iii) • desarrollo de nuevos vasos sanguíneos sobre la membrana corioalantoica de embrión de pollo (CAM) . Puesto que se ha demostrado que HGF se sinergiza con VEGF en la angiogénesis (Xin et al., Am. J. Pathol. 158:1111, 2001), estos análisis pueden ser efectuados tanto en presencia como en ausencia de VEGF. El análisis de proliferación de HUVEC se efectúa como se describe con una modificación (Conn et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:1323, 1990). Células HÜVEC obtenidas de Clonetics son cultivadas en medio de cultivo endotelial (EBM-2) que contiene 10% de FCS más complemento de cultivo celular endotelial proporcionados por Clonetics. Preferiblemente, las células de los pasajes 4 a 7 son usados en este estudio. Las células son resuspendidas para ser de 105 células/ml en medio-199 que contiene antibióticos, 10 mM HEPES y 10% de FCS (medio de análisis) . Células HUVEC (50 µl/cavidad) son agregadas a cavidades de microtítulo que contienen una concentración apropiada de HGF con varias concentraciones de mAbs anti-HGF durante 1 hora a 37 °C. Después que las células son incubadas durante 72 horas a 37 °C en 5% de C02, se determina el nivel de proliferación celular mediante la incorporación de 3H-timidina durante 4 horas. A concentraciones suficientes, el mAb L2G7 inhibirá extensa o completamente la proliferación inducida por HGF de los HUVEC, y mAbs L2C7 y L1H4 puede por lo menos inhibir parcialmente la proliferación. Alternativamente, el nivel de proliferación cloruro puede ser determinado mediante el análisis de MTT colorimétrico bien conocido. Las células HUVEC (104 células/100 µl/cavidad) son cultivadas en medio libre de suero durante 24 horas y luego incubadas con 100 µl de 50 ng/ml de HGF (predeterminada para ser una cantidad sub-óptima) con varias concentraciones de mAb L2G7 durante 72 horas. Se agrega solución de MTT (5 mg/ml) a cada cavidad (20 µl/200 µl de medio) durante 4 horas. Luego 100 µl de medio/cavidad son separados y mezclados con 100 µl/cavidad de alcohol isopropílico acidificado (HCl 0.04 N en isopropilo) . Las placas son leídas sobre un lector de ELISA a 560 nm. El % de respuesta máxima es calculada como sigue: [OD de HGF + células tratadas con mAB - OD de células sin tratar] / [OD de HGF de células tratadas - OD de células sin tratar] x 100. La Figura 10 muestra que aún a un exceso molar duplicado de L2G7 mAB bloquea extensamente la proliferación de HUVEC en respuesta a HGF. El análisis de tubo endotelial es llevado a cabo esencialmente como se describe (Matsumura, et al., J. Immunol . 158:3408, 2001; Xin et al., Am. J. Pathol. 158:111, 2001). HÜVEC (Clonetics) de los pasajes 4-7 son cultivadas en medio de EGM Clonetics complementado con 10% de FBS y complementos de cultivo celular endotelial. Las placas son recubiertas con Matrigel (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante a 37 °C durante 30 minutos y las células son sembradas como 3 x 106 células/ml en 1 x de medio basal con HGF y varias concentraciones de mAbs anti-HGF. La formación del tubo es evaluada bajo el microscopio a una amplificación de baja potencia (lOx) . A concentraciones suficientes, el mAb L2G7 inhibirá extensa o completamente la formación de tubo endotelial inducida por HGF y los mAbs L2C7 y L1H4 pueden por lo menos inhibirlo parcialmente. El análisis de membrana corioalantoica de embrión de pollo (CAM) se efectúa esencialmente como se describe (Kim et al., Nature 362:841, 1992). Embriones de pollo de tres días son retirados de sus cascaras y cultivados en cajas de Petri en 5% de C02 a 37 °C. Siete días más tarde, los discos de metilcelulosa secos que contienen HGF con varias concentraciones de mAbs anti-HGF son estratificados sobre el CAM. Las cajas de metilcelulosa son preparadas al mezclar 5 µl de 1.5% de metilcelulosa en PBS con 5 µl de HGF preincubado con mAbs. Tres días más tarde el desarrollo de vasos sanguíneos alrededor de las cajas de metilcelulosa es examinado. A concentraciones suficientes, el mAb L2G7 inhibirá extensa o completamente tal formación de vasos sanguíneos y los mAbs L2C7 y L1H4 pueden inhibirlo por lo menos parcialmente. También se reporta que el HGF promueve el crecimiento de tumor (Comoglio y Trusolino, J. Clin. Invest. 109:857, 2002) . La capacidad de los anticuerpos anti-HGF para inhibir esta actividad es demostrada en dos etapas. En primer lugar, un número de líneas de célula de tumor son examinadas en cuanto a su capacidad para segregar HGF y proliferar en respuesta a HGF puesto que HGF puede ser un factor de crecimiento autocrino para algunas de estas células. Estas las celulares incluyen un panel de línea de célula de tumor humano que se sabe que expresan HGF y cMet (Koochekpour et al., Cáncer Res. 57:5391, 1997; Wang et al., J. Cell. Biol. 153:1023, 2001). Las líneas celulares específicas a ser probadas incluyen glioma U-118, carcinoma de colon HCT116, carcinoma de pulmón A549 y células de carcinoma epidermoides A431, todas disponibles de la ATCC. Una vez que tales líneas de células de tumor son identificadas, el efecto de los mAbs anti-HGF sobre la respuesta proliferativa a HGF de estas células es determinado, utilizando métodos similares a aquellos descritos anteriormente. A concentraciones suficientes, el mAb L2G7 inhibirá extensa o completamente la proliferación inducida por HGF de muchas o todas de estas líneas celulares y los mAbs L2C7 y L1H4 pueden inhibir por lo menos parcialmente la proliferación. Por ejemplo, células de tumor HCT116 humanas son sembradas en placas de microtítulo de 96 cavidades a 5 x 103 células/cavidad en 200 µl de DMEM más 5% de FCS. Después de una incubación de 24 horas a 37 °C en 5% de C02, las células son lavadas con PBS e incubadas en DMEM libre de suero durante 48 horas. Luego las células son incubadas con 100 ng/ml de HGF +/-20 µg/ml de mAbs en DMEM por otras 20 horas. Como controles, células cultivadas en DMEM solo o DMEM más 10% de FCS son incluidas. Al final de la incubación, los niveles de proliferación celulares son determinados mediante incorporación de 3H-timidina durante 4 horas. El resultado de tal experimento se efectúa por triplicado como se muestra en la figura 11. HGF indujo una proliferación moderada de las células HCT116, la cual fue abolida completamente mediante la adición del anticuerpo L2G7 (pero no por el anticuerpo L1H4 menos potente) . En todos los análisis descritos anteriormente, cada anticuerpo anti-HGF neutralizará o inhibirá la actividad cuando sea usado solo sin otros antagonistas de HGF, esto es, como un solo agente, pero efectos aditivos o sinergísticos pueden ser obtenidos al administrar el anticuerpo en conjunción con otros anticuerpos anti-HGF u otros agentes activos.

. Capacidad de los mAbs anti-HGF para Inhibir el Crecimiento de Tumor In Vivo La capacidad de los anticuerpos anti-HGF para inhibir el crecimiento de tumor humano se demuestra en modelos de xenoinjerto en ratones inmunodeficientes u otros roedores, tales como rata. Ejemplos ilustrativos pero no limitantes de cepas inmunodeficientes de ratones que pueden ser usados son ratones desnudos tales como CD-1 desnudo, Nu/Nu, Balb/c desnudo, NIH-III (NIH-bg-nu-xid BR) ; ratones scid tales como Fox Chase SCID (C.B-17 SCID), Fox Chase outbread SCID y SCID Beieg; ratones deficientes en enzima RAG; también como ratas desnudas. Los experimentos son llevados a cabo como se describe previamente (Kim et al., Nature 362:841, 1992, que es incorporado en la presente por referencia) . Células de tumor humano cultivadas en medio de DMEM completos son cosechadas en HBSS. Ratones inmunodeficientes hembra, por ejemplo ratones desnudos atímicos (de 4-6 semanas) son inyectados s.c. comúnmente con 5xl06 células en 0.2 ml de HBSS en las áreas dorsales. Cuando el tamaño del tumor llega a 50-100 mm3, los ratones son agrupados aleatoriamente y cantidades apropiadas de los anti-HGF y mAbs de control (comúnmente entre 0.1 y 1.0 mg, por ejemplo 0.5 mg) son administrados i.p. una vez, dos veces o tres veces por semana en un volumen de por ejemplo 0.1 ml, durante por ejemplo 1, 2, 3 ó 4 semanas o la duración del experimento. Los tamaños de tumor son determinados comúnmente dos veces a la semana al medir en dos dimensiones [longitud (a) y ancho (b) ] . El volumen del tumor es calculado de acuerdo con V = ab2/2 y expresado como volumen de tumor promedio ± SEM. El número de ratones en cada grupo de tratamiento es por lo menos 3, pero más frecuentemente entre 5 y 10, por ejemplo 7. El análisis estadístico puede ser efectuado utilizando por ejemplo la prueba de t de Student. En una variación de este experimento, la administración del anticuerpo comienza simultáneamente o brevemente después de la inyección de las células de tumor. El efecto del anticuerpo puede también ser medido por la prolongación de la sobrevivencia de los ratones o incremento en % de los ratones que sobreviven. Varias líneas de células de tumor se sabe que segregan o responden a HGF son usadas en experimentos separados, por ejemplo células de glioblastoma humanas U-118 y/o células de tumor de colon humano HCT116. Los anticuerpos preferidos de la invención, tales como anticuerpos semejantes a humano y de inmunogenicidad reducida y el anticuerpo L2G7 y sus formas quiméricas y humanizadas y anticuerpos con el mismo epítopo como L2G7, cuando son usados como un solo agente, inhibirán el crecimiento de tumores por al menos 25%, pero posiblemente 40% o 50% y tanto como 75% o 90% o mayor o aún inhiben completamente el crecimiento del tumor después de algún período de tiempo o provocan regresión del tumor o desaparición. Esta inhibición tomará lugar por al menos línea de célula de tumor tal como U118 en por lo menos una cepa de ratón tal como ratón Beige/Desnudo NIH III, pero preferiblemente ocurrirá durante 2, 3, varias, muchas o aún esencialmente todas las líneas de célula de tumor que expresan HGF de un tipo particular (por ejemplo glioma) o cualquier tipo, cuando son probados en una o más cepas de ratón inmunodeficientes que no generan una respuesta de anticuerpo neutralizante contra el anticuerpo inyectado. El tratamiento con algunos anticuerpos preferidos en uno o más de los modelos de xenoinjerto conduce a la sobrevivencia indefinida de 50%, 75%, 90% o aún esencialmente todos los ratones, que de otra manera morirían o necesitarían ser sacrificados debido al crecimiento de su tumor. Por ejemplo, tal experimento fue efectuado con células de gioblastoma U-118, cultivadas en medio DMEM con FCS y cosechadas en HBSS. Ratones Beige/Desnudo NIH III hembras (4- 6 semanas) son inyectados s.c. con 10d células en 0.2 ml de HBSS en las áreas dorsales. Cuando el tamaño del tumor llega a -50 mm3, los ratones son agrupados aleatoriamente en dos grupos de 6 ratones cada uno y se administran 200 µg de mAb de L2G7 (grupo de tratamiento) o de PBS (grupo de control) i.p. dos veces a la semana en un volumen de 0.1 ml . Los tamaños del tumor son determinados dos veces a la semana como se describe anteriormente. Al final del experimento, los tumores son extirpados y pesados. La figura 12 muestra que el tratamiento con L2G7 inhibe completamente en crecimiento del tumor. Experimentos de inhibición de tumor similares son efectuados con el anticuerpo anti-HGF administrado en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos tales como 5-FU 85-fluorouracilo) o CPT-11 (Camptosar) a los cuales el tipo de tumor se espera que sea sensible, como se describe por Ashkenize et al., J. Clin. Invest. 104:155, 1999. La combinación del anticuerpo y fármaco quimioterapéutico puede producir una inhibición mayor de crecimiento de tumor que ya sea uno u otro agente solo. El efecto puede ser aditivo o sinergístico e inhibir fuertemente el crecimiento, por 80% o 90% o más o aún provocar regresión o desaparición del tumor. El anticuerpo anti-HGF puede también ser administrado en combinación con un anticuerpo contra otro factor de crecimiento o factor angiogénico, por ejemplo anti-VEGF y se espera la inhibición de crecimiento aditiva o sinergística y/o regresión o desaparición del tumor. Aunque la invención se ha descrito con referencia a las modalidades actualmente preferidas, se debe entender que varias modificaciones se pueden efectuar sin desviarse de la invención. A no ser que se sea de otra manera evidente a partir del contexto de cualquier etapa, elemento, modalidad o elemento o aspecto de la invención puede ser usado con otro. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos a la misma extensión como si cada publicación, patente y solicitud de patente individual fuera indicada específica e individualmente a ser incorporada por referencia en su totalidad para todos los propósitos .

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza y neutraliza el factor de crecimiento de hepatocito humano.
2. 2. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es quimérico.
3. 3. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es humanizado.
4. 4. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es humano.
5. 5. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe el enlace del factor de crecimiento de hepatocito a cMet por al menos 50%.
6. 6. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la dispersión inducida por el factor de crecimiento de hepatocito de células de riñon caninas Madin-Darby.
7. 7. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la proliferación inducida por el factor de crecimiento de hepatocito de células HUVEC .
8. 8. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento de hepatocito.
9. 9. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque neutraliza todas las actividades biológicas del factor de crecimiento de hepatocito.
10. 10. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe el crecimiento de un xenoinjerto de tumor humano en un ratón.
11. 11. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque inhibe completamente el crecimiento de un xenoinjerto de tumor humano en un ratón.
12. 12. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un Fab o fragmento F(ab')2 o anticuerpo de una sola cadena.
13. 13. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se enlaza específicamente con HGF con una afinidad de enlace de por lo menos 108 M"1.
14. 14. Un anticuerpo L2G7 mAb caracterizado porque es quimérico o humanizado.
15. 15. Un anticuerpo caracterizado porque compite por el enlace al HGF humano con un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14.
16. 16. Una línea celular caracterizada porque produce el anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1.
17. 17. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 14.
18. 18. Un método para el tratamiento de cáncer en un paciente caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-HGF neutralizante.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el cáncer es glioblastoma.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo L2G7 quimérico o humanizado.