KR20170027312A

KR20170027312A - 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20170027312A
Application number: KR1020160112699A
Authority: KR
Inventors: 권혁상; 고종희; 이영민; 정혜윤; 양석우; 강재훈; 김용성
Original assignee: 일동제약(주)
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2016-09-01
Publication date: 2017-03-09
Also published as: US10919947B2; EP3345613A1; RU2727238C2; CN108348575B; EP3345613A4; AU2016317882B2; SI3345613T1; RU2018111390A; EP3345613B1; CA2996937A1; JP2018531989A; JP6893928B2; AU2016317882A1; FI3345613T3; ES2951260T3; BR112018004078A2; KR102128966B1; MX2018002524A; CN108348575A; WO2017039358A1

Abstract

본 발명은 조직 투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자(항-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 발명으로, 보다 구체적으로 본 발명은 항-혈관 내피세포 성장인자 제제의 조직 투과성이 개선되고 암 타겟팅 효과가 발휘되어 신생혈관형성 저해 효과가 우수할 뿐만 아니라, 항-VEGF 제제에 내성 또는 무반응을 나타내는 암에 대해서도 치료효과를 나타낼 수 있는 융합단백질의 암 또는 혈관신생관련 질환의 예방 및 치료 용도에 관한 발명이다.

Description

종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions for preventing and treating of cancer or angiogenesis related disease comprising fusion protein of tumor penetrating peptide and anti-angiogenesis agent}

본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성(항-angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 발명으로, 보다 구체적으로 본 발명은 항-신생혈관생성 제제의 종양 투과성이 개선되고 암 타겟팅 효과가 발휘되어 신생혈관형성 저해 효과가 우수할 뿐만 아니라, 항-신생혈관생성 제제의 효능을 증진시켜 내성 또는 무반응을 나타내는 암에 대해서도 치료효과를 나타낼 수 있는 융합단백질의 암 또는 혈관신생관련 질환의 예방 및 치료 용도에 관한 발명이다.

혈관신생(Angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정을 의미하며, 정상적인 생리작용으로 발생과정과 상처치유(wound healing), 여성의 생식 사이클에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있는데, 예를 들어 비정상적으로 과도한 혈관신생은 암의 성장과 전이(metastasis), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 연령관련 황반변성(agerelated macular degeneration), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 자궁내막증, 건선(psoriasis) 또는 만성 염증(chronic inflammation)과 같은 질환에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 반면에, 불충분한 혈관신생은 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 뇌졸중(stroke), 심근경색(myocardiac infarction), 궤양(ulcer) 또는 상처치유의 지연(delayed wound healing) 등의 원인이 되고 있다.

상기한 질환들 중 암은 육체를 이루는 세포에 어떤 발암인자가 작용하여 불규칙하게 분열함으로써, 그 세포 자체가 육체를 구성하는 제어로부터 벗어나 무계획적으로 증식하게 되는 질병을 의미한다. 나아가 주위에 있는 조직을 침해하고 혈관, 림프관 등을 통하여 다른 장기로 원격전이하여 장애를 일으키고, 그대로 방치하면 생명을 빼앗기는 병태이기 때문에 악성종양 또는 악성신생물이라고도 하며, 그 세포를 암세포, 악성세포라고 한다.

암의 종류에 따라 치료 방법이 다양하나 일반적으로 수술, 세포 사멸을 유발하는 화학적 요법, 방사선 치료 요법, 암세포 표적 치료, 면역치료, 고온열치료, 줄기세포 이식, 광선역학요법 등이 사용되고 있다. 근래에는 정상 세포 파괴로 인한 부작용을 최소화하면서 약물의 효능을 높이기 위해 표적 치료를 많이 시행하고 있고 그 종류에는 암 특이적인 성장을 저해하는 신호전달차단제, 암 세포로의 산소 및 영양 공급을 차단하기 위한 신생혈관형성 저해제, 세포 사멸 유도제, 면역력 증강제 등이 있다.

신생혈관형성(angiogenesis)은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정으로 발생·발달 단계와 정상 세포와 조직의 분열과 성장뿐만 아니라 암세포의 분열과 성장에도 필요한 과정 중 하나이다.

혈관 내피세포 성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)는 혈관 형성에 관여하는 여러 성장 인자 중 하나이며 이들 중 VEGF-A의 역할이 중요하다고 알려져 있다. VEGF-A를 특이적으로 저해함으로써 신생혈관형성을 억제하는 항 VEGF 단클론 항체 bevacizumab (Avastin)은 2004년과 2005년에 각각 FDA와 EMA에서 5-fluorouracil과 병용요법으로 전이성 대장암의 1차 또는 2차 치료제로 허가 받았으며, 그 뒤로도 수백 건의 임상 시험을 통해 전이성 신장암, 전이성 비소세포암, 진행성 교모세포종과 전이성 유방암 등 다양한 암 치료제로 승인받았다.

Avastin과 같은 항-VEGF 제제들은 신생혈관형성이 활발하게 일어나는 암으로 표적할 수 있으나, 암 뿐만 아니라 VEGF 농도가 높은 타 장기에도 영향을 주기 때문에 신장과 위 등에서 부작용이 용량 의존적으로 나타난다.

한편, 신생혈관형성에는 VEGF-A외에도 fibroblast growth factor (FGF), notch ligand/receptor system, placenta growth factor (PlGF), platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) 등 다른 성장인자와 신호 전달 기작이 관여하기 때문에 상기 Avastin과 같은 항-VEGF제제들에 의해 VEGF-A가 차단되더라도 다른 기전을 통한 보상이 가능하다. 따라서 많은 환자들이 Avastin과 같은 항-VEGF 제제에 무반응이거나 반복적인 Avastin 투여에 의해 내성이 발생되어 뚜렷한 효과를 볼 수 없는 것으로 추정된다.

Avastin과 같은 항-VEGF 제제들은 VEGF-A에 의한 신호 전달을 차단함으로써 신생혈관형성을 저해하여 높은 항암 활성을 갖고 있기 때문에 치료가 어려운 전이성 암을 포함한 다양한 암종에 단독 혹은 병용요법으로 적용이 가능한 효과적인 제제이다. 그럼에도 불구하고 작용기전과 투여용량에 기인한 내성 및 부작용 때문에 임상에서의 효과가 기대보다 낮고 사용이 제한적이다. 따라서 이러한 Avastin과 같은 항-VEGF 제제들의 단점은 극복하고 효능을 높일 수 있는 새로운 제제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 항-신생혈관생성 제제에 뉴로필린 수용체 (NRP)을 타겟팅하는 종양 투과성 펩타이드(TPP, tumor penetrating peptide)를 융합한 융합단백질이 항-신생혈관생성 제제의 종양 투과성을 증가시킬 뿐만 아니라, TPP에 의한 암 타겟팅 효과가 발휘되어 높은 투여 용량의 감소에 의한 환자 편의성 증가 뿐만 아니라 용량 의존적 부작용도 줄일 수 있고, 항-신생혈관생성 제제의 지속적인 사용에 의한 혈관주변 미세 환경 변화에서 유래하는 내성을 극복할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성(항-angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항-angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항-angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항-angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항-angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

혈관내피세포 성장인자-A(VEGF-A)는 혈액의 분출 (일혈, Extravasation)을 유도하는 것으로 잘 알려져 있다. 이는 다른 이름으로 혈관투과성인자 (Vascular permeability factor)로도 불린다. 이 작용은 혈관내피세포 성장인자 수용체 (VEGFR2)와 결합으로 인한 현상으로 알려져 있는데, 흥미롭게도 혈관 내피세포 성장인자-A의 돌연변이 실험에서 혈관내피세포 성장인자 수용체에 결합하지 못하더라도, 혈관투과성이 증진되는 사례를 보여주었다. 이는 혈관내피세포 성장인자-A의 또 다른 수용체가 존재함을 제시하였다(Stacker et al. 1999).

뉴로필린은 Takagi et al., (1987)과 Fujisawa et al., (1989)에 의해 처음으로 Xenopus nervous system에서 발견되었다. 뉴로필린은 막투과성 당단백질 (transmembrane glycoprotein)로서, NRP1 및 NRP2의 두 가지 형태가 있다. 뉴로필린은 VEGF 패밀리 리간드 결합에 의해 VEGFRs (VEGF receptors)들의 공수용체 (coreceptor)로 작용한다. 특히 NRP1은 VEGFR1,VEGFR2, VEGFR3의 공수용체로 작용하여 다양한 VEGF 리간드와 결합함으로써 리간드와 수용체간의 결합력을 강화시킨다는 것이 NRP1에 의한 VEGF165가 VEGFR2의 결합력 변화를 통해 밝혀졌다(Soker et al., 1998). 반면 NRP2는 VEGFR2, VEGFR3의 공수용체로 작용하여 림프관 형성 (lymphangiogenesis) 및 세포부착 (adhesion)에 기여한다. 또한 NRP1/NRP2 (NRP1/2)는 Plexin family receptors의 공수용체로 작용하여 분비된 세마포린 3계열 리간드 (class 3 semaphorins : Sema3A, Sema3B, Sema3C, Sema3D, Sema3E, Sema3F, Sema3G) 리간드와 결합한다.

NRP1은 VEGFR-2와 co-receptor로 작용하여 내피세포에서 세포 이동과 혈관신생을 증가시키고 pericyte가 혈관을 둘러싸는 혈관 재건축 과정에 관여하는 등 혈관 발달에 주요한 인자이다. 또한 vascular endothelial (VE)-cadherin과 epithelium-specific cell adhesion molecule (E-cadherin)의 발현을 증가시켜 세포와 세포 사이의 adherent junction을 유지시키는 역할을 한다. 특히 NRP1은 폐, 유방, 전립선, 췌장과 대장 등 다양한 암 세포주에서 고발현되며, advanced colorectal carcinoma 환자 중 NRP1의 발현이 높으면 림프절이나 간으로의 전이 가능성이 높고 생존률이 짧은 것으로 알려져 있는 등 NRP1과 암 전이와의 관련성이 임상적으로도 밝혀져 있다.

본 발명에서 상기 “종양 투과성”이란 NRP를 과발현하는 조직을 특이적으로 인식하여 축적되거나, 혈관내피세포의 세포간극을 넓혀 약물의 혈관밖 유출을 촉진시키고, 수용성 분자에 대한 장벽(barrier) 역할을 하는 조직인 각막세포간극을 조절하여 약물의 조직 내 분포를 촉진하는 특성 중 어느 하나의 특성을 갖는 것을 의미한다.

신생혈관생성(angiogenesis)는 단순한 혈관내피세포의 성장 뿐 아니라 내피세포의 기저막 (basement membrane) 침투, 이동 (migration)과 분화 그리고 모세혈관 형성 등 다양하고 복잡한 일련의 과정이 필요하다. 혈관형성과정을 조절하는 많은 촉진 인자와 억제 인자들이 보고 되었다. 또한, 신생혈관 형성을 위해서는 조직 분해효소의 활성화 등이 필요하며, 이러한 일련의 과정은 암 세포의 침투 (invasion) 과정과 매우 유사하다.

가장 잘 알려진 혈관형성 촉진인자는 혈관 내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)이다. VEGF는 32-44 kDa의 크기로 거의 모든 세포에서 분비되며, 종양의 침투성과 깊은 관계가 있다 (Takahashi et al., 1995). VEGF는 일찍이 혈관유출인자(vascular permeablity factor)로 알려졌으며, 히스타민 보다 50,000 배 이상의 강력한 혈액 유출 효과를 나타내었다 (Senger et al., 1983). 이러한 혈액 유출에 대한 특성은 혈액내의 단백질을 혈관 밖으로 이동시켜 새로운 혈관이 형성되는데 도움을 준다.

최근 angiopoietins류의 단백질이 새롭게 분리 정제되었으며, 신생혈관구조 형성에 중요한 작용을 하는 것으로 알려지고 있다. Angiopoietins (ANG) 단백질은 Ang-1과 Ang-2로 구분되며, 이들은 내피세포에 특이하게 존재하는 Tie-2 수용체와 결합한다. Ang-1은 내피 세포의 분화와 안정화에 관여하는 반면, Ang-2는 Tie-2 수용체에 결합하여 Ang-1의 결합을 억제함으로 내피세포의 비안정화 및 혈관퇴화 (vascular regression)의 결과를 가져온다. 암 조직에서 신생혈관 형성을 위해서 먼저 암세포가 기존의 혈관을 선택하여 혈관공용 (vascular cooption), 그리고 혈관퇴화 과정을 거치게 되는데 이때 Ang-2가 작용을 나타낸다 (Holash et al., 1999).

상기한 VEGF 및 ANG 이외에도 혈관신생과정에는 PIGF(placenta growth factor), FGF(fibroblast growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), TGF(transforming growth factor), IGF(insulin-like growth factor), Ephrin, Interleukin 및 BMP(bone morphogenetic protein)를 포함하는 다양한 리간드들이 일련의 수용체를 활성화시킴으로써 촉진되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 상기 “항-신생혈관생성”은 신생혈관생성과 관련된 분자들과 천연 수용체 사이의 상호작용을 방해하는 분자, 예를 들면, VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합하여 VEGF와 VEGF 수용체 사이의 상호작용을 방지하거나 그렇지 않으면 저지하는 분자를 포함한다. VEGF 길항제로는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 수용체 항체 및 VEGF 수용체-기반 키메라 분자가 포함된다. 또한 PDGF, PlGF, FGF, TGF, ANG, HGF, IGF, Ephrin A, Interleukin, BMP과 각각의 수용체가 결합하여 서로의 상호작용을 방지하거나 그렇지 않으면 저지하는 분자를 포함한다. 이들의 길항제로는 항-PDGF, 항-PlGF, 항-FGF, 항-TGF, 항-ANG, 항-HGF, 항-IGF, 항-Ephrin A, 항-Interleukin, 항-BMP 항체와 각각의 수용체의 길항 항체 및 수용체-기반 키메라 분자가 포함된다.

본 발명에 있어서 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 항-신생혈관생성제제에 종양 투과성 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 링커 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 링커 펩타이드는 예를 들면 항체의 Fc 단편의 C 말단에 결합할 수 있다.

한편, 항-신생혈관생성 제제는 신생혈관생성에 관련된 신호 전달을 차단함으로써 신생혈관형성을 저해하여 높은 항암 활성을 갖고 있기 때문에 치료가 어려운 전이성 암을 포함한 다양한 암종에 단독 혹은 병용요법으로 적용이 가능한 효과적인 약물이다. 그럼에도 불구하고 작용기전과 투여용량에 기인한 내성 및 부작용 때문에 임상에서의 효과가 기대보다 낮고 사용이 제한적이다. 이러한 항-신생혈관생성 제제들 중 가장 대표적인 약물인 항-VEGF 제제, Avastin(물질명 bevacizumab)은 다른 항체의약품과 달리 암 특이적으로 타게팅되는 약물이 아니므로 효능을 발휘하기 위해 투여량이 높을 뿐만 아니라 암 조직 외 VEGF 농도가 높은 타 조직에서도 분포가 가능하므로 이로 인해 부작용이 발생하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 상기 융합단백질은 항-신생혈관생성 제제에 NRP을 특이적으로 타겟팅하는 종양 투과성 펩타이드를 융합함으로써 암에 많이 분포되어 있는 NRP를 타겟팅하기 때문에, 항-신생혈관생성 제제의 암 특이적 효과를 높여 투여 용량의 감소에 의한 환자 편의성 증가뿐만 아니라 용량 의존적인 부작용도 줄일 수 있다.

또한, NRP1은 VEGFR-1, -2와 co-receptor로 작용하면서 VEGF-A 이외에도 VEGF-B, C, D, E와 PDGF 등 다른 성장인자들과도 결합하기 때문에, 본 발명의 융합단백질에 융합된 종양 투과성 펩타이드를 통해 상기 성장인자들과 NRP1과의 결합을억제함으로써 항-신생혈관생성 제제에 의한 신생혈관형성 저해 효과가 상승될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 암 또는 혈관신생관련 질환은 항-신생혈관생성 제제에 내성 또는 무반응인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.

상기 내성 또는 무반응이란 일반적으로 치료 효과를 나타내는 약물 농도에서 치료효과를 나타내지 않는 것을 의미한다.

신생혈관형성에는 VEGF-A외에도 FGF, notch ligand/receptor system, PlGF, PDGF-BB 등 다른 성장인자와 신호 전달 기작이 관여하기 때문에 하나의 신호를 차단하더라도 다른 기전을 통한 보상작용으로 혈관신생이 계속적으로 발생할 수 있다. 따라서 많은 환자들이 항-신생혈관생성 제제에 불응하거나 반복적인 투여에 의해 내성이 발생되어 뚜렷한 효과를 볼 수 없는 것으로 추정되고 있다.

보다 구체적으로, 항-신생혈관생성 중 항-VEGF 제제의 사용을 예로 들 수 있다. 신생혈관형성은 VEGF 농도가 높을 때 세포의 분열과 성장을 통해 혈관이 성장하게 되고 이후 VEGF 농도가 낮아지고 PDGF 농도가 상승하면서 정상화 혹은 재건축 과정을 거치게 된다. 정상화 과정에는 미성숙 혈관의 수와 크기 감소와 더불어 주피세포(pericyte)가 혈관을 둘러쌈(coverage)으로써 세포간질액에 의한 혈관 압력을 감소시키는 단계가 포함된다. Avastin과 같은 항-VEGF제제 투여에 의해 VEGF 농도가 낮아지면 혈관은 정상화 과정을 통해 pericyte coverage를 증가시키므로 약물의 암 조직 내 침투가 약화되며, 실제 Avastin과 docetaxel을 비소세포폐암 환자에게 병용투여 시 암으로의 침투량 감소가 보고되었다. 이는 Avastin과 같은 항-VEGF제제와 타 약제와의 병용투여에 한계가 있음을 의미할 뿐만 아니라 항-VEGF제제의 내성 발생의 원인이 될 것으로 판단되고 있다.

한편, 본 발명의 융합단백질은 항-신생혈관생성 제제뿐만 아니라 NRP에 직접적으로 결합하여 작용할 수 있는 종양 투과성 펩타이드가 융합되어 있고, NRP는 pericyte association을 통한 혈관의 재건축에 관여하므로 본 발명의 융합단백질 내 조직 투과성 펩타이드를 통해 이를 저해함으로써 신생혈관 발달을 직접적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 항-신생혈관생성 제제의 지속적인 사용에 의한 혈관주변 미세 환경 변화에서 유래하는 내성을 극복할 수 있다.

더불어 NRP1은 세포 간 junction 유지에 관여하는 VE-cadherin과 E-cadherin의 발현을 조절하는데, 본 발명의 융합단백질은 이를 저해함으로써 세포 사이 간격을 느슨하게 하고 따라서 기존 항체치료제와 같은 병용투여 약물과 면역 세포의 암종괴 내부로의 침투력을 상승시켜 약물의 효능을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 항-VEGF제제인 Avastin의 C 말단에 조직 투과성 펩타이드인 A22p를 융합한 Avastin-A22p 융합단백질과 TPP11을 융합한 Avastin-TPP11 융합단백질을 제작하여 다양한 생리학적 활성을 평가하였다. 구체적으로, 본 발명에 따른 융합단백질은 (i) NRP1 및 VEGF에 대한 결합능이 매우 우수하며(실시예 2), (ii) 야생형의 Avastin과 비교해 암 표적하는 능력과 조직 내 침투력이 월등히 향상되었으며(실시예 3), (iii) 항-VEGF제제의 내성 발생기전으로 추정되는 pericyte coverage를 현저히 감소시키는 것으로 나타났다(실시예 4), (iv) 종양 동물모델에서도 우수한 항종양 활성을 나타내었고(실시예 5).

본 발명의 융합단백질이 상기한 바와 같은 우수한 생리학적 활성을 나타내는 것은 항-VEGF제제와 종양 투과성 펩타이드가 VEGF와 NRP1에 각각 동시에 작용함으로써 상승효과를 나타내었기 때문으로 판단된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 융합단백질을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 1,000mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명은 또한 상기 항-신생혈관생성 제제는 항-혈관 내피세포 성장인자(항-VEGF) 제제, 항-PDGF 제제, 항-PlGF 제제, 항-FGF 제제, 항-TGF 제제, 항-ANG 제제, 항-HGF 제제, 항-IGF 제제, 항-ALK1(activin receptor-like kinase 1) 제제, 항-Ephrin A 제제, 항-Interleukin 제제, 항-BMP(bone morphogenetic protein) 제제,

VEGF, PDGF, PIGF, FGF, TGF, ANG, HGF, insulin-like growth factor, ALK1, ephrin A 및 Interleukin 각각에 대한 수용체의 길항 항체,

및 상기 수용체 기반-키메라 분자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 항-혈관 내피세포 성장인자(항-VEGF) 제제는 베바시주맙(bevacizumab), 라니비주맙(ranibizumab), r84(PLoS One. 2010 Aug 6;5(8)), 아플리버셉트(aflibercept), 컨버셉트(conbercept), CT01(WO2005056764A2), DOM15-10-11(WO2008149147A2), DOM15-26-593(WO2008149143A2) , PRS-050(PLoS One. 2013 Dec 13;8(12)), CT-322(BMC Cancer 2008, 8:352), ESBA903(Eur J Pharm Biopharm. 2015 Mar 14. pii: S0939-6411(15)00089-2), EPI-0030(WO2011023130A1) 및 항-VEGF 항체와 약물이 융합된 항체-약물융합체(ADC, antibody-drug conjugate)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이들의 동등생물의약품(biosimilar) 및 변이체도 포함하는 개념이다. 보다 바람직하게는 라니비주맙, 베바시주맙, 아플리버셉트, 컨버셉트일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 동등생물의약품(biosimilar)이란, 유전자재조합 및 세포배양기술 등 생명공학기술을 활용하여 이미 개발/판매되고 있는 특허 만료된 오리지널 바이오 의약품을 모방하여 품질, 효능 및 안전성의 측면에서 동등성을 입증한 복제 의약품을 의미한다.

상기 변이체란 상기 항-혈관 내피세포 성장인자 제제의 핵심적인 생리학적 활성은 그대로 보유하면서, 이러한 활성에는 영향을 주지 않는 아미노산 위치에서 하나 이상의 변이를 포함하는 모든 유사한 서열을 포함한다. 즉, 상기 나열한 항-혈관 내피세포 성장인자 제제의 아미노산 서열과 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 기능적 변이체일 수 있다.

본 발명에서 상기 “수용체의 길항 항체”란 VEGF, PDGF, PIGF, FGF, TGF, ANG, HGF, IGF, ALK1, ephrin A 및 Interleukin에 대한 수용체의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 항체를 의미한다. 이러한 항체는 상기 리간드에 대한 수용체의 결합을 방해함으로써 혈관의 신생을 위한 분자생물학적 신호전달을 저해하는 기능을 나타낼 수 있다. 본 발명에서 상기 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, Fv-단편, Fab-단편, F(ab’)2-단편 및 scFv 단편으로 이루어질 수 있으며, 항체 (antibody)는 전체 항체 (whole antibody) 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다.

본 발명에서 상기 혈관신생관련 질환은 기존의 혈관으로부터 혈관내피세포가 출아하여 조직에 침입하는 형태로 모세혈관이 뻗어나가는 맥관 형성으로 인해 발생되는 질환을 의미하며, 이의 비제한적인 예시로는 류마티스성 관절염, 건선, 염증, 자궁내막증 및 혈관종을 들 수 있다.

본 발명에서 상기 암은 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 상기 조직 투과성 펩타이드는 뉴로필린 1(NRP1) 및 뉴로필린 2(NRP2)에 모두 결합하거나 또는 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 조직 투과성 펩타이드 중 뉴로필린 1 및 뉴로필린 2에 모두 결합하는 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합하는 펩타이드는 서열번호 5 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 표시된 조직투과성 펩타이드는, 뉴로필린 1 및 2에 모두 결합할 수 있는 펩타이드로 뉴로필린의 b1b2 도메인에 결합하는 VEGF165 리간드의 결합부위 아미노산 서열 및 길이를 분석하고, 뉴로필린에 결합한다고 알려진 세마포린 3A 및 세마포린 3F의 퓨린 C-말단 서열 의 염기서열을 분석하여 이들의 C-말단의 서열이 유사함을 바탕으로 설계된 펩타이드이다.

상기 서열번호 5 내지 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시된 조직 투과성 펩타이드는 뉴로필린 2에는 결합하지 않고 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합하는 펩타이드로, 본 발명자들은 중쇄불변부위(Fc)의 C-말단(Carboxy-terminus)에 융합된 펩타이드 라이브러리를 디자인하여, 이를 효모세포표면에 발현시켜 Fc-융합펩타이드 라이브러리를 구축한 후, 뉴로필린1의 b1 도메인에 선택적으로 결합하는 클론을 선별하여 도출된 펩타이드를 분리, 동정하였다. 한편, 상기 Fc-펩타이드 라이브러리에서 뉴로필린1에 특이적이며 고친화도로 결합하는 펩타이드를 분리하기 위해, 뉴로필린1의 b1b2 도메인 단백질을 이용하여 선별함과 동시에 뉴로필린2 의 b1b2 도메인 단백질을 경쟁자(competitor)로 이용하여, 선별과정을 진행하여 펩타이드를 제작하였다.

본 발명에서 상기 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열은 다음과 같다:

본 발명에서 상기 융합단백질은 상기 조직 투과성 펩타이드와 항-VEGF제제는 링커를 통해 융합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 링커 펩타이드는 1 내지100개의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 4 내지 20개, 더욱 바람직하게는 4 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 링커 펩타이드는 글라이신 (glycine), 세린 (serine) 또는 알라닌(alanine)으로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 상기 링커 펩타이드의 서열은 (GA)n 또는 (GGGGS)m의 아미노산 서열로 이루어진 것 (단, 상기 n 및 m은 각각 독립적으로 정수 1 내지 20이다)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 GAGA 또는 (GGGGS)3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 상기 링커는 서열번호 8 (GGGGSGGGGSGGGGS)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 이용하였다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 융합단백질은 Avastin과 조직투과성 펩타이드가 융합된 것으로 중쇄로는 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 갖고 경쇄로는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 융합단백질일 수 있다. 또한, 상기 융합단백질은 Avastin 변이체와 조직투과성 펩타이드가 융합된 것으로 중쇄로는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고 경쇄로는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 융합단백질일 수 있다.

본 발명은 또한 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

암 전이는 원발성 암에서 암 세포가 타 장기로 퍼져 새로운 암을 형성하는 것이다. 전이는 다양한 암 환자에서 목숨을 위협하는 주요 현상이기에 전이를 예방하거나 조절하는 것은 암 연구분야의 중요 목표이다. 전이가 되지 않은 초기에 진단이 된 경우에는 수술, 항암치료, 또는 방사선 치료가 효과적이나 진단시에 전이가 되어 있는 경우에는 이들 치료의 효과는 감소된다. 이뿐 아니라 진단시 전이를 확인하지 못하였으나 전이가 치료 중이나 후에 확인되는 경우도 종종 있다.

전이는 침투 (invasion), 혈관내 유입 (intravasation), 멈춤 (arrest), 혈관외 배출 (extravasation), 그리고, 집락화 (colonization) 등의 연속적인 단계로 구성되어 있으며 이 과정을 통하여 원발성 장기에서 시작하여 최종적으로 다른 장기에 암을 형성하게 된다. 첫 번째 단계인 침투는 전이의 시작 단계로 암 세포의 세포간 또는 세포외 기질과의 상호작용 변화, 주변 조직의 분해, 그리고 조직 내로의 암 세포의 이동 등을 포함한다.

본 발명의 일실시예에서는 Avastin에 대해 내성을 나타내는 종양 세포주에 본 발명에 따른 융합단백질(Avastin-A22p)을 처리한 결과, 종양 세포의 migration이 현저히 억제가 되는 것을 확인하였다. 이는, 본 발명에 따른 융합단백질이 VEGF-A 이외에도 다른 성장인자에 의한 신호 전달을 억제하기 때문에 Avastin에 대해 내성을 나타내는 종양세포에 대해서도 우수한 전이 억제효과를 나타낸 것으로 판단된다.

한편, 암 세포에서 PDGF가 PDGF 수용체에 결합하면 p130cas 단백질의 인산화가 증가하면서 암세포의 migration과 invasion이 촉진되는 것을 알려져 있는데, Avastin을 처리했을 때에는 별다른 변화가 없던 p130cas 단백질의 인산화가 Avastin-A22p를 처리에 의해 대조군 수준으로 억제되는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 융합단백질은 VEGF를 저해할 뿐만 아니라 NRP1에도 결합함으로써 PDGF에 의한 신호 전달도 억제하여 PDGF에 의한 종양세포의 migration과 invasion을 억제하여 항-VEGF 제제에 내성을 나타내는 종양세포에 대해서도 효과적인 전이 억제 효과를 나타내는 것으로 판단할 수 있다.

따라서, 본 발명에서 상기 암은 항-신생혈관생성 제제에 내성 또는 무반응인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 조직 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항-angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물은 항-신생혈관생성 제제의 종양 투과성이 개선되고, 암을 타겟팅하는 효과를 발휘하여 적은 용량으로도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있어 항-신생혈관생성 제제의 부작용을 경감시킬 수 있으며, 신생혈관생성 관련 성장 인자와 NRP1에 동시에 결합함으로써 항-신생혈관생성 제제에 내성을 나타내는 암 또는 혈관신생 관련 질환에도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 종양 투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자가 융합된 융합단백질(Avastin-A22p)의 모식도이다.
도 2는 종양 투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자가 융합된 융합단백질을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다(Lane 1: Avastin, Lane 2: Avastin-A22p, Lane 3: Avastin-TPP11).
도 3은 종양 투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자가 융합된 융합단백질(Avastin-A22p)을 SE-HPLC로 확인한 결과이다(A: Avastin, B: Avastin-A22p).
도 4는 Avastin-A22p의 NRP1 또는 VEGF와의 결합력을 평가한 결과이다(A: NRP1과의 결합력, B: VEGF와의 결합력).
도 5는 Avastin과 Avastin-A22p를 SW620 xenograft 동물 모델에 투여한 후 3시간, 8시간, 16시간 경과 후 형광현미경을 통해 암 조직에서의 단백질 분포를 관찰한 결과이다(Veh: saline 투여군).
도 6은 Avastin-A22p를 처리 시 암세포 내 pericyte coverage의 변화를 평가한 결과이다(PECAM1: 혈관염색, NG2: pericyte 염색)
도 7은 SW620 xenograft 동물 모델에서 Avastin-A22p의 항암효능을 평가한 결과이다.
도 8은 Avastin에 대한 내성을 나타내는 HCT116/bev 세포에 VEGF를 처리하여 migration을 유도한 후, Avastin 또는 Avastin-A22p를 각각 1uM 처리하여 migration 억제 효과를 확인한 결과이다(A: 현미경 관찰 사진, B: 현미경 관찰 결과를 정량화 하여 그래프로 나타낸 결과).
도 9는 Avastin-A22p가 PDGF에 의한 신호전달을 억제하는지 여부를 확인하기 위해, U87MG 세포에 Avastin과 Avastin-A22p를 각각 25ug/ml이 되도록 처리하고 30분 뒤에 PDGF를 50ng/ml이 되도록 처리한 후 p130cas의 단백질 인산화 여부를 확인한 결과이다(A: 웨스턴 블로팅 결과, B: 웨스턴 블로팅 결과를 정량화한 그래프, A22p+P: Avastin-A22p 25ug/ml + PDGF 50ng/ml, P: PDGF 50ng/ml, C: 대조군, A+P: Avastin 25ug/ml + PDGF 50ng/ml).
도 10은 종양 투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자가 융합된 융합단백질을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다(Lane 1: Avastin(V)-A22p, Lane 2: Avastin-A22p).
도 11은 종양 투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자가 융합된 융합단백질을 SE-HPLC로 확인한 결과이다(A: Avastin(V)-A22p, B: Avastin-A22p).
도 12는 Avastin(V)-A22p의 NRP1 또는 VEGF와의 결합력을 Avastin-A22p와 비교하여 평가한 결과이다(A: NRP1과의 결합력, B: VEGF와의 결합력).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

Avastin -조직 투과성 펩타이드 ( TPP ) 융합 단백질의 제작

본 발명자들은 항-VEGF 제제인 Avastin의 효능 증대 및 내성 극복을 위해 Avastin의 C-말단에 뉴로필린 1(NRP1) 및 2에 모두 결합하거나 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합할 수 있는 조직 투과성 펩타이드(TPP)를 융합하고자 하였으며, TPP의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1의 서열목록 중 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 TPP는 뉴로필린 1 및 2에 모두 결합이 가능하며, 서열번호 5 내지 7의 아미노산 서열을 갖는 TPP는 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합이 가능하다. Avastin에 TPP가 융합된 융합단백질의 모식도를 도 1에 나타내었다.

본 발명에서 사용한 Avastin은 중쇄는 서열번호 13, 경쇄는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로, www.Drugbank.com에서 입수하여 본 실험에 사용하였다.

한편, 하기 표 1에 나타낸 TPP중 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 TPP인 A22p는 뉴로필린의 intrinsic ligand인 VEGF₁₆₅ 및 세마포린 3계열 리간드들의 C 말단 부위를 변형(modify)한 것이고 TPP11은 뉴로필린1의 b1b2 도메인 단백질과 동시에 뉴로필린2 의 b1b2 도메인 단백질을 경쟁자(competitor)로 이용하여 뉴로필린1의 b1 도메인에 선택적으로 결합하는 클론으로부터 도출된 펩타이드를 분리 동정한 것으로서, 여기에 링커로 Avastin을 융합하여 뉴로필린 수용체에 bivalent로 작용할 수 있도록 함으로써 VEGF와 Sema3A 리간드와 비슷한 친화력을 갖으면서도 조직투과성을 가질 수 있게 design하였다.

구체적으로, Avastin의 C-말단에 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 TPP(A22p)와 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 TPP(TPP11)이 각각 융합된 융합단백질 및 이를 생산하는 세포주를 하기 방법에 따라 제작하였다.

<1-1> 발현 벡터의 제작 및 세포의 형질전환

pcDNA3.1(-) 벡터에 선별마커 DHFR 유전자를 삽입하고 Avastin-A22p, Avastin-TPP11의 중쇄와 경쇄를 각각 제한효소 NotI과 BamHI으로 클로닝하였다. CHO DG44 세포에 상기 구축된 각각의 항체 중쇄불변부위와 NRP1에 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 인코딩하는 플라스미드와 경쇄사슬 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 Neon^TM eletroporesis를 이용하여 단백질을 발현시켰다. T25 flask에 각각의 플라스미드를 트랜스펙션(transfection)한 3 X 10⁶ cells을 접종하고 37℃에서 배양하였다. 선별 마커를 이용하여 stable cell을 확보한 뒤 바이오리액터에서 무혈청 SFM4CHO (Hyclone)를 이용하여 부유상태로 7일간, 100 rpm, 37℃, pH7.2, 50% D0₂조건에서 배양하였다. 상등액은 원심분리를 이용하여 세포와 분리하고 0.22μm 필터를 이용하여 제균하였다.

<1-2> 융합단백질의 정제

Avastin, Avastin-A22p와 Avastin-TPP11의 배양액을 회수하여 표준 프로토콜을 참조하여 각각의 단백질을 정제하였다. 정제 컬럼은 단백질 A 레진 (MabselectSure resin)(GE healthcare)을 XK16/20 컬럼(MabselectSure resin)(GE healthcare)에 20 mL 충진하여 200 cm/h의 선속도를 적용하였다. 단백질 A컬럼에 1L의 항체를 적용하고, 컬럼의 15배 부피를 PBS(pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액 100 mL을 이용하여 pH3.0에서 항체를 용리한다. UV흡광도 280 nm 파장에서 10 mAU~10 mAU까지 회수된 단백질 60 mL을 1 M Tris 완충액 0.7 mL을 사용하여 pH 7.0으로 중화하였다. 항체 분획은 0.2um 필터(Millipore) 여과 후, amicon(30 MWCO) 농축기(Millipore)를 사용하여 3,500rpm에서 10분씩 농축하고, 10% glycerol을 포함한 PBS(pH 7.4) 완충액으로 교환하였다. 정제된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질은 보정된 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다. 정제된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질은 환원성 및 비환원성 조건으로 10% SDS-PAGE에서 분석하였다.

Avastin과 Avastin-A22p, Avastin-TPP11을 발현하는 세포주에서 회수한 배양액에서 각각의 단백질을 정제하여 SDS-PAGE로 분리하였다. 도 2에서 Avastin-A22p와 Avastin-TPP11이 정상적으로 항체를 형성하고 환원 조건에서 Avastin에 펩타이드가 융합되어 환원 조건에서 Avastin에 비해 Avastin-A22p와 Avastin-TPP11의 크기가 큼을 확인할 수 있었다. 또한 Avastin-A22p와 Avastin-TPP11이 유사한 수준으로 발현됨에 따라 TPP 융합이 항체 발현에 큰 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다.

Avastin-A22p 정제된 단백질의 순도를 확인하기 위해 HPLC (High performance lipid chromatography)분석을 수행하였다. Agilent1200 기기(Agilent)를 이용하였으며, 크기 배제 컬럼(Biosuite 250)(Waters)을 사용하였다.

구체적으로, 0.2 M 인산칼륨과 0.25 M 염화칼륨을 혼합한 완충용액(pH 6.2)을 이동상으로 사용하였고, 0.35 ml/min 유속으로 20분간 흘려주어 시행되었다. 머무른 시간에 따라 단백질의 크기를 확인하고, 면적과 높이에 따라 순도를 확인하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 정제한 Avastin-A22p의 순도를 SE-HPLC를 이용하여 분석하였다. Avastin-A22p의 순도가 97% 이상이고 Avastin에 비해 크기가 큼을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은, 이하에서 Avastin에 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 TPP인 A22p를 융합한 Avastin-A22p 융합단백질을 제작하여 그 활성을 평가하였다.

<실시예 2>

Avastin-조직 투과성 펩타이드(TPP) 융합 단백질의 NRP1 및 VEGF 결합능

상기 실시예 1에서 제작된 융합 단백질인 Avastin-A22p의 N-말단은 기존의 Avastin과 동일하게 VEGF를 제거하고, C-말단의 A22p는 NRP1과 결합하여 관련 신호전달을 이중으로 차단할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 Avastin-A22p의 NRP1 및 VEGF 결합능을 평가하였다.

정제된 Avastin-A22P의 뉴로필린1의 b1b2 도메인 (Neuropilin 1-b1b2 domain)에 대한 결합능을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)에서 확인하였다. 양성 대조군으로 Herceptin-A22p (HCT-A22p), 음성 대조군으로 Avastin (Roche co., Swiss) 을 사용하였다. 표적분자 뉴로필린 1의 b1b2 도메인(273-586) 을 96 well Maxibinding Immuno 플레이트(SPL Life sciences., Korea)에 1개 well당 1μg씩 2시간 동안 37˚C 에서 결합시킨 후 0.1 % PBST (0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄)로 1분간 3회 씻어내었다. 5 % 스킴 밀크(skim milk)가 포함된 0.1% PBST로 1시간 동안 결합한 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 양성 대조군으로 Herceptin-A22p, 음성 대조군으로 Avastin (Roche co., swiss)을 사용하고 실험군으로 Avastin-A22p를 50nM, 25nM, 12.5nM, 6.25nM이 되게 0.1 % PBST로 희석하여 각 농도별로 37˚C에서 1시간 처리한 뒤 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. HRP가 접합된 anti-kappa light chain 항체 (Horseradish peroxidase-conjugated anti-human kappa light chain mAb, SIGMA-ALDRICH co., USA) 를 5 % 스킴 밀크가 포함된 0.1% PBST에 100,000배 희석하여 37˚C에서 30분 처리하였다. 그 후 0.1 % PBST로 1분간 5회 씻어냈다. 발색을 위하여 TMB HRP colorimetric substrate (Surmodics co., USA)를 처리하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 동부피의 1N HCl (stop buffer)을 처리한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 얻어진 ELISA 결과를 통해 발현 정제한 Avastin-A22p의 뉴로필린 1의 b1b2 도메인에 대한 결합능을 확인 하였다.

정제된 Avastin-A22p의 Recombinant human VEGF 165 (R&D systems co., China)에 대한 결합능을 ELISA에서 확인하였다. 양성 대조군으로 Avastin, 음성 대조군으로 HCT-A22p를 사용 하였다. 표적분자 Recombinant human VEGF 165를 96 well Maxibinding Immuno 플레이트에 1개 well당 0.2μg씩 2시간 동안 37˚C 에서 결합시킨 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 5 % 스킴 밀크가 포함된 0.1% PBST로 1시간 동안 결합한 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 양성 대조군으로 Avastin, 음성 대조군으로 Herceptin-A22p를 사용 하고 실험군으로 Avastin-A22p를 1.5nM, 0.75nM, 0.35nM,0.17nM이 되게 0.1 % PBST로 희석하여 각 농도별로 37˚C에서 1시간 처리한 뒤 0.1 % PBST 로 1분간 3회 씻어내었다. HRP가 접합된 anti-kappa light chain 항체를 0.1% PBST가 포함된 5 % 스킴 밀크에 100,000배 희석하여 37˚C에서 30분 처리하였다. 그 후 0.1 % PBST로 1분간 5회 씻어낸다. 발색을 위하여 TMB HRP colorimetric substrate를 처리하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 동부피의 1N HCl을 처리한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 얻어진 ELISA 결과를 통해 발현 정제한 Avastin-A22p의 Recombinant human VEGF 165에 대한 결합능을 확인 하였다.

이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, Avastin-A22p는 대조군으로 사용된 HCT-A22p와 동등한 수준으로 NRP1에 결합하였고 VEGF와도 Avastin과 동등한 수준으로 결합하는 것으로 확인되었다.

<실시예 3>

Avastin - A22p의 암 타겟팅 시험

Avastin은 다른 항체의약품과 달리 암 특이적으로 타게팅 되는 약물이 아니므로 효능을 발휘하기 위해 투여량이 높을 뿐만 아니라 암 조직 외 VEGF 농도가 높은 타 조직에서도 분포가 가능하므로 이로 인해 부작용이 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서 NRP1의 암 특이적 분포를 이용한다면 암 타케팅 효과를 높여 투여 용량의 감소에 의한 환자 편의성 증가뿐만 아니라 용량 의존적인 부작용도 줄일 수 있을 것으로 예상되어, 본 발명자들은 Avastin-A22p가 암을 효과적으로 타겟팅할 수 있는지 여부를 평가하고자 하였다.

즉, Avastin-A22p가 암 조직 및 종괴 내부의 신생혈관에 존재하는 NRP1을 타게팅함으로써 암 세포에서 분포가 Avastin 보다 우수한지 여부를 확인하기 위해 SW620을 nude 마우스에 이식하고 종양의 부피가 250mm³ 정도가 되었을 때, 각각 PBS, Avastin-A22p 또는 Avastin를 각각 5mg/kg씩 정맥 투여한 후 3시간, 8시간, 16시간이 경과한 시점에서 종양을 적출하고, 형광현미경으로 암 조직에서 단백질의 분포를 면역 조직화학(immunohistochemistry) 실험을 통해 확인하였다.

보다 구체적으로, 적출한 종양은 파라핀 절편(paraffin section) 방법으로 8 um의 두께로 잘라, 1차 항체인 NG2항체(Cell Signaling technology, USA)와 이를 인지하는 Alexa(적색형광, Life Technologies)이 결합된 2차 항체로 혈관주변세포를 염색하였고, 조직 내에 분포되어 있는 Avastin과 Avastin-A22p을 관찰하기 위해, IgG를 인식하는 Alexa(녹색형광, Life Technologies)이 결합된 항체를 사용하였다.

이에 대한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, Avastin-A22p는 투여 후 3시간부터 Avastin에 비해 암 조직 내 농도가 높았으며, 시간이 지남에 따라 혈관에서 떨어진 세포 사이에도 더 많은 양의 단백질이 분포되어 있었으며, 암종괴 내부의 혈관신생도 효과적으로 감소시킴을 확인하였다.

본 현광현미경 관찰 결과 Avastin-A22p는 Avastin보다 암을 표적하는 능력과 조직 내 침투력이 우수할 것을 예상할 수 있으며, Avastin과 달리 VEGF-A 뿐만 아니라 VEGF-B, VEGF-C, PlGF 등 다양한 신생혈관 생성인자들을 억제함에 의해 혈관신생을 더 효과적으로 억제할 것으로 판단할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 낮은 투여 용량으로도 종양으로 표적이 가능하기 때문에 부작용을 줄일 수 있다. 또한 높은 침투력으로 인해 혈관과 근접한 암세포 뿐만 아니라 종괴 안쪽 암 조직에도 도달함으로써 이들 세포에서 분비되는 VEGF-A를 포함한 다양한 신생혈관 생성인자들의 활성을 저해함으로써 세포 분열을 억제하고 이를 통해 항암 활성을 높일 수 있다고 예상해 볼 수 있었다.

결론적으로 본 결과를 통해 신생혈관 형성 인자들 중 VEGF-A에 대한 의존성이 비교적 낮음으로써 발생하는 Avastin 불응 환자의 치료에 Avastin-A22p의 적용 가능성을 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

Avastin - A22p가 pericyte coverage에 미치는 영향

신생혈관형성은 VEGF 농도가 높을 때 세포의 분열과 성장을 통해 혈관이 성장하게 되고 이후 VEGF 농도가 낮아지고 PDGF 농도가 상승하면서 정상화 혹은 재건축 과정을 거치게 된다. 정상화 과정에는 미성숙 혈관의 수와 크기 감소와 더불어 주피세포(pericyte)가 혈관을 둘러쌈(coverage)으로써 세포간질액에 의한 혈관 압력을 감소시키는 단계가 포함된다. Avastin 투여에 의해 VEGF 농도가 낮아지면 혈관은 정상화 과정을 통해 pericyte coverage를 증가시키므로 약물의 암 조직 내 침투가 약화되며, 실제 Avastin과 docetaxel을 비소세포폐암 환자에게 병용투여 시 암으로의 약물 침투량 감소가 보고되었다(Arjaans et al., 2013). 이는 Avastin과 타 약제와의 병용투여에 한계가 있음을 의미할 뿐만 아니라 Avastin 내성 발생의 원인이 될 것으로 추정되고 있다.

Fan 등의 보고에 의하면 원발성 혹은 전이성 대장암 세포주에 각각 Avastin을 3개월간 지속적으로 처리한 결과 두 세포주 모두에서 Avastin에 적응한 세포주들이 만들어 졌고, 이 세포주들의 세포성장은 기존 세포주와 동일하지만 세포의 이동성이 증가되는 특성을 지녀 xenograft 시 기존 암세포에 비해 전이가 잘되는 것으로 확인되었다. 이러한 Avastin 적응 세포주들은 VEGFR1과 NRP1이 특이적으로 고발현 되며, VEGF-A 뿐만 아니라 VEGF-B, VEGF-C, PlGF 등 다양한 신생혈관 생성인자들을 더 많이 분비하는 세포로 변형되어 Avastin에 내성을 보였다고 한다(Fan et al., 2011). 따라서 NRP1에 결합하여 VEGF-A 이외에도 다양한 신생혈관 생성인자들의 신호전달을 저해할 수 있는 Avastin-A22p 혹은 Avastin-TPP11 처리 시 Avastin에 내성을 보이는 세포주의 생장 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 판단되었다.

또한 항 NRP1 항체와 VEGF 저해제의 병용 투여 시 항 NRP1 항체에 의한 혈관의 pericyte coverage 감소가 혈관의 정상화를 조절하여 항암효능 증대와 직접적으로 관련될 뿐만 아니라 내성극복과도 연관될 수 있다는 보고를 토대로, 본 발명자들은 Avastin과 Avastin-A22p를 투여한 xenograft 모델에서 암조직 내 pericyte coverage의 변화를 현광현미경으로 비교하는 시험을 실시하였다.

마우스 모델에서 Avastin-A22p의 신생혈관생성 및 혈관안정화 억제능을 확인하기 위하여, SW620을 nude 마우스에 이식한 뒤에 Avastin-A22p와 Avastin를 각각 투여하고 형광현미경으로 암 조직에서 pericyte coverage를 확인하였다. Balb/c 누드 마우스에 SW620 세포를 주입시켰고, 종양의 부피가 250mm³ 정도가 되었을 때, 각각 PBS, Avastin, Avastin-A22p를 5mg/kg으로 정맥 주사하였다. 각각 16시간 후 마우스로부터 종양을 적출하여, 면역조직화학실험을 수행하였다. 적출한 종양은 파라핀 절편 방법으로 8 um의 두께로 잘라, 1차 항체인 PECAM1(Sigma)와 이를 인지하는 Alexa이 결합된 2차 항체로 혈관세포를 염색하였고, 1차 항체인 NG2항체와 이를 인지하는 Alexa이 결합된 2차 항체로 혈관주변세포를 염색하였다.

이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, Avastin에 비해 Avastin-A22p 투여군에서 혈관 대비 pericyte coverage가 뚜렷하게 낮아짐을 확인하여 Avastin-A22p에 의한 항암효과의 증진은 pericyte coverage와 연관됨을 예상할 수 있었다. 이와 같은 결과는 Genetech 사에서 개발했었던 항-NRP1 항체와 Avastin을 병용 투여한 동물 시험 결과와 일치하는 것으로 Avastin-A22p가 VEGF와 NRP1의 각각의 저해 효과가 독립적인 각각의 항체를 사용한 것과 유사한 수준임을 확인할 수 있는 결과이다. 즉, Avastin-A22p가 VEGF와 NRP1을 동시에 저해하는 이중항체 개념의 단백질임을 검증할 수 있었다.

이러한 결과는 A22p에 의한 pericyte coverage 감소를 통해 Avastin-A22p는 신생혈관형성 저해 효과 증대 및 Avastin의 지속적인 투여에서 발생하는 내성 극복 가능성이 있음을 암시한다고 할 수 있다.

<실시예 5>

Avastin - A22p 의 in vivo 항암 효능평가

Avastin-A22p의 항암 효능을 확인하기 위하여 대장암세포주인 SW620 xenograft 모델에서 Avastin과 비교 시험을 실시하였다. SW620 세포주는 VEGF에 대한 RGI가 45%인 종양 세포주로 본 동물실험은 일반적인 종양에 대한 항암 효능평가의 목적으로 수행하였다. 예비실험을 통해 Avastin-A22p는 Avastin 대비 동등 이상의 효능을 나타냄을 확인하여(결과 미도시), 본 실험에서는 SW620 세포를 이식한 Balb/c-nude 마우스에 Avastin 5mg/kg와 Avastin-A22p 0.5, 1.25, 2.5mg/kg를 각각 1주에 2회씩 5주간 정맥 투여하였다.

이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, Avastin 5mg/kg 투여군과 Avastin-A22p 1.25mg/kg 투여군의 암 성장 억제 효과가 유사한 수준임을 확인하였다. 즉 Avastin-A22p 융합단백질은 Avastin의 1/4 용량으로도 동등한 정도의 항암 효능을 나타낼 수 있다는 것을 알 수 있었다.

Avastin-A22p가 Avastin의 1/4 용량으로도 동일한 항암 효과를 나타내는 것은 A22p에 의한 NRP1 신호 전달 차단의 결과로 생각되며, 이러한 결과는 임상 적용 시에도 투여 용량 감소를 통한 부작용 감소 가능성을 제시한다고 할 수 있다.

<실시예 6>

Avastin - A22p 의 내성세포주 migration 억제 확인 시험

Avastin의 내성 및 무반응의 원인 중 하나는 Avastin의 타겟인 VEGF-A외에도FGF, notch ligand/receptor system, PlGF, PDGF-BB 등 다른 성장인자와 신호 전달 기작이 관여하기 때문이다. NRP1은 VEGF-A와 결합하는 VEGFR2외에도 VEGFR1, VEGFR3, C-met, PDGFR와도 co-receptor로 역할을 하여 신호 전달에 영향을 미친다고 알려져 있다. 본 발명자들은 Avastin과 융합된 A22p가 NRP1에 결합하는 다른 angiogenic factor와 경쟁적으로 결합을 저해하는지 확인하고자 하였다.

HCT116 세포에 Avastin을 지속적으로 처리하여 Avastin에 내성을 획득한 세포주 HCT116/bev (L M Ellis, MD anderson에서 제공)에 Avastin과 Avastin-A22p를 처리하여 각각의 migration 억제능을 확인하였다. HCT116/bev는 모세포인 HCT116에 비해 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, PlGF의 발현량이 높고 cell migration과 metastasis 능력이 모세포보다 뛰어나기 때문에 (Fan et al., 2011), Avastin-A22p가 HCT116/bev 세포의 migration을 억제한다면 Avastin에 의한 내성을 극복하고 효능 증대 가능성을 확인할 수 있다고 판단하였다. 구체적인 시험방법은 다음과 같다.

HCT116과 HCT116/bev 세포를 각각 6-well 플레이트에 4 x 10⁵/well개씩 분주하고 2일 배양하였다. 그 후 각 well에 십자 모양의 공란을 만들었으며, 배지를 제거하고 1% FBS가 첨가된 MEM-alpha 배지에 VEGF가 50ng/ml이 되도록 첨가하여 분주하였다. Avastin과 Avastin-A22p는 각각 1uM이 되도록 처리하였다. 공란은 약물을 처리하고 난 뒤 바로 촬영하였으며 (0시간), 48시간부터 2시간 간격으로 동일한 위치를 촬영하였다. 촬영 결과물은 Image J 프로그램을 통해 빈 공란의 넓이를 계산하여 역으로 세포의 이동 정도를 정량화 하여 Avastin-A22p와 Avastin의 세포 이동 저해능을 비교하였다.

이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, HCT116는 VEGF에 의해 migration이 51.7%에서 67.4%로 증가하였고 Avastin과 Avastin-A22p 처리 시 각각 61.2%, 61.7%로 동일한 수준으로 감소하였다. 이에 반해 HCT116/bev 세포는 VEGF를 처리하지 않은 군에서도 65.3%로 HCT116보다 더 공격적임을 확인하였고 VEGF 처리 시 72.9%로 상승하였다. Avastin에 의해서는 74.1%로 migration에 차이가 없었으나 Avastin-A22p 처리 시에는 66.2%로 VEGF를 처리하지 않은 군과 동일한 수준으로 migration이 억제됨을 확인하였다.

Avastin 적응세포주인 HCT116/bev가 모세포인 HCT116에 비해 VEGF-A 첨가 유무에 상관없이 migration이 증가한 것은 HCT116/bev가 VEGF-A 뿐만 아니라 다른 성장인자에 의존적인 migration이 증가하였음을 보여주는 결과로, Avastin 처리시 이를 억제하지 못하지만 Avastin-A22p 처리시에는 VEGF-A를 처리하지 않은 수준으로 migration이 감소되었다. 이는 Avastin-A22p가 VEGF-A외에도 다른 성장인자에 의한 신호 전달을 억제한다는 것을 의미하며, 따라서 Avastin에 의한 내성 극복에 기여할 수 있음을 의미한다. 또한 VEGF-A외에도 다른 신호 전달을 억제하여 항암 효과를 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 내성발생 가능성도 낮출 수 있음을 암시한다.

<실시예 7>

Avastin - A22p 의 PDGF 신호 전달 억제 확인 시험

NRP1은 PDGF 수용체의 co-receptor로 작용하여 PDGF에 의한 신호 전달을 강화시킨다. 암 세포에서 PDGF가 이들의 수용체에 결합하면 p130cas 단백질 인산화가 증가하면서 암세포의 migration과 invasion이 촉진된다고 알려져 있다. 본 발명자들은 Avastin과 융합된 A22p가 NRP1에 결합함으로써 PDGF의 신호 전달을 억제하는지 확인하고자 하였다.

U87MG 세포에 Avastin과 Avastin-A22p를 각각 25ug/ml이 되도록 처리하고 30분 뒤에 PDGF를 50ng/ml이 되도록 처리하였다. 5분 뒤에 단백질을 추출하고 anti-phospho-p130 antibody와 anti-p130cas antibody를 사용하여 p130cas 인산화를 비교하였다.

이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, PDGF에 의해 p130cas 인산화가 증가하였고, Avastin 처리 시에는 차이가 없으나, Avastin-A22p 처리군에서는 인산화가 vehicle 수준으로 억제됨을 확인할 수 있었다.

이는 Avastin-A22p가 VEGF-A를 제거할 뿐만 아니라 NRP1에도 결합함으로써 PDGF에 의한 신호 전달도 억제함을 의미하며 PDGF에 의한 migration과 invasion을 억제함으로써 항암 효과를 증가시킬 수 있음을 의미한다.

<실시예 8>

Avastin 변이체 -조직 투과성 펩타이드 ( TPP ) 융합 단백질의 제작

본 발명자들은 다른 항체의약품에서 많이 변형되는 서열을 포함하는 변이체에 조직 투과성 펩타이드(TPP)를 융합한 융합단백질에서도 그 특성이 유지되는 지를 확인하기 위하여 Avastin의 아미노산 서열에서 362번째 및 364번째 아미노산이 변이된 Avastin 변이체 펩타이드(이하“라 함)의 C-말단에 뉴로필린 1(NRP1) 및 2에 모두 결합하는 조직 투과성 펩타이드(TPP)를 융합하고자 하였다.

구체적으로, Avastin(V)의 C-말단에 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 TPP(A22p)가 각각 융합된 융합단백질 및 이를 생산하는 세포주를 제작하였다. pcDNA3.1(-) 벡터에 선별마커 DHFR 유전자를 삽입하고 Avastin(V)-A22p 중쇄와 경쇄를 제한효소 NotI과 BamHI으로 각각 클로닝하였다. CHO DG44 세포에 상기 구축된 각각의 항체 중쇄불변부위와 NRP1에 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 인코딩하는 플라스미드와 경쇄사슬 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 Neon^TM eletroporesis를 이용하여 단백질을 발현시켰다. T25 flask에 각각의 플라스미드를 트랜스펙션(transfection)한 3X10⁶ cells을 접종하고 37℃에서 배양하였다. 선별 마커를 이용하여 stable cell을 확보한 뒤 바이오리액터에서 무혈청 SFM4CHO (Hyclone)를 이용하여 부유상태로 7일간, 100 rpm, 37℃, pH7.2, 50% D0₂조건에서 배양하였다. 상등액은 원심분리를 이용하여 세포와 분리하고 0.22μm 필터를 이용하여 제균하였다.

Avastin(V)-A22p의 배양액을 회수하여 표준 프로토콜을 참조하여 각각의 단백질을 정제하였다. 정제 컬럼은 단백질 A 레진 (MabselectSure resin)(GE healthcare)을 XK16/20 컬럼(MabselectSure resin)(GE healthcare)에 20 mL 충진하여 200 cm/h의 선속도를 적용하였다. 단백질 A컬럼에 1L의 항체를 적용하고, 컬럼의 15배 부피를 PBS(pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액 100 mL을 이용하여 pH3.0에서 항체를 용리한다. UV흡광도 280 nm 파장에서 10 mAU~10 mAU까지 회수된 단백질 60 mL을 1 M Tris 완충액 0.7 mL을 사용하여 pH 7.0으로 중화하였다. 항체 분획은 0.2um 필터(Millipore) 여과 후, amicon (30 MWCO) 농축기(Millipore)를 사용하여 3,500rpm에서 10분씩 농축하고, 10% glycerol을 포함한 PBS(pH 7.4) 완충액으로 교환하였다. 정제된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질은 환원성 및 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 분석하였다.

Avastin(V)-A22p, Avastin-A22p를 발현하는 세포주에서 회수한 배양액에서 각각의 단백질을 정제하여 SDS-PAGE로 분리하였다. 도 10에서 Avastin(V)-A22p가 정상적으로 항체를 형성하고 Avastin-A22p와 유사한 분자량을 가짐을 확인할 수 있었다.

Avastin(V)-A22p 정제된 단백질의 순도를 확인하기 위해 HPLC (High performance lipid chromatography)분석을 수행하였다. Agilent1200 기기(Agilent)를 이용하였으며, 크기 배제 컬럼(Biosuite 250)(Waters)을 사용하였다.

도 11에서 정제한 Avastin(V)-A22p의 순도를 SE-HPLC를 이용하여 분석하였다. Avastin(V)-A22p(도11A)의 순도가 97% 이상이고 Avastin-A22p(도11B)와 동일함을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은, 이하에서 Avastin(V)에 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 TPP인 A22p를 융합한 Avastin(V)-A22p 융합단백질을 제작하여 그 활성을 평가하였다.

<실시예 9>

Avastin(V)-조직 투과성 펩타이드(TPP) 융합 단백질의 NRP1 및 VEGF 결합능

상기 실시예 8에서 제작된 융합 단백질인 Avastin(V)-A22p이 Avastin-A22p와 N-말단은 기존의 Avastin과 동일하게 VEGF를 제거하고, C-말단은 NRP1과 결합하여 관련 신호전달을 이중으로 차단할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 Avastin(V)-A22p의 NRP1 및 VEGF 결합능을 평가하였다.

정제된 Avastin(V)-A22p의 뉴로필린1의 b1b2 도메인 (Neuropilin 1-b1b2 domain)에 대한 결합능을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)에서 확인하였다. 양성 대조군으로 Avastin-A22p을 사용하였다. 표적분자 뉴로필린 1의 b1b2 도메인(273-586) 을 96 well Maxibinding Immuno 플레이트(SPL Life sciences., Korea)에 1개 well당 1μg씩 2시간 동안 37˚C 에서 결합시킨 후 0.1 % PBST (0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄)로 1분간 3회 씻어내었다. 5 % 스킴 밀크(skim milk)가 포함된 0.1% PBST로 1시간 동안 결합한 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 실험군으로 Avastin(V)-A22p를 50nM, 25nM, 12.5nM 이 되게 0.1 % PBST로 희석하여 각 농도별로 37˚C에서 1시간 처리한 뒤 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. HRP가 접합된 anti-kappa light chain 항체 (Horseradish peroxidase-conjugated anti-human kappa light chain mAb, SIGMA-ALDRICH co., USA) 를 5 % 스킴 밀크가 포함된 0.1% PBST에 100,000배 희석하여 37˚C에서 30분 처리하였다. 그 후 0.1 % PBST로 1분간 5회 씻어냈다. 발색을 위하여 TMB HRP colorimetric substrate (Surmodics co., USA)를 처리하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 동부피의 1N HCl (stop buffer)을 처리한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 얻어진 ELISA 결과를 통해 발현 정제한 Avastin(V)-A22p의 뉴로필린 1의 b1b2 도메인에 대한 결합능을 확인 하였다.

정제된 Avastin(V)-A22p의 Recombinant human VEGF 165 (R&D systems co., China)에 대한 결합능을 ELISA에서 확인하였다. 양성 대조군으로 Avastin-A22p를 사용 하였다. 표적분자 Recombinant human VEGF 165를 96 well Maxibinding Immuno 플레이트에 1개 well당 0.2μg씩 2시간 동안 37˚C 에서 결합시킨 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 5 % 스킴 밀크가 포함된 0.1% PBST로 1시간 동안 결합한 후 0.1 % PBST로 1분간 3회 씻어내었다. 실험군으로 Avastin(V)-A22p를 6.25nM, 3.12nM, 1.56nM이 되게 0.1 % PBST로 희석하여 각 농도별로 37˚C에서 1시간 처리한 뒤 0.1 % PBST 로 1분간 3회 씻어내었다. HRP가 접합된 anti-kappa light chain 항체를 0.1% PBST가 포함된 5 % 스킴 밀크에 100,000배 희석하여 37˚C에서 30분 처리하였다. 그 후 0.1 % PBST로 1분간 5회 씻어낸다. 발색을 위하여 TMB HRP colorimetric substrate를 처리하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 동부피의 1N HCl을 처리한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 얻어진 ELISA 결과를 통해 발현 정제한 Avastin(V)-A22p의 Recombinant human VEGF 165에 대한 결합능을 확인 하였다.

이에 대한 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, Avastin(V)-A22p는 대조군으로 사용된 Avastin-A22p와 동등한 수준으로 NRP1에 결합하였고(도12A) VEGF와도 Avastin-A22p와 동등한 수준으로 결합하는 것으로 확인되었다(도12B).

본 발명의 조직 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항-angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물은 항-신생혈관생성 제제의 종양 투과성이 개선되고, 암을 타겟팅하는 효과를 발휘하여 적은 용량으로도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있어 항-신생혈관생성 제제의 부작용을 경감시킬 수 있으며, 신생혈관생성과 관련된 성장 인자와 NRP1에 동시에 결합함으로써 항-신생혈관생성 제제에 내성을 나타내는 암 또는 혈관신생 관련 질환에도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

<110> IL DONG PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Pharmaceutical compositions for preventing and treating of cancer or angiogenesis related disease comprising fusion protein of tumor penetrating peptide and anti-angiogenesis agent <130> NP16-0099 <150> 10-2015-0123878 <151> 2015-09-01 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP#1 <400> 1 His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu Asn Lys 1 5 10 15 Lys Gly Arg Asn Arg Arg 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP#2 <400> 2 His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu Asn Lys 1 5 10 15 Lys Gly Arg Pro Arg Arg 20 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP#3 <400> 3 Arg Glu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Glu Pro Gln Asp Gln Lys 1 5 10 15 Lys Pro Arg Asn Arg Arg 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP#4 <400> 4 Arg Glu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Glu Pro Gln Asp Gln Lys 1 5 10 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Claims

종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항-angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생 관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암 또는 혈관신생 관련 질환은 항-신생혈관생성 제제에 내성 또는 무반응인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 종양 투과성 펩타이드는 뉴로필린 1(NRP1) 및 뉴로필린 2(NRP2)에 모두 결합하거나 또는 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 종양 투과성 펩타이드 중 뉴로필린 1 및 뉴로필린 2에 모두 결합하는 펩타이드는 서열번호 1 내지 4 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합하는 펩타이드는 서열번호 5 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 종양 투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자는 링커를 통해 융합된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 융합단백질은 서열번호 9, 10 및 12로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항-신생혈관생성 제제는 항-혈관 내피세포 성장인자(항-VEGF) 제제, 항-PDGF(platelet-derived growth factor) 제제, 항-PlGF(placenta growth factor) 제제, 항-FGF(fibroblast growth factor) 제제, 항-TGF(transforming frowth factor) 제제, 항-ANG(angiopoietin) 제제, 항-HGF(hepatocyte growth factor) 제제, 항-IGF(Insulin-like growth factor) 제제, 항-ALK1(activin receptor-like kinase 1) 제제, 항-Ephrin A 제제, 항-Interleukin 제제, 항-BMP(bone morphogenetic protein) 제제,
VEGF, PDGF, PIGF, FGF, TGF, ANG, HGF, IGF, ALK1, ephrin A 또는 Interleukin 각각에 대한 수용체의 길항 항체,
및 상기 수용체 기반-키메라 분자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 항-혈관 내피세포 성장인자(항-VEGF) 제제는 라니비주맙(ranibizumab), 베바시주맙(bevacizumab), 아플리버셉트(aflibercept), 컨버셉트(Conbercept), 이들의 동등생물의약품(biosimilar), 이들의 변이체 및 항체-약물융합체 (ADC, Antibody Drug Conjugate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혈관신생관련 질환은 류마티스성 관절염, 건선, 염증, 자궁내막증 및 혈관종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 (항-angiogenesis) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 암은 항-신생혈관생성 (항-angiogenesis) 제제에 내성 또는 무반응인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.