KR20110117728A - Ｈｇｆ 베타 쇄와 ｃ-ｍｅｔ 사이의 상호작용의 변조 - Google Patents

Ｈｇｆ 베타 쇄와 ｃ-ｍｅｔ 사이의 상호작용의 변조 Download PDF

Info

Publication number
KR20110117728A
KR20110117728A KR1020117022830A KR20117022830A KR20110117728A KR 20110117728 A KR20110117728 A KR 20110117728A KR 1020117022830 A KR1020117022830 A KR 1020117022830A KR 20117022830 A KR20117022830 A KR 20117022830A KR 20110117728 A KR20110117728 A KR 20110117728A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hgf
chain
met
molecule
binding
Prior art date
Application number
KR1020117022830A
Other languages
English (en)
Inventor
다니엘 케이. 키르크호퍼
로버트 에이. 라자루스
지아오이 야오
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33555430&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20110117728(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20110117728A publication Critical patent/KR20110117728A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 특히 c-met에 대한 HGF β쇄의 결합을 조절함으로써, HGF/c-met 신호전달 경로를 변조하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

ＨＧＦ 베타 쇄와 Ｃ-ＭＥＴ 사이의 상호작용의 변조{MODULATING THE INTERACTION BETWEEN HGF BETA CHAIN AND C-MET}
관련 출원
본 출원은 2003년 6월 6일 출원된 가출원 제60/476,778호 및 2003년 12월 23일 출원된 가출원 제60/532,117호에 대해 35 USC 119(e) 하에서의 우선권을 주장하면서, 37 CFR 1.53(b)(1) 하에 출원된 본출원이다.
본 발명은 일반적으로 분자생물학 및 성장 인자 조절에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 HGF/c-met 신호전달 경로의 변조제, 및 상기 변조제의 용도에 관한 것이다.
분산 인자(scatter factor(SF))로도 알려져 있는, 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)(HGF)는 c-met 원형암유전자(protooncogene)(Cooper 등, 1984a & b)에 의해 코딩되는 수용체 티로신 키나제, Met(Bottaro 등, 1991)에 대한 리간드이다. Met에 대한 HGF 결합은 다양한 세포 타입에서 세포 성장, 분화 및 이동에 이르게 하는 복잡한 세트의 세포내 경로의 활성화를 가져오는 세포내 키나제 영역의 인산화를 유도한다; 몇몇 최근 간행된 검토는 포괄적 개요를 제공한다(Birchmeier 등, 2003; Trusolino 및 Comoglio, 2002; Maulik 등, 2002). 배아 발생 및 조직 재생에서 그의 기본적 중요성에 더하여, HGF/Met 신호전달 경로는 또한 침투성 종양 성장에 연루되어 있으며 그 자체로 흥미로운 치료 표적이 된다(Birchmeier 등, 2003; Trusolino 및 Comoglio, 2002; Danilkovitch-Miagkova 및 Zbar, 2002; Ma 등, 2003).
HGF는 플라스미노젠-관련 성장 인자 훼밀리에 속하고 N-말단 핑거 영역(N) 및 네 크링글(Kringle)(K1-K4) 영역을 함유하는 69 kDa α-쇄와, Clan PA(S)/훼밀리 S1으로부터의 키모트립신-양 세린 프로테아제의 프로테아제 영역과 강한 유사성을 갖는 34 kDa β-쇄를 포함한다(Nakamura 등, 1989; Donate 등, 1994; Rawlings 등, 2002). 플라스미노젠 및 기타 세린 프로테아제 자이모젠(zymogen)과 같이, HGF는 단일 쇄 전구체 형태(scHGF)로 분비된다. scHGF는 세포 표면 상에서 또는 세포외 매트릭스에서 신데칸-1(Derksen 등, 2002)과 같은, 황산헤파란 프로테오글리칸에 결합한다. 황산헤파란 프로테오글리칸은 또한 K1(Lokker 등, 1994)에 위치한 아미노산과 함께 고 친화도 Met 결합에 기여하는 N 영역(Hartmann 등, 1998)에 결합한다. 비록 scHGF가 높은 친화도로 Met에 결합할 수 있을지라도, 그것은 수용체를 활성화할 수 없다(Lokker 등, 1992; Hartmann 등, 1992). HGF 신호전달 활성의 획득은 이황화물-연결된 α/β 헤테로다이머인, 성숙 HGF의 형성을 가져오는 Arg494-Val495에서의 scHGF의 단백분해적 절단(활성화)에 의존한다(Lokker 등, 1992; Hartmann 등, 1992; Naldini 등, 1992).
HGF(HGF β-쇄)의 프로테아제-양 영역은 그것이 Gln534[c57] 및 Tyr673[c195]을 갖는, 모든 세린 프로테아제(Perona 및 Craik, 1995; Hedstrom, 2002)에서 발견되는 요구되는 Asp[c102]-His[c57]-Ser[c195](전체적으로 []에서 표준 키모트립시노겐 넘버링) 촉매 삼가물(triad)을 결여하므로 촉매 활성을 갖지 않는다.
HGF 활성을 조절함에 있어서 그의 중요성 때문에, 이 과정은 HGF 전환 효소 및 그들의 상응하는 생리적 저해제에 의해 엄격하게 제어되어야만 한다. scHGF 활성화는 시험관 내에서 간세포 성장 인자 활성화제(HGFA)(Miyazawa 등, 1993), 매트립타제/MT-SP1(Takeuchi 등 1999; Lin 등, 1999), 유로키나제-타입 플라스미노젠 활성화제(Naldini 등, 1992), 인자 ⅩⅡa(Shimomura 등, 1995), 인자 ⅩΙa(Peek 등, 2002) 및 플라스마 칼리크레인(Peek 등, 2002)을 포함하는 키모트립신-양 세린 프로테아제에 의해 매개된다. scHGF와 유사하게, 이들 프로테아제는 불활성 전구체로서 생산된다; 그들의 효소 활성은 또한 다른 활성화 프로테아제와 쿠니츠- 및 세르핀-타입 저해제 양자에 의해 엄격하게 조절된다.
세린 프로테아제와 그들의 활성화 과정이 기재되어 있다(Donate 등, 1994). 세린 프로테아제에서, 자이모젠의 활성화 절단은 적절하게 형성된 활성 위치와 기질/저해제 상호작용 부위를 생성시키는 소위 '활성화 영역'의 형태적 재배열을 수행한다. 활성화 영역은 [c140]-, [c180]- 및 [c220]-루프로 명명된 표면-노출된 루프와 소수성 포켓으로의 새로 형성된 N-말단의 삽입으로 이루어진다(Huber 및 Bode, 1978). 동족 리간드/수용체 쌍 매크로파지 자극 단백질(MSP)/Ron에서, 세린 프로테아제-양 MSP β-쇄는 수용체 결합을 위해 주 에너지를 제공한다(Wang 등, 1997; Miller 및 Leonard, 1998). 이것은 Met에 대한 고 친화도 수용체 결합 위치가 HGF α-쇄에 존재하는 HGF/Met 시스템과 반대이다(Lokker 등, 1994; Okigaki 등, 1992).
특허출원 및 간행물을 포함하는, 여기에 인용된 모든 참조문헌은 그들 전체로 참조에 의해 도입된다.
발명의 개시
플라스미노젠-관련 성장 인자, 간세포 성장 인자(HGF)는 발생, 조직 재생 및 침투성 종양 성장에 관여하는, 그의 수용체 티로신 키나제 Met(여기에서 c-Met 또는 c-met로도 언급되는)에 결합한다. 여기에 기재된, HGF 프로테아제-양 β쇄의 성공적인 발현과 정제는 c-Met 활성화 기작의 보다 명확한 이해에 이르게 하는, cMet와 HGF, 구체적으로 HGF β-쇄의 상호작용의 성질을 명확히 결정할 수 있게 하였다. 여기에서는 세린 프로테아제-양 HGF β-쇄 자체가 Met에 결합하는 것이 실험적으로 증명된다. 이에 비해, HGF β의 자이모젠-양 형태는 훨씬 더 약한 Met 결합을 가져, 최적의 상호작용이 가공 시의 형태적 변화로부터 초래됨을 암시한다. 세포 이동, Met 인산화, HGF-의존적 세포 증식 및 Met 결합 어세이에서 시험된 β-쇄 돌연변이체의 패널은 전장 HGF 돌연변이체의 감소된 생물학적 활성이 적어도 부분적으로 Met에 대한 HGF β-쇄의 감소된 결합에 기인함을 보여주었다. 기능적 결합 위치는 세린 프로테아제의 기질-가공 위치와 유사한, '활성화 영역'과 '활성 위치 부위'를 포함한다. 데이터는 활성화된(자이모젠-양 형태가 아닌) β쇄가 최대/최적 c-met 활성화를 수행하기 위하여 다른 HGF β쇄와 같은 다른 분자와의 최적의 상호작용을 위해 요구되는 경계면을 포함할 수 있음을 나타낸다. 여기에 기재된 돌연변이 분석은 효능 스펙트럼에 걸쳐 야생형 HGF/c-met 상호작용을 저해할 수 있는 HGF 돌연변이체 설계를 위한 기초를 제공한다. 그러한 돌연변이체의 예는 여기에 기재되어 있다. 이들 돌연변이체는 c-met에 대한 결합에 대해 야생형 HGF와 경쟁할 수 있으나, c-met 관련된 생물학적 기능을 수행하는 감소된 능력을 나타낸다. 이것은 HGF/c-met 축의 완전한 또는 실질적인 저해가 바람직하지 않은 경우 특히 장점을 갖는다; HGF 및 c-met는 정상 세포와 조직에서 도처에 발현되므로 이것은 특히 중요하다. 이들 돌연변이체는 또한 완전한 부재는 아니지만, 감소된 HGF/c-met 생물학적 활성이 바람직한 병리적 상태를 치료하기 위한 우수한 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 일반적으로 아래 더 상세히 기재되는 이들 발견에 기초한다. HGF β쇄와 c-met와 그의 상호작용은 HGF/c-met 경로의 비정상적 또는 원치않는 신호전달과 관련된 병리적 상태에 대하여 예방적 및/또는 치료적 접근법을 설계함에 있어서 더 큰 미세-조절을 위해 독특하고 우수한 표적이 될 수 있다. 따라서, 본 발명은 c-met에 대한 HGF β쇄 결합의 변조를 통해 HGF/c-met 경로를 변조할 수 있는 물질의 동정 및 사용, 및 HGF/c-met 신호전달과 관련된 생물학적/생리학적 활성의 변조를 위한 방법, 조성물, 키트 및 제조물품을 제공한다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 (a) (ⅰ) 활성화된 HGF β쇄(아래에서 더욱 상세히 기재되는)에 대한 후보 물질의 결합을, (ⅱ) 참조 HGF β쇄에 대한 후보 물질의 결합과 비교하는 것을 포함하고, 상기 참조 β쇄가 c-met에 대해 특이적 및/또는 실질적 결합을 할 수 없고; 이로써 참조 HGF β쇄에 대해서 보다 활성화된 HGF β쇄에 대해 더 큰 결합 친화도를 나타내는 후보 물질이 활성화된 HGF β쇄에 선택적으로 결합하는 물질로 선별(또는 동정)되는, 활성화된 간세포 성장 인자 β쇄와 선택적으로 결합하는 물질을 스크리닝(또는 동정)하는 방법을 제공한다. 일부 태양에서, 참조 β쇄는 단일 쇄 HGF 폴리펩티드 내에 함유된다. 일부 태양에서, 참조 β쇄는 C-말단 부위의 위치 494(야생형 인간 HGF에 상응하는)가 아르기닌 이외의 아미노산(예를 들어, 글루탐산)인, HGF α쇄의 C-말단 부위의 일부에 그의 N-말단에서 융합된다. 일부 태양에서, HGF α쇄의 C-말단 부위의 일부는 인간 HGF의 잔기 479 내지 494로부터의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다.
다른 측면에서, 본 발명은 c-met에 결합(반드시는 아니지만, 바람직하게, 특이적으로)하고 c-met에 대한 HGF β쇄의 특이적 결합을 차단하는 물질을 스크리닝하는 것을 포함하는, c-met 활성화를 차단하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 일부 태양에서, 물질은 c-met에 대한 결합을 위해 HGF β쇄와 경쟁한다. 일 태양에서, 물질은 야생형 HGF(예를 들어, 인간) β쇄, 예를 들어, 아미노산 잔기 495(Val) 내지 728(Ser)을 포함하는 인간 β쇄(예를 들어, 여기에 기재된 야생형 HGF β쇄)에 대해 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 물질이 그러한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성되는 일부 태양에서, 위치 604 및/또는 561은 시스테인 이외의 아미노산이다. 이들 태양의 일부에서, 물질은 실질적으로 HGF α쇄 또는 그의 일부와 결합(공유 또는 비-공유)을 형성할 수 없다.
본 발명의 스크리닝(동정) 방법의 일부 태양에서, 방법은 자연 발생 형태 또는 변이체 형태의 HGF β쇄의 부분 또는 전체를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성되는 표적 항원에 대한 후보 물질의 결합 친화도를 결정하는 것을 포함한다. 그러한 표적 항원은 적어도 하나의 돌연변이(특히 상기 적어도 하나의 돌연변이가 c-Met에 결합하는 HGF β쇄의 능력을 변화시키는)를 포함하는 HGF β쇄 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성되는 어느 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 폴리펩티드는 이종 폴리펩티드 서열(HGF α쇄의 부분 또는 전부와 같은)에 융합된 HGF β쇄 아미노산 서열(야생형 또는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는)을 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 그러한 HGF β쇄의 예는 여기에 기재된 것들, 예를 들어, 자이모젠-양 HGF β쇄(예를 들어, 위치 494에서의 돌연변이), HGF β쇄(Cys604Ser), 및 "활성 위치 부위" 돌연변이를 포함한다. 본 발명은 위치 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 및/또는 702와 같은, β쇄의 하나 이상의 위치에서 돌연변이(활성 위치 부위의 돌연변이 포함)를 갖는 HGF 돌연변이체를 제공한다. 제공되는 다른 돌연변이체는 그들이 시험관 내에서 또는 생체 내에서 활성화(예를 들어, 절단)될 수 있게 하는 HGF 내의 위치에서 돌연변이를 갖는 것들을 포함한다; 하나의 그러한 돌연변이체의 예는 위치 424 및/또는 494에서의 돌연변이를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 HGF β쇄의 잔기 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 및/또는 702의 적어도 하나, 두 개, 세 개, 네 개, 또는 어느 개 내지 모두에 결합하는 물질을 선별하는 것을 포함하는, HGF의 그의 수용체에 대한 결합(예를 들어, HGF의 제1 수용체 분자에 대한 결합, 및/또는 수용체 다이머화를 위한 HGF의, 예를 들어, 하나 또는 양 α 및 β쇄를 통한, 제2 수용체 분자에 대한 결합)을 차단하는 HGF 수용체 길항제의 스크리닝 방법을 제공한다. 두 개 이상의 잔기의 조합은 HGF β쇄의 잔기 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 및/또는 702 중 어느 것을 포함한다. 일 태양에서, 물질은 (ⅰ) 잔기 673 및 695의 적어도 하나, 또는 양자, 및 (ⅱ) 잔기 692에 결합한다. 다른 태양에서, 물질은 (ⅰ) 잔기 673 및 695의 적어도 하나, 또는 양자, 및 (ⅱ) 잔기 692, 및 (ⅲ) 잔기 534 및 578의 적어도 하나, 또는 양자에 결합한다. 다른 태양에서, 물질은 (ⅰ) 잔기 673 및 695의 적어도 하나, 또는 양자, 및 (ⅱ) 잔기 534, 578 및 692의 적어도 하나, 두 개 또는 모두에 결합한다. 다른 태양에서, 물질은 (ⅰ) 잔기 673, 695 및 696의 적어도 하나, 양자 또는 모두, 및 (ⅱ) 잔기 534, 578, 692 및 694의 적어도 하나, 양자 또는 어느 개 내지 모두에 결합한다. 일 태양에서, 물질은 위치 534, 673 및/또는 692에서 돌연변이가 있으면, β쇄는 또한 위치 578, 694, 695 및 696의 적어도 하나, 양자 또는 어느 개 내지 모두에서 돌연변이를 포함하는 HGF β쇄에 결합한다. 이들 분자의 일부 태양에서, 활성화된 β쇄는 단일 쇄 HGF의 절단에 의해 수득된 β쇄의 형태를 갖고; 이들 태양의 일부에서, 절단은 단일 쇄 HGF의 잔기 494 및 495에 있거나 그에 인접하고, 예를 들어, 절단은 단일 쇄 HGF의 잔기 494와 495 사이에서 발생할 수 있다. 일 태양에서, 물질은 잔기 673, 693, 694, 695 및 696 중 적어도 하나에 결합한다. 일 태양에서, 물질은 잔기 692 및 702 중 적어도 하나에 결합한다. 일 태양에서, 물질은 잔기 534 및 578 중 적어도 하나에 결합한다. 일 태양에서, 물질은 잔기 513, 516, 619 및 699 중 적어도 하나에 결합한다. 일 태양에서, 물질은 잔기 673, 693, 694, 695 및 696으로 구성된 제1 그룹, 잔기 692 및 702로 구성된 제2 그룹, 잔기 534 및 578로 구성된 제3 그룹 및 잔기 513, 516, 619 및 699로 구성된 제4 그룹으로부터 선택되는 두 개 이상의 잔기에 결합한다. 상기 두 개 이상의 잔기는 동일한 그룹 또는 네 그룹 중 어느 것의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 태양에서, 물질은 추가로 잔기 423, 424, 494 및/또는 495에 결합한다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 상기한 것들에 일치하는 스크리닝 어세이는 또한 제1 세트의 후보 변조 물질을 얻기 위한 기능적 리드아웃(readout)에 기초한 스크리닝의 제1 단계에 이어서, c-met에 대한 HGF β의 결합을 변조하는 제1 세트의 후보 변조 물질의 능력에 기초한 스크리닝의 제2 단계를 포함할 수 있다. 기능적 리드아웃은 HGF/c-met 신호전달 경로와 관련된 생물학적 활성의 지식에 기초한, 당업자에게 명백한 어느 것일 수 있다. 이들 생물학적 활성은 C-met 인산화, C-met 키나제의 기질인 세포성 분자의 인산화, 세포 성장(증식, 생존 등), 혈관신생, 세포 이동, 세포 형태발생 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일 측면에서, 본 발명은 HGF/c-met 신호전달 경로를 파괴하는 HGF/c-met 길항제를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 활성화된 간세포 성장 인자 β쇄에 결합하고 c-met에 대한 활성화된 HGF β쇄의 특이적 결합을 저해하는 분자를 제공한다. 일 태양에서, β쇄의 활성화된 형태에 대한 분자의 결합 친화도는 자이모젠 형태의 β쇄에 대한 분자의 결합 친화도 보다 더 크다. 일부 태양에서, 분자는 β쇄의 활성 위치/영역에 결합한다. 일부 태양에서, 상기 활성 위치는 β쇄의 잔기 534, 578, 673, 692, 694, 695 및/또는 696의 적어도 하나, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개 또는 모두를 포함한다. 두 개 이상의 잔기의 조합은 HGF β쇄의 잔기 534, 578, 673, 692, 694, 695 및/또는 696 중 어느 것을 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 분자는 HGF β쇄의 잔기 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 및/또는 702의 적어도 하나, 두 개, 세 개, 네 개 또는 어느 개 내지 모두에 결합한다. 두 개 이상의 잔기의 조합은 HGF β쇄의 잔기 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 및/또는 702 중 어느 것을 포함할 수 있다. 일 태양에서, 물질은 잔기 673 및 695 중 적어도 하나 또는 양자에 결합한다. 다른 태양에서, 물질은 (ⅰ) 잔기 673 및 695의 적어도 하나, 또는 양자, 및 (ⅱ) 잔기 692에 결합한다. 다른 태양에서, 물질은 (ⅰ) 잔기 673 및 695의 적어도 하나, 또는 양자, 및 (ⅱ) 잔기 692, 및 (ⅲ) 잔기 534 및 578의 적어도 하나, 또는 양자에 결합한다. 다른 태양에서, 물질은 (ⅰ) 잔기 673 및 695의 적어도 하나, 또는 양자, 및 (ⅱ) 잔기 534, 578 및 692의 적어도 하나, 두 개 또는 모두에 결합한다. 다른 태양에서, 물질은 (ⅰ) 잔기 673, 695 및 696의 적어도 하나, 양자 또는 모두, 및 (ⅱ) 잔기 534, 578, 692 및 694의 적어도 하나, 양자 또는 어느 개 내지 모두에 결합한다. 일 태양에서, 물질은 위치 534, 673 및/또는 692에서 돌연변이가 있으면, β쇄는 또한 위치 578, 694, 695 및 696의 적어도 하나, 양자 또는 어느 개 내지 모두에서 돌연변이를 포함하는 HGF β쇄에 결합한다. 일 태양에서, 물질은 잔기 673, 693, 694, 695 및 696 중 적어도 하나에 결합한다. 일 태양에서, 물질은 잔기 692 및 702 중 적어도 하나에 결합한다. 일 태양에서, 물질은 잔기 534 및 578 중 적어도 하나에 결합한다. 일 태양에서, 물질은 잔기 513, 516, 619 및 699 중 적어도 하나에 결합한다. 일 태양에서, 일 태양에서, 물질은 잔기 673, 693, 694, 695 및 696으로 구성된 제1 그룹, 잔기 692 및 702로 구성된 제2 그룹, 잔기 534 및 578로 구성된 제3 그룹 및 잔기 513, 516, 619 및 699로 구성된 제4 그룹으로부터 선택되는 두 개 이상의 잔기에 결합한다. 상기 두 개 이상의 잔기는 동일 그룹 또는 네 그룹 중 어느 것의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 태양에서, 물질은 추가로 잔기 423, 424, 494 및/또는 495에 결합한다. 이들 분자의 일부 태양에서, 활성화된 β쇄는 단일 쇄 HGF의 절단에 의해 수득된 β쇄의 형태를 갖고; 이들 태양의 일부에서, 절단은 단일 쇄 HGF의 잔기 494 및 495에 있거나 그에 인접하고, 예를 들어, 절단은 단일 쇄 HGF의 잔기 494와 495 사이에서 발생할 수 있다.
일부 태양에서, 물질 또는 분자는 소 분자, 펩티드, 항체, 항체 단편, 앱타머, 또는 그들의 배합물이거나 이를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 HGF/c-met 변조 활성을 갖는 HGF 돌연변이체, 예를 들어, HGF/c-met 활성의 길항제 또는 HGF 생물학적 활성(예를 들어, 세포 성장 자극 활성)의 부재는 아니지만, 감소를 나타내는 HGF 변이체를 제공한다. 일 태양에서, 본 발명의 길항제는 야생형(생체 내) HGF의 생물학적 활성(그러한 생물학적 활성은 세포 증식의 자극, 세포 생존의 증진, 혈관신생의 촉진, 세포 이동의 유도/촉진을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다)을 저해할 수 있다. 일 태양에서, HGF 변이체는 감소된 세포 성장(세포 증식, 세포 생존, 혈관신생, 세포 이동을 포함하지만 이들로 제한되지 않는) 촉진 활성을 제공한다. 일 태양에서, HGF 돌연변이체는 자이모젠-양 HGF β쇄(예를 들어, 위치 494에서의 돌연변이)이다. 예를 들어, 이들 돌연변이체는 그것이 시험관 내 또는 생체 내에서 활성화(예를 들어, 절단)될 수 없게 하는 HGF 내의 위치에서의 돌연변이를 갖는 것들을 포함한다; 하나의 그러한 돌연변이의 예는 위치 424 및 494에서 돌연변이를 포함한다. 일 태양에서, HGF 돌연변이체는 단일 쇄 HGF, 예를 들어 위치 424 및/또는 494, 및/또는 잔기 424 및/또는 494에 인접한 위치에서 돌연변이를 포함하는 HGF이다. 일 태양에서, 본 발명의 HGF 돌연변이체는 추가로 위치 604에서의 돌연변이(예를 들어, HGF β쇄 Cys604Ser)를 포함한다. 일 태양에서, 본 발명의 HGF 돌연변이체는 상기한 바와 같은 "활성 위치 부위" 돌연변이체이다. 일 태양에서, 본 발명은 위치 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 및/또는 702와 같은, β쇄에 하나 이상의 위치에서 돌연변이(활성 위치 부위에서의 돌연변이 포함)를 갖는 HGF 돌연변이체를 제공한다.
일부 태양에서, 활성화된 β쇄에 대한 본 발명의 물질 또는 분자의 결합은 HGF에 의한 c-met 활성화를 저해한다. 일부 태양에서, 활성화된 β쇄에 대한 상기 물질 또는 분자의 결합은 HGF에 의해 유도되는 세포 성장(세포 증식, 생존, 혈관신생, 형태발생, 이동)을 저해한다. 일부 태양에서, 활성화된 β쇄에 대한 상기 물질 또는 분자의 결합은 c-met 수용체 다이머화를 저해한다.
일부 태양에서, 본 발명의 물질 또는 분자는 여기에 기재된 바와 같은 본 발명의 스크리닝 또는 동정방법에 의해 수득된다.
일부 태양에서, 본 발명의 물질 또는 분자는 펩티드를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 펩티드는 서열 VDWVCFRDLGCDWEL을 포함한다. 일부 태양에서, 펩티드는 서열 VDWVCFRDLGCDWEL과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이 서열의 변이체는 당업계에 알려진 방법, 예를 들어 조합 돌연변이유발(예를 들어, 파지 디스플레이에 의해)에 의해 수득될 수 있다. 그러한 변이체의 구체적 예는 아래 표 1에 도시된 것들을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 태양에서, 이들 펩티드는 그들의 저해 및/또는 치료 효과(예를 들어, 증진된 친화도, 향상된 약동력학 성질(반감기, 안정성, 제거속도와 같은), 대상체에 대한 감소된 독성을 포함하는)를 증진시키는 수식을 포함한다. 그러한 수식은 예를 들어, 글리코실화, peg화, 비-자연 발생적이지만 기능적으로 균등한 아미노산으로의 치환, 결합 그룹 등을 포함한다. 그러한 수식은 당업계에 잘 알려져 있으며, 더욱이 필요한 바대로 실험적으로 결정할 수 있다.
Figure pat00001
Figure pat00002

일 태양에서, 본 발명은 c-met에 대한 결합을 위한 간세포 성장 인자 β쇄와 경쟁하는 물질 또는 분자인 HGF/c-met 길항제를 제공한다. 일부 태양에서, 상기 분자는 c-met 수용체 멀티머화(예를 들어, 다이머화)를 저해한다. 일부 태양에서, 상기 분자는 다른 β쇄 분자와 상호작용(예를 들어, 멀티머화/다이머)하는 감소된 능력을 갖는 변이체(돌연변이체) β쇄를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 분자는 HGF β쇄 멀티머화(예를 들어, 다이머화)를 저해한다. 일부 태양에서, 상기 분자는 c-met에 결합하지만 c-met 활성화를 수행하는 감소된 능력을 나타낸다(예를 들어, 감소된 c-met 인산화, 마이토젠 활성화된 단백질 키나제(MAPK) 인산화, 및/또는 감소된 HGF/c-met 의존성 세포 이동, 세포 증식, 세포 생존, 세포 형태발생 등에 의해 나타내어지는 바와 같은). 일 태양에서, 분자는 β쇄가 위치 695, 696 및 673 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함하는, HGF β쇄의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 일 태양에서, 분자는 β쇄가 위치 695, 696 및 673 중 하나 이상에서 돌연변이, 및 위치 534, 578, 692 및 694 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 두 개 이상의 잔기의 조합은 HGF β쇄의 잔기 534, 578, 673, 692, 694, 695 및 696 중 어느 것을 포함할 수 있다. 일 태양에서, 분자는 β쇄가 잔기 673 및 695 중 적어도 하나, 또는 양자에서 돌연변이를 포함하는, HGF β쇄의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 다른 태양에서, 분자는 β쇄가 (ⅰ) 잔기 673 및 695의 적어도 하나, 또는 양자, 및 (ⅱ) 잔기 692에 돌연변이를 포함하는 HGF β쇄의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 다른 태양에서, 분자는 β쇄가 (ⅰ) 잔기 673 및 695의 적어도 하나, 또는 양자, 및 (ⅱ) 잔기 692, 및 (ⅲ) 잔기 534 및 578의 적어도 하나, 또는 양자에 돌연변이를 포함하는 HGF β쇄의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 다른 태양에서, 분자는 β쇄가 (ⅰ) 잔기 673 및 695의 적어도 하나, 또는 양자, 및 (ⅱ) 잔기 534, 578 및 692의 적어도 하나, 두 개 또는 모두에 돌연변이를 포함하는 HGF β쇄의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 다른 태양에서, 분자는 β쇄가 (ⅰ) 잔기 673, 695 및 696의 적어도 하나, 양자 또는 모두, 및 (ⅱ) 잔기 534, 578, 692 및 694의 적어도 하나, 양자 또는 어느 개 내지 모두에 돌연변이를 포함하는 HGF β쇄의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 일 태양에서, 분자는 β쇄가 돌연변이를 포함하고, 위치 534, 673 및/또는 692에서 돌연변이가 있으면, β쇄는 또한 위치 578, 694, 695 및 696의 적어도 하나, 양자 또는 어느 개 내지 모두에서 돌연변이를 포함하는 HGF β쇄의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 일 태양에서, 분자는 β쇄가 위치 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 및/또는 702와 같은, β쇄의 하나 이상의 위치에서 돌연변이(활성 위치 부위에서의 돌연변이 포함)를 포함하는 HGF β쇄의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 일 태양에서, 분자는 상기 부분이 그것이 시험관 내 또는 생체 내에서 활성화(예를 들어, 절단)될 수 없게 하는 HGF 내의 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 포함하는, HGF의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다; 하나의 그러한 돌연변이체의 예는 위치 424 및/또는 494에서의 돌연변이를 포함한다. 이들 태양의 일부에서, β쇄는 HGF 알파 쇄(또는 그의 기능적 균등물)의 적어도 일부에 결합된다(예를 들어, 이황화물 결합에 의해). 일부 태양에서, β쇄는 HGF 알파 쇄(또는 그의 기능적 균등물)의 실질적으로 모두에 결합된다(예를 들어, 이황화물 결합에 의해). 일부 태양에서, β쇄는 HGF 알파 쇄 서열(또는 그의 기능적 균등물)에 결합되지 않는다. 다른 물질이나 분자는 본 발명의 스크리닝 또는 동정 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 경우, 물질이나 분자는 여기에서 제공된 정보에 기초하여, 예를 들어, HGF β쇄의 활성화 영역, 활성 부위의 잔기, 및/또는 특정 잔기(잔기 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 및/또는 702 중 하나 이상과 같은)(예를 들어, 프로테아제-양 영역의 잔기)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 기능적으로-유의한 잔기와 상호작용할 것으로 예상되는 소분자 스캐폴드 또는 펩티드 서열에 기초하여, 설계된 출발 물질 또는 분자의 반복물의 수식 산물일 수 있다.
하나 이상의 위치가 야생형 상대 서열에 대해 돌연변이된 본 발명의 어느 분자에서, 돌연변이는 상응하는 야생형 잔기의 기능적 효과를 감소하거나 제거하는(또는 일부 경우 증가시키는) 어느 형태의 것일 수 있다. 돌연변이는 예를 들어 치환, 삽입, 부가 및/또는 결실에 의해, 당업계에 알려진 어느 적당한 형태로 수득될 수 있다(있고/거나 실험적으로 결정될 수 있다). 일부 태양에서, 돌연변이는 비-보존적 돌연변이를 포함한다. 적당한 치환은 예를 들어 알라닌과 세린과 같은 아미노산으로의, 여기에(특히 실시예에) 기재된 것들을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일 측면에서, 분자/물질(예를 들어, 여기에 기재된 바와 같은 HGF/c-met 변조제)은 세포독성제와 같은 독소에 결합된다. 이들 분자/물질은 방사선조사 및/또는 화학요법제와 같은, 첨가제/증진제와 배합되어 제제화되거나 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 HGF/c-met 신호전달 축의 조절곤란과 관련된 질환 상태를 변조하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 HGF/c-met 변조제 분자(예를 들어, c-met에 대한 야생형(천연) HGF β쇄의 특이적 결합을 저해하는 물질)를 대상체에게 투여함으로써, c-met 활성화가 변조되는 것을 포함하는, 대상체에서 c-met 활성화를 변조하는 방법을 제공한다. 일 태양에서, 상기 분자는 HGF/c-met 활성을 저해하는 HGF/c-met 길항제이다. 일 태양에서, 상기 길항제는 c-met에 대한 HGF β의 특이적 결합을 저해한다. 일 태양에서, 상기 분자는 HGF/c-met 활성을 증가시키는 작용제이다. 일 태양에서, 상기 작용제는 c-met에 대한 HGF β의 증가된 특이적 결합을 갖거나 수행한다. 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 c-met 길항제(예를 들어, c-met에 대한 야생형(천연) HGF β쇄의 특이적 결합을 저해하는 물질)를 대상체에게 투여함으로써, c-met 활성화가 저해되는 것을 포함하는, 대상체에서 c-met 활성화와 관련된 병리적 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
HGF/c-met 신호전달 경로는 예를 들어, 세포 성장 자극(예를 들어 세포 증식, 세포 생존, 세포 이동, 형태발생) 및 혈관신생을 포함하는, 여러 생물학적 및 생리적 기능에 연루되어 있다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 세포 또는 조직을 본 발명의 c-met 길항제(예를 들어, c-met에 대한 야생형(천연) HGF β쇄의 특이적 결합을 저해하는 물질)와 접촉시킴으로써, c-met 활성화와 관련된 세포 증식이 저해되는 것을 포함하는, c-met 활성화된 세포 성장(예를 들어 증식 및/또는 생존)을 저해하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 이상적 혈관신생과 관련된 이상을 갖는 세포, 조직 및/또는 대상체에게 본 발명의 c-met 길항제(예를 들어, c-met에 대한 야생형(천연) HGF β쇄의 특이적 결합을 저해하는 물질)을 투여함으로써, 혈관신생이 변조되는 것을 포함하는, 혈관신생을 변조하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역(자가면역과 같은) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은, 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 c-met 길항제의 용도를 제공한다. c-met 길항제는 항체, 항체 단편, 소 분자(예를 들어, 유기 분자), 폴리펩티드(예를 들어, 올리고펩티드), 핵산(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은, 올리고뉴클레오티드), 앱타머, 또는 그들의 배합물을 포함하는, 여기에 기재된 어느 형태일 수도 있다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역(자가면역과 같은) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은, 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 핵산의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역(자가면역과 같은) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은, 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 발현 벡터의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역(자가면역과 같은) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은, 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역(자가면역과 같은) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은, 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 제조물품의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역(자가면역과 같은) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은, 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 키트의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 세포 또는 조직을 유효량의 본 발명의 c-met 길항제와 접촉시킴으로써 c-met 활성화와 관련된 세포 증식이 저해되는 것을 포함하는, c-met 활성화된 세포 증식을 저해하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 본 발명의 c-met 길항제를 투여함으로써 상태가 치료되는 것을 포함하는, 대상체에서 c-met 활성화의 조절곤란과 관련된 병리적 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 세포를 본 발명의 c-met 길항제와 접촉시킴으로써 세포 성장의 저해를 유발하는 것을 포함하는, c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 둘 다를 발현하는 세포의 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 일 태양에서, 세포는 상이한 세포에 의해 발현되는 HGF에 의해 접촉된다(예를 들어, 측분비 효과를 통해).
일 측면에서, 본 발명은 포유류에게 유효량의 본 발명의 c-met 길항제를 투여함으로써 포유류를 효과적으로 치료하는 것을 포함하는, c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 둘 다를 발현하는 세포를 포함하는 암성 종양을 갖는 포유류를 치료적으로 치료하는 방법을 제공한다. 일 태양에서, 세포는 상이한 세포에 의해 발현되는 HGF에 의해 접촉된다(예를 들어, 측분비 효과를 통해).
일 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 c-met 길항제를 투여함으로써 세포 증식성 장애를 효과적으로 치료하거나 예방하는 것을 포함하는, c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 둘 다의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 세포 증식성 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 태양에서, 상기 증식성 장애는 암이다.
일 측면에서, 본 발명은 세포를 유효량의 본 발명의 c-met 길항제와 접촉시킴으로써 세포의 성장을 저해하는 것을 포함하는, 세포의 성장이 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 둘 다의 성장 강화 효과에 적어도 부분적으로 의존적인, 세포의 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 일 태양에서, 세포는 상이한 세포에 의해 발현되는 HGF에 의해 접촉된다(예를 들어, 측분비 효과를 통해).
일 측면에서, 본 발명은 세포를 유효량의 본 발명의 c-met 길항제와 접촉시킴으로써 종양을 효과적으로 치료하는 것을 포함하는, 종양의 성장이 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 둘 다의 성장 강화 효과에 적어도 부분적으로 의존적인, 포유류에서 종양을 치료적으로 치료하는 방법을 제공한다. 일 태양에서, 세포는 상이한 세포에 의해 발현되는 HGF에 의해 접촉된다(예를 들어, 측분비 효과를 통해).
본 발명의 방법은 어느 적당한 병리적 상태, 예를 들어, HGF/c-met 신호전달 경로의 조절곤란과 관련된 세포 및/또는 조직에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 일 태양에서, 본 발명의 방법에서 표적이 되는 세포는 암 세포이다. 예를 들어, 암 세포는 유방암 세포, 결장직장암 세포, 폐암 세포, 유두종 세포(예를 들어, 갑상선의), 결장암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 자궁경부암 세포, 중추신경계 암 세포, 골육종 세포, 신장암 세포, 간세포암 세포, 방광암 세포, 위암 세포, 두경부 편평세포암종 세포, 흑색종 세포 및 백혈병 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있다. 일 태양에서, 본 발명의 방법에서 표적으로 되는 세포는 과증식성 및/또는 과형성성 세포이다. 일 태양에서, 본 발명의 방법에서 표적으로 되는 세포는 이형성 세포이다. 또 다른 태양에서, 본 발명의 방법에서 표적으로 되는 세포는 전이 세포이다.
본 발명의 방법은 추가로 부가적인 치료 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 태양에서, 방법은 추가로 표적화된 세포 및/또는 조직(예를 들어, 암 세포)가 방사선 치료 또는 화학요법제에 노출되는 단계를 포함한다.
여기에 기재된 바와 같이, c-met 활성화는 그의 조절곤란이 수많은 병리적 상태에 이르게 하는 중요한 생물학적 과정이다. 따라서, 본 발명의 방법의 일 태양에서, 표적으로 되는 세포(예를 들어, 암 세포)는 c-met의 활성화가 동일한 조직 기원의 정상 세포에 비해 증진되는 것이다. 일 태양에서, 본 발명의 방법은 표적화된 세포의 사멸을 유발한다. 예를 들어, 본 발명의 길항제와의 접촉은 세포 사멸을 초래하는, c-met 경로를 통해 신호전달하는 세포의 무능을 초래할 수 있다.
c-met 활성화(및 따라서 신호전달)의 조절곤란은 예를 들어, HGF(c-met의 동족 리간드) 및/또는 c-met 자체의 과잉발현을 포함하는, 많은 세포 변화로부터 초래될 수 있다. 따라서, 일부 태양에서, 본 발명의 방법은 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 둘 다가 동일한 조직 기원의 정상 세포에 비해 세포(예를 들어, 암 세포)에 의해 더 풍부하게 발현되는 세포를 표적화하는 것을 포함한다. c-met-발현 세포는 다양한 출처로부터의, 즉 자가분비 또는 측분비 방식으로, HGF에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 일 태양에서, 표적화된 세포는 상이한 세포에서 발현되는 간세포 성장 인자에 의해(예를 들어, 측분비 효과를 통해) 접촉/결합된다. 상기 상이한 세포는 동일하거나 상이한 조직 기원일 수 있다. 일 태양에서, 표적화된 세포는 표적화된 세포 자체에 의해 발현되는 HGF에 의해(예를 들어, 자가분비 효과/루프를 통해) 접촉/결합된다.
일 측면에서, 본 발명은 대상체에게 초-정상 수준(예를 들어, 유사한 치료 조건 하에서 유사한 양의 야생형 HGF로 얻어지는 활성 수준 보다 낮은)의 HGF 생물학적 활성을 수행할 수 있는 HGF 변이체를 투여하는 것을 포함하고, HGF 활성이 최적-이하(즉, 야생형 보다 낮은) 수준으로 요구되고, 이로써 HGF 생물학적 활성의 목적하는 양이 달성되는 방법을 제공한다. 일 태양에서, 상기 HGF 변이체는 위치 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 및/또는 702 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함한다. 일 태양에서, 상기 HGF 변이체는 그것이 시험관 내 또는 생체 내에서 활성화(예를 들어, 절단)될 수 없게 하는 HGF 내의 돌연변이를 포함한다; 하나의 그러한 돌연변이의 예는 위치 424 및/또는 494에서의 돌연변이를 포함한다. 이 방법에 의해 치료되는 적당한 상태는 대상체에서 비정상적으로/바람직하지 않게 낮은 생리적 수준의 HGF/c-met 활성과 관련되고, 치료제에 의해 유도되는 HGF/c-met 활성의 양을 엄격하게 조절하는 것이 필요한 병리적 상태를 포함한다. 그러한 상태의 예는 상처 치유, 심장 비대, 심근경색, 사지 허혈, 말초동맥 질환 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 c-met 길항제 중 어느 것도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 일부 태양에서, c-met 길항제는 일부 태양에서 HGF 알파 쇄(또는 그의 기능적 균등물)에 이황화물 결합되지 않은, 활성화된 HGF β쇄(또는 그의 기능적 균등물)를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성되는 물질 또는 분자이다. 일부 태양에서, 물질 또는 분자는 위치 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 및/또는 702(여기에 기재된 조합 중 어느 것을 포함하는) 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함하는 활성화된 HGF β쇄(또는 그의 기능적 균등물)를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 일부 태양에서, 활성화된 β쇄는 HGF 알파 쇄(또는 그의 기능적 균등물)의 적어도 일부에 결합(예를 들어, 이황화물 결합에 의해)된다. 일부 태양에서, 활성화된 β쇄는 HGF 알파 쇄(또는 그의 기능적 균등물)의 실질적으로 모두에 결합(예를 들어, 이황화물 결합에 의해)된다. 일부 태양에서, 활성화된 β쇄는 HGF 알파 쇄 서열(또는 그의 기능적 균등물)에 결합되지 않는다.
본 발명의 방법의 일부 태양에서, 물질 또는 분자는 소 분자, 펩티드, 항체, 항체 단편, 앱타머, 또는 그들의 배합물이거나 이를 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 태양에서, c-met 길항제는 일부 태양에서 서열 VDWVCFRDLGCDWEL을 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성되는 펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성되는 물질 또는 분자이다. 일부 태양에서, 펩티드는 서열 VDWVCFRDLGCDWEL과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수로 하여 구성된다. 일 태양에서, 이 서열의 변이체는 위 표 1에 도시된 것들 중 어느 것이다. 일부 태양에서, 이들 펩티드는 그들의 저해 및/또는 치료 효과(예를 들어, 증진된 친화도, 향상된 약동력학 성질(반감기, 안정성, 제거속도와 같은), 대상체에 대한 감소된 독성을 포함)를 증진시키는 수식을 포함한다. 그러한 수식은 예를 들어, 글리코실화, peg화, 비-자연 발생적이나 기능적으로 균등한 아미노산으로의 치환, 결합 그룹 등을 포함하는 수식을 포함한다. 적당한 수식은 당업계에 잘 알려져 있으며, 더욱이 필요한대로 실험적으로 결정될 수 있다.
일부 태양에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 스크리닝 및/또는 동정 방법 중 어느 것에 의해 수득된 물질 또는 분자를 이용한다.
본 발명의 방법 및 조성물의 일부 태양에서, HGF/c-met 신호전달을 저해하는 물질/분자는 활성화된 HGF β쇄 이외의 세포 성분과 c-met 사이의 결합 상호작용을 실질적으로 방해하지 않는다. 예를 들어, 일 태양에서, 물질/분자는 c-met에 대한 HGF α쇄의 결합을 실질적으로 방해하지 않는다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 물질/분자(예를 들어, HGF/c-met 길항제)와 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 태양에서, 담체는 약제학적으로 허용된다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 물질/분자(예를 들어, HGF/c-met 길항제)를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일 태양에서, 본 발명의 핵산은 폴리펩티드(예를 들어, 올리고펩티드)이거나 이를 포함하는 물질/분자(예를 들어, HGF/c-met 길항제)를 코딩한다. 일 태양에서, 본 발명의 핵산은 항체 또는 그의 단편이거나 이를 포함하는 물질/분자(예를 들어, HGF/c-met 길항제)를 코딩한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 벡터는 어느 타입, 예를 들어 발현 벡터와 같은 재조합 벡터일 수 있다. 다양한 숙주 세포 중 어느 것이 사용될 수 있다. 일 태양에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어, E. 콜라이(E. coli)이다. 일 태양에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유류 세포이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 물질/분자(예를 들어, HGF/c-met 길항제)를 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 적당한 숙주 세포에서 항체(또는 그의 단편)를 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 발현하고, 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항체(또는 그의 단편)이거나 그를 포함하는 c-met 길항제의 제조방법을 제공한다. 다른 예에서, 본 발명은 적당한 숙주 세포에서 폴리펩티드(올리고펩티드와 같은)를 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 발현하고, 상기 폴리펩티드(올리고펩티드와 같은)를 회수하는 것을 포함하는, 폴리펩티드(올리고펩티드와 같은)이거나 그를 포함하는 물질/분자(예를 들어, HGF/c-met 길항제)의 제조방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 용기; 및 용기 내에 함유된 조성물을 포함하고, 조성물이 본 발명의 하나 이상의 물질/분자(예를 들어, HGF/c-met 길항제)를 포함하는 제조물품을 제공한다. 일 태양에서, 조성물은 본 발명의 핵산을 포함한다. 일 태양에서, 물질/분자(예를 들어, HGF/c-met 길항제)를 포함하는 조성물은 추가로 일부 태양에서 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일 태양에서, 본 발명의 제조물품은 추가로 대상체에게 조성물(예를 들어, 길항제)을 투여하기 위한 지침을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 물질/분자(예를 들어, HGF/c-met 길항제)를 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 완충제를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 일 태양에서, 완충제는 약제학적으로 허용된다. 일 태양에서, 물질/분자(예를 들어, HGF/c-met 길항제)를 포함하는 조성물은 추가로 일부 태양에서 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일 태양에서, 키트는 추가로 대상체에게 조성물(예를 들어, 길항제)을 투여하기 위한 지침을 포함한다.
도 1 Met 인산화 어세이에서 HGF β 직접 및 경쟁 결합 및 활성
(A) 표면 플라스몬 공명에 의한 Met의 세포외 영역(Met ECD)에 대한 HGF β의 결합. Met ECD를 ∼2000 공명 단위의 CM5 칩 상에서 포획하였다. HGF β를 12.5 nM 내지 100 nM의 농도 시리즈로 주입하였다. 화살표는 결합 및 해리 기의 개시를 나타낸다. 데이터를 그로부터 kon, koff 및 Kd 값이 결정되는 1:1 결합 모델을 이용하는 글로벌 피트에 의해 분석하였다.
(B) HGF β/Met-IgG 경쟁 ELISA. Met-IgG를 토끼 항-인간 IgG Fc로 코팅된 플레이트 상에서 포획하고 250 nM 말레이미드-커플링된 바이오티닐화된 야생형 HGF β 및 비표지된 HGF β(●) 및 프로HGF β(■)의 농도 시리즈를 함유하는 혼합물로 인큐베이션하였다. 플레이트에 결합된 바이오티닐화된 야생형 HGF β의 양을 뉴트라비딘-HRP에 의해 검출하였다. 각각 적어도 3개의 독립된 결정으로부터의 데이터를 정규화, 평균 및 그로부터 IC50 값이 결정되는 칼레이다그래프를 이용한 4 지수 피트에 의해 피팅하였다; 에러 막대는 표준 편차를 나타낸다
(C) A549 세포에서 Met의 HGF-의존적 인산화를 HGF(▲) 및 HGF β(●)를 이용하여 실시예에 기재된 바와 같이 수행하였다.
(D) Met의 HGF-의존적 인산화의 저해를 증가하는 농도의 HGF β 존재 하에 A549 세포를 자극하기 위해 0.5 nM(◆), 0.25 nM(▲) 및 0.125 nM(■)의 HGF를 이용하여 실시예에 기재된 바와 같이 이중으로 수행하였다.
(E) 전장 HGF/Met-IgG 경쟁 ELISA. 이것을 1 nM NHS-커플링된 바이오티닐화된 HGF 및 표지된 HGF(○)의 농도 시리즈, 및 HGF β(●)를 이용하여 (A)와 유사하게 수행하였다. 각각 세 독립된 결정으로부터의 데이터를 정규화, 평균 및 위와 같이 피팅하였다.
도 2 HGF 돌연변이체에 의한 HGF-의존적 세포 이동. (A) HGF 돌연변이체의 대표적 순도. 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의해 분석된 모든 HGF 돌연변이체의 순도를 양이온 교환 정제된 HGF I623A에 대해 나타내었다. 1% FBS(v/v)에서 CHO 발현에 의한 분비된 단일-쇄 형태의 불완전한 전환이 레인 1에 나타내어져 있다. 5% FBS에 대한 부가적인 노출이 활성화 과정을 완료시켜 순수한 2-쇄 HGF I623A(레인 2)를 생성하였다. 분자량 마커를 Mr×103으로 나타내었다. (B) 1 nM HGF 돌연변이체의 존재 하에 트랜스웰 어세이에서 MDA-MB435 세포의 이동. 활성을 1 nM 야생형 HGF에 노출된 대조 세포의 백분율 이동으로 표현한다; 전장 HGF 서열 넘버링[키모트립시노젠 넘버링]이 나타내어져 있다. 값은 4-8 독립적 실험의 평균±SD를 나타낸다. (C) 야생형 HGF의 부재 하(a), 1 nM 야생형 HGF(b), 1 nM HGF R695A(c) 및 1 nM HGF G696A(d)를 이용한 MDA-MB435 세포 이동의 사진.
도 3 HGF 돌연변이체에 의한 Met의 HGF-의존적 인산화. A549 세포의 Met의 인산화를 다양한 농도의 HGF(●), 프로HGF(◆), HGF Q534A(○), HGF D578A(▲), HGF Y673A(△), HGF V692A(◇), HGF R695A(□) 및 HGF G696A(▼)를 이용하여 실시예에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 4 HGF β 돌연변이체의 Met 경쟁 결합. HGF β/Met-IgG 경쟁 ELISA를 야생형 HGF β(△), HGF β(●) 및 HGF β 돌연변이체 Q534A[c57](○), D578A[c102](▲), Y619A[c143](◇), R695A[c217](□), G696A[c219](▼) 및 I699A[c221a](◆)의 Met 결합을 평가하는데 사용하였다. 데이터를 칼레이다그래프를 이용하여 4 지수 피트에 의해 핏팅하였다; 대표적인 개별적 경쟁 어세이를 n≥3인 여러 독립적 결정에 대해 나타내었다.
도 5 HGF β의 β-쇄 및 2-쇄 HGF의 돌연변이의 영향. HGF β/Met 경쟁 결합 ELISA에서 HGF β 돌연변이체의 Met 경쟁 결합 테이터와 MDA-MB-435 세포 이동 어세이에서 2-쇄 HGF 돌연변이체의 세포 이동 활성을 나타내었다. HGF β-쇄 돌연변이체를 다르게 언급하지 않으면 C604S 배경에서 제조하였다.
도 6. 세포 증식의 자극 및 저해에 대한 HGF 돌연변이의 영향. (A) BxPC3 세포에서 2-쇄 HGF 및 2-쇄 HGF 돌연변이체(표시된 돌연변이를 갖는)에 의한 HGF-의존적 세포 증식. (B) BxPC3 세포에서 HGF β쇄에서의 2-쇄 HGF 돌연변이체(표시된 돌연변이를 갖는) 및 1-쇄 HGF에 의한 HGF-의존적 세포 증식의 저해.
도 7 HGF/Met 경쟁 결합 ELISA에 의해 결정되는 Met에 대한 HGF 돌연변이체의 상대적 결합 친화도.
도 8 상이한 농도의 HGF 돌연변이체의 전-이동 활성.
도 9 HGF β쇄 경쟁 ELISA에 의해 결정되는 c-Met-IgG에 대한 단일 쇄 프로-HGF 및 2 쇄 HGF 결합의 분석. 데이터를 칼레이다그래프를 이용하여 4 지수 피트에 의해 핏팅하고 2 쇄 HGF에 대한 IC50을 결정하였다. 100 nM 이하 농도의 단일 쇄 프로-HGF는 cMet-IgG에 대한 HGF β쇄 결합과 경쟁하지 않았다.
발명을 실시하기 위한 형태
본 발명은 HGF/c-met 신호전달 경로의 저해제(특히, c-met에 대한 HGF β쇄 결합의 저해제)를 동정하는 방법, 조성물, 키트 및 제조물품, 및 그러한 저해제의 사용방법을 제공한다.
이러한 방법, 조성물, 키트 및 제조물품의 상세한 내용이 여기에 제공된다.
일반적 기술
본 발명의 실시는, 다르게 언급하지 않으면, 당업계의 기술 범위 내인 분자생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 그러한 기술은 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2판(Sambrook 등, 1989); "Oligonucleotide Synthesis"(M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture"(R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology"(Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology"(F. M. Ausubel 등, eds., 1987, 및 정기적 업데이트); "PCR: The Polymerase Chain Reaction"(Mullis 등, ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning"(Perbal Bernard V., 1988)와 같은, 문헌에 충분히 설명되어 있다.
정의
펩티드(예를 들어, VDWVCFRDLGCDWEL) 또는 폴리펩티드 서열에 관한 "백분율(%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 백분율 서열 동일성을 얻기 위하여, 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후, 어느 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않은, 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 어떠한 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 지수를 결정할 수 있다. 그러나, 여기에서의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 소스 코드가 아래 표 A에 제공되어 있는, 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, Inc.에 의해 저술되었고 아래 표 A에 나타내어진 소스 코드는 U.S. 저작권 등록번호 TXU510087 하에 등록된, 워싱턴 D. C. 20559, 미합중국 저작권청에 사용 설명서와 함께 제출되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아, 사우쓰 샌프란시스코, 제넨테크, Inc.를 통해 공개적으로 입수가능하거나, 아래 도 8에서 제공되는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운용 체계, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서의 사용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 지수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변화하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 그에 대한, 주어진 아미노산 서열 A(다르게는 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 그에 대해, 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있는)의 % 아미노산 서열 동일성은 아래와 같이 계산된다:
100×분수 X/Y
여기에서 X는 A와 B의 그 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 계산된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않음이 이해될 것이다.
특별히 다르게 언급하지 않으면, 여기에 사용되는 모든 % 아미노산 서열 동일성은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 앞 문단에 설명되어 있는 바와 같이 수득된다.
표 A
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
Figure pat00024
Figure pat00025
Figure pat00026
Figure pat00027
Figure pat00028
Figure pat00029

여기에 사용된, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 한 타입의 벡터는 부가적인 DNA 조각이 결찰될 수 있는 환상의 이본쇄 DNA 루프를 말하는, "플라스미드"이다. 또 하나의 타입의 벡터는 파지 벡터이다. 또 하나의 타입의 벡터는 부가적인 DNA 조각이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는, 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 세균 복제 기원을 갖는 세균 벡터와 에피좀성 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피좀성 포유류 벡터)는 숙주 세포로의 도입 시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그들이 작동하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 여기에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "재조합 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 자주 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는 플라스미드가 가장 보편적으로 사용되는 형태의 벡터이므로 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
여기에 상호교환가능하게 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 어느 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 말하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 수식된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의하거나, 합성 반응에 의해 폴리머로 도입될 수 있는 어느 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 그들의 유사체와 같은, 수식된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 수식은 폴리머의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 개입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지와의 포접에 의해서와 같이, 합성 후 추가로 수식될 수 있다. 다른 타입의 수식은 예를 들어, "캡", 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 예를 들어, 비하전된 결합(예를 들어, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 결합(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것들, 예를 들어, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, ply-L-리신 등)과 같은 펜던트 부위를 갖는 것들, 삽입제를 갖는 것들(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터를 함유하는 것들(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등), 알킬화제를 함유하는 것들, 수식된 결합을 갖는 것들(예를 들어, 알파 아노머성 핵산 등), 및 비수식된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)와 같은, 뉴클레오티드 간 수식을 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 하이드록실 그룹 중 어느 것은 예를 들어, 포스포네이트 그룹, 포스페이트 그룹에 의해 대체되거나, 표준 보호 그룹에 의해 보호되거나, 부가적인 뉴클레오티드에 대한 부가적인 결합을 제조하기 위하여 활성화될 수 있거나, 고상 또는 반-고상 지지체에 포접될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 아민이나 1 내지 20 탄소 원자의 유기 캡핑 그룹 부위로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실은 또한 표준 보호 그룹으로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어, 2'-0-메틸-, 2'-0-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당 유사체, 알파-아노머 당, 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스와 같은 에피머 당, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵튤로스, 어사이클릭 유사체 및 메틸 리보사이드와 같은 무염기 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는, 당업계에 일반적으로 알려져 있는 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 대체 결합 그룹으로 대체될 수 있다. 이들 대체 결합 그룹은 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), "(O)NR.sub.2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH.sub.2("포름아세탈")로 대체되고, 여기에서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알딜을 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬(1-20 C)인 태양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드에 있는 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA와 DNA를 포함하는, 여기에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
일반적으로, 여기에 사용된, "올리고뉴클레오티드"는, 반드시는 아니지만 일반적으로, 길이가 약 200 뉴클레오티드 미만인 짧은, 일반적으로 일본쇄인, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 말한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"와 "폴리뉴클레오티드"는 서로 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 위 설명은 올리고뉴클레오티드에 동일하게 또한 완전히 적용가능하다.
여기에 사용된, 용어 "간세포 성장 인자" 또는 "HGF"는, 다르게 구체적으로 또는 문맥상으로 표시되지 않으면, 그러한 과정이 일어나도록 허용되는 조건 하에서 HGF/c-met 신호전달 경로를 활성화할 수 있는 어느 천연 또는 변이체(천연이든 합성이든) HGF 폴리펩티드를 말한다. 용어 "야생형 HGF"는 일반적으로 자연 발생 HGF 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 용어 "야생형 HGF 서열"은 자연 발생 HGF에서 발견되는 아미노산 서열을 말한다.
"활성화된 HGF β쇄", 또는 그의 변이체는 야생형 HGF 단백질의 잔기 494와 잔기 495 사이의 절단으로부터 적어도 부분적으로 초래되는, 단일 쇄로부터 2쇄 형태(즉, α 및 β쇄)로 야생형 HGF 단백질의 전환 시 야생형 HGF β쇄에 의해 채택되는 형태를 갖는 어느 HGF β쇄를 말한다. 일부 태양에서, 상기 형태는 구체적으로 β쇄에 있는 프로테아제-양 영역의 활성화 영역의 형태를 말한다. 일부 태양에서, 상기 형태는 보다 더 구체적으로 β쇄에 있는 프로테아제-양 영역의 활성 위치 부위의 형태를 말한다. 일반적으로, 상기 형태의 채택은 여기에 기재된 바와 같은, c-met 결합 위치를 노출시킨다.
용어 "항체"와 "면역글로불린"은 최광의로 상호교환가능하게 사용되고 모노클로날 항체(예를 들어, 전장 또는 완전한 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 그들이 목적으로 하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이성 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편(여기에 더 상세히 설명되는)을 포함할 수 있다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙될 수 있다.
"항체 단편"은 부분이 바람직하게는 완전한 항체에 존재할 때 그 부분과 정상적으로 관련된 기능의 적어도 하나, 바람직하게는 대부분 또는 모두를 보유하는, 완전한 항체의 부분만을 포함한다. 일 태양에서, 항체 단편은 완전한 항체의 항원 결합 위치를 포함하고 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 다른 태양에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 부위를 포함하는 것은 FcRn 결합, 항체 반감기 변조, ADCC 기능 및 보체 결합과 같은, 완전한 항체에 존재할 때 Fc 부위와 정상적으로 관련된 생물학적 기능 중 적어도 하나를 보유한다. 일 태양에서, 항체 단편은 완전한 항체와 실질적으로 유사한 생체 내 반감기를 갖는 일가 항체이다. 예를 들어, 그러한 항체 단편은 단편의 생체 내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암 상에서 포함할 수 있다.
여기에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어진 항체, 즉 집단을 구성하는 개개 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 말한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일의 항원에 대한 것이다. 더욱이, 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다.
여기에서 모노클로날 항체는 구체적으로 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스나 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동적인 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스나 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동적인 "키메라" 항체, 및 그러한 항체의 단편을, 그들이 목적으로 하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 포함한다(미국특허 제4,816,567호; 및 Morrison 등, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 81: 6851-685(1984)).
비-인간(예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이고 여기에서 수혜자의 고가변 부위 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은, 비-인간 종(공여자 항체)으로부터의 고가변 부위로부터의 잔기에 의해 대체된다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 프레임워크 부위(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수혜자 항체에서도 공여자 항체에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 수식은 항체 성능을 더 정련하기 위하여 가해진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 고가변 루프가 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FRs가 인간 면역글로불린 서열의 것들인, 실질적으로 모든 적어도 하나, 전형적으로 두 개의, 가변영역을 포함할 것이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다. 더 상세한 것에 대해, Jones 등, Nature, 321: 522-525(1986); Reichmann 등, Nature, 332: 323-329(1988); 및 Presta, Curr . Op . Struct. Biol ., 2:593-596(1992)를 참조하라. 또한 아래 검토 논문 및 그 안에 인용된 참조문헌을 참조하라: Vaswani 및 Hamilton, Ann . Allergy , Asthma & Immunol. 1: 105-115(1998); Harris, Biochem . Soc . Transactions 23: 1035-1038(1995); Hurle 및 Gross, Curr . Op . Biotech . 5: 428-433(1994).
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되는 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/거나 여기에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하는 기술 중 어느 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 제외한다.
"친화도 성숙된" 항체는 그들 변화(들)를 갖지 않는 친 항체에 비해, 항원에 대한 항체의 친화도에 있어서 개선을 가져오는 그의 하나 이상의 CDR들에서 하나 이상의 변화를 갖는 것이다. 바람직한 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙된 항체는 당업계에 알려진 방법에 의해 제조된다. Marks 등, Bio / Technology 10: 779-783(1992)는 VH 및 VL 영역 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기재하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 Barbas 등, Proc Nat . Acad . Sci , USA 91: 3809-3813(1994); Schier 등, Gene 169: 147-155(1995); Yelton 등, J. Immunol . 155: 1994-2004(1995); Jackson 등, J. Immunol . 154(7): 3310-9(1995); 및 Hawkins 등, J. Mol . Biol . 226: 889-896(1992)에 의해 기재되어 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원(예를 들어, 활성화된 HGF β쇄 또는 활성화된 HGF β가 결합하는 c-met 상의 위치/에피토프)의 생물학적 활성을 저해하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 실질적으로 또는 경쟁적으로 항원의 생물학적 활성을 저해한다.
여기에 사용된, "작용제 항체"는 관심있는 폴리펩티드의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모사하는 항체이다(예를 들어, 항체는 활성화된 HGF β쇄의 c-met 활성화 기능 중 적어도 하나를 제공할 수 있다).
"장애"는 본 발명의 물질/분자 또는 방법으로의 치료로부터 이익을 받을 수 있는 어느 상태이다. 이것은 포유류를 해당 장애에 걸리기 쉽게 하는 그들 병리적 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 여기에서 치료하고자 하는 장애의 비-제한적 예는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프 악성물; 뉴우런, 교세포, 성상세포, 갑상선하 및 기타 선, 대식세포, 상피세포, 기질 및 및 포배강 장애; 및 염증, 면역 및 기타 혈관신생-관련 장애를 포함한다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적 세포 증식이 관련된 장애를 말한다. 일 태양에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
여기에 사용된, "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 말한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 여기에 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유류에서의 생리적 상태를 말하거나 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 그러한 암의 더욱 특별한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 아데노카시노마, 폐의 편평 암종, 복막의 암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 헤파토마, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁체부암, 타액선관 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 및 다양한 유형의 두부 및 경부 암을 포함한다.
여기에서 사용된 바, "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변화하려는 시도에서의 임상적 개입을 말하고, 예방을 위해 또는 임상적 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 어느 직접적 또는 간접적 병리적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행속도의 감소, 질병 상태의 완화 또는 경감 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 태양에서, 본 발명의 항체는 질환이나 장애의 발병을 지연시키는데 사용된다.
"유효량"은 필요한 용량과 시간 동안, 목적하는 치료 또는 예방적 결과를 얻는데 유효한 양을 말한다.
본 발명의 물질/분자, 작용제 또는 길항제의 "치료 유효량"은 개체의 질병 상태, 나이, 성별과 체중, 및 물질/분자, 작용제 또는 길항제의 개체에서 목적하는 반응을 도출하는 능력과 같은 인자에 따라 변화할 수 있다. 치료 유효량은 또한 물질/분자의 어느 유독하거나 치명적인 영향이 치료학적으로 유익한 영향에 의해 능가당하는 것이다. "예방 유효량"은 필요한 용량과 시간 동안, 목적하는 예방적 결과를 얻는데 유효한 양을 말한다. 반드시는 아니지만 전형적으로, 예방적 용량은 질병 이전이나 초기에 대상체에서 사용되므로, 예방 유효량은 치료 유효량 보다 더 적을 것이다.
여기에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해 또는 방지하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 말한다. 이 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어, 메토트렉사트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 핵용해 효소와 같은 효소 및 그의 단편, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람뷰실, 다우노루비신 또는 기타 삽입제, 그의 단편 및/또는 변이체를 포함하는, 소분자 독소와 같은 독소나 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 및 아래 개시된 다양한 항종양 또는 항암제를 포함하고자 하는 것이다. 다른 세포독성제는 아래 기재되어 있다. 기타 살종양제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)®사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조포다, 카보쿠온, 메튜레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토제닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르미신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘루테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 클로람뷰실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로소우레아; 엔디인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼라케아미신 오메가I1(예를 들어, Agnew, Chem Intl . Ed . Engl ., 33: 183-186(1994)를 참조하라); 디네미신 A를 포함하는, 디네미신; 클로드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 크로모포어 및 관련 크로모단백질 엔디인 항생제 크로모포어), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤로-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉사트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항-대사물; 데노프테린, 메토트렉사트, 프테로프테린, 트리메트렉사트와 같은 폴산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항-아드레날; 프롤린산과 같은 폴산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레뷸린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라뷰실; 비스안트렌; 에다트락사트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄신 및 안사미토신과 같은 마이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체(OR, 유진, JHS 내츄럴 프로덕트); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀(NJ, 프린스톤, 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지), 아브락산(ABRAXANE)™ 파클리탁셀의 무-크레모포어, 알부민-조작된 나노입자 제제(일리노이, 샤움버그, 어메리칸 파마슈티컬 파트너즈), 및 탁소티어(TAXOTERE)® 도세탁셀(프랑스, 안토니, 롱-프랑 로라); 클로람뷰실; 겜자르(GEMZAR)® 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉사트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)® 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉사트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 저해제 RFS2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 카페시타빈; 및 상기한 것 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
위 "화학요법제"의 정의에 예를 들어 타목시펜(놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 파레스톤(FARESTON) 토레미펜을 포함하는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 변조제(SERMs); 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, 리비조르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸과 같은 부신 선에서 에스트로겐 생산을 조절하는, 효소 아로마타제를 저해하는 아로마타제 저해제; 및 플루타미드, 니루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 예를 들어, PKC-알파, Ralf 및 H-Ras와 같은, 이상적 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 저해하는 것들; VEGF 발현 저해제(예를 들어, 앤지오자임(ANGIOZYME)® 리보자임) 및 HER2 발현 저해제와 같은 리보자임; 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 백시드(VAXID)® 백신과 같은 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 저해제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 및 상기한 것 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체와 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 작용을 하는 항-호르몬제도 포함된다.
여기에서 사용될 때 "성장 저해제"는 성장이 시험관 내 또는 생체 내에서 HGF/c-met 활성화에 의존하는 세포의 성장을 저해하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 성장 저해제는 S 기에 있는 HGF/c-met-의존적 세포의 백분율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 저해제의 예는 G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 물질과 같은, 세포 주기 진행을 차단하는(S 기 이외의 위치에서) 물질을 포함한다. 고전적인 M-기 차단제는 빈카(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포사이드 및 블레오마이신과 같은 토포이소머라제 Ⅱ 저해제를 포함한다. G1을 정지시키는 그들 물질, 예를 들어, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉사트, 5-플루오로우라실 및 ara-C와 같은 DNA 알킬화제는 또한 S-기 정지로 흐른다. 추가 정보는 Murakami 등(WB Saunders: Philadelphia, 1995)에 의한 The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn 및 Israel, eds., 제목이 "Cell cycle regulation, oncogenes, 및 antineoplastic drugs"인 1장, 특히, 13면에서 발견될 수 있다. 탁산(파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목나무로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유래된, 도세탁셀(탁소티어®, 롱-프랑 로라)은 파클리탈셀(탁솔L®, 브리스톨-마이어스 스퀴브)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀과 도세탈셀은 튜뷸린 다이머로부터 마이크로튜뷸의 조립을 촉진하고 해중합을 방지함으로써 마이크로튜뷸을 안정화시켜, 세포에서 유사분열의 저해를 일으킨다.
"독소루비신"은 안트라사이클린 항생제이다. 독소루비신의 완전한 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라하이드로-6,8,11-트리하이드록시-8-(하이드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.
벡터 제작
여기에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술에 의해 수득될 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 출처 세포로부터 단리되고 서열결정될 수 있다. 항체를 위한 출처 세포는 하이브리도마 세포와 같은 항체 생산 세포일 것이다. 대안으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기나 PCR 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 일단 수득되면, 면역글로불린을 코딩하는 서열은 숙주 세포에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제하고 발현시킬 수 있는 재조합 벡터로 삽입된다. 당업계에 이용가능하고 알려져 있는 많은 벡터가 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터로 삽입하고자 하는 핵산의 크기와 벡터로 형질전환시키고자 하는 특정 숙주 세포에 의존할 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능(이종 폴리펩티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다)과 그것이 위치하는 특정 숙주 세포와 그의 적합성에 따라, 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기원(특히 벡터가 원핵 세포로 삽입될 때), 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 위치(RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열:을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 적합성인 종으로부터 유래된 레플리콘과 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 연결되어 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 위치, 및 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 표지 서열을 운반한다. 예를 들어, E. 콜라이는 전형적으로 E. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드, pBR322를 이용하여 형질전환된다. pBR322는 앰피실린(Amp) 및 테트라사이클린(Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 함유하고 따라서 형질전환된 세포를 동정하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체, 또는 기타 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 또한 내생 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나, 함유하도록 수식될 수 있다.
부가적으로, 숙주 세포와 적합성인 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파지 벡터가 이들 숙주와 연결되어 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, λGEM.TM.-11과 같은 박테리오파지가 E. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포를 형질전환하는데 사용될 수 있는 재조합 벡터를 제조하는데 사용될 수 있다.
구성적 또는 유도성 프로모터가 당업자에 의해 확인될 수 있는, 특정 상황의 필요에 따라, 본 발명에서 사용될 수 있다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 많은 프로모터가 잘 알려져 있다. 선택된 프로모터는 제한효소 분해를 통해 출처 DNA로부터의 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 선택한 벡터로 삽입함으로써 여기에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열과 많은 이종 프로모터 둘 다 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이종 프로모터가, 그들이 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 더 큰 전사와 더 높은 수율의 발현된 표적 유전자를 허용하므로, 바람직하다.
원핵 숙주와 사용하기에 적당한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 tac 또는 trc 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균에서 기능적인 기타 프로모터(기타 알려진 세균 또는 파지 프로모터와 같은) 역시 적당하다. 그들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있고, 이로써 당업자가 어느 요구되는 제한 위치를 제공하기 위하여 링커나 어댑터를 사용하여 그들을 표적 경 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 작동가능하게 결찰할 수 있다(Siebenlist 등(1980) Cell 20: 269).
일부 태양에서, 재조합 벡터 내의 각 시스트론은 막을 가로질러 발현된 폴리펩티드의 전좌를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 그것은 벡터로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택되는 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 가공(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 천연인 신호 서열을 인식하고 가공하지 못하는 원핵 숙주 세포를 위해, 신호 서열이 예를 들어, 알칼라인 포스파타제, 페니실리나제, Ipp 또는 열-안정성 내독소 Ⅱ(STⅡ) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 구성된 그룹으로부터 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환될 수 있다.
폴리펩티드를 발현하기에 적당한 원핵 숙주 세포는 고세균 및 그램-음성 또는 그램-양성 유기체와 같은, 진정세균을 포함한다. 유용한 세균의 예는 에스케리키아(예를 들어, E. 콜라이), 바실러스(B. 서브틸리스), 엔테로박테리아, 슈도모나스 종(예를 들어, P. 아에루기노사), 살모넬라 타이피뮤리움, 세라티아 마르세스칸스, 크렙시엘라, 프로테우스, 시겔라, 리조비아, 비트레오실라, 또는 파라코커스를 포함한다. 바람직하게는, 그램-음성 세포가 사용된다. 바람직하게는 숙주 세포는 최소량의 단백분해 효소를 분비해야 하고, 부가적인 프로테아제 저해제가 세포 배양물로 바람직하게 도입될 수 있다.
폴리펩티드 생산
숙주 세포는 상기 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염되고 프로모터를 유도하고, 형질전환체를 선별하고, 목적 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하기에 적절하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
형질감염은 어느 코딩 서열이 사실상 발현되든지 안되든지 숙주 세포에 의한 발현 벡터의 획득을 말한다. 수많은 형질감염 방법, 예를 들어, CaP04 침전 및 전기천공이 당업자에게 알려져 있다. 이 벡터 작동의 어느 표시가 숙주 세포 내에서 발생할 때 성공적인 형질감염이 일반적으로 인식되다.
형질전환은 DNA가 염색체 외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 DNA를 원핵 숙주로 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그러한 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 행해진다. 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리가 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 세균 세포를 위해 일반적으로 사용된다. 다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 사용되는 원핵 세포는 당업계에 알려져 있고 선택된 숙주 세포의 배양을 위해 적당한 배지에서 성장된다. 적당한 배지의 예는 루리아 브로쓰(LB)와 필요한 영양 보충성분을 포함한다. 바람직한 태양에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선별적으로 허용하기 위하여, 발현 벡터의 제작에 기초하여 선택되는, 선별제를 함유한다. 예를 들어, 앰피실린이 앰피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 배지에 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 인산원 이외의 어느 필요한 보충성분이 또한 단독 또는 복합 질소원과 같은 다른 보충성분 또는 배지와의 혼합물로서 적절한 농도로 포함될 수 있다. 임의로 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포는 적당한 온도에서 배양된다. E. 콜라이 성장을 위해, 예를 들어, 바람직한 온도는 약 20 ℃ 내지 약 39 ℃, 보다 바람직하게는 약 25 ℃ 내지 약 37 ℃, 보다 더 바람직하게는 약 30 ℃ 범위이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라, 약 5 내지 약 9 범위의 어느 pH일 수 있다. E. 콜라이를 위해, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 보다 바람직하게는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 발현 벡터에서 사용되는 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적당한 조건 하에서 유도된다. 예를 들어, PhoA 프로모터가 전사를 제어하기 위해 사용되면, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위해 인산염-제한 배지에서 배양될 수 있다.
미생물에서 발현되는 여기에 기재된 폴리펩티드는 숙주 세포의 세포질간극으로 분비되고 그로부터 회수될 수 있다. 단백질 회수는 전형적으로, 일반적으로 삼투 쇼크, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해, 미생물을 파쇄하는 것을 포함한다. 일단 세포가 파쇄되면, 세포 찌꺼기나 전체 세포는 원심분리나 여과에 의해 제거될 수 있다. 단백질은 예를 들어, 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가 정제될 수 있다. 대안으로, 단백질은 배양 배지로 수송되고 그로부터 단리될 수 있다. 세포는 배양물로부터 제거되고 생산된 단백질의 추가 정제를 위해 여과 및 농축될 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 면역친화도 또는 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 G-75를 이용하는 젤 여과; 및 소수성 친화도 수지, 매트릭스에 고정화된 적당한 항원을 이용하는 리간드 친화도 및 웨스턴 블랏 어세이와 같은 통상적으로 알려진 방법을 이용하여 추가로 단리 및 동정될 수 있다.
원핵 숙주 세포 이외에, 진핵 숙주 세포 시스템 또한 당업계에 잘 확립되어 있다. 적당한 숙주는 CHO와 같은 포유류 세포주와 아래 기재된 것들과 같은 곤충 세포를 포함한다.
폴리펩티드 정제
생산된 폴리펩티드는 추가 어세이 및 사용을 위해 실질적으로 균질한 제제를 얻기 위하여 정제될 수 있다. 당업계에 알려진 표준 단백질 정제방법이 사용될 수 있다. 아래 과정은 적당한 정제 과정의 예시이다: 면역친화도 또는 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어, 세파덱스 G-75를 이용하는 젤 여과.
본 발명의 방법
본 발명은 활성화된 HGF β가 c-met에 직접 결합할 수 있고 그러한 결합이 적절한 물질 또는 분자로 저해될 수 있다는 발견에 기초한 다양한 방법을 제공한다.
다양한 물질 또는 분자(펩티드 등 포함)는 치료제로서 사용될 수 있다. 이들 물질 또는 분자는 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지의 방법에 따라 제제화될 수 있고, 이로써 여기에서의 산물은 약제학적으로 허용되는 담체 비히클과의 혼합물로 배합된다. 치료 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분을 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여(Remington's Pharmaceutical Sciences 16판, Osol, A. Ed.(1980)), 동결건조된 제제나 수용액의 형태로 저장을 위해 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량과 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨이나 솔비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및/또는 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
생체 내 투여에 사용되는 제제는 멸균이어야 한다. 이것은 동결건조와 재구성 전이나 후에, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
여기에서의 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사바늘에 의해 천공가능한 뚜껑을 갖는 정맥 내 용액 백이나 바이알에 위치된다.
투여 경로는 공지의 방법, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안구내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사나 주입, 국소 투여, 또는 서방성 시스템에 따른다.
본 발명의 약제학적 조성물의 용량과 원하는 약물 농도는 예상되는 특정 용도에 따라 변화할 수 있다. 적절한 용량이나 투여경로의 결정은 당연히 통상적인 내과의사의 기술 내에 있다. 동물 실험은 인간 요법을 위한 유효용량의 결정을 위한 믿을 수 있는 가이드를 제공한다. 유효용량의 종간 스케일링은 Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi 등, Eds., Pergamon Press, New York 1989, 42-96면에서 Mordenti, J. 및 Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics"에 의해 제기된 원리에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 물질 또는 분자의 생체 내 투여가 사용될 때, 정상적 용량은 투여 경로에 따라, 하루 당 포유류 체중의 약 10 ng/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이하, 바람직하게는 약 1 ㎍/㎏/일 내지 10 ㎎/㎏/일로 변할 수 있다. 특정 용량 및 전달방법에 관한 가이드는 문헌에 제공되어 있다; 예를 들어, 미국특허 제4,657,760호; 제5,206,344호; 또는 제5,225,212호를 참조하라. 상이한 제제가 상이한 치료 화합물 및 상이한 장애를 위해 유효하고, 한 기관이나 조직을 표적으로 하는 투여는 예를 들어 다른 기관이나 조직에 대한 것과는 상이한 방식으로 전달하는 것을 필요로 할 수 있을 것이 예상된다.
물질 또는 분자의 서방성 투여가 물질 또는 분자의 투여를 요구하는 어느 질환이나 장애의 치료에 적당한 방출 특성을 갖는 제제에서 원해지는 경우, 물질 또는 분자의 마이크로캡슐화가 착상된다. 서방출을 위한 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인간 성장 호르몬(rhGH), 인터페론-(rhIFN-), 인터류킨-2, 및 MN rgp120으로 성공적으로 수행되었다. Johnson 등, Nat . Med ., 2: 795-799(1996); Yasuda, Biomed. Ther ., 27: 1221-1223(1993); Hora 등, Bio / Technology, 8: 755-758(1990); Vaccine Design : The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 및 Newman, eds,(Plenum Press: New York, 1995), 439-462면에 있는 Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems"; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 및 미국특허 제5,654,010호.
이들 단백질의 서방성 제제는 그의 생체적합성 및 광범위한 생분해 성질로 인해 폴리-락틱-코글리콜산(PLGA) 폴리머를 이용하여 개발되었다. PLGA의 분해 산물, PLGA, 락트산과 글리콜산은 인체 내에서 신속하게 제거될 수 있다. 더욱이, 이 폴리머의 분해가능성은 그의 분자량 및 조성에 따라 수개월에서 수년까지 조정될 수 있다. M. Chasin 및 R. Langer(Eds.), Biodegradable Polymers as Drus Delivery Systems(Marcel Dekker: New York, 1990), 1-41면의: Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer".
본 발명은 HGF β쇄와 c-met 상호작용을 방해하는 것을 통해 HGF/c-met 신호전달을 저해하는 것들을 동정하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 포함한다. 활성화된(바람직하게는 자이모젠-양이 아닌) HGF β쇄 및/또는 c-met(c-met에 대한 활성화된 HGF β쇄의 결합을 저해하는 c-met 상의 위치)와 결합하거나 복합체를 형성하거나 활성화된 HGF β쇄의 다른 세포성 단백질과의 상호작용을 다르게 방해하는 화합물을 동정하기 위하여 스크리닝 어세이가 설계된다. 그러한 스크리닝 어세이는 그들을 소분자 약물 후보를 동정하기에 특히 적당하게 하는, 화학물질 라이브러리의 고-처리율 스크리닝에 적합한 어세이를 포함할 것이다.
어세이는 당업계에서 잘 특성분석되어 있는 단백질-단백질 결합 어세이, 생화학적 스크리닝 어세이, 면역어세이 및 세포-기초 어세이를 포함하는, 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
길항제에 대한 모든 어세이는 그들이 약물 후보를 활성화된 HGF β쇄와 c-met의 결합 상호작용에 관여하는 HGF β쇄(또는 그의 균등물) 및/또는 c-met 상의 위치와, 이들 두 성분이 상호작용하는 것을 허용하기에 충분한 조건 하와 시간 동안, 접촉시키는 것을 요구하는 점에서 공통적이다.
결합 어세이에서, 상호작용은 결합이고 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 단리되거나 검출될 수 있다. 특정 태양에서, 후보 물질 또는 분자는 고상, 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트 상에, 공유 또는 비-공유 결합에 의해 고정화된다. 비-공유적 결합은 일반적으로 고체 표면을 물질/분자의 용액으로 코팅하고 건조함으로써 달성된다. 대안으로, 고정화하고자 하는 물질/분자에 특이적인 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체와 같은, 고정화된 친화도 분자가 그것을 고체 표면에 앵커링하는데 사용될 수 있다. 어세이는 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비-고정화된 성분을 앵커링된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 가함으로써 수행된다. 반응이 완료될 때, 미반응된 성분이 예를 들어, 세척에 의해 제거되고, 고체 표면 상에 앵커링된 복합체가 검출된다. 원래 비-고정화된 성분이 검출가능한 표지를 가질 때, 표면 상에 고정화된 표지의 검출은 복합체 형성이 일어났음을 가리킨다. 원래 비-고정화된 성분이 표지를 갖지 않는 경우, 복합체 형성은 예를 들어, 고정화된 복합체에 특이적을 결합하는 표지된 항체를 이용하여 검출될 수 있다.
후보 화합물이 활성화된 HGF β쇄 또는 c-met와 상호작용하지만 결합하지 않으면, 폴리펩티드와 그의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위해 잘 알려진 방법에 의해 어세이될 수 있다. 그러한 어세이는 가교결합, 공동-면역침전 및 구배나 크로마토그래피 칼럼을 통한 공동-정제와 같은 전통적 접근법을 포함한다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 Chevray 및 Nathans, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 89: 5789-5793(1991)에 의해 개시되어 있는 바와 같이 Fields와 공동작업자(Fields 및 Song, Nature ( London ), 340: 245-246(1989); Chien 등, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 88: 9578-9582(1991))에 의해 기재된 효모-기초 유전자 시스템을 사용하여 모니터링될 수 있다. 효모 GAL4와 같은 많은 전사 활성화제는 하나는 DNA-결합 영역으로 작용하고, 나머지 하나는 전사-활성화 영역으로 작용하는, 두 물리적으로 분리된 모듈 영역으로 이루어진다. 상기 간행물에 기재된 효모 발현 시스템(일반적으로 "2-하이브리도 시스템"으로 언급되는)은 이 성질을 이용하며, 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 영역에 융합되는 하나와, 후보 활성화 단백질이 활성화 영역에 융합되는 다른 하나인, 두 하이브리드 단백질을 사용한다. GAL4-활성화된 프로모터의 제어 하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 의존한다. 상호작용 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질로 검출된다. 2-하이브리드 기술을 이용하여 두 특정 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 동정하기 위한 완전 키트(매치메이커(MATCHMAKER)™)가 클론테크로부터 상업적으로 입수가능하다. 이 시스템은 또한 이들 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기를 선정하는 것 뿐 아니라 특정 단백질 상호작용에 관련된 단백질 영역을 맵핑하도록 확장될 수 있다.
활성화된 HGF β쇄와 c-met의 상호작용을 방해하는 화합물은 아래와 같이 시험될 수 있다: 보통 활성화된 HGF β쇄와 c-met(또는 c-met 상의 동족 활성화된 HGF β쇄 결합 위치를 포함하는 그의 균등물)를, 두 산물의 상호작용과 결합을 허용하는 조건 하 및 시간 동안, 함유하는 반응 혼합물이 제조된다. 후보 화합물의 결합을 저해하는 능력을 시험하기 위하여, 반응을 시험 화합물 부재 및 존재 하에 실행한다. 부가하여, 양성 대조로 역할하기 위하여, 위약을 제3 반응 혼합물에 가할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 활성화된 HGF β쇄 및/또는 c-met(또는 상기한 바와 같은 그의 균등물) 간의 결합(복합체 형성)이 여기 위에 기재된 바와 같이 모니터링된다. 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서는 아니지만 대조 반응(들)에서 복합체의 형성은 시험 화합물이 활성화된 HGF β쇄와 c-met의 상호작용을 방해함을 가리킨다.
저해제(길항제와 같은)를 어세이하기 위하여, 활성화된 HGF β쇄를 포함하는 2-쇄 HGF를 특정 활성에 대해 스크리닝하고자 하는 화합물과 함께 세포에 가할 수 있고, 2-쇄 HGF의 존재 하에 관심있는 활성을 저해하는 화합물의 능력은 그 화합물이, HGF α쇄(예를 들어, 2-쇄 HGF 또는 단일 쇄 HGF에서 발견되는)와는 아니지만 활성화된 HGF β쇄와 특이적으로 결합하거나 상호작용하는 그의 능력을 결정함으로써 추가로 확인될 수 있는 성질인, 활성화된 HGF β쇄의 길항제일 수 있음을 암시한다.
잠재적 길항제의 보다 구체적인 예는 활성화된 HGF β쇄 및/또는 c-met 상의 그의 결합 위치에 결합하는 올리고뉴클레오티드(앱타머일 수 있는), 특히 폴리- 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일-쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 및 그러한 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화된 버전, 및 인간 항체 및 항체 단편을 제한없이 포함하는 항체를 포함한다. 대안으로, 잠재적 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어, HGF β쇄 결합 상대를 인식하지만 영향을 미치지 않음으로써, 야생형 HGF β쇄의 작용을 경쟁적으로 저해하는 돌연변이된 형태의 HGF β쇄일 수 있다.
잠재적 길항제는 HGF β쇄의 활성 위치, c-met 상의 활성화된 HGF β쇄의 결합 위치, 또는 활성화된 HGF β쇄의 다른 관련 결합 위치에 결합함으로써, 활성화된 HGF β쇄의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는, 소분자를 포함한다. 소분자의 예는 소 펩티드 또는 펩티드-양 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
이들 소분자는 여기 위에 논의된 스크리닝 어세이 중 어느 하나 이상 및/또는 당업자에게 잘 알려져 있는 어느 다른 스크리닝 기술에 의해 동정될 수 있다.
여기에서 기재된 바와 같이, 본 발명의 물질/분자는 펩티드일 수 있다. 그러한 펩티드를 수득하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 적당한 표적 항원에 대한 결합제에 대해 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 일 태양에서, 적당한 표적 항원은 여기에 상세히 기재된, 활성화된 HGF β쇄(또는 c-met에 대한 결합 위치를 포함하는 그의 일부)를 포함할 것이다. 예를 들어, 적당한 표적 항원은 여기에 기재된 바와 같은 활성화된 HGF β쇄 폴리펩티드, 또는 2-쇄 HGF 폴리펩티드(여기에 기재된 바와 같이, 활성화된 HGF β쇄 성분을 포함하는)이다. 일부 예에서, 특히 목적 물질/분자가 HGF α쇄 및/또는 자이모젠-형태 HGF β쇄는 아니지만 활성화된 HGF β쇄에 어느 유의한 정도로 결합하는 것인 경우, 후보 결합제는 또한 자이모젠 형태(즉, 비활성화된 HGF β쇄)(예를 들어, 단일 쇄 HGF)의 HGF β쇄를 포함하는 폴리펩티드에 대한 실질적 결합 능력의 결여에 대해 스크리닝될 수 있다. 펩티드의 라이브러리는 당업계에 잘 알려져 있고, 또한 당업계 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, Clark 등, 미국특허 제6,121,416호를 참조하라. 파지 외피 단백질과 같은, 이종 단백질 성분에 융합된 펩티드의 라이브러리는 예를 들어, 상기 Clark 등에 기재되어 있는 바와 같이, 당업계에 잘 알려져 있다. 일 태양에서, c-met에 대한 활성화된 HGF β쇄의 결합을 차단하는 능력을 갖는 펩티드는 아미노산 서열 VDWVCFRDLGCDWEL, 또는 그의 변이체를 포함한다. 제1 펩티드 결합제의 변이체는 관심있는 특성(예를 들어, 표적 결합 친화도 증진, 증진된 약동력학, 감소된 독성, 향상된 치료 지수 등)을 얻기 위하여 펩티드의 돌연변이체를 스크리닝함으로써 생성될 수 있다. 돌연변이유발 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 더욱이, 스캐닝 돌연변이유발 기술(알라닌 스캐닝에 기초한 것들과 같은)이 펩티드 내의 개개 아미노산 잔기의 구조적 및/또는 기능적 중요성을 평가하는데 특히 도움을 줄 수 있다.
아미노산 서열 VDWVCFRDLGCDWEL을 포함하는 펩티드 또는 그의 변이체와 같은, 본 발명의 후보 물질/분자의 HGF/c-met 신호전달 및/또는 상기 신호전달과 관련된 생물학적 활성을 변조하는 능력의 결정은 예를 들어, 상기 Okigaki 등; 상기 Matsumoto 등; Date 등, FEBS Let.(1997), 420: 1-6; 상기 Lokker 등; 상기 Hartmann 등에 기재되어 있는 바와 같이, 당업계에 잘 확립되어 있는, 시험관 내 또는 생체 내 어세이에서 물질/분자의 변조 능력을 시험함으로써 수행될 수 있다.
항-활성화 HGF β쇄 항체
본 발명은 추가로 항-활성화 HGF β쇄 항체의 사용을 포함하는 방법을 제공한다. 예시적 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이성 및 헤테로포접체 항체를 포함한다.
1. 폴리클로날 항체
항-활성화 HGF β쇄 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조방법은 당업자에게 알려져 있다. 폴리클로날 항체는 포유류에서 예를 들어, 면역화제와 원하는 경우, 애쥬번트의 하나 이상의 주사에 의해 유발될 수 있다. 전형적으로, 면역화제 및/또는 애쥬번트는 포유류에 여러 피하 또는 복강내 주사에 의해 주사될 것이다. 면역화제는 활성화된 HGF β쇄(또는 그의 일부) 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화제를 면역화되는 포유류에서 면역원적인 것으로 알려져 있는 단백질에 포접하는 것이 유용할 수 있다. 그러한 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 및 대두 트립신 저해제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 애쥬번트의 예는 프로인트 완전 애쥬번트와 MPL-TDM 애쥬번트(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 부당한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다.
2. 모노클로날 항체
항-활성화 HGF β쇄 항체는, 대안으로, 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 Kohler 및 Milstein, Nature, 256:495(1975)에 의해 기재된 것들과 같은, 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터나 기타 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발하기 위하여 면역화제로 면역화된다. 대안으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 전형적으로 활성화된 HGF β쇄(또는 그의 일부) 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포를 원하면 말초혈액 림프구("PBLs")가 사용되거나, 비-인간 포유류 출처를 원하면 지라 세포나 림프절 세포가 사용된다. 그런 다음 림프구는 폴리에틸렌글리콜과 같은 적절한 융합제를 이용하여 불멸화된 세포주와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press(1986), 59-103면). 불멸화된 세포주는 보통 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 보통, 랫트나 마우스의 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은, 불멸화된 세포의 성장이나 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적당한 배양 배지에 배양된다. 예를 들어, 친 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)를 결여하면, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 물질이 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는, 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")을 포함할 것이다.
바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고 수준 발현을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것들이다. 보다 바람직한 불멸화된 세포주는 예를 들어, 캘리포니아, 샌디에고, 샐크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)와 버지니아, 매나싸스, 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수가능한 쥐 골수종 주이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기재되어 있다[Kozbor, J. Immunol ., 133: 3001(1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York(1987) 51-63면].
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 활성화된 HGF β쇄에 대한 모노클로날 항체의 존재에 대해 어세이된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전이나 방사성면역어세이(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISA)와 같은 시험관 내 결합 어세이에 의해 결정된다. 그러한 기술과 어세이는 당업계에 알려져 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어, Munson 및 Pllard, Anal . Biochem ., 107: 220(1980)의 스캣챠드 분석에 의해 결정될 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포가 동정된 후, 클론은 희석 과정을 제한함으로써 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다[상기 Goding]. 이 목적을 위해 적당한 배양 배지는 예를 들어, 둘베코즈 변형 이글즈 배지 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안으로, 하이브리도마 세포는 포유류에서 복수로 생체 내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제과정에 의해 배양 배지 또는 복수 액으로부터 단리되거나 정제될 수 있다.
모노클로날 항체는 또는 미국특허 제4,816,567호에 기재된 것들과 같이, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고 통상적인 과정을 이용하여 서열결정된다(예를 들어, 쥐 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여). 본 발명의 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 출처로 역할한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터로 위치되어, 그런 다음 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 E. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 얻을 수 있다. DNA는 또한 예를 들어, 상동적 쥐 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변영역의 코딩 서열을 치환하거나[미국특허 제4,816,567호; 상기 Morrison 등], 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전체 또는 일부를 공유적으로 결합시킴으로써, 수식될 수 있다. 그러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변영역을 치환하거나, 본 발명의 항체의 항원-결합 위치의 가변영역을 치환하여 키메라 이가 항체를 창제할 수 있다.
항체는 일가 항체일 수 있다. 일가 항체의 제조방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 수식된 중쇄의 재조합적 발현을 포함한다. 중쇄는 일반적으로 중쇄 가교결합을 방지하기 위하여 Fc 부위의 어느 점에서 절단된다. 대안으로, 가교결합을 방지하기 위하여 관련 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.
시험관 내 방법이 또한 일가 항체를 제조하는데 적당하다. 항체의 그의 단편, 특히 Fab 단편을 셍산하기 위한 분해가 당업계에 알려진 일상적인 기술을 이용하여 달성될 수 있다.
항체는 또한 활성화된 HGF β쇄(또는 균등물)에 대해 적당한/원하는 친화도로 결합하는 항체 또는 항체 단편에 대해 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 생성될 수 있다. 그러한 기술은 예를 들어, 미국특허 제5,750,373호; 제5,780,279호; 제5,821,047호; 제6,040,136호; 제5,427,908호; 제5,580,717호, 및 그 안의 참조문헌에 개시되어 있는 바와 같이, 당업계에 잘 알려져 있다.
3. 인간 및 인간화된 항체
본 발명의 항-활성화 HGF β쇄 항체는 추가로 인간화된 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간(예를 들어, 쥐) 항체의 인간화된 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 서브서열)이다. 인간화된 항체는 수혜자의 상보성 결정 부위(CDR)가 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은, 비-인간 종(공여자 항체)으로부터의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 인간화된 항체는 또한 수혜자 항체나 수입된 CDR이나 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 부위가 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 부위가 인간 면역글로불린 공통 서열의 것들인, 실질적으로 모든 적어도 하나, 전형적으로 두 개의, 가변영역을 포함할 것이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다[Jones 등, Nature , 321: 522-525(1986); Reichmann 등, Nature , 332: 323-329(1988); 및 Presta, Curr . Op . Struct . Biol ., 2: 593-596(1992)].
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비인간 출처로부터 그로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 자주 전형적으로 "수입(import)" 가변영역으로부터 취해지는, "수입" 잔기로 언급된다. 인간화는 Winter와 공동작업자의 방법에 따라 설치류 CDR들이나 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열 대신 치환함으로써, 필수적으로 수행될 수 있다[Jones 등, Nature , 321: 522-525(1986); Riechmann 등, Nature , 332: 323-327(1988); Verhoeyen 등, Science , 239: 1534-1536(1988)]. 따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 실질적으로 완전한 인간 가변영역 미만이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된, 키메라 항체(미국특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기와 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 위치로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는, 당업계에 알려져 있는 다양한 기술을 이용하여 제조될 수 있다{Hoogenboom 및 Winter, J. Mol . Biol. 227: 381(1991); Marks 등, J. Mol . Biol ., 222: 581(1991)]. Cole 등과 Boerner 등의 기술이 또한 인간 모노클로날 항체의 제조를 위해 이용가능하다(Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77면(1985) 및 Boerner 등, J. Immunol ., 147(1): 86-95(1991)]. 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 위치를 형질전환 동물, 예를 들어 내생적 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스로 도입함으로써 제조될 수 있다. 공격 시, 유전자 재배열, 조립 및 항체 레파토리를 포함하는, 모든 측면에서 인간에서 보여지는 것을 밀접하게 닮은 인간 항체 생산이 관찰된다. 이 접근법은 예를 들어, 미국특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 아래 과학 간행물에 기재되어 있다: Marks 등, Bio/Technology 10, 779-783(1992); Lonberg 등, Nature 368, 856-859(1994); Morrison, Nature 368, 812-13(1994); Fishwild 등, Nature Biotechnology 14, 845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826(1996); Lonberg 및 Huszar, Intern . Rev . Immunol . 13, 65-93(1995).
항체는 또한 상기한 바와 같이 공지의 선별 및/또는 돌연변이유발 방법을 이용하여 친화도 성숙될 수 있다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 성숙 항체가 제조되는 출발 항체(일반적으로 쥐, 인간화된 또는 인간) 보다 5배, 보다 바람직하게는 10배, 보다 더 바람직하게는 20 또는 30배인 친화도를 갖는다.
4. 이중특이성 항체
이중특이성 항체는 적어도 두 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는, 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화된, 항체이다. 본 경우에는, 결합 특이성 중 하나는 활성화된 HGF β쇄 및/또는 c-met의 HGF β쇄 결합 위치에 대한 것이고, 나머지 하나는 어느 다른 항원, 바람직하게는 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.
이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합적 생산은 두 중쇄가 상이한 특이성을 갖는, 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초한다[Millstein 및 Cuello, Nature 305, 537-539(1983)]. 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 무작위적 분류로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 단지 하나만이 정확한 이중특이성 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산한다. 정확한 분자의 정제는 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 보통 달성된다. 유사한 과정이 1993년 5월 13일 공개된 WO 93/08829와, Traunecker 등, EMBO J., 10: 3655-3659(1991)에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 위치)을 갖는 항체 가변영역이 면역글로불린 불변영역 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 경첩, CH2 및 CH3 부위의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변영역과이다. 융합물 중 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 위치를 함유하는 제1 중쇄 불변영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA가 별도 발현 벡터에 삽입되고, 적당한 숙주 유기체에 공동형질감염된다. 이중특이성 항체를 생성하는 추가 상세사항에 대해서는, 예를 들어, Suresh 등, Methods in Enzymology , 121: 210(1986)을 참조하라.
WO 96/27011에 기재된 다른 접근법에 따르면, 항체 분자 쌍 간의 경계는 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로다이머의 백분율을 최대화하기 위하여 조작될 수 있다. 바람직한 경계는 항체 불변영역의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "강"(cavities)이 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것들(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 경계면에 창출된다. 이것은 호모다이머와 같은 다른 원치않는 최종산물에 비해 헤테로다이머의 수율을 증가시키기 위한 기작을 제공한다.
이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이중특이성 항체)로서 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이성 항체를 생성하기 위한 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. Brennan 등, Science, 229: 81(1985)는 완전한 항체가 단백분해적으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 과정을 기술하고 있다. 이들 단편은 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 이황화물 형성을 방지하기 위하여 디티올 복합화제 나트륨 아르세나이트 존재 하에 환원된다. 그런 다음 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 그런 다음 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 균등 몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이성 항체를 형성한다. 생산된 이중특이성 항체는 효소의 선별적 고정화를 위한 물질로 사용될 수 있다.
Fab' 단편이 E. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 이중특이성 항체를 형성할 수 있다. Shalaby 등, J. Exp . Med ., 175: 217-225(1992)는 완전히 인간화된 이중특이성 항체 F(ab')2 분자의 제조를 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 E. 콜라이로부터 별도로 분비되고 시험관 내에서 특이적 화학 커플링에 가해져 이중특이성 항체를 형성하였다. 그렇게 형성된 이중특이성 항체는 ErbB2 수용체를 과잉발현하는 세포와 정상적 인간 T 세포에 결합할 뿐 아니라, 인간 유방암 표적에 대해 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 이중특이성 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기술이 또한 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 류신 지퍼를 이용하여 생산되었다. Kostelny 등, J. Immunol ., 148(5): 1547-1553(1992). Fos와 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 두 상이한 항체의 Fab' 부분에 결합되었다. 항체 호모다이머는 경첩부에서 환원되어 모노머를 형성한 후 재산화되어 항체 헤테로다이머를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 호모다이머를 생산하기 위해 사용될 수 있다. Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90: 6444-6448(1993)에 의해 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 대체 기작을 제공하였다. 단편은 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 두 영역 간의 쌍형성을 허용하지 못하는 링커에 의해 경쇄 가변영역(VL)에 연결된 중쇄 가변영역(VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH와 VL 영역은 다른 단편의 상보적인 VL과 VH 영역과 쌍을 형성하도록 강제됨으로써 두 항원-결합 위치를 형성한다. 단일-쇄 Fv(scFv) 다이머를 이용하여 이중특이성 항체 단편을 제조하는 다른 전략 또한 보고되어 있다. Gruber 등, J. Immunol ., 152: 5368(1994)를 참조하라.
2 이상의 결합가를 갖는 항체가 착상된다. 예를 들어, 삼중특이성 항체가 제조될 수 있다. Tutt 등, J. Immunol. 147: 60(1991).
예시적 이중특이성 항체는 활성화된 HGF β쇄 상의 두 상이한 에피토프 또는 활성화된 HGF β쇄 상의 에피토프와 다른 폴리펩티드(예를 들어 c-met 또는 HGF α쇄) 상의 에피토프에 결합할 수 있다.
5. 헤테로포접체 항체
헤테로포접체 항체 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 헤테로포접체 항체는 두 공유적으로 결합된 항체로 이루어진다. 그러한 항체는 예를 들어, 원치않는 세포에 대해 면역 체계 세포를 표적화하기 위해[미국특허 제4,676,980호], 또한 HIV 감염의 치료를 위해[WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089] 제안되어 있다. 헤테로포접체 항체는 가교결합제를 관여시키는 것들을 포함하는, 합성 단백질 화학에서 공지의 방법을 이용하여 시험관 내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소가 이황화물 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성함으로써 제작될 수 있다. 이 목적을 위한 적당한 시약의 예는 이미노티올레이트와 메틸-4-머캅토부티르이미데이트와 예를 들어 미국특허 제4,676,980호에 개시된 것들을 포함한다.
6. 효과기 기능 조작
예를 들어, 암을 치료하는데 있어서 항체의 효능을 증진시키기 위하여, 본 발명의 항체를 효과기 기능에 관하여 수식하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)가 Fc 부위로 도입됨으로써, 이 부위에서 쇄간 이황화물 결합 형성을 허용할 수 있다. 그렇게 생성된 호모다이머성 항체는 향상된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸화 및 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. Caron 등, J. Exp Med ., 176: 1191-1195(1992) 및 Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922(1992)를 참조하라. 증진된 항-종양 활성을 갖는 호모다이머성 항체가 또한 Wolff 등, Cancer Research , 53: 2560-2565(1993)에 기재되어 있는 바와 같이 헤테로이관능성 가교결합제를 이용하여 제조될 수 있다. 대안으로, 이중 Fc 부위를 가지고 이로써 증진된 보체 용해와 ADCC 능력을 가질 수 있는 항체가 조작될 수 있다. Stevenson 등, Anti - Cancer Drug Design, 3: 219-230(1989)를 참조하라.
7. 면역포접체
본 발명은 또한 화학요법제, 독소(예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성포접체)와 같은 세포독성에 포접된 항체를 포함하는 면역포접체에 관한 것이다.
*그러한 면역포접체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테이라 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데킨 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPⅠ, PAPⅡ 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 리스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성핵종이 방사성포접된 항체의 생산을 위해 이용가능하다. 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re을 포함한다. 항체와 세포독성제의 포접체는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체(디메틸아디피미데이트 HCL과 같은), 활성 에스테르(디석신이미딜 수베르에이트와 같은), 알데히드(글루타르알데히드와 같은), 비스-아지도 화합물(비스(p-아지도벤조일)헥산디아민과 같은), 비스-디아조늄 유도체(비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민과 같은), 디이소시아네이트(톨리엔 2,6-디이소시아네이트와 같은), 및 비스-활성 불소 화합물(1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은)과 같은 다양한 이관능성 단백질 커플링제를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소가 Vitetta 등, Science 238: 1098(1987)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)이 항체에 방사성핵종을 포접하기 위한 예시적 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조하라.
다른 태양에서, 항체는 항체-수용체 포접체가 환자에게 투여된 후, 세정제를 이용하여 순환으로부터 미결합된 포접체를 제거한 후 세포독성제(예를 들어, 방사성핵종)에 포접된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)를 투여하는 종양 예비표적화에 사용하기 위해 "수용체"(스트렙타비딘과 같은)에 포접될 수 있다.
8. 면역리포좀
여기에 개시된 항체는 또한 면역리포좀으로 제제화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 Epstein 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 82: 3688(1985); Hwang 등, Proc . Natl Acad . Sci . USA , 77: 4030(1980); 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기재된 바와 같은, 당업계에 알려진 방법에 의해 제조된다. 순환시간이 증가된 리포좀은 미국특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 정해진 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포좀을 생성한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 이황화물-상호교환 반응을 통해 Martin 등, J. Biol . Chem . 257: 286-288(1982)에 기재된 바와 같은 리포좀에 포접될 수 있다. 화학요법제(독소루비신과 같은)가 임의로 리포좀 내에 함유된다. Gabizon 등, J. National Cancer Inst . 81(19): 1484(1989)를 참조하라
9. 항체의 약제학적 조성물
여기 위에 기재된 스크리닝 어세이에 의해 동정된 다른 분자 뿐 아니라 항체는 약제학적 조성물의 형태로 다양한 장애의 치료를 위해 투여될 수 있다.
전체 항체가 저해제로서 사용되면, 내재화 항체가 바람직하다. 그러나, 리포펙션 또는 리포좀도 본 발명의 물질/분자를 원하는 세포로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 최소의 저해 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열에 기초하여, 활성화된 HGF β쇄 및/또는 c-met 상의 HGF β쇄 결합 위치에 결합하고/거나 활성화된 HGF β쇄와 c-met 사이의 상호작용을 방해하는 능력을 보유하는 펩티드 분자가 설계될 수 있다. 그러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/거나 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Marasco 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 90: 7889-7893(1993)을 참조하라. 여기에서의 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 미치지 않는 보충적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 대안으로, 또는 부가하여, 조성물은 그의 기능을 증진시키는 물질, 예를 들어, 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제 또는 성장-저해제를 포함할 수 있다. 그러한 분자는 의도되는 목적을 위해 효과적인 양으로 배합물에 적당하게 존재한다.
활성성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이트화 기술이나 경계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 그러한 기술은 상기 Remington's Pharmaceutical Sciences에 개시되어 있다.
생체 내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균이어야만 한다. 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적당한 예는 매트릭스가 성형 물품, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐 형태인, 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로젤(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)나 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드(미국특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™(락트산-글리콜산 공중합체와 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트와 락트산-글리콜산과 같은 폴리머가 100 일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하는 반면, 어느 하이드로젤은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 단백질이 장시간 체내에 남아있을 때, 그들은 37 ℃에서 수분에 대한 노출의 결과로 변성하거나 응집하여, 생물학적 활성의 상실이나 면역원성의 가능한 변화를 일으킬 수 있다. 합리적인 전략이 관여되는 기작에 따라 안정화를 위해 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기작이 티오-이황화물 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 설프하이드릴 잔기를 수식하고, 산성 용액으로부터 동결건조하고, 수분 함량을 제어하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 폴리머 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
하기하는 것은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 위에 제공된 일반적인 설명 하에, 다양한 다른 태양이 실시될 수 있음이 이해된다.
<실시예>
재료 및 방법
재료
C-말단 His6 택을 함유하는 성숙 형태의 Met ECD(Glu25 내지 Gln929) 영역을 곤충 세포에서 발현시키고 Ni-NTA 금속 킬레이트 및 아래 기재된 바와 같은 표준 프로토콜을 이용하는 젤 여과 크로마토그래피에 의해 정제하였다. Met-IgG 융합 단백질을 이전에 기재된 바(Mark 등, 1992)와 같이 수득하였다.
HGF β 단백질의 발현 및 정제
HGF β 단백질을 산물을 배지로 분비하기 위한 신호 서열을 함유하는, 배큘로바이러스 분비 벡터 pAcGP67(CA, 샌디에고, 파밍겐, BD 바이오사이언시즈)를 이용하여 곤충 세포에서 발현시켰다. 모든 제작물은 카르복시 말단에 His6 택을 함유하였고 Ni-NTA 금속 킬레이트 및 젤 여과 크로마토그래피에 의해 균질하게(>95% 순도) 정제하였다. 야생형 HGF β를 위해, 잔기 Val495[c16] 내지 Ser728[c250]의 HGF β-쇄를 코딩하는 cDNA 단편을 Val495[c16]이 분비 신호 서열 바로 다음에 삽입되도록 PCR에 의해 클로닝하였다. 부위-특이적 돌연변이유발을 올리고뉴클레오티드 5'CCTAATTATGGATCCACAATTCCTG3'으로 퀵체인지(QuickChange)™(CA, 라 졸라, 스트라타진)를 이용하여 수행하여 프로테아제-양 영역의 노출된 쌍을 이루지 않은 Cys의 잠재적 연루를 방지하기 위하여 Cys604[c128]에서 Ser으로의 돌연변이(HGF β)를 함유하는 HGF β를 제조하였다. HGF β 돌연변이체 Y513A[c36], R516A[c39], Q534A[c57], D578A[c102], Y619A[c143], Y673A[c195], V692A[c214], P693D[c215], G694E[c216], R695A[c217], G696A[c219], I699A[c221a] 및 R702A[c224]를 HGF β 제작물(C604S 돌연변이를 갖는)에서 상기한 바와 같이 제조하였다. HGF β 돌연변이체 C561S[c78](즉, C561S:C604S)를 또한 양 유리 시스테인을 제거하기 위하여 HGF β 제작물에서 상기한 바와 같이 제조하였다. 프로HGF β는 잔기 Asn479로부터 Ser728까지 HGF를 코딩하고 올리고뉴클레오티드 5'CAAAACGAAACAATTGGAAGTTGTAAATGGGATTC3'을 이용하여 만들어진 R494E 돌연변이를 갖는다. Cys487과 Cys604 사이에서 추정되는 이황화물 형성을 허용하기 위하여 시스테인을 이 제작물에서 변화시키지 않았다. 아미노산 위치의 넘버링은 아래와 같다: 전장 HGF 서열[키모트립시노젠 넘버링].
목적하는 삽입체를 함유하는 배큘로바이러스 벡터를 제조자의 지시(CA, 샌디에고, BD 바이오사이언시즈 파밍겐)에 따라 배큘로골드(Baculogold)™ 발현 시스템을 통해 TNM-FH 배지에서 플레이트 상에서 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9) 세포로 형질감염시켰다. 2-4 라운드의 바이러스 증폭 후, 10 ㎖의 바이러스 스탁을 사용하여 TNM-FH 배지 중 5×105 세포/㎖의 현탁액 중 하이 파이브(High Five)™ 세포(CA, 샌디에고. 인비트로젠) 1 ℓ를 감염시켰다. 15 분간 8,000×g에서의 원심분리에 의해 배양 배지를 수획하기 전에 72 시간 동안 27 ℃에서 배양물을 인큐베이션하였다. 세포 배양 배지를 4 ㎖ Ni-NTA 아가로스 칼럼(CA, 발렌시아, 퀴아젠)에 적용하였다. 4 칼럼 부피의 50 mM Tris·HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 mM 이미다졸로 세척한 후, HGF β 단백질을 50 mM Tris·HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸로 용출하였다. 용출물을 풀링하고 10 mM HEPES pH 7.2, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2로 평형화된 슈퍼덱스(Superdex)™-200 칼럼(NJ, 피스카타웨이, 아머샴 바이오사이언시즈)에 적용하였다. 단백질 피크를 모으고 센트리프렙(Centriprep)™ YM-10(MA, 베드포드, 밀리포어)을 이용하여 농축하였다. 분획을 쿠마시 블루로 염색된 12% SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 모든 돌연변이를 DNA 서열결정과 질량 분광계측에 의해 검증하였다. 단백질 농도를 정량적 아미노산 분석에 의해 결정하였다. N-말단 서열결정은 프로HGF β 및 HGF β를 위해 존재하는 단일의 정확한 N-말단을 밝혔다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE 상에서 정확한 분자 질량을 나타내었다; 서열로부터 예상된 것 보다 ∼2 kDa 더 높은 분자 질량을 갖는 질량 분광계측 데이터와 일치하는, 관찰된 여러 밴드는 불균일한 글리코실화에 기인하는 것 같았다.
전장 HGF 단백질의 제작, 발현 및 정제
재조합 단백질을 일시적 형질감염에 의해 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 1 ℓ 배양물에서 제조하였다(Peek 등, 2002). 아미노산 변화를 부위-특이적 돌연변이유발(Kunkel, 1985)에 의해 도입하고 DNA 서열결정에 의해 검증하였다. 발현 배지(F-12/둘베코즈 변형 이글즈 배지)는 1%(v/v) 초저 IgG 우태아혈청(FBS)(NY, 그랜드 아일랜드, 집코)을 함유하였다. 8 일후, 배지를 수획하고 FBS로 보충하여 5-10%(v/v)의 최종 함량을 제공하였다. 37 ℃에서 2-3 일간 더 인큐베이션하여 완전한 단일-쇄 HGF 전환을 일으켰다. 이 단계를 활성화 절단 위치(R494E)와 α-쇄에 있는 프로테아제-감수성 위치(R424A)에 아미노산 변화를 갖는, 절단불가능한 단일 쇄 형태, 프로HGF의 발현을 위해 생략하였다(Peek 등, 2002). 돌연변이체 단백질을 기재된 바와 같이(Peek 등, 2002) HiTrap-세파로스 SP 양이온 교환 크로마토그래피(NJ, 피스카타웨이, 아머샴 바이오사이언시즈)에 의해 배지로부터 정제하였다. 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE(4-20% 구배 젤)와 심플리 블루 세이프스테인으로의 염색에 의한 조사는 모든 돌연변이체 HGF 단백질이 >95% 순수하고 단일-쇄 형태로 남아있는 프로HGF를 제외하고 α/β 헤테로다이머로 완전히 전환되었음을 보여주었다. 각각의 돌연변이체에 대한 단백질 농도를 정량적 아미노산 분석에 의해 결정하였다.
표면 플라스몬 공명에 의한 HGF β와 Met 결합 친화도
Met에 대한 HGF β의 결합 친화도를 바이아코어 3000 장치(NJ, 피스카타웨이, 바이아코어, Inc.)를 이용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 결정하였다. Met ECD 영역을 제조자의 지시에 따라 ∼2000 공명 단위의 아민 커플링을 이용하여 CM5 칩 상에 고정화하였다. 12.5 nM 내지 100 nM 범위의 10 mM HEPES pH 7.2, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2 중의 HGF β(즉, C604S 돌연변이체)의 농도 시리즈를 40 초간 20 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 결합된 HGF β를 10 분간 해리되도록 하였다. 적절한 배경 제거를 수행하였다. 결합(kon) 및 해리(koff) 속도 상수를 장치가 제공된 글로벌 핏팅 프로그램에 의해 얻었다; koff/kon의 비율을 사용하여 해리 상수(Kd)를 계산하였다.
Met 에 대한 HGF β의 결합 및 경쟁 결합 ELISA
마이크로타이터 플레이트(덴마크, 로스킬데, 눙크)를 밤새 4 ℃에서 50 mM 탄산나트륨 완충액, pH 9.6 중 2 ㎍/㎖의 토끼 항-인간 IgG Fc 특이적 항체(PA, 웨스트 그로브, 잭슨 이뮤노리서치 래보라토리)로 코팅하였다. HBS 완충액(50 mM HEPES pH 7.2, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2 및 0.1% Tween-20) 중 1% BSA로 차단한 후, 1 ㎍/㎖ Met-IgG 융합 단백질(Mark 등, 1992)을 가하고 플레이트를 실온에서 부드럽게 진탕하면서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. HBS 완충액으로 세척한 후, HGF β 단백질을 1 시간 동안 가하였다. 결합된 HGF β를 항-His-HRP(CA, 발렌시아, 퀴아젠)를 이용하여 검출한 후 TMB/H202 기질(MD, 게이스버그, KPL)을 가하였다. 반응을 1 M H3PO4로 중지시키고 A450을 분자 장치 스펙트라맥스 플러스384 마이크로플레이트 리더 상에서 측정하였다. 최대 결합의 절반을 제공하는 유효농도(EC50)를 칼레이다그래프(PA, 리딩, 시너지 소프트웨어)를 이용하여 4 지수 피트에 의해 결정하였다.
경쟁 ELISA를 개발하기 위하여, 야생형 HGF β를 실온에서 2 시간 동안 20-배 몰 과량의 바이오틴-말레이미드(IL, 락포드, 피어스)를 이용하여 바이오티닐화하였다. 플레이트를 바이오티닐화된 야생형 HGF β를 사용하고 HRP-뉴트라비딘(IL, 락포드, 피어스)을 이용하여 검출한 것을 제외하고는 상기한 바와 같이 처리하였다. 경쟁 어세이는 250 nM 바이오티닐화된 야생형 HGF β와 표시된 바와 같이 다양한 농도의 단백질(예를 들어, 비표지된 HGF β 변이체, HGF(즉, 2-쇄) 또는 프로HGF(즉, 단일 쇄 형태의 HGF))의 혼합물을 함유하였다. 실온에서 1 시간 인큐베이션한 후, 플레이트에 결합된 바이오티닐화된 야생형 HGF β의 양을 상기한 바와 같이 측정하였다. IC50 값을 데이터를 4-지수 등식에 핏팅함으로써 결정하였다(PA, 리딩, 시너지 소프트웨어, 칼레이다그래프).
Met 에 대한 HGF 돌연변이체의 결합
바이오티닐화된 HGF를 시그마 면역프로브 바이오티닐화 키트(MO, St. 루이스, 시그마)를 이용하여 제조하였다. 마이크로타이터 플레이트를 상기와 같이 토끼 항-인간 IgG Fc 특이적 항체로 코팅하였다. 플레이트를 PBS 0.05%(v/v) Tween-20에서 세척한 후 실온에서 PBS, pH 7.4 중 0.5%(w/v)의 BSA, 0.05% Tween-20으로 1 시간 인큐베이션하였다. 세척 후, 다양한 농도의 HGF 돌연변이체, 야생형 HGF β와 함께, 1 nM 바이오티닐화된 HGF 및 0.2 nM Met-IgG 융합 단백질(Mark 등, 1992)을 웰에 가하고 2 시간 인큐베이션하였다. 세척 후, 결합된 바이오티닐화된 HGF를 희석된(1:3000) 스트렙타비딘 호스래디쉬 퍼옥시다제 포접체(CA, 사우쓰 샌프란시스코, 지메드)에 이어서 슈어블루(SureBlue) TMB 퍼옥시다제 기질 및 중지 용액 TMB 스탑(MD, 게이스버그, KPL)을 가하여 검출하였다. 상기한 바와 같이 A450을 측정하고 IC50 값을 결정하였다. 상대적 결합 친화도를 IC50(돌연변이)/IC50(야생형 HGF)로 표현한다.
Met 의 HGF -의존적 인산화
키나제 수용체 활성화 어세이(KIRA)를 아래와 같이 실행하였다. 이전에 10% FBS(MO, St. 루이스, 시그마)를 함유하는 성장 배지(Ham's F12/DMEM 50:50(NY, 그랜드 아일랜드, 집코)에서 유지된, 폐암 A549 세포(CCL-185, VA, 매나싸스, ATCC)의 컨플루언트 배양물을 애큐타제(Accutase)(OH, 오로라, ICN)를 이용하여 탈리시키고 96 웰 플레이트에 웰 당 50,000 세포의 밀도로 접종하였다. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 성장 배지를 제거하고 세포를 0.1% FBS를 함유하는 배지에서 30 내지 60 분간 혈청 기근시켰다. HGF 또는 HGF 돌연변이체에 의한 Met 인산화 활성을 0.1% FBS를 함유하는 배지에서 500 내지 0.2 ng/㎖의 계열 희석물을 가한 후 37 ℃에서 10 분 인큐베이션하고, 배지를 제거하고, 1× 프로테아제 저해제 칵테일 세트 Ⅰ(Cat #539131, CA, 샌디에고, 캘바이오켐)으로 보충된 1× 세포 용해 완충액(Cat. #9803, MA, 베버리, 셀 시그널링 테크놀로지즈)으로 세포 용해하여 결정하였다. HGF β-쇄를 5 ㎍/㎖에서 시작하여 유사하게 수행하였다. HGF β-쇄에 의한 HGF 의존적 Met 인산화 활성의 저해를 어세이 플레이트에 156 내지 0.06 nM의 계열 희석물을 가한 후 37 ℃에서 15 분간 인큐베이션하고, 12.5, 25 또는 50 nM의 HGF를 가하고, 37 ℃에서 10 분간 더 인큐베이션하고, 배지를 제거하고 상기와 같이 세포 용해하여 결정하였다. 세포 용해물을 바이오 베리스(Bio Veris) M-시리즈 장치(MD, 게이스버그, 바이오 베리스 코포레이션)를 이용하여 전자화학발광 어세이를 통해 인산화된 Met에 대해 분석하였다. 항-포스포티로신 mAb 4G10(MY, 레이크 플라시드, 업스테이트)을 제조자의 지시(바이오 베리스)에 따라 NHS-에스테르 화학을 통해 BV-택으로 표지하였다. 항-Met ECD mAb 1928(CA, 사우쓰 샌프란시스코, 제넨테크)을 바이오틴-X-NHS(OH, 클리브랜드, 리서치 오가닉스)로 바이오티닐화하였다. BV-택-표지된 4G10 및 바이오티닐화된 항-Met mAb를 어세이 완충액(PBS, 0.5% Tween-10, 0.5% BSA)에서 희석하고 칵테일을 세포 용해물에 가하였다. 실온에서 격렬히 진탕하면서 1.5 내지 2 시간 인큐베이션한 후, 스트렙타비딘 자기 비드(다이나비즈, 바이오 베리스)를 가하고 45 분간 인큐베이션하였다. 결합된 물질(항-Met 항체/Met/항-포스포티로신 항체)을 갖는 비드를 외부적으로 적용된 자석에 의해 포획하였다. 세척 단계 후 광원에 의해 생성된 화학발광 신호를 바이오 베리스 장치 상에서 상대적 발광 단위로서 측정하였다. 각 실험을 위해, HGF 돌연변이체에 의해 유도된 Met 인산화를 2-쇄 HGF로 얻어진 최대 신호의 백분율로 표현하였다.
증식 어세이
BxPC3(인간 췌장 아데노카시노마; ECACC 번호 93120816)를 유러피언 컬렉션 오브 셀 컬쳐(UK, 윌트샤이어, 샐리스버리, 포톤 다운, CAMR 센터 포 어플라이드 마이크로바이올로지 앤드 리서치)로부터 얻고 HGF-의존적 증식 어세이에 사용하였다. 세포를 10% FCS(시그마 F-6178, MO, St. 루이스), 10 mM HEPES, 2 mM 글루타민, 1× 페니실린-스트렙토마이신(인비트로젠 15140-122, CA, 칼스바드), 100× 페니실린 10000 ㎍/㎖ - 스트렙토마이신 10000 ㎍/㎖), 및 250 ㎍/㎖의 G418(인비트로젠 10131-035)을 함유하는 RPMI 배지에서 성장시켰다. 세포를 PBS, 10 mM EDTA를 함유하는 PBS로 순차적으로 세척한 후, 트립신을 이용하여 제거하였다. 세포를 혈청 함유 배지로 수획하고 세포 밀도를 헤마토사이토미터를 이용하여 결정하였다. 50000-75000/㎖의 세포를 내부 60 웰만을 이용하여 백색 바닥 MT 플레이트(컬투르 플레이트(Cultur Plate)™ 6005680, MA, 보스톤, 팩커드/퍼킨엘머)로 웰 당 200 ㎕로 접종하고 24 시간 동안 성장하도록 하였다. 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고 0.1% BSA(SF-BSA)를 함유하는 200 ㎕의 무-혈청 배지를 세포에 도로 가하였다. 세포를 24 시간 더 성장시켰다. 배지를 제거하고 150 ㎕의 SF-BSA 중의 다양한 시험 HGF 단백질(n=4)을 웰에 가하였다. 2-쇄 HGF를 저해 어세이를 위해 최종 1 nM로 사용하였다. 대조를 HGF 부재 및/또는 시험 HGF 단백질 부재 하에 실행하였다.
세포를 72 시간 성장하도록 한 후 셀타이터(CellTiter)-Glo 발광 키트(프로메가 G7571, WI, 매디슨)를 이용하여 어세이하였다. 잇따른 과정은 프로메가 테크니컬 불리틴 TB288에 기재되어 있다. 마이크로타이터 플레이트를 트로픽스(Tropix) TR717 마이크로플레이트 루미노미터(베르톨드 75323, 독일, 바트 빌트바트) 상에서 읽었다. 세포 증식의 자극 또는 저해의 백분율을 적절한 대조에 대해 정규화하였다.
세포 이동 어세이
유방암 세포 MDA-MB-435(HTB-129, VA, 매나싸스, ATCC)를 권장되는 혈청-보충된 배지에서 배양하였다. 컨플루언트 세포를 10 mM EDTA를 함유하는 PBS에서 탈리시키고 최종 농도 0.6-0.8×105 세포/㎖로 희석하였다. 이 현탁액 0.2 ㎖(1.2-1.6×105 총 세포)를 10 ㎍/㎖의 랫트 꼬리 콜라겐 타입 Ⅰ(NY, 레이크 플라시드, 업스테이트)으로 예비-코팅된 24-웰 트랜스웰 플레이트(8 ㎛ 공극 크기)(HTS 멀티웰(Multiwell)™ 삽입 시스템, NJ, 프랭클린 레이크스, 팔콘)의 상부 챔버로 삼중으로 가하였다. 다르게 특정되지 않으면, 야생형 HGF 또는 HGF 돌연변이체를 무-혈청 배지에 100 ng/㎖로 하부 챔버에 가하였다. HGF β-쇄를 또한 30 ㎍/㎖에서 시험하였다. 13-14 시간 인큐베이션한 후, 막의 끝 쪽에 있는 세포를 제거하고 아래 쪽으로 이동한 것들을 4% 파라포름알데히드에서 고정한 후 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 세척 및 공기건조 후, 세포를 10% 아세트산에 가용화시키고, A560을 몰레큘라 디바이시즈 마이크로플레이트 리더 상에서 측정하였다. HGF 돌연변이체의 전-이동 활성을 HGF 부재 하의 기저 이동을 제한 후 HGF 대조의 백분율로 표현하였다. 염색된 세포의 사진을 라이쯔 현미경(독일, 베츨라, 레이카 미크로스코페 & 시스테메 GmbH)에 연결된 스팟 디지털 카메라(MI, 스털링 하이츠, 다이아그노스틱스 인스트루먼츠, Inc.)로 찍었다. 사진을 아도베 포토샵 4.0.1(CA, 산 호세, 아도베 시스템즈 Inc.)에 의해 얻었다.
결과
Met 에 대한 HGF β의 결합
Met에 대한 HGF β 결합을 Met의 세포외 영역(Met ECD)으로 유도체화된 CM5 칩 상에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 공명 단위에서의 변화로부터 평가하였다. 결과는 HGF β가 상대적으로 빠른 결합(kon = 1.18×105 M-1s-1) 및 해리 속도 상수(koff = 0.0103 s-1)로부터 계산된 87 nM의 Kd로 Met ECD에 결합함을 보여준다(도 1A). 유사한 결과가 27 nM의 Kd가 계산된(결과 미도시), c-met Sema 영역에 대한 결합에 대해 얻어졌다. Met에 대한 HGF β의 결합을 또한 플레이트 ELISA를 이용하여 두번째의 독립된 방법에 의해 확인하였다. 고정화된 항-Fc 항체에 결합된 적절하게 배향된 Met-IgG 융합물과의 바이오티닐화된 HGF β의 인큐베이션과 HRP-뉴트라비딘으로의 검출 후, 320±140 nM의 EC50 값이 결정되었다(n = 6; 결과 미도시).
단일-쇄 HGF는 2-쇄 HGF에 비교할만한 친화도로 Met에 결합하지만, Met 인산화를 유도하지 않으므로(Lokker 등, 1992; Hartmann 등, 1992), 우리는 이것이 비절단된 형태의 β-쇄에 Met 결합 위치의 결여에 기인한 것이라고 가정하였다. 이 가설을 시험하기 위하여, 우리는 HGF α-쇄로부터의 C-말단 16 잔기와 단일-쇄 형태가 손상되지 않게 남아있는 것을 보장하기 위하여 절단 위치에서 돌연변이(R494E)를 함유하는 자이모젠-양 형태의 HGF β, 프로HGF β를 발현시키고 정제하였다. Met에 대한 HGF β 및 프로HGF β의 결합을 경쟁 결합 ELISA로 결정하여, 각각 0.86±0.17 및 11.6±1.8 μM의 IC50 값을 얻었다(도 1B). 13.5-배 감소된 결합은 자이모젠-양 HGF β 상의 Met 결합 위치가 사실상 존재하지만, 최적이지 않음을 보여준다. 프로HGF β의 결합 친화도 상실이 또한 도 5에 요약된 데이터에서 예시되어 있다. 진실로, 다른 라운드의 실험에서, 자이모젠-양 β쇄는 이 어세이에서 0.56 μM의 HGF β쇄에 대해 확인된 값 보다 약 75-배 높은, 약 41 μM의 IC50을 갖는, c-Met에 대한 결합을 위해 표지된 β쇄와 경쟁하는 그의 능력에서 훨씬 덜 효율적인 것으로 밝혀져, 자이모젠-양 HGF β쇄가 c-Met에 대해 유의하게 감소된 결합을 가짐을 입증하였다(결과 미도시). 따라서, 다양한 실험이 자이모젠-양 β쇄(프로HGF β)가 최적-이하인 Met 리간드임을 확인시킨다.
HGF β에 의한 활성의 저해
HGF β가 Met에 결합할지라도, 그것은 Met 인산화를 유도하지 않는다(도 1C). 도 1C는 HGF β가 전장 HGF에 의한 최적의 인산화 활성을 >1000-배 초과하는 농도에서조차, 완전히 비활성적임을 보여주었다. 유사하게, MDA-MB-435 세포 이동 어세이에서, 0.95 μM 이하 농도의 HGF β는 아무런 효과도 갖지 않았다. 그러나, 비록 저해가 사용된 최고 농도에서 불완전하였을지라도, HGF β는 농도 의존적 방식으로 Met의 HGF-의존적 인산화를 저해한다(도 1D). Met 인산화의 저해는 Met 결합에 대한 HGF와의 직접적 경쟁과 일치한다. 이것과 일치하게, 경쟁 결합 어세이는 HGF β가 대략 다소 높은 농도에서(IC50 = 830±26 nM; n = 3) Met에 대한 전장 HGF 결합을 저해함을 보여주었다(도 1E). 이에 비해, 전장 야생형 HGF는 이 어세이에서 0.86±0.47 nM(n = 3)의 IC50 값을 가졌다.
HGF 및 HGF β 에서의 돌연변이는 세포 이동과 Met 인산화에 영향을 미친다.
β-쇄에서 Met 결합 위치를 확인하기 위해 우리는 여기에서 HGF의 '활성화 영역' 및 '활성 위치 부위'로 언급된, 세린 프로테아제의 활성화 영역 및 활성 위치에 상응하는 부위의 잔기를 체계적으로 변화시켰다. CHO 세포에서의 HGF 돌연변이체의 최초 발현은 돌연변이체 HGF I623A에 의해 예시되는 단일- 및 2-쇄 HGF 형태의 혼합물을 생성시켰다(도 2A). 잔여 미절단 HGF의 완전한 전환을 수획된 배양 배지를 수 일간 5-10% 혈청에 부가적으로 노출시켜 달성하였다(도 2A). 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제 후 HGF I623A의 순도는 모든 HGF 돌연변이체의 대표이다(도 2A).
HGF에 있는 β-쇄 잔기를 돌연변이시킨 기능적 결과를 MDA-MB435 세포의 이동을 자극하는 HGF 돌연변이체의 능력을 결정함으로써 평가하였다. 결과는 5 돌연변이체 Q534A[c57], D578A[c102], V692A[c214], P693A[c215] 및 G694A[c216]가 야생형 활성의 20%-60%를 가짐에 비해, 3 HGF 돌연변이체, R695A[c217], G696A[c219] 및 Y673A[c195]가 야생형 활성의 20% 미만을 가져, 심각하게 손상되었음을 보여주었다(도 2B). 부가적인 세트의 9 돌연변이체(R514A, P537A, Y619A, T620A, G621A, K649A, I699A, N701A 및 R702A)는 야생형 활성의 60-80%를 가졌다. 나머지 21 돌연변이체는 야생형의 것의 >80% 활성을 가졌고 HGF로부터 필수적으로 변화되지 않은 것으로 간주되었다. 예상된 바와 같이, 프로HGF는 세포 이동을 자극하지 않았다(도 2B). 세포 이동을 촉진하는 1 nM R695A[c217] 또는 G696A[c219]의 감소된 능력이 어느 한 돌연변이의 존재 하에서 이동이 HGF 부재 하의 기저 이동과 유사함을 보여주는, 도 2C에 도시되어 있다.
세포 이동에서 감소된 활성이 감소된 Met 인산화와 상호관련되어 있는지 여부를 조사하기 위하여, HGF 돌연변이체의 서브세트를 키나제 수용체 어세이(KIRA)에서 조사하였다. 야생형 HGF 및 HGF 돌연변이체에 대해, 최대 Met 인산화를 0.63 내지 1.25 nM의 농도에서 관찰하였다(도 3). 돌연변이체 Y673A[c195], R695A[c217] 및 G696A[c219]에 의해 달성된 최대 Met 인산화는 야생형의 30% 미만이어서, 그들의 최소 또는 무 전-이동 활성과 일치하였다. 돌연변이체 Q534A[c57], D578A[cl02] 및 V692A[c214]는 세포 이동 어세이에서 중간 활성(30-60%)을 가졌다: 그들은 또한 야생형 HGF의 56%-83%를 갖는, 중간 수준의 Met 인산화를 가졌다. 세포 이동 활성의 결여와 일치하여, 프로HGF는 Met 인산화 활성을 갖지 않았다(도 3).
Met 에 대한 HGF 및 HGF β-쇄의 결합에 대한 β-쇄 돌연변이의 영향
Met-IgG 융합 단백질에 대한 각 돌연변이체의 친화도를 HGF 경쟁 결합에 의해 분석하였다. K649A[c173]과 Y673A[c195](둘 다 약 4-배 약한 결합)를 제외하고는, 모든(>30) HGF 돌연변이체가 0.36 내지 2.25 범위의, 그들의 IC50 비율(IC50mut/IC50WT)에 의해 나타내어지는, 2-쇄 HGF(IC50 = 0.83±0.32 nM; n = 30)와 필수적으로 동일한 결합 친화도를 가졌다(도 7). HGF Y673A[c195]와 프로HGF는 HGF에 비해 약 4-배 약한 결합을 나타내었다(도 7)[결합 친화도 측정의 절대 값은 실험 간에 변할 수 있지만, 야생형에 비한 결합 능력에 대한 특정 돌연변이의 영향은 여러 실험 사이에 재현가능함이 주목되어야 한다]. 우리는 또한 10- 및 50-배 높은 농도에서 선택된 돌연변이체의 세포 이동 활성을 조사하였다; 전-이동 활성의 증가가 관찰되지 않았다(도 8). 따라서, 50-배 이하의 농도 증가가 아무 보상 효과를 갖지 않으므로, HGF 돌연변이체의 손상된 기능은 Met에 대한 감소된 결합에 기인한 것이 아니다.
Met에 대한 HGF 돌연변이체 결합과 HGF-의존적 세포 이동 또는 Met 인산화의 빈약한 상관관계는 β-쇄로 인한 어느 감소된 친화도를 차폐할 수 있는, Met와 HGF α-쇄 간의 상대적으로 높은 친화도에 기인하는 것 같다. 따라서, 우리는 어떠한 α-쇄 영향을 제거하기 위하여 HGF β 자체에 선택된 돌연변이를 만들었다. HGF β 돌연변이체 Y513A[c36], R516A[c39], Q534A[c57], D578A[c102], Y619A[c143], Y673A[c195], V692A[c214], P693D[c215], G694E[c216], R695A[c217], G696A[c219], I699A[c221a] 및 R702A[c224]를 Met-IgG에 대한 바이오티닐화된 HGF β와의 경쟁 ELISA에서 시험하였다. HGF β 돌연변이체 C561S[c78](C604S:C561S)을 유리 시스테인을 갖지 않는 돌연변이체에서 활성을 평가하기 위하여 시험하였다. 정제 중 어느 가능한 다이머화를 막기 위하여 HGF β C604S[c128] 배경에 돌연변이체를, 비록 이 돌연변이가 Met-IgG에 대한 결합에 영향을 미치지 않을지라도, 만들었다. 그런 다음 돌연변이체의 결합 친화도를 IC50 ∼0.55±0.38 μM(n = 16)을 갖는, HGF β에 대해 정규화하였다. 결과는 도 5에 나타내어져 있다. 이들의 선택된 서브세트는 도 4에 그래프로 도시되어 있다. 대부분의 돌연변이체는 Met에 대해 감소된 결합 친화도를 가졌고 일부 돌연변이체 - 예를 들어 R695A[c217]과 G696A[c219] - 는 전혀 결합에 대해 경쟁하지 않았다(도 5를 참조하라). 우리는 이제 HGF β의 상응하는 돌연변이체의 감소된 결합과 전장 2-쇄 HGF 돌연변이체의 감소된 활성에 대한 강력한 상관관계를 안다. 이동 활성에서 가장 큰 손실을 가진(2-쇄 전장 HGF 돌연변이체와 같이), 일부 돌연변이체(예를 들어 R695A[c217], G696A[c219] 및 Y673A[c195])는 또한 Met 결합에서 가장 큰 손실을 가졌다(HGF β 돌연변이체와 같이). 역으로, 이동 활성의 작은 감소를 갖는 돌연변이체(예를 들어 Y619A[c143] 및 I699A[c221a])는 또한 Met 결합에서 작은(10-배 미만) 감소를 가졌다(도 5). 따라서, 이 Met 결합 어세이에서 HGF α-쇄 결합 기여의 제거는 전장 HGF 돌연변이체의 감소된 이동 활성이 Met 수용체와 HGF β-쇄의 손상된 결합 상호작용에 기인함을 밝혔다.
HGF 에서의 돌연변이는 성장 자극 활성 감소와 HGF -의존적 세포 증식의 증진된 저해를 일으킨다
도 6A에 나타낸 바와 같이, HGF β쇄에서의 돌연변이체는 BxPC3 세포에서 증식의 활성화제로서 덜 활성적이다. 도 6A의 예시적 돌연변이체는 성장 자극 활성 감소의 넓은 스펙트럼의 감소 정도를 반영한다. 25 ng/㎖에서의 HGF WT 활성이 100 ng/㎖에서의 활성의 83.6±13.0%(n = 12)임을 주목하라. % 활성은 HGF 또는 HGF 돌연변이체(100 ng/㎖ 또는 25 ng/㎖)의 존재 하에 증식의 양 - HGF 부재 하에 증식의 양을 말한다. SD는 표준편차이고 n은 독립적 결정의 수이다.
HGF β쇄에서의 돌연변이는 또한 야생형 HGF 존재 하에 세포 증식의 저해제로서 작용할 수 있다(도 6B). 도 6B에서, 상대적 활성은 증식 어세이에서 상대적 활성을 말한다. % 저해는 몇몇 방식으로 계산될 수 있으며, 그들 중 두 개가 도 6B에 나타내어져 있다. % 활성 Ⅰ은 무 HGF(0%) 및 25 ng/㎖ HGF WT(100%)에 대해 정규화된 증식 양을 말한다. 따라서 HGF R695A 또는 HGF R424A:494E는 각각 79% 또는 63%의 HGF-의존적 세포 증식 활성을 저해한다. % 활성 Ⅱ는 5 ㎍/㎖ HGF R695A(0%) 또는 HGF R424:R494E(0%) 및 25 ng/㎖ HGF WT(100%)에 대해 정규화된 증식 양을 말한다. 따라서 HGF R695A 또는 HGF R424A:494E HGF는 각각 68% 또는 75%의 HGF-의존적 세포 증식 활성을 저해한다. HGF WT는 25 ng/㎖이고 2-쇄 HGF; 2-쇄 R695A 및 1-쇄 R424A:494E는 5 ㎍/㎖이었음을 주목하라.
c- Met 에 대한 HGF β쇄의 결합은 단일 쇄 프로- HGF 에 의해 경쟁될 수 없다
우리의 데이터는 HGF β쇄가 c-Met, 보다 구체적으로 c-Met의 Sema 영역에 결합함을 가리킨다. HGF α쇄 역시 c-Met에 결합하고 또한 Sema 영역에 결합할 수 있다. 우리는 이들 두 쇄에 대한 결합 위치가 c-Met 상에서 중복되는지 여부를 해결하였다. 결과는 손상되지 않는 α쇄와 자이모젠-양 β쇄를 갖는, 단일 쇄 프로-HGF가 도 9에 표시된 농도에서 cMet-IgG에 대한 HGF β쇄 결합과 경쟁하지 않음을 보여주었다. 그러나, 손상되지 않는 α쇄와 활성화된 β쇄를 갖는, 2 쇄 HGF는 19 nM의 IC50으로 경쟁하여, α 및 β쇄가 cMet 상의 상이한 위치에서 결합한다는 결론을 뒷받침한다(도 9). 경쟁적 ELISA에서의 대조 실험은 단일 쇄 프로-HGF가 2 쇄 HGF에 대한 6 nM의 IC50 값과 유사한, 12 nM의 IC50으로 c-Met-IgG에 대한 바이오티닐화된 2 쇄 HGF 결합과 경쟁함을 보여주었다(결과 미도시).
논의
HGF는 단일 쇄 전구체의 2-쇄 HGF로의 단백분해적 전환 시 생물학적 활성을 획득한다(Naka 등, 1992; Hartmann 등, 1992; Lokker 등, 1992; Naldini 등 1992). 키모트립십-양 세린 프로테아제(Perona 및 Craik, 1995; Rawlings 등, 2002; Donate 등, 1994) 특히 플라스미노젠과 HGF의 구조적 유사성에 기초하여, 우리는 이 활성화 과정이 HGF β-쇄에서 발생하는 구조적 변화와 관련되어 있다고 가정한다. 여기에서 '활성화된' HGF β-쇄가 키모트립신-양 세린 프로테아제의 기질/저해제 결합 위치에 상응하는 부위에 위치된 분리된 Met 결합 위치를 함유한다는 증거가 제공된다.
Met 에 대한 HGF 결합 상호작용
정제된 HGF β-쇄로의 결합 연구는 Met 결합 위치의 최적화가 단일-쇄 HGF의 가공에 의존한다는 견해와 일치하게, '활성화된' 형태의 HGF β(Val495-Ser728)가 그의 전구체 형태, 프로HGF β(Asn479-Ser728) 보다 약 14-배 더 높은 친화도로 Met에 결합함을 밝혔다. 이것은 Met 결합 위치가 scHGF 절단 후 형태적 재배열을 수행하는 HGF 부위, 즉 '활성화 영역'을 포함함을 암시하였다. 정말로, '활성화 영역'에 아미노산 치환을 갖는 HGF 변이체의 기능적 분석은 기능적 Met 결합 위치의 동정에 이르게 하였다. 그러나, HGF 친화도는 HGF α-쇄에 의해 지배되므로(Lokker 등, 1994; Okigaki 등, 1992), 전-이동 활성에서 가장 큰 손실을 갖는 HGF 돌연변이체(Q534A, D578A, Y673A, V692A, P693A, G694A, R695A, G696A 및 R702A)는 Y673A(4-배 손실)를 제외하고는 Met에 대해 필수적으로 변화하지 않은 결합 친화도를 나타내었다. 이것과 일관되게, 감소된 활성은 50-배 초과로 HGF 돌연변이체의 농도를 증가하였을 때 변화하지 않은 채로 있었다(도 8). 따라서, HGF 돌연변이체의 감소된 활성은 HGF β-쇄의 Met 상의 그의 특이적, 저 친화도 결합 위치와의 교란된 분자 상호작용으로부터 초래되는 것으로 해석되었다. 이것을 지지하는 것으로, 우리는 선별된 HGF 돌연변이체(2-쇄 전장)의 감소된 생물학적 활성이 HGF α-쇄의 결합 기여를 제거한 어세이에서 상응하는 HGF β 돌연변이의 감소된 Met 결합과 잘 상호관련되어 있음을 발견하였다. 예를 들어, HGF β 돌연변이체 R695A[c217], G696A[c219] 및 Y673A[c195]는 전장 돌연변이체와 같이 크게 손상된 생물학적 기능과 상호관련된, 측정가능한 Met 결합을 갖지 않았다.
Met에 대한 HGF β 결합에 대한 상대적으로 낮은 친화도 결합 위치에 대한 데이터와 일치하게, 고정화된 Met 세포외 영역을 이용한 표면 플라스몬 공명 실험은 HGF β가 약 90 nM의 Kd로 Met와 결합함을 보여주었다. Kd와 IC50 값 사이에 관찰된 명백한 친화도 차이는 예를 들어 더 높은 IC50 값이 Met에 대한 결합을 위해 250 nM 바이오티닐화된 HGF β와 경쟁하는데 필요한 더 높은 농도의 HGF β를 반영하는, 사용된 상이한 어세이에 기인한다.
기능적 Met 결합 위치는 '촉매성 3가 잔기' Gln534[c57], Asp578[c102], Tyr673[c195] 및 [c220]-루프(잔기 Val692, Gly694, Arg695 및 Gly696) 상에 집중되어 있다. 우리의 Ala 치환의 모두는 Gly696에서를 제외라고 주 쇄 형태의 큰 변화를 요구하지 않는다. 여기에서, 50°/146°의 파이/사이 각과 비-Gly 잔기의 치환은 [c20]-루프에서의 형태적 변화를 유발하여, G696A 돌연변이체의 감소된 활성을 일으킨다. 함께, 이들 잔기는 진정한 세린 프로테아제의 기질-가공 부위에 현저한 유사성을 갖는다. 이 발견은 Met 활성화를 위해 중요한 잔기로서 Y673 및 V692를 동정한, 이전 연구(Lokker 등, 1992)와 일치한다. 그 연구에서 HGF 변이체 Q534H에 대해 측정된 정상 활성을 상대적으로 밀접한 ㄷ도동배체인 His에 의한 Gln의 기능성 보상을 반영할 수 있다.
[c220]-루프의 기능적 중요성은 키모트립신-양 세린 프로테아제의 잘-기술된 훼밀리에서 선례를 가지고 있다(Perona 및 Craik, 1994; Hedstrom, 2002). 기질과 저해제의 연장된 표준적 형태는 [c214-c218]로부터 주 쇄 상호작용을 형성할 수 있는 잔기를 포함한다. 이 부위는 또한 트롬빈 촉매 활성의 알로스테릭 조절자(Di Cera 등, 1995)와 그의 저해제 히루딘과의 상호작용 위치(Stubbs 및 Bode, 1993)로 인식되어 있다. 부가적으로, HGF R695[c217]에 상응하는 인자 Ⅶa 및 트롬빈에서의 잔기가 효소-촉매된 기질 가공을 위해 중요하다(Tsiang 등, 1995; Dickinson 등, 1996). 더욱이, MSP에서 상응하는 잔기, R683[c217]은 MSP β-쇄의 그의 수용체 Ron과의 고 친화도 상호작용에 중추적인 역할을 한다(Danilkovitch 등, 1999). MSP R683[c217]은 Ron에 대한 고 친화도 결합에 관여하는 것으로 제안된 5개 표면 노출된 아르기닌 잔기의 클러스터의 일부이다(Miller 및 Leonard, 1998). 비록 R695[c217]과 가능하게 K649[c173]만이 HGF에서 보존되어 있을지라도, 이들 잔기는 모두 HGF β-쇄의 Met 결합 부위 내에 위치되어 있어, 우리가 MSP β-쇄 상의 Ron 결합 위치가 고도로 상동적이라고 추측하게 하였다.
HGF Ala 돌연변이체를 이용한 여기에 기재된 결과는 Tyr673[c195]와 Val692[c214]가 각각 세린에 의해 대체된 이전 연구(Lokker 등,1991)와 일치한다. 두 이전 보고(Lokker 등, 1991; Matsumoto 등, 1991)에서 HGF 변이체 Q534H[c57]에 대해 측정된 정상적 생물학적 활성은 Gln의 상대적으로 밀접한 동배체인, His에 의한 기능적 보상을 반영할 수 있다. 그러나, 우리의 결과는 HGF β- 쇄 자체가 Met에 결합하지도 Met에 대한 HGF 결합을 저해하지도 않음을 입증한 이전 연구(Hartmann 등, 1992; Matsumoto 등, 1998)와 상반된다. 일례에서, HGF β-쇄는 Met 결합에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는, HGF의 엘라스타제 절단으로부터 유래된 여분의 α-쇄 잔기를 가져, 우리의 것과 상이하였다. 그러나, 그 보다 사용되는 농도, 어세이의 민감도 또는 프로-HGF 가공의 정도가 이 낮은 친화도 위치에 대한 결합을 관찰하기에 불충분했을 수 있을 것 같다(Matsumoto 등, 1998). HGF β-쇄는, α-쇄로부터의 NK4 단편의 존재 하에서만 일지라도, Met에 결합하는 것으로 보고되었다(Matsumoto 등, 1998).
신호전달 기작
원칙적으로, 한 HGF 분자에 두 Met 결합 위치 - 고 친화도의 하나와 저 친화도의 하나 - 의 존재는 제안된 2:1 모델의 Ron:MSP(Miller 및 Leonard, 1998)와 유사한, 2:1 모델의 Met:HGF 신호전달 복합체를 뒷받침할 수 있다. 관련된 MSP/Ron 리간드/수용체 시스템에서, 신호전달 활성이 결여된, MSP의 개개 α- 및 β-쇄는 Ron에 결합하고 수용체 결합에 대해 전장 MSP와 경쟁할 수 있다(Danilkovitch 등,1999). 동일한 것이 HGF/Met 시스템에서 사실이다. 그러나, 생화학적 연구는 Met:HGF의 어떠한 2:1 복합체도 동정하지 못하였다(Gherardi 등, 2003). 부가적으로 수용체 활성화의 이 모델은 하나의 HGF 분자가 그의 α- 및 β-쇄를 통해 하나의 Met 수용체에 동시에 결합하는 것을 방지하는 아직 미지의 분자적 기작으로서 어느 것을 요구한다.
대안으로, HGF β-쇄는 HGF:Met의 2:2 복합체를 선호하는 Met와의 직접적 상호작용에 관여하는 것들을 넘어 수용체 활성화에 결정적 기능을 가질 수 있다. 우리는 프로HGF β, 단일 쇄 '비활성화된' 형태의 HGF β-쇄가 '활성화된' 형태의 HGF β에서의 몇몇 돌연변이체, 즉 Y673A, V692A 및 R695A 보다 Met에 더 단단하게 결합함을 발견하였다(예를 들어, 도 5). 중요하게, 모든 세 상응하는 전장 HGF 돌연변이체가 측정가능한 수용체 인산화 및/또는 전-이동 활성을 나타내지만, 프로HGF는 HGF에 의한 활성을 위해 필요한 것 보다 1000-배 높은 농도에서조차 그렇지 않다. 이 의미있는 차이는 우리가 수용체 활성화에서 HGF β-쇄의 부가적인 기능을 고려하도록 한다.
결론
결론적으로, 여기에 제시된 결과는 HGF의 β-쇄가 세린 프로테아제의 '활성 위치 부위'와 유사한, Met와의 지금까지 알려지지 않은 상호작용 위치를 함유함을 보여준다. 따라서 HGF는 α-쇄의 NK1 부위에서 고 친화도 Met 결합 위치를 갖는, 이가이다. 다른 중요한 상호작용이 두 HGF β-쇄, 두 HGF α-쇄 , 및 MSP/Ron으로 발견된 바와 같이(Angeloni 등, 2004), 두 Met Sema 영역 사이에서 일어날 수 있다(Donate 등, 1994). 더욱이, 헤파린은 또한 HGF/Met 수용체 결합에서 핵심적 역할을 한다. HGF β-쇄 상의 구별되는 Met 결합 위치의 동정은 암과 같은 질환에 대해 치료 가능성을 갖는 새로운 클래스의 Met 저해제를 설계하기 위해 과학적 및 실험적 근거를 제공한다.
참조문헌의 부분적 목록
Figure pat00030
Figure pat00031
Figure pat00032
Figure pat00033
Figure pat00034
Figure pat00035
Figure pat00036
<110> Genentech, Inc. <120> Methods and Compositions for Modulating HGF/MET <130> P2035R1PCT <140> PCT/US2004/017901 <141> 2004-06-04 <150> US 60/476,778 <151> 2003-06-06 <150> US 60/532,117 <151> 2003-12-23 <160> 41 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Leu Gly Cys Asp Trp Glu Leu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Val Asp Trp Ile Cys Phe Arg Asp Ile Gly Cys Asp Trp Val Val 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 Val Asp Trp Ile Cys Leu Arg Asp Val Gly Cys Asp Trp Val Gln 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Phe Gly Cys Asp Trp Val Val 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Phe Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 6 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Phe Gly Cys Asp Trp Val His 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 7 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Phe Gly Cys Tyr Trp Glu Gln 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 8 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Phe Gly Cys Trp Phe Glu Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 9 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp His Gly Cys Glu Tyr Val Glu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 10 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Ile Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 11 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Glu Phe Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 12 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Glu Ile Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 13 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Gly Ile Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 14 Val Asp Trp Val Cys Leu Arg Asp Ile Gly Cys Asp Trp Val Pro 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 15 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Leu Gly Cys Asp Tyr Glu His 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 16 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Leu Gly Cys Asp Tyr Val Leu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 17 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Glu Leu Gly Cys Asp Trp Val Val 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 18 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Glu Leu Gly Cys Asp Trp Val Phe 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 19 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Met Gly Cys Tyr Tyr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 20 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Met Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 21 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Ser Gly Cys Tyr Tyr Ala Thr 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 22 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Thr Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 23 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Val Gly Cys Asp Trp Val Gln 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 24 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Val Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 25 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Glu Val Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 26 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Val Gly Cys Asp Trp Val Met 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 27 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Tyr Gly Cys Asp Met Val Pro 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 28 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Val Gly Cys Asp Trp Val Gln 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 29 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Tyr Gly Cys Glu Trp Val Ala 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 30 Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Val Gly Cys Glu Trp Val Val 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 31 Val Asn Trp Val Cys Phe Arg Asp Ile Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 32 Val Asn Trp Val Cys Phe Arg Asp Leu Gly Cys Asp Trp Val Ala 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 33 Val Asn Trp Val Cys Phe Arg Asp Leu Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 34 Val Asn Trp Val Cys Phe Arg Asp Leu Gly Cys Asp Trp Val Pro 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 35 Val Asn Trp Val Cys Phe Arg Asp Leu Gly Cys Asp Trp Val Val 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 36 Val Asn Trp Val Cys Phe Arg Asp Gln Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 37 Val Asn Trp Val Cys Phe Arg Asp Val Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 38 Val Asn Trp Val Cys Phe Arg Glu Leu Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 39 Val Asn Trp Val Cys Leu Arg Asp Val Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 40 cctaattatg gatccacaat tcctg 25 <210> 41 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 41 caaaacgaaa caattggaag ttgtaaatgg gattc 35

Claims (26)

  1. c-met에 대한 간세포 성장 인자(HGF) β쇄의 특이적 결합을 변조함으로써 c-met 활성화가 변조되도록 하는 물질을 포함하는, 대상체에서 c-met 활성화를 변조하기 위한 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 물질이 c-met에 대한 HGF β쇄의 특이적 결합을 저해함으로써 c-met 활성화가 감소되는 것인 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 물질이 c-met에 대한 HGF β쇄의 특이적 결합을 증가시킴으로써 c-met 활성화가 증가되는 것인 제약 조성물.
  4. c-met에 대한 HGF β쇄의 특이적 결합을 저해함으로써 c-met 활성화와 관련된 세포 증식이 저해되도록 하는 물질을 포함하는, c-met 활성화 세포 증식을 저해하기 위한 제약 조성물.
  5. c-met에 대한 HGF β쇄의 특이적 결합을 저해함으로써 c-met 활성화가 저해되도록 하는 물질을 포함하는, 대상체에서 c-met의 활성화와 관련된 병리적 상태를 치료하기 위한 제약 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 병리적 상태가 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 장애 또는 혈관신생-관련 장애인 제약 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 암이 유방암, 결장직장암, 폐암, 췌장암 또는 교아세포종인 제약 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 HGF 알파 쇄에 이황화물 결합되지 않은 활성화된 HGF β쇄인 제약 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 서열 VDWVCFRDLGCDWEL을 포함하는 펩티드인 제약 조성물.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 활성화된 HGF β쇄에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 제약 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 소 분자, 펩티드, 항체, 항체 단편, 앱타머, 또는 그들의 혼합물인 제약 조성물.
  12. 활성화된 간세포 성장 인자 β쇄에 결합하여 c-met에 대한 상기 활성화된 HGF β쇄의 특이적 결합을 저해하는 분자.
  13. 제12항에 있어서, 활성화된 형태의 β쇄에 대한 분자의 결합 친화도가 자이모젠 형태의 β쇄에 대한 분자의 결합 친화도 보다 큰 것인 분자.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, β쇄의 활성 위치에 결합하는 분자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 활성 위치가 β쇄의 잔기 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 및 702 중 적어도 하나를 포함하는 것인 분자.
  16. 제14항에 있어서, 활성화된 β쇄가 단일 쇄 HGF의 절단에 의해 수득되는 β쇄의 형태(conformation)를 갖는 것인 분자.
  17. 제16항에 있어서, 상기 절단이 단일 쇄 HGF의 잔기 494와 495에 있거나 그에 인접한 것인 분자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 절단이 단일 쇄 HGF의 잔기 494와 495 사이에서 일어나는 것인 분자.
  19. 제12항 또는 제13항에 있어서, 소 분자, 항체 또는 그의 단편, 펩티드, 또는 그들의 배합물인 분자.
  20. 제12항 또는 제13항에 있어서, 활성화된 β쇄에 대한 상기 분자의 결합이 HGF에 의한 c-met 활성화를 저해하는 것인 분자.
  21. 제12항 또는 제13항에 있어서, 활성화된 β쇄에 대한 상기 분자의 결합이 HGF에 의해 유도되는 세포 증식을 저해하는 것인 분자.
  22. 제12항 또는 제13항에 있어서, 활성화된 β쇄에 대한 상기 분자의 결합이 c-met 수용체 다이머화를 저해하는 것인 분자.
  23. 제12항 또는 제13항에 있어서, 서열 VDWVCFRDLGCDWEL을 포함하는 펩티드인 분자.
  24. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 물질이 활성화된 HGF β쇄에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 분자.
  25. c-met에 대한 결합에 대해 간세포 성장 인자 β쇄와 경쟁하는 분자.
  26. 제25항에 있어서, c-met 수용체 다이머화를 저해하는 분자.
KR1020117022830A 2003-06-06 2004-06-04 Ｈｇｆ 베타 쇄와 ｃ-ｍｅｔ 사이의 상호작용의 변조 KR20110117728A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47677803P 2003-06-06 2003-06-06
US60/476,778 2003-06-06
US53211703P 2003-12-23 2003-12-23
US60/532,117 2003-12-23

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057023299A Division KR101148657B1 (ko) 2003-06-06 2004-06-04 Ｈｇｆ 베타 쇄와 ｃ-ｍｅｔ 사이의 상호작용의 변조

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20110117728A true KR20110117728A (ko) 2011-10-27

Family

ID=33555430

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117022830A KR20110117728A (ko) 2003-06-06 2004-06-04 Ｈｇｆ 베타 쇄와 ｃ-ｍｅｔ 사이의 상호작용의 변조
KR1020057023299A KR101148657B1 (ko) 2003-06-06 2004-06-04 Ｈｇｆ 베타 쇄와 ｃ-ｍｅｔ 사이의 상호작용의 변조

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057023299A KR101148657B1 (ko) 2003-06-06 2004-06-04 Ｈｇｆ 베타 쇄와 ｃ-ｍｅｔ 사이의 상호작용의 변조

Country Status (17)

Country Link
US (8) US20060035278A9 (ko)
EP (3) EP2093570A1 (ko)
JP (1) JP2007526447A (ko)
KR (2) KR20110117728A (ko)
AT (1) ATE425463T1 (ko)
AU (1) AU2004252475A1 (ko)
CA (1) CA2528343A1 (ko)
DE (1) DE602004019919D1 (ko)
DK (1) DK1636593T5 (ko)
ES (1) ES2323425T3 (ko)
HK (1) HK1092872A1 (ko)
HR (1) HRP20090324T1 (ko)
MX (1) MXPA05013181A (ko)
PL (1) PL1636593T3 (ko)
PT (1) PT1636593E (ko)
SI (1) SI1636593T1 (ko)
WO (1) WO2005001486A1 (ko)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040208876A1 (en) 2003-04-18 2004-10-21 Kim Kyung Jin Monoclonal antibodies to hepatocyte growth factor
KR101254371B1 (ko) * 2003-07-18 2013-05-02 암젠 프레몬트 인코포레이티드 간세포 성장인자에 결합하는 분리된 항체
ATE475099T1 (de) 2004-10-20 2010-08-15 Peas Inst Ab Beurteilung der biologischen aktivität von hgf (hepatocyte growth factor)
AU2006213890B2 (en) 2005-02-09 2011-07-21 Arqule Inc. Meleimide derivatives, pharmaceutical compositions and methods for treatment of cancer
ZA200707953B (en) * 2005-03-25 2009-06-24 Genenthech Inc Methods and compositions for modulating hyperstabilized c-met
AU2006229990A1 (en) * 2005-03-25 2006-10-05 Genentech, Inc. C-met mutations in lung cancer
SG161281A1 (en) 2005-04-15 2010-05-27 Genentech Inc Hgf beta chain variants
AR059922A1 (es) 2006-04-01 2008-05-07 Galaxy Biotech Llc Anticuerpos monoclonales humanizados para el factor de crecimiento de hepatocitos
US20110053931A1 (en) * 2006-06-08 2011-03-03 John Gaudino Quinoline compounds and methods of use
EP3095455A1 (en) 2006-12-19 2016-11-23 Genentech, Inc. Vegf-specific antagonists for adjuvant and neoadjuvant therapy and the treatment of early stage tumors
EP2173748B1 (en) 2007-06-22 2011-08-31 ArQule, Inc. Indolyl pyrrolidines for the treatment of cancer
US8304425B2 (en) 2007-06-22 2012-11-06 Arqule, Inc. Pyrrolidinone, pyrrolidine-2,5-dione, pyrrolidine and thiosuccinimide derivatives, compositions and methods for treatment of cancer
WO2009002808A2 (en) 2007-06-22 2008-12-31 Arqule, Inc. Quinazolinone compounds and methods of use thereof
EP2219656A2 (en) 2007-11-09 2010-08-25 New York Medical College Methods for the repair and/or regeneration of damaged myocardium using variants of hepatocyte growth factor
KR20160095186A (ko) * 2008-03-06 2016-08-10 제넨테크, 인크. Ｃ-ｍｅｔ 및 ｅｇｆｒ 길항제로의 조합 요법
US9157920B2 (en) * 2009-06-26 2015-10-13 Peas Institut Ab Method for determining biologically active HGF
RU2559533C2 (ru) 2009-10-22 2015-08-10 Дженентек, Инк. Антитела против гепсина и способы их применения
EP2545077B1 (en) 2010-03-10 2018-10-31 Genmab A/S Monoclonal antibodies against c-met
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
CN102643268B (zh) 2011-12-30 2014-05-21 沈阳药科大学 喹啉类及噌啉类化合物及其应用
WO2013143376A1 (zh) 2012-03-26 2013-10-03 武汉盛云生物医药科技有限责任公司 含1，2，4-三嗪-3，5-二酮的喹啉类化合物及其应用
CN104837502B (zh) 2012-10-12 2018-08-10 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
KR102066319B1 (ko) 2013-03-13 2020-01-14 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨쥬게이트
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
JP2017516458A (ja) 2014-03-24 2017-06-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド ｃ−ｍｅｔ拮抗剤による癌治療及びｃ−ｍｅｔ拮抗剤のＨＧＦ発現との相関
WO2016037644A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN113150147A (zh) 2015-03-16 2021-07-23 塞尔德克斯医疗公司 抗-met抗体及其使用方法
US20200023072A1 (en) 2016-10-11 2020-01-23 Medimmune Limited Antibody-drug conjugates with immune-mediated therapy agents
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
CN113286616A (zh) 2018-05-23 2021-08-20 Adc治疗有限公司 分子佐剂
JP7380999B2 (ja) * 2018-09-06 2023-11-15 国立大学法人 東京大学 環状ペプチド
CN114340684A (zh) 2019-09-16 2022-04-12 瑞泽恩制药公司 用于免疫pet成像的放射性标记的met结合蛋白
US20230372528A1 (en) 2020-10-16 2023-11-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycoconjugates
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
JP2755395B2 (ja) 1987-09-23 1998-05-20 ブリストル―マイアーズ スクイブ コムパニー Ｈｉｖ感染細胞に殺作用する抗体異種結合体
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DK0479909T3 (da) 1989-06-29 1997-04-07 Medarex Inc Bispecifikke reagenser til AIDS-behandling
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6344321B1 (en) * 1990-06-11 2002-02-05 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands which bind to hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) or its receptor c-met
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
US5780279A (en) 1990-12-03 1998-07-14 Genentech, Inc. Method of selection of proteolytic cleavage sites by directed evolution and phagemid display
JP3293823B2 (ja) * 1991-05-10 2002-06-17 フアルマシア・エ・アツプジヨン・エツセ・ピー・アー 肝細胞成長因子（ｈｇｆ）レセプターの部分切除形態
JPH06507398A (ja) 1991-05-14 1994-08-25 リプリジェン　コーポレーション Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5328837A (en) * 1992-05-18 1994-07-12 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor protease domain variants
PL174721B1 (pl) 1992-11-13 1998-09-30 Idec Pharma Corp Przeciwciało monoklonalne anty-CD20
DE69329295T2 (de) 1992-12-02 2001-03-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Wachstumhormon enthaltende mikrosphaeren mit kontrollierter freisetzung
ES2151079T3 (es) 1994-09-09 2000-12-16 Takeda Chemical Industries Ltd Preparacion de liberacion sostenida que contiene una sal metalica de un peptido.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5647409A (en) 1995-04-04 1997-07-15 Allergan On-site syringe filling apparatus for viscoelastic materials, and corresponding method for on-site syringe filling
US5686292A (en) * 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
RU2161502C2 (ru) 1995-06-07 2001-01-10 Элкермес Контролд Терапьютикс, Инк. Композиция для пролонгированного высвобождения гормона роста человека
ZA965368B (en) 1995-07-14 1997-01-14 Novo Nordisk As A pharmaceutical formulation
US6121416A (en) 1997-04-04 2000-09-19 Genentech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
US5911252A (en) 1997-04-29 1999-06-15 Cassel; Douglas Automated syringe filling system for radiographic contrast agents and other injectable substances
US6677377B2 (en) * 2000-06-21 2004-01-13 Georgetown University School Of Medicine Structure based discovery of inhibitors of matriptase for the treatment of cancer and other conditions

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20090324T1 (hr) 2010-02-28
JP2007526447A (ja) 2007-09-13
MXPA05013181A (es) 2006-06-23
US20130143813A1 (en) 2013-06-06
EP2367008A3 (en) 2014-12-24
EP2093570A1 (en) 2009-08-26
US20050037431A1 (en) 2005-02-17
ATE425463T1 (de) 2009-03-15
US20070129301A1 (en) 2007-06-07
KR101148657B1 (ko) 2012-07-05
EP1636593B1 (en) 2009-03-11
PT1636593E (pt) 2009-06-03
DE602004019919D1 (de) 2009-04-23
ES2323425T3 (es) 2009-07-15
KR20060017634A (ko) 2006-02-24
AU2004252475A1 (en) 2005-01-06
HK1092872A1 (en) 2007-02-16
US20170106042A1 (en) 2017-04-20
WO2005001486A1 (en) 2005-01-06
US20150126448A1 (en) 2015-05-07
US20100040634A1 (en) 2010-02-18
CA2528343A1 (en) 2005-01-06
EP1636593B9 (en) 2009-12-16
EP2367008A2 (en) 2011-09-21
SI1636593T1 (sl) 2009-08-31
US20110177058A1 (en) 2011-07-21
DK1636593T3 (da) 2009-06-15
EP1636593A1 (en) 2006-03-22
US20190054138A1 (en) 2019-02-21
PL1636593T3 (pl) 2009-08-31
US20060035278A9 (en) 2006-02-16
DK1636593T5 (da) 2009-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101148657B1 (ko) Ｈｇｆ 베타 쇄와 ｃ-ｍｅｔ 사이의 상호작용의 변조
KR101259655B1 (ko) Ｈｇｆ 베타 사슬 변이체
US7572447B2 (en) Methods and compositions for selective modulation of vascularization
CN100538364C (zh) 调节HGFβ链和C-MET的相互作用
AU2011236037A1 (en) Modulating the interaction between HGF beta chain and C-MET

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
WITB Written withdrawal of application