PT1734995E - Anticorpos monoclonais contra o factor de crescimento de hepatócitos - Google Patents

Description

ΕΡ 1 734 995/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Anticorpos monoclonais contra o factor de crescimento de hepatócitos"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se genericamente à combinação de tecnologias de anticorpos monoclonais (mAb) e ADN recombinante para o desenvolvimento de produtos novos biológicos, e mais particularmente, por exemplo, à produção de anticorpos monoclonais gue se ligam a, e neutralizam, o factor de crescimento de hepatócitos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 factor de crescimento de hepatócitos (HGF) humano é um polipéptido heterodimérico multifuncional produzido por células mesenquimatosas. Foi mostrado que o HGF estimula a angiogénese, a morfogénese e a motogénese, assim como o crescimento e a dispersão de vários tipos de células (Bussolino et al., J. Cell. Biol. 1991: 629, 1992, Zarnegar e Michalopoulos, J. Cell Biol. 129: 1177, 1995; Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier e Gherardi,

Trends Cell. Biol. 8: 404, 1998; Xin et al., Am. J. Pathol. 158: 1111, 2001). As actividades peliotrópicas de HGF são mediadas através do seu receptor, uma tirosina-quinase transmembranar codificada pelo proto-oncogene cMet. Além de regularem várias funções celulares normais, foi mostrado que o HGF e o seu receptor c-Met estão envolvidos na iniciação, invasão e metástase de tumores (Jeffers et al., J. Mol. Med. 74: 505, 1996; Comoglio e Trusolino, J. Clin. Invest. 109: 857, 2002). O HGF/cMet são co-expressos, com frequência sobre-expressos, em vários tumores sólidos humanos incluindo tumores derivados de tecido de pulmão, cólon, recto, estômago, rim, ovário, pele, mieloma múltiplo e tiróide (Prat et al., Int. J. Câncer 49: 323, 1991, Chan et al., Oncogene 2: 593, 1988;

Weidner et al. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8: 229, 1993;

Derkesen et al., Blood 99: 1405, 2002). O HGF actua como um factor de crescimento autócrino (Rong et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91: 4731, 1994; Koochekpour et al., Câncer 2 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ

Res. 57: 5391, 1997) e parácrino (Weidner et al., Am. J.

Respir. Cell. Mol. Biol. 8: 229, 1993) e regulador anti- apoptótico (Gao et al., J. Biol. Chem. 276: 47257, 2001) para estes tumores. O HGF é uma proteína de 102 kDa com similaridade de sequência e estrutural com o plasminogénio e outras enzimas da coagulação do sangue (Nakamura et al., Nature 342: 440, 1989,

Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8: 229, 1993, cada um aqui incorporado por referência (figura 1) . O HGF humano é sintetizado na forma de um precursor de 728 aminoácidos (preproHGF), que sofre clivagem intracelular numa forma de cadeia única inactiva (proHGF) (Nakamura et al., Nature, 342; 440, 1989, Rosen et al., J. Cell. Biol. 127: 1783, 1994). Aquando da secreção extracelular, o proHGF é clivado para originar a molécula heterodimérica ligada por dissulfureto biologicamente activa composta por uma

subunidade-α e uma subunidade-β (Nakamura et al., Nature 342; 440, 1989; Naldini et al. EMBO J. 11: 4825, 1992). A subunidade-α contém 440 resíduos (69 kDa com glicosilação) consistindo no domínio "gancho de cabelo" ("hairpin") N- terminal e quadro domínios kringle. A subunidade-β contém 234 resíduos (34 kDa) e tem um domínio semelhante a serina-protease a que falta actividade proteolítica. A clivagem de HGF é requerida para activação do receptor, mas não para ligação do receptor (Hartmann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 11574, 1992; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268: 17145, 1992). O HGF contém 4 locais de N-glicosilação putativos, 1 na subunidade-α e 3 na subunidade-β. O HGF tem 2 locais de ligação específicos de células únicos: um local de ligação de alta afinidade (Kd = 2 x IO”10 M) para o receptor cMet e um local de ligação de baixa afinidade (Kd = 1CT9 M) para os proteoglicanos de sulfato de heparina (HSPG), que estão presentes na superfície da célula e na matriz extracelular (Naldini et al., Oncogene, 6:501, 1991; Bardelli et al., J. Biotechnol. 37: 109, 1994; Sakata et al., J. Biol. Chem. 272; 9457, 1997) . NK2 (uma proteína englobando o terminal N e os primeiros dois domínios kringle da subunidade-α) é suficiente para ligação a cMet e activação da cascata de sinalização para motilidade, no entanto, a proteína de comprimento completo é requerida para a resposta mitogénica (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8: 229, 1993). HSPG liga-se a HGF por interaeção com o terminal N de HGF (Aoyama, et al., Biochem. 3 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ 36: 10286, 1997; Sakata et al., J. Biol. Chem. 272: 9457, 1997). Os papéis postulados para a interacção HSPG-HGF incluem a melhoria da biodisponibilidade, actividade biológica e oligomerização de HGF (Bardelli et al., J. Biotechnol. 37: 109, 1994; Zioncheck et al., J. Biol. Chem. 270: 16871, 1995). cMet é um membro da família de receptores proteína-tirosina-quinases da classe IV. O gene cMet de comprimento completo foi clonado e identificado como o proto-oncogene cMet (Cooper et al., Nature 311: 29, 1984, Park et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 6379, 1987) . O receptor cMet é inicialmente sintetizado na forma de um precursor em cadeia única parcialmente glicosilado, pl70(MET) (figura 1). (Park et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 6379, 1987; Giordano et al., Nature 339: 155, 1989, Giordano et al., Oncogene 4: 1383, 1989; Bardelli et al., J. Biotechnol. 37: 109, 1994). Aquando de glicosilação adicional, a proteína é proteoliticamente clivada numa proteína madura de 190 kDa heterodimérica (1385 aminoácidos) , consistindo na subunidade-α de 50 kDa (resíduos 1-307) e na subunidade-β de 145 kDa. O domínio de tirosina-quinase citoplasmático da subunidade-β está envolvido na transdução de sinal. Várias abordagens diferentes foram investigadas para obter uma molécula antagonista da interacção HGF/cMet: proteínas HGF truncadas como NK1 (domínio N-terminal mais domínio krlngle 1; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268: 17145, 1993), NK2 (domínio N-terminal mais domínios krlngle 1 e 2; Chan et al., Science 254: 1382, 1991) e NK4 (domínio N- terminal mais 4 domínios krlngle·, Kuba et al., Câncer REs 60: 6737, 2000), os mAb anti-cMet (Dodge, Tese de Mestrado, San

Francisco State University, 1998) e os mAb anti-HGF (Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 98: 7443, 2001, que se incorpora aqui por referência). NK1 e NK2 podem competir eficazmente na ligação de HGF ao seu receptor, mas foi mostrado que possuem actividades agonistas parciais In vitro (Cioce et al., J. Biol. Chem. 271: 13110, 1996; Schwall et al., J. Cell Biol. 133: 709, 1996), em vez de actividades puramente antagonistas, como desejado. Mais recentemente, Kuba et al., Câncer Res. 60: 6737, 2000, demonstraram que NK4 podia parcialmente inibir o crescimento primário (figura 2) e a metástase de tumor de pulmão murino 4 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ LLC num modelo de ratinho nu por infusão contínua de NK4. 0 facto de que NK4 precisa ser administrado continuamente para obter uma inibição parcial do crescimento de tumores primários indica uma meia-vida potencialmente curta da molécula de NK4 e/ou falta de potência. Comparativamente com NK4, a abordagem da utilização de anticorpos irá beneficiar da sua farmacocinética favorável e da possibilidade de obter anticorpos com uma potência muito maior.

Noutra abordagem, Dodge, (Tese de Mestrado, San Francisco State University, 1998) gerou anticorpos monoclonais (mAb) anti-cMet antagonistas. Um mAb, o 5D5, exibiu uma forte actividade antagonista em ELISA, mas induziu uma resposta proliferativa de células BAF-3 que expressam cMet, provavelmente devido à dimerização dos receptores de membrana. Prat et al., J. Cell. Sei. 111: 237, 1998, também registou estas actividades agonistas dos mAb anti-cMet. Zaccolo et al., Eur. J. Immunol. 27: 618, 1997, usaram métodos de exibição em fagos para desenvolver fragmentos Fab humanos contra factor de crescimento de hepatócitos de ratinho e humano. Estes fragmentos Fab não tiveram efeito sobre a actividade de HGF quando usados sozinhos. Quando um dos fragmentos Fab anti-HGF humano foi combinado com um anticorpo que se ligava ao próprio fragmento Fab, realmente melhorou a actividade de HGF num ensaio biológico.

Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 7443, 2001, demonstraram que a administração de um cocktail de três mAb anti-HGF, que foram seleccionados com base na sua capacidade de inibir a actividade de dispersão de HGF in vitro, foram capazes de inibir o crescimento de tumores humanos no modelo de ratinho nu de xenoenxerto (figura 3) . Eles postularam que eram requeridos três mAb reconhecendo três diferentes locais de ligação em HGF para inibir as bioact ividades de HGF in vivo: dois mAb inibiram a ligação de HGF a cMet e um mAb inibiu a ligação de HGF a heparina. No entanto, não é praticável, por razões comerciais e regulatórias, desenvolver um fármaco combinando três novos mAb, por exemplo, porque seria necessário demonstrar alguma actividade clínica de cada anticorpo independentemente.

Assim, existe uma necessidade de um único anticorpo monoclonal que bloqueie a actividade biológica de HGF in vitro 5 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ e in vivo. A presente invenção atende a esta e outras necessidades.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um mAb neutralizante para o factor de crescimento de hepatócitos humano (HGF) como definido pelas reivindicações. 0 mAb inibe pelo menos uma, e preferivelmente várias ou todas as actividades biológicas de HGF incluindo a ligação ao seu receptor cMet, induzindo a dispersão de células como células de rim canino Madin-Darby, induzindo a proliferação de células epiteliais de macaco 4MBr-5 e/ou hepatócitos e/ou HUVEC, e induzindo a angiogénese. 0 mAb anti-HGF pode inibir esta actividade quando usado como um agente único. 0 mAb anti-HGF inibe, mais preferivelmente inibe completamente, o crescimento de um xenoenxerto tumoral humano num ratinho. Preferivelmente, o mAb da invenção é quimérico, humanizado, semelhante a humano ou humano. São exemplos de anticorpos o L2G7 e suas formas quiméricas e humanizadas. As linhas celulares que produzem estes anticorpos são também proporcionadas. Noutra concretização, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-HGF neutralizante, como definido pelas reivindicações, por exemplo L2G7 quimérico ou humanizado. Numa terceira concretização, a composição farmacêutica é administrada a um paciente para tratar cancro ou outra doença.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Modelos esquemáticos de HGF e cMet.

Figura 2. Gráfico mostrando que NK4 inibe parcialmente o crescimento primário de tumor de pulmão murino LLC em ratinhos nus (de Kuba et al., Câncer Res 60: 6737, 2000). NK4 foi infundido continuamente durante 14 dias a partir do 4o' dia após o implante do tumor s.c. em ratinhos nus.

Figura 3. Gráfico mostrando que é requerido um cocktail de três mAb anti-HGF para inibir o crescimento de células U-118 de tumor de cérebro humano em ratinhos nus (de Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 7443, 2001). As células tumorais U-118 foram injectadas s.c. em ratinhos nus. A partir do dia 1, os mAb anti-HGF A-l, -5 e -7, ou os mAb 7-2 e -3 6 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ foram administrados a 200 μg/injecção, duas vezes/ semana durante 10 semanas.

Figura 4. Determinação de epítopos de ligação relativos dos mAb L1H4, L2C7, L2G7 usando ELISA de ligação competitiva. As placas foram revestidas com HGF recombinante (rHGF), bloqueadas com leite desnatado e incubadas com uma concentração subóptima dos mAb biotinilados na presença de quantidades em excesso de lOOx dos mAb não marcados. O mAb biotinilado ligado foi detectado pela adição de HRP- estreptavidina.

Figura 5. Ligação dos mAb anti-HGF a rHGF como determinado num ELISA de ligação directa de HGF. A placa foi revestida com o sobrenadante de Hl-Fll contendo rHGF, bloqueada por leite desnatado a 2% e incubada com os mAb, seguindo-se a adição de HRP-GaMIgG (como descrito nos exemplos).

Figura 6. Capacidades dos mAb anti-HGF capturarem rHGF-Flag em solução. Os mAb anti-HGF foram capturados numa placa de ELISA revestida com IgG de cabra anti-ratinho. As placas foram então bloqueadas com leite desnatado a 2% e incubadas com rHGF-Flag, seguindo-se mAb anti-Flag M2-HRP (como descrito nos exemplos).

Figura 7. Inibição de ligação de rHGF-Flag a cMet-Fc pelos mAb anti-HGF num ELISA de captura. O cMet-Fc capturado na placa revestida com IgG de cabra anti-humano é incubado com HGF-Flag pré-incubado com/sem os mAb. O rHGF-Flag ligado foi detectado pela adição de mAb anti-Flag M2-HRP (como descrito nos exemplos).

Figura 8. Neutralização de HGF induziu a dispersão de MDCK pelo mAb anti-HGF L2G7. (A) Controlo sem qualquer tratamento. (B) rHGF + IgG. (C) rHGF + mAb L2G7. As células MDCK foram incubadas com uma diluição 1:20 de sobrenadante de cultura Hl-Fll (~3 μρ/ιηΐ de HGF) na presença de 10 μρ/πιΐ dos mAb. As fotografias foram obtidas com uma ampliação de lOOx.

Figura 9. Inibição de proliferação induzida por HGF de células Mv 1 LU por mAb L2G7. O número de vezes de excesso molar de mAb relativamente ao HGF é mostrado no eixo 7 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ horizontal, e as cpm x 1(Γ2 incorporadas são mostradas no eixo vertical. Os pontos de dados foram obtidos em triplicado.

Figura 10. Inibição de proliferação induzida por HGF de HUVEC por mAb L2G7 e anticorpo de ratinho de controlo (mlgG). Os pontos de dados foram obtidos em triplicado.

Figura 11. Efeito sobre a proliferação induzida por HGF de células tumorais do cólon HCT 116 pelos anticorpos L2G7 e L1H4. Os pontos de dados foram obtidos em triplicado.

Figura 12. Efeito do tratamento com mAb L2G7 ou PBS (controlo) no crescimento de tumores U-118 em grupos de ratinhos Beije/Nude NIH III (n = 6) . A seta indica quando as injecções começam. (A) tamanho do tumor versus dia após implante do tumor. (B) Massa tumoral no final da experiência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção proporciona anticorpos monoclonais anti-HGF neutralizantes, composições farmacêuticas compreendendo os mesmos, e os mesmos para utilização no tratamento de doença. 1. Anticorpos

Os anticorpos são moléculas complexas muito grandes (peso molecular de -150 000 ou cerca de 1320 aminoácidos) com estrutura interna intrincada. Uma molécula de anticorpo natural contém dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada. Cada cadeia leve e cadeia pesada consiste, por sua vez, em duas regiões: uma região variável ("V") envolvida na ligação ao antigénio alvo, e uma região constante ("C") que interage com outros componentes do sistema imunitário. As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dobram-se no espaço tridimensional para formar uma região variável que liga o antigénio (por exemplo um receptor na superfície de uma célula). Dentro de cada região variável de cadeia leve ou pesada, existem três segmentos curtos (com uma média de 10 aminoácidos de comprimento) denominadas as regiões determinantes de complementaridade ("CDR"). As seis CDR no domínio variável de um anticorpo (três da cadeia leve e três da cadeia pesada) dobram-se no espaço 3-D para formar o local de ligação real do anticorpo que se fecha sobre o antigénio alvo. A posição e o 8 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ comprimento das CDR foram definidos precisamente. Kabat E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987. A parte de uma região variável não contida nas CDR é denominada o esqueleto, que forma o ambiente para as CDR.

Um anticorpo monoclonal (mAb) é uma espécie molecular única de anticorpo e, assim, não engloba anticorpos policlonais produzidos pela injecção de um animal (como um roedor, coelho ou cabra) com um antigénio, e a extracção do soro do animal. Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente manipulado (monoclonal) em que as CDR de um anticorpo de ratinho ("anticorpo dador", que pode ser também de rato, hamster ou outra espécie similar) são enxertados num anticorpo humano ("anticorpo aceitador"). Os anticorpos humanizados também podem ser preparados com menos que a totalidade das CDR de um anticorpo de ratinho (por exemplo Pascalis et al., J. Immunol. 169: 3076, 2002). Assim, um anticorpo humanizado é um anticorpo tendo CDR de um anticorpo dador e esqueleto da região variável e regiões constantes de um anticorpo humano. Assim, tipicamente, um anticorpo humanizado compreende (i) uma cadeia leve compreendendo três CDR de um anticorpo de ratinho, por exemplo L2G7, um esqueleto da região variável de um anticorpo humano e uma região constante humana, e (ii) uma cadeia pesada compreendendo três CDR de um anticorpo de ratinho, por exemplo L2G7, um esqueleto da região variável de um anticorpo humano e uma região constante humana. Além disso, a fim de reter uma afinidade de ligação elevada, pode ser empregue pelo menos um de entre dois elementos estruturais adicionais. Ver, patentes US 5 530 101 e 5 585 089, cada uma aqui incorporada por referência, que proporcionam instruções detalhadas para a construção de anticorpos humanizados.

No primeiro elemento estrutural, o esqueleto da região variável da cadeia pesada do anticorpo humanizado é escolhido para obter a identidade de sequências máxima (entre 65% e 95%) com o esqueleto da região variável da cadeia pesada do anticorpo dador, por selecção apropriada do anticorpo aceitador de entre os muitos anticorpos humanos conhecidos. A identidade de sequências é determinada quando as sequências de anticorpos que são comparadas são alinhadas de acordo com a convenção de numeração de Kabat. No segundo elemento 9 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ estrutural, na construção do anticorpo humanizado, os aminoácidos seleccionadas no esqueleto do anticorpo aceitador humano (fora das CDR) são substituídos por aminoácidos correspondentes do anticorpo dador, de acordo com regras específicas. Especificamente, os aminoácidos a substituir no esqueleto são escolhidos com base na sua capacidade de interagir com as CDR. Por exemplo, os aminoácidos substituídos podem estar adjacentes a uma CDR na sequência do anticorpo dador ou a 4-6 angstroms de uma CDR no anticorpo humanizado, como medido no espaço tridimensional.

Um anticorpo quimérico é um anticorpo em que a região variável de um anticorpo de ratinho (ou outro roedor) é combinada com a região constante de um anticorpo humano; a sua construção por meio de engenharia genética é bem conhecida. Estes anticorpos retém a especificidade de ligação do anticorpo de ratinho, embora sendo cerca de dois terços humanos. A proporção de sequência não humana presente em anticorpos de ratinho, quiméricos e humanizados sugere que a imunogenicidade de anticorpos quiméricos é intermediária entre anticorpos de ratinho e humanizados. Outros tipos de anticorpos geneticamente manipulados, que podem ter uma reduzida imunogenicidade em relação aos anticorpos de ratinho incluem os anticorpos humanos preparados usando métodos de exibição em fagos (Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/001047; Winter, W092/ 20791, e Winter, FEBS Lett. 23:92, 1998, cada um aqui incorporado por referência) ou usando animais transgénicos (Lonberg et al., W093/12227; Kucherlapati WO91/10741, cada um aqui incorporado por referência).

Como usado aqui, o termo anticorpo "semelhante a humano" refere-se a um mAb em que uma porção substancial da sequência de aminoácidos de uma ou ambas as cadeias (por exemplo cerca de 50% ou mais) é originária de genes de imunoglobulina humanos. Assim, os anticorpos semelhantes a humanos englobam, mas não são limitados a anticorpos quiméricos, humanizados e humanos. Como usado aqui, um anticorpo de "imunogenicidade reduzida" é um que se espera com uma imunogenicidade significativamente menor do que um anticorpo de ratinho quando administrado a pacientes humanos. Estes anticorpos englobam anticorpos quiméricos, humanizados e humanos, assim como anticorpos preparados por substituição de aminoácidos 10 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ específicos em anticorpos de ratinhos que podem contribuir para epítopos de células B ou T, por exemplo resíduos expostos (Padlan, Mol. Immunol. 28: 489, 1991). Como usado aqui, um anticorpo "geneticamente manipulado" é um para o qual os genes foram construídos ou colocados num ambiente não natural (por exemplo genes humanos num ratinho ou num bacteriófago) com a ajuda de técnicas de ADN recombinante, e assim, por exemplo, não devem englobar um mAb de ratinho preparado por tecnologia de hibridomas convencional. O epítopo de um mAb é a região do seu antigénio ao qual o mAb se liga. Dois anticorpos ligam-se ao mesmo epitopo ou a epítopos sobrepostos se cada inibir competitivamente (bloquear) a ligação do outro ao antigénio. Isto é, um excesso de lx, 5x, lOx, 20x ou lOOx de um anticorpo inibe a ligação do outro em pelo menos 50%, mas preferivelmente 75%, 90% ou mesmo 99% como medido num ensaio de ligação competitiva comparativamente com um controlo sem o anticorpo competidor (ver por exemplo Junghans et al., Câncer Res. 50: 1495, 1990, que se incorpora aqui por referência). Alternativamente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antigénio que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem a ligação do outro. Dois anticorpos têm epítopos sobrepostos se algumas mutações de aminoácidos, que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo, reduzirem ou eliminarem a ligação do outro. 2. Anticorpos anti-HGF neutralizantes

Um anticorpo monoclonal (mAb) que liga HGF (isto é, um mAb anti-HGF) diz-se que neutraliza HGF, ou como é neutralizante, se a ligação inibir parcial ou completamente uma ou mais actividades biológicas de HGF (isto é, quando o mAb é usado como um agente único). Entre as propriedades biológicas de HGF, que um anticorpo neutralizante pode inibir, estão a capacidade de HGF se ligar ao seu receptor cMet, causar a dispersão de algumas linhas celulares tais como as células de rim canino Madin-Darby (MDCK); para estimular a proliferação de (isto é, ser mitogénico para) algumas células incluindo hepatócitos, células epiteliais de macaco 4MBr-5, e várias células tumorais humanas; ou estimular a angiogénese, por exemplo como medido por estimulação da proliferação de células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) ou da formação 11 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ de túbulos ou por indução de vasos sanguíneos quando aplicados a uma membrana corioalantóica de embrião de pinto (CAM). Os anticorpos da invenção preferivelmente ligam-se a HGF humano, isto é, à proteína codificada pela sequência no GenBank com número de acesso D90334 (incorporada por referência).

Um mAb neutralizante da invenção numa concentração de, por exemplo, 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 ou 50 μg/ml irá inibir uma função biológica de HGF (por exemplo estimulação da proliferação ou dispersão) em cerca de pelo menos 50%, mas preferivelmente 75%, mais preferivelmente 90% ou 95% ou mesmo 99%, e o mais preferivelmente aproximadamente 100% (essencialmente completamente) como testado por métodos descritos nos exemplos ou bem conhecidos na especialidade. A inibição é considerada completa se o nível de actividade estiver dentro da margem de erro para um controlo negativo sem HGF. Tipicamente, a extensão da inibição é medida quando a quantidade de HGF usada for apenas suficiente para estimular completamente a actividade biológica, ou é de 0,05, 0,1, 0,5, 1, 3 ou 10 μg/ml. Preferivelmente, será conseguida inibição de pelo menos 50%, 75%, 90% ou 95% ou uma inibição essencialmente completa, quando a relação molar de anticorpo para HGF for de 0,5x, lx, 2x, 3x, 5x ou lOx. Preferivelmente, o mAb será neutralizante, isto é, inibe a actividade biológica, quando usado como um agente único, mas serão necessários 2 mAb possíveis juntos para originar inibição. Mais preferivelmente, o mAb irá neutralizar não apenas uma mas várias das actividades biológicas listadas acima; para os fins daqui, um mAb anti-HGF que, usado como um agente único, neutraliza todas as actividades biológicas de HGF, será denominado "completamente neutralizante" e estes mAb são mais ou preferíveis. Os mAb da invenção serão preferivelmente específicos para HGF, isto é, não se irão ligar, ou somente se ligam numa extensão muito menor (por exemplo Ka pelo menos dez vezes menor), as proteínas que estão relacionadas com HGF, como o factor de crescimento de fibroblastos (FGF) e o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Os anticorpos preferidos não têm actividade agonística em relação a HGF. Isto é, os anticorpos bloqueiam a interacção de HGH com cMet sem estimular directamente as células contendo HGF. Os mAb da invenção tipicamente têm uma afinidade de ligação (Ka) para HGF de, pelo menos, 107 M_1, mas preferivelmente 108 M' 12 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ maior, e mais preferivelmente 109 M 1 ou maior, ou mesmo ΙΟ10 ΝΓ1, ou maior.

Os mAb da invenção incluem anticorpos anti-HGF na sua forma tetramérica natural (2 cadeias leves e 2 cadeias pesadas) e podem ser de qualquer um dos isotipos conhecidos IgG, IgA, IgM, IgD e IgE e seus subtipos, isto é, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 humanos e IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 de ratinhos. Nos mAb da invenção também se pretende incluir fragmentos de anticorpos como Fv, Fab e F(ab')2; anticorpos híbridos bifuncionais (por exemplo Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987), anticorpos de cadeia única (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879, 1988, Bird et al., Science 242: 423, 1988), e anticorpos com regiões constantes alteradas (por exemplo patente US 5 624 821). Os mAb podem ser de origem animal (por exemplo ratinho, rato, hamster ou galinha), ou podem ser geneticamente manipulados. Os mAb de roedores são preparados por métodos-padrão bem conhecidos na especialidade, compreendendo imunização múltipla com HGF em adjuvante apropriado, i.p., i.v., ou na almofada da pata, seguida por extraeção de células do baço ou dos nódulos linfáticos e fusão com uma linha celular imortalizada apropriada, e depois selecção de hibridomas que produzem anticorpo que se liga a HGF, por exemplo, ver os exemplos. Os mAb quiméricos e humanizados, preparados por métodos bem conhecidos na especialidade acima mencionados, são concretizações preferidas da invenção. Os anticorpos humanos preparados, por exemplo, por métodos de ratinhos transgénicos ou exibição em fagos são também preferidos (ver, por exemplo Dower et al., McCafferty et al., Winter, Lonberg et al., Kucherlapati, supra). Mais geralmente, os anticorpos de imunogenicidade reduzida e geneticamente manipulados, semelhantes a humanos, como definidos aqui, são todos preferidos.

Os mAb anti-HGF neutralizantes L1H4, L2C7 e os mAb L2G7, descritos infra, são exemplos, sendo o L2G7 um exemplo preferido. Os mAb neutralizantes com o mesmo epítopo ou epítopos sobrepostos, que qualquer um destes mAb, por exemplo o L2G7, proporcionam outros exemplos. Uma forma quimérica ou humanizada de L2G7 é uma concretização especialmente preferida. Um mAb (incluindo anticorpos quiméricos, humanizados e humanos) que compete com L2G7 pela ligação a HGF 13 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ e neutraliza HGF em pelo menos um, e preferivelmente todos os ensaios in vitro ou in vivo, descritos aqui, é também preferido. Os mAb que são 90%, 95%, 99% ou 100% idênticos (determinado por alinhamento das sequências dos anticorpos de acordo com a convenção de Kabat) a L2G7 em sequência de aminoácidos, pelo menos nas CDR, estão incluídos na invenção. Preferivelmente, estes anticorpos diferem de L2G7 num número pequeno de substituições de aminoácidos funcionalmente inconsequentes (por exemplo substituições conservativas) , deleções ou inserções. Preferivelmente, estes anticorpos retêm as propriedades funcionais de L2G7, isto é, estes anticorpos neutralizam HGF em pelo menos um, e preferivelmente em todos os ensaios in vitro ou in vivo aqui descritos. Para fins de classificação de substituições de aminoácidos como conservativas ou não conservativas, os aminoácidos podem ser agrupados como se segue: Grupo I (cadeias laterais hidrófobas): norleucina, met, ala, vai, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gin, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influenciam a orientação da cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservativas envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não conservativas constituem uma troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra.

Os mAb nativos da invenção podem ser produzidos a partir dos seus hibridomas. Os mAb geneticamente manipulados, por exemplo mAb quiméricos ou humanizados, podem ser expressos por vários métodos bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, os genes que codificam as suas regiões V de cadeia leve e pesada podem ser sintetizados a partir de oligonucleótidos sobrepostos e inseridos juntamente com regiões C disponíveis em vectores de expressão (por exemplo comercialmente disponível de Invitrogen) que proporcionam as regiões reguladoras necessárias, por exemplo promotores, melhoradores, locais poli A, etc. O uso do promotor - melhorador de CMV é preferido. Os vectores de expressão podem ser então transfectados usando vários métodos bem conhecidos como lipofecção ou electroporação em várias linhas celulares de mamíferos, como CHO, ou não produtoras de mielomas, incluindo Sp2/0 e NSO, e células que expressam os anticorpos 14 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ seleccionados por selecção com antibióticos apropriados. Ver, por exemplo, patente US 5 530 101. Quantidades maiores de anticorpo podem ser produzidas por crescimento das células em biorreactores comercialmente disponíveis.

Uma vez expressos, os mAb ou outros anticorpos da invenção podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão da especialidade como microfiltração, ultrafiltração, cromatografia de afinidade em proteína A ou G, cromatografia de exclusão por tamanhos, cromatografia de troca aniónica, cromatografia de troca catiónica, e/ou outras formas de cromatografia de afinidade com base em corantes orgânicos ou outros. Os anticorpos substancialmente puros com pelo menos cerca de 90 ou 95% de homogeneidade são preferidos, e com 98% ou 99% ou maior homogeneidade são mais preferidos, para usos farmacêuticos. 3. Usos terapêuticos

Numa concretização preferida, a presente invenção proporciona uma formulação farmacêutica compreendendo os anticorpos aqui descritos. Isto é, os anticorpos podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento de doença. As formulações farmacêuticas (isto é, medicamentos) dos anticorpos contêm o mAb num transportador fisiologicamente aceitável, opcionalmente com excipientes ou estabilizantes, na forma de soluções liofilizadas ou aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os recebedores nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões como fosfato, citrato ou acetato a um pH tipicamente de 5,0 a 8,0, com maior frequência 6,0 a 7,0; sais como cloreto de sódio, cloreto de potássio, etc., para os tornar isotónicos; antioxidantes, conservantes, polipéptidos de baixo peso molecular, proteínas, polímeros hidrófilos, como polissorbato 80, aminoácidos, hidratos de carbono, agentes quelantes, açúcares, e outros ingredientes padrão bem conhecidos dos peritos na especialidade (Remington's

Pharmaceutical Science, 16a. ed., Osol. A. Ed. 1980). O mAb está tipicamente presente numa concentração de 1 - 100 mg/ml, por exemplo 10 mg/ml.

Os anticorpos da invenção são tipicamente substancialmente puros de contaminantes indesejados. Isto significa que o anticorpo é tipicamente pelo menos cerca de 15 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ 50% ρ/ρ (peso/peso) puro, assim como está substancialmente isento de proteínas e contaminantes interferentes.

Preferivelmente, os anticorpos são pelo menos 90, 95% ou 99% p/p puros. As composições farmacêuticas para administração parentérica são geralmente estéreis, substancialmente isotónicas e preparadas de acordo com as boas práticas de fabrico da FDA ou de organizações similares. O mAb preparado numa formulação farmacêutica pode ser administrado a um paciente por qualquer via apropriada, em especial parentericamente por infusão intravenosa ou injecção de bolo, intramuscularmente ou subcutaneamente. A infusão intravenosa pode ser dada durante apenas 15 min, mas com maior frequência durante 30 min, ou mais de 1, 2 ou mesmo 3 horas. O mAb pode ser também injectado directamente no local de doença (por exemplo um tumor) ou encapsulado em agentes de transporte como lipossomas. A dose dada será suficiente para aliviar a condição a tratar ("dose terapeuticamente eficaz") e é provavelmente de 0,1 a 5 mg/kg peso corporal, por exemplo 1, 2, 3 ou 4 mg/kg, mas pode ser tão elevada como 10 mg/kg ou mesmo 15 ou 20 mg/kg. Uma dose unitária fixa também pode ser dada, por exemplo, 50, 100, 200, 500 ou 1000 mg, ou a dose pode ser baseada na área de superfície do paciente, por exemplo 100 mg/m2. Geralmente, entre 1 e 8 doses (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) são administrados para tratar cancro, mas podem ser dadas 10, 20 ou mais doses. O mAb pode ser administrado diariamente, bissemanalmente, semanalmente, semana sim, semana não, mensalmente, ou a algum outro intervalo, dependendo, por exemplo, da meia-vida do mAb, durante 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 3-6 meses ou mais. Os cursos repetidos de tratamento são também possíveis, como é a administração crónica. Um regime de uma dosagem e intervalos de administração, que alivia ou pelo menos parcialmente pára os sintomas da doença (bioquímicos, histológicos e/ou clínicos), incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença, é referido como um regime terapeuticamente eficaz.

As composições farmacêuticas da invenção também podem ser usadas na profilaxia de um paciente em risco de cancro. Estes pacientes incluem os que têm susceptibilidade genética para cancro, pacientes que sofreram exposição a agentes carcinogénicos, como radiação ou toxinas, e pacientes que 16 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ sofreram um tratamento anterior para cancro e estão em risco de recaída. Uma dosagem profilática numa quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade, ou retardar o início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou clínicos da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. A administração de uma composição farmacêutica numa quantidade e em intervalos eficazes para efectuar um ou mais destes objectivos é referida como um regime profilacticamente eficaz.

As doenças especialmente susceptíveis a terapia com os mAb anti-HGF da invenção incluem tumores sólidos conhecidos ou que se suspeita que requeiram angiogénese ou estarem associados com níveis elevados de HGF, por exemplo, cancro ovariano, cancro da mama, cancro do pulmão (célula pequena ou célula não pequena), cancro do cólon, cancro da próstata, cancro pancreático, cancro renal, cancro gástrico, cancro do fígado, tumores da cabeça e pescoço, melanoma, sarcomas e tumores do cérebro (por exemplo, glioblastomas), de crianças ou adultos. 0 tratamento também pode ser administrado a pacientes com leucemias ou linfornas. Numa concretização preferida, o mAb anti-HGF pode ser administrado junto com (isto é, antes, durante ou após) outra terapia anticancerosa. Por exemplo, o mAb anti-HGF pode ser administrado juntamente com qualquer um ou mais dos fármacos quimioterapêuticos bem conhecidos dos peritos na especialidade da oncologia, por exemplo Taxol (paclitaxel) ou seus derivados, compostos de platina como carboplatina ou cisplatina, antrociclinas como doxorrubicina, agentes alquilantes como ciclofosfamida, anti-metabolitos como 5-fluorouracilo, ou etoposido. 0 mAb anti-HGF pode ser administrado em combinação com dois, três ou mais destes agentes num regime quimioterapêutico padrão, por exemplo taxol e carboplatina, por exemplo cancro de mama e ovariano. Outros agentes com os quais o mAb anti-HGF pode ser administrado incluem produtos biológicos como anticorpos monoclonais, incluindo Herceptin™ contra o antigénio HER2, Avastin™ contra VEGF, ou anticorpos para o receptor de EGF, assim como fármacos anti-angiogénicos de molécula pequena ou antagonistas de receptores de EGF. Além disso, o mAb anti-HGF pode ser usado juntamente com terapia de radiação ou cirurgia. 17 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ Ο tratamento (por exemplo, quimioterapia padrão) incluindo o anticorpo mAb anti-HGF pode aumentar a sobrevivência livre de progressão mediana ou o tempo de sobrevivência total dos pacientes com estes tumores (por exemplo, ovariano, da mama, do pulmão, do pâncreas, do cérebro e do cólon, especialmente quando recidivo ou refractário) em pelo menos 30% ou 40%, mas preferivelmente 50%, 60% a 70% ou mesmo 100% ou mais, comparativamente com o mesmo tratamento (por exemplo, quimioterapia) mas sem o mAb anti-HGF. Além disso ou alternativamente, o tratamento (por exemplo, quimioterapia padrão) incluindo o mAb anti-HGF pode aumentar a taxa de resposta completa, a taxa de resposta parcial, ou a taxa de resposta objectiva (completa + parcial) de pacientes com estes tumores (por exemplo, ovariano, da mama, do pulmão, do pâncreas, do cérebro e do cólon, especialmente quando recidivos ou ref ractários) em pelo menos 30% ou 40%, mas preferivelmente 50%, 60% a 70%, ou mesmo 100% comparativamente com o mesmo tratamento (por exemplo quimioterapia) mas sem o mAb anti-HGF. Opcionalmente, o tratamento pode inibir a invasão tumoral ou a metástase.

Tipicamente, num ensaio clinico (por exemplo, um ensaio de fase II, fase II/III ou fase III), os aumentos acima mencionados na taxa mediana de resposta e/ou de sobrevivência sem progressão dos pacientes tratados com quimioterapia mais o mAb anti-HGF, em relação ao grupo de controlo de pacientes apenas recebendo quimioterapia (ou mais placebo), serão estatisticamente significativos, por exemplo ao nivel de p = 0,05 ou 0,01 ou mesmo 0,001. Será também entendido por um perito na especialidade que as taxas de resposta completas e parciais são determinadas por critérios objectivos comummente usados em ensaios clínicos para o cancro, por exemplo, como listado ou aceite pelo National Câncer Institute e/ou Food and Drug Administration. 4. Outros métodos

Os mAb anti-HGF da invenção também são úteis em métodos de diagnóstico, prognóstico e laboratoriais. Podem ser usados para medir o nível de HGF num tumor ou na circulação de um paciente com um tumor, e assim para seguir e guiar o tratamento do tumor. Por exemplo, um tumor associado com níveis elevados de HGF será especialmente susceptível ao 18 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ tratamento com um mAb anti-HGF. Em concretizações particulares, os mAb podem ser usados num ELISA ou radioimunoensaio para medir o nível de HGF, por exemplo num espécime de biópsia tumoral ou em soro ou em sobrenadante de meio de células que segregam HGRF em cultura de células. 0 uso de dois mAb anti-HGF que se ligam a diferentes epítopos (isto é, não competem pela ligação) será especialmente útil no desenvolvimento de um ELISA em "sanduíche" sensível para detectar HGF. Para vários ensaios, o mAb pode ser marcado com moléculas fluorescentes, moléculas marcadas por spin, enzimas ou radioisótopos, e pode ser proporcionado na forma de um kit com todos os reagentes necessários para realizar o ensaio ao HGF. Em outros usos, os mAb anti-HGF serão usados para purificar HGF, por exemplo por cromatografia de afinidade.

EXEMPLOS

1. Geração dos mAb anti-HGF

Para gerar os mAb que se ligam a, e bloqueiam a actividade de, HGF humano, foi primeiro produzido o HGF humano recombinante (rHGF) num sistema de expressão de mamíferos. ADNc codificando o HGF humano recombinante (rHGF) ou péptido rHGF-Flag (8 resíduos de aminoácido de Flag ligados ao terminal C de HGF) foram construídos num vector de expressão indutível por pIND (No et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 3346, 1996). Estes ADNc foram então transfectados em fibroblastos de rim humano EcR-293 (Invitrogen) usando o reagente de transfecção Fugene (Roche). As linhas celulares estáveis, Hl-Fll e 24.1, que segregam HGF e HGF-Flag, respectivamente, foram seleccionadas na presença de 600 μρ/ιηΐ e G418 e 400 ^g/ml de Zeocin (Invitrogen) . As Hl-Fll e 24.1 foram induzidas a segregar HGF e HGF-Flag por tratamento com 4 μΜ de Ponasterona A (Invitrogen) durante 4-5 dias em DMEM isento de soro contendo glutamina e antibióticos. Após os agregados serem removidos por centrifugação a 15 000 rpm durante 3 0 min a 4°C, o HGF segregado para o sobrenadante da cultura foi concentrado aproximadamente 100 vezes usando um cartucho de ultrafiltração de membrana com um filtro de limite de exclusão de PM 50 000 (filtro Amicon Centriprep YM-50 seguido por filtro microcon YM-50 (Millipore)] . Este sobrenadante de cultura de Hl-Fll concentrado contém -100 μρ/ιηΐ de HGF e -120 μρ/ιηΐ de albumina de soro bovino. 19 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ

Ratinhos Balb/c foram imunizados em cada almofada de pata traseira >10 vezes a intervalos de uma semana, com 1-2 μρ de rHGF purificado (Pepro Tech) ou 1-2 μρ de rHGF mais 1-2 μρ de BSA (sobrenadante de cultura de Hl-Fll concentrado) ressuspenso em MPL-TDM (Ribi Immunochem. Research). Três dias após o reforço final, células de nódulos linfáticos popliteais foram fundidas com células de mieloma murino, P3X63AgU.l (ATCC CRL1597) usando polietilenoglicol a 35%. Os hibridomas foram seleccionados em meio HAT como descrito (Chuntharapai e Kim, J. Immunol. 163: 766, 1997, que se incorpora aqui por referência). Dez dias após a fusão, os sobrenadantes da cultura dos hibridomas foram rastreados num ELISA de ligação directa de HGF assim como num ELISA de captura de HGF-Flag. Este último ensaio foi usado para confirmar adicionalmente a especificidade dos mAb anti-HGF seleccionados usando o ELISA de ligação directa de HGF e para seleccionar os mAb que se podem ligar a HGF em fase de solução. As actividades de bloqueio dos mAb seleccionados foram então determinadas no ELISA de ligação de HGF-Flag/cMet-Fc e no ensaio de dispersão de MDCK como descrito (Jeffers et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 14417, 1998). Os hibridomas seleccionados foram clonados duas vezes usando técnicas de diluição limitante. O isotipo dos mAb foi determinado usando um kit de isotipagem (Zymed). Ascites dos mAb seleccionados foram criadas e purificadas usando o kit de purificação de IgG ImmunoPure (A/G) (Pierce). Também os mAb biotinilados foram preparados usando EZ-sulfo-NHS-LC-biotina de acordo com as instruções fornecidas por Pierce. Cada um dos ensaios referidos aqui é descrito em maior detalhe abaixo. Para o ELISA de ligação directa de HGF, placas de microtitulação (Maxisorb, Nunc) são revestidas com 50 μΐ/poço de sobrenadantes de cultura de Hl-Fll contendo rHGF, diluído em PBS numa razão de 1:2 de HGF/ PBS, durante a noite a 4°C. Após lavar a placa, os locais de ligação não específica foram bloqueados com PBS contendo leite desnatado a 2% durante 1 h à temperatura ambiente (TA) . Após lavagem da placa, 50 μΐ/poço dos mAb purificados ou dos sobrenadantes de cultura dos hibridomas foram adicionados a cada poço durante 1 h. Após lavagem, as placas são então incubadas com 50 μΐ/poço de IgG de cabra anti-ratinho - HRP (HRP-GocMIgG, Cappel) a 1 μg/ml, durante 1 h. O HRP-GaMIgG ligado é detectado pela adição do substrato tetrametilbenzimida (Sigma). A reacção é parada pela adição de 20 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ H2S04 IN e as placas são então lidas a 450 nm usando um leitor de placas de ELISA. As lavagens são realizadas 3 vezes com tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% de Tween 20).

Para o ELISA de captura de HGF-Flag, as placas de microtitulação foram revestidas com 50 μg/poço de 2 μρ/ιηΐ de anticorpos de cabra específicos para a porção Fc de IgG de ratinho (GaMIgG- Fc) em PBS durante a noite a 4°C e bloqueadas com leite desnatado a 2% durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas são incubadas com 50 μΐ/poço dos mAb purificados ou sobrenadantes da cultura de hibridomas durante 1 h. Após lavagem, as placas são então incubadas com 50 μΐ/poço de sobrenadante da cultura de células 24.1 contendo rHGF-Flag. Após lavagem, as placas são então incubadas com 50 μΐ/poço de mAb anti-Flag M2-RHP (Invitrogen) na presença de 15 μΐ/ml de IgF murina. O anti-Flag M2-HRP ligado é detectado pela adição do substrato, como descrito acima. As lavagens são realizadas 3 vezes com tampão de lavagem.

Pelo menos três mAb, designados L1H4, L2C7 e L2G7, obtidos de hibridomas gerados por imunização de ratinhos Balb/c com rHGF em sobrenadante de cultura de Hl-Fll concentrado como descrito acima, apresentaram ligação tanto no ELISA de ligação directa de rHGF como no ELISA de captura de HGF-Flag e foram seleccionados para estudo adicional. Estes hibridomas foram então clonados duas vezes, foram criadas ascites em ratinhos por métodos padrão, e os mAb foram purificados usando uma coluna de proteína G/A. Os seus isotipos foram determinados usando um kit de isotipagem (Zymed Lab.). O hibridoma L2G7 foi depositado em 29 de abril de 2003, na American Type Culture Collection, PO. Box. 1549 Manassas, VA 20108, com o número ATCC PTA-5162, ao abrigo do Tratado de Budapeste. Este depósito será mantido num repositório autorizado e substituído no caso de mutação, perda de viabilidade ou destruição durante um período de pelo menos cinco anos após a solicitação mais recente de acesso a uma amostra ter sido recebida no repositório, durante um período de pelo menos trinta anos após a data do depósito, ou durante a vida legal da patente relacionada, o período que for mais longo. Todas as restrições relativas à disponibilidade ao público destas linhas de células serão irrevogavelmente 21 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ levantadas aquando da concessão de uma patente originária do pedido.

Uma vez isolado um único mAb anti-HGF humano arquétipo, por exemplo L2G7, que tenha as propriedades desejadas aqui descritas de neutralização e/ou inibição de HGF in vivo (por exemplo, completamente) do crescimento tumoral in vivo, é directo gerar outros mAb com propriedades similares, por uso de métodos conhecidos dos peritos. Por exemplo, ratinhos podem ser imunizados com HGF como descrito acima, podem ser produzidos hibridomas, e os mAb resultantes podem ser rastreados quanto à capacidade de competir com o mAb arquétipo pela ligação a HGF. Alternativamente, o método de Jespers et al., Biotechnology 12: 899, 1994, que se incorpora aqui por referência, pode ser usado para guiar a selecção dos mAb com o mesmo epitopo e, portanto, propriedades similares ao mAb arquétipo, por exemplo L2G7. Usando exibição em fagos, primeiro a cadeia pesada do anticorpo arquétipo é emparedada com um repertório de cadeias leves (preferivelmente humanas) para seleccionar um mAb que se liga a HGF, e depois a nova cadeia leve é emparedada com um repertório de cadeias pesadas (preferivelmente humanas) para seleccionar um mAb que se liga a HGF (preferivelmente humano) tendo o mesmo epitopo que o mAb arquétipo. 2. Caracterização de mAb anti-HGF in vitro

Os epitopos de ligação dos anticorpos foram parcialmente caracterizados por um ELISA de ligação competitiva em que um excesso de lOOx de mAb não marcado foi usado para competir com a ligação do mesmo ou outro mAb biotinilado no ELISA de ligação de HGF. A figura 4 mostra que a ligação dos mAb anti-HGF, L1H4 e L2G7, foi inibida somente por eles mesmos, sugerindo que eles reconhecem epitopos únicos. A ligação de L2C7 foi inibida por L2G7 mas não por L1H4. Isto sugere que o epitopo de L2C7 se sobrepõe com o de L2G7 mas não com o de L1H4. No entanto, L2C7 não foi capaz de inibir a ligação de L2G7, sugerindo que os epitopos de L2C7 e L2G7 se sobrepõem, mas são distintos, e/ou que a afinidade de L2C7 é muito menor do que a de L2G7. Os epitopos de L1H4, L2C7 e L2G7 são respectivamente designados A, B, e C.

As capacidades de ligação relativas dos três mAb anti-HGF foram medidas usando anticorpos purificados no ELISA de 22 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ ligação directa de HGF, em que rHGF é primeiro ligado à placa. Neste ensaio, L2C7 e L2G7 ligam-se melhor do que L1H4 (figura 5). A capacidade dos mAb se ligarem a rHGF-Flag em solução foi também determinada, usando o ELISA de captura de HGF-Flag. Todos os três mAb foram capazes de capturar rHGF-Flag em fase de solução mas o mAb L2G7 foi mais eficaz do que os outros (figura. 6). Estes resultados sugerem que o mAb L2G7 tem a maior afinidade de ligação para HGF de entre os três mAb.

Uma das actividades biológicas de HGF é a capacidade de se ligar ao seu receptor cMet, pelo que foi testada a capacidade dos mAb anti-HGF inibirem a ligação de HGF a cMET. Para este ensaio, cMet-Fc foi primeiro produzido por transfecção de células fibroblastos humanos 293 com resíduos de codificação de ADNc 1-929 ECD de cMet ligados à porção Fc de IgGl humana (resíduos 216 a 446) como descrito por Mark et al., J. Biol. Chem. 267: 26166, 1992, no vector de expressão pDisplay (Invitrogen). As placas de microtitulação são revestidas com 50 μΐ/poço, de 2 μρ/ιηΐ de anticorpos de cabra específicos para a porção Fc de IgG humana (GaHIgG-Fc) em PBS durante a noite a 4°C e bloqueadas com BSA a 2% durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem das placas, 50 μΐ do sobrenadante de cultura de 293 transfectadas com ADNc de cMet-Fc são adicionados a cada poço durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem das placas, 50 μΐ/poço de sobrenadante de cultura de células 24.1 contendo rHGF-Flag, pré-incubadas com várias concentrações dos mAb, são adicionados a cada poço durante 1 h. Após lavagem, as placas são então incubadas com 50 μΐ/poço de mAb anti-Flag M2-HRP (Invitrogen). O anti-Flag M2-HRP ligado é detectado pela adição do substrato como descrito acima. As lavagens são realizadas 3 vezes com tampão de lavagem.

Neste ensaio de inibição da ligação de HGF-Flag/ cMet-Fc, todos os três mAb demonstraram alguns graus de inibição enquanto um anticorpo de controlo Ig não (figura 7) . O mAb L2G7 a >1 μρ/ιηΐ e o mAb L1H4 a 50 μρ/ιηΐ aboliram completamente a ligação de rHGF-Flag a cMet-Fc; o mAb L2C7 mesmo a 50 μg/ml apenas originou 85% de inibição. Assim, o mAb L2G7 foi muito mais potente na inibição da interacção de rHGF-Flag com cMet-Fc (e portanto, presumivelmente de HGF com seu receptor cMet) 23 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ do que os outros anticorpos, o que é consistente com a sua afinidade putativamente maior para com HGF.

Porque a proteína receptora usada no ELISA de ligação de cMet-Fc/HGF-Flag é uma proteína receptora solúvel, a sua conformação pode ser diferente da do receptor ligado à membrana natural. Além disso, o HGF liga-se a HSPG em adição a cMet e sabe-se que a interacção HSPG-HGF melhora várias actividades do HGF. Assim, os mAb que bloqueiam a interacção de HGF com cMet solúvel podem não ter necessariamente a capacidade de neutralizar as bioactividades de HGF nas células. Assim, é importante ainda confirmar as actividades de bloqueio dos mAb em sistemas biológicos seleccionados. Sabe-se que o HGF tem um potente factor de dispersão. Assim, a actividade neutralizante dos mAb anti-HGF foi também determinada usando o ensaio de dispersão de células de rim canino Madin-Darby (células MDCK obtidas de ATCC) como descrito (Jeffers et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95: 14417, 1998). As células MDCK crescidas em DMEM suplementado com 5% de FCS foram plaqueadas a 103 células/100 μΐ/poço na presença de concentrações predeterminadas de rHGF com ou sem os mAb em DMEM com 5% de FCS. Após 2 dias de incubação a 37°C em 5% de C02, as células foram então lavadas com PBS, fixadas em formaldeído a 2% durante 10 min à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS, as células foram coradas com violeta cristal a 0,5% em etanol a 50% (v/v) durante 10 min à temperatura ambiente. A actividade de dispersão é determinada por exame microscópico. O sobrenadante da cultura do clone Hl-Fll que segrega HGF, descrito acima, foi usado como fonte de HGF no ensaio de dispersão. Tão pouco como uma diluição de 1:80 do sobrenadante de cultura de Hl-Fll induziu a dispersão e o crescimento de células MDCK. No entanto, os ensaios de dispersão foram realizados usando uma diluição 1:20 de sobrenadante de cultura de Hl-Fll (~3 pg/ml) . O mAb L2G7 mesmo numa relação molar de 1:5 de HGF/mAb inibiu a dispersão induzida por HGF de MDCK sozinho (figura 8), demonstrando, de modo conclusivo, que o mAb L2G7 é, de facto, um mAb neutralizante. O mAb L1H4 a >20 μυ/ιηΐ também pode neutralizar a dispersão de MDCK induzida por HGF, enquanto o mAb L2C7 mesmo a 20 μρ/ιηΐ teve somente uma actividade neutralizante parcial (dados não mostrados). 24 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ

As várias características dos três anticorpos anti-HGF determinadas nos ensaios acima são resumidas na tabela 1.

Tabela 1. Caracterização dos mAb para HGF mAb Isotipo Epítopo de ligação Bloqueio da Ligação de HGF/cMet-Fc Bloqueio da Dispersão de MDCK L1H4 Gl, K A Bloqueio fraco + L2C7 G2b, K B Bloqueio parcial + /- L2G7 G2a, κ C Bloqueio forte +++ 0 HGF é um membro da família dos factores de crescimento de ligação a heparina que inclui o factor de crescimento de fibroblastos (FGF) e o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) . Também, o HGF tem -40% de similaridade de sequência global com o plasminogénio (Nakamura et al., Nature, 342: 440, 1989) e compartilha uma estrutura de domínios similar com a proteína estimulante de macrófagos (MSF, Wang et al., Scand. J. Immunol. 56: 545, 2002). Assim, a especificidade de ligação dos anticorpos anti-HGF tem que ser determinada. A ligação dos mAb anti-HGF a estas proteínas relacionadas com HGF (disponíveis de R&D Systems) é testada usando um ELISA de ligação directa similar ao usado para HGF descrito acima. O mAb L2G7, o mAb L2C7 e o mAb L1H4 não se irão ligar de modo significativo a estas proteínas, demonstrando a sua especificidade para HGF.

3. Capacidade dos mAb anti-HGF para inibir as actividades biológicas promotoras de tumor do HGF O HGF apresenta várias actividades biológicas que tornam provável que desempenhe um papel no crescimento e invasividade de determinados tumores humanos. Uma tal actividade do HGF é como um mitogénio poderoso para hepatócitos e outras células epiteliais (Rubin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88: 415, 1991). Assim, para adicionalmente provar a actividade neutralizante dos mAb anti-HGF, são determinados os efeitos 25 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ dos mAb sobre a proliferação induzida por HGF de células epiteliais de macaco 4MBr-5 (ATCC) ou hepatócitos de rato. Os hepatócitos são isolados de acordo com o método descrito por Garrison e Haynes, J. Biol. Chem. 269: 4264, 1985. As células são ressuspensas a 5 x 104 células /ml em DMEM contendo 5% de FCS e estimuladas com uma concentração predeterminada de HGF com várias concentrações dos mAb. Após 2½ dias de incubação a 37°C em 5% de CO2, o nível de proliferação celular é determinado pela adição de 3H-timidina durante 4 h. As células são colhidas usando um colector de células automatizado e o nível de 3H-timidina incorporada é determinado num contador de cintilação. Em concentrações suficientes, o mAb L2G7 pode inibir muito ou completamente a proliferação induzida por HGF das células e os mAb L2C7 e L1H4 podem ser inibir pelo menos parcialmente a proliferação. Estes anticorpos também podem inibir a proliferação induzida por HGF de outras linhas celulares epiteliais.

Por exemplo, foi determinada a actividade inibidora de L2G7 sobre a proliferação induzida por HGF de células Mv 1 Lu de pulmão de marta (Borset et al., J. Immunol. Methods 189: 59, 1996) . As células crescidas em DMEM contendo 10% de FCS são colhidas por tratamento com EDTA/ tripsina. Após lavagem, as células são ressuspensas a 5 x 104 células/ml em DMEM isento de soro com uma concentração predeterminada (50 ng/ml) de HGF +/- várias concentrações dos mAb. Após 1 dia de incubação a 37°C em 5% de CO2, o nível de proliferação celular é determinado pela adição de 1 //Ci de 3H-timidina durante mais 24 h. As células são colhidas em filtros de fibra de vidro usando um colector de células automatizado e o nível de 3H-timidina incorporada é determinado num contador de cintilação. A figura 9 mostra que a adição de uma concentração molar 100 vezes maior de mAb L2G7 inibiu completamente a resposta proliferativa de células Mv 1 Lu. De facto, o L2G7 mesmo numa relação molar de 3 vezes de mAb para HGF mostrou inibição completa, enquanto a IgG de controlo não mostrou inibição mesmo num excesso molar de 100 vezes. O HGF é também relatado como sendo um factor de angiogénese potente (Bussolino et al., J. Cell. Biol. 199; 629, 1992; Cherrington et al., Adv. Câncer Res. 79:1, 2000), a angiogénese, a formação de novos vasos sanguíneos, é essencial, como se acredita, para o crescimento de tumores. 26 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ

Assim, a capacidade dos mAb anti-HGF inibirem as propriedades angiogénicas de HGF é mostrada em três ensaios: (i) proliferação de células endoteliais vasculares humanas (HUVEC), (ii) formação de túbulos de HUVEC, e (iii) desenvolvimento de novos vasos sanguíneos na membrana corioalantóica de embrião de pinto (CAM). Porque se mostrou que o HGF sinergiza com VEGF na angiogénese (Xin et al., Am. J. Pathol. 158: 1111, 2001), estes ensaios podem ser realizados tanto na presença como na ausência de VEGF. O ensaio de proliferação de HUVEC é realizado como descrito com uma modificação (Conn et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 1323, 1990) . As células HUVEC obtidas de

Clonetics são crescidas em meio de crescimento endotelial (EBM-2), contendo 10% de FCS mais suplementos de crescimento de células endoteliais proporcionados por Clonetics. Preferivelmente, utilizam-se células das passagens 4 a 7 neste estudo. As células são ressuspensas a 105 células/ml em meio 199 contendo antibióticos, HEPES 10 mM e 10% de FCS (meio de ensaio). As células HUVEC (50 μΐ/poço) são adicionadas aos cavidades de microtitulação contendo uma concentração apropriada de HGF com várias concentrações dos mAb anti-HGF durante lha 37°C. Após as células serem incubadas durante 72 h a 37°C em 5% de C02, o nível de proliferação celular é determinado por incorporação de 3H- timidina durante 4 h. Em concentrações suficientes, o mAb L2G7 irá inibir muito ou completamente a proliferação induzida por HGF das HUVEC, e os mAb L2C7 e L1H4 podem pelo menos parcialmente inibir a proliferação.

Alternativamente, o nível de proliferação celular pode ser determinado pelo ensaio MTT colorimétrico bem conhecido. As HUVEC (104 células/100 μΐ/poço) são crescidas em meio isento de soro durante 24 h, e depois incubadas com 100 μΐ de HGF a 50 ng/ml (predeterminada como sendo uma quantidade subóptima) com várias concentrações de mAb L2G7 durante 72 h. A solução de MTT (5 mg/ml) é adicionada a cada poço (200 μ1/200 μΐ de meio) durante 4 h. Então, 100 μΐ de meio/poço são removidos e misturados com 100 μΐ/poço de álcool isopropílico acidificado (HC1 0,04N em isopropilo). As placas são lidas num leitor de ELISA a 560 nm. A resposta máxima em % é calculada como se segue: [DO de células tratadas com HGF + 27 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ mAb - DO de células não tratadas] / [DO de células tratadas com HGF - DO de células não tratadas] x 100. A figura 10 mostra que mesmo um excesso molar de 2 vezes de mAb L2G7 bloqueia largamente a proliferação de HUVEC em resposta a HGF. O ensaio de túbulos endoteliais é realizado essencialmente como descrito (Matsumura et al., J. Immunol. 158: 3408, 2001, Xin et al., Am. J. Pathol. 158: 1111, 2001). HUVEC (Clonetics) de passagem 4-7 são crescidas em meio EGTM da Clonetics suplementado com 10% de FBS e suplementos de crescimento de células endoteliais. As placas são revestidas com Matrigel (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante a 37°C durante 30 min, e as células são semeadas a 3 x 106 células/ml em lx meio basal com HGF e várias concentrações dos mAb anti-HGF. A formação de túbulos é avaliada ao microscópio em ampliação de baixa potência (lOx). Em concentrações suficientes, o mAb L2G7 irá inibir muito ou completamente a formação de túbulos endoteliais induzida por HGF, e os mAb L2C7 e L1H4 podem pelo menos parcialmente inibir a mesma. O ensaio de membrana corioalantóica de embrião de pinto (CAM) é realizado essencialmente como descrito (Kim et al., Nature, 362: 841, 1992). Embriões de pinto de três dias de idade são removidos das suas cascas e cultivados em placas de Petri em 5% de CO2 a 37°C. Sete dias depois, discos de metilcelulose secos contendo HGF com várias concentrações dos mAb anti-HGF são colocados em camada sobre a CAM. Os discos de metilcelulose são preparados por mistura de 5 μΐ de metilcelulose a 1,5% em PBS com 5 μΐ de HGF pré-incubado com os mAb. Três dias depois, o desenvolvimento de vasos sanguíneos em torno dos discos de metilcelulose é examinado. Em concentrações suficientes, o mAb L2G7 irá inibir muito ou completamente esta formação de vasos sanguíneos, e os mAb L2C7 e L1H4 podem pelo menos inibir parcialmente a mesma.

Está também relatado que o HGF promove o crescimento tumoral (Cromoglio e Trusolino, J. Clin. Invest. 109: 857, 2002). A capacidade dos anticorpos anti-HGF inibirem esta actividade é mostrada em duas etapas. Primeiro, um número de linhas celulares tumorais é examinado quanto á sua capacidade de segregar HGF e proliferar em resposta a HGF porque o HGF pode ser um factor de crescimento autócrino para algumas 28 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ destas células. Estas linhas celulares incluem um painel de linhas celulares tumorais humanas que se sabe que expressam HGF e cMet (Koochekpour et al., Câncer Res. 57: 5391, 1997;

Wang et al., J. Cell Biol. 153: 1023, 2001). As linhas celulares especificas a testar incluem células de glioma U-118, carcinoma do cólon HCT116, carcinoma do pulmão A549 e carcinoma epidermóide A431, todas disponíveis na ATCC. Uma vez identificadas estas linhas celulares tumorais, o efeito dos mAb anti-HGF sobre a resposta proliferativa a HGF destas células é determinado, usando métodos similares aos descritos acima. Em concentrações suficientes, o mAb L2G7 irá inibir muito ou completamente a proliferação induzida por HGF de muitas ou todas estas linhas celulares, e os mAb L2C7 e L1H4 podem pelo menos parcialmente inibir a proliferação.

Por exemplo, as células tumorais HCT116 humanas são semeadas em placas de microtitulação de 96 cavidades a 5 x 103 células/poço em 200 μΐ de DMEM mais 5% de FCS. Após 24 h de incubação a 37°C em 5% de C02, as células são lavadas com PBS e incubadas em DMEM isento de soro durante 48 h. As células são então incubadas com 100 ng/ml de HGF + /- 20 μρ/ιηΐ dos mAb em DMEM durante mais 20 h. Como controlos, são incluídas células crescidas em DMEM sozinho ou DMEM mais 10% de FCS. No final da incubação, os níveis de proliferação celular são determinados por incorporação de 3H-timidina durante 4 h. O resultado de tal experiência realizada em triplicado é mostrado na figura 11. O HGF induziu uma proliferação moderada das células HCT116, que foi completamente abolida por adição de anticorpo L2G7 (mas não pelo anticorpo L1H4, menos potente).

Em todos os ensaios descritos acima, cada anticorpo anti-HGF irá neutralizar ou inibir a actividade quando usado sozinho sem outros antagonistas de HGF, isto é, como agente único, mas efeitos aditivos ou sinérgicos podem ser obtidos por administração do anticorpo em conjunto com outros anticorpos anti-HGF ou outros agentes activos. 4. Capacidade dos mAb anti-HGF inibirem o crescimento tumoral in vivo A capacidade dos anticorpos anti-HGF inibirem o crescimento de tumores humano é demonstrada em modelos de 29 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ xenoenxertos em ratinhos imunodeficientes ou outros roedores, como o rato. São exemplos ilustrativos, mas não limitativos, de estirpes imunodeficientes de ratinhos que podem ser usados, os ratinhos nus como CD-I nu, Nu/Nu, Balb/c nu, NIH-III (NIH-bg-nu-xid BR) ; ratinhos scid como SCID Fox Chase (C.B-17 SCID), SCID Fox Chase exogâmicos e SCID Beige; ratinhos deficientes na enzima RAG; assim como ratos nus. AS experiências são realizadas como descrito previamente (Kim et al., Nature 362: 841, 1992, que se incorpora aqui por referência). As células tumorais humanas crescidas em meio DMEM completo são colhidas em HBSS. Os ratinhos fêmea imunodeficientes, por exemplo atímicos nus (4-6 semanas de idade) são injectados s.c. tipicamente com 5 x 106 células em 0,2 ml de HBSS nas áreas dorsais. Quando o tamanho do tumor alcança 50-100 mm3, os ratinhos são agrupados aleatoriamente e quantidades apropriadas dos mAb anti-HGF e de controlo (tipicamente entre 0,1 e 1,0 mg, por exemplo 0,5 mg) são administrados i.p. uma vez, duas ou três vezes por semana num volume de, por exemplo, 0,1 ml, durante por exemplo 1, 2, 3 ou 4 semanas ou a duração da experiência. Os tamanhos do tumor são determinados tipicamente duas vezes por semana por medição em duas dimensões [comprimento (a) e largura (b)]. O volume do tumor é calculado de acordo com V = ab2/2 e expresso como o volume de tumor médio + SEM. O número de ratinhos em cada grupo de tratamento é de pelo menos 3, mas com maior frequência entre 5 e 10, por exemplo 7. A análise estatística pode ser realizada usando, por exemplo, o teste t de Student. Numa variação desta experiência, a administração do anticorpo começa simultaneamente ou logo após a injecção das células tumorais. O efeito do anticorpo pode ser também medido pelo prolongamento da sobrevivência dos ratinhos, ou aumento na percentagem dos ratinhos sobreviventes. Várias linhas celulares tumorais que se sabe que segregam ou respondem a HGF são usadas em experiências separadas, por exemplo células de glioblastoma humano U118, e/ou células tumorais do cólon humano HCT116. Os anticorpos preferidos da invenção, como anticorpos semelhantes a humanos ou de imunogenicidade reduzida e o anticorpo L2G7 e suas formas quiméricas e humanizadas e anticorpos com o mesmo epítopo que L2G7, quando usados como um agente único, irão inibir o crescimento de tumores em pelo menos 25%, mas possivelmente 40% ou 50%, e tanto quanto 75% ou 90% ou mais, ou mesmo inibir 30 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ completamente ο crescimento tumoral após algum período de tempo ou causar a regressão ou desaparecimento do tumor. Esta inibição irá ocorrer para pelo menos uma linha celular tumoral como U118 em pelo menos uma estirpe de ratinho, como NIH III Beige/Nude, mas preferivelmente irá ocorrer para 2, 3, várias, muitas ou mesmo essencialmente todas as linhas celulares tumorais que expressam HGF de um tipo particular (por exemplo glioma) ou qualquer tipo, quando testadas numa ou mais estirpes de ratinhos imunodeficientes que não geram uma resposta de anticorpos neutralizantes contra o anticorpo injectado. O tratamento com alguns anticorpos preferidos num ou mais dos modelos de xenoenxerto leva à sobrevivência indefinida de 50%, 75%, 90% ou mesmo essencialmente todos os ratinhos, que iriam de outra forma morrer ou precisar de ser sacrificados devido ao crescimento do seu tumor.

Por exemplo, esta experiência foi realizada com células de glioblastoma U-118, crescidas em meio DMEM com FCS e colhidas em HBSS. Ratinhos fêmea NIH III Beige/Nude (4-6 semanas de idade) são injectados s.c. com 106 células em 0,2 ml de HBSS nas áreas dorsais. Quando o tamanho do tumor alcança ~50 mm3, os ratinhos são agrupados aleatoriamente em 2 grupos de 6 ratinhos cada, e 200 μg de mAb L2G7 (grupo de tratamento) ou de PBS (grupo de controlo) são dados i.p. duas vezes por semana num volume de 0,1 ml. Os tamanhos dos tumores são determinados duas vezes por semana como descrito acima. No final da experiência, os tumores são excisados e pesados. A figura 12 mostra que o tratamento com L2G7 inibiu completamente o crescimento tumoral.

Experiências de inibição tumoral similares são realizadas com o anticorpo anti-HGF administrado em combinação com um ou mais agentes quimioterapêuticos como 5-FU (5-fluorouracilo) ou CPT-11 (Camptosar) ao qual se espera que o tipo de tumor responda, como descrito por Ashkenize et al., J. Clin. Invest. 104: 155, 1999. A combinação do anticorpo com o fármaco quimioterapêutico pode produzir uma maior inibição do crescimento tumoral do que cada um dos agentes sozinho. 0 efeito pode ser aditivo ou sinérgico, e inibir fortemente o crescimento, por exemplo em 80% ou 90% ou mais, ou mesmo causar a regressão ou desaparecimento do tumor. O anticorpo anti-HGF também pode ser administrado em combinação com um anticorpo contra outro factor angiogénico ou de crescimento, 31 ΕΡ 1 734 995/ΡΤ içao de crescimento desaparecimento do por exemplo anti-VEGF, e espera-se a inib sinérgica ou aditiva e/ou regressão ou tumor.

Lisboa, 2010-08-11

Claims (11)

1. ΕΡ 1 734 995/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal (mAb) quimérico ou humanizado que compete com o anticorpo L2G7 produzido pelo hibridoma ATCC N.°: PTA-5162 pela ligação ao Factor de Crescimento de Hepatócitos (HGF), e que neutraliza o HGF e inibe o crescimento de um xenoenxerto tumoral humano num ratinho como único agente.
2. 2. mAb da reivindicação 1 que é um fragmento Fab ou F(ab')2 ou um anticorpo de cadeia única.
3. 3. mAb de qualquer reivindicação anterior que inibe a ligação de HGF a cMet em pelo menos 50%.
4. 4. mAb de qualquer reivindicação anterior que inibe o crescimento de um xenoenxerto tumoral de glioblastoma humano U118 num ratinho.
5. 5. mAb de qualquer reivindicação anterior que inibe a angiogénese induzida por HGF.
6. 6. mAb de qualquer reivindicação anterior que se liga especificamente a HGF com uma afinidade de ligação de pelo menos ΙΟ8 M_1.
7. 7. mAb da reivindicação 1 que é um mAb L2G7 quimérico ou humanizado.
8. 8. Linha celular que produz um mAb de qualquer reivindicação anterior.
9. 9. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal (mAb) numa concentração de 1-100 mg/ml num transportador fisiologicamente aceitável, em que o mAb compete com o anticorpo produzido pelo hibridoma ATCC N.°: PTA-5162 pela ligação ao Factor de Crescimento de Hepatócitos (HGF), e que neutraliza o HGF e inibe o crescimento de um xenoenxerto tumoral de glioblastoma humano U118 num ratinho como único agente. ΕΡ 1 734 995/ΡΤ 2/2
10. 10. Composição farmacêutica da reivindicação 9 em que o mAb é um mAb de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8.
11. 11. Anticorpo monoclonal (mAb) que compete com o anticorpo produzido pelo hibridoma ATCC N.°: PTA-5162 pela ligação ao Factor de Crescimento de Hepatócitos (HGF), e que neutraliza o HGF e inibe o crescimento de um xenoenxerto tumoral de glioblastoma humano U118 num ratinho como único agente, para utilização no tratamento do cancro num paciente numa dose de 0,1 a 5 mg/kg ou até 10, 15 ou 20 mg/kg. Lisboa, 2010-08-11