KR20160095186A - Ｃ-ｍｅｔ 및 ｅｇｆｒ 길항제로의 조합 요법 - Google Patents

Ｃ-ｍｅｔ 및 ｅｇｆｒ 길항제로의 조합 요법 Download PDF

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엘렌 필바로프
마크 머찬트
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Abstract

본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 성장 인자 조절 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 c-met 길항제 및 EGFR 길항제를 포함하는, 병리학적 상태, 예컨대 암의 치료를 위한 조합 요법에 관한 것이다.

Description

Ｃ-ＭＥＴ 및 ＥＧＦＲ 길항제로의 조합 요법{COMBINATION THERAPY WITH C-MET AND EGFR ANTAGONISTS}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 35 USC § 119(e) 하에 미국 가출원 번호 61/034,446 (2008년 3월 6일 출원), 및 미국 가출원 번호 61/044,438 (2008년 4월 11일 출원)을 우선권으로 청구하고, 이들의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 성장 인자 조절 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 병리학적 상태, 예컨대 암의 치료를 위한 조합 요법에 관한 것이다.
HGF는 다수의 상이한 세포 유형에 대한 분열촉진(mitogenic), 운동촉진(motogenic) 및 형태발생(morphogenic) 활성이 있는 중간엽-유래 다면발현성 인자이다. HGF 효과는 특이적 타이로신 카이네이스인 c-met에 의해 매개되고, 비정상적인 HGF 및 c-met 발현이 각종 암에서 빈번하게 관찰된다. 예를 들어, [Maulik et al., Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59]; [Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7):863-867] 참조. HGF/c-Met 신호전달 경로의 조절이 종양 진행 및 전이에 연루된다. 예를 들어, [Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300] 참조.
HGF는 c-met 수용체 타이로신 카이네이스 (RTK)의 세포외 도메인에 결합하고, 다양한 생물학적 프로세스 예컨대 세포 분산, 증식 및 생존을 조절한다. HGF-Met 신호전달은 정상적인 배아 발달에, 특히 근육 전구 세포의 이동 및 간 및 신경계의 발달에서 필수적이다 ([Bladt et al., Nature (1995), 376, 768-771]; [Hamanoue et al., Faseb J (2000), 14, 399-406]; [Maina et al., Cell (1996), 87, 531-542]; [Schmidt et al., Nature (1995), 373, 699-702]; [Uehara et al., Nature (1995), 373, 702-705]). Met 녹아웃(knockout) 마우스와 HGF 녹아웃 마우스의 발달 표현형이 매우 유사하고, 이는 HGF가 Met 수용체에 대한 동족 리간드임을 시사한다 ([Schmidt et al., 1995, 상기 문헌]; [Uehara et al., 1995, 상기 문헌]). HGF-Met는 간 재생, 혈관형성, 및 상처 치유에서 또한 역할을 한다 ([Bussolino et al., J Cell Biol (1992), 119, 629-641]; [Matsumoto and Nakamura, Exs (1993), 65, 225-249]; [Nusrat et al., J Clin Invest (1994) 93, 2056-2065]). 전구체 Met 수용체가 디설피드 결합에 의해 연결된 세포외 α 서브유닛 및 막-스패닝(spanning) β 서브유닛으로 단백질분해에 의해 절단된다 ([Tempest et al., Br J Cancer (1988), 58, 3-7]). β 서브유닛은 세포질 카이네이스 도메인을 함유하고, C-말단에 다중-기질 도킹(docking) 부위가 있으며, 이곳에서 어댑터(adapter) 단백질이 결합하여 신호전달을 개시한다 ([Bardelli et al., Oncogene (1997), 15, 3103-3111]; [Nguyen et al., J Biol Chem (1997), 272, 20811-20819]; [Pelicci et al., Oncogene (1995), 10, 1631-1638]; [Ponzetto et al., Cell (1994), 77, 261-271]; [Weidner et al., Nature (1996), 384, 173-176]). HGF 결합 시, Met의 활성화가 각각 Gab1 및 Grb2/Sos 매개 PI3-카이네이스 및 Ras/MAPK 활성화를 통해 타이로신 인산화 및 하류 신호전달에 이르고, 이는 세포 운동성 및 증식을 구동한다 ([Furge et al., Oncogene (2000), 19, 5582-5589]; [Hartmann et al., J Biol Chem (1994), 269, 21936-21939]; [Ponzetto et al., J Biol Chem (1996), 271, 14119-14123]; [Royal and Park, J Biol Chem (1995), 270, 27780-27787]).
Met는 발암물질로 처리된 골육종 세포주에서 형질전환성인 것으로 나타났다 ([Cooper et al., Nature (1984), 311, 29-33]; [Park et al., Cell (1986), 45, 895-904]). Met 과발현 또는 유전자 증폭이 각종 다양한 암에서 관찰되었다. 예를 들어, Met 단백질이 결장직장암에서 5배 이상 과발현되고, 간 전이에서 유전자가 증폭된 것으로 보고되었다 ([Di Renzo et al., Clin Cancer Res (1995), 1, 147-154]; [Liu et al., Oncogene (1992), 7, 181-185]). 구강 편평 세포 암종, 간세포 암종, 신세포 암종, 유방 암종, 및 폐 암종에서 Met 단백질이 과발현되는 것으로 또한 보고되었다 ([Jin et al., Cancer (1997), 79, 749-760]; [Morello et al., J Cell Physiol (2001), 189, 285-290]; [Natali et al., Int J Cancer (1996), 69, 212-217]; [Olivero et al., Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868]; [Suzuki et al., Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868]). 또한, mRNA의 과발현이 간세포 암종, 위 암종, 및 결장직장 암종에서 관찰되었다 ([Boix et al., Hepatology (1994), 19, 88-91]; [Kuniyasu et al., Int J Cancer (1993), 55, 72-75]; [Liu et al., Oncogene (1992), 7, 181-185]).
Met의 카이네이스 도메인에서의 다수의 돌연변이가 신장 유두 암종에서 발견되었고, 이는 구성적인 수용체 활성화에 이른다 ([Olivero et al., Int J Cancer (1999), 82, 640-643]; [Schmidt et al., Nat Genet (1997), 16, 68-73]; [Schmidt et al., Oncogene (1999), 18, 2343-2350]). 이러한 활성화 돌연변이는 구성적인 Met 타이로신 인산화를 제공하고, MAPK 활성화, 병소 형성 및 종양형성을 초래한다 ([Jeffers et al., Proc Natl Acad Sci USA (1997), 94, 11445-11450]). 또한, 이러한 돌연변이는 세포 운동성 및 침습을 강화한다 ([Giordano et al., Faseb J (2000), 14, 399-406]; [Lorenzato et al., Cancer Res (2002), 62, 7025-7030]). 형질전환된 세포에서의 HGF-의존적 Met 활성화는 증가된 운동성, 분산 및 이동을 매개하고, 이는 결국 침습성 종양 성장 및 전이에 이른다 ([Jeffers et al., Mol Cell Biol (1996), 16, 1115-1125]; [Meiners et al., Oncogene (1998), 16, 9-20]).
Met는 수용체 활성화, 형질전환 및 침습을 구동시키는 다른 단백질과 상호작용하는 것으로 나타났다. 신생물성 세포에서, Met는 라미닌과 같은 세포외 매트릭스(ECM) 성분에 대한 수용체인 α6β4 인테그린과 상호작용하여, HGF-의존적 침습성 성장을 촉진하는 것으로 보고되었다 ([Trusolino et al., Cell (2001), 107, 643-654]). 또한, Met의 세포외 도메인이 세마포린 패밀리의 구성원인 플렉신 B1과 상호작용하고 침습성 성장을 강화하는 것으로 나타났다 ([Giordano et al., Nat Cell Biol (2002), 4, 720-724]). 추가로, 종양형성 및 전이에 연루된 CD44v6이 Met 및 HGF와 복합체를 형성하고 Met 수용체 활성화를 초래하는 것으로 또한 보고되었다 ([Orian-Rousseau et al., Genes Dev (2002), 16, 3074-3086]).
Met는 Ron 및 Sea가 포함되는 수용체 타이로신 카이네이스 (RTK) 서브패밀리의 구성원이다 ([Maulik et al., Cytokine Growth Factor Rev (2002), 13, 41-59]). Met의 세포외 도메인의 예측은 세마포린 및 플렉신과의 공통된 상동성을 제안한다. Met의 N-말단은 아미노산 약 500개의 Sema 도메인을 함유하고, 이는 모든 세마포린 및 플렉신에서 보존된다. 세마포린 및 플렉신은 신경 발달에서의 역할에 대해 최초로 기술된 분비형 및 막-결합형 단백질의 대형 패밀리에 속한다 ([Van Vactor and Lorenz, Curr Bio (1999), 19, R201-204]). 그러나, 더욱 최근에는, 세마포린 과발현이 종양 침습 및 전이와 상관되었다. 플렉신, 세마포린 및 인테그린에서 발견된 시스테인-풍부 PSI 도메인 (Met-관련 서열 도메인으로 또한 지칭됨)이 Sema 도메인에 인접하고, 여기에 플렉신 및 전사 인자에서 발견되는 면역글로불린-유사 영역인 4개의 IPT 반복물이 이어진다. 최근의 연구는 Met Sema 도메인이 HGF 및 헤파린 결합에 충분함을 시사하였다 ([Gherardi et al., Proc Natl Acad Sci USA (2003), 100(21):12039-44]).
상기 언급된 바와 같이, Met 수용체 타이로신 카이네이스는 이의 동족 리간드 HGF에 의해 활성화되고, 수용체 인산화는 MAPK, PI-3 카이네이스 및 PLC-γ의 하류 경로를 활성화시킨다 ([L. Trusolino and P. M. Comoglio, Nat Rev Cancer 2, 289 (2002)]; [C. Birchmeier et al., Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003)]). 카이네이스 도메인 내의 Y1234/Y1235의 인산화는 Met 카이네이스 활성화에 결정적인 한편, 다중 기질 도킹 부위 내의 Y1349 및 Y1356은 하류 신호전달 경로의 활성화를 매개하기 위한 src 상동성-2 (SH2) 단백질, 포스포타이로신 결합 (PTB) 단백질, 및 Met 결합 도메인 (MBD) 단백질의 결합에 중요하다 ([C. Ponzetto et al., Cell 77, 261 (1994)]; [K. M. Weidner et al., Nature 384, 173 (1996)]; [G. Pelicci et al., Oncogene 10, 1631 (1995)]). 추가적인 막근접(juxtamembrane) 인산화 부위인 Y1003은 Cb1 E3-라이게이스의 타이로신 카이네이스 결합 (TKB) 도메인에의 결합에 대해 잘 특성화되었다 ([P. Peschard et al., Mol Cell 8, 995 (2001)]; [P. Peschard, N. Ishiyama, T. Lin, S. Lipkowitz, M. Park, J Biol Chem 279, 29565 (2004)]). Cb1 결합은 엔도필린-매개 수용체 세포내이입, 유비퀴틴화, 및 이어지는 수용체 분해를 구동시키는 것으로 보고되었다 ([A. Petrelli et al., Nature 416, 187 (2002)]). 유사한 Cb1 결합 부위를 또한 지니는 EGFR 패밀리에서 이러한 수용체 하향조절 메커니즘이 기존에 기술되었다 ([K. Shtiegman, Y. Yarden, Semin Cancer Biol 13, 29 (2003)]; [M. D. Marmor, Y. Yarden, Oncogene 23, 2057 (2004)]; [P. Peschard, M. Park, Cancer Cell 3, 519 (2003)]). Met 및 HGF의 조절곤란이 다양한 종양에서 보고되었다. 리간드-구동 Met 활성화가 여러 암에서 관찰되었다. 상승된 혈청 및 종양내 HGF가 폐, 유방 암, 및 다발성 골수종에서 관찰된다 ([J. M. Siegfried et al., Ann Thorac Surg 66, 1915 (1998)]; [P. C. Ma et al., Anticancer Res 23, 49 (2003)]; [B. E. Elliott et al. Can J Physiol Pharmacol 80, 91 (2002)]; [C. Seidel, et al., Med Oncol 15, 145 (1998)]). Met 및/또는 HGF의 과발현, Met 증폭 또는 돌연변이가 결장직장암, 폐암, 위암 및 신장암과 같은 다양한 암에서 보고되었고, 리간드-독립적 수용체 활성화를 구동시키는 것으로 생각된다 ([C. Birchmeier et al., Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003)]; [G. Maulik et al., Cytokine Growth Factor Rev 13, 41 (2002)]). 추가적으로, 마우스 간 모델에서의 Met의 유도성 과발현은 간세포 암종을 발생시키고, 이는 수용체 과발현이 리간드 독립적 종양형성을 구동시킨다는 것을 실연한다 ([R. Wang, et al., J Cell Biol 153, 1023 (2001)). Met를 암에 연루시키는 가장 흥미로운 증거가 가족형 및 산발성 신장 유두 암종 (RPC) 환자에서 보고되었다. 수용체의 구성적 활성화에 이르는 Met의 카이네이스 도메인에서의 돌연변이가 RPC에서 생식계열 및 체세포 돌연변이로서 확인되었다 ([L. Schmidt et al., Nat Genet 16, 68 (1997)]). 트랜스제닉(transgenic) 마우스 모델에서의 이러한 돌연변이의 도입은 종양형성 및 전이에 이른다 ([M. Jeffers et al., Proc Natl Acad Sci USA 94, 11445 (1997)]).
c-met 및 c-met 길항제에 관한 간행물에는 [Martens, T, et al (2006) Clin Cancer Res 12(20 Pt 1):6144]; US 6,468,529; WO2006/015371; WO2007/063816; WO2006/104912; WO2006/104911; WO2006/113767; US2006-0270594; US2006-US 특허 번호 7,481,993; WO2009/007427; WO2005/016382; WO2009/002521; WO2007/143098; WO2007/115049; WO2007/126799가 포함된다.
표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 패밀리는 분화 및 증식과 같은 세포 응답에서 수반되는 4개의 밀접하게 관련된 수용체 (HER1/EGFR, HER2, HER3 및 HER4)를 포함한다. EGFR 카이네이스, 또는 이의 리간드 TGF-알파의 과발현이 유방, 폐, 결장직장, 난소, 신세포, 방광, 두경부 암, 교모세포종, 및 별아교세포종이 포함되는 다수의 암과 빈번하게 관련되고, 이러한 종양들의 악성 성장에 기여하는 것으로 여겨진다. EGFR 유전자 (EGFRvIII)에서의 특정 결실-돌연변이가 세포 종양발생성을 증가시키는 것으로 또한 발견되었다. EGFR-자극 신호전달 경로의 활성화는 잠재적으로 암-촉진성인 여러 프로세스, 예를 들어, 증식, 혈관형성, 세포 운동성 및 침습, 감소된 세포자멸사 및 약물 내성 유도를 촉진한다. 증가된 HER1/EGFR 발현이 진행된 질환, 전이 및 불량한 예후와 빈번하게 연관된다. 예를 들어, NSCLC 및 위암에서, 증가된 HER1/EGFR 발현이 높은 전이율, 불량한 종양 분화 및 증가된 종양 증식과 상관되는 것으로 나타났다.
수용체의 내인성 단백질 타이로신 카이네이스 활성을 활성화시키고/시키거나 하류 신호전달을 증가시키는 돌연변이가 NSCLC 및 교모세포종에서 관찰되었다. 그러나, EGF 수용체 억제제, 예를 들어 에를로티닙(erlotinib) (TARCEVA®) 또는 제피티닙(gefitinib)에 대한 민감성을 부여하는 것에서의 본질적인 메커니즘으로서의 돌연변이의 역할은 논쟁의 여지가 있었다. EGF 수용체 타이로신 카이네이스 억제제 제피티닙에 대한 응답성을 예측하도록 돌연변이체 형태의 전장 EGF 수용체가 보고되었다 ([Paez, J. G. et al. (2004) Science 304:1497-1500]; [Lynch, T. J. et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350:2129-2139]). 세포 배양 연구에서, 이같은 돌연변이체 형태의 EGF 수용체 (즉, H3255)를 발현하는 세포주가 EGF 수용체 타이로신 카이네이스 억제제 제피티닙에 의한 성장 억제에 더욱 민감성이고, 훨씬 더 높은 농도의 제피티닙이 야생형 EGF 수용체를 발현하는 종양 세포주를 억제하는데 요구된 것으로 나타났다. 이러한 관찰은 특정 돌연변이체 형태의 EGF 수용체가 EGF 수용체 억제제에 대해 더 큰 민감도를 반영할 수 있음을 시사하지만, 완전하게 비-응답성인 표현형은 확인되지 않는다.
EGFR의 카이네이스 활성을 직접적으로 억제하는 화합물, 뿐만 아니라 EGFR 활성화를 차단함으로써 EGFR 카이네이스 활성을 감소시키는 항체를 항종양제로서 사용하기 위해 개발하는 것은 집중적인 연구가 시도되고 있는 분야이다 (de Bono J. S. and Rowinsky, E.K. (2002) Trends in Mol. Medicine 8:S19-S26]; [Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313]). 여러 연구에서, 일부 EGFR 카이네이스 억제제가 특정한 또다른 항암제 또는 화학요법제 또는 치료와 조합되어 사용되는 경우 종양 세포 또는 신생물 사망을 개선시킬 수 있다는 것이 실연되거나, 개시되거나, 또는 제안되었다 (예를 들어, [Herbst, R. S. et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1:719-732]; [Solomon, B. et al (2003) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55:713-723]; [Krishnan, S. et al. (2003) Frontiers in Bioscience 8, e1-13]; [Grunwald, V. and Hidalgo, M. (2003) J. Nat. Cancer Inst. 95:851-867]; [Seymour L. (2003) Current Opin. Investig. Drugs 4(6):658-666]; [Khalil, M.Y. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther.3:367-380]; [Bulgaru, A.M. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther.3:269-279]; [Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313]; [Ciardiello, F. et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6:2053-2063]; 및 특허 공개 번호 US 2003/0157104).
에를로티닙 (예를 들어, 에를로티닙 HCl (TARCEVA® 또는 OSI-774로 또한 알려짐))은 경구 투여가능한, EGFR 카이네이스의 억제제이다. 시험관 내에서, 에를로티닙은 결장직장암 및 유방암이 포함되는 다수의 인간 종양 세포주에서 EGFR 카이네이스에 대한 실질적인 억제 활성을 나타냈고 ([Moyer J.D. et al. (1997) Cancer Res. 57:4838]), 전-임상 평가는 다수의 EGFR-발현 인간 종양 이종이식편에 대한 활성을 나타냈다 (Pollack, V. A. et al.(1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:739]. 에를로티닙은 두경부암 ([Soulieres, D., et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:77]), NSCLC ([Perez-Soler R, et al. (2001) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20:310a, abstract 1235]), CRC ([Oza, M., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:196a, abstract 785]) 및 MBC ([Winer, E., et al. (2002) Breast Cancer Res. Treat. 76:5115a, abstract 445]; [Jones, R.J., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:45a, abstract 180])이 포함되는 다수의 적응증에서 임상 시험에서 활성을 나타냈다. 제III상 시험에서, 에를로티닙 단독요법은 치료-불응성 NSCLC가 진행된 환자에서 유의하게 생존을 연장시켰고, 질환 진행을 지연시켰으며, 폐암-관련 증상의 악화를 지연시켰다 ([Shepherd, F. et al. (2004) J. Clin. Oncology, 22:14S (July 15 Supplement), Abstract 7022]). 2004년 11월에, 미국 식품의약청 (FDA)은 1회 이상의 이전의 화학요법 계획의 실패 후의 국소적으로 진행되었거나 전이성인 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자의 치료에 대해 TARCEVA®을 승인하였다.
암 치료에서의 상당한 발달에도 불구하고, 개선된 치료법이 여전히 추구된다.
특허 출원 및 간행물을 포함하여, 본원에서 언급된 모든 참고문헌은 전문이 본원에 참고로 인용된다.
발명의 개요
본 발명은 c-met 길항제가 EGFR 길항제와 조합됨으로써 상당한 항종양 활성이 제공되는, 암과 같은 병리학적 상태의 치료를 위한 조합 요법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 대상에게 치료적 유효량의 c-met 길항제 및 EGFR 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
c-met 길항제의 예로는 가용성 c-met 수용체, 가용성 HGF 변이체, c-met 또는 HGF에 대해 특이적인 앱타머(aptamer) 또는 펩티바디(peptibody), c-met 소형 분자, 항-c-met 항체 및 항-HGF 항체가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 항-c-met 항체이다.
한 실시양태에서, 항-c-met 항체는 도 7에 도시된 CDR1-HC, CDR2-HC 및 CDR3-HC 서열 (서열 13-15) 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 도 7에 도시된 CDR1-LC, CDR2-LC 및 CDR3-LC 서열 (서열 5-7) 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인은 도 7에 도시된 FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC 및 FR4-HC 서열 (서열 9-12)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인은 도 7에 도시된 FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC 및 FR4-LC 서열 (서열 1-4)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-c-met 항체는 1가이고, Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 도 7에 도시된 Fc 서열 (서열 17)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 1가이고, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 이때 제1 폴리펩티드는 도 7에 도시된 Fc 서열 (서열 17)을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 도 8에 도시된 Fc 서열 (서열 18)을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-c-met 항체는 (a) 서열
Figure pat00001
의 중쇄 가변 도메인, 도 7에 도시된 CH1 서열 (서열 16), 및 도 7에 도시된 Fc 서열 (서열 17)을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (b) 서열
Figure pat00002
의 경쇄 가변 도메인, 및 도 7에 도시된 CL1 서열 (서열 8)을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (c) 도 8에 도시된 Fc 서열 (서열 18)을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함한다.
한 양상에서, 항-c-met 항체는 항체 단편 내의 Fc 서열들의 동종이량체화를 최소화하면서 이종이량체화를 촉진하는 특성을 하나 이상 포함한다. 이같은 특성(들)은 면역글로불린 집단의 수율 및/또는 순도 및/또는 균질성을 개선시킨다. 한 실시양태에서, 항체는 WO2005/063816에 기술된 바와 같은 "놉(knob)" 및 "홀(hole)"을 구성하는 Fc 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 홀 돌연변이는 Fc 폴리펩티드 내의 T366A, L368A 및/또는 Y407V 중 하나 이상일 수 있고, 공동(cavity) 돌연변이는 T366W일 수 있다.
일부 실시양태에서, c-met 길항제는 SGX-523, PF-02341066, JNJ-38877605, BMS-698769, PHA-665,752, SU5416, SU1274, XL-880, MGCD265, ARQ 197, MP-470, AMG 102, 항체 223C4 또는 인간화 항체 223C4 (WO2009/007427), L2G7, NK4, XL-184, MP-470, 또는 Comp-1이다.
c-met 길항제는 c-met 활성화, 하류의 분자성 신호전달 (예를 들어, 분열촉진물질 활성화 단백질 카이네이스 (MAPK) 인산화, AKT 인산화, c-met 인산화, PI3 카이네이스 매개 신호전달), 세포 증식, 세포 이동, 세포 생존, 세포 형태발생 및 혈관형성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 HGF/c-met-관련 효과들 중 하나 이상의 양상을 감소시키거나 억제하는데 사용될 수 있다. c-met에 대한 리간드 (예를 들어, HGF) 결합, c-met 인산화 및/또는 c-met 다량체화의 파괴가 포함되는 임의의 생물학적으로 관련된 메커니즘에 의해 이러한 효과들이 조정될 수 있다.
EGFR 길항제의 예로는 EGFR에 결합하는 항체 및 소형 분자가 포함된다. EGFR 길항제에는 US5616582, US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, WO9814451, WO9850038, WO9909016, WO9924037, WO9935146, WO0132651, US6344455, US5760041, US6002008, US5747498에 기술된 화합물들과 같은 소형 분자가 또한 포함된다. 특정 소형 분자 EGFR 길항제에는 OSI-774 (CP-358774, 에를로티닙 (OSI Pharmaceuticals)); PD 183805 (CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 디하이드로클로라이드 (Pfizer Inc.)); 이레사(Iressa)® (ZD1839, 제피티닙 (AstraZeneca)); ZM 105180 ((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린 (Zeneca)); BIBX-1382 (N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민 (Boehringer Ingelheim)); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-하이드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); EKB-569 (N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드); 라파티닙 (타이커브(Tykerb) (Glaxo SmithKline)); ZD6474 (작티마(Zactima) (AstraZeneca)); CUDC-101 (Curis); 카네르티닙 (CI-1033); AEE788 (6-[4-[(4-에틸-1-피페라지닐)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민, WO2003013541 (Novartis)) 및 PKI166 (4-[4-[[(1R)-1-페닐에틸]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀, WO9702266 (Novartis))이 포함된다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제은 본원에 참고로 인용된 US 5,757,498에 따른 하기 화학식 I을 갖는 것이다:
<화학식 I>
Figure pat00003
식 중,
m은 1, 2, 또는 3이고;
각각의 R1은 수소, 할로, 하이드록시, 하이드록시아미노, 카르복시, 니트로, 구아니디노, 우레이도, 시아노, 트리플루오로메틸, 및 -(C1-C4 알킬렌)-W-(페닐) (식 중 W는 단일 결합, O, S 또는 NH이다)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되거나;
또는 각각의 R1은 시아노로 치환된 C1-C4 알킬 및 R9로부터 독립적으로 선택되거나 (식 중 R9는 R5, -OR6, -NR6R6, -C(O)R7, -NHOR5, -OC(O)R6, 시아노, A 및 -YR5로 구성된 군으로부터 선택되고; R5는 C1-C4 알킬이고; R6은 독립적으로 수소 또는 R5이고; R7은 R5, -OR6 또는 -NR6R6이고; A는 피페리디노, 모르폴리노, 피롤리디노, 4-R6-피페라진-1-일, 이미다졸-1-일, 4-피리돈-1-일, -(C1-C4 알킬렌)(CO2H), 페녹시, 페닐, 페닐설파닐, C2-C4 알케닐, 및 -(C1-C4 알킬렌)C(O)NR6R6으로부터 선택되고; Y는 S, SO, 또는 SO2이며; R5, -OR6 및 -NR6R6 내의 알킬 모이어티(moiety)는 1개 내지 3개의 할로 치환기로 임의 치환되고, R5, -OR6 및 -NR6R6 내의 알킬 모이어티는 1개 또는 2개의 R9 기로 임의 치환되며, 상기 임의 치환기의 알킬 모이어티는 할로 또는 R9로 임의 치환되고, 단 2개의 헤테로원자가 동일한 탄소 원자에 부착되지 않는다);
또는 각각의 R1은 -NHSO2R5, 프탈이미도-(C1-C4)-알킬설포닐아미노, 벤즈아미도, 벤젠설포닐아미노, 3-페닐우레이도, 2-옥소피롤리딘-1-일, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일, 및 R10-(C2-C4)-알카노일아미노로부터 독립적으로 선택되거나 (식 중, R10은 할로, -OR6, C2-C4 알카노일옥시, -C(O)R7, 및 -NR6R6으로부터 선택되고; 상기 -NHSO2R5, 프탈이미도-(C1-C4)-알킬설포닐아미노, 벤즈아미도, 벤젠설포닐아미노, 3-페닐우레이도, 2-옥소피롤리딘-1-일, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일, 및 R10-(C2-C4)-알카노일아미노 R1 기는 할로, C1-C4 알킬, 시아노, 메탄설포닐 및 C1-C4 알콕시로부터 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 치환기로 임의 치환된다);
또는 2개의 R1 기가, 이들이 부착된 탄소와 함께, O, S 및 N으로부터 선택된 1개 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 5-8원 고리를 형성하고;
R2는 수소, 또는 할로, C1-C4 알콕시, -NR6R6 및 -SO2R5로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 3개의 치환기로 임의 치환된 C1-C6 알킬이고;
n은 1 또는 2이고, 각각의 R3은 수소, 할로, 하이드록시, C1-C6 알킬, -NR6R6, 및 C1-C4 알콕시로부터 독립적으로 선택되고, 상기 R3 기의 알킬 모이어티는 할로, C1-C4 알콕시, -NR6R6, 및 -SO2R로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 3개의 치환기로 임의 치환되고;
R4는 아지도 또는 -(에티닐)-R11 (식 중, R11은 수소, 또는 하이드록시, -OR6 또는 -NR6R6으로 임의 치환된 C1-C6 알킬이다)이다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 화학식 I에 따른 화합물이다:
(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-[3-(3'-하이드록시프로핀-1-일)페닐]-아민; [3-(2'-(아미노메틸)-에티닐)페닐]-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-아민; (3-에티닐페닐)-(6-니트로퀴나졸린-4-일)-아민; (6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-(4-에티닐페닐)-아민; (6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-2-메틸페닐)-아민; (6-아미노퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-(6-메탄설포닐아미노퀴나졸린-4-일)-아민; (3-에티닐페닐)-(6,7-메틸렌디옥시퀴나졸린-4-일)-아민; (6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-6-메틸페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-(7-니트로퀴나졸린-4-일)-아민; (3-에티닐페닐)-[6-(4'-톨루엔설포닐아미노)퀴나졸린-4-일]-아민; (3-에티닐페닐)-{6-[2'-프탈이미도-에트-1'-일-설포닐아미노]퀴나졸린-4-일}-아민; (3-에티닐페닐)-(6-구아니디노퀴나졸린-4-일)-아민; (7-아미노퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-(7-메톡시퀴나졸린-4-일)-아민; (6-카르보메톡시퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (7-카르보메톡시퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; [6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐페닐)-아민; (3-아지도페닐)-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-아민; (3-아지도-5-클로로페닐)-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-아민; (4-아지도페닐)-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-아민; (3-에티닐페닐)-(6-메탄설포닐-퀴나졸린-4-일)-아민; (6-에탄설파닐-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-4-플루오로-페닐)-아민; (6,7-디메톡시-퀴나졸린-4-일)-[3-(프로핀-1'-일)-페닐]-아민; [6,7-비스-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(5-에티닐-2-메틸-페닐)-아민; [6,7-비스-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-4-플루오로-페닐)-아민; [6,7-비스-(2-클로로-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; [6-(2-클로로-에톡시)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; [6,7-비스-(2-아세톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; 2-[4-(3-에티닐-페닐아미노)-7-(2-하이드록시-에톡시)-퀴나졸린-6-일옥시]-에탄올; [6-(2-아세톡시-에톡시)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; [7-(2-클로로-에톡시)-6-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; [7-(2-아세톡시-에톡시)-6-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; 2-[4-(3-에티닐-페닐아미노)-6-(2-하이드록시-에톡시)-퀴나졸린-7-일옥시]-에탄올; 2-[4-(3-에티닐-페닐아미노)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-6-일옥시]-에탄올; 2-[4-(3-에티닐-페닐아미노)-6-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-7-일옥시]-에탄올; [6-(2-아세톡시-에톡시)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; (3-에티닐-페닐)-{6-(2-메톡시-에톡시)-7-[2-(4-메틸-피페라진-1-일)-에톡시]-퀴나졸린-4-일}-아민; (3-에티닐-페닐)-[7-(2-메톡시-에톡시)-6-(2-모르폴린-4-일)-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-아민; (6,7-디에톡시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디부톡시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디이소프로폭시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디에톡시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐-2-메틸-페닐)-아민; [6,7-비스-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-(3-에티닐-2-메틸-페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-[6-(2-하이드록시-에톡시)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-아민; [6,7-비스-(2-하이드록시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-(3-에티닐페닐)-아민; 2-[4-(3-에티닐-페닐아미노)-6-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-7-일옥시]-에탄올; (6,7-디프로폭시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-페닐)-아민; (6,7-디에톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-5-플루오로-페닐)-아민; (6,7-디에톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-4-플루오로-페닐)-아민; (6,7-디에톡시-퀴나졸린-4-일)-(5-에티닐-2-메틸-페닐)-아민; (6,7-디에톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-4-메틸-페닐)-아민; (6-아미노메틸-7-메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-페닐)-아민; (6-아미노메틸-7-메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐메틸-7-메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐에틸-7-메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐메틸-7-에톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐에틸-7-에톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐메틸-7-이소프로폭시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐메틸-7-프로폭시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐메틸-7-메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐에틸-7-이소프로폭시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; 및 (6-아미노카르보닐에틸-7-프로폭시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디에톡시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-[6-(2-하이드록시-에톡시)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-아민; [6,7-비스-(2-하이드록시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-(3-에티닐페닐)-아민; [6,7-비스-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디메톡시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-(6-메탄설포닐아미노-퀴나졸린-1-일)-아민; 및 (6-아미노-퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 EGFR 길항제는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민이다. 특정 실시양태에서, EGFR 길항제 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민은 HCl 염 형태이다. 또다른 특정 실시양태에서, EGFR 길항제 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민은 약 6.26, 12.48, 13.39, 16.96, 20.20, 21.10, 22.98, 24.46, 25.14 및 26.91에 2-세타 각도로 표현되는 특징적인 피크가 있는 X선 분말 회절 패턴을 나타내는, 실질적으로 균질한 결정성 다형체 형태 (WO 01/34,574에서 다형체 B로 기술됨)이다. 이같은 다형체 형태의 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민은 타르세바(Tarceva)™, 뿐만 아니라 OSI-774, CP-358774 및 에를로티닙으로 지칭된다.
EGFR 길항제는 EGFR 활성화, 하류의 분자성 신호전달, 세포 증식을 포함하지만 이에 한정되지 않는 EGFR-EGFR 리간드-관련 효과들 중 하나 이상의 양상을 감소시키거나 억제하는데 사용될 수 있다. EGFR에 대한 리간드 결합의 파괴 및 EGFR 인산화의 파괴가 포함되는 임의의 생물학적으로 관련된 메커니즘에 의해 이러한 효과들이 조정될 수 있다.
본 발명의 방법은 임의의 적절한 병리학적 상태에 영향을 미치는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은, 고형 종양 및 연조직 종양 양쪽 모두를 막론하고, 여러 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 치료를 받을 수 있는 암의 비제한적인 예로는 유방암, 결장직장암, 직장암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 비-호지킨(Hodgkin) 림프종 (NHL), 신세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 교모세포종, 흑색종, 난소암, 위암, 중피종, 및 다발성 골수종이 포함된다. 특정 양상에서, 암은 전이성이다. 또다른 양상에서, 암은 비-전이성이다.
한 실시양태에서, 항-c-met 항체와 에를로티닙이 비-소세포 폐 암종과 같은 암의 조합 요법에서 사용된다.
특정 실시양태에서, 암은 EGFR 길항제 (예를 들어, 에를로티닙 또는 제피티닙) 내성 암이 아니다. 특정 실시양태에서, 암은 에를로티닙 또는 제피티닙 내성 암이 아니다.
특정 실시양태에서, 암은 타이로신 카이네이스 억제제-내성 암이 아니다. 특정 실시양태에서, 암은 소형 분자 EGFR 타이로신 카이네이스 억제제-내성 암이 아니다.
특정 실시양태에서, 암은 c-met 및/또는 EGFR 발현, 증폭, 또는 활성화를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 암은 c-met 및/또는 EGFR 발현, 증폭, 또는 활성화를 나타내지 않는다. 특정 실시양태에서, 암은 c-met 증폭을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 암은 c-met 증폭 및 EGFR 증폭을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 암은 야생형 EGFR 유전자를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 암은 야생형 EGFR 유전자 및 c-met 증폭 및/또는 c-met 돌연변이를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 암은 EGFR 돌연변이를 나타낸다. 돌연변이는 EGFR 유전자 또는 EGFR 유전자와 관련된 조절 영역의 임의의 부분 내에 위치할 수 있다. 예시적인 EGFR 돌연변이에는, 예를 들어, 엑손 18, 19, 20 또는 21에서의 돌연변이, 카이네이스 도메인에서의 돌연변이, G719A, L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, S768I, L858P, E746-R748 del, R748-P753 del, M766-A767 AI ins, S768-V769 SVA ins, P772-H773 NS ins, 2402OC, 2482OA, 2486T>C, 2491 G>C, 2494OC, 2510OT, 2539OA, 2549OT, 2563OT, 2819T>C, 2482-2490 del, 2486-2503 del, 2544-2545 ins GCCATA, 2554-2555 ins CCAGCGTGG, 또는 2562-2563 ins AACTCC가 포함된다. EGFR 활성화 돌연변이의 또다른 예들이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, US 특허 공개 번호 2005/0272083 참조). 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포주는 EGFR 유전자 내에 T790M 돌연변이를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 암은 c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 암은 c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타내지 않는다.
특정 실시양태에서, 암은 구성적인 c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 구성적인 EGFR은 타이로신 카이네이스 도메인에서의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 암은 구성적인 c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타내지 않는다.
특정 실시양태에서, 암은 리간드-독립적 c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 암은 리간드-독립적 c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타내지 않는다.
c-met 길항제는 순차적으로, 또는 동일한 조성물 내에서 또는 별도의 조성물로서 EGFR 길항제와 조합되어 투여될 수 있다. c-met 길항제 및 EGFR 길항제는 동시에, 예를 들어, 단일 조성물로서, 또는 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 사용하는 2가지 이상의 별개의 조성물로서 투여될 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 임의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 임의 순서로 순차 투여 및 동시 투여 양쪽 모두를 조합하여 단계들이 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 2가지 이상의 조성물의 투여 사이에 수분 내지 수일에서 수주 내지 수개월까지 범위의 간격이 존재할 수 있다. 예를 들어, EGFR 길항제가 먼저 투여된 후, c-met 길항제가 투여될 수 있다. 그러나, c-met 길항제의 동시 투여 또는 c-met 길항제를 먼저 투여하는 것이 또한 고려된다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 c-met 길항제 (예컨대 항-c-met 항체)의 투여에 이은 EGFR 길항제 (예컨대 에를로티닙 (TARCEVA®))의 투여를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 2가지 이상의 조성물의 투여 사이에 수분 내지 수일에서 수주 내지 수개월까지 범위의 간격이 존재할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 유효량의 c-met 길항제 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 암 치료에서 사용하기 위한 조성물로서, 상기 사용이 EGFR 길항제의 동시 투여 또는 순차적 투여를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 항-c-met 항체이다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 (TARCEVA®)이다.
한 양상에서, 본 발명은 유효량의 c-met 길항제 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 암 치료에서 사용하기 위한 조성물로서, 상기 사용이 EGFR 길항제의 동시 투여 또는 순차적 투여를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 항-c-met 항체이다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 (TARCEVA®)이다.
치료될 특정 암 적응증에 따라, 본 발명의 조합 요법은 추가적인 치료제, 예컨대 화학요법제, 또는 추가적인 요법 예컨대 방사선요법 또는 수술과 조합될 수 있다. 다수의 공지된 화학요법제가 본 발명의 조합 요법에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 특정 적응증의 치료에 대해 관례적인 화학요법제들이 사용될 것이다. 바람직하게는, 조합되어 사용될 각각의 치료제의 투여량 및 빈도는 또다른 작용제(들) 없이 사용되는 경우의 상응하는 작용제의 투여량 또는 빈도와 동일하거나 이보다 낮을 것이다.
도 1a 및 1b: qRT-PCR에 의한 NSCLC 세포주 및 원발성 종양에서의 EGFR 및 MET mRNA 공동-발현의 확인. EGFR 및 MET mRNA의 발현이 NSCLC 세포주 (1a) 또는 동결된 원발성 NSCLC 종양의 용해물 (1b)의 패널에서 정량적 RT-PCR에 의해 결정되었다. EGFR 및 MET mRNA 수준이 세포주 (ρ=0.59, p<0.0001) 및 원발성 NSCLC 검사물 (ρ=0.48, p=0.0003)에서 양성으로 상관되었다.
도 2: c-met에 대해 지시된 테트라사이클린 유도성 shRNA 또는 GFP에 대해 지시된 대조군 shRNA (shGFP2)를 함유하는 EBC1 shMet 4.12 세포 (shMet 4.12)를 대조군 배지 (Con) 또는 0.1 ㎍/㎖의 테트라사이클린 유사체 독시사이클린이 있는 배지 (Dox)에서 48시간 동안 성장시켰다. 2시간 동안의 혈청 고갈 후, 세포를 처리하지 않거나 (-), 또는 TGFα (T, 20 nM) 또는 헤레굴린(Heregulin) b1 (Hrg, 2 nM)으로 20분 동안 처리하였다. 전체 세포 용해물을 지시된 바와 같이 전체 단백질 및 인단백질의 발현에 대해 평가하였다. 레인들 간의 등가의 로딩(loading)을 나타내도록 베타-액틴 (β-액틴)이 검출되었다.
도 3: c-met에 대해 지시된 유도성 shRNA 또는 GFP에 대해 지시된 대조군 shRNA를 함유하는 NSCLC H441 세포를 대조군 배지 또는 0.1 ㎍/㎖ Dox를 함유하는 배지 (Dox)에서 48시간 동안 성장시켰다. 2시간 동안의 혈청 고갈 후, 세포를 처리하지 않거나 (-), 또는 TGFα (T) 또는 헤레굴린 b1 (H)으로 20분 동안 처리하였다. 레인들 간의 등가의 로딩을 나타내도록 베타-액틴 (β-액틴) (네번째 패널)이 검출되었다.
도 4: EBC-1 NSCLC 이종이식 모델에서의 에를로티닙과 c-met의 shRNA 녹다운(knockdonw)의 조합 효능. EBC-1-shMet-4.5 종양이 누드(nude) (CRL nu/nu) 동물에서 확립된 후, 메틸셀룰로스 트윈 (MCT) 비히클 + 5％ 수크로스를 함유하는 음료수 (Suc) (화살표가 지시하는 날에 PO, QD), MCT + 5％ 수크로스로 제형된 음료수 내의 1 ㎎/㎖ 독시사이클린 (Dox) (100 ㎎/㎏; 화살표가 지시하는 날에 PO, QD), 에를로티닙 + 5％ 수크로스를 함유하는 음료수 (화살표가 지시하는 날에 PO, QD), 또는 에를로티닙 + 5％ 수크로스로 제형된 음료수 내의 1 ㎎/㎖ 독시사이클린 (화살표가 지시하는 날에 PO, QD)으로 처리하였다. 화살표로 지시된 날에 경구 투약하였다. 수크로스 또는 Dox 음료수는 병들을 2-3일마다 교환하면서 연구 기간 전반에 걸쳐 유지시켰다. 실시예에 기술된 바와 같이 종양 부피 및 SEM이 계산되었다.
도 5: NCI-H596 hu-HGF-Tg-C3H-SCID 이종이식 모델에서의 MetMAb과 에를로티닙의 조합 효능. NCI-H596 종양을 hu-HGF-Tg-C3H-SCID 또는 C3H-SCID 한배새끼 대조군 동물들에서 성장시키고, 캡티솔(Captisol) 비히클 (PO, QD, ×2주), 에를로티닙 (흑색 원, 짧은 점선; 150 ㎎/㎏, PO, QD, ×2주), MetMAb (30 ㎎/㎏, IP, 1회), 또는 동일한 용량 및 일정의 MetMAb + 에를로티닙의 조합물로 처리하였다. MetMAb (백색 화살촉) 및 에를로티닙 또는 비히클 (흑색 화살촉)에 대해 도면 아래에 지시된 바와 같이 투약하였다. 약 9주 동안 또는 군 내의 대형 종양 크기로 인해 연구에서 군이 제거될 때까지 일주일에 2회 내지 3회 캘리퍼로 종양을 측정하였다. 실시예에 기술된 바와 같이 종양 부피 및 SEM이 계산되었다.
도 6: 종양의 크기가 배가되기까지 걸리는 시간으로 정의되는 종양 배가 시간 (TTD) 측정이 각각의 군에 대해 계산되었고, 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 생성시키는데 사용되었다. MetMAb + 에를로티닙의 조합은 MetMAb-처리군의 17.8 (± 2.2) 일, 에를로티닙-처리군의 9.5 (± 1.2) 일, 및 비히클 대조군의 9.5 (± 1.2) 일에 비해 49.5 (± 2.6) 일의 평균 TTD로 종양 진행에서 극적인 개선을 나타냈다. 비히클 및 에를로티닙 군에 대한 곡선이 완전히 겹쳐졌다.
도 7은 항-c-met 항체의 한 실시양태의 프레임워크 영역 (FR), 초가변 영역 (HVR), 제1 불변 도메인 (CL 또는 CH1) 및 Fc 영역 (Fc)의 아미노산 서열을 도해한다. 도해된 Fc 서열은 WO 2005/063816에 기술된 바와 같은 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다.
도 8은 WO 2005/063816에 기술된 바와 같은 돌연변이 T366W를 포함하는 Fc 폴리펩티드의 서열을 도해한다. 한 실시양태에서, 이러한 서열을 포함하는 Fc 폴리펩티드가 도 7의 Fc 서열을 포함하는 Fc 폴리펩티드와 복합체를 형성하여, Fc 영역이 생성된다.
도 9a-e: c-met 활성이 EGFR 리간드의 발현을 조절한다. a) HGF로의 처리가 HGF-응답성 NSCLC 세포주에서 EGFR 리간드의 상향조절을 유도하였다. Hop92 또는 NCI-H596 세포를 하룻밤 동안 혈청-고갈시킨 후, 처리하지 않거나 (HGF 없음), 또는 HGF (50 ng/㎖)로 6시간 동안 처리하였다 (HGF). 처리되지 않은 세포 및 HGF로 처리된 세포로부터의 RNA를 실시예에 기술된 바와 같이 마이크로어레이 분석하였다. RMA = 상대적 마이크로어레이. b) c-met 녹다운이 리간드-독립적 NSCLC 세포주 EBC-1에서 EGFR 리간드의 발현을 감소시켰다. c-met에 대해 지시된 shRNA를 안정적으로 발현하는 클론 (클론 3-15 및 4-12)을 처리하지 않거나 (Dox 없음), 또는 독시사이클린 (Dox)으로 24시간 또는 48시간 동안 처리하였다. 세포들로부터의 RNA를 실시예에 기술된 바와 같이 마이크로어레이 분석하였다. c) c-met에 대해 지시된 shRNA를 안정적으로 발현하는 EBC1shMet4-12 세포를 처리하지 않거나 (Dox 없음), 또는 HGF 없이 (HGF 없음) 또는 2시간 동안의 HGF (100 ng/㎖)와 함께 Dox로 24시간 동안 처리하였다 (Dox). 세포들로부터의 RNA를 실시예에 기술된 바와 같이 마이크로어레이 분석하였다. d) c-met에 대해 지시된 shRNA를 안정적으로 발현하는 EBCshMet4-12 세포 및 shGFP2를 안정적으로 발현하는 대조군 세포를 처리하지 않거나 (Dox 없음), 또는 Dox로 24시간 동안 처리하였다 (Dox). 세포들로부터의 RNA를 실시예에 기술된 바와 같이 마이크로어레이 분석하였다. e) EBC1shMet-4.12 또는 EBCshMet-3.15 세포로부터의 종양이 누드 (CRL nu-nu) 동물에서 확립되었고, 마우스에게 5％ 수크로스 내의 1 ㎎/㎖ Dox가 있는 음료수 (Dox) 또는 5％ 수크로스만 있는 음료수를 제공하였다. 3일 후, 종양 용해물 내의 TGFα 수준을 ELISA로 평가하였다.
도 10a-c: (a) EBCshMet 4.12 또는 EBCshGFP2 세포를 처리하지 않거나 (-), 또는 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 Dox로 처리하였다 (+). 단백질 용해물을 c-met, pEGFR 또는 Her3에 대해 웨스턴 블롯팅(western blotting)에 의해 평가하였다. (b) EBCshMet 4.12 세포를 Dox (100 ng/㎖)로 48시간 동안 처리하고, FACS에 의해 세포 표면 Her3에 대해 분석하였다. (c) EBCshMet 4.12 종양이 있는 마우스에게 5％ 수크로스 내의 1 ㎎/㎖ Dox가 있는 음료수 (Dox) 또는 5％ 수크로스만 있는 음료수 (수크로스)를 3일 동안 제공하였다. 종양 용해물을 Her3 단백질에 대해 웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다.
도 11: EBC-1 shMet 세포 (3.15 또는 4.5 또는 4.12)를 처리하지 않거나 (-), 또는 96시간 동안 Dox 단독으로 또는 Dox 처리를 시작하고 나서 48시간 후에 HGF (5 또는 100 ng/㎖) 또는 TGFa (1 또는 50 nM)를 첨가하면서 100 ng/㎖ Dox로 처리하였다 (+). 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo)를 사용하여 세포수를 평가하였다.
도 12: HGF의 존재 (오른쪽 패널) 또는 부재 (왼쪽 패널) 하에 NCI-H596 세포로 경시적 실험을 수행하였다. 자극 후 10분 (10'), 24시간, 48시간 또는 72시간 (hr)에 세포 용해물을 제조하였고, 웨스턴 블롯을 수행하여 전체 c-met (가장 위쪽의 패널), 포스포-EGFR (2번째 패널), 및 전체 EGFR (세번째 패널)을 검출하였다. 레인들 간의 등가의 로딩을 나타내도록 베타-액틴 (β-액틴) (네번째 패널)이 검출되었다.
도 13: NCI-H596 세포를 리간드의 부재 하에, 또는 TGF-α 단독, TGF-α + HGF 또는 HGF 단독의 존재 하에 플레이팅하였다. 자극 후 10분 (10분) 및 24시간 (시간)에 세포 용해물을 제조하였고, c-met에 대한 면역침전 (IP)을 수행한 후, 포스포-타이로신 (4G10; 가장 위쪽의 패널), c-met (두번째 패널), 및 EGFR (세번째 패널)에 대해 웨스턴 블롯팅하였다. 포스포-타이로신 블롯은 리간드-의존적 방식의 EGFR (위쪽 밴드) 및 c-met (아래쪽 밴드)의 활성화를 나타내고, 이는 24시간 후 감쇠되었다. c-met 면역침전은 EGFR 또는 c-met의 활성화 상태와 관계없이 모든 조건에서 EGFR을 침전시켰다.
도 14: NCI-H596 세포로 생육력 분석법을 수행하여, TGFα 및 지시된 바와 같은 다양한 농도의 HGF의 존재 하에서의 에를로티닙에 대한 세포의 응답을 평가하였다. HGF 수준이 0.5 ng/㎖에서 50 ng/㎖로 증가되었을 때 에를로티닙에 대한 상대적 응답에서의 감소가 검출되었다.
도 15: 다양한 농도의 에를로티닙으로, MetMAb (1 μM) 없이 또는 이의 존재 하에, TGFα 및 HGF (50 ng/㎖)의 존재 하에 NCI-H596 세포로 생육력 분석법이 수행되었다. 데이터는 미처리 대조군의 백분율로서 표현된다. 미처리 대조군 값이 도면의 왼쪽 위에 개별적인 점들로 표시된다.
도 16: MetMAb 및 에를로티닙으로의 조합 처리가 포스포-Akt 및 포스포-ERK1/2의 더욱 효과적인 억제를 초래하였다. NCI-H596 종양을 보유하는 인간-HGF-트랜스제닉-SCID (hu-HGF-Tg-SCID) 마우스를 비히클 (MetMAb 완충제 (100 ㎕, IP) 및 메틸셀룰로스 트윈 (MCT, 100 ㎕, PO), MetMAb ((30 ㎎/㎏, IP, 1회) 및 MCT), 에를로티닙 ((MCT 내의 100 ㎎/㎏, 100 ㎕, PO) 및 MetMAb 완충제 (100 ㎕, IP)), 또는 MetMAb 및 에를로티닙 (각각에 대해 기술된 바와 동일한 투약)으로 처리하였다. MetMAb (또는 완충제)를 0시 (t 0시)에 투약하고, 에를로티닙 (또는 MCT)를 18시 (t 18시)에 투약하고, 24시 (t 24시)에 마우스를 안락사시키고 종양을 수집하였다. 직접적인 웨스턴 블롯팅 및 면역침전에 이은 웨스턴 블롯 양쪽 모두에 의해 종양 용해물을 전체 단백질 및 인단백질에 대해 분석하였다. 약어: pTyr = 포스포-타이로신, EGFR = 표피 성장 인자 수용체, ERK (세포외 신호-조절 카이네이스-1 및 2. 레인들 간의 등가의 로딩을 나타내도록 베타-액틴 (β-액틴)이 검출되었다.
도 17a 및 17b는 본 출원에 기술된 결과들 중 일부를 도식적으로 묘사한다.
I. 정의
본원에서 사용된 용어 "간세포 성장 인자" 또는 "HGF"는, 달리 지시되지 않는 한, HGF/c-met 신호전달 경로의 활성화가 일어나도록 허용하는 조건 하에 HGF/c-met 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 임의의 천연 또는 변이체 (천연 또는 합성 변이체) HGF 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로 용어 "야생형 HGF"는 천연 발생 HGF 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로 용어 "야생형 HGF 서열"은 천연 발생 HGF에서 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. c-met는 HGF에 대한 공지된 수용체이고, 이를 통해 HGF 세포내 신호전달이 생물학적으로 실시된다.
본원에서 사용된 용어 "HGF 변이체"는 천연 HGF 서열 내에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 HGF 폴리펩티드를 지칭한다. 임의적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환(들)을 포함한다.
"천연 서열" 폴리펩티드는 천연으로부터 유래된 폴리펩티드와 아미노산 서열이 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 임의의 포유동물로부터의 천연 발생 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지닐 수 있다. 이같은 천연 서열 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열" 폴리펩티드는 천연-발생 말단절단형 또는 분비형 형태의 폴리펩티드 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연-발생 변이체 형태 (예를 들어, 별법적으로 스플라이싱된 형태)의 폴리펩티드 및 폴리펩티드의 천연-발생 대립유전자 변이체를 특히 포함한다.
폴리펩티드 "변이체"는 천연 서열 폴리펩티드와의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상인 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 이같은 변이체는 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 95％ 이상일 것이다.
"EGFR" (상호교환가능하게 "ErbB1", "HER1" 및 "표피 성장 인자 수용체"로 칭해짐)은 [Ullrich et al., Nature (1984) 309:418425]에 기술된 수용체 타이로신 카이네이스 폴리펩티드 표피 성장 인자 수용체 (별법적으로 Her-1 및 c-erbB 유전자 생성물로 지칭됨), 뿐만 아니라 이들의 변이체 예컨대 EGFRvIII을 의미한다. EGFR의 변이체는 결실, 치환 및 삽입 변이체, 예를 들어 [Lynch et al., New England Journal of Medicine 2004, 350:2129], [Paez et al., Science 2004, 304:1497], [Pao et al., PNAS 2004, 101:13306]에 기술된 것들을 또한 포함한다.
"생물학적 샘플" (상호교환가능하게 "샘플" 또는 "조직 또는 세포 샘플"로 칭해짐)은 개체로부터 수득된 다양한 샘플 유형을 포함하고, 진단 또는 모니터링 분석법에서 사용될 수 있다. 이러한 정의는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액체 샘플, 고형 조직 샘플 예컨대 생검 검사물 또는 조직 배양물 또는 이로부터 유래된 세포, 및 이의 자손을 포함한다. 이러한 정의는 획득 후 임의의 방식으로, 예컨대 시약으로의 처리, 가용화, 또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 특성 성분에 대한 강화, 또는 절편화 목적을 위한 반고체 또는 고체 매트릭스 내의 매립에 의해 조작된 샘플을 또한 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상 샘플을 포함하고, 배양물 내의 세포, 세포 상등액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플을 또한 포함한다. 생물학적 샘플의 공급원은 신선하고/하거나, 동결되고/되거나, 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 성분; 체액 예컨대 뇌척수액, 양수, 복막액, 또는 간질액; 대상의 임신 또는 발달 중 임의 시점으로부터의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 수득된다. 생물학적 샘플은 본래 천연에서는 조직과 혼합되지 않는 화합물 예컨대 방부제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등을 함유할 수 있다.
"c-met 길항제" (상호교환가능하게 "c-met 억제제"로 칭해짐)는 c-met 활성화 또는 기능을 방해하는 작용제이다. c-met 억제제의 예로는 c-met 항체; HGF 항체; 소형 분자 c-met 길항제; c-met 타이로신 카이네이스 억제제; 안티센스(antisense) 및 억제성 RNA (예를 들어, shRNA) 분자 (예를 들어, WO2004/87207 참조)가 포함된다. 바람직하게는, c-met 억제제는 c-met에 결합하는 항체 또는 소형 분자이다. 특정 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met에 대한 결합 친화력 (해리 상수)이 약 1,000 nM 이하이다. 또다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met에 대한 결합 친화력이 약 100 nM 이하이다. 또다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met에 대한 결합 친화력이 약 50 nM 이하이다. 특정 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met에 공유결합으로 결합된다. 특정 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met 신호전달을 1,000 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met 신호전달을 500 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met 신호전달을 50 nM 이하의 IC50으로 억제한다.
본원에서 사용된 용어 "c-met-표적화 약물"은 c-met에 결합하고 c-met 활성화를 억제하는 치료제를 지칭한다. c-met 표적화 약물의 예는 MetMAb (OA5D5.v2)이다.
"c-met 활성화"는 c-met 수용체의 활성화 또는 인산화를 지칭한다. 일반적으로, c-met 활성화는 신호 전달 (예를 들어, c-met 또는 기질 폴리펩티드 내의 타이로신 잔기를 인산화시키는 c-met 수용체의 세포내 카이네이스 도메인에 의해 야기되는 것)을 초래한다. c-met 활성화는 관심 c-met 수용체에 c-met 리간드 (HGF)가 결합하는 것에 의해 매개될 수 있다. c-met에 HGF가 결합하는 것은 c-met의 카이네이스 도메인을 활성화시킴으로써 c-met 내의 타이로신 잔기의 인산화 및/또는 추가적인 기질 폴리펩티드(들) 내의 타이로신 잔기의 인산화를 초래할 수 있다.
"EGFR 길항제" (상호교환가능하게 "EGFR 억제제"로 칭해짐)는 EGFR 활성화 또는 기능을 방해하는 작용제이다. EGFR 억제제의 예로는 EGFR 항체; EGFR 리간드 항체; 소형 분자 EGFR 길항제; EGFR 타이로신 카이네이스 억제제; 안티센스 및 억제성 RNA (예를 들어, shRNA) 분자 (예를 들어, WO2004/87207 참조)가 포함된다. 바람직하게는, EGFR 억제제는 EGFR에 결합하는 항체 또는 소형 분자이다. 일부 실시양태에서, EGFR 억제제는 EGFR-표적화 약물이다. 특정 실시양태에서, EGFR 억제제는 EGFR에 대한 결합 친화력 (해리 상수)이 약 1,000 nM 이하이다. 또다른 실시양태에서, EGFR 억제제는 EGFR에 대한 결합 친화력이 약 100 nM 이하이다. 또다른 실시양태에서, EGFR 억제제는 EGFR에 대한 결합 친화력이 약 50 nM 이하이다. 특정 실시양태에서, EGFR 억제제는 EGFR에 공유결합으로 결합된다. 특정 실시양태에서, EGFR 억제제는 EGFR 신호전달을 1,000 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또다른 실시양태에서, EGFR 억제제는 EGFR 신호전달을 500 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또다른 실시양태에서, EGFR 억제제는 EGFR 신호전달을 50 nM 이하의 IC50으로 억제한다.
"ErbB2" 및 "HER2"라는 표현은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, [Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)] 및 [Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986)]에 예를 들어 기술된 인간 HER2 단백질 (진뱅크(Genebank) 접속 번호 X03363)을 지칭한다. 용어 "erbB2"는 인간 ErbB2를 코딩하는 유전자를 지칭하고, "neu"는 래트 p185 neu 를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 바람직한 HER2는 천연 서열 인간 HER2이다.
"ErbB3" 및 "HER3"은 미국 특허 번호 5,183,884 및 5,480,968, 뿐만 아니라 [Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)]에 예를 들어 개시된 바와 같은 수용체 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서의 용어 "ErbB4" 및 "HER4"는 EP 특허 출원 번호 599,274; [Plowman et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993)]; 및 [Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)]에 예를 들어 개시된 바와 같은 수용체 폴리펩티드를 지칭하고, WO99/19488 (1999년 4월 22일 공개)에 예를 들어 개시된 바와 같은 이의 이소형(isoform)을 포함한다.
본원에서 사용된 "ErbB"는 수용체 폴리펩티드 EGFR, HER2, HER3, 및 HER4를 지칭한다.
"EGFR 활성화"는 EGFR의 활성화 또는 인산화를 지칭한다. 일반적으로, EGFR 활성화는 신호 전달 (예를 들어, EGFR 또는 기질 폴리펩티드 내의 타이로신 잔기를 인산화시키는 EGFR 수용체의 세포내 카이네이스 도메인에 의해 야기되는 것)을 초래한다). EGFR 활성화는 EGFR을 포함하는 EGFR 이량체에 EGFR 리간드가 결합하는 것에 의해 매개될 수 있다. EGFR 이량체에 EGFR 리간드가 결합하는 것은 이량체 내의 EGFR 중 하나 이상의 카이네이스 도메인을 활성화시킬 수 있고, 이에 의해 EGFR 중 하나 이상 내의 타이로신 잔기의 인산화 및/또는 추가적인 기질 폴리펩티드(들) 내의 타이로신 잔기의 인산화가 초래된다.
본원에서 사용된 용어 "EGFR-표적화 약물"은 EGFR에 결합하고 EGFR 활성화를 억제하는 치료제를 지칭한다. 이같은 작용제의 예로는 EGFR에 결합하는 항체 및 소형 분자가 포함된다. EGFR에 결합하는 항체의 예로는 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 번호 4,943,533 (Mendelsohn et al.) 참조) 및 이의 변이체, 예컨대 키메라 225 (C225 또는 세툭시맵(Cetuximab); ERBUTIX®) 및 재성형 인간 225 (H225) (WO 96/40210 (Imclone Systems Inc.) 참조); 완전히 인간형인 EGFR-표적화 항체인 IMC-11F8 (Imclone); 제II형 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 5,212,290); 미국 특허 번호 5,891,996에 기술된 바와 같은 EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 EGFR에 결합하는 인간 항체, 예컨대 ABX-EGF (WO 98/50433 (Abgenix) 참조); EMD 55900 ([Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)]); EGFR 결합에 대해 EGF 및 TGF-알파 양쪽 모두와 경쟁하는 EGFR에 대해 지시된 인간화 EGFR 항체인 EMD7200 (마투주맵); 및 mAb 806 또는 인간화 mAb 806 ([Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)])이 포함된다. 항-EGFR 항체가 세포독성제와 접합되어, 면역접합체가 생성될 수 있다 (예를 들어, EP 659,439A2 (Merck Patent GmbH) 참조). EGFR에 결합하는 소형 분자의 예로는 ZD1839 또는 제피티닙 (IRESSA; Astra Zeneca); CP-358774 또는 에를로티닙 (TARCEVA™; Genentech/OSI); 및 AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen); EMD-7200이 포함된다.
"EGFR 내성" 암은 EGFR 길항제 치료법을 받는 동안 암 환자가 진행되었거나 (즉, 환자가 "EGFR 불응성임), 또는 EGFR 길항제-기반 치료법 계획을 완료하고 나서 12개월 (예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월 또는 6개월) 이내에 환자가 진행되었음을 의미한다. 예를 들어, T790M 돌연변이체 EGFR이 혼입된 암은 에를로티닙 및 제피티닙 치료법에 대해 내성이다.
"에를로티닙 또는 제피티닙 내성" 암은 에를로티닙- 또는 제피티닙-기반 치료법을 받는 동안 암 환자가 진행되었거나 (즉, 환자가 "에를로티닙 또는 제피티닙 불응성임), 또는 에를로티닙- 또는 제피티닙-기반 치료법 계획을 완료하고 나서 12개월 (예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월 또는 6개월) 이내에 환자가 진행되었음을 의미한다.
수용체 신호전달 활성에 예를 들어 적용되는, 본원에서 사용된 용어 "리간드-독립적"은 리간드의 존재에 좌우되지 않는 신호전달 활성을 지칭한다. 예를 들어, HER 패밀리의 또다른 구성원 예컨대 HER2와의 이량체화로부터 EGFR 신호전달이 초래될 수 있다. 리간드-독립적 카이네이스 활성이 있는 수용체는 카이네이스 활성의 추가적인 활성화를 일으키기 위해 이러한 수용체에 리간드가 결합하는 것을 반드시 배제하지는 않을 것이다.
수용체 카이네이스 활성에 예를 들어 적용되는, 본원에서 사용된 용어 "구성적"은 리간드 또는 기타 활성화 분자의 존재에 좌우되지 않는 수용체의 지속적인 신호전달 활성을 지칭한다. 예를 들어, 다형성 교모세포종에서 통상적으로 발견되는 EGFR 변이체 III (EGFRvIII)은 이의 세포외 도메인이 많이 결실되어 있다. 리간드가 EGFRvIII에 결합할 수 없음에도 불구하고, 이는 지속적으로 활성이고, 비정상적인 증식 및 생존과 관련된다. 수용체의 성질에 따라, 모든 활성이 구성적일 수 있거나 또는 수용체의 활성이 또다른 분자 (예를 들어, 리간드)의 결합에 의해 추가로 활성화될 수 있다. 수용체의 활성화에 이르는 세포 이벤트들이 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 활성화는 더 높은 차수의 수용체 복합체로의 올리고머화, 예를 들어, 이량체화, 삼량체화 등을 포함할 수 있다. 복합체는 단일 종의 단백질을 포함할 수 있고, 즉 동종체성 복합체일 수 있다. 별법적으로, 복합체는 2가지 이상의 상이한 단백질 종을 포함할 수 있고, 즉 이종체성 복합체일 수 있다. 예를 들어, 세포 표면 상에서의 정상 형태 또는 돌연변이체 형태의 수용체의 과발현에 의해 복합체 형성이 야기될 수 있다. 수용체 내의 특정 돌연변이 또는 돌연변이들에 의해 복합체 형성이 또한 야기될 수 있다.
"유전자 증폭"이라는 구절은 특정 세포 또는 세포주에서 유전자 또는 유전자 단편의 여러 카피가 형성되는 프로세스를 지칭한다. 중복된 영역 (증폭된 DNA의 스트레치(stretch))은 종종 "앰플리콘(amplicon)"으로 지칭된다. 일반적으로, 생산된 메신저 RNA (mRNA)의 양, 즉 유전자 발현 수준이 발현된 특정 유전자로 제조된 카피의 수와 비례하여 또한 증가된다.
"타이로신 카이네이스 억제제"는 c-met 수용체와 같은 타이로신 카이네이스의 타이로신 카이네이스 활성을 어느 정도 억제하는 분자이다.
"c-met 및/또는 EGFR 발현, 증폭, 또는 활성화를 나타내는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 테스트에서, c-met 및/또는 EGFR을 발현 (과발현 포함)하고/하거나, c-met 및/또는 EGFR 유전자가 증폭되었고/되었거나, 또다른 방식으로 c-met 및/또는 EGFR의 활성화 또는 인산화를 나타내는 것이다.
"c-met 및/또는 EGFR 발현, 증폭, 또는 활성화를 나타내지 않는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 테스트에서, c-met 및/또는 EGFR을 발현 (과발현 포함)하지 않고/않거나, c-met 및/또는 EGFR 유전자가 증폭되지 않았고/않았거나, 또다른 방식으로 c-met 및/또는 EGFR의 활성화 또는 인산화를 나타내지 않는 것이다.
"c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타내는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 테스트에서, c-met 및/또는 EGFR의 활성화 또는 인산화를 나타내는 것이다. 이같은 활성화는 직접적으로 (예를 들어, ELISA에 의해 c-met 및/또는 EGFR 인산화를 측정함으로써), 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타내지 않는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 테스트에서, c-met 및/또는 EGFR의 활성화 또는 인산화를 나타내지 않는 것이다. 이같은 활성화는 직접적으로 (예를 들어, ELISA에 의해 c-met 및/또는 EGFR 인산화를 측정함으로써), 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"구성적인 c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타내는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 테스트에서, c-met 및/또는 EGFR의 구성적인 활성화 또는 인산화를 나타내는 것이다. 이같은 활성화는 직접적으로 (예를 들어, ELISA에 의해 c-met 및/또는 EGFR 인산화를 측정함으로써), 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"c-met 및/또는 EGFR 증폭을 나타내지 않는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 테스트에서, c-met 및/또는 EGFR 유전자가 증폭되지 않은 것이다.
"c-met 및/또는 EGFR 증폭을 나타내는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 테스트에서, c-met 및/또는 EGFR 유전자가 증폭된 것이다.
"구성적인 c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타내지 않는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 테스트에서, c-met 및/또는 EGFR의 구성적인 활성화 또는 인산화를 나타내지 않는 것이다. 이같은 활성화는 직접적으로 (예를 들어, ELISA에 의해 c-met 및/또는 EGFR 인산화를 측정함으로써), 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"리간드-독립적 c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타내는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 테스트에서, c-met 및/또는 EGFR의 리간드-독립적 활성화 또는 인산화를 나타내는 것이다. 이같은 활성화는 직접적으로 (예를 들어, ELISA에 의해 c-met 및/또는 EGFR 인산화를 측정함으로써), 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"리간드-독립적 c-met 및/또는 EGFR 활성화를 나타내지 않는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 테스트에서, c-met 및/또는 EGFR의 리간드-독립적 활성화 또는 인산화를 나타내지 않는 것이다. 이같은 활성화는 직접적으로 (예를 들어, ELISA에 의해 c-met 및/또는 EGFR 인산화를 측정함으로써), 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
본원에서의 "포스포-ELISA 분석법"은 시약, 일반적으로 항체를 사용하여 인산화된 c-met 및/또는 EGFR, 기질, 또는 하류 신호전달 분자를 검출하는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에서 하나 이상의 c-met 및/또는 EGFR의 인산화가 평가되는 분석법이다. 바람직하게는, 인산화된 c-met 및/또는 EGFR을 검출하는 항체가 사용된다. 이러한 분석법은 세포 용해물, 바람직하게는 신선한 또는 동결된 생물학적 샘플로부터의 세포 용해물 상에서 수행될 수 있다.
"c-met 및/또는 EGFR 과발현 또는 증폭"이 있는 암은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교하여 c-met 및/또는 EGFR 단백질 또는 유전자의 수준이 유의하게 더 높은 암이다. 이같은 과발현은 유전자 증폭에 의해 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 야기될 수 있다. 세포 표면 상에 존재하는 증가된 수준의 c-met 및/또는 EGFR 단백질을 평가함 (예를 들어, 면역조직화합 분석법 (IHC)를 통해)으로써 진단 또는 예후 분석법에서 c-met 및/또는 EGFR 과발현 또는 증폭이 결정될 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 예를 들어 형광 원위치 혼성화 (FISH; WO98/45479 (1998년 10월 공개) 참조), 서던(southern) 블롯팅, 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해, 세포 내의 c-met 및/또는 EGFR-코딩 핵산의 수준을 측정할 수 있다. 상기 분석법들과 별개로, 당업자는 다양한 생체내 분석법들을 이용할 수 있다. 예를 들어, 환자의 신체 내의 세포를 항체 (검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 임의적으로 표지됨)에 노출시킬 수 있고, 예를 들어 방사성의 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 미리 노출된 환자로부터 취해진 생검을 분석함으로써, 환자 내의 세포에 대한 항체의 결합을 평가할 수 있다.
"c-met 및/또는 EGFR이 과발현 또는 증폭되지 않은" 암 세포는 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교하여 c-met 및/또는 EGFR 단백질 또는 유전자의 정상 수준보다 높지 않은 암 세포이다.
본원에서 사용된 용어 "돌연변이"는 각각 야생형 단백질 또는 핵산과 비교하여 특정 단백질 또는 핵산 (유전자, RNA)의 아미노산 또는 핵산 서열에서의 차이를 의미한다. 돌연변이된 단백질 또는 핵산은 유전자의 하나의 대립유전자 (이종접합형) 또는 양쪽 대립유전자 (동종접합형)로부터 발현되거나 이러한 대립유전자 상에서 발견될 수 있고, 체세포성 또는 생식계열일 수 있다. 본 발명에서, 돌연변이는 일반적으로 체세포성이다. 돌연변이는 서열 재배열 예컨대 삽입, 결실 및 점 돌연변이 (단일 뉴클레오티드/아미노산 다형성)을 포함한다.
"억제하다"는 기준물과 비교하여 활성, 기능, 및/또는 양을 감소 또는 저하시키는 것이다.
단백질 "발현"은 유전자 내에 코딩된 정보가 메신저 RNA (mRNA)로, 이어서 단백질로 전환되는 것을 지칭한다.
본원에서, 관심 단백질 (예컨대 HER 수용체 또는 HER 리간드)을 "발현"하는 샘플 또는 세포는 샘플 또는 세포 내에 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 단백질 (이의 단편 포함)이 존재하는 것으로 결정되는 샘플 또는 세포이다.
"면역접합체" (상호교환가능하게 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 지칭됨)는 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 폴리펩티드 서열을 포함하는 이량체 복합체를 일반적으로 지칭하고, 이때 C-말단 폴리펩티드 서열은 무손상 항체의 파파인 소화에 의해 수득가능한 것이다. Fc 영역은 천연 또는 변이체 Fc 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대략 위치 Cys226의 아미노산 잔기로부터 또는 대략 위치 Pro230으로부터 Fc 서열의 카르복실 말단까지 이르는 것으로 일반적으로 정의된다. 면역글로불린의 Fc 서열은 일반적으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인의 2개의 불변 도메인을 포함하고, 임의적으로 CH4 도메인을 포함한다. Fc 영역의 C-말단 라이신 (EU 번호매김 시스템에 따른 잔기 447)이, 예를 들어, 항체의 정제 동안, 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역이 있는 항체를 포함하는 조성물은 K447이 있는 항체, 모든 K447이 제거된 항체, 또는 K447 잔기가 있는 항체와 K447 잔기가 없는 항체의 혼합물을 포함할 수 있다.
본원에서의 "Fc 폴리펩티드"는 Fc 영역을 구성하는 폴리펩티드들 중 하나를 의미한다. Fc 폴리펩티드는 임의의 적절한 면역글로불린, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아유형, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 폴리펩티드는 야생형 힌지(hinge) 서열의 일부 또는 모두를 포함한다 (일반적으로 N 말단에). 일부 실시양태에서, Fc 폴리펩티드는 기능성 또는 야생형 힌지 서열을 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 "힌지 영역", "힌지 서열", 및 이의 변형은 당업계에 공지된 의미를 포함하고, 이는 예를 들어 [Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999)]; [Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415]; [Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202]에 설명되어 있다.
본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐, 면역글로불린 중쇄 내의 잔기들의 번호매김은 본원에 명백히 참고로 인용되는 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서와 같은 EU 인덱스이다. "카밧(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호매김을 지칭한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 1가 항체, 다가 항체, 및 항체 단편을 특히 포함하며, 단 이들은 원하는 생물학적 활성을 나타낸다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부만을 포함하고, 이때 바람직하게는 이러한 부분은 무손상 항체 내에 존재할 때 이러한 부분과 정상적으로 관련되는 기능들 중 하나 이상, 바람직하게는 대부분 또는 모두를 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 유지한다. 또다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 하나 이상을 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 생체내 반감기가 무손상 항체와 실질적으로 유사한 일가 항체이다. 예를 들어, 이같은 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 팔(arm)을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 WO 2005/063816에 기술된 바와 같은 외팔(one-armed) 항체이다. 한 실시양태에서, 외팔 항체는 WO2005/063816에 기술된 바와 같은 "놉" 및 "홀"을 구성하는 Fc 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 홀 돌연변이는 Fc 폴리펩티드 내의 T366A, L368A 및/또는 Y407V 중 하나 이상일 수 있고, 공동 돌연변이는 T366W일 수 있다.
"차단" 항체 또는 항체 "길항제"는 자신이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 완전히 억제한다.
달리 지시되지 않는 한, "다가 항체"라는 표현은 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 나타내도록 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된다. 바람직하게는 다가 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위가 있도록 조작되고, 일반적으로 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다.
"Fv" 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 단단하게 회합된 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성되고, 예를 들어 scFv에서, 상기 회합은 사실상 공유결합일 수 있다. 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 규정하는 것은 이러한 형상 내이다. 총괄적으로, 6개의 CDR 또는 이의 부분집합이 항원 결합 특이성을 항체에 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다는 낮은 친화력이지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 지닌다.
본원에서 사용된 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 프레임워크 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄의 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다. 본 발명에서 사용된 방법에 따르면, CDR 및 FR에 할당되는 아미노산 위치는 [Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 & 1991)]에 따라 정의될 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 번호매김 또한 카밧의 번호매김을 따른다.
본원에서 사용된 용어 "상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 이의 존재가 항원 결합에 필요한 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 전형적으로 각각의 가변 도메인에는 CDR1, CDR2 및 CDR3로 확인되는 3개의 CDR 영역이 있다. 각각의 상보성 결정 영역은 카밧에 의해 정의된 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 (즉, 대략적으로 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (즉, 대략적으로 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상보성 결정 영역은 카밧 및 초가변 루프에 따라 정의된 CDR 영역 양쪽 모두로부터의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 4D5의 중쇄의 CDRH1은 아미노산 26 내지 35를 포함한다.
"프레임워크 영역" (이하 FR)은 CDR 잔기를 제외한 가변 도메인 잔기이다. 전형적으로 각각의 가변 도메인에는 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 식별되는 4개의 FR이 있다. CDR이 카밧에 따라 정의되면, 경쇄 FR 잔기는 대략적인 잔기 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), 및 98-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기 내의 대략적인 잔기 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3), 및 103-113 (HCFR4)에 위치한다. CDR이 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함하면, 경쇄 FR 잔기는 경쇄 내의 대략적인 잔기 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3), 및 97-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기 내의 대략적인 잔기 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3), 및 102-113 (HCFR4)에 위치한다. 일부 예에서, CDR이 카밧에 의해 정의되는 바와 같은 CDR 및 초가변 루프의 것 양쪽 모두로부터의 아미노산을 포함하는 경우, 이에 따라 FR 잔기가 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35을 포함하는 경우, 중쇄 FR1 잔기는 위치 1-25에 있고, FR2 잔기는 위치 36-49에 있다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인 및 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 한쌍의 Fab 단편을 포함하고, 일반적으로 이러한 단편들은 이들의 카르복시 말단 근처에서 이들 사이의 힌지 시스테인에 의해 공유결합으로 연결된다. 항체 단편들의 또다른 화학적 커플링이 당업계에 또한 공지되어 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, 이러한 Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 리뷰를 위해, [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참조한다.
용어 "디아바디(diabody)"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH 및 VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위가 있는 소형 항체 단편을 지칭한다. 동일한 사슬 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성하도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들은 또다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강요된다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 충분하게 기술되어 있다.
"선형 항체"라는 표현은 [Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)]에 기술된 항체를 지칭한다. 간략하게, 이러한 항체는 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 직렬 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
수식어구 "모노클로날"은 항체들의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된다는 항체의 특성을 가리키고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 (예를 들어, [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)이 예를 들어 포함되는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다..
본원에서의 모노클로날 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 사슬(들)의 나머지 부분은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편이 명확하게 포함된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 및 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체는 항체의 항원-결합 영역이, 예를 들어, 관심 항원으로 짧은꼬리 원숭이를 면역화시킴으로써 생산된 항체로부터 유래된 PRIMATIZED® 항체가 포함된다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린(murine)) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및/또는 능력이 있는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (도너 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 교체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 도너 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 정련시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 임의적으로, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. 추가적인 상세사항을 위해, [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조용 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 제외한다. 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간 항체가 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 인간 항체가 선별된다 ([Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)]; [Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)]; [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (1991)]). 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내로 도입함으로써 인간 항체가 또한 제조될 수 있다. 챌린지(challenge) 시, 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리가 포함되는 모든 사항에서 인간에서 보이는 것과 매우 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 이러한 접근법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 하기의 과학 간행물에 기술되어 있다: [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368:812-13 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]. 별법적으로, 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 인간 B 림프구 (이같은 B 림프구는 개체로부터 회수될 수 있거나, 또는 시험관 내에서 면역화될 수 있다)의 불멸화를 통해 인간 항체가 제조될 수 있다. 예를 들어, [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991)]; 및 미국 특허 번호 5,750,373 참조.
"네이키드(naked) 항체"는 이종 분자, 예컨대 세포독성 모이어티 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체이다.
"친화력 성숙된" 항체는 이의 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경이 있어 이러한 변경(들)이 없는 어버이 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화력이 개선된 것이다. 바람직한 친화력 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 친화력이 나노놀 또는 심지어 피코몰일 것이다. 친화력 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산된다. [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화력 성숙이 기술되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다.
지정된 항체의 "생물학적 특성"을 지니는 항체는 동일한 항원에 결합하는 다른 항체들로부터 이러한 항체를 구별시키는 이러한 항체의 생물학적 특성들 중 하나 이상을 보유하는 것이다.
관심 항체가 결합한 항원 상의 에피토프에 결합하는 항체들을 스크리닝하기 위해, 일상적인 교차-차단 분석법 예컨대 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기술된 것을 수행할 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어, 미국 특허 5,739,277에 기술된 바와 같이, 항체 (특히, 항체 단편)에 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 조작된 핵산 분자에 의해 발현되는 융합 단백질이 샐비지 수용체 결합 에피토프 및 본 발명의 폴리펩티드 서열을 포함하도록, 샐비지 수용체 결합 에피토프를 코딩하는 핵산 분자를 본 발명의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산에 인-프레임(in frame)으로 연결시킬 수 있다. 본원에 사용된 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 것을 담당하는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다 (예를 들어, [Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000)]의 표 1). Fc 영역 내에 치환이 있고 혈청 반감기가 증가된 항체가 WO00/42072, WO 02/060919; [Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)]; [Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)]에 또한 기술되어 있다. 또다른 실시양태에서, 예를 들어, 또다른 폴리펩티드 서열을 부착하는 것에 의해, 혈청 반감기가 또한 증가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 유용한 항체 또는 기타 폴리펩티드가 혈청 알부민 또는 FcRn 수용체에 결합하는 혈청 알부민의 일부분에 부착될 수 있거나 또는 혈청 알부민이 항체 또는 폴리펩티드에 결합하도록 혈청 알부민 결합 펩티드 (예를 들어, 이같은 폴리펩티드 서열이 WO01/45746에 개시되어 있음)에 부착될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 부착될 혈청 알부민 펩티드는 DICLPRWGCLW의 아미노산 서열 (서열 21)을 포함한다. 또다른 실시양태에서, Fab의 반감기가 이러한 방법들에 의해 증가된다. 혈청 알부민 결합 펩티드 서열에 대해 [Dennis et al. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002)]를 또한 참조한다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 "단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드 또는 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 결정시 95 중량％를 초과하는 폴리펩티드 또는 항체, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드 또는 항체에는 재조합 세포 내의 계내 폴리펩티드 또는 항체가 포함되는데, 이는 폴리펩티드의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드 또는 항체는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단편"은 바람직하게는 기준 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 또는 그 초과를 함유하는 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 일부분을 의미한다. 단편은 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 또는 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 또는 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 120개, 140개, 160개, 180개, 190개, 200개 또는 그 초과의 아미노산을 함유할 수 있다.
"치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 수단 양쪽 모두를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상은 양성, 전-암성 또는 비-전이성 종양이 이미 있는 대상, 뿐만 아니라 암의 발생 또는 재발을 방지하려는 대상을 포함한다.
용어 "치료적 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 효과적인 치료제의 양을 지칭한다. 암의 경우, 치료적 유효량의 치료제는 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; 원발성 종양 크기를 감소시킬 수 있고/있거나; 주변 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제할 수 있고/있거나 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 정지시킴); 종양 전이를 억제할 수 있고/있거나 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 정지시킴); 종양 성장을 어느 정도 억제할 수 있고/있거나; 장애와 관련된 증상들 중 하나 이상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 성장을 방지할 수 있고/있거나 기존의 암 세포를 사멸시킬 수 있다는 점에서, 이는 세포정지성(cytostatic) 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법에 대해, 생체내 효능이, 예를 들어, 생존 기간, 질환 진행까지의 시간 (TTP), 응답율 (RR), 응답 기간 및/또는 삶의 질을 평가함으로써 측정될 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 용태를 지칭하거나 기술한다. 이러한 정의에는 양성 및 악성 암이 포함된다. "초기 단계 암" 또는 "초기 단계 종양"은 침습성 또는 전이성이지 않거나 0기, I기, 또는 II기 암으로 분류되는 암을 의미한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종 (속질모세포종 및 망막모세포종 포함), 육종 (지방육종 및 윤활세포 육종 포함), 신경내분비 종양 (암종 종양, 가스트린종, 및 섬세포 암 포함), 중피종, 신경초종 (청신경초종 포함), 수막종, 선암종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프양 악성종양이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 이같은 암의 보다 특정한 예에는 편평세포암 (예를 들어 상피 편평세포암), 소세포 폐암 (SCLC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 폐의 선암종 및 폐의 편평세포암종이 포함되는 폐암, 복막암, 간세포 암, 위장암이 포함되는 위암, 췌장암, 교모세포종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종, 유방암 (전이성 유방암 포함), 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담관 종양, 뿐만 아니라 두경부암이 포함된다.
용어 "전-암성"은 전형적으로 암에 선행하거나 암으로 발달되는 용태 또는 성장을 지칭한다. "전-암성" 성장에는 비정상적인 세포 주기 조절, 증식 또는 분화를 특징으로 하는 세포가 있을 것이고, 이는 세포 주기 조절, 세포 증식 또는 분화의 마커에 의해 결정될 수 있다.
"형성이상"은 조직, 기관 또는 세포의 임의의 비정상적인 성장 또는 발달을 의미한다. 바람직하게는, 형성이상은 고등급 또는 전-암성이다.
"전이"는 암이 이의 원발성 부위로부터 신체 내의 다른 장소로 확산되는 것을 의미한다. 암 세포는 원발성 종양으로부터 이탈하여, 림프관 및 혈관 내로 침투하고, 혈류를 통해 순환하여, 신체 내의 다른 곳의 정상 조직 내의 원격 병소에서 성장할 수 있다 (전이될 수 있다). 전이는 국소 전이 또는 원격 전이일 수 있다. 전이는 원발성 종양으로부터 분리되어, 혈류를 통해 이동하고, 원격 부위에서 정지하는 종양 세포를 조건으로 하는 순차적인 프로세스이다. 새로운 부위에서, 세포는 혈류 공급을 확립하고, 생명을 위협하는 덩어리를 형성하도록 성장할 수 있다.
종양 세포 내에서의 자극성 및 억제성 분자 경로 양쪽 모두 이러한 거동을 조절하고, 원격 부위에서의 종양 세포와 숙주 세포 간의 상호작용 또한 중요하다.
"비-전이성"은 양성이거나, 또는 원발성 부위에 남아 있고 림프관 또는 혈관 시스템 내로 또는 원발성 부위 이외의 조직으로 침투하지 않은 암을 의미한다. 일반적으로, 비-전이성 암은 임의의 0기, I기, 또는 II기 암이고, 종종 III기 암이다.
"원발성 종양" 또는 "원발성 암"은 대상의 신체 내의 또다른 조직, 기관 또는 장소에 위치하는 전이성 병변이 아닌 본래의 암을 의미한다.
"양성 종양" 또는 "양성 암"은 원래의 부위에 계속 위치하고 원격 부위로 침투, 침습 또는 전이되는 능력이 없는 종양을 의미한다.
"종양 존재량(burden)"는 암 세포의 개수, 종양 크기, 또는 신체 내의 암의 양을 의미한다. 종양 존재량은 종양 부하(load)로 또한 지칭된다.
"종양수"는 종양의 개수를 의미한다.
"대상"은 인간 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하지만 이에 한정되지 않는 포유동물을 의미한다. 바람직하게는, 대상은 인간이다.
용어 "항암 요법"은 암을 치료하는데 유용한 치료법을 지칭한다. 항암 치료제의 예로는, 예를 들어, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에서 사용되는 작용제, 항혈관형성제, 세포자멸사 작용제, 항-튜불린 작용제, 및 암을 치료하기 위한 기타 작용제, 항-CD20 항체, 혈소판 유래 성장 인자 억제제 (예를 들어, 글리벡(Gleevec)™ (Imatinib Mesylate)), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕십), 인터페론, 사이토카인, 표적 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들) 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 기타 생체활성(bioactive) 및 유기 화학 작용제 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이들의 조합물 또한 본 발명에 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 I131, I125, Y90 및 Re186), 화학요법제, 및 독소 예컨대 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편을 포함하도록 의도된다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학 화합물이다. 포함되는 화학요법제의 예는 암의 침료에서 유용한 화학 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 사이톡산(CYTOXAN)® 사이클로스포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민이 포함되는, 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 엔다이인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (예를 들어, [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 다이네마이신 A가 포함되는 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색단백질 엔다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라바이신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사마이토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products (Eugene, OR)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology (Princeton, N.J.)), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제형인 아브락산(ABRAXANE)™ 크레모포르-프리(Cremophor-free) (American Pharmaceutical Partners (Schaumberg, Illinois)), 및 탁소티어(TAXOTERE)® 독세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer (Antony, France)); 클로란부실; 젬자르(GEMZAR)® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캠프토사르(Camptosar), CPT-11) (5-FU 및 류코보빈과 조합된 이리노테칸의 치료 요법 포함); 토포아이소머레이스 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴 (옥살리플라틴 치료 요법 (FOLFOX) 포함); 세포 증식을 감소시키는, PKC-알파, Raf, H-Ras 및 EGFR의 억제제 (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)™)) 및 VEGF-A의 억제제, 및 임의의 상기 물질들의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
이러한 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON) 토레미펜이 예를 들어 포함되는 항-에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM); 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소인 아로마테이스를 억제하는 아로마테이스 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸; 및 항-안드로겐제 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 바이칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 사이토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서의 유전자, 예를 들어, PKC-알파, Raf 및 H-Ras의 발현을 억제하는 것들; 리보자임 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME)® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 백시드(VAXID)® 백신; 프로류킨(PROLEUKTN)® rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포아이소머레이스 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 비노렐빈(Vinorelbine) 및 에스페라마이신(Esperamicin) (미국 특허 번호 4,675,187 참조), 및 임의의 상기 물질의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 또한 포함된다.
본 출원에서 사용된 용어 "전구약물"은 어버이 약물에 비해 종양 세포에 덜 세포독성이고, 더욱 활성인 어버이 형태로 효소적으로 활성화되거나 전환될 수 있는, 제약상 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어, [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)] 및 [Stella et al. "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)] 참조. 본 발명의 전구약물로는 더욱 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 설페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로사이토신 및 기타 5-플루오로유리딘 전구약물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 상기 기술된 화학요법제들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
"방사선 요법"은 정상적으로 기능하는 세포의 능력을 제한하도록 또는 세포를 완전히 파괴하도록, 지정된 감마선 또는 베타선을 사용하여 세포에 충분한 손상을 유도하는 것을 의미한다. 치료 기간 및 투여량을 결정하기 위한 다수의 방식이 당업계에 공지되어 있음이 이해될 것이다. 전형적인 치료는 1회 투여로 제공되고, 전형적인 투여량은 1일 10 내지 200 유닛 (그레이(Gray)) 범위이다.
치료제
본 발명은 대상에서 종양과 같은 병리학적 상태를 치료하기 위해 조합 요법으로 c-met 길항제와 EGFR 길항제를 사용하는 것을 특징으로 한다.
c-met 길항제
본 발명의 방법에서 유용한 c-met 길항제에는 c-met에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, 항-c-met 항체, c-met에 특이적으로 결합하는 c-met 소형 분자, 수용체 분자 및 유도체, 및 융합 단백질이 포함된다. c-met 길항제에는 c-met 폴리펩티드의 길항성 변이체, c-met 및 HGF에 대한 RNA 앱타머 및 펩티바디가 또한 포함된다. 항-HGF 항체, 항-HGF 폴리펩티드, HGF에 특이적으로 결합하는 c-met 수용체 분자 및 유도체가 본 발명의 방법에 유용한 c-met 길항제로서 또한 포함된다. 이들 각각의 예가 하기에 기술된다.
본 발명의 방법에서 유용한 항-c-met 항체에는 충분한 친화력 및 특이성으로 c-met에 결합하고 c-met 활성을 감소시키거나 억제할 수 있는 임의의 항체가 포함된다. 선택된 항체는 일반적으로 c-met에 대한 결합 친화력이 충분히 강할 것이고, 예를 들어, 항체는 인간 c-met에 100 nM - 1 pM 사이의 Kd 값으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 표면 자기 공명 기반 분석법 (예컨대 PCT 출원 공개 번호 WO2005/012359에 기술된 바와 같은 BIAcore 분석법); 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA); 및 경쟁 분석법 (예를 들어 RIA)에 의해 항체 친화력을 결정할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항-c-met 항체는 c-met/HGF 활성이 수반되는 질환 또는 용태를 표적화하고 이를 방해하는 것에서 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어, 치료제로서의 항체의 유효성을 평가하기 위해, 또다른 생물학적 활성 분석법에 항체가 적용될 수 있다. 이같은 분석법은 당업계에 공지되어 있고, 표적 항원 및 항체에 대한 계획된 용도에 좌우된다.
항-c-met 항체는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, [Martens, T, et al (2006) Clin Cancer Res 12(20 Pt 1):6144]; US 6,468,529; WO2006/015371; WO2007/063816; US 7,408,043; WO2009/007427; WO2005/016382; WO2007/126799 참조). 한 실시양태에서, 항-c-met 항체는 도 7에 도시된 CDR1-HC, CDR2-HC 및 CDR3-HC 서열 (서열 13-15) 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 도 7에 도시된 CDR1-LC, CDR2-LC 및 CDR3-LC 서열 (서열 5-7) 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인은 도 7에 도시된 FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC 및 FR4-HC 서열 (서열 9-12)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인은 도 7에 도시된 FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC 및 FR4-LC 서열 (서열 1-4)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-c-met 항체는 1가이고, Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 도 7에 도시된 Fc 서열 (서열 17)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 1가이고, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 이때 제1 폴리펩티드는 도 7에 도시된 Fc 서열 (서열 17)을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 도 8에 도시된 Fc 서열 (서열 18)을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-c-met 항체는 (a) 서열
Figure pat00004
의 중쇄 가변 도메인, 도 7에 도시된 CH1 서열 (서열 16), 및 도 7에 도시된 Fc 서열 (서열 17)을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (b) 서열
Figure pat00005
의 경쇄 가변 도메인, 및 도 7에 도시된 CL1 서열 (서열 8)을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (c) 도 8에 도시된 Fc 서열 (서열 18)을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 항-c-met 항체는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) 접속 번호 ATCC HB-11894 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 HB-11895 (하이브리도마 5D5.11.6) 하에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체이다. 또다른 실시양태에서, 항체는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 접속 번호 ATCC HB-11894 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 HB-11895 (하이브리도마 5D5.11.6) 하에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체의 CDR 서열들 중 하나 이상을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 c-met 항체는 c-met Sema 도메인 또는 이의 변이체의 적어도 일부분에 특이적으로 결합한다. 한 예에서, 본 발명의 길항제 항체는 LDAQT (서열 22) (예를 들어, c-met의 잔기 269-273), LTEKRKKRS (서열 23) (예를 들어, c-met의 잔기 300-308), KPDSAEPM (서열 24) (예를 들어, c-met의 잔기 350-357) 및 NVRCLQHF (서열 25) (예를 들어, c-met의 잔기 381-388)으로 구성된 군으로부터 선택된 서열들 중 하나 이상에 특이적으로 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 LDAQT (서열 22) (예를 들어, c-met의 잔기 269-273), LTEKRKKRS (서열 23) (예를 들어, c-met의 잔기 300-308), KPDSAEPM (서열 24) (예를 들어, c-met의 잔기 350-357) 및 NVRCLQHF (서열 25) (예를 들어, c-met의 잔기 381-388)으로 구성된 군으로부터 선택된 서열들 중 하나 이상의 일부분 또는 전체에 의해 형성된 입체형상 에피토프에 특이적으로 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 서열 LDAQT (서열 22), LTEKRKKRS (서열 23), KPDSAEPM (서열 24) 및/또는 NVRCLQHF (서열 25)와의 서열 동일성 또는 유사성이 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％인 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다.
항-HGF 항체는 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, [Kim KJ, et al. Clin Cancer Res. (2006) 12(4):1292-8]; WO2007/115049; WO2009/002521; WO2007/143098; WO2007/017107; WO2005/017107; L2G7; AMG-102 참조.
예를 들어, HGF 단백질에 결합하여 격리시킴으로써 신호를 전달하지 못하도록 하기 위해, HGF에 특이적으로 결합하는 c-met 수용체 분자 또는 이의 단편이 본발명의 방법에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, c-met 수용체 분자, 또는 이의 HGF 결합 단편은 가용성 형태이다. 일부 실시양태에서, HGF에 결합하고, 이에 의해 HGF가 표적 세포의 표면 상에 존재하는 이의 천연 수용체에 결합하지 못하도록 함으로써, 가용성 형태의 수용체가 c-met 단백질의 생물학적 활성에 대한 억제 효과를 발휘한다. c-met 수용체 융합 단백질이 또한 포함되고, 이의 예가 하기에 기술된다.
본 발명의 가용성 c-met 수용체 단백질 또는 키메라 c-met 수용체 단백질은 막횡단 도메인을 통해 세포 표면에 고정되지 않은 c-met 수용체 단백질을 포함한다. 이에 따라, 가용성 형태의 c-met 수용체 (키메라 수용체 단백질 포함)는, HGF에 결합하여 이를 불활성화시킬 수 있는 한편, 막횡단 도메인을 포함하지 않고, 따라서, 일반적으로, 분자가 발현되는 세포의 세포막과 회합되지 않는다. 예를 들어, [Kong-Beltran, M et al Cancer Cell (2004) 6(1): 75-84] 참조.
c-met에 특이적으로 결합하고 c-met의 활성화를 차단하거나 감소시킴으로써, c-met이 신호를 전달하지 못하게 하는 HGF 분자 또는 이의 단편이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
앱타머는 표적 분자, 예컨대 HGF 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 3차 구조를 형성하는 핵산 분자이다. 앱타머의 생성 및 치료적 사용이 당업계에 잘 확립되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,475,096 참조. HGF 앱타머는 세포외 HGF에 결합할 수 있게 하는 3차원 입체형상을 채택한, PEG화 변형 올리고뉴클레오티드이다. 앱타머에 관한 추가적인 정보를 미국 특허 출원 공개 번호 20060148748에서 확인할 수 있다.
펩티바디는 면역글로불린 분자의 단편 또는 일부분을 코딩하는 아미노산 서열에 연결된 펩티드 서열이다. 이러한 폴리펩티드는 파지 디스플레이 기술을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 방법에 의해 특이적 결합에 대해 선택된 무작위화 서열들로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 선택된 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 부분을 코딩하는 아미노산 서열에 연결될 수 있다. HGF 또는 c-met에 특이적으로 결합하고 이를 길항하는 펩티바디가 본 발명의 방법에서 또한 유용하다.
c-met 길항제에는 US 5,792,783; US 5,834,504; US 5,880,141; US 6,297,238; US 6,599,902; US 6,790,852; US 2003/0125370; US 2004/0242603; US 2004/0198750; US 2004/0110758; US 2005/0009845; US 2005/0009840; US 2005/0245547; US 2005/0148574; US 2005/0101650; US 2005/0075340; US 2006/0009453; US 2006/0009493; WO 98/007695; WO 2003/000660; WO 2003/087026; WO 2003/097641; WO 2004/076412; WO 2005/004808; WO 2005/121125; WO 2005/030140; WO 2005/070891; WO 2005/080393; WO 2006/014325; WO 2006/021886; WO 2006/021881, WO 2007/103308에 기술된 화합물들과 같은 소형 분자가 포함된다. PHA-665752는 c-Met의 촉매적 활성, 뿐만 아니라 다양한 종양 세포의 세포 성장, 세포 운동성, 침습 및 형태학의 ATP-경쟁적, 활성-부위 억제제 소형 분자이다 ([Ma et al (2005) Clin. Cancer Res. 11 :2312-2319]; [Christensen et al (2003) Cancer Res. 63:7345-7355]).
EGFR 길항제
EGFR 길항제에는 니모투주맵으로 공지된 인간화 모노클로날 항체 (YM Biosciences), 완전히 인간형인 ABX-EGF (파니투무맵, Abgenix Inc.), 뿐만 아니라 E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 및 E7.6.3으로 공지되어 있고 US 6,235,883에 기술된 완전히 인간형인 항체; MDX-447 (Medarex Inc)과 같은 항체가 포함된다. 퍼투주맵 (2C4)은 HER2에 직접적으로 결합하지만 HER2-EGFR 이량체화를 방해함으로써 EGFR 신호전달을 억제하는 인간화 항체이다. EGFR에 결합하는 항체의 또다른 예로는 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 번호 4,943, 533 (Mendelsohn et al.) 참조) 및 이들의 변이체, 예컨대 키메라화 225 (C225 또는 세툭시맵(Cetuximab); ERBUTIX®) 및 재성형 인간 225 (H225) (WO 96/40210 (Imclone Systems Inc.) 참조); 완전히 인간형인 EGFR-표적화 항체인 IMC-11F8 (Imclone); 제II형 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 5,212,290); 미국 특허 번호 5,891,996에 기술된 바와 같은 EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 EGFR에 결합하는 인간 항체, 예컨대 ABX-EGF (WO 98/50433 (Abgenix) 참조); EMD 55900 ([Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)]); EGFR 결합에 대해 EGF 및 TGF-알파 양쪽 모두와 경쟁하는 EGFR에 대해 지시된 인간화 EGFR 항체인 EMD7200 (마투주맵); 및 mAb 806 또는 인간화 mAb 806 ([Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)])이 포함된다. 항-EGFR 항체가 세포독성제와 접합되어, 면역접합체가 생성될 수 있다 (예를 들어, EP 659.439 A2 (Merck Patent GmbH) 참조).
본 발명의 방법에서 유용한 항-EGFR 항체에는 충분한 친화력 및 특이성으로 EGFR에 결합하고 EGFR 활성을 감소시키거나 억제할 수 있는 임의의 항체가 포함된다. 선택된 항체는 일반적으로 EGFR에 대한 결합 친화력이 충분히 강할 것이고, 예를 들어, 항체는 인간 c-met에 100 nM - 1 pM 사이의 Kd 값으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 표면 자기 공명 기반 분석법 (예컨대 PCT 출원 공개 번호 WO2005/012359에 기술된 바와 같은 BIAcore 분석법); 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA); 및 경쟁 분석법 (예를 들어 RIA)에 의해 항체 친화력을 결정할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항-c-met 항체는 EGFR/EGFR 리간드 활성이 수반되는 질환 또는 용태를 표적화하고 이를 방해하는 것에서 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어, 치료제로서의 항체의 유효성을 평가하기 위해, 또다른 생물학적 활성 분석법에 항체가 적용될 수 있다. 이같은 분석법은 당업계에 공지되어 있고, 표적 항원 및 항체에 대한 계획된 용도에 좌우된다.
이중특이적 항체는 2가지 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성이 있는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체가 EGFR 및 c-met에 결합할 수 있다. 또다른 예에서, 예시적인 이중특이적 항체가 동일한 단백질, 예를 들어, c-met 단백질 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 별법적으로, 세포성 방어 메카니즘이 c-met 또는 EGFR-발현 세포에 집중되도록, c-met 또는 EGFR 팔(arm)이 백혈구 상의 촉발 분자 예컨대 T-세포 수용체 분자 (예를 들어 CD2 또는 CD3), 또는 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)과 같은 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR)에 결합하는 팔과 조합될 수 있다. 또한 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성제를 EGFR 또는 c-met을 발현하는 세포에 국소화시킬 수 있다. 이러한 항체들은 EGFR 또는 c-met-결합 팔, 및 세포독성제 (예를 들어 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신(ricin) A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 팔을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
EGFR 길항제에는 US5616582, US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, WO9814451, WO9850038, WO9909016, WO9924037, WO9935146, WO0132651, US6344455, US5760041, US6002008, US5747498에 기술된 화합물들과 같은 소형 분자가 또한 포함된다. 특정 소형 분자 EGFR 길항제에는 OSI-774 (CP-358774, 에를로티닙 (OSI Pharmaceuticals)); PD 183805 (CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 디하이드로클로라이드 (Pfizer Inc.)); 이레사(Iressa)® (ZD1839, 제피티닙 (AstraZeneca)); ZM 105180 ((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린 (Zeneca)); BIBX-1382 (N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민 (Boehringer Ingelheim)); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-하이드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); EKB-569 (N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드); 라파티닙 (타이커브(Tykerb) (Glaxo SmithKline)); ZD6474 (작티마(Zactima) (AstraZeneca)); CUDC-101 (Curis); 카네르티닙 (CI-1033); AEE788 (6-[4-[(4-에틸-1-피페라지닐)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민, WO2003013541 (Novartis)) 및 PKI166 (4-[4-[[(1R)-1-페닐에틸]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀, WO9702266 (Novartis))이 포함된다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 본원에 참고로 인용된 US 5,757,498에 따른 하기 화학식 I의 것이다:
<화학식 I>
Figure pat00006
식 중,
m은 1, 2, 또는 3이고;
각각의 R1은 수소, 할로, 하이드록시, 하이드록시아미노, 카르복시, 니트로, 구아니디노, 우레이도, 시아노, 트리플루오로메틸, 및 -(C1-C4 알킬렌)-W-(페닐) (식 중, W는 단일 결합, O, S 또는 NH이다)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되거나;
또는 각각의 R1은 시아노로 치환된 C1-C4 알킬 및 R9로부터 독립적으로 선택되거나 (식 중, R9는 R5, -OR6, -NR6R6, -C(O)R7, -NHOR5, -OC(O)R6, 시아노, A 및 -YR5로 구성된 군으로부터 선택되고; R5는 C1-C4 알킬이고; R6은 독립적으로 수소 또는 R5이고; R7은 R5, -OR6 또는 -NR6R6이고; A는 피페리디노, 모르폴리노, 피롤리디노, 4-R6-피페라진-1-일, 이미다졸-1-일, 4-피리돈-1-일, -(C1-C4 알킬렌)(CO2H), 페녹시, 페닐, 페닐설파닐, C2-C4 알케닐, 및 -(C1-C4 알킬렌)C(O)NR6R6으로부터 선택되고; Y는 S, SO, 또는 SO2이며; R5, -OR6 및 -NR6R6 내의 알킬 모이어티는 1개 내지 3개의 할로 치환기로 임의 치환되고, R5, -OR6 및 -NR6R6 내의 알킬 모이어티는 1개 또는 2개의 R9 기로 임의 치환되며, 상기 임의 치환기의 알킬 모이어티는 할로 또는 R9로 임의 치환되고, 단 2개의 헤테로원자가 동일한 탄소 원자에 부착되지 않는다);
또는 각각의 R1은 -NHSO2R5, 프탈이미도-(C1-C4)-알킬설포닐아미노, 벤즈아미도, 벤젠설포닐아미노, 3-페닐우레이도, 2-옥소피롤리딘-1-일, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일, 및 R10-(C2-C4)-알카노일아미노로부터 독립적으로 선택되거나 (식 중, R10은 할로, -OR6, C2-C4 알카노일옥시, -C(O)R7, 및 -NR6R6으로부터 선택되고; 상기 -NHSO2R5, 프탈이미도-(C1-C4)-알킬설포닐아미노, 벤즈아미도, 벤젠설포닐아미노, 3-페닐우레이도, 2-옥소피롤리딘-1-일, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일, 및 R10-(C2-C4)-알카노일아미노 R1 기는 할로, C1-C4 알킬, 시아노, 메탄설포닐 및 C1-C4 알콕시로부터 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 치환기로 임의 치환된다);
또는 2개의 R1 기가, 이들이 부착된 탄소와 함께, O, S 및 N으로부터 선택된 1개 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 5-8원 고리를 형성하고;
R2는 수소, 또는 할로, C1-C4 알콕시, -NR6R6 및 -SO2R5로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 3개의 치환기로 임의 치환된 C1-C6 알킬이고;
n은 1 또는 2이고, 각각의 R3은 수소, 할로, 하이드록시, C1-C6 알킬, -NR6R6, 및 C1-C4 알콕시로부터 독립적으로 선택되고, 상기 R3 기의 알킬 모이어티는 할로, C1-C4 알콕시, -NR6R6, 및 -SO2R로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 3개의 치환기로 임의 치환되고;
R4는 아지도 또는 -(에티닐)-R11 (식 중, R11은 수소, 또는 하이드록시, -OR6 또는 -NR6R6으로 임의 치환된 C1-C6 알킬이다)이다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 화학식 I에 따른 화합물이다:
(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-[3-(3'-하이드록시프로핀-1-일)페닐]-아민; [3-(2'-(아미노메틸)-에티닐)페닐]-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-아민; (3-에티닐페닐)-(6-니트로퀴나졸린-4-일)-아민; (6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-(4-에티닐페닐)-아민; (6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-2-메틸페닐)-아민; (6-아미노퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-(6-메탄설포닐아미노퀴나졸린-4-일)-아민; (3-에티닐페닐)-(6,7-메틸렌디옥시퀴나졸린-4-일)-아민; (6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-6-메틸페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-(7-니트로퀴나졸린-4-일)-아민; (3-에티닐페닐)-[6-(4'-톨루엔설포닐아미노)퀴나졸린-4-일]-아민; (3-에티닐페닐)-{6-[2'-프탈이미도-에트-1'-일-설포닐아미노]퀴나졸린-4-일}-아민; (3-에티닐페닐)-(6-구아니디노퀴나졸린-4-일)-아민; (7-아미노퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-(7-메톡시퀴나졸린-4-일)-아민; (6-카르보메톡시퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (7-카르보메톡시퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; [6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐페닐)-아민; (3-아지도페닐)-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-아민; (3-아지도-5-클로로페닐)-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-아민; (4-아지도페닐)-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-아민; (3-에티닐페닐)-(6-메탄설포닐-퀴나졸린-4-일)-아민; (6-에탄설파닐-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-4-플루오로-페닐)-아민; (6,7-디메톡시-퀴나졸린-4-일)-[3-(프로핀-1'-일)-페닐]-아민; [6,7-비스-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(5-에티닐-2-메틸-페닐)-아민; [6,7-비스-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-4-플루오로-페닐)-아민; [6,7-비스-(2-클로로-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; [6-(2-클로로-에톡시)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; [6,7-비스-(2-아세톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; 2-[4-(3-에티닐-페닐아미노)-7-(2-하이드록시-에톡시)-퀴나졸린-6-일옥시]-에탄올; [6-(2-아세톡시-에톡시)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; [7-(2-클로로-에톡시)-6-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; [7-(2-아세톡시-에톡시)-6-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; 2-[4-(3-에티닐-페닐아미노)-6-(2-하이드록시-에톡시)-퀴나졸린-7-일옥시]-에탄올; 2-[4-(3-에티닐-페닐아미노)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-6-일옥시]-에탄올; 2-[4-(3-에티닐-페닐아미노)-6-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-7-일옥시]-에탄올; [6-(2-아세톡시-에톡시)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)-아민; (3-에티닐-페닐)-{6-(2-메톡시-에톡시)-7-[2-(4-메틸-피페라진-1-일)-에톡시]-퀴나졸린-4-일}-아민; (3-에티닐-페닐)-[7-(2-메톡시-에톡시)-6-(2-모르폴린-4-일)-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-아민; (6,7-디에톡시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디부톡시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디이소프로폭시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디에톡시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐-2-메틸-페닐)-아민; [6,7-비스-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-(3-에티닐-2-메틸-페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-[6-(2-하이드록시-에톡시)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-아민; [6,7-비스-(2-하이드록시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-(3-에티닐페닐)-아민; 2-[4-(3-에티닐-페닐아미노)-6-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-7-일옥시]-에탄올; (6,7-디프로폭시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-페닐)-아민; (6,7-디에톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-5-플루오로-페닐)-아민; (6,7-디에톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-4-플루오로-페닐)-아민; (6,7-디에톡시-퀴나졸린-4-일)-(5-에티닐-2-메틸-페닐)-아민; (6,7-디에톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-4-메틸-페닐)-아민; (6-아미노메틸-7-메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐-페닐)-아민; (6-아미노메틸-7-메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐메틸-7-메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐에틸-7-메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐메틸-7-에톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐에틸-7-에톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐메틸-7-이소프로폭시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐메틸-7-프로폭시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐메틸-7-메톡시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6-아미노카르보닐에틸-7-이소프로폭시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; 및 (6-아미노카르보닐에틸-7-프로폭시-퀴나졸린-4-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디에톡시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-[6-(2-하이드록시-에톡시)-7-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-아민; [6,7-비스-(2-하이드록시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-(3-에티닐페닐)-아민; [6,7-비스-(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-1-일]-(3-에티닐페닐)-아민; (6,7-디메톡시퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민; (3-에티닐페닐)-(6-메탄설포닐아미노-퀴나졸린-1-일)-아민; 및 (6-아미노-퀴나졸린-1-일)-(3-에티닐페닐)-아민.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 EGFR 길항제는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민이다. 특정 실시양태에서, EGFR 길항제 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민은 HCl 염 형태이다. 또다른 특정 실시양태에서, EGFR 길항제 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민은 약 6.26, 12.48, 13.39, 16.96, 20.20, 21.10, 22.98, 24.46, 25.14 및 26.91에 2-세타 각도로 표시되는 특징적인 피크가 있는, 실질적으로 균질한 결정성 다형체 형태 (WO 01/34,574에서 다형체 B로 기술됨)이다. 이같은 다형체 형태의 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민은 타르세바™, 뿐만 아니라 OSI-774, CP-358774 및 에를로티닙으로 지칭된다.
화학적으로 관련된 화합물들의 제조에 적용가능한 것으로 공지된 임의의 공정에 의해 화학식 I의 화합물, 이의 제약상 허용가능한 염 및 전구약물 (이하 활성 화합물)이 제조될 수 있다. 일반적으로, US 5,747,498에 개시된 반응식 I에 제시된 바와 같이 적합하게 치환된 아민을 사용하여 적합하게 치환된 퀴나졸린으로부터 활성 화합물이 제조될 수 있다:
<반응식 I>
Figure pat00007
반응식 I에 나타난 바와 같이, 식 중 X가 적절한 치환가능한 이탈기 예컨대 할로, 아릴옥시, 알킬설피닐, 알킬설포닐 예컨대 트리플루오로메탄설포닐옥시, 아릴설피닐, 아릴설포닐, 실록시, 시아노, 피라졸로, 트리아졸로 또는 테트라졸로, 바람직하게는 4-클로로퀴나졸린인 적합한 4-치환 퀴나졸린 2가 (C1-C6)알코올, 디메틸포름아미드 (DMF), N-메틸피롤리딘-2-온, 클로로포름, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란 (THF), 1-4 디옥산, 피리딘 또는 기타 비양자성(aprotic) 용매와 같은 용매 내에서 적합한 아민 또는 아민 하이드로클로라이드 4 또는 5 (식 중, R4는 상기 기술된 대로이고, Y는 Br, I, 또는 트리플루오로메탄-설포닐옥시이다)와 반응된다. 염기, 바람직하게는 알칼리금속 또는 알칼리토금속 탄산염 또는 수산화물 또는 3차 아민 염기, 예컨대 피리딘, 2,6-루티딘, 콜리딘, N-메틸-모르폴린, 트리에틸아민, 4-디메틸아미노-피리딘 또는 N,N-디메틸아닐린의 존재 하에 반응이 달성될 수 있다. 이하 이러한 염기는 적절한 염기로 지칭된다. 반응 혼합물을 주위온도 정도 내지 용매의 환류 온도 정도까지의 온도, 바람직하게는 약 35℃ 내지 환류 온도 정도에서 실질적으로 잔류 4-할로퀴나졸린이 검출될 수 없을 때까지, 전형적으로는 약 2시간 내지 약 24시간 동안 유지시킨다. 바람직하게는, 불활성 대기 예컨대 건조 질소 하에서 반응이 수행된다.
일반적으로, 반응물들이 화학량론적으로 조합된다. 아민 4 또는 5의 염 (전형적으로는 HCl 염)이 사용되는 화합물에 대해 아민 염기가 사용되는 경우, 과량의 아민 염기, 일반적으로는 여분의 등가량의 아민 염기를 사용하는 것이 바람직하다. (별법적으로, 아민 염기가 사용되지 않으면, 과량의 아민 4 또는 5가 사용될 수 있다).
입체 장애 아민 4 (예컨대 2-알킬-3-에티닐아닐린) 또는 매우 반응성인 4-할로퀴나졸린이 사용되는 화합물들에 대해, t-부틸 알코올 또는 극성 비양자성 용매 예컨대 DMF 또는 N-메틸피롤리딘-2-온을 용매로 사용하는 것이 바람직하다.
별법적으로, 식 중 X가 하이드록실 또는 옥소인 4-치환 퀴나졸린 2 (그리고, 2-질소가 수소화됨)가 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로에탄, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴 또는 기타 비양자성 용매 또는 이들의 혼합물과 같은 용매 내에서 사염화탄소 및 임의적으로 불활성 중합체 상에 지지된 임의 치환된 트리아릴포스핀 (예를 들어, 중합체에 지지된 트리페닐포스핀, 알드리치(Aldrich) 카탈로그 번호 36,645-5 (수지 1 g 당 3 mmol 인을 함유하는 2％ 디비닐벤젠 가교 폴리스티렌))과 반응된다. 반응 혼합물을 주위온도 정도 내지 환류 온도 정도까지의 온도, 바람직하게는 약 35℃ 내지 환류 온도에서 2시간 내지 24시간 동안 유지시킨다. 이러한 혼합물을 적합한 아민 또는 아민 하이드로클로라이드 4 또는 5와 직접적으로, 또는 용매를 제거 (예를 들어, 진공 증발에 의해)하고 적절한 별법적인 용매 예컨대 (C1-C6) 알코올, DMF, N-메틸피롤리딘-2-온, 피리딘 또는 1-4 디옥산을 첨가한 후 반응시킨다. 그후, 반응 혼합물을 주위온도 정도 내지 용매의 환류 온도까지의 온도, 바람직하게는 약 35℃ 내지 환류 온도 정도에서 실질적으로 완전한 생성물 형성이 달성될 때까지, 전형적으로는 약 2시간 내지 약 24시간 동안 유지시킨다. 바람직하게는, 불활성 대기 예컨대 건조 질소 하에서 반응이 수행된다.
화합물 4 (식 중 Y는 Br, I 또는 트리플루오로메탄설포닐옥시이다)가 퀴나졸린 2와의 반응에서 출발 물질로 사용되는 경우, 화학식 3의 화합물 (식 중 R1, R2, R3, 및 Y는 상기 정의된 대로이다)이 형성된다. 디에틸아민 또는 트리에틸아민과 같은 용매 내에서 적절한 루이스산(Lewis acid) 예컨대 염화제1구리 및 적절한 알킨 예컨대 트리메틸실릴아세틸렌, 프로파길 알코올 또는 3-(N,N-디메틸아미노)-프로핀의 존재 하에 적절한 팔라듐 시약 예컨대 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 또는 비스(트리페닐포스핀)팔라듐 디클로라이드와의 반응에 의해 화합물 3이 화학식 1 (식 중 R4는 R11 에티닐이고, R11은 상기 정의된 대로이다)의 화합물로 전환된다. 화합물 3을 디아조화제, 예컨대 산 및 니트라이트 (예를 들어, 아세트산 및 NaNO2)로 처리한 후 생성물을 아지드, 예컨대 NaN3으로 처리함으로써 식 중 Y가 NH2인 화합물 3이 식 중 R4가 아지드인 화합물 1로 전환될 수 있다.
식 중 R1이 아미노 또는 하이드록시아미노 기인 화학식 I의 화합물의 생산을 위해, 식 중 R1이 니트로인 상응하는 화학식 I의 화합물의 환원이 이용된다.
이같은 변형에 대해 공지된 다수의 절차 중 임의의 것에 의해 환원이 편리하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절한 금속 촉매 예컨대 팔라듐, 백금 또는 니켈의 존재 하에 반응-불활성 용매에서의 니트로 화합물의 수소화에 의해 환원이 수행될 수 있다. 추가적인 적절한 환원제는, 예를 들어, 활성 금속 예컨대 활성 철 (철 분말을 염산과 같은 산의 묽은 용액으로 세척함으로써 생산됨)이다. 따라서, 예를 들어, 물과 알코올 (예를 들어, 메탄올 또는 에탄올)의 혼합물과 같은 용매 에서 진한 염산과 함께 니트로 화합물과 활성 금속의 혼합물을, 예를 들어, 50℃ 내지 150℃ 범위의 온도, 편리하게는 70℃ 또는 이에 근접한 온도로 가열함으로써 환원이 수행될 수 있다. 또다른 적절한 클래스의 환원제는 알칼리금속 차아황산염 예컨대 차아황산나트륨이고, 이는 (C1-C4)알칸산, (C1-C6)알칸올, 물 또는 이들의 혼합물에서 사용될 수 있다.
식 중 R2 또는 R3에 1차 또는 2차 아미노 모이어티 (퀴나졸린과 반응하도록 의도되는 아미노 기 이외의 것)가 혼입된 화학식 I의 화합물의 생산을 위해, 바람직하게는 이같은 유리 아미노 기가 상기 기술된 반응 전에 보호되고, 상기 기술된 4-(치환)퀴나졸린 2와의 반응 후 탈보호된다.
여러 주지된 질소 보호기가 사용될 수 있다. 이같은 기에는 (C1-C6)알콕시카르보닐, 임의 치환된 벤질옥시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 트리틸, 비닐옥시카르보닐, O-니트로페닐설포닐, 디페닐포스피닐, p-톨루엔설포닐, 및 벤질이 포함된다. 3차 아민 염기 예컨대 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민 또는 피리딘, 바람직하게는 트리에틸아민의 존재 또는 부재 하에, 약 0℃ 내지 약 50℃의 온도, 바람직하게는 주위온도 정도에서, 염화 탄화수소 용매 예컨대 염화메틸렌 또는 1,2-디클로로에탄, 또는 에테르성 용매 예컨대 글라임, 디글라임 또는 THF에서 질소 보호기의 부가가 수행될 수 있다. 별법적으로, 쇼텐-바우만(Schotten-Baumann) 조건을 사용하여 보호기가 간편하게 부착된다.
화합물 2와 화합물 5의 상기 기술된 커플링 반응에 이어서, 당업자에게 공지된 탈보호 방법 예컨대 tert-부톡시카르보닐로 보호된 생성물에 대한 염화메틸렌에서의 트리플루오로아세트산으로의 처리에 의해 보호기를 제거할 수 있다.
보호기 및 이의 사용에 관한 설명을 위해, [T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis" Second Ed., John Wiley & Sons, New York, 1991]을 참조한다.
식 중 R1 또는 R2가 하이드록시인 화학식 I의 화합물의 생산을 위해, 식 중 R1 또는 R2가 (C1-C4)알콕시인 화학식 I의 화합물의 절단이 바람직하다.
이같은 변형에 대해 공지된 다수의 절차 중 임의의 것에 의해 절단 반응이 편리하게 수행될 수 있다. 보호된 화학식 I 유도체를 용융된 피리딘 하이드로클로라이드 (20-30 당량)로 150℃ 내지 175℃에서 처리하는 것이 O-탈알킬화에 사용될 수 있다. 별법적으로, 예를 들어, 보호된 퀴나졸린 유도체를 알칼리금속 (C1-C4)알킬설피드, 예컨대 소듐 에탄티올레이트로 처리함으로써 또는 알칼리금속 디아릴포스피드 예컨대 리튬 디페닐포스피드로 처리함으로써 절단 반응이 수행될 수 있다. 보호된 퀴나졸린 유도체를 붕소 또는 알루미늄 3할로겐화물 예컨대 3브롬화 붕소로 처리함으로써 절단 반응이 또한 편리하게 수행될 수 있다. 바람직하게는 이같은 반응은 적절한 온도에서 반응-불활성 용매의 존재 하에 수행된다.
식 중 R1 또는 R2이 (C1-C4)알킬설피닐 또는 (C1-C4)알킬설포닐 기인 화학식 I의 화합물은 식 중 R1 또는 R2이 (C1-C4)알킬설파닐 기인 화학식 I의 화합물의 산화에 의해 바람직하게 제조된다. 설파닐에서 설피닐 및/또는 설포닐로의 산화를 위한 적절한 산화제가 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 백금의 존재 하의 과산화수소, 과산 (예컨대 3-클로로퍼옥시벤조산 또는 퍼옥시아세트산), 알칼리금속 퍼옥시설페이트 (예컨대 포타슘 퍼옥시모노설페이트), 삼산화크롬 또는 기체 산소이다. 과잉 산화 및 다른 관능기에 대한 손상의 위험을 감소시키기 위해 화학양론적인 양의 산화제를 사용하여 가능한 한 온화한 조건 하에서 산화가 수행되는 것이 일반적이다. 일반적으로, 적절한 용매 예컨대 염화메틸렌, 클로로포름, 아세톤, 테트라하이드로푸란 또는 tert-부틸 메틸 에테르에서, 약 -25℃ 내지 50℃, 바람직하게는 주위온도 또는 주위온도에 가까운 온도, 즉 15℃ 내지 35℃의 온도에서 반응이 수행된다. 설피닐 기를 보유하는 화합물을 원하는 경우, 더 온화한 산화제 예컨대 소듐 또는 포타슘 메타퍼요오데이트가, 편리하게는 극성 용매 예컨대 아세트산 또는 에탄올에서, 사용되어야 한다. (C1-C4)알킬설포닐 기를 함유하는 화학식 I의 화합물은 상응하는 (C1-C4)알킬설피닐 화합물, 뿐만 아니라 상응하는 (C1-C4)알킬설파닐 화합물의 산화에 의해 수득될 수 있다.
식 중 R1이 임의 치환된 (C2-C4)알카노일아미노, 우레이도, 3-페닐우레이도, 벤즈아미도 또는 술폰아미도인 화학식 I의 화합물은 식 중 R1이 아미노인 상응하는 화합물의 아실화 또는 설포닐화에 의해 제조할 수 있다. 적절한 아실화제는 아미노에서 아실아미노로의 산화를 위한 당업계에 공지된 임의의 작용제이고, 예를 들어, 아실 할라이드, 예를 들어, (C2-C4)알카노일 클로라이드 또는 브로마이드 또는 벤조일 클로라이드 또는 브로마이드, 알칸산 무수물 또는 혼합형 무수물 (예를 들어, 알칸산과 (C1-C4)알콕시카르보닐 할라이드, 예를 들어 (C1-C4)알콕시카르보닐 클로라이드의 반응에 의해 형성된 아세트산 무수물 또는 혼합형 무수물) (적절한 염기가 존재함)이다. 식 중 R1이 우레이도 또는 3-페닐우레이도인 화학식 I의 화합물의 생산을 위해, 적절한 아실화제는, 예를 들어, 시아네이트, 예를 들어, 알칼리금속 시아네이트 예컨대 소듐 시아네이트, 또는 이소시아네이트 예컨대 페닐 이소시아네이트이다. 3차 아민 염기의 존재 하에 적절한 설포닐 할라이드 또는 설포닐 무수물로 N-설포닐화가 수행될 수 있다. 일반적으로, 반응-불활성 용매에서 약 -30℃ 내지 120℃의 온도, 편리하게는 주위온도 또는 주위온도에 가까운 온도에서 아실화 또는 설포닐화가 수행된다.
식 중 R1이 (C1-C4)알콕시 또는 치환된 (C1-C4)알콕시이거나 또는 R1이 (C1-C4)알킬아미노 또는 치환된 모노-N- 또는 디-N,N-(C1-C4)알킬아미노인 화학식 I의 화합물은, 바람직하게는 적절한 염기의 존재 하에, 식 중 R1이 각각 하이드록시 또는 아미노인 상응하는 화합물의 알킬화에 의해 제조된다. 적절한 알킬화제에는 반응-불활성 용매 내의 적절한 염기의 존재 하의 약 10℃ 내지 140℃ 범위의 온도, 편리하게는 주위온도 또는 주위온도에 가까운 온도의 알킬 할라이드 또는 치환된 알킬 할라이드, 예를 들어, 임의 치환된 (C1-C4)알킬 클로라이드, 브로마이드 또는 요오다이드가 포함된다.
식 중 R1이 아미노-, 옥시- 또는 시아노-치환된 (C1-C4)알킬 치환기인 화학식 I의 화합물의 생산을 위해, 식 중 R1이 아미노-, 알콕시-, 또는 시아노 기로 치환가능한 기를 보유하는 (C1-C4)알킬 치환기인 상응하는 화합물이, 바람직하게는 적절한 염기의 존재 하에, 적합한 아민, 알코올 또는 시아나이드와 반응된다. 바람직하게는, 반응-불활성 용매 또는 희석제에서 약 10℃ 내지 100℃ 범위의 온도, 바람직하게는 주위온도 또는 주위온도에 가까운 온도에서 반응이 수행된다.
식 중 R1이 카르복시 치환기 또는 카르복시 기를 포함하는 치환기인 화학식 I의 화합물은 식 중 R1이 (C1-C4)알콕시카르보닐 치환기 또는 (C1-C4)알콕시카르보닐 기를 포함하는 치환기인 상응하는 화합물의 가수분해에 의해 제조된다. 예를 들어, 염기성 조건 하에, 예컨대 알칼리금속 수산화물의 존재 하에 가수분해가 편리하게 수행될 수 있다.
식 중 R1이 아미노, (C1-C4)알킬아미노, 디-[(C1-C4)알킬]아미노, 피롤리딘-1-일, 피페리디노, 모르폴리노, 피페라진-1-일, 4-(C1-C4)알킬피페라진-1-일 또는 (C1-C4)알킬설파닐인 화학식 I의 화합물은, 적절한 염기의 존재 하에, 식 중 R1이 아민 또는 티올 치환가능한 기인 상응하는 화합물과 적합한 아민 또는 티올의 반응에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 반응-불활성 용매 또는 희석제에서 약 10℃ 내지 180℃ 범위, 편리하게는 100℃ 내지 150℃ 범위의 온도에서 반응이 수행된다.
식 중 R1이 2-옥소피롤리딘-1-일 또는 2-옥소피페리딘-1-일인 화학식 I의 화합물은, 적절한 염기의 존재 하에, 식 중 R1이 할로-(C2-C4)알카노일아미노 기인 상응하는 화합물의 고리화에 의해 제조된다. 바람직하게는, 반응은 반응-불활성 용매 또는 희석제에서 약 10℃ 내지 100℃ 범위의 온도, 편리하게는 주위온도 또는 주위온도에 가까운 온도에서 수행된다.
식 중 R1이 카르바모일, 치환된 카르바모일, 알카노일옥시 또는 치환된 알카노일옥시인 화학식 I의 화합물의 생산을 위해, 식 중 R1이 하이드록시인 상응하는 화합물의 카르바모일화 또는 아실화가 편리하다.
하이드록시아릴 모이어티에서 알카노일옥시아릴 기로의 아실화를 위한 당업계에 공지된 적절한 아실화제에는, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 (C2-C4)알카노일 할라이드, (C2-C4)알카노일 무수물 및 혼합형 무수물이 포함되고, 적절한 이들의 치환된 유도체가 사용될 수 있으며, 전형적으로는 적절한 염기의 존재 하에 사용된다. 별법적으로, (C2-C4)알칸산 또는 적절하게 치환된 이들의 유도체가 축합제 예컨대 카르보디이미드에 의해 식 중 R1이 하이드록시인 화학식 I의 화합물과 커플링될 수 있다. 식 중 R1이 카르바모일 또는 치환된 카르바모일인 화학식 I의 화합물의 생산을 위해, 적절한 카르바모일화제는, 예를 들어, 시아네이트 또는 알킬 또는 아릴이소시아네이트이고, 전형적으로는 적절한 염기의 존재 하에 사용된다. 별법적으로, 적절한 중간체 예컨대 식 중 R1이 하이드록시인 화학식 I의 화합물의 클로로포르메이트 또는 카르보닐이미다졸릴 유도체가, 예를 들어, 상기 유도체를 포스겐 (또는 포스겐 등가물) 또는 카르보닐디이미다졸로 처리함으로서 생성될 수 있다. 그후, 생성된 중간체를 적합한 아민 또는 치환된 아민과 반응시켜, 원하는 카르바모일 유도체를 생산할 수 있다.
식 중 R1이 아미노카르보닐 또는 치환된 아미노카르보닐인 화학식 I의 화합물은 식 중 R1이 카르복시인 적절한 중간체의 아미노분해에 의해 제조될 수 있다.
식 중 R1이 카르복시인 화학식 I의 화합물의 활성화 및 커플링은 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 적절한 방법에는 원하는 아민과의 커플링을 위한 적합한 반응성이 있는 산 할라이드, 아지드, 대칭형 또는 혼합형 무수물, 또는 활성 에스테르로서의 카르복실의 활성화가 포함된다. 이같은 유형의 중간체 및 이들의 생산 및 커플링에서의 사용의 예를 문헌에서 광범위하게 발견할 수 있다; 예를 들어 [M. Bodansky and A. Bodansky, "The Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, New York, 1984]. 생성된 화학식 I의 화합물들을 표준 방법, 예컨대 용매 제거 및 재결정화 또는 크로마토그래피에 의해 단리 및 정제할 수 있다.
기술된 반응식 I을 위한 출발 물질 (예를 들어, 아민, 퀴나졸린 및 아민 보호기)은 용이하게 입수가능하거나, 당업자가 유기 합성의 통상적인 방법을 사용하여 쉽게 합성할 수 있다. 예를 들어, 2,3-디하이드로-1,4-벤즈옥사진 유도체의 제조가 [R. C. Elderfield, W. H. Todd, S. Gerber, Ch. 12, "Heterocyclic Compounds", Vol. 6, R. C. Elderfield ed, John Wiley and Sons, Inc., N.Y., 1957]에 기술되어 있다. 치환된 2,3-디하이드로벤조티아지닐 화합물이 [R. C. Elderfield and E. E. Harris, Ch. 13, Volume 6, of the Elderfield "Heterocyclic Compounds"]에 기술되어 있다.
또다른 특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 본원에 참고로 인용된 US 5,457,105에 기술된 바와 같은 하기 화학식 II의 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염이고; 단, 4-(4'-하이드록시아닐리노)-6-메톡시퀴나졸린, 4-(4'-하이드록시아닐리노)-6,7-메틸렌디옥시퀴나졸린, 6-아미노-4-(4'-아미노아닐리노)퀴나졸린, 4-아닐리노-6-메틸퀴나졸린 또는 이의 하이드로클로라이드 염 및 4-아닐리노-6,7-디메톡시퀴나졸린 또는 이의 하이드로클로라이드 염은 제외된다:
<화학식 II>
Figure pat00008
식 중,
m은 1, 2 또는 3이고;
각각의 R1은 독립적으로 6-하이드록시, 7-하이드록시, 아미노, 카르복시, 카르바모일, 우레이도, (1-4C)알콕시카르보닐, N-(1-4C)알킬카르바모일, N,N-디-[(1-4C)알킬]카르바모일, 하이드록시아미노, (1-4C)알콕시아미노, (2-4C)알카노일옥시아미노, 트리플루오로메톡시, (1-4C)알킬, 6-(1-4C)알콕시, 7-(1-4C)알콕시, (1-3C)알킬렌디옥시, (1-4C)알킬아미노, 디-1[(1-4C)알킬]아미노, 피롤리딘-1-일, 피페리디노, 모르폴리노, 피페라진-1-일, 4-(1-4C)알킬피페라진-1-일, (1-4C)알킬티오, (1-4C)알킬설피닐, (1-4C)알킬설포닐, 브로모메틸, 디브로모메틸, 하이드록시-(1-4C)알킬, (2-4C)알카노일옥시-(1-4C)알킬, (1-4C)알콕시-(1-4C)알킬, 카르복시-(1-4C)알킬, (1-4C)알콕시카르보닐-(1-4C)알킬, 카르바모일-(1-4C)알킬, N-(1-4C)알킬카르바모일-(1-4C)알킬, N,N-디-[(1-4C)알킬]카르바모일-(1-4C)알킬, 아미노-(1-4C)알킬, (1-4C)알킬아미노-(1-4C)알킬, 디-[(1-4C)알킬]아미노-(1-4C)알킬, 피페리디노-(1-4C)알킬, 모르폴리노-(1-4C)알킬, 피페라진-1-일-(1-4C) 알킬, 4-(1-4C)알킬피페라진-1-일-(1-4C) 알킬, 하이드록시-(2-4C)알콕시-(1-4C) 알킬, (1-4C)알콕시-(2-4C)알콕시-(1-4C)알킬, 하이드록시-(2-4C)알킬아미노-(1-4C)알킬, (1-4C)알콕시-(2-4C)알킬아미노-(1-4C)알킬, (1-4C)알킬티오-(1-4C)알킬, 하이드록시-(2-4C)알킬티오-(1-4C)알킬, (1-4C)알콕시-(2-4C)알킬티오-(1-4C)알킬, 페녹시-(1-4C)알킬, 아닐리노-(1-4C)알킬, 페닐티오-(1-4C)알킬, 시아노-(1-4C)알킬, 할로게노-(2-4C)알콕시, 하이드록시-(2-4C)알콕시, (2-4C)알카노일옥시-(2-4C)알콕시, (1-4C)알콕시-(2-4C)알콕시, 카르복시-(1-4C)알콕시, (1-4C)알콕시카르보닐-(1-4C)알콕시, 카르바모일-(1-4C)알콕시, N-(1-4C) 알킬카르바모일-(1-4C)알콕시, N,N-디-[(1-4C)알킬]카르바모일-(1-4C)알콕시, 아미노-(2-4C)알콕시, (1-4C)알킬아미노-(2-4C)알콕시, 디-[(1-4C)알킬]아미노-(2-4C)알콕시, (2-4C)알카노일옥시, 하이드록시-(2-4C)알카노일옥시, (1-4C)알콕시-(2-4C)알카노일옥시, 페닐-(1-4C)알콕시, 페녹시-(2-4C)알콕시, 아닐리노-(2-4C)알콕시, 페닐티오-(2-4C)알콕시, 피페리디노-(2-4C)알콕시, 모르폴리노-(2-4C)알콕시, 피페라진-1-일-(2-4C)알콕시, 4-(1-4C)알킬피페라진-1-일-(2-4C)알콕시, 할로게노-(2-4C)알킬아미노, 하이드록시-(2-4C)알킬아미노, (2-4C)알카노일옥시-(2-4C)알킬아미노, (1-4C)알콕시-(2-4C)알킬아미노, 카르복시-(1-4C)알킬아미노, (1-4C)알콕시카르보닐-(1-4C)알킬아미노, 카르바모일-(1-4C)알킬아미노, N-(1-4C)알킬카르바모일-(1-4C)알킬아미노, N,N-디-[(1-4C)알킬]카르바모일-(1-4C)알킬아미노, 아미노-(2-4C)알킬아미노, (1-4C)알킬아미노-(2-4C)알킬아미노, 디-1(1-4C)알킬]아미노-(2-4C)알킬아미노, 페닐-(1-4C)알킬아미노, 페녹시-(2-4C)알킬아미노, 아닐리노-(2-4C)알킬아미노, 페닐티오-(2-4C)알킬아미노, (2-4C)알카노일아미노, (1-4C)알콕시카르보닐아미노, (1-4C)알킬설포닐아미노, 벤즈아미도, 벤젠설포아미도, 3-페닐우레이도, 2-옥소피롤리딘-1-일, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일, 할로게노-(2-4C)알카노일아미노, 하이드록시-(2-4C)알카노일아미노, (1-4C)알콕시-(2-4C)알카노일아미노, 카르복시-(2-4C)알카노일아미노, (1-4C)알콕시카르보닐-(2-4C)알카노일아미노, 카르바모일-(2-4C)알카노일아미노, N-(1-4C)알킬카르바모일-(2-4C)알카노일아미노, N,N-디-[(1-4C)알킬]카르바모일-(2-4C)알카노일아미노, 아미노-(2-4C)알카노일아미노, (1-4C)알킬아미노-(2-4C)알카노일아미노 또는 디-[(1-4C)알킬]아미노-(2-4C)알카노일아미노이고, 이때 R1 치환기 내의 상기 벤즈아미도 또는 벤젠설포아미도 치환기 또는 임의의 아닐리노, 페녹시 또는 페닐 기는 임의적으로 1개 또는 2개의 할로게노, (1-4C)알킬 또는 (1-4C)알콕시 치환기를 보유할 수 있고;
n은 1 또는 2이고;
각각의 R2는 독립적으로 수소, 하이드록시, 할로게노, 트리플루오로메틸, 아미노, 니트로, 시아노, (1-4C)알킬, (1-4C)알콕시, (1-4C)알킬아미노, 디-[(1-4C)알킬] 아미노, (1-4C)알킬티오, (1-4C)알킬설피닐 또는 (1-4C)알킬설포닐이다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-6,7-디메톡시퀴나졸린; 4-(3',4'-디클로로아닐리노)-6,7-디메톡시퀴나졸린; 6,7-디메톡시-4-(3'-니트로아닐리노)-퀴나졸린; 6,7-디에톡시-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 6-메톡시-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 4-(3'-클로로아닐리노)-6-메톡시퀴나졸린; 6,7-에틸렌디옥시-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 6-아미노-7-메톡시-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 4-(3'-메틸아닐리노)-6-우레이도퀴나졸린; 6-(2-메톡시에톡시메틸)-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 6,7-디-(2-메톡시에톡시)-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 6-디메틸아미노-4-(3'-메틸아닐리노)퀴나졸린; 6-벤즈아미도-4-(3'-메틸아닐리노)퀴나졸린; 6,7-디메톡시-4-(3'-트리플루오로메틸아닐리노)-퀴나졸린; 6-하이드록시-7-메톡시-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 7-하이드록시-6-메톡시-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 7-아미노-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 6-아미노-4-(3'-메틸아닐리노)퀴나졸린; 6-아미노-4-(3'-클로로아닐리노)-퀴나졸린; 6-아세트아미도-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 6-(2-메톡시에틸아미노)-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 7-(2-메톡시아세트아미도)-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 7-(2-하이드록시에톡시)-6-메톡시-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 7-(2-메톡시에톡시)-6-메톡시-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린; 6-아미노-4-(3'-메틸아닐리노)-퀴나졸린으로 구성된 군으로부터 선택된 화학식 II에 따른 화합물이다.
화학적으로 관련된 화합물들의 제조에 적용가능한 것으로 공지된 임의의 공정에 의해 화학식 II의 퀴나졸린 유도체, 또는 이의 제약상 허용가능한 염이 제조될 수 있다. 예를 들어, 적절한 공정이 US 4,322,420에서 사용된 공정에서 설명되어 있다. 필요한 출발 물질들은 시판되거나, 또는 유기 화학의 표준 절차에 의해 수득될 수 있다.
(a) 편리하게는 적절한 염기의 존재 하에서의, 퀴나졸린 (i) (식 중 Z는 치환가능한 기이다)과 아닐린 (ii)의 반응.
Figure pat00009
적절한 치환가능한 기 Z는, 예를 들어, 할로게노, 알콕시, 아릴옥시 또는 설포닐옥시 기, 예를 들어 클로로, 브로모, 메톡시, 페녹시, 메탄설포닐옥시 또는 톨루엔-p-설포닐옥시 기이다.
적절한 염기는, 예를 들어, 유기 아민 염기 예컨대 피리딘, 2,6-루티딘, 콜리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 트리에틸아민, 모르폴린, N-메틸모르폴린 또는 디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔, 또는, 예를 들어, 알칼리금속 또는 알칼리토금속 탄산염 또는 수산화물 예컨대 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨이다.
바람직하게는, 적절한 불활성 용매 또는 희석제, 예를 들어 알칸올 또는 에스테르 예컨대 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 에틸 아세테이트, 할로겐화 용매 예컨대 염화메틸렌, 클로로포름 또는 사염화탄소, 에테르 예컨대 테트라하이드로푸란 또는 1,4-디옥산, 방향족 용매 예컨대 톨루엔, 또는 2극성 비양자성 용매 예컨대 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리딘-2-온 또는 디메틸설폭시드의 존재 하에 반응이 수행된다. 편리하게는, 예를 들어, 10℃ 내지 150℃ 범위, 바람직하게는 20℃ 내지 80℃ 범위의 온도에서 반응이 수행된다.
화학식 II의 퀴나졸린 유도체가 유리 염기의 형태로 이러한 공정으로부터 수득될 수 있거나, 또는 별법적으로 화학식 H-Z (식 중 Z는 상기 정의된 의미를 지닌다)의 산과의 염의 형태로 수득될 수 있다. 염으로부터 유리 염기를 수득하는 것이 바람직한 경우, 통상적인 절차를 사용하여 상기 정의된 바와 같은 적절한 염기로 염을 처리할 수 있다.
(b) 식 중 R1 또는 R2가 하이드록시인 화학식 II의 화합물의 생산을 위한, 식 중 R1 또는 R2가 (1-4C)알콕시인 화학식 II의 퀴나졸린 유도체의 절단.
이같은 변형에 대해 공지된 다수의 절차 중 임의의 것에 의해 절단 반응이 편리하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 퀴나졸린 유도체를 알칼리금속 (1-4C)알킬설피드 예컨대 소듐 에탄티올레이트로 처리함으로써, 또는, 예를 들어, 알칼리금속 디아릴포스피드 예컨대 리튬 디페닐포스피드로 처리함으로써 반응이 수행될 수 있다. 별법적으로, 예를 들어, 퀴나졸린 유도체를 붕소 또는 알루미늄 3할로겐화물 예컨대 3브롬화 붕소로 처리함으로써 절단 반응이 편리하게 수행될 수 있다. 바람직하게는 이같은 반응은 상기 정의된 바와 같은 적절한 불활성 용매 또는 희석제의 존재 하에 적절한 온도에서 수행된다.
(c) 식 중 R1 또는 R2가 (1-4C)알킬설피닐 또는 (1-4C)알킬설포닐 기인 화학식 II의 화합물의 생산을 위한, 식 중 R1 또는 R2가 (1-4C)알킬티오 기인 화학식 II의 퀴나졸린 유도체의 산화.
적절한 산화제는, 예를 들어, 티오에서 설피닐 및/또는 설포닐로의 산화를 위한 당업계에 공지된 임의의 작용제, 예를 들어, 백금의 존재 하의 과산화수소, 과산 (예컨대 3-클로로퍼옥시벤조산 또는 퍼옥시아세트산), 알칼리금속 퍼옥시설페이트 (예컨대 포타슘 퍼옥시모노설페이트), 삼산화크롬 또는 기체 산소이다. 과잉 산화 및 다른 관능기에 대한 손상의 위험을 감소시키기 위해, 필요한 화학양론적인 양의 산화제를 사용하여 가능한 한 온화한 조건 하에서 산화가 수행되는 것이 일반적이다. 일반적으로, 적절한 용매 또는 희석제 예컨대 염화메틸렌, 클로로포름, 아세톤, 테트라하이드로푸란 또는 tert-부틸 메틸 에테르에서, 예를 들어, 약 -25℃ 내지 50℃, 편리하게는 주위온도 또는 주위온도에 가까운 온도, 즉 15℃ 내지 35℃ 범위의 온도에서 반응이 수행된다. 설피닐 기를 보유하는 화합물을 원하는 경우, 더 온화한 산화제, 예를 들어 소듐 또는 포타슘 메타퍼요오데이트가, 편리하게는 극성 용매 예컨대 아세트산 또는 에탄올에서, 또한 사용될 수 있다. (1-4C)알킬설포닐 기를 함유하는 화학식 II의 화합물이 필요한 경우, 이는 상응하는 (1-4C)알킬설피닐 화합물, 뿐만 아니라 상응하는 (1-4C)알킬티오 화합물의 산화에 의해 수득될 수 있음이 이해될 것이다.
(d) 식 중 R1이 아미노인 화학식 II의 화합물의 생산을 위한, 식 중 R1이 니트로인 화학식 I의 퀴나졸린 유도체의 환원.
이같은 변형에 대해 공지된 다수의 절차 중 임의의 것에 의해 환원이 편리하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절한 금속 촉매 예컨대 팔라듐 또는 백금의 존재 하에 상기 정의된 바와 같은 불활성 용매 또는 희석제 내의 니트로 화합물의 용액의 수소화에 의해 환원이 수행될 수 있다. 추가적인 적절한 환원제는, 예를 들어, 활성 금속 예컨대 활성 철 (철 분말을 염산과 같은 산의 묽은 용액으로 세척함으로써 생산됨)이다. 따라서, 예를 들어, 물과 알코올 (예를 들어, 메탄올 또는 에탄올)의 혼합물과 같은 적절한 용매 또는 희석제 내의 니트로 화합물과 활성 금속의 혼합물을, 예를 들어, 50℃ 내지 150℃ 범위의 온도, 편리하게는 70℃ 또는 이에 근접한 온도로 가열함으로써 환원이 수행될 수 있다.
(e) 식 중 R1이 (2-4C)알카노일아미노 또는 치환된 (2-4C)알카노일아미노, 우레이도, 3-페닐우레이도 또는 벤즈아미도이거나, 또는 R2가 아세트아미도 또는 벤즈아미도인 화학식 II의 화합물의 생산을 위한, 식 중 R1 또는 R2가 아미노인 화학식 II의 퀴나졸린 유도체의 아실화.
적절한 아실화제는, 예를 들어, 아미노에서 아실아미노로의 아실화를 위한 당업계에 공지된 임의의 작용제, 예를 들어, 아실 할라이드, 예를 들어, (2-4C)알카노일 클로라이드 또는 브로마이드 또는 벤조일 클로라이드 또는 브로마이드 (편리하게는 상기 정의된 바와 같은 적절한 염기가 존재함), 알칸산 무수물 또는 혼합형 무수물, 예를 들어 알칸산과 (1-4C)알콕시카르보닐 할라이드, 예를 들어 (1-4C)알콕시카르보닐 클로라이드의 반응에 의해 형성된 (2-4C)알칸산 무수물 예컨대 아세트산 무수물 또는 혼합형 무수물 (상기 정의된 바와 같은 적절한 염기가 존재함)이다. 식 중 R1이 우레이도 또는 3-페닐우레이도인 화학식 II의 화합물의 생산을 위해, 적절한 아실화제는, 예를 들어, 시아네이트, 예를 들어, 알칼리금속 시아네이트 예컨대 소듐 시아네이트, 또는 이소시아네이트 예컨대 페닐 이소시아네이트이다. 일반적으로, 상기 정의된 바와 같은 적절한 불활성 용매 또는 희석제에서, 예를 들어, -30℃ 내지 120℃ 범위의 온도, 편리하게는 주위 온도 또는 주위 온도에 가까운 온도에서 아실화가 수행된다.
(f) 식 중 R1이 (1-4C)알콕시 또는 치환된 (1-4C)알콕시이거나 또는 R1이 (1-4C)알킬아미노 또는 치환된 (1-4C)알킬아미노인 화학식 II의 화합물의 생산을 위한, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 적절한 염기의 존재 하에서의, 식 중 R1이 필요한 대로 하이드록시 또는 아미노인 화학식 II의 퀴나졸린 유도체의 알킬화.
적절한 알킬화제는, 예를 들어, 하이드록시에서 알콕시 또는 치환된 알콕시로의 알킬화, 또는 아미노에서 알킬아미노 또는 치환된 알킬아미노로의 알킬화를 위한 당업계에 공지된 임의의 작용제, 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 적절한 염기의 존재 하의 상기 정의된 바와 같은 적절한 불활성 용매 또는 희석제 내의 예를 들어 10℃ 내지 140℃ 범위의 온도, 편리하게는 주위온도 또는 주위온도에 가까운 온도의 알킬 할라이드 또는 치환된 알킬 할라이드, 예를 들어 (1-4C)알킬 클로라이드, 브로마이드 또는 요오다이드 또는 치환된 (1-4C)알킬 클로라이드, 브로마이드 또는 요오다이드이다.
(g) 식 중 R1이 카르복시 치환기 또는 카르복시 기를 포함하는 치환기인 화학식 II의 화합물의 생산을 위한, 식 중 R1이 (1-4C)알콕시카르보닐 치환기 또는 (1-4C)알콕시카르보닐 기를 포함하는 치환기인 화학식 II의 퀴나졸린 유도체의 가수분해.
예를 들어, 염기성 조건 하에, 가수분해가 편리하게 수행될 수 있다.
(h) 식 중 R1이 아미노-, 옥시-, 티오- 또는 시아노-치환된 (1-4C)알킬 치환기인 화학식 II의 화합물의 생산을 위한, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 적절한 염기의 존재 하에서의, 식 중 R1이 상기 정의된 바와 같은 치환가능한 기를 보유하는 (1-4C)알킬 치환기인 화학식 II의 퀴나졸린 유도체와 적합한 아민, 알코올, 티올 또는 시아나이드의 반응.
바람직하게는, 상기 정의된 바와 같은 적절한 불활성 용매 또는 희석제에서, 예를 들어, 10℃ 내지 100℃ 범위의 온도, 편리하게는 주위온도 또는 주위온도에 가까운 온도에서 반응이 수행된다.
화학식 II의 퀴나졸린 유도체의 제약상 허용가능한 염이 필요한 경우, 예를 들어, 통상적인 절차를 사용하여 상기 화합물을 예를 들어 적절한 산과 반응시킴으로써 이러한 염이 수득될 수 있다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 본원에 참고로 인용된 US 5,770,599에 개시된 바와 같은 화학식 II'에 따른 화합물, 또는 이의 제약상 허용가능한 염이다:
<화학식 II'>
Figure pat00010
식 중,
n은 1, 2 또는 3이고;
각각의 R2는 독립적으로 할로게노 또는 트리플루오로메틸이고;
R3은 (1-4C)알콕시이며;
R1은 디-[(1-4C)알킬]아미노-(2-4C)알콕시, 피롤리딘-1-일-(2-4C)알콕시, 피페리디노-(2-4C)알콕시, 모르폴리노-(2-4C)알콕시, 피페라진-1-일-(2-4C)알콕시, 4-(1-4C)알킬피페라진-1-일-(2-4C)알콕시, 이미다졸-1-일-(2-4C)알콕시, 디-[(1-4C)알콕시-(2-4C)알킬]아미노-(2-4C)알콕시, 티아모르폴리노-(2-4C)알콕시, 1-옥소티아모르폴리노-(2-4C)알콕시 또는 1,1-디옥소티아모르폴리노-(2-4C)알콕시이고, 이때 N 또는 O 원자에 부착되지 않은 CH2 (메틸렌) 기를 포함하는 임의의 상기 언급된 R1 치환기는 임의적으로 상기 CH2 기 상에 하이드록시 치환기를 보유한다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(2-피롤리딘-1-일에톡시)-퀴나졸린; 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(2-모르폴리노에톡시)-퀴나졸린; 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-6-(3-디에틸아미노프로폭시)-7-메톡시퀴나졸린; 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)-퀴나졸린; 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-6-(3-디메틸아미노프로폭시)-7-메톡시퀴나졸린; 4-(3',4'-디플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)-퀴나졸린; 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-피페리디노프로폭시)-퀴나졸린; 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)-퀴나졸린; 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-6-(2-디메틸아미노에톡시)-7-메톡시퀴나졸린; 4-(2',4'-디플루오로아닐리노)-6-(3-디메틸아미노프로폭시)-7-메톡시퀴나졸린; 4-(2',4'-디플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)-퀴나졸린; 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-6-(2-이미다졸-1-일에톡시)-7-메톡시퀴나졸린; 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-6-(3-이미다졸-1-일프로폭시)-7-메톡시퀴나졸린; 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-6-(2-디메틸아미노에톡시)-7-메톡시퀴나졸린; 4-(2',4'-디플루오로아닐리노)-6-(3-디메틸아미노프로폭시)-7-메톡시퀴나졸린; 4-(2',4'-디플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)-퀴나졸린; 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-6-(2-이미다졸-1-일에톡시)-7-메톡시퀴나졸린; 및 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-6-(3-이미다졸-1-일프로폭시)-7-메톡시퀴나졸린으로 구성된 군으로부터 선택된 화학식 II'에 따른 화합물이다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 ZD 1839, 제피티닙 및 이레사(Iressa)®로 별법적으로 지칭되는, 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)-퀴나졸린인 화학식 II'에 따른 화합물이다.
화학적으로 관련된 화합물들의 제조에 적용가능한 것으로 공지된 임의의 공정에 의해 화학식 II'의 퀴나졸린 유도체, 또는 이의 제약상 허용가능한 염이 제조될 수 있다. 예를 들어, 적절한 공정에는 US5616582, US 5580870, US 5475001 및 US5569658에 설명된 것들이 포함된다. 달리 언급되지 않는 한, n, R2, R3 및 R1은 화학식 II'의 퀴나졸린 유도체에 대해 상기 정의된 의미들 중 임의의 의미를 지닌다. 필요한 출발 물질들은 시판되거나, 또는 유기 화학의 표준 절차에 의해 수득될 수 있다.
(a) 편리하게는 적절한 염기의 존재 하에서의, 퀴나졸린 (iii) (식 중 Z는 치환가능한 기이다)과 아닐린 (iv)의 반응.
Figure pat00011
적절한 치환가능한 기 Z는, 예를 들어, 할로게노, 알콕시, 아릴옥시 또는 설포닐옥시 기, 예를 들어 클로로, 브로모, 메톡시, 페녹시, 메탄설포닐옥시 또는 톨루엔-4-설포닐옥시 기이다.
적절한 염기는, 예를 들어, 유기 아민 염기 예컨대 피리딘, 2,6-루티딘, 콜리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 트리에틸아민, 모르폴린, N-메틸모르폴린 또는 디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔, 또는, 예를 들어, 알칼리금속 또는 알칼리토금속 탄산염 또는 수산화물 예컨대 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨이다. 별법적으로, 적절한 염기는, 예를 들어, 알칼리금속 또는 알칼리토금속 아미드, 예를 들어 소듐 아미드 또는 소듐 비스(트리메틸실릴)아미드이다.
바람직하게는, 적절한 불활성 용매 또는 희석제, 예를 들어 알칸올 또는 에스테르 예컨대 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 에틸 아세테이트, 할로겐화 용매 예컨대 염화메틸렌, 클로로포름 또는 사염화탄소, 에테르 예컨대 테트라하이드로푸란 또는 1,4-디옥산, 방향족 용매 예컨대 톨루엔, 또는 2극성 비양자성 용매 예컨대 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리딘-2-온 또는 디메틸설폭시드의 존재 하에 반응이 수행된다. 편리하게는, 예를 들어, 10℃ 내지 150℃ 범위, 바람직하게는 20℃ 내지 80℃ 범위의 온도에서 반응이 수행된다.
화학식 II'의 퀴나졸린 유도체가 유리 염기의 형태로 이러한 공정으로부터 수득될 수 있거나, 또는 별법적으로 화학식 H-Z (식 중 Z는 상기 정의된 의미를 지닌다)의 산과의 염의 형태로 수득될 수 있다. 염으로부터 유리 염기를 수득하는 것이 바람직한 경우, 통상적인 절차를 사용하여 상기 정의된 바와 같은 적절한 염기로 염을 처리할 수 있다.
(b) 식 중 R1이 아미노-치환된 (2-4C)알콕시 기인 화학식 II'의 화합물의 생산을 위한, 편리하게는 상기 정의된 바와 같은 적절한 염기의 존재 하에서의, 식 중 R1이 하이드록시 기인 화학식 II'의 퀴나졸린 유도체의 알킬화.
적절한 알킬화제는, 예를 들어, 하이드록시에서 아미노-치환된 알콕시로의 알킬화를 위한 당업계에 공지된 임의의 작용제, 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 적절한 염기의 존재 하의 상기 정의된 바와 같은 적절한 불활성 용매 또는 희석제 내의, 예를 들어, 10℃ 내지 140℃ 범위의 온도, 편리하게는 80℃ 또는 80℃에 가까운 온도의 아미노-치환된 알킬 할라이드, 예를 들어 아미노-치환된 (2-4C)알킬 클로라이드, 브로마이드 또는 요오다이드이다.
(c) 식 중 R1이 아미노-치환된 (2-4C)알콕시 기인 화학식 II'의 화합물의 생산을 위한, 편리하게는 상기 정의된 바와 같은 적절한 염기의 존재 하에서의, 식 중 R1이 하이드록시-(2-4C)알콕시 기인 화학식 II'의 화합물 또는 이의 반응성 유도체와 적합한 아민의 반응.
식 중 R1이 하이드록시-(2-4C)알콕시 기인 화학식 II'의 화합물의 반응성 유도체는, 예를 들어, 할로게노- 또는 설포닐옥시-(2-4C)알콕시 기 예컨대 브로모- 또는 메탄설포닐옥시-(2-4C)알콕시 기이다.
바람직하게는, 상기 정의된 바와 같은 적절한 불활성 용매 또는 희석제의 존재 하에, 예를 들어, 10℃ 내지 150℃ 범위의 온도, 편리하게는 50℃ 또는 50℃에 가까운 온도에서 반응이 수행된다.
(d) 식 중 R1이 하이드록시-아미노-(2-4C)알콕시 기인 화학식 II'의 화합물의 생산을 위한, 식 중 R1이 2,3-에폭시프로폭시 또는 3,4-에폭시부톡시 기인 화학식 II'의 화합물과 적합한 아민의 반응.
바람직하게는, 상기 정의된 바와 같은 적절한 불활성 용매 또는 희석제의 존재 하에, 예를 들어, 10℃ 내지 150℃ 범위의 온도, 편리하게는 70℃ 또는 70℃에 가까운 온도에서 반응이 수행된다.
화학식 II'의 퀴나졸린 유도체의 제약상 허용가능한 염, 예를 들어 화학식 II'의 퀴나졸린 유도체의 모노- 또는 디-산 부가염이 필요한 경우, 예를 들어, 통상적인 절차를 사용하여 상기 화합물을 예를 들어 적절한 산과 반응시킴으로써 이러한 염이 수득될 수 있다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 본원에 참고로 인용된 WO9935146에 개시된 바와 같은 화학식 III에 따른 화합물, 또는 이의 염 또는 용매화물이다:
<화학식 III>
Figure pat00012
식 중,
X는 N 또는 CH이고;
Y는 CR1이고 V는 N이거나;
또는 Y는 N이고 V는 CR1이거나;
또는 Y는 CR1이고 V는 CR2이거나;
또는 Y는 CR2이고 V는 CR1이고;
R1은 CH3SO2CH2CH2NHCH2-Ar- 기를 나타내고, 식 중 Ar은 페닐, 푸란, 티오펜, 피롤 및 티아졸로부터 선택되고, 이들 각각은 1개 또는 2개의 할로, C1- 4알킬 또는 C1-4알콕시 기로 임의 치환될 수 있고;
R2는 수소, 할로, 하이드록시, C1- 4알킬, C1- 4알콕시, C1- 4알킬아미노 및 디[C1-4알킬]아미노를 포함하는 군으로부터 선택되고;
U는 R3 기로 치환되고 1개 이상의 독립적으로 선택된 R4 기로 임의 치환된, 페닐, 피리딜, 3H-이미다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 1H-인다졸릴, 2,3-디하이드로-1H-인다졸릴, 1H-벤즈이미다졸릴, 2,3-디하이드로-1H-벤즈이미다졸릴 또는 1H-벤조트리아졸릴 기를 나타내고;
R3은 벤질, 할로-, 디할로- 및 트리할로벤질, 벤조일, 피리딜메틸, 피리딜메톡시, 페녹시, 벤질옥시, 할로-, 디할로- 및 트리할로벤질옥시 및 벤젠설포닐을 포함하는 군으로부터 선택되거나;
또는 R3은 트리할로메틸벤질 또는 트리할로메틸벤질옥시를 나타내거나;
또는 R3은 하기 화학식의 기를 나타내고:
Figure pat00013
(식 중 각각의 R5는 독립적으로 할로겐, C1- 4알킬 및 C1- 4알콕시로부터 선택되고; n은 0 내지 3이다);
각각의 R4는 독립적으로 하이드록시, 할로겐, C1- 4알킬, C2- 4알케닐, C2- 4알키닐, C1- 4알콕시, 아미노, C1- 4알킬아미노, 디[C1-4알킬]아미노, C1- 4알킬티오, C1- 4알킬설피닐, C1- 4알킬설포닐, C1- 4알킬카르보닐, 카르복시, 카르바모일, C1- 4알콕시카르보닐, C1-4 알카노일아미노, N-(C1- 4알킬)카르바모일, N,N-디(C1-4알킬)카르바모일, 시아노, 니트로 및 트리플루오로메틸이다.
특정 실시양태에서, 화학식 III의 EGFR 길항제는 (1-벤질-1H-인다졸-5-일)-(6-(5-((2-메탄설포닐-에틸아미노)-메틸)-푸란-2-일)-피리도[3,4-d]피리미딘-4-일-아민; (4-벤질옥시-페닐)-(6-(5-((2-메탄설포닐-에틸아미노)-메틸)-푸란-2-일)-피리도[3,4-d]피리미딘-4-일-아민; (1-벤질-1H-인다졸-5-일)-(6-(5-((2-메탄설포닐-에틸아미노)-메틸)-푸란-2-일)-퀴나졸린-4-일-아민; (1-벤질 H-인다졸-5-일)-(7-(5-((2-메탄설포닐-에틸아미노)-메틸)-푸란-2-일)-퀴나졸린-4-일-아민; 및 (1-벤질-1H-인다졸-5-일)-(6-(5-((2-메탄설포닐-에틸아미노)-메틸)-1-메틸-피롤-2-일)-퀴나졸린-4-일-아민을 제외한다.
특정 실시양태에서, 화학식 III의 EGFR 길항제는 4-(4-플루오로벤질옥시)-페닐)-(6-(5-((2-메탄설포닐-에틸아미노)메틸)-푸란-2-일)-피리도[3,4-d]피리미딘-4-일)-아민; (4-(3-플루오로벤질옥시)-페닐)-(6-(5-((2-메탄설포닐-에틸아미노)메틸)푸란-2-일)-피리도[3,4-d]피리미딘-4-일)-아민; (4-벤젠설포닐-페닐)-(6-(5-((2-메탄설포닐-에틸아미노)-메틸)-푸란-2-일)-피리도[3,4-d] 피리미딘-4-일)-아민; (4-벤질옥시-페닐)-(6-(3-((2-메탄설포닐-에틸아미노)-메틸)-페닐)-피리도[3,4-d]피리미딘-4-일)-아민; (4-벤질옥시-페닐)-(6-(5-((2-메탄설포닐-에틸아미노)-메틸)-푸란-2-일)퀴나졸린-4-일)-아민; (4-(3-플루오로벤질옥시-페닐)-(6-(4-((2-메탄설포닐-에틸아미노)-메틸)-푸란-2-일)-피리도[3,4-d]피리미딘-4-일)-아민; (4-벤질옥시-페닐)-(6-(2-((2-메탄설포닐에틸아미노)-메틸)-티아졸-4-일)퀴나졸린-4-일)-아민; N-{4-[(3-플루오로벤질)옥시]페닐}-6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; N-{4-[(3-플루오로벤질)옥시]-3-메톡시페닐}-6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; N-[4-(벤질옥시)페닐]-7-메톡시-6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; N-[4-(벤질옥시)페닐]-6-[4-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; N-{4-[(3-플루오로벤질)옥시]-3-메톡시페닐}-6-[2-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-1,3-티아졸-4-일]-4-퀴나졸린아민; N-{4-[(3-브로모벤질)옥시]페닐}-6-[2-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-1,3-티아졸-4-일]-4-퀴나졸린아민; N-{4-[(3-플루오로벤질)옥시]페닐)-6-[2-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)1,3-티아졸-4-일]-4-퀴나졸린아민; N-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-6-[2-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-1,3-티아졸-4-일]-4-퀴나졸린아민; N-(1-벤질-1H-인다졸-5-일)-7-메톡시-6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; 6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-2-푸릴]-N-(4-{[3-(트리플루오로메틸)벤질]옥시)페닐)-4-퀴나졸린아민; N-{3-플루오로-4-[(3-플루오로벤질)옥시]페닐}-6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; N-{4-[(3-브로모벤질)옥시]페닐)-6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; N-[4-(벤질옥시)페닐]-6-[3-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; N-[1-(3-플루오로벤질)-1H-인다졸-5-일]-6-[2-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-1,3-티아졸-4-일]-4-퀴나졸린아민; 6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-2-푸릴]-N-[4-(벤젠설포닐)페닐]-4-퀴나졸린아민; 6-[2-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-1,3-티아졸-4-일]-N-[4-(벤젠설포닐)페닐]-4-퀴나졸린아민; 6-[2-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-1,3-티아졸-4-일]-N-(4-{[3-(트리플루오로메틸)벤질]옥시)페닐)-4-퀴나졸린아민; N-{3-플루오로-4-[(3-플루오로벤질)옥시]페닐)-6-[2-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-1,3-티아졸-4-일]-4-퀴나졸린아민; N-(1-벤질-1H-인다졸-5-일)-6-[2-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-1,3-티아졸-4-일]-4-퀴나졸린아민; N-(3-플루오로-4-벤질옥시페닐)-6-[2-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-1,3-티아졸-4-일]-4-퀴나졸린아민; N-(3-클로로-4-벤질옥시페닐)-6-[2-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-1,3-티아졸-4-일]-4-퀴나졸린아민; N-{3-클로로-4-[(3-플루오로벤질)옥시]페닐}-6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; 6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-2-푸릴]-7-메톡시-N-(4-벤젠설포닐)페닐-4-퀴나졸린아민; N-[4-(벤질옥시)페닐]-7-플루오로-6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; N-(1-벤질-1H-인다졸-5-일)-7-플루오로-6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; N-[4-(벤젠설포닐)페닐]-7-플루오로-6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노}메틸)-2-푸릴]-4-퀴나졸린아민; N-(3-트리플루오로메틸-4-벤질옥시페닐)-6-[5-({[2-(메탄설포닐)에틸]아미노)메틸)-4-푸릴]-4-퀴나졸린아민; 및 이들의 염 및 용매화물로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 N-[3-클로로-4-[(3-플루오로페닐)메톡시]페닐]-6-[5-[[[2-(메틸설포닐)에틸]아미노]메틸]-2-푸라닐]-4-퀴나졸린아민 디토실레이트 염 (라파티닙)이다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 본원에 참고로 인용된 WO0132651에 개시된 바와 같은 화학식 IV에 따른 화합물, 또는 이의 염이다:
<화학식 IV>
Figure pat00014
식 중,
m은 1 내지 3의 정수이고;
R1은 할로게노 또는 C1-3알킬을 나타내고;
X1은 -O-를 나타내고;
R2는 하기 1)-3) 중 하나로부터 선택되고:
1) C1- 5알킬R3 (식 중 R3은 하이드록시, 할로게노, C1- 4알킬, C1- 4하이드록시알킬 및 C1- 4알콕시로부터 선택된 1개 또는 2개의 치환기를 보유할 수 있는 피페리딘-4-일이다);
2) C2-5알케닐R3 (식 중 R3은 상기 정의된 대로이다);
3) C2-5알키닐R3 (식 중 R3은 상기 정의된 대로이다),
이때 임의의 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기는 하이드록시, 할로게노 및 아미노로부터 선택된 1개 이상의 치환기를 보유할 수 있다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 4-(4-클로로-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린; 4-(2-플루오로-4-메틸아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린; 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린; 4-(4-클로로-2,6-디플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린; 4-(4-브로모-2,6-디플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린; 4-(4-클로로-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린; 4-(2-플루오로-4-메틸아닐리노)-6-메톡시-7-(피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린; 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린; 4-(4-클로로-2,6-디플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린; 4-(4-브로모-2,6-디플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린; 및 이의 제약상 허용가능한 염 및 용매화물로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, EGFR 길항제는 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린 (작티마(Zactima)) 및 이의 염이다.
조합 요법
본 발명은 c-met 길항제 및 EGFR 길항제의 조합된 활성으로부터 이로운 효과를 제공하도록 의도되는 특정 치료 계획의 일부로서의 c-met 길항제 및 EGFR 길항제의 조합 사용을 특색으로 한다. 조합의 이로운 효과에는 치료제들의 조합으로부터 초래되는 약동학적 또는 약역학적 공동-작용이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 다양한 단계의 다양한 유형의 암을 치료하는데 특히 유용하다.
용어 암은 전-암성 성장물, 양성 종양 및 악성 종양이 포함되지만 이에 한정되지 않는 증식성 장애들의 선집을 포함한다. 양성 종양은 계속 원래의 부위에 국소화되고, 원격 부위로 침윤, 침습 또는 전이되는 능력이 없다. 악성 종양은 주변의 다른 조직을 침습하여 손상시킬 것이다. 악성 종양은 원래의 부위로부터 분리되어, 일반적으로 혈류를 통해 또는 림프절이 위치하는 림프계를 통해, 신체의 다른 부분으로 확산되는 (전이되는) 능력을 또한 획득할 수 있다. 원발성 종양은 종양이 발생한 조직의 유형에 의해 분류되고, 전이성 종양은 암 세포가 유래된 조직 유형에 의해 분류된다. 시간이 경과하면, 악성 종양의 세포는 더욱 비정상이게 되고, 보다 덜 정상 세포처럼 보인다. 암 세포의 외형에서의 이러한 변화는 종양 등급으로 칭해지고, 암 세포는 상당히 분화됨 (저등급), 중간 정도로 분화됨, 불량하게 분화됨, 또는 분화되지 않음 (고등급)으로 기술된다. 상당히 분화된 세포는 꽤 정상으로 보이고, 자신이 유래된 정상 세포와 유사하다. 분화되지 않은 세포는 매우 비정상적이게 되어서 더 이상 세포의 기원을 결정할 수 없는 세포이다.
암 병기결정 시스템은 해부학적으로 암이 얼마나 멀리 확산되었는지를 기술하고, 예후 및 치료가 유사한 환자들이 동일한 병기 군에 배치되도록 시도된다. 생검 및 특정 영상화 테스트 예컨대 흉부 X선, 유방촬영사진, 골 스캔, CT 스캔 및 MRI 스캔이 포함되는 여러 테스트가 암 병기결정을 돕기 위해 수행될 수 있다. 혈액 테스트 및 임상 평가를 또한 사용하여, 환자의 전반적인 건강을 평가하고 , 암이 특정 기관으로 확산되었는지 여부를 검출할 수 있다.
암의 병기를 결정하기 위해, 미국의 암 합동 위원회(American Joint Committee on Cancer)에서 최초로 TNM 분류 시스템을 사용하는 문자 카테고리로 암, 특히 고형 종양을 배치하였다. 문자 T (종양 크기), N (촉진가능한 결절), 및/또는 M (전이)로 암이 지정된다. T1, T2, T3, 및 T4는 원발성 병변의 증가되는 크기를 기술하고; N0, N1, N2, N3은 점진적으로 진행되는 결절 병발을 가리키며; M0 및 M1은 원격 전이의 부재 또는 존재를 반영한다.
전반적 병기 분류(Overall Stage Grouping) 또는 로마 숫자 병기분류(Roman Numeral Staging)로 또한 공지된 두번째 병기결정 방법에서, 암은 원발성 병변의 크기, 뿐만 아니라 확산된 결절 또는 원격 전이의 존재를 통합하여 0기 내지 IV기로 분류된다. 이러한 시스템에서, 암은 로마 숫자 I 내지 IV로 표시되는 4개의 병기로 군이 지정되거나, 또는 "재발"로 분류된다. 일부 암에 대해, 유방암에 대한 원위치 관상 암종 또는 원위치 소엽성 암종과 같이, 0기가 "원위치" 또는 "Tis"로 지칭된다. 고등급 선종이 또한 0기로 분류될 수 있다. 일반적으로, I기 암은 통상적으로 치유가능한, 국소화된 소형 암인 한편, IV기는 수술불가능하거나 전이성인 암을 통상적으로 나타낸다. 통상적으로 II기 및 III기 암은 국소적으로 진행되었고/되었거나 국소 림프절의 병발을 나타낸다. 일반적으로, 더 높은 병기 숫자는 더 광범위한 질환을 가리키고, 여기에는 더 큰 종양 크기 및/또는 원발성 종양에 인접한 가까운 림프절 및/또는 기관으로의 암의 확산이 포함된다. 이러한 병기는 정확하게 정의되지만, 각각의 종류의 암에 대해 정의가 상이하고, 이는 당업자에게 공지되어 있다.
다수의 암 등록, 예컨대 NCI의 감독, 역학 및 최종 결과 프로그램 (SEER: Surveillance, Epidemiology, and End Results Program)은 요약 병기결정을 이용한다. 이러한 시스템은 모든 유형의 암에 대해 사용된다. 이는 암 사례들을 5가지 주요 카테고리로 분류한다:
원위치(in situ)는 암이 시작되는 세포의 층에만 존재하는 초기 암이다.
국소화(localized)는 확산 흔적이 없이, 암이 시작된 기관에만 한정되는 암이다.
국부적(regional)은 본래의 (원발성) 부위를 넘어서 가까운 림프절 또는 기관 또는 조직으로 확산된 암이다.
원격(distant)은 원발성 부위로부터 원격 기관 또는 원격 림프절로 확산된 암이다.
미지(unknown)는 병기를 나타내기에 충분한 정보가 없는 사례를 기술하도록 사용된다.
또한, 원발성 종양이 제거되고 나서 수개월 또는 수년 후 암이 재발하는 것이 통상적이다. 모든 가시적인 종양이 근절된 후에 재발하는 암은 재발성 질환으로 칭해진다. 원발성 종양 구역에서 재발하는 질환은 국소 재발성이고, 전이물로서 재발되는 질환은 원격 재발성으로 지칭된다.
종양은 고형 종양 또는 비-고형 또는 연질 조직 종양일 수 있다. 연질 조직 종양의 예로는 백혈병 (예를 들어, 만성 골수 백혈병, 급성 골수 백혈병, 성인 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수 백혈병, 성숙형 B-세포 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 전림프구성 백혈병, 또는 털세포 백혈병) 또는 림프종 (예를 들어, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 또는 호지킨 질환)이 포함된다. 고형 종양에는 혈액, 골수 또는 림프계 이외의 신체 조직의 모든 암이 포함된다. 고형 종양은 상피 세포 기원의 종양 및 비-상피 세포 기원의 종양으로 더 나뉠 수 있다. 상피 세포 고형 종양의 예로는 위장관, 결장, 유방, 전립선, 폐, 신장, 간, 췌장, 난소, 두경부, 구강, 위, 십이지장, 소장, 대장, 항문, 담낭, 음순, 코인두, 피부, 자궁, 남성 생식 기관, 비뇨 기관, 방광, 및 피부의 종양이 포함된다. 비-상피 기원의 고형 종양에는 육종, 뇌 종양 및 골 종양이 포함된다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 치료법 전 및/또는 치료법 동안 및/또는 치료법 후에, 본원에서의 환자가 진단 테스트에 적용된다. 일반적으로, 진단 테스트가 수행되는 경우, 치료법을 필요로 하는 환자로부터 샘플이 수득될 수 있다. 대상이 암에 걸린 경우, 샘플은 종양 샘플, 또는 기타 생물학적 샘플, 예컨대 혈액, 소변, 타액, 복수, 또는 혈청 및 혈장과 같은 파생물 등이 비제한적으로 포함되는 생체액일 수 있다.
본원에서의 생물학적 샘플은 고정된 샘플, 예를 들어 포르말린 고정, 파라핀매립 (FFPE) 샘플, 또는 동결된 샘플일 수 있다.
mRNA 또는 단백질의 발현을 결정하기 위한 다양한 방법에는 유전자 발현 프로파일링(profiling), 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (정량적 실시간 PCR (qRT-PCR) 포함), 마이크로어레이 분석, 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), 매스어레이(MassARRAY), 대규모 병렬 서명 서열분석 (MPSS: Massively Parallel Signature Sequencing)에 의한 유전자 발현 분석, 프로테오믹스(proteomics), 면역조직화학(IHC) 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, mRNA가 정량된다. 바람직하게는, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)의 기술을 사용하여, 또는 마이크로어레이 분석에 의해 이같은 mRNA 분석이 수행된다. PCR이 사용되는 경우, 바람직한 형태의 PCR은 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)이다. 한 실시양태에서, 상기 언급된 유전자들 중 하나 이상의 발현이, 예를 들어 동일한 종양 유형의 다른 샘플과 비교하여, 중앙값 이상이면 양성 발현으로 간주된다. 중앙값 발현 수준은 본질적으로 유전자 발현을 측정하면서 동시에 결정될 수 있거나, 또는 미리 결정되어 있을 수 있다.
mRNA 단리, 정제, 프라이머 확장 및 증폭이 포함되는, 고정된 파라핀-매립 조직을 RNA 공급원으로 사용하여 유전자 발현을 프로파일링하기 위한 대표적인 프로토콜의 단계들이 다양한 공개된 저널 기사에서 제공된다 (예를 들어: [Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000)]; [Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)]). 간략하게, 대표적인 프로세스는 파라핀에 매립된 종양 조직 샘플의 약 10 마이크로그램 두께의 절편을 절단하는 단계로 시작된다. 그후, RNA를 추출하고, 단백질 및 DNA를 제거한다. RNA 농도의 분석 후, 필요하다면 RNA 복구 및/또는 증폭 단계가 포함될 수 있고, 유전자 특이적 프로모터를 사용하여 RNA가 역전사되고, PCR이 이어진다. 마지막으로, 데이터를 분석하여, 시험된 종양 샘플에서 확인된 특징적인 유전자 발현 패턴을 기초로 환자가 이용가능한 최상의 치료 선택권(들)을 확인한다.
유전자 또는 단백질 발현의 검출은 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
암에서의 c-met 및/또는 EGFR의 발현 또는 증폭을 결정할 수 있다 (직접적으로 또는 간접적으로). 다양한 진단/예후 분석법이 이를 위해 이용가능하다. 한 실시양태에서, c-met 및/또는 EGFR 과발현을 IHC에 의해 분석할 수 있다. 파라핀에 매립된, 종양 생검으로부터의 조직 절편을 IHC 분석법에 적용하고, 하기와 같은 c-met 및/또는 EGFR 단백질 염색 강도 기준을 부여할 수 있다:
0점: 염색이 관찰되지 않거나, 10％ 미만의 종양 세포에서 막 염색이 관찰된다.
1+점: 10％를 초과하는 종양 세포에서 엷은/겨우 인지할 수 있는 막 염색이 검출된다. 세포들이 이의 막의 일부에서만 염색된다.
2+점: 10％를 초과하는 종양 세포에서 약한 정도 내지 중간 정도의 완전한 막 염색이 관찰된다.
3+점: 10％를 초과하는 종양 세포에서 중간 정도 내지 강한 정도의 완전한 막 염색이 관찰된다.
일부 실시양태에서, c-met 및/또는 EGFR 과발현 평가에 대해 점수가 0 또는 1+인 종양은 c-met 및/또는 EGFR을 과발현하지 않는 것으로 특성화될 수 있는 한편, 점수가 2+ 또는 3+인 종양은 c-met 및/또는 EGFR을 과발현하는 것으로 특성화될 수 있다.
일부 실시양태에서, c-met 및/또는 EGFR을 과발현하는 종양은 세포 당 발현된 c-met 및/또는 EGFR 분자의 카피의 개수에 따라 면역조직화학적 점수에 의해 등급될 수 있고, 생화학적으로 결정될 수 있다:
0 = 0-10,000개의 카피/세포,
1+ = 약 200,000개 이상의 카피/세포,
2+ = 약 500,000개 이상의 카피/세포,
3+ = 약 2,000,000개 이상의 카피/세포.
별법적으로 또는 추가적으로, 종양 내의 c-met 및/또는 EGFR 증폭 정도 (존재하는 경우)를 결정하기 위해 포르말린-고정, 파라핀-매립 종양 조직에 대해 FISH 분석법이 수행될 수 있다.
c-met 또는 EGFR 활성화를 직접적으로 (예를 들어, 포스포-ELISA 테스트, 또는 인산화된 수용체를 검출하는 또다른 수단에 의해), 또는 간접적으로 (예를 들어, 활성화된 하류 신호전달 경로 성분의 검출, 수용체 이량체 (예를 들어, 동종이량체, 이종이량체)의 검출, 유전자 프로파일의 검출 등에 의해) 결정할 수 있다.
유사하게, c-met 또는 EGFR의 구성적인 활성화 또는 리간드-독립적 EGFR 또는 c-met의 존재를 직접적으로 또는 간접적으로 검출할 수 있다 (예를 들어, 구성적인 활성과 상관되는 수용체 돌연변이의 검출, 구성적인 활성과 상관되는 수용체 증폭의 검출 등에 의해).
핵산 돌연변이의 검출 방법은 당업계에 주지되어 있다. 종종, 필수적이지는 않지만, 돌연변이가 존재하는지 여부의 결정을 위해 원하는 양의 물질을 제공하도록 샘플 내의 표적 핵산이 증폭된다. 증폭 기술은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 증폭 생성물이 돌연변이가 존재할 것으로 추측되는 특정 아미노산/핵산 서열 위치를 포함하는 한, 증폭 생성물은 관심 단백질을 코딩하는 핵산 서열 전체를 포함하거나 그렇지 않을 수 있다.
한 예에서, 샘플로부터의 핵산을 돌연변이된 핵산을 코딩하는 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산 프로브와 접촉시키고, 상기 혼성화를 검출함으로써, 돌연변이의 존재를 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 방사성동위원소 (3H, 32P, 33P 등), 형광 작용제 (로다민, 형광물질 등) 또는 발색제로, 프로브가 검출가능하게 표지된다. 일부 실시양태에서, 프로브는 안티센스 올리고머, 예를 들어 PNA, 모르폴리노-포스포르아미데이트, LNA 또는 2'-알콕시알콕시이다. 프로브는 뉴클레오티드 약 8개 내지 뉴클레오티드 약 100개, 또는 약 10개 내지 약 75개, 또는 약 15개 내지 약 50개, 또는 약 20개 내지 약 30개일 수 있다. 또다른 양상에서, 샘플 내의 c-met 돌연변이를 확인하기 위한 키트 내에서 본 발명의 핵산 프로브가 제공되고, 상기 키트는 c-met을 코딩하는 핵산 내의 돌연변이 부위 또는 이에 인접한 부위에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 키트는 c-met 돌연변이를 함유하는 종양이 있는 환자를 키트를 사용하는 혼성화 테스트의 결과를 기초로 c-met 길항제로 치료하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
증폭된 핵산의 전기영동 이동성을 야생형 c-met을 코딩하는 상응하는 핵산의 전기영동 이동성과 비교함으로써 돌연변이가 또한 검출될 수 있다. 이동성에서의 차이는 증폭된 핵산 서열 내의 돌연변이의 존재를 가리킨다. 임의의 적합한 분자 분리 기술에 의해, 예를 들어 폴리아크릴아미드 젤 상에서 전기영동 이동성을 결정할 수 있다.
효소 돌연변이 검출 (EMD: Enzymatic Mutation Detection)을 사용하여 돌연변이의 검출을 위해 핵산을 또한 분석할 수 있다 ([Del Tito et al., Clinical Chemistry 44:731-739, 1998]). EMD는 박테리오파지 리졸베이스(resolvase) T4 엔도뉴클리에이스 VII를 사용하고, 이는 점 돌연변이, 삽입 및 결실과 같은 핵산 변경으로부터 초래된 염기쌍 미스매치(mismatch)에 의해 야기되는 구조적 왜곡을 검출하여 절단할 때까지 이중-가닥 DNA를 스캐닝한다. 예를 들어 젤 건기영동에 의한, 리솔베이스 절단에 의해 형성된 2개의 짧은 단편의 검출은 돌연변이의 존재를 가리킨다. EMD 방법의 이점은 증폭 반응으로부터 직접적으로 분석되는 점 돌연변이, 결실 및 삽입을 확인하기 위한 단일 프로토콜이며, 이는 샘플 정제를 필요없게 하고, 혼성화 시간을 단축시키며, 신호-대-잡음 비율을 증가시킨다. 20배 과량까지의 정상 핵산 및 크기가 4 kb 이하인 단편을 함유하는 혼합된 샘플이 분석될 수 있다. 그러나, EMD 스캐닝에서는 돌연변이 양성 샘플에서 발생하는 특정 염기 변화가 확인되지 않고, 따라서 필요하다면 특정 돌연변이를 확인하기 위해 추가적인 서열분석 절차를 종종 요구한다. US 특허 번호 5,869,245에 설명된 바와 같이, CEL I 효소가 리솔베이스 T4 엔도뉴클리에이스 VII와 유사하게 사용될 수 있다.
돌연변이를 검출하기 위한 또다른 간단한 키트는 혈색소증을 야기하는 HFE, TFR2 및 FPN1 유전자에서의 다중 돌연변이를 검출하기 위한 혈색소증 스트립어세이(StripAssay)™ (Viennalabs http://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)와 유사한 역-혼성화 테스트 스트립이다. 이같은 분석법은 PCR에 의한 증폭에 이은 서열 특이적 혼성화를 기초로 한다. 단일 돌연변이 분석법을 위해서는 마이크로플레이트-기반 검출 시스템이 적용될 수 있는 반면, 다중 돌연변이 분석법을 위해서는 테스트 스트립이 "마크로-어레이(macro-array)"로 사용될 수 있다. 키트는 샘플 프렙(prep), 증폭 및 돌연변이 검출을 위한 즉석 사용(ready-to use) 시약을 포함할 수 있다. 멀티플렉스(multiplex) 증폭 프로토콜이 편리를 제공하고, 부피가 매우 제한된 샘플의 테스트를 허용한다. 간단한 스트립어세이 양식을 사용하여, 20개 이상의 돌연변이에 대한 테스트가 값비싼 장비 없이 5시간 이내에 완료될 수 있다. 일반적으로 단일 ("멀티플렉스") 증폭 반응에서, 샘플로부터 DNA가 단리되고, 표적 핵산이 시험관 내에서 증폭되고 (예를 들어, PCR에 의해), 비오틴-표지된다. 그후, 프로브가 평행한 선 또는 밴드로 고정되어 있는 테스트 스트립과 같은 고체 지지체 상에 고정된 올리고뉴클레오티드 프로브 (야생형 및 돌연변이체 특이적)에 증폭 생성물이 선택적으로 혼성화된다. 결합된 비오틴화 앰플리콘이 스트렙타비딘-알칼리성 포스파테이스 및 유색 기질을 사용하여 검출된다. 이같은 분석법은 본 발명의 돌연변이 모두 또는 이의 임의의 부분집합을 검출할 수 있다. 특정 돌연변이체 프로브 밴드에 관하여, 3가지 신호전달 패턴 중 하나가 가능하다: (i) 정상 핵산 서열을 가리키는 오직 야생형 프로브에만 대한 밴드, (ii) 이형접합 유전자형을 가리키는 야생형 및 돌연변이체 프로브 양쪽 모두에 대한 밴드, 및 (iii) 동종접합 유전자형을 가리키는 오직 돌연변이체 프로브에만 대한 밴드. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 증폭 생성물이 리간드를 포함하도록, 샘플로부터 표적 c-met 핵산 서열을 단리하고/하거나 증폭시키는 단계, 증폭 생성물을 리간드에 대한 검출가능한 결합 파트너를 포함하고, 본 발명의 돌연변이에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브와 접촉시키는 단계, 및 이어서 상기 증폭 생성물에 대한 상기 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는, 본 발명의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 리간드는 비오틴이고, 결합 파트너는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한다. 한 실시양태에서, 결합 파트너는 스트렙타비딘-알칼리성을 포함하고, 이는 유색 기질로 검출가능하다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 상이한 돌연변이들에 대해 상보적인 프로브들이 서로 분리되어 있는 테스트 스트립 상에 프로브가 고정된다. 별법적으로, 증폭된 핵산이 방사성동위원소로 표지되고, 이러한 경우 프로브는 검출가능한 표지를 포함할 필요가 없다.
야생형 유전자의 변경은 모든 형태의 돌연변이 예컨대 삽입, 역위, 결실 및/또는 점 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 체세포 돌연변이이다. 체세포 돌연변이는 특정 조직, 예를 들어, 종양 조직에서만 발생하는 것이고, 생식계열에서 유전되지 않는다. 생식계열 돌연변이는 모든 신체 조직에서 발견될 수 있다.
당업계에 주지되어 있고, 종양의 특정 유형 및 위치에 적합한 방법에 의해 표적 핵산을 포함하는 샘플을 수득할 수 있다. 종양 조직의 대표적인 조각을 수득하기 위해 종양 생검이 종종 사용된다. 별법적으로, 관심 종양 세포를 함유하는 것으로 공지되었거나 생각되는 조직/유체의 형태로 종양 세포가 간접적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 절제술, 기관지경술, 세침 흡인, 기관지 브러싱(brushing)에 의해, 또는 가래, 흉수 또는 혈액으로부터 폐암 병변의 샘플을 수득할 수 있다. 돌연변이체 유전자 또는 유전자 생성물을 종양으로부터 또는 기타 신체 샘플 예컨대 소변, 가래 또는 혈청으로부터 수득할 수 있다. 종양 샘플 내의 돌연변이체 표적 유전자 또는 유전자 생성물의 검출에 대해 상기 논의된 것과 동일한 기술을 또다른 신체 샘플에 적용할 수 있다. 암 세포가 종양으로부터 떨어져 나와 이같은 신체 샘플 내에서 나타난다. 이같은 신체 샘플을 스크리닝함으로써, 암과 같은 질환에 대해 간단한 초기 진단이 달성될 수 있다. 또한, 돌연변이체 표적 유전자 또는 유전자 생성물에 대해 이같은 신체 샘플을 테스트함으로써 치료법의 진행을 더욱 쉽게 모니터링할 수 있다.
종양 세포에 대해 조직 제제를 강화하는 수단이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 조직을 파라핀 또는 초냉동 절편으로부터 단리할 수 있다. 또한 암 세포를 유동 세포측정법 또는 레이저 포획 미세절개에 의해 정상 세포로부터 분리할 수 있다. 이러한 기술, 뿐만 아니라 종양을 정상 세포로부터 분리하기 위한 기타 기술이 당업계에 주지되어 있다. 종양 조직이 정상 세포로 고도로 오염된 경우, 돌연변이의 검출이 더욱 어려울 수 있지만, 오염 및/또는 거짓 양성/음성 결과를 최소화하는 방법이 공지되어 있고, 이들 중 일부가 하기에 기술된다. 예를 들어, 관심 종양 세포와 관련되지만 상응하는 정상 세포와는 관련되지 않는 것으로 또는 이와 반대인 것으로 공지된 바이오마커 (돌연변이 포함)의 존재에 대해 샘플을 또한 평가할 수 있다.
당업계에 주지된 기술을 사용하는 표적 핵산의 분자 클로닝 및 핵산의 서열분석에 의해 표적 핵산 내의 점 돌연변이의 검출이 달성될 수 있다. 별법적으로, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 증폭 기술을 사용하여 종양 조직으로부터의 게놈 DNA 제제로부터 직접적으로 표적 핵산 서열을 증폭시킬 수 있다. 그후, 증폭된 서열의 핵산 서열을 결정하고, 이로부터 돌연변이를 결정한다. 증폭 기술, 예를 들어, [Saiki et al., Science 239:487, 1988]; 미국 특허 번호 4,683,203 및 4,683,195에 기술된 바와 같은 중합효소 연쇄 반응이 당업계에 주지되어 있다.
적합한 프라이머의 디자인 및 선택이 당업계에 잘 확립되어 있는 기술임을 주지하여야 한다.
당업계에 공지된 라이게이스 연쇄 반응 또한 표적 핵산 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, [Wu et al., Genomics, Vol. 4, pp. 560-569 (1989)] 참조. 또한, 대립유전자 특이적 PCR로 공지된 기술도 사용될 수 있다. 예를 들어, [Ruano and Kidd, Nucleic Acids Research, Vol. 17, p. 8392, 1989] 참조. 이러한 기술에 따르면, 자신의 3' 말단에서 특정 표적 핵산 돌연변이에 혼성화하는 프라이머들이 사용된다. 특정 돌연변이가 존재하지 않으면, 증폭 생성물이 관찰되지 않는다. 유럽 특허 출원 공개 번호 0332435, 및 [Newton et al., Nucleic Acids Research, Vol. 17, p.7, 1989]에 개시된 바와 같은 증폭 불응성 돌연변이 시스템 (ARMS) 또한 사용될 수 있다. 클로닝, 서열분석 및 증폭에 의해 유전자의 삽입 및 결실이 또한 검출될 수 있다. 또한, 유전자 또는 주변의 마커 유전자에 대한 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 프로브를 사용하여 다형성 단편 내의 삽입 또는 대립유전자의 변경을 채점할 수 있다. 대립유전자의 염기 변화 변이체를 검출하기 위해 단일 가닥 형상 다형성 (SSCP) 분석이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어 [Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989], 및 [Genomics, Vol. 5, pp. 874-879, 1989] 참조. 당업계에 공지된 바와 같은 삽입 및 결실을 검출하기 위한 또다른 기술들이 또한 사용될 수 있다.
유전자의 야생형 발현 생성물의 변경을 기초로 야생형 유전자의 변경을 또한 검출할 수 있다. 이같은 발현 생성물에는 mRNA, 뿐만 아니라 단백질 생성물 양쪽 모두가 포함된다. mRNA를 증폭시키고 서열분석함으로써, 또는 mRNA로부터 제조된 cDNA의 분자 클로닝을 통해 점 돌연변이를 검출할 수 있다. 클로닝된 cDNA의 서열을 당업계에 주지된 DNA 서열분석 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 cDNA의 서열을 또한 분석할 수 있다.
미스매치는 100％ 상보적이지 않은 혼성화된 핵산 듀플렉스(duplex)이다. 완전한 상보성의 결여는 결실, 삽입, 역위, 치환 또는 프레임이동 돌연변이 때문일 수 있다. 미스매치 검출을 사용하여 표적 핵산 내의 점 돌연변이를 검출할 수 있다. 이러한 기술은 서열분석보다 덜 민감할 수 있지만, 다수의 조직 샘플에 대해 수행하기가 더 간단하다. 미스매치 절단 기술의 예는 RNase 보호 방법이고, 이는 [Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 7575, 1985], 및 [Meyers et al., Science, Vol. 230, p. 1242, 1985]에 상세하게 기술되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 인간 야생형 표적 핵산에 대해 상보적인 표지된 리보프로브의 사용을 수반할 수 있다. 리보프로브와 조직 샘플로부터 유래된 표적 핵산이 함께 어닐링(annealing) (혼성화)되고, 이어서 듀플렉스 RNA 구조 내의 일부 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 소화된다. 미스매치가 RNase A에 의해 검출되면, RNase A가 미스매치 부위에서 RNA를 절단한다. 따라서, 어닐링된 RNA 제제가 전기영동 젤 매트릭스 상에서 분리될 때, 미스매치가 검출되어 RNase A에 의해 절단되면, mRNA 또는 DNA 및 리보프로브에 대한 전장 듀플렉스 RNA보다 작은 RNA 생성물이 보일 것이다. 리보프로브는 표적 핵산 mRNA 또는 유전자의 전체 길이일 필요가 없고, 돌연변이된 것으로 추측되는 위치를 포함하는 한 표적 핵산의 일부분일 수 있다. 리보프로브가 표적 핵산 mRNA 또는 유전자의 절편만을 포함하는 경우, 원한다면 미스매치에 대해 전체 표적 핵산 서열을 스크리닝하기 위해 다수의 이러한 프로브들을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
유사한 방식으로, DNA 프로브를 사용하여, 예를 들어, 효소 또는 화학적 절단을 통해, 미스매치를 검출할 수 있다. 예를 들어, [Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, 4397, 1988]; 및 [Shenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, p. 989, 1975] 참조. 별법적으로, 매칭된 듀플렉스에 비해 미스매칭된 듀플렉스의 전기영동 이동성에서의 변화에 의해 미스매치를 검출할 수 있다. 예를 들어, [Cariello, Human Genetics, Vol. 42, p. 726, 1988] 참조. 리보프로브 또는 DNA 프로브로, 돌연변이를 함유할 수 있는 표적 핵산 mRNA 또는 DNA가 혼성화 전에 증폭될 수 있다. 표적 핵산 DNA에서의 변화를, 특히 변화가 전반적인 재배열, 예컨대 결실 및 삽입인 경우, 서던(Southern) 혼성화를 사용하여 또한 검출할 수 있다.
증폭된 표적 핵산 DNA 서열을 대립유전자-특이적 프로브를 사용하여 또한 스크리닝할 수 있다. 이러한 프로브는 핵산 올리고머이고, 이들 각각은 공지된 돌연변이를 보유하는 표적 핵산 유전자의 영역을 함유한다. 예를 들어, 1개의 올리고머는 표적 유전자 서열의 일부분에 상응하는, 뉴클레오티드 약 30개의 길이일 수 있다. 한 벌의 이같은 대립유전자-특이적 프로브를 사용함으로써, 표적 핵산 증폭 생성물을 표적 유전자 내의 기존에 확인된 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 나일론 필터 상에서, 대립유전자-특이적 프로브와 증폭된 표적 핵산 서열의 혼성화가 수행될 수 있다. 엄격한 혼성화 조건 하에서의 특정 프로브에 대한 혼성화는 대립유전자-특이적 프로브에서와 동일한 돌연변이가 종양 조직 내에 존재함을 가리킨다.
상응하는 야생형 단백질의 변경에 대해 스크리닝함으로써 야생형 표적 유전자의 변경을 또한 검출할 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자 생성물과 면역반응성인 모노클로날 항체, 예를 들어, 유전자 생성물 (단백질)의 돌연변이된 특정 위치에 결합하는 것으로 공지된 항체를 사용하여 조직을 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 항체는 결실된 엑손 (예를 들어, 엑손 14)에 결합하거나 또는 표적 단백질의 결실된 부분을 포함하는 입체형상 에피토프에 결합하는 항체일 수 있다. 동족 항원의 결여는 돌연변이를 가리킬 것이다. 돌연변이체 대립유전자의 생성물에 특이적인 항체를 또한 사용하여, 돌연변이체 유전자 생성물을 검출할 수 있다. 파지 항체 라이브러리로부터 항체가 확인될 수 있다. 이같은 면역학적 분석법은 당업계에 공지된 임의의 편리한 양식으로 수행될 수 있다. 여기에는 웨스턴(Western) 블롯, 면역조직화학 분석법 및 ELISA 분석법이 포함된다. 변경된 단백질을 검출하기 위한 임의의 수단을 사용하여 야생형 표적 유전자의 변경을 검출할 수 있다.
프라이머 쌍이 핵산 증폭 기술 예컨대 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는데 유용하다. 단일 가닥 DNA 프라이머들의 쌍이 표적 서열의 증폭을 프라이밍하기 위해 표적 핵산 서열 내의 또는 표적 핵산 서열 주변의 서열에 어닐링될 수 있다. 대립유전자-특이적 프라이머들이 또한 사용될 수 있다. 이같은 프라이머들은 특정 돌연변이체 표적 서열만 어닐링되고, 따라서 주형으로서의 돌연변이체 표적 서열의 존재 하에서만 생성물이 증폭될 것이다. 증폭된 서열의 후속 클로닝을 용이하게 하기 위해, 프라이머의 말단에 제한효소 부위 서열이 부가될 수 있다. 이같은 효소 및 부위는 당업계에 주지되어 있다. 당업계에 주지된 기술을 사용하여 프라이머 자체가 합성될 수 있다. 일반적으로, 시판되는 올리고뉴클레오티드 합성 기구를 사용하여 프라이머를 제조할 수 있다. 특정 프라이머의 디자인은 충분히 당업계에 기술 내에 속한다.
다수의 목적에 핵산 프로브가 유용하다. 이들은 상기에 이미 논의된 점 돌연변이를 검출하기 위한 RNase 보호 방법 및 게놈 DNA에 대한 서던 혼성화에서 사용될 수 있다. 표적 핵산 증폭 생성물을 검출하는데 프로브가 사용될 수 있다. 이들은 또다른 기술을 사용하여 야생형 유전자 또는 mRNA와의 미스매치를 검출하는데 또한 사용될 수 있다. 효소 (예를 들어, S1 뉴클리에이스), 화학물질 (예를 들어, 하이드록실아민 또는 4산화오스뮴 및 피페리딘), 또는 전적으로 매칭되는 하이브리드와 비교했을 때 미스매칭된 하이브리드의 전기영동 이동성에서의 변화를 사용하여 미스매치를 검출할 수 있다. 이러한 기술들은 당업계에 공지되어 있다. [Novack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83, p. 586, 1986] 참조. 일반적으로, 프로브들은 카이네이스 도메인 외부의 서열에 대해 상보적이다. 전체적인 한 벌의 핵산 프로브가 사용되어, 표적 핵산 내의 돌연변이들을 검출하기 위한 키트를 구성할 수 있다. 이러한 키트는 관심 표적 서열의 대형 영역에 대한 혼성화를 허용한다. 프로브들은 서로 중첩될 수 있거나 또는 연속적일 수 있다.
mRNA와의 미스매치를 검출하기 위해 리보프로브가 사용되는 경우, 이는 일반적으로 표적 유전자의 mRNA에 대해 상보적이다. 따라서 리보프로브는 센스 가닥에 상보적이기 때문에 상응하는 유전자 생성물을 코딩하지 않는다는 점에서 안티센스 프로브이다. 일반적으로 리보프로브는 방사성, 비색성 또는 형광측정성 물질로 표지될 것이고, 이는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. DNA와의 미스매치를 검출하기 위해 리보프로브가 사용되는 경우, 이는 어느 한쪽 극성의 센스 또는 안티센스일 수 있다. 유사하게, DNA 프로브가 또한 미스매치를 검출하는데 사용될 수 있다.
일부 예에서, 암은 c-met 수용체 및/또는 EGFR를 과발현하거나 또는 그렇지 않다. 세포 표면 상에 존재하는 수용체 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써 (예를 들어, 면역조직화학 분석법 (IHC)를 통해), 진단 또는 예후 분석법에서 수용체 과발현을 결정할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 예를 들어 형광 원위치 혼성화 (FISH; WO98/45479 (1998년 10월 공개) 참조), 서던 블롯팅, 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 실시간 정량적 PCR (RT-PCR)을 통해, 세포 내의 수용체-코딩 핵산의 수준을 측정할 수 있다. 상기 분석법에 더하여, 다양한 생체내 분석법이 당업자에게 이용가능하다. 예를 들면, 환자의 신체 내의 세포를 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 임의적으로 표지된 항체에 노출시킬 수 있고, 환자 내의 세포에 대한 항체의 결합을, 예를 들어, 방사성에 대한 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 이전에 노출된 환자로부터 취해진 생검물을 분석함으로써, 평가할 수 있다.
화학요법제
본 발명의 조합 요법은 하나 이상의 화학요법제(들)을 추가로 포함할 수 있다. 조합 투여는 별도의 제형 또는 단일 제약 제형을 사용하는 공동 투여 또는 동시 투여, 및 임의 순서의 연속 투여를 포함하고, 이때 바람직하게는 양쪽 (또는 모든) 활성 작용제가 동시에 이들의 생물학적 활성을 발휘하는 기간이 있다.
일반적으로, 화학요법제 (투여되는 경우)는 이에 대해 공지된 투여량으로, 또는 약물들의 조합 작용 또는 항-대사물질 화학요법제의 투여에 기인하는 음성 부작용으로 인해 임의적으로 감소된 투여량으로 투여된다. 이같은 화학요법제들의 제조 및 투약 계획은 제조사의 설명서에 따라 또는 당업자에 의해 경험적으로 결정되는 바와 같이 사용될 수 있다.
조합될 수 있는 다양한 화학요법제들이 상기에 개시되어 있다. 조합하기에 바람직한 화학요법제는 탁소이드 (도세탁셀 및 파클리탁셀 포함), 빈카 (예컨대 비노렐빈 또는 빈블라스틴), 백금 화합물 (예컨대 카르보플라틴 또는 시스플라틴), 아로마테이스 억제제 (예컨대 레트로졸, 아나스트라졸, 또는 엑세메스탄), 항-에스트로겐제 (예를 들어 풀베스트란트 또는 타목시펜), 에토포시드, 티오테파, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 리포솜성 독소루비신, PEG화 리포솜성 독소루비신, 카페시타빈, 젬시타빈, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕십), 또는 프로테오솜 억제제 (예를 들어 PS342)로 구성된 군으로부터 선택된다.
제형, 투여량 및 투여
본 발명에서 사용되는 치료제는 좋은 진료(good medical practice)와 일치하는 방식으로 제형, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 환경에서 고려할 인자에는 치료될 특정 장애, 치료될 특정 대상, 개별적인 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 조합될 작용제들의 약물-약물 상호작용, 및 의사에게 공지된 기타 인자들이 포함된다.
원하는 정도의 순도를 지니는 활성 성분을 임의적인 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 치료 제형이 제조된다 ([Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]). 허용가능한 담체에는 염수, 또는 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산; 아스코르브산이 포함되는 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 당 알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온 예컨대 나트륨; 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™, 또는 PEG가 포함된다.
임의적으로, 그러나 바람직하게는, 제형은 제약상 허용가능한 염, 바람직하게는 염화나트륨을 함유하고, 바람직하게는 이는 대략적으로 생리학적 농도이다. 임의적으로, 본 발명의 제형은 제약상 허용가능한 방부제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방부제 농도는 0.1 내지 2.0％ (전형적으로는 v/v) 범위이다. 적절한 방부제에는 제약 업계에 공지된 것들이 포함된다. 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 및 프로필파라벤이 바람직한 방부제이다. 임의적으로, 본 발명의 제형은 0.005 내지 0.02％의 농도로 제약상 허용가능한 계면활성제를 포함할 수 있다.
본원에서의 제형은 치료될 특정 적응증에 필요하다면 1가지를 초과하는 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 보완적인 활성이 있는 것들을 또한 함유할 수 있다. 적절하게는 이같은 분자들은 의도되는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.
코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀션 내에 활성 성분들이 또한 포획될 수 있다. 이같은 기술이 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌]에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로젤 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 루프론 디포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일을 초과하여 분자가 방출될 수 있게 하는 한편, 특정 하이드로젤은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 항체가 신체 내에 장기간 동안 유지되는 경우, 37℃에서 습도에 노출된 결과로 이들이 변성되거나 응집될 수 있어, 생물학적 활성의 손실, 그리고 가능하게는 면역원성의 변화를 초래한다. 수반되는 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 설프하이드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적합한 첨가제의 사용, 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화가 달성될 수 있다.
본 발명의 치료제는 공지된 방법에 따라, 예컨대 볼루스로서의 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의한 정맥내 투여, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여된다. VEGF 길항제의 경우, 광범위한 부작용 또는 독성이 VEGF 길항작용과 관련된다면 국소 투여가 특히 바람직하다. 생체외 전략이 치료 용도에 또한 사용될 수 있다. 생체외 전략은 대상으로부터 수득된 세포를 c-met 또는 EGFR 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키거나 세포에 이러한 폴리뉴클레오티드를 형질도입하는 것을 수반한다. 그후, 형질감염 또는 형질도입된 세포를 대상으로 돌려보낸다. 세포는 조혈 세포 (예를 들어, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, T 세포 또는 B 세포), 섬유모세포, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 또는 근육 세포가 비제한적으로 포함되는 광범위한 유형 중 임의의 세포일 수 있다.
예를 들어, c-met 또는 EGFR 길항제가 항체인 경우, 임의의 적절한 수단에 의해 항체가 투여되고, 여기에는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내 투여, 및 국소적인 면역억제 치료를 원하는 경우의 병변내 투여가 포함된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 항체는 펄스 주입, 특히 항체의 용량이 감쇠되는 펄스 주입으로 적절하게 투여된다. 바람직하게는 주사에 의해, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투약이 제공되고, 이는 투여가 단기 투여 또는 장기 투여인지 여부에 부분적으로 의존한다.
또다른 예에서, 종양의 위치 또는 장애가 허용하는 경우 c-met 또는 EGFR 길항제 화합물이 국소적으로, 예를 들어, 직접적인 주사에 의해 투여되고, 이러한 주사가 주기적으로 반복될 수 있다. 또한, 국소적인 재발 또는 전이를 방지하거나 감소시키기 위해, 수술에 의한 종양 제거 후, c-met 또는 EGFR 길항제가 대상에게 전신적으로, 또는 종양 세포, 예를 들어, 종양 또는 종양 층(bed)에 직접 전달될 수 있다.
치료제들의 조합 투여는 전형적으로 한정된 기간 (일반적으로, 선택된 조합에 따라 수분, 수시간, 수일 또는 수주)에 걸쳐 수행된다. 조합 요법은 이러한 치료제들의 순차적인 방식의 투여, 즉 각각의 치료제가 상이한 시점에 투여되는 것, 뿐만 아니라 이러한 치료제들 또는 치료제들 중 2가지 이상이 실질적으로 동시에 투여되는 것을 포함하도록 의도된다.
치료제는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합물 내의 EGFR 또는 c-met 길항제는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있는 한편, 조합물 내의 단백질 카이네이스 억제제는 경구 투여될 수 있다. 별법적으로, 예를 들어, 특정 치료제에 따라, 치료제들 양쪽 모두가 경구 투여될 수 있거나, 또는 양쪽 치료제가 정맥내 주사될 수 있다. 특정 치료제에 따라, 치료제들이 투여되는 순서 또한 달라진다.
질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어, 1회 이상의 분리된 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든, 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ (예를 들어, 0.1-20 ㎎/㎏)의 각각의 치료제가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 용태에 따라, 상기 기술된 방법에 의해 측정 시 암이 치료될 때까지 치료가 지속된다. 그러나, 또다른 투여량 계획이 유용할 수 있다. 한 예에서, cmet 또는 EGFR 길항제가 항체인 경우, 2주 내지 3주마다 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 15 ㎎/㎏ 범위의 용량으로 본 발명의 항체가 투여된다. c-met 또는 EGFR 길항제가 경구 소형 분자 화합물인 경우, 약물이 약 25 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏ 범위의 용량으로 매일 투여된다. 또한, 본 발명의 경구 화합물은 전통적인 간헐적 고용량 계획 하에 투여될 수 있거나, 또는 계획된 중단 없이 더 낮은 용량을 더 빈번하게 사용하여 투여될 수 있다 ("메트로놈(metronomic) 요법"으로 지칭됨). 간헐적 계획이 사용되는 경우, 예를 들어, 일일 용량 및 특정 적응증에 따라, 약물이 2주 내지 3주 동안 매일 제공된 후, 1주일 동안 중단될 수 있거나, 또는 4주 동안 매일 투여된 후 2주 동안 중단될 수 있다. 통상적인 기술 및 분석법에 의해 본 발명의 치료법의 진행이 쉽게 모니터링된다.
유전자 요법에 의한 met 및/또는 EGFR 길항제의 투여가 본 출원에서 구현된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성시키기 위한 유전자 요법의 용도에 관한 WO96/07321 (1996년 3월 14일 공개) 참조.
핵산 (임의적으로, 벡터 내에 함유됨)을 환자의 세포 내로 넣는 것에 관하여 2가지 주요 접근법이 있다: 생체내 및 생체외. 생체내 전달을 위해서는, 일반적으로 항체가 필요한 부위에서, 핵산을 환자 내로 직접적으로 주사한다. 생체외 치료를 위해서는, 환자의 세포를 제거하고, 핵산을 이러한 단리된 세포 내로 도입하고, 변형된 세포를 환자에게 직접적으로 투여하거나, 또는, 예를 들어, 다공성 막 내에 캡슐화시켜 이를 환자 내로 이식한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,892,538 및 5,283,187 참조). 핵산을 살아있는 세포로 도입하는데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 이러한 기술들은 핵산이 배양된 세포 내로 시험관 내에서 전달되는지 또는 의도되는 숙주의 세포에 생체내 전달되는지 여부에 따라 달라진다. 핵산을 시험관 내에서 포유류 세포 내로 전달하는데 적절한 기술에는 리포솜, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등의 사용이 포함된다. 유전자의 생체외 전달을 위한 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.
현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술에는 바이러스 벡터 (예컨대 아데노바이러스, 제I형 단순 헤르페스 바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스) 및 지질-기반 시스템 (예를 들어, 유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다)으로의 형질감염이 포함된다. 일부 경우에, 표적 세포를 표적으로 하는 작용제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 세포내이입과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어, 특정 세포 유형에 대해 굴성인 캡시드(capsid) 단백질 또는 이의 단편, 순환시 내재화가 일어나는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국소화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 강화시키는 단백질을 표적화에 및/또는 섭취를 용이하게 하는데 사용할 수 있다. 수용체-매개 세포내이입의 기술은, 예를 들어, [Wu et al., J. Biol. Chem, 262:4429-4432 (1987)] 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990)]에 기술되어 있다. 현재 공지된 유전자 마킹(marking) 및 유전자 요법 프로토콜의 개관을 위해, [Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992)]을 참조한다. WO 93/25673 및 이에 인용된 참고문헌을 또한 참조한다.
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 또다른 실시양태들이 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
실시예 1: NSCLC 세포주 및 종양 샘플에서의 c-met 및 EGFR 발현의 분석
재료 및 방법
마이크로어레이 연구. NSCLC 세포주 및 원발성 종양의 기본적인 유전자 발현 분석을 어피메트릭스(Affymetrix) (Santa Clara, CA) 마이크로어레이 플랫폼 (HGU133Plus_2.0 칩) 상에서 준-전면성장 세포 배양물 또는 동결 종양 용해물로부터 추출된 RNA를 사용하여 수행하였다. 제조사의 프로토콜을 사용하여, 특히 [Hoffman EP et al., Nat Rev Genet 5:229-37 (2004)]에 기술된 바와 같이, 상보적 RNA의 프렙(preparation), 어레이 혼성화, 및 이어지는 데이터 분석을 수행하였다.
c-met 발현과 NSCLC 검사물에서 발현된 또다른 수용체 타이로신 카이네이스 (RTK)의 발현의 상관관계를 평가하기 위해, 변동 필터를 사용하여, 분석되는 샘플들에 걸쳐 변동이 최소인 유전자들을 제외하였다. 발현이 최소인 유전자 (샘플들에 걸쳐 절대 변동 (최대값 - 최소값)이 < 1000인 것들)을 추가 분석에서 제외하였다. 또한, 1개의 유전자를 나타내도록 단일 프로브가 선택되었다. MET mRNA (프로브 ID, 203510_at) 또는 c-met 단백질 (IHC)와 대조하여 각각의 유전자에 대해 스피어만(Spearman) 순위 상관 계수 (ρ)를 결정하였다.
정량적 PCR. 표준 택맨(Taqman) 기술을 사용하여 정량적 RT-PCR에 의해 EGFR 및 MET mRNA 발현 수준을 평가하였다. 전사물 수준을 살림(housekeeping) 유전자인 리보솜 단백질 L19 (RPL19)에 대해 표준화하였고, 결과는 표준화된 발현값 (=2-ΔCt) 또는 풀링된 조직 공급원과 비교된 표준화된 발현 (=2- ΔΔCt)로 표현되었다. 하기의 프라이머/프로브 셋트를 이용하였다:
Figure pat00015
EGFR에 대한 프라이머/프로브 셋트는 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems (Foster City, CA))으로부터 구입하였다 (카탈로그 # 4331182, Hs00193306).
면역조직화학(IHC). 포르말린에 고정되고 파라핀에 매립된 검사물을 5 ㎛ 두께로 슬라이드 상에 절편화하였다. 파라핀을 제거하고 다시 수화시킨 후, 절편들을 c-Met 및 EGFR IHC 분석용으로 프로세싱하였다. 제조사의 설명서에 따라 EGFR pharmDx™ 키트 (Dako (Glostrup, Denmark))로 EGFR IHC를 수행하였다. c-met 면역조직화학(IHC)을 위해, 예비 가열된 타겟 리트리벌(Target Retrieval) 완충제 (Dako (Glostrup, Denmark))를 사용하여 c-met IHC를 위해 40분 동안 99℃에서 항원 회복(retrieval)을 수행하였다. 4분 동안 실온에서 KPL 차단 용액 (KPL (Gaithersburg, MD))으로 내인성 과산화효소 활성을 켄칭(quenching)시켰다. 내인성 아비딘/비오틴을 벡터 아비딘 비오틴 차단 키트(Vector Avidin Biotin Blocking Kit) (Vector Laboratories (Burlingame, CA))로 차단하였다. 이어서, 절편을 실온에서 60분 동안 차단 혈청 내의 10 ㎍/㎖ 마우스 항-c-met (클론 DL-21) 모노클로날 항체 (Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY))와 함께 인큐베이션한 후, 비오틴화 2차 말 항-마우스 항체와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 벡타스타테인 ABC 엘리트 시약(Vectastain ABC Elite Reagent) (Vector Laboratory (Burlingame, CA))과 메탈 인핸스드(Metal Enhanced) DAB (Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL))를 사용하여 슬라이드를 발색시켰다. 발현 수준을 음성 (-), 약 (+), 중 (++) 또는 강 (+++)으로 정의하였다. 약, 중 또는 강 염색의 종양 세포를 10％를 초과하여 함유한 세포주 또는 종양 검사물을 양성으로 간주하였다.
세포 배양 및 종양 샘플.
표 1에 제시된 바와 같이 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, NCI 디비젼 오브 캔서 트리트먼트 앤 다이아그노시스(NCI Division of Cancer Treatment and Diagnosis), 및 저패니스 헬스 사이언스 리소스(Japanese Health Sciences Resources) 기탁소로부터 세포주들을 수득하였다. 모든 세포주들을 10％ FBS (Sigma (St. Louis, MO)), 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 유지시켰다. 유니버시티 오브 미시간(University of Michigan), 사이브르디오(Cybrdio), 쿠퍼레이티브 휴먼 티슈 네트워크(Cooperative Human Tissue Network) 및 인티그레이티드 라버러터리 서비비스(Integrated Laboratory services)에서 종양 샘플들을 수득하였다.
Figure pat00016
Figure pat00017
결과
MET mRNA 발현이 NSCLC 세포주에서 EGFR mRNA 발현과 상관된다.
c-met의 발현이 NSCLC 세포주에서 EGFR 및 기타 수용체 타이로신 카이네이스 (RTK)의 발현과 상관되는지 여부를 평가하기 위해, 표 1에 제시된 50개의 NSCLC 세포주로부터 생성된 마이크로어레이-기반 유전자 발현 데이터로부터 스피어만 순위 상관 계수를 결정하였다. EGFR 및 MET mRNA 수준이 세포주들에서 양성으로 상관되었고 (ρ=0.54, p<0.0001), EGFR 발현이 MET 발현과 고도로 상관되었다 (표 2).
Figure pat00018
cMET 단백질 발현이 NSCLC 세포주에서 EGFR mRNA 발현과 상관된다
면역조직화학(IHC)에 의해 결정된 c-met 단백질 발현이 NSCLC 세포주에서 EGFR 및 기타 수용체 타이로신 카이네이스 (RTK)의 발현과 상관되는지 여부를 평가하기 위해, 표 1에 제시된 50개의 NSCLC 세포주에서 생성된 마이크로어레이-기반 유전자 발현 데이터로부터 스피어만 순위 상관 계수를 결정하였다. EGFR mRNA 및 c-met 단백질 수준이 세포주들에서 양성으로 상관되었고 (ρ=0.50, p=0.002), EGFR 발현이 c-met 단백질의 발현과 고도로 상관되었다 (표 3).
Figure pat00019
Figure pat00020
MET mRNA 발현이 NSCLC 종양 샘플에서 EGFR mRNA 발현과 상관된다.
c-met mRNA 발현이 표 1에 제시된 NSCLC 세포주에서 EGFR 및 기타 수용체 타이로신 카이네이스 (RTK)의 발현과 상관되는지 여부를 평가하기 위해, 78개의 NSCLC 종양으로부터 생성된 마이크로어레이-기반 유전자 발현 데이터로부터 스피어만 순위 상관 계수를 결정하였다. EGFR mRNA 및 MET mRNA의 발현이 NSCLC 종양에서 양성으로 상관되었다 (ρ=0.26, p=0.02) (표 4).
Figure pat00021
NSCLC 세포주 및 원발성 종양에서의 EGFR 및 MET의 공동-발현.
c-met 및 EGFR이 NSCLC 세포주 및 원발성 종양 샘플에서 공동-발현되는지 여부를 평가하기 위해, EGFR 및 MET mRNA의 발현을 NSCLC 세포주들 (표 1에 지시됨) 또는 동결된 원발성 NSCLC 종양 용해물들의 패널에서 정량적 RT-PCR에 의해 결정하였다. EGFR 및 MET mRNA 수준이 세포주들 (ρ=0.59, p<0.0001) (도 1, 왼쪽 패널) 및 원발성 NSCLC 검사물 (ρ=0.48, p=0.0003) (도 1, 오른쪽 패널)에서 양성으로 상관되었다. 이러한 데이터는 NSCLC 세포주 및 원발성 종양 샘플에서 MET 및 EGFR의 발현에 중첩이 있음을 실연한다.
NSCLC 세포주 및 원발성 종양에서의 IHC에 의한 EGFR 및 MET 공동-발현의 확인.
47개의 비-소세포 폐암 (NSCLC) 세포주 (표 1에 지시됨) 및 138개의 원발성 NSCLC 샘플 (제넨테크(Genentech)의 선집)을 IHC에 의해 c-met 및 EGFR IHC 발현에 대해 시험하였다. 발현 수준을 음성 (-), 약 (+), 중 (++) 또는 강 (+++)으로 채점하였고, 약, 중 또는 강 염색의 종양 세포를 10％를 초과하여 함유한 세포주 또는 종양 검사물을 양성으로 채점하였다.
세포주의 79％ (37/47) 및 NSCLC 종양의 68％ (94/138)가 EGFR에 대해 양성으로 염색되었다 (표 5). EGFR 양성 샘플 (세포주의 79％ 및 원발성 종양의 68％)을 이들의 c-met 발현 수준을 기초로 추가로 계층화하였다 (표 5). EGFR 양성 세포주는 약한 c-met 발현 (22％), 중간 정도의 c-met 발현 (57％) 및 강한 c-met 발현 (19％)을 나타내었고, EGFR-양성 원발성 종양 샘플은 단지 약하게 또는 중간 정도로만 양성이었다. 선암종 아유형이 편평 세포 아유형보다 더욱 통상적으로 c-met 염색에 대해 양성이었고 (70％ 대 40％), 중간 정도의 염색에서 더 많은 사례가 있었다 (30％ 대 7％). 이러한 데이터는 NSCLC 세포주 및 종양 샘플, 특히 선암종 종양 아유형에서의 c-met 발현과 EGFR 발현 사이의 유의한 중첩을 실연한다.
Figure pat00022
실시예 2: NSCLC 세포에서의 c-met 단백질 발현 감소가 EGFR , Her2 및 Her3의 리간드-유도 활성화를 증가시킨다.
재료 및 방법
레트로바이러스 shRNA 구축물. c-met에 대한 shRNA 서열
Figure pat00023
을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 H1 프로모터 하류의 pShuttle-H1 벡터의 BglII/HindIII 부위 내로 클로닝하였다 (GNE의 데이빗 데이비스(David Davis)). 볼드체 문자는 표적 혼성화 서열을 의미한다. 이러한 구축물을 클로네이스(Clonase) II 효소를 사용하여 레트로바이러스 pHUSH-GW 벡터 ([Gray D et al. BMC Biotechnology. 2007; 7:61])와 재조합시켜, shRNA 발현이 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 구축물을 생성시켰다. 테트라사이클린 유사체 독시사이클린으로 처리하면 shRNA 발현이 초래된다. 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)의 데이빗 데이비스가 GFP에 대해 지시된 shRNA를 함유하는 shGFP2 제어 레트로바이러스 구축물 ([Hoeflich et al. Cancer Res. (2006) 66(2):999-1006])을 제공하였다. shGFP2는 하기의 올리고뉴클레오티드를 함유한다:
Figure pat00024
세포 배양. GP-293 패키징(packaging) 세포 (Clontech)를 10％ Tet-프리(Free) FBS (Clontech), 2 mM L-글루타민 (GNE), 및 100 U/㎖ 페니실린 및 100 U/㎖ 스트렙토마이신 (Gibco)이 보충된 HGDMEM (GNE)에서 유지시켰다. H441 세포 (ATCC 번호 HTB-174)를 10％ Tet-프리 FBS (Clontech), 2 mM L-글루타민 (GNE), 및 100 U/㎖ 페니실린 및 100 U/㎖ 스트렙토마이신 (Gibco)이 보충된 50:50 배지 (DMEM:F12, MediaTech)에서 유지시켰다. EBC-1 세포 (Japanese Health Sciences Resources; [Cancer Res. (2005) 65(16):7276-82] 참조)를 10％ Tet-프리 FBS (Clontech), 2 mM L-글루타민 (GNE), 및 100 U/㎖ 페니실린 및 100 U/㎖ 스트렙토마이신 (Gibco)이 보충된 RPMI 1640 (GNE)에서 유지시켰다. 세포들을 37℃, 5％ CO2에서 유지시켰다.
재조합 레트로바이러스 및 안정적인 세포주의 발달. GP-293 패키징 세포를 FuGene 6 (Roche) 및 CalPhos 포유류 형질감염 키트 (Clontech)를 사용하여 pVSV-G (Clontech) 및 상기 재조합 레트로바이러스 구축물로 공동-형질감염시켰다. 그후, 재조합 바이러스를 함유하는 배지를 EBC-1 및 H441 세포에 첨가하고, 세포를 푸로마이신 (Clontech)에서 선별하였다. 그후, 레트로바이러스 구축물을 안정적으로 발현하는 세포를 FACS를 통해 96웰 플레이트 내로 오토클로닝(autocloning)하였다.
웨스턴 블롯. 단백질들을 분리하기 위해, 20 ㎍의 전체 세포 용해물을 MOPS 완충제와 함께 4-12％ 비스-트리스(Bis-Tris) NuPAGE 젤 (Invitrogen) 상에 러닝(running)시켰다. 항산화제 완충제와 함께 2× NUPAGE 이동 완충제로 젤을 평형화시킨 후, 아이블롯(iBlot)에 의해 0.2 ㎛ PVDF 막으로 옮겼다. 1시간 동안 실온에서 5％ BSA를 함유하는 TBST (10 mM TRIS, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1％ 트윈(Tween) 20)에서 막을 차단한 후, 하룻밤 동안 4℃에서 차단 완충제에 희석된 1차 항체에서 인큐베이션하였다. 막을 TBST로 세정한 후, 5％ 무지방 밀크가 있는 TBST 내의 HRP-접합 2차 항체 (GE Healthcare)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 화학발광에 의해 항체를 검출하였다 (GE Healthcare, ECL Plus).
안정적인 세포주의 스크리닝. 레트로바이러스 구축물이 안정적으로 형질도입된 클론들을 적합한 배지 +/- 1 ㎍/㎖ 독시사이클린 (Clontech)에서 성장시켜 shRNA의 발현을 유도하였고, 항-c-met C-12 항체 (Santa Cruz Biotech)를 사용하여 c-met 녹다운에 대해 웨스턴 블롯을 통해 스크리닝하였다. 항-포스포-c-met Y1003 (Biosource) 및 항-포스포-c-met Y1234/1234 (Cell Signaling) 항체를 사용하여 포스포-c-met을 블롯팅하였다. 대조군으로서, 항-액틴 I-19 항체 (Santa Cruz Biotech)를 사용하여 액틴을 블롯팅하였다. EBC 클론 3.15 및 EBC 클론 4.12는 met 발현 및 포스포 c-met 수준의 강한 감소를 나타냈고, H441 클론 3.11 및 H441 클론 3.1은 c-met 발현 및 포스포-met 발현의 중간 정도의 감소를 나타냈으며, EBC 클론 4.5는 c-met 및 포스포-c-met 발현의 더 작은 감소를 나타냈다.
세포주 EBC 클론 4.5, EBC 클론 4.12는 구축물 shMet4를 함유하였고, 세포주 H441 클론 3.1, H441 클론 3.11, 및 EBC 클론 3.15는 구축물 shMet 3을 함유하였다.
리간드 응답 실험. 독시사이클린과 함께/독시사이클린 없이 48시간 (EBC shMet) 또는 6일 (H441 shMet) 동안 계대된 세포를 6웰 접시에 1×106개의 세포/웰로 10％ FBS-RPMI 내에 Dox (0.1 ㎍/㎖)와 함께 또는 Dox 없이 플레이팅하고, 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 헹구고, 배지를 0.5％ BSA-RPMI (독시사이클린 존재/부재)로 교환하여, 2시간 동안 37℃에서 세포를 혈청 고갈시켰다. 리간드 (20 nM TGFa 또는 2 nM HRG)를 함유하는 배지를 웰에 첨가하고, 20분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 웰을 저온 TBS로 헹군 후, TBS, 1％ NP-40, 컴플리트(Complete) 프로티에이스 억제제 칵테일 (Roche) 및 포스파테이스(phosphatase) 억제제 칵테일 1 및 2 (Sigma)로 용해시켰다. 단층 및 상등액을 웰로부터 긁어 내어, 미세원심분리(microfuge) 튜브로 옮기고, 용해물을 얼음 상에서 10-30분 동안 인큐베이션하였다. 미세원심분리에 의해 세포 잔해물을 펠렛으로 만들고, 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다. 단백질 농도를 BCA 분석법 (Pierce)으로 정량하고, 전기영동을 위해 해동시킬 때까지 -20℃에서 용해물을 보관하였다. 20 ㎍ (EBC1) 또는 15 ㎍ (H441)의 전체 세포 용해물을 젤 상에 러닝시키고, 상기 기술된 바와 같이 포스포-c-met (YY1234/35, 3126 (Cell Signaling Technology)), 전체 c-met (C12, sc-10 (Santa Cruz Biotechnology)), b-액틴 (I-19, sc-1616 (Santa Cruz Biotechnology)), 포스포-EGFR (Y1173, 04-341 (Upstate)), 전체 EGFR (MI-12-1 (MBL)), 포스포-Her2 (YY1121/22, 2243 (Cell Signaling Technology)), 전체 Her3 (C18, sc-284 (Santa Cruz Biotechnology)), 포스포-Her3 (Y1289, 4791 (Cell Signaling Technology)), 또는 전체 Her3 (C17, sc-285 (Santa Cruz Biotechnology))에 대해 블롯팅하였다.
결과
c-met을 표적으로 하는 테트라사이클린-유도성 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 보유하는 레트로바이러스를 사용하여, shRNA를 발현하도록 유도되어 c-met 발현을 녹다운시킬 수 있는 안정적인 NSCLC 세포주 클론을 생성시켰다. NSCLC 세포주 EBC1에서 EGFR 패밀리 구성원의 발현 및 인산화에 대한 c-met 녹다운의 효과를 시험하기 위해, met에 대해 지시된 유도성 shRNA 또는 GFP에 대해 지시된 대조군 shRNA를 함유하는 EBC1 shMet 4.12 세포를 대조군 배지 또는 0.1 ㎍/㎖ Dox를 함유하는 배지에서 48시간 동안 성장시켰다. 2시간 동안의 혈청 고갈 후, 세포를 처리하지 않거나, 또는 TGFα 또는 헤레굴린 b1으로 20분 동안 처리하였다. 전체 세포 용해물을 지시된 바와 같이 전체 단백질 및 인단백질의 발현에 대해 평가하였다.
shRNA를 사용하여 c-met 단백질 발현이 녹다운된 Dox-처리 EBC1 세포 (도 2; EBCshMet 4.12, Dox, 왼쪽 패널)은 TGFa 처리에 응답하여 증가된 pEGFR 및 pHer2, 및 헤레굴린 처리에 응답하여 증가된 pHer3, 뿐만 아니라 TGFa 또는 헤레굴린 처리로 증가된 pAKT를 나타냈지만, Dox-처리 대조군 EBC1 세포 (도 2; shGFP2, 오른쪽 패널)는 그렇지 않았다. Dox-처리 EBC shMet 4.12 세포 (리간드 자극 없음)는 증가된 전체 Her2 및 전체 Her3, 및 감소된 pEGFR 및 pHer3을 나타냈다. EBC1 세포는 c-met 녹다운의 부재 하에 TGFa 또는 헤레굴린 처리에 응답하여 pEGFR, pHer2, pHer3, 또는 pAKT의 확고한 유도를 나타내지 않았다.
또다른 NSCLC 세포주에서 EGFR 패밀리 구성원의 발현 및 인산화에 대한 c-met 녹다운의 효과를 시험하기 위해, met에 대해 지시된 유도성 shRNA 또는 GFP에 대해 지시된 대조군 shRNA를 함유하는 NSCLC H441 세포를 대조군 배지 또는 0.1 ㎍/㎖ Dox를 함유하는 배지에서 48시간 동안 성장시켰다. 2시간 동안의 혈청 고갈 후, 세포를 처리하지 않거나, 또는 TGFα 또는 헤레굴린 b1으로 20분 동안 처리하였다. 전체 세포 용해물을 지시된 바와 같이 전체 단백질 및 인단백질의 발현에 대해 평가하였다.
shRNA를 사용하여 c-met 단백질 발현이 녹다운된 H441 세포 (도 3; Dox-처리 shMet 3.1, 왼쪽 패널 및 Dox-처리 shMet 3.11 중간 패널)는 헤레굴린 처리에 응답하여 강화된 pHer2 및 pHer3을 나타냈지만, Dox-처리 대조군 H441 세포 (도 3; shGFP1, 오른쪽 패널)는 그렇지 않았다. Dox 처리 shMet 3.1 및 shMet 3.11 세포는 증가된 전체 Her3 및 감소된 pEGFR을 또한 나타냈다. EBC1 세포와 달리, H441 세포는 c-met 녹다운의 부재 하에 TGFα (pEGFR) 및 헤레굴린 (pHer2 및 pHer3)에 대한 약간의 응답이 있었다. EBC1 세포가 H441 세포보다 c-met 수준이 더 높았다.
이러한 실험들은 NSCLC 세포주에서의 c-met 발현 감소가 EGFR (pEGFR)의 감소된 기초적 활성화 및 Her2 및 Her3의 증가된 리간드-유도 활성화에 이른다는 것을 실연하였고, 이는 Met 억제가 EGF 패밀리의 리간드들에 대한 민감성을 증가시킨다는 것을 시사한다.
실시예 3: met 녹다운과 EGFR 억제제 에를로티닙으로의 처리의 조합이 이종이식 모델에서의 종양 성장을 유의하게 억제하였다.
c-met 기능이 부분적으로 억제된 세포에서 종양 생존을 유지하는데 EGFR이 역할을 하는지 여부를 테스트하기 위해, EBC-1 shMet-4.5 종양을 보유하는 동물을 에를로티닙 (Tarceva™)과 Dox의 조합물로 처리하였다.
재료 및 방법
테스트 물질. OSI 파마슈티컬스(OSI Pharmaceuticals)에서 제넨테크(Genentech)의 포뮬레이션 디파트먼트에게 에를로티닙 (Tarceva™)을 제공하였고, 이는 충분한 양의 비히클 (메틸셀룰로스 트윈 (MCT))과 함께 칭량되었다. 4℃ 내지 8℃의 온도 범위를 유지하도록 설정된 냉장고에서 물질들을 보관하였다. 항-c-met 1가 모노클로날 항체 MetMAb (rhuOA5D5v2) (WO2007/063816)는 제넨테크 인코포레이티드의 안티바디 엔지니어링 디파트먼트에서 투명액 형태로 제공하였다. EBC-1 세포주는 저패니스 콜렉션 오브 리서치 바이오리소스 (Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB))로부터 수득되었다.
종. 40마리의 누드 마우스 (nu/nu)를 찰스 리버 래버러토리즈((Charles River Laboratories) (CRL)로부터 수득하였고, 연구 전에 적어도 1주일 동안 적응시켰다. 동물들을 고효율 미립자 공기 (High-Efficiency Particulate Air: HEPA)를 공급하는 필터가 있는 방 내의 통풍 우리 시스템에 거주시켰다. 건강한 것으로 보이고 명백한 이상이 없는 동물들만 연구에 사용하였다.
연구 디자인. EBC-1 세포를 RPMI 1640 배지 (Invitrogen), 2 mM L-글루타민 및 10％ 소 태아 혈청으로 구성된 성장 배지에서 배양하였다. 마우스 내로 접종하기 위한 세포를 제조하기 위해, 세포를 트립신처리하고, 10 ㎖의 무균성 1× 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세정하였다. 트립판 블루 배제에 의해 세포들의 부분집합을 카운팅하고, 나머지 세포를 100 ㎕의 무균성 1× PBS에 5×107개의 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 마우스의 오른쪽 견갑골하 영역에 5×106개의 EBC-1 세포를 피하 접종하였다. 평균 부피가 300 ㎣에 도달할 때까지 종양을 모니터링하였다.
종양 세포가 이식된 마우스를 각각 10마리의 군 4개로 무작위화하고, 처리를 시작하였다 (표 6에 요약됨). 제1군 (대조군)의 마우스는 매일 (QD), 경구 섭식 (PO)을 통해 100 ㎕의 비히클 대조군인 메틸셀룰로스 트윈 (MCT)으로 처리하였고, 5％ 수크로스를 함유하는 음료수로 전환되었다. 제2군 (c-met 녹다운 군)의 마우스는 100 ㎕의 MCT, QD, PO로 처리하였지만, 5％ 수크로스 내의 0.5 ㎎/㎖의 독시사이클린 (Dox)을 함유하는 음료수로 전환되었다. 제3군 (에를로티닙 처리 군)의 마우스는 MCT 내에 제형된 100 ㎕ 부피의 100 ㎎/㎏의 에를로티닙, QD, PO로 처리하였고, 5％ 수크로스를 함유하는 음료수로 전환되었다. 제4군 (c-met 녹다운 + 에를로티닙 처리 군)은 MCT 내에 제형된 100 ㎕ 부피의 100 ㎎/㎏의 에를로티닙, QD, PO로 처리하였고, 5％ 수크로스 내의 1 ㎎/㎖의 독시사이클린 (Dox)을 함유하는 음료수로 전환되었다. Dox 및 수크로스 물을 2-3일마다 교체하였다. 에를로티닙 및 MCT를 14일 동안 투약하였고, 6일 동안 중단한 후, 남은 연구 동안 재개하였다 (20일). 종양이 1000 ㎣ 초과에 도달하거나 또는 종양이 괴사 병변의 징후를 나타내면 동물을 연구에서 제거하였다. 임의의 군에서 3마리를 초과하는 동물이 연구에서 제거되면, 이러한 군에서의 처리를 중지하고, 모든 동물을 연구에서 제거하였다. 마우스의 모든 연구 및 취급은 동물 실험 윤리 위원회 (IACUC: Institutional Animal Care and Use Committee)의 가이드라인을 따랐다.
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종양 및 체중 측정. 종양 부피를 UltraCal-IV 캘리퍼스 (모델 54-10-111, Fred V. Fowler Company, Inc. (Newton, MA))를 사용하여 2가지 치수 (길이 및 폭)으로 측정하였다. 엑셀(Excel) v11.2 (Microsoft Corporation (Redmond, WA))로 하기의 식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다:
종양 부피 (㎣) = (길이 ㆍ 폭2) ㆍ 0.5
효능 데이터 분석. 칼레이다그래프(KaleidaGraph) 3.6 (Synergy Software (Reading, PA))를 사용하여 종양 억제를 플롯팅하였다. 제17일의 성장 억제 백분율 (％Inh)을 하기와 같이 계산하였다:
％Ihn = 100 × [종양 크기 (비히클) - {종양 크기 (MetMAb)/종양 크기 (비히클)}]
종양 발생률 (TI)을 제17일의 각각의 군 내의 측정가능한 종양의 개수에 의해 결정하였다. 부분적 퇴행 (PR)은 연구 동안의 임의의 날에 출발 종양 부피의 50％를 초과하지만 100％ 미만인 종양 퇴행으로 정의된다. 완전 퇴행 (CR)은 연구 동안의 임의의 날에 최초의 출발 종양 부피로부터의 100％의 종양 퇴행으로 정의된다.
평균 종양 부피 및 평균의 표준 오차 (SEM)를 버젼 5.1.2의 JMP 소프트웨어 (SAS Institute (Cary, NC))를 사용하여 계산하였다. 버젼 5.1.2의 JMP 소프트웨어를 사용하여 스튜던트(Student) t-테스트 또는 던넷(Dunnett) t-테스트를 사용하는 데이터 분석 및 p-값 생성을 또한 수행하였다.
결과
c-met 녹다운과 에를로티닙 처리의 조합이 이종이식 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하였다.
EBC-1 모델에서 종양 성장을 구동시키는 것에서의 c-met의 역할을 조사하기 위해, c-met 발현을 녹다운시키는 shRNA를 발현하도록 유도될 수 있는 안정적인 EBC-1 클론을 c-met을 표적으로 하는 테트라사이클린-유도성 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)을 보유하는 레트로바이러스를 사용하여 생성시켰다. EBC-1 비-소세포 폐암 (NSCLC) 세포주는 c-met에 대해 고도로 증폭되고, 세포 및 종양 성장을 구동시키도록 리간드-독립적 방식으로 작용하는 c-met 수용체를 다량으로 발현한다. EGFR 유전자는 EBC-1 세포주에서 야생형이다.
테트라사이클린 유사체 독시사이클린으로 shRNA 발현을 유도한 후, 클론 EBC-1 shMet-3.15는 c-met 발현의 효율적이고 주로 완전한 녹다운을 나타냈다. 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo) 또는 알라마 블루(Alamar Blue) 세포 생육력 분석법에서 분석된 바와 같이, shRNA의 유도는 이러한 세포들의 증식을 또한 차단하였다. shRNA를 유도하고 나서 24-72시간 후에 EBC1 shMet3.15 세포에서 성장 정지에 이은 세포자멸사가 관찰되었다. 동일한 세포주 클론을 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 동물 모델 내로 이식하였고 (단, 동물을 에를로티닙으로 처리하지 않음), 종양이 형성되도록 하였다. 이러한 동물에서 종양 형성 후 shRNA 발현을 유도하면 생체내 종양 퇴행이 초래되었다. 이러한 결과는 c-met 발현이 시험관 내 및 생체 내에서의 EBC-1 세포의 성장 및 생존을 위해 필수적임을 실연하였다.
EBC-1 shMet-4.5 클론은 Dox로의 shRNA 발현 유도 후 c-met 발현의 부분적인 녹다운을 나타냈다. c-met 발현의 감소는 이러한 클론에서 세포 성장 및 생존에 대한 효과를 또한 초래하였다: shRNA 발현의 유도는 시험관내 세포 생육력 분석법에서 분석했을 때 세포수를 감소시켰고, 이종이식 모델에서의 종양 형성 후 shRNA 발현의 유도는 종양 성장을 억제하였지만 종양 퇴행을 야기하지는 않았다.
클론 shMet-4.5를 하기 기술된 바와 같이 c-met 발현의 녹다운과 에를로티닙 처리를 조합하는 것의 효과를 평가하는 실험에서 사용하기 위해 선택하였다.
EBC-1 shMet-4.5 NSCLC 세포주를 누드 마우스에 접종한 후, 이식된 세포가 약 300 ㎣의 종양을 형성하였을 때까지 동물을 종양 성장에 대해 모니터링하였다. 그후, 마우스를 4개의 처리 병기로 분류하였다; 제1군: 비히클, 제2군: 독시사이클린 (Dox), 제3군: 에를로티닙 (100 ㎎/㎏), 및 제4군: 에를로티닙 + Dox (표 6 참조).
에를로티닙으로의 마우스 처리는 종양 성장에 대한 효과가 없는 반면 (-6％ 종양 억제; 도 4), Dox로의 처리 (met 발현 억제)는 제19일에 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장에서 38％ 감소를 초래하여 (도 4; 스튜던트 t-테스트, p = 0.084), 통계적 유의성이 약간 부족하다. 그러나, 에를로티닙 단독 군과 비교했을 때 종양 성장의 감소가 통계적으로 유의하였다 (스튜던트 t-테스트, p = 0.004; 도 4). 에를로티닙과 Dox의 조합은 효율에서의 극적인 개선을 초래하여, 제19일에 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장이 68％ 감소되었다 (스튜던트 t-테스트, p = 0.001; 도 4). 에를로티닙과 Dox의 조합물로의 처리는 Dox 단독으로의 처리 (스튜던트 t-테스트, p = 0.03) 또는 에를로티닙 단독으로의 처리 (스튜던트 t-테스트, p < 0.0001)와 비교했을 때 종양 성장에서의 통계적으로 유의한 감소를 또한 초래하였다.
Dox 및 에를로티닙으로의 처리는 더 높은 수의 부분적 응답 (PR; 연구 동안의 임의의 날에 출발 종양 부피의 50％를 초과하지만 100％ 미만인 종양 퇴행으로 정의됨) 및 완전 퇴행 (CR: 연구 동안의 임의의 날에 최초의 출발 종양 부피로부터의 100％의 종양 퇴행으로 정의됨)을 초래하였다. 구체적으로, 에를로티닙 + Dox의 조합은 1 PR 및 3 CR을 초래한 반면, 에를로티닙으로의 처리는 PR 또는 CR을 초래하지 않았고, Dox로의 처리 (c-Met 녹다운)는 2 PR 및 1 CR을 초래하였다. 이러한 데이터는 c-met 또는 EGFR 단독의 억제보다 met 억제 (Dox 처리)와 EGFR 억제 (에를로티닙 처리)의 조합이 완전한 종양 퇴행을 더욱 야기할 것 같다는 것을 실연하지만, 개별적인 동물 종양 데이터의 분석은 모든 종양이 c-met 억제와 에를로티닙의 조합에 강하게 응답하지는 않았음을 드러냈다.
이러한 결과는 EBC-1 shMet-4.5 이종이식 모델에서의 c-met 및 EGFR의 억제가 종양 성장에서의 유의한 감소를 초래하였음을 나타낸다. 따라서, c-met 발현 및 활성이 부분적으로 억제된 종양은 종양 성장 및 생존을 확실하게 하기 위해 EGFR 경로를 사용한다. 이는 EGFR이 c-met이 억제되는 종양에서 종양 생존 및 성장에서 역할을 한다는 것을 가리킨다.
실시예 4: 항-c-met 항체 및 EGFR 억제제 에를로티닙으로의 처리가 항-c-met 항체 또는 에를로티닙 단독으로의 처리에 비해 효능에서 극적인 개선을 나타냈다.
재료 및 방법
테스트 물질. 항-c-met 1가 모노클로날 항체 MetMAb (rhuOA5D5v2)는 제넨테크 인코포레이티드의 안티바디 엔지니어링 디파트먼트에서 10.6 ㎎/㎖의 투명액 형태로 제공하였다. 비히클은 10 mM 히스티딘 숙시네이트, 4％ 트레할로스 2수화물, 0.02％ 폴리소르베이트 20, pH 5.7이었다. OSI 파마슈티컬스에서 제넨테크의 파마슈티칼스 디파트먼트에게 에를로티닙 (Tarceva™)을 제공하였고, 이는 충분한 양의 비히클 (메틸셀룰로스 트윈 (MCT))과 함께 칭량되었다. 모든 물질들을 제넨테크에서 반 안델 리서치 인스티튜트 (VARI (Van Andel Research Institute); Grand Rapids, MI)로 운송하였고, 동물 처리 전에 제형하였다. 4℃ 내지 8℃의 온도 범위를 유지하도록 설정된 냉장고에서 물질들을 보관하였다. NCI-H596 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (Manassas, VA)에서 수득하였다.
종. 40마리의 인간 HGF 트랜스제닉 C3H-SCID 마우스 (hu-HGF-Tg-C3H-SCID)를 반 안델 리서치 인스티튜트 (VARI; Grand Rapids, MI)에서 사내(in-house) 집단으로부터 수득하였다. 5마리의 C3H-SCID 마우스를 잭슨 래버러토리즈(Jackson Laboratories)로부터 수득하였다. 동물들은 4-6주령이었고, 각각 21-22 g이었다. 종양 세포 접종 전에 적어도 3일 동안 마우스들을 연구 조건에 적응시켰다. 마우스들을 샤워-인(shower-in) 배리어(barrier) 시설에 거주시켰다. 동물들을 고효율 미립자 공기 (HEPA)를 공급하는 필터가 있는 방 내의 통풍 우리 시스템에 거주시켰다. 건강한 것으로 보이고 명백한 이상이 없는 동물들만 연구에 사용하였다.
연구 디자인. 대부분의 HGF 응답성 종양이 측분비 방식으로 구동되기 때문에, 측분비 구동 성장 모델인 이종이식 모델을 선택하였다. 마우스 HGF는 인간 c-met에 대한 불량 리간드이어서, 마우스 HGF에 대한 인간 c-met 발현 세포주의 낮은 생물학적 응답에 이른다 ([Bhargava, M., et al., 1992]; [Rong, S., et al. 1992]). 따라서, 측분비 HGF-구동 인간 종양의 모델을 위해, 메탈로티오네인 프로모터로부터 편재성 방식으로 인간 HGF를 발현하는 트랜스제닉 마우스 (hu-HGF-Tg-SCID)가 생성되었다 ([Zhang, Y., et al., 2005]). hu-HGF-Tg-SCID 마우스에서의 혈청 HGF 수준은 생리학적 수준보다 약 5-10배 더 높고 (1-5 ng/㎖ 대 0.2-0.5 ng/㎖), 시험관 내에서 증식함으로써 HGF에 응답하는 세포주는 hu-HGF-Tg-SCID 마우스에서 이종이식 종양으로 성장될 때 종양 성장의 강력한 강화를 나타낸다.
NCI-H596 비-소세포 폐암 (NSCLC) 세포주가 hu-HGF-Tg-SCID 마우스에서의 생체내 효능 연구에 대해 선택되었는데, 이는 이러한 세포주가 고도로 HGF 응답성이고, 항-c-met 항체인 MetMAb이 시험관 내에서 이러한 세포주의 HGF-구동 증식을 차단하기 때문이다 ([Kong-Beltran, M., et al., 2006]). NCI-H596 세포주는 E3 유비퀴틴 라이게이스 Cb1에 대한 결합 부위를 코딩하는 엑손 14가 없는 돌연변이된 형태의 c-met 유전자를 보유한다 ([Kong-Beltran, M., 2006]). HGF 결합 후 Cb1-결합 부위가 타이로신 1003 (Y1003)에서 인산화되어, Cb1이 c-met에 결합하여 이를 유비퀴틴화하도록 하고, 따라서 c-met을 프로테오솜 분해에 표적화시킨다 ([Peschard, P., et al., 2001]). NCI-H596의 응답성을 생체 내에서 또한 볼 수 있는데, 이는 이러한 세포주가 HGF-Tg-SCID 마우스 (상기 언급된 바와 같이, 인간 HGF를 발현함)에서 쉽게 종양을 형성하지만, 인간 HGF가 없는 면역손상 마우스 (nu/nu 누드 마우스 또는 SCID 마우스)에서는 종양을 형성하지 않을 것이기 때문이다. NCI-H596 세포는 c-met-구동 종양을 형성하는 것으로 간주된다. NCI-H596 세포는 야생형 EGFR 유전자를 지니고, 에를로티닙 및 TGFα의 존재 하에 성장되었을 때 감소된 세포 생육력에 의해 실연되는 바와 같이, TGFα의 존재 하에 성장되었을 때 EGFR 억제제 에를로티닙 (TARCEVA™)에 대해 민감성이다.
NCI-H596 세포를 RPMI 1640 배지 (Invitrogen), 2 mM L-글루타민 및 10％ 소 태아 혈청으로 구성된 성장 배지에서 배양하였다. 마우스 내로 접종하기 위한 세포를 제조하기 위해, 세포를 트립신처리하고, 10 ㎖의 무균성 1× 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세정하였다. 트립판 블루 배제에 의해 세포들의 부분집합을 카운팅하고, 나머지 세포를 100 ㎕의 무균성 1× PBS에 5×106개의 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다.
이발기로 등쪽 구역을 면도함으로써 접종에 대해 마우스를 준비시켰다. 다음날, 각각의 마우스의 오른쪽 견갑골하 영역에 5×105개의 NCI-H596 세포를 피하 접종하였다. 평균 부피가 100 ㎣에 도달할 때까지 종양을 모니터링하였다.
HGF-Tg-C3H-SCID 마우스를 각각 11마리의 마우스의 군 2개로 무작위화하고, 4주 동안 매주 2회 테스트 물질을 복강내 주사하였다. 제1군의 동물에게는 100 ㎕의 비히클을 제공하였고, 제2군의 동물에게는 30 ㎎/㎏의 항-c-met 1가 모노클로날 항체 MetMAb를 제공하였다. 연구 디자인이 표 7에 제시된다. 처리일에 시작하여 5주 동안 3회/주로 종양을 측정하였다. 5주 후 마우스를 안락사시켰고, 대형 종양 부피 (> 1500 ㎣)로 인해 일부 동물은 더 먼저 안락사시켰다. 종양 성장에 대한 음성 대조군으로서 작용하도록 대조군 C3H-SCID 마우스에게 또한 접종하였고, 5주 동안 종양 성장에 대해 모니터링하였다.
마우스의 모든 연구 및 취급은 동물 실험 윤리 위원회 (IACUC)의 가이드라인을 따랐다.
Figure pat00026
종양 및 체중 측정. 종양 부피를 UltraCal-IV 캘리퍼스 (모델 54-10-111, Fred V. Fowler Company, Inc. (Newton, MA))를 사용하여 2가지 치수 (길이 및 폭)으로 측정하였다. 엑셀 v11.2 (Microsoft Corporation (Redmond, WA))로 하기의 식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다:
종양 부피 (㎣) = (길이 ㆍ 폭2) ㆍ 0.5
효능 데이터 분석. 칼레이다그래프 3.6 (Synergy Software (Reading, PA))를 사용하여 종양 억제를 플롯팅하였다. 제17일의 성장 억제 백분율 (％Inh)을 하기와 같이 계산하였다:
％Ihn = 100 × [종양 크기 (비히클) - {종양 크기 (MetMAb)/종양 크기 (비히클)}]
종양 발생률 (TI)을 제17일의 각각의 군 내의 측정가능한 종양의 개수에 의해 결정하였다. 부분적 퇴행 (PR)은 연구 동안의 임의의 날에 출발 종양 부피의 50％를 초과하지만 100％ 미만인 종양 퇴행으로 정의된다. 완전 퇴행 (CR)은 연구 동안의 임의의 날에 최초의 출발 종양 부피로부터의 100％의 종양 퇴행으로 정의된다.
평균 종양 부피 및 평균의 표준 오차 (SEM)를 버젼 5.1.2의 JMP 소프트웨어 (SAS Institute (Cary, NC))를 사용하여 계산하였다. 버젼 5.1.2의 JMP 소프트웨어를 사용하여 스튜던트 t-테스트 또는 던넷 t-테스트를 사용하는 데이터 분석 및 p-값 생성을 수행하였다.
각각의 군에 대해 종양 배가 시간에 대해 카플란-마이어 생존 곡선을 작성하였다. 군들 간의 쌍별(pairwise) 비교를 수행하였다. 로그-순위 테스트로 통계학적 비교를 수행하였다. JMP 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과
NCI-H596 NSCLC 세포주를 hu-HGF-Tg-C3H-SCID 동물에게 접종하고, 이식된 세포가 약 100 ㎣의 종양을 형성하였을 때까지 동물을 종양 성장에 대해 모니터링하였다. 그후, 마우스를 4개의 처리 병기로 분류하였다; 제1군: 비히클, 제2군: 에를로티닙, 제3군: MetMAb, 및 제4군: 에를로티닙 + MetMAb (표 7 참조). MetMAb로 처리된 군에게는 1회만 투약한 반면, 에를로티닙으로 처리된 군에게는 2주 동안 매일 투약한 후, 처리를 중지하고, 종양 성장을 2-3회/주로 모니터링하였다. C3H-SCID 대조군 마우스에게 또한 접종하였고, 인간 HGF에 노출되지 않은 NCI-H596 종양의 성장에 대해 모니터링하였다.
C3H-SCID 대조군 마우스와 비교하여 hu-HGF-Tg-C3H-SCID 마우스의 환경에서 NCI-H596 종양의 성장이 크게 개선되었다 (도 5; 비히클 대조군을 C3H-SCID와 비교). 항-c-met 1가 모노클로날 항체 MetMAb로 마우스를 처리하면, NCI-H596 모델에서의 MetMAb의 기존의 연구와 일관되게, 제20일에 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장의 67％ 감소가 초래되었다 (도 5; 스튜던트 t-테스트, p = 0.0044). NCI-H596 종양-보유 마우스를 에를로티닙으로 처리하면, 제20일에 비히클 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하지 않은 종양 성장 감소가 초래되었다 (도 5; 스튜던트 t-테스트, p = 0.165). MetMAb와 에를로티닙의 조합물로의 처리는 제20일에 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장의 89％ 감소를 초래하여, 효능에서의 극적인 개선을 나타냈다 (도 5; 스튜던트 t-테스트, p = 0.0035).
MetMAb로 마우스를 처리하면, NCI-H596 모델에서의 MetMAb의 기존의 연구와 일관되게, 제20일에 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장의 67％ 감소가 초래되었다 (도 5; 스튜던트 t-테스트, p = 0.0044). NCI-H596 종양-보유 마우스를 에를로티닙으로 처리하면, 제20일에 비히클 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하지 않은 종양 성장 감소가 초래되었다 (도 5; 스튜던트 t-테스트, p = 0.165). MetMAb와 에를로티닙의 조합물로의 처리는 제20일에 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장의 89％ 감소를 초래하여, 어느 한쪽 작용제 단독에 비해 효능에서의 극적인 개선을 나타냈다 (도 5; 스튜던트 t-테스트; MetMAb + 에를로티닙 대 비히클, 제20일 - p = 0.0035; MetMAb + 에를로티닙 대 에를로티닙 단독, 제26일 - p = 0.0009; MetMAb + 에를로티닙 대 MetMAb 단독, 제48일 p = 0.0149).
MetMAb + 에를로티닙의 조합이 종양 진행까지의 시간에서의 개선을 초래하였는지 여부를 다루기 위해 투약이 종료되고 나서 9주 동안 종양 부피 데이터를 수집하였다. 이러한 논점을 다루기 위해, 종양의 크기가 배가되기까지 걸리는 시간으로 정의되는 종양 배가 시간 (TTD) 측정이 각각의 군에 대해 계산되었고, 카플란-마이어 생존 곡선을 생성시키는데 사용되었다. MetMAb + 에를로티닙의 조합은 MetMAb-처리군의 17.8 (± 2.2) 일, 에를로티닙-처리군의 9.5 (± 1.2) 일, 및 비히클 대조군의 9.5 (± 1.2) 일에 비해 49.5 (± 2.6) 일의 평균 TTD로 종양 진행까지의 시간에서 극적인 개선을 나타냈다 (도 6). 이러한 데이터는 MetMAb + 에를로티닙의 조합이 어느 한쪽 단일 작용제 단독에 비해 종양 진행까지의 시간을 유의하게 개선시킨다는 것을 나타낸다 (로그-순위 테스트; 비히클 대 MetMAb - p < 0.0001; 비히클 대 MetMAb + 에를로티닙 - p < 0.0001; 에를로티닙 대 MetMAb + 에를로티닙 p < 0.0001 및 MetMAb 대 MetMAb + 에를로티닙 - p = 0.0009).
이러한 데이터는 MetMAb와 에를로티닙의 조합물로의 처리가 MetMAb 또는 에를로티닙 단독으로의 처리에 비해 종양 성장 억제 및 종양 진행에서 고도로 유의한 개선을 초래한다는 것을 실연한다.
실시예 5: c-met 신호전달이 EGFR 신호전달을 조절한다.
재료 및 방법
마이크로어레이 분석: 어피메트릭스(Affymetrix) HGU133 플러스(Plus) 2.0 어레이를 사용하여 3가지 마이크로어레이 실험을 수행하였다. 각각의 경우에, 제조사의 프로토콜을 사용하여, 특히 [Hoffman EP et al., Nat Rev Genet 5:229-37 (2004)]에 기술된 바와 같이, 상보적 RNA의 프렙(preparation), 어레이 혼성화, 및 이어지는 데이터 분석을 수행하였다. 파텍(Partek) GS 6.3b 소프트웨어 패키지 (Partek (Saint Louis, MO))에서 실행되는 바와 같이 RMA 표준화 방법 ([Irizarry, Biostatistics, 2003, PubMed ID 12925520])을 사용하여 개별적인 샘플들에 대한 데이터 간의 비-생물학적 변동 요인들을 제거하기 위해 어피메트릭스 CEL 파일 형태의 미처리 발현 데이터를 단체로 표준화하였다. 생성된 표준화된 log2 스케일 발현값을 하기와 같이 분석하고, 플롯팅 목적을 위해 선형 스케일로 변환시켰다.
첫번째 실험에서, mRNA 발현 프로파일링 전에 리간드-응답성 NSCLC HOP92 및 H596 세포를 처리하지 않거나, 또는 50 ng/㎖ HGF로 6시간 동안 자극하였다. 간략하게, 세포를 6웰 플레이트에 약 5×105 개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 세정한 후, RPMI 배지 + 0.1％ BSA로 옮겼다. 제3일에, 세포를 6시간 동안 RPMI 배지 + 0.1％ BSA 내의 50 ng/㎖의 HGF로 자극하였다. 세포를 저온 PBS로 1회 세정하고, RNAeasy 용해 완충제로 용해시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 프렙하였다. HOP92 및 H596 샘플을 t-테스트를 사용하여 별도로 분석하여, +HGF 및 -HGF 조건에서의 각각의 유전자에 대한 발현 수준에서의 차이의 유의성 (P-값)을 측정하였다. 이러한 P-값들을 벤자미니 & 호치버그(Benjamini & Hochberg) 방법 ([Benjamini and Hochberg, 1995])을 사용하여 다중 테스트에 대해 수정함으로써 Q-값으로 전환시켰다. 그후, 각각의 세포주에서의 발현 수준 차이의 통계학적 유의성 (Q-값)에 대해 유전자들의 순위를 매겼다.
두번째 실험에서, 50 ng/㎖ 독시사이클린과 함께 또는 독시사이클린 없이 24시간 및 48시간 인큐베이션한 후 클론 EBCshMet3-15 및 EBCshMet4-12의 mRNA 발현 수준을 분석하였다. 클론 (3-15 또는 4-12), 처리 (대조군 또는 독시사이클린), 및 시점 (24시간 또는 48시간)의 효과, 뿐만 아니라 시점과 처리 효과의 상호작용을 평가하는 선형 통계학적 모델 (ANOVA)을 사용하여 각각의 어피메트릭스 프로브 셋트 (유전자)의 발현 패턴을 분석하였다. ANOVA 절차에서 이러한 4가지 효과 각각에 대한 유의성 (P-값)이 측정되었다. 이러한 P-값들을 벤자미니 & 호치버그 방법을 사용하여 다중 테스트에 대해 수정함으로써 Q-값으로 전환시켰다. 그후, 독시사이클린 샘플과 대조군 샘플 간의 발현 수준 차이의 통계학적 유의성 (Q-값)에 대해 유전자들의 순위를 매겼다.
세번째 실험에서, EBCMet shRNA 4-12 세포 또는 대조군 EBCGFP shRNA 세포를 단독 배지 또는 50 ng/㎖ 독시사이클린이 있는 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 추가적인 처리 (2시간 동안 +/- HGF 100 ng/㎖) 후, mRNA 발현을 마이크로어레이에 의해 분석하였다. shRNA 표적 (Met 또는 GFP), shRNA 유도 (독시사이클린 또는 대조군), 및 HGF 처리, 뿐만 아니라 이러한 3가지 변수의 상호작용의 효과를 평가하는 선형 통계학적 모델 (ANOVA)을 사용하여 각각의 어피메트릭스 프로브 셋트 (유전자)의 발현 패턴을 분석하였다. 그후, 이러한 P-값들을 독시사이클린-처리 EBCMetshRNA4-12 샘플들에서의 플러스(+)-HGF 조건과 마이너스(-)-HGF 조건 간의 발현 수준 차이의 Q-값으로 전환시켰다. +/- HGF 군의 비교를 위한 2배 발현 변화 및 Q-값 0.05 (5％ 오류 발견률)의 차단을 사용하여, 188개의 프로브셋트가 선택되었다.
TGFα ELISA: Dox를 5％ 수크로스 내의 1 ㎎/㎖으로 사용하고, 처리 시작 전에 종양이 300-400 ㎣로 성장하도록 하는 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같이 EBC-1-shMet 이종이식 종양을 생성시키고 Dox를 투약하였다. 3일 동안 동물에게 투약한 후, 희생시켰다. 급속 동결된 EBC-1-shMet-4.12 이종이식 종양 샘플을 2 ㎖의 저온 용해 완충제 (PBS + 1％ 트리톤(Triton) X-100 + 포스파테이스 칵테일 2 (Sigma 카탈로그# P5726)) 및 컴플리트 미니 EDTA-프리(Complete Mini EDTA-Free) 프로티에이스 억제제 (Roche #11 836 170 001) (용액 10 ㎖ 당 1개의 정제) 내에 놓았다. 소형 균질화기로 종양을 균질화하고, 용해물을 때때로 와동시키면서 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 4℃에서 10분 동안 10000×G에서 회전시켜 용해물을 가라앉히고, 새로운 튜브로 옮기고, BCA 분석법 (Pierce 카탈로그# 23225)를 사용하여 Her 3 단백질을 정량하였다.
항-TGF-알파 폴리클로날 항체 (R&D Systems (Minneapolis, MN))를 포스페이트 완충 염수 (PBS)에서 1 ㎍/㎖로 희석하고, 4℃에서 하룻밤 동안의 인큐베이션 동안 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다 (25 ㎕/웰, 맥시소프(MaxiSorp) 표면이 있는 384웰 플레이트; Nunc (Neptune, NJ)). 세정 완충제 (PBS / 0.05％ 트윈-20)로 6회 세정한 후, 플레이트를 PBS / 0.5％ 소 혈청 알부민 (BSA)으로 1시간 내지 2시간 동안 차단하였다. 이러한 인큐베이션 및 모든 후속 인큐베이션을 실온에서 궤도형 쉐이커 상에서 수행하였다. 샘플을 샘플 완충제 (PBS / 0.5％ BSA / 0.5％ 트윈-20 / 0.2％ 소 감마 글로불린 / 0.25％ CHAPS / 5 mM EDTA / 10 ppm 프로클린(Proclin))를 사용하여 희석하였다. 동일한 완충제를 사용하여, 400-12.5 pg/㎖의 표준 곡선 범위의 재조합 인간 TGF-알파 (R&D Systems)의 단계 희석물들을 제조하였다. 표준 곡선의 고도, 중도 및 저도 영역에서 정량되도록 미리 희석된 동결된 대조군 샘플을 해동시켰다. 플레이트를 6회 세정하고, 샘플, 표준물 및 대조군을 첨가하고 (25 ㎕/웰), 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 12회 세정한 후, 샘플 완충제에서 1 ㎍/㎖로 희석된 비오틴화 염소 항-TGF 알파 폴리클로날 항체 (R&D Systems)를 첨가하였다 (25 ㎕/웰). 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 12회 세정하였다. 그후, 샘플 완충제에서 1/4,000 희석된 스트렙타비딘-양고추냉이 과산화효소 (GE Healthcare (Piscataway, NJ)를 첨가하였다 (25 ㎕/웰). 최종적인 30분 인큐베이션 후, 플레이트를 12회 세정하고, 테트라메틸 벤지딘 (TMB, Kirkegaard & Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))을 첨가하였다. 실온에서 6분 내지 8분 동안 발색시키고, 1 M 인산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기 (450 nm, 620 기준)를 사용하여 흡광도 값을 수득하였고, 표준 곡선의 4-파라메터 피트(fit)로부터 샘플 농도를 계산하였다.
결과
HGF 처리에 의한 c-met 활성화가 리간드-응답성 NSCLC 세포주인 Hop-92 및 NCI-H596에서 EGFR 리간드 (HB-EGF, 에피레굴린(Epiregulin), 앰피레굴린(Amphiregulin), TGFα)의 mRNA 발현을 증가시켰다 (도 9a). 반대로, 리간드-독립적 NSCLC 세포주 EBC1 세포에서의 shRNA를 사용한 c-met 발현의 억제는 이러한 EGFR 리간드들의 mRNA 발현을 감소시켰다 (도 9b). dox-처리 EBC1shMet 세포주 4-12의 HGF 처리는 EGFR 리간드들의 발현을 복구하였다 (도 9c). GFP에 대해 지시된 siRNA를 발현한 대조군 EBC-1 세포에서는 EGFR 리간드들의 감소가 발생하지 않았다 (도 9D). EBC-1-shMet 이종이식 종양에서의 c-met 발현 감소는 처리후 제3일에 종양 TGFα 단백질 수준에서의 감소를 초래하였다 (도 9e).
이러한 데이터는 c-met이 증폭된 HGF-독립적 세포 (EBC1), 뿐만 아니라 HGF-의존적 세포주 (Hop92 및 NCI-H596)에서 c-met 활성이 EGFR 신호전달을 조절할 수 있음을 실연한다. 더욱 구체적으로, c-met 신호전달이 EGFR 패밀리의 리간드들의 발현을 증가시키고 유지시켰으며, 그후 이들은 자신의 EGFR 패밀리 수용체를 자가분비 방식으로 자극할 수 있었다. 반대로, c-met 신호전달의 억제는 EGFR 리간드들의 감소된 발현을 초래하였다. 이러한 자가분비 루프의 방해는 c-met 녹다운 후에 EBC1 세포에서 관찰되는 감소된 pEGFR (도 10) 및 실시예 2에 기술된 c-met 녹다운 후의 EGFR의 리간드-유도 활성화에 대한 증가된 민감성의 가능한 원인이다. 이러한 결과들은 EGFR 활성이 HGF-의존적 및 HGF-독립적 종양에서 c-met 신호전달 활성의 손실을 보상할 수 있음을 시사하고, EGFR과 c-met 억제제의 조합물로 종양을 처리했을 때 관찰되는 극적으로 증가된 이종이식 종양 효율 (실시예 4)과 일관된다.
실시예 6: c-met 활성이 HER3 발현을 조절한다.
재료 및 방법
pEGFR 및 Her3 단백질의 웨스턴 블롯 분석: 세포들을 1×106개의 밀도로 플레이팅하고, RPMI 1640 내의 10％ Tet-인가(approved) FBS에서 18시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 0.1 ㎍/㎖ Dox가 있는 새로운 정상 배지 또는 Dox가 없는 새로운 정상 배지로 교체하였다. 배지를 교체하고 나서 24시간, 48시간 및 72시간 후, 저온 TBS로 헹군 후 단백질을 1％ NP-40/TBS/로쉐(Roche)의 컴플리트 프로티에이스 억제제 칵테일/시그마(Sigma)의 포스파테이스 억제제 칵테일 1 및 2로 추출하였다. 15 ㎍의 전체 단백질을 인비트로젠(Invitrogen)의 4-12％ 비스-트리스(Bis-Tris) NUPADE 젤 상에 MOPS 완충제와 함께 로딩하고, 인비트로젠의 아이블롯에 의해 PVDF로 옮겼다. 막을 인산화된 단백질 (5％ BSA/TBST 내에 1:1000 희석된 pEGFR (Y1173) 업스테이트(Upstate) 04-341)에 대해 면역블롯팅하고, 피어스(Pierce)의 리스토어(Restore) 스트리핑(stripping) 완충제로 스트리핑한 후, 전체 단백질 (c-met: 1:10,000 희석된 SCBT sc-10; Her3: 5％ 무지방 분유 및 TBST 내에 1:2000 희석된 SCBT sc-285)에 대해 다시 프로빙하였다. 아머샴(Amersham)의 ECL 플러스(Plus) 화학발광 키트를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 아머샴의 HRP-접합 2차 항체 (아머샴 항-토끼-HRP, #NA934V; 아머샴 항-마우스-HRP)로 단백질을 검출하였다.
Her3 FACS : EBC-1 shMet 4-12 세포를 플레이트 10 ㎝ 당 106개의 세포로 RPMI 1640 내에 파종하였고 (상기와 같음), 플레이트를 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. Dox를 100 ng/㎖의 최종 농도로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 트립신처리하고, 원심분리하고, 200 ㎕의 저온 PBS + 2％ FBS (FACS 완충제)에 재현탁시키고, 96웰 플레이트로 옮겼다. 세포를 회전시켜 가라앉히고, FACS 완충제 + 10 ㎍/㎖의 Her3:1638 (3E9.2G6) 항체 (Genentech)에 재현탁시켰다. 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 저온 FACS 완충제로 세정하고, FACS 완충제 + 1:200 RPE 접합 F(ab')2 염소 항-마우스 IgG + IgM (H+L) (잭슨 이뮤노(Jackson Immuno) 카탈로그# 115-116-068)에 재현탁시켰다. 세포를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 저온 FACS 완충제로 1회 세정하고, FACS 완충제 + 7AAD (BD 파미젠(BD Pharmingen) 카탈로그# 559925)에 재현탁시켰다. 제조사의 설명서에 따라 FACS 분석을 수행하였다.
종양 용해물 : Dox를 5％ 수크로스 내의 1 ㎎/㎖으로 사용하고, 처리 시작 전에 종양이 300-400 ㎣로 성장하도록 하는 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같이 EBC-1-shMet 이종이식 종양을 생성시키고 Dox를 투약하였다. 3일 동안 동물에게 투약한 후, 희생시켰다. 급속 동결된 EBC-1-shMet-4.12 이종이식 종양 샘플을 2 ㎖의 저온 용해 완충제 (PBS + 1％ 트리톤 X-100 + (3×) 포스파테이스 칵테일 2 (시그마 카탈로그# P5726)) 및 컴플리트 미니 EDTA-프리 프로티에이스 억제제 (로쉐 #11 836 170 001) 내에 놓았다. 소형 균질화기로 종양을 균질화하고, 용해물을 때때로 와동시키면서 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 4℃에서 10분 동안 10000×G에서 회전시켜 용해물을 가라앉히고, 새로운 튜브로 옮기고, BCA 분석법 (피어스 카탈로그# 23225)를 사용하여 Her 3 단백질을 정량하였다.
결과
c-met 발현의 shRNA-매개 녹다운이 pEGFR 수준을 감소시켰고, HER3 단백질 수준을 유의하게 증가시켰다 (도 10a). FACS 분석은 c-met 녹다운 후 증가된 표면 HER3 수준을 드러냈다 (도 10b). EBC-1shMet-4.12 이종이식 종양에서의 c-met 녹다운은 HER3 단백질 수준에서의 증가를 초래하였다 (도 10c).
이러한 데이터는 c-met 활성이 HER3 발현 수준을 조절할 수 있다는 것을 실연한다. 구체적으로, c-met 억제가 증가된 HER3 단백질 수준 및 감소된 pEGFR 수준을 초래하였다. c-met 억제 후의 pEGFR 감소는 아마도 EGFR 리간드에 의한 자가분비 신호전달 감소 때문일 것이고 (도 9 참조), 증가된 HER3 수준은, 다른 이들에 의해 실연된 바와 같이 (예를 들어, [Yauch et al. Clin Cancer Res (2005) 11:8686-98]), 에를로티닙 민감성을 증가시켰을 수 있다. 이러한 결과들은 HER3 활성 (예를 들어, HER2를 통한 신호전달)이 c-met 신호전달의 억제 후 증가될 수 있음을 시사하고, c-met과 HER3 억제제로의 조합 요법을 암 치료를 위해 사용하는 것을 추가로 지지한다.
실시예 7: EGFR 경로 활성화가 c-met 활성이 억제된 세포의 세포 증식 및 생육력을 복원할 수 있다.
재료 및 방법
EBC-1 shMet 세포를 흑색 벽의 96웰 플레이트에 5000개/웰로 RPMI 1640 배지 (클론테크(Clontech)로부터의 10％ Tet-프리 FBS (카탈로그# 631107) 함유) 내에 파종하고, 플레이트를 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 배지를 새로운 배지 +/- 100 ng/㎖ dox로 교체하고, 플레이트를 48시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, EGFR 리간드를 하기 기술된 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 추가로 48시간 동안 인큐베이션한 후, 세포수를 셀 타이터글로(Cell TiterGlo) (Promega #G7570)를 사용하여 본원에 기술된 바와 같이 결정하였다: Dox + 100 ng/㎖ HGF; Dox + 50 nM TGFα; Dox + 5 ng/㎖ HGF; 및 Dox + 1 nM TGFα.
결과
shRNA에 의한 c-met 발현 녹다운은 세포수에서의 유의한 감소를 초래하였고, 이는 세포 생육력 및 증식에서의 감소를 암시한다. EGFR 리간드인 HGF 및 TGFα가 용량-의존적 방식으로 세포수를 구출할 수 있었지만, HGF가 TGFα보다 다소 양호하게 세포수를 구출할 수 있었다. 이러한 결과들은 EGFR 경로 활성화가 c-met 신호전달 활성이 억제된 세포에서 세포 증식 및 세포 생육력을 복원할 수 있음을 실연하였다. 따라서, EGFR (및/또는 기타 HER 패밀리 구성원) 신호전달이 c-met 신호전달 활성의 손실을 보상하였다. 이러한 결과들은 c-met과 EGFR 억제제로의 조합 요법을 사용하는 것을 지지하고, EGFR과 c-met 억제제의 조합물로 종양을 처리했을 때 관찰되는 극적으로 증가된 이종이식 종양 효율 (실시예 4)과 일관된다.
실시예 8: c-met 활성화가 EGFR 활성화를 초래하고, c-met이 c-met 또는 EGFR 경로 활성화와 독립적으로 EGFR과 상호작용하며, c-met 활성화가 EGFR 억제제에 대한 응답을 감쇠시켰다.
재료 및 방법
세포: NCI-H596 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)로부터 수득하였고, 10％ 소 태아 혈청 (FBS; Sigma (St. Louis, MO)) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 유지시켰다. 실험에 따라 하기 기술된 바와 같이 세포 분석법 배지를 교환하였다.
치료제 및 성장 인자: 에를로티닙 및 MetMAb을 상기 기술된 바와 같이 제넨테크 인코포레이티드로부터 수득하였다. HGF 및 TGFα는 제넨테크에서 생성되었다.
면역침전 및 면역블롯팅 : 세포를 하룻밤 동안 0.1％ BSA/RPMI에서 고갈시킨 후, 본문에 기술된 바와 같이 리간드로 자극하고/하거나 화합물을 투약하였다. HGF 및 TGF-α 리간드는 사내에서 생성되었다. 수확 시점에, 세포를 즉시 빙냉 PBS에서 1회 세정한 후, 1 mM의 각각의 하기 물질이 보충된 용해 완충제 (CST #9803)에서 용해시켰다: 프로티에이스 억제제 (시그마 카탈로그# P3840), 포스파테이스 억제제 (시그마 카탈로그# P2850 및 P3726), NaF, Na3VO4 및 PMSF. 샘플들을 4℃에서 180°회전자 상에 놓은 후, 14,000 rpm, 20분, 4℃로 청정화화하였다. 브래드포드(Bradford) 분석법을 사용하여 단백질 농도를 추정하였다.
세포 용해물을 직접 젤 상에 로딩하거나 (도 12, 40 ㎍/레인의 등가 용해물 농도), 또는 면역침전시켰다 (도 13, 1.6 ㎎/샘플의 등가 용해물 농도). 각각의 하기 항체로 면역침전을 수행하였다; 아가로스 접합 cMET:(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology) 카탈로그# SC-161AC), EGFR (Neomarkers MS-609-P) + 단백질 A 세파로스 패스트 플로우 비드(Protein A Sepharose Fast Flow Beads). 샘플들을 4℃에서 하룻밤 동안 180°회전자 상에 놓은 후, 용해 완충제로 3회 세정하고, 이어서 베타-메르캅토에탄올을 함유하는 SDS 샘플 완충제에서 변성시켰다. 샘플을 5분 동안 95℃에서 가열한 후, 4-12％ 구배 젤 상에 로딩하고, 표준 웨스턴 블롯팅 절차를 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 실온에서 1시간 동안 5％ 밀크/TBST로 차단한 후, 본문에 지시된 바와 같이 하룻밤 동안 4℃에서 하기의 포스포-항체로 프로빙하였다: p-c-met: pTyr 4G10 (업스테이트 카탈로그# 05-777); pEGFR (셀 시그널링 테크놀러지(Cell Signaling Technologies) 카탈로그# 2264). 막을 리스토어 스트리핑 완충제 (피어스 카탈로그# 21059)로 스트리핑하고, 전체 단백질에 대한 항체로 다시 프로빙하였다: cMET DL-21 (업스테이트 바이오텍(Upstate Biotech) 카탈로그# 05-238); EGFR (MBL 카탈로그# MI-12-1); 베타 액틴 (산타 크루즈 바이오테크놀로지 카탈로그# SC-1616). 2차 항체는 잭슨 래버러토리즈로부터 수득하였다. 면역블롯을 ECL 방법을 사용하여 제조사의 권고대로 검출하였다.
세포 생육력 분석법: 세포 생육력 분석법을 위해, 세포를 384웰 플레이트에 1×103개의 세포/웰로 0.5％ FBS를 함유하는 RPMI (분석법 배지) 내에 4중으로 플레이팅한 후, 3 nM TGF-a +/- HGF를 함유하는 분석법 배지로 자극하였다. 에를로티닙을 여러 농도로 첨가하고, 72시간 후, 셀타이터-글로 발광 세포 생육력 분석법 (Promega (Madison, WI))을 사용하여 세포 생육력을 측정하였다.
결과
HGF로의 c-met 활성화가 EGFR의 활성화를 초래한다.
c-met 활성화가 NCI-H596 세포에서 수많은 EGFR 리간드의 상향조절을 초래하였기 때문에, 본 발명가들은 c-met 활성화가 EGFR 경로의 트랜스활성화(transactivation)을 초래하는 것으로 가정하였다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, NCI-H596 NSCLC 세포를 시험관 내에서 HGF로 또는 HGF 없이 처리하였고, 세포 용해물을 10분, 24시간, 48시간 및 72시간에 분석하여, EGFR 경로 활성화를 시험하였다. c-met 신호전달의 활성화는 EGFR 신호전달의 활성화를 초래하였다 (도 12). pEGFR 수준의 유도가 빠르게는 HGF 자극 10분 후에 관찰되었고, 이는 c-met 활성화가 EGFR 신호전달을 직접 트랜스활성화시킨다는 것을 시사한다 (도 12). 증가된 수준의 pEGFR이 추후의 시점 (HGF 자극 24시간 후, 48시간 후, 및 72시간 후)에 관찰되었다 (도 12). 지연된 pEGFR 활성화 동역학은 c-met 활성이 EGFR 리간드의 증가된 발현을 초래한다는 것을 나타내는 데이터와 일관되고, 이는 지연된 (24시간 초과) EGFR 경로 활성화의 원인일 수 있다. 이러한 모델에서, 본원에서 제시된 데이터와 일관되게, EGFR의 활성화가 더 나중의 시점에 증가되어 비교적 높게 유지될 것으로 예측될 것이다.
c-met이 c-met 또는 EGFR 경로 활성화 상태와 독립적으로 EGFR와 상호작용한다.
공동-면역침전 실험 (공동-IP)을 수행하여, c-met 및/또는 EGFR 활성이 c-met과 EGFR의 물리적 회합을 초래하는지 여부를 결정하였다. NCI-H596 세포를 10분 또는 24시간 동안 리간드 없음, TGFα 단독, HGF 단독, 또는 TGF-a + HGF로 처리하였다. 이러한 처리 후, c-met을 면역침전시키고, 포스포-타이로신 (4G10), EGFR 또는 c-met에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
c-met 면역침전은 어느 한쪽 리간드의 부재 하에, 그리고 pc-met 및 pEGFR 수준이 하락한 추후의 시점에 EGFR을 끌어내렸고, 이는 c-met이 c-met 또는 EGFR 경로 활성화 상태와 관계없이 EGFR과 상호작용하였음을 가리킨다 (도 13). 포스포-타이로신에 대해 블롯팅된 c-met IP는 EGFR 및 c-met 활성화가 리간드-의존적이었고 24시간 후 감쇠되었음을 드러냈다. HGF에 의한 c-met 활성화는 pEGFR의 공동-면역침전을 초래하였다; 그러나, pEGFR 수준은 세포가 TGFα 단독 또는 TGFα + HGF로 자극되었을 때 관찰된 pEGFR 수준보다 훨씬 더 낮았다. c-met 또는 EGFR의 이들 각각의 리간드에 의한 활성화는 각각의 경로가 서로 독립적으로 활성화될 수 있음을 나타냈다.
c-met의 활성화가 EGFR 억제제에 대한 NCI-H596 세포의 응답을 감쇠시켰고, 항-c-met 항체 MetMAb로의 처리가 EGFR 억제제에 대한 응답을 구출하였다.
NCI-H596 세포는 에를로티닙 및 TGFα의 존재 하에 성장되었을 때의 감소된 세포 생육력에 의해 실연되는 바와 같이, TGFα의 존재 하에서 성장되었을 때 EGFR 억제제 에를로티닙 (TARCEVA™)에 대해 민감성이다. c-met 경로의 활성화가 에를로티닙에 대한 NCI-N596 세포의 응답을 변화시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 세포를 TGFα로 자극하고, 에를로티닙 및/또는 HGF로 처리한 후, 세포 생육력을 분석하였다.
낮은 수준의 HGF는 에를로티닙에 대한 세포 민감성에 대해 약간의 효과를 나타냈다; 그러나, HGF 농도가 증가됨에 따라, 이러한 조건 하에서의 증가된 세포 생육력에 의해 드러나는 바와 같이, 에를로티닙에 대한 민감성이 용량-의존적 방식으로 극적으로 감소되었다 (도 14). 이러한 데이터는 Met 경로의 HGF 활성화가 에를로티닙에 대한 NCI-H596 세포의 응답을 감쇠시키는데 충분하다는 것을 가리킨다.
c-met 억제제와 EGFR 억제제의 조합이 HGF 및 TGFα에 의해 공동-활성화되는 세포주의 세포 생육력을 감소시켰는지 여부를 결정하기 위해, NCI-H596 세포 생육력 분석법을 HGF, TGFα, 및 다양한 용량의 에를로티닙 및/또는 c-met 길항제 항체 MetMAb (1 uM)의 존재 하에 수행하였다.
HGF의 존재는 에를로티닙에 대한 NCI-H596 세포의 응답을 감쇠시켰다 (도 15). MetMAb에 의한 c-met 경로의 억제는 에를로티닙 민감성을 극적으로 복원시켰고 (도 15), 따라서 c-met 및 EGFR 억제제로의 처리가 NCI-H596 세포주에서 세포 생육력에 영향을 미치는 조합 효과를 지닐 수 있음을 시사한다.
총괄적으로, 이러한 연구들은 c-met 경로의 활성화가, EGFR 리간드 발현의 유도, 뿐만 아니라 c-met과 EGFR 간의 직접적인 상호작용 양쪽 모두를 통해, EGFR 경로를 직접적으로 활성화시켰다는 가설을 지지한다. 이러한 결과들은 EGFR과 c-met 억제제의 조합물로 종양을 처리했을 때 관찰되는 극적으로 증가된 이종이식 종양 효율 (실시예 4)과 일관된다.
실시예 9: c-met 길항제와 EGFR 길항제로의 조합 치료가 NCI-H596 이종이식 종양에서 증식 및 생존 신호전달 경로의 더 양호한 억제를 초래하였다.
재료 및 방법
NCI-H596 hu - HGF - Tg - SCID 이종이식 종양: NCI-H596 이종이식편을 실시예 4에 기술된 바와 같이 hu-HGF-Tg-SCID 마우스에서 확립시켰다. 처리 전에 종양이 200-300 ㎣로 성장하도록 하였다. 표 8에 기술된 바와 같이 투약을 수행하였다. 간략하게, MetMAb (30 ㎎/㎏) 또는 MetMAb 완충제를 0시 시점 (0시)에 투약하였고, 메틸셀룰로스 트윈 비히클 (MCT) 또는 에를로티닙 (150 ㎎/㎏)을 18시 시점 (18시)에 투약하였다. 24시 시점 (24시)에 마우스를 안락사키시고, 종양 및 혈장을 수집하였다. 종양을 액체 질소에서 급속 동결시킨 후, 면역침전 및 면역블롯팅용으로 프로세싱할 때까지 -70℃에서 보관하였다.
Figure pat00027
면역침전 및 면역블롯팅 : 단백질 분석용으로 종양을 프로세싱하기 위해, 먼저 종양을 유리 다운스(dounce)를 사용하여 1 mM PMSF, 추가적인 프로티에이스 억제제 칵테일 및 포스파테이스 억제제 칵테일 I 및 II (Sigma, Inc. (St. Louis, MO))가 보충된 용해 완충제 (Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA))로 균질화시켰다. 용해물을 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 14,000×g에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 수집하였다. 단백질 농도를 BCA™ 단백질 분석법 키트 (Pierce, Inc. (Rockford, IL))를 사용하여 결정하고, 샘플을 면역블롯팅하였다. 면역침전을 위해, 1.5 ㎎의 종양 용해물을 사용하여, 4℃에서 하룻밤 동안 회전시키면서, 아가로스 비드에 접합된 C-28 항-인간 c-Met 폴리클로날 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA))를 사용하여 Met을 끌어내리거나 또는 MI-12-1 항체 (MBL, Inc. (Woburn, MA))을 사용하여 EGFR을 끌어내렸다. 비드를 4℃에서 용해 완충제로 3회 세정한 후, 2.5％ (w/v) 베타-메르캅토에탄올을 함유하는 1× 노벡스 트리스-글리신 SDS 러닝 버퍼(Novex Tris-Glycine SDS Running Buffer) (Invitrogen, Inc. (Carlsbad, CA))에 재현탁시켰다. 직접적인 웨스턴 블롯을 위해, 레인 당 50 ㎍의 종양 용해물을 로딩하였다. 그후, SDS-PAGE 및 면역블롯팅에 의해 샘플을 분석하였다. 사용된 항체에는 마우스 항-인간 c-Met DL-21, 마우스 항-포스포타이로신 mAb 4G10 (양쪽 모두 Upstate Biotechnology/Millepore, Inc. (Charlottesville, VA)), 항-Akt, 항-p44/42 MAP 카이네이스 (ERK-1/2), 항-포스포-Akt (Ser473), 항-포스포-p44/42 MAP 카이네이스 (ERK-1/2) (Thr202/Tyr204) (모두 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA))가 포함되었고, 모두 제조사의 권고에 따라 사용되었다. 염소-항-마우스-IRdye800 (Rockland Immunochemicals, Inc. (Gilbertsville, PA)) 및 염소-항-토끼-알렉사플루오르(AlexaFluor)680 (Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR))이 2차 항체로 사용되었다. 오디세이(Odyssey) 영상화기 (LI-COR Biosciences (Lincoln, NE))를 사용하여 면역블롯을 영상화하고, 인단백질 수준을 정량하고, 전체 단백질 수준에 대해 표준화하였다 (예를 들어, pEGFR 대 전체 EGFR).
결과
NCI-H596 hu-HGF-Tg-SCID 마우스 이종이식 모델에서 생성되고 EGFR 억제제, c-met 억제제 및 EGFR 억제제와 c-met 억제제의 조합물로 처리된 이종이식 종양에서 c-met 및 EGFR 경로 활성화를 시험하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 20마리의 hu-HGF-Tg-SCID 마우스에 NCI-H596 세포를 접종하고 종양을 확립시켰다. 종양이 200-300 ㎣의 크기에 도달하면, 마우스를 종양 부피에 따라 4개의 군으로 고르게 나누고, 투약을 시작하였다 (표 8). MetMAb은 종양 수확 24시간 전에 투약한 반면, 에를로티닙은 수확 6시간 전에 투약하였다. 각각의 치료제의 상대적인 반감기를 기초로 투약 시간이 선택되었다. 24시에, 마우스를 안락사시키고, 종양을 수집하고, 인산화 및 전체 Met, EGFR, Akt 및 ERK-1/2에 대한 면역침전 (IP) 및/또는 면역블롯용으로 종양을 프로세싱하였다.
MetMAb 단독으로의 처리는 비히클 대조군의 12％ (+/-3.6％)로 c-met 인산화를 억제하였고 (도 16), MetMAb 및 에를로티닙으로의 조합 처리는 비히클 대조군의 6％ (+/-3.5％)로 c-met 인산화를 억제하였다 (도 16) (p =0.039). 에를로티닙 단독으로의 처리 (도 16)는 c-met 인산화를 감소시키지 않았다. 에를로티닙 단독으로의 처리는 EGFR의 인산화를 비히클 대조군의 16％ (+/-7.9％)로 억제하였고, 에를로티닙 및 MetMAb으로의 조합 처리는 EGFR의 인산화를 비히클 대조군의 19％ (+/-15％)로 억제하였다 (도 16). MetMAb 단독으로의 처리 또한 pEGFR를 비히클 대조군의 62％ (+/-21.6％)로 어느 정도 억제하였다 (p = 0.006).
이러한 결과들은 MetMAb 및 에를로티닙이 각각 효율적으로 각자의 표적의 활성화를 억제하고, c-met의 차단이 NCI-H596 hu-HGF-Tg-SCID 모델에서 pEGFR 응답을 억제할 수 있다는 것을 실연하였다.
MetMAb 및 에를로티닙으로의 조합 처리는 활성화된 Met 및 EGFR의 하류에서 활성화되는 PI-3K/Akt 및 Ras-RAF-MEK-ERK1/2 경로 (이러한 경로들은 각각 종양 세포 생존 및 증식을 활성화시키는 작용을 하고, 종양발생을 구동시키는 것을 돕는다)의 더욱 효과적인 억제를 또한 초래하였다. MetMAb, 에를로티닙 또는 MetMAb + 에를로티닙으로 처리된 동물로부터의 이종이식 종양에서 포스포-Akt 및 포스포-ERK-1/2를 시험하였다.
MetMAb 단독으로의 처리는 비히클 대조군의 72％ (+/-27.9％)로 pAkt를 억제하였고, 비히클 대조군의 72％ (+/-40.3％)로 pERK-1/2를 억제하였다 (도 15, 표 9). 에를로티닙 처리는 pAkt를 비히클 대조군의 45％ (+/-25.7％)로, 그리고 ERK-1/2를 비히클 대조군의 39％ (+/-8.9％)로 각각 더욱 강하게 억제하였다 (도 16, 표 9). MetMAb 및 에를로티닙의 조합물로의 처리는 각각 비히클 대조군의 24％ (+/-13.8％) 및 비히클 대조군의 29％ (+/-2.9％)로 pAkt 및 pERK-1/2의 개선된 억제를 나타냈다 (도 15, 표 9). 이러한 결과들은 MetMAb 및 에를로티닙으로의 조합 처리가 MetMAb 또는 에를로티닙 단독으로의 처리보다 더욱 효과적으로 하류 신호전달 경로를 억제하였음을 실연하였다.
Figure pat00028
도 17a 및 17b은 하기와 같이 본원에 개시된 발견들 중 일부를 도식적으로 요약한다:
(1) c-met 및 EGFR이 NSCLC 세포주 및 종양에서 공동-발현되었다;
(2) c-met 활성이 EGFR 리간드 및 pEGFR의 발현을 양성으로 조절하였다;
(3) c-met 활성이 HER3의 발현을 음성으로 제어하였다;
(4) TGFα 처리가 리간드-독립적 c-met 활성화 세포를 c-met 억제제에 의해 매개되는 생육력 손실로부터 구출하였다;
(5) c-met 활성화가 시험관 내 및 생체 내에서 에를로티닙에 대한 응답을 감소시켰다.
참조문헌들의 부분적인 목록
Figure pat00029
상기의 발명이 이해를 명확하게 하기 위한 목적으로 실례 및 예에 의해 일부 상세하게 기술되었지만, 이러한 설명 및 실시예가 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
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Claims (8)

  1. 치료적 유효량의 c-met 길항제 및 EGFR 길항제를 포함하는 제약 조성물이며,
    여기서 EGFR 길항제가 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민이고,
    c-met 길항제가 (a) 서열
    Figure pat00030

    을 갖는 중쇄 가변 도메인, 도 7에 도시된 CH1 서열 (서열 16), 및 도 7에 도시된 Fc 서열 (서열 17)을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (b) 서열
    Figure pat00031

    을 갖는 경쇄 가변 도메인, 및 도 7에 도시된 CL1 서열 (서열 8)을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (c) 도 8에 도시된 Fc 서열 (서열 18)을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하는 항체인,
    대상에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, EGFR 길항제 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민이 HCl 염 형태인 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, EGFR 길항제 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민이 약 6.26, 12.48, 13.39, 16.96, 20.20, 21.10, 22.98, 24.46, 25.14 및 26.91에 2-세타 각도로 표현되는 특징적인 피크가 있는 X선 분말 회절 패턴을 나타내는, 실질적으로 균질한 결정성 다형체 형태인 제약 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 항체가 1가 항체인 제약 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 암이 유방암, 결장직장암, 직장암, 비-소세포 폐암, 비-호지킨 림프종, 신세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 위암, 흑색종, 난소암, 중피종, 및 다발성 골수종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 암이 비-소세포 폐암인 제약 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 EGFR 길항제 내성 암이 아닌 제약 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
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