JP7371093B2 - 腫瘍および/または転移の治療のための抗-met fab-fc - Google Patents
腫瘍および/または転移の治療のための抗-met fab-fc Download PDFInfo
- Publication number
- JP7371093B2 JP7371093B2 JP2021518891A JP2021518891A JP7371093B2 JP 7371093 B2 JP7371093 B2 JP 7371093B2 JP 2021518891 A JP2021518891 A JP 2021518891A JP 2021518891 A JP2021518891 A JP 2021518891A JP 7371093 B2 JP7371093 B2 JP 7371093B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- met
- human
- domain
- antibody fragment
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
- C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/35—Valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/522—CH1 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
(i)1つのヒト化軽鎖可変(VL)ドメインおよび1つのヒト軽鎖定常(CL)ドメインを含む第1のポリペプチド(ここで、ヒト化軽鎖可変(VL)ドメインは、N末端からC末端の方向で、ヒト軽鎖定常(CL)ドメインに融合されて、ここで、ヒト化軽鎖可変(VL)ドメインは、配列番号1、2および3に示されるアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、ヒト化VLドメインは、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有する);
(ii)1つのヒト化重鎖可変(VH)ドメイン、1つのヒト重鎖定常CH1ドメインおよび第1のFcポリペプチドを含む第2のポリペプチド(ここで、第1のFcポリペプチドは、1つのヒトヒンジ領域、1つのヒト定常CH2ドメインおよび1つのヒト定常CH3ドメインを含み、ここで、N末端からC末端の方向で、ヒト化重鎖可変(VH)ドメインがヒト重鎖定常CH1ドメインに融合されて、それがヒトヒンジ領域に融合されて、それがヒト定常CH2ドメインに融合されて、それがヒト定常CH3ドメインに融合されて、ここで、ヒト化重鎖可変(VH)ドメインは、配列番号4、5および6に示されるアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、ヒト化VHドメインは、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する);
(iii)第2のヒトFcポリペプチドを含む第3のポリペプチド(ここで、第2のヒトFcポリペプチドは、1つのヒンジ領域、1つのヒト定常CH2ドメイン、および、1つのヒト定常CH3ドメインを含み、ここで、N末端からC末端の方向で、ヒンジ領域がヒトCH2定常ドメインに融合されて、それがヒトCH3定常ドメインに融合されて、ここで、ヒンジ領域は、N末端がトランケートされている)。
(i)1つのヒト化軽鎖可変(VL)ドメインおよび1つのヒト軽鎖定常(CL)ドメインを含む、好ましくはからなる、第1のポリペプチド(ここで、ヒト化軽鎖可変(VL)ドメインは、N末端からC末端の方向で、ヒト軽鎖定常(CL)ドメインに融合されて、ここで、ヒト化軽鎖可変(VL)ドメインは、配列番号1、2および3に示されるアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、ヒト化軽鎖可変(VL)ドメインは、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有する);
(ii)1つのヒト化重鎖可変(VH)ドメイン、1つのヒト重鎖定常CH1ドメインおよび第1のFcポリペプチドを含む第2のポリペプチド(ここで、第1のFcポリペプチドは、1つのヒトヒンジ領域、1つのヒト定常CH2ドメイン、および、1つのヒト定常CH3ドメインを含み、ここで、N末端からC末端の方向で、ヒト化重鎖可変(VH)ドメインがヒト重鎖定常CH1ドメインに融合されて、それがヒトヒンジ領域に融合されて、それがヒト定常CH2ドメインに融合されて、それがヒト定常CH3ドメインに融合されて、ここで、ヒト化重鎖可変(VH)ドメインは、配列番号4、5および6に示されるアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、ヒト化重鎖可変(VH)ドメインは、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する);
(iii)第2のヒトFcポリペプチドを含む、好ましくはからなる、第3のポリペプチド(ここで、第2のヒトFcポリペプチドは、1つのヒトヒンジ領域、1つのヒト定常CH2ドメイン、および、1つのヒト定常CH3ドメインを含み、好ましくはからなり、ここで、N末端からC末端の方向で、ヒンジ領域がヒトCH2定常ドメインに融合されて、それがヒトCH3定常ドメインに融合されて、ここで、ヒンジ領域は、N末端がトランケートされている)。
DN30抗体のキメラおよびヒト化1本アーム形式の作製。
古典的な分子生物学技術によって、本発明者らは、DN30 mAb重鎖および軽鎖の定常ドメインを、ヒト免疫グロブリンに由来する定常ドメインで置換した。軽鎖定常ドメインをヒトκタイプのドメイン(天然ヒト抗体においてより代表的なもの)で置換して、重鎖定常ドメインをヒトIgG1に由来する相同ドメイン(ADCC/CDCを誘導することのできるもの)で置換した。
キメラまたはヒト化DN30抗体の精製された1本アーム形態を、ELISAアッセイによって、Met受容体に対する結合に関して分析した。参照として、キメラDN30 Fab(MvDN30)12を分析に含めた。固相中にMet-Fcおよび液相中にDN30誘導体を含むようにアッセイをアセンブルした。抗-ヒトk鎖抗体を用いて結合を明らかにした。データは、キメラおよびヒト化抗体の両方ともMetに結合することを示し、hOA-DN30-cl03E08が最も高い親和性を示した(図2A)。
本発明者らは、(i)ヒト、マウス、ラット、およびサル起源の精製されたMet細胞外ドメインを用いたELISAアッセイ(図2B);(ii)ヒト、マウス、ラット、イヌおよびサル起源の細胞によって発現された表面Metに結合する抗体のフローサイトメーター分析(図2C)を行ない、hOA-DN30-cl03E08の種交差反応性を分析した。実験結果は、hOA-DN30-cl03E08が、ヒト、ラット、イヌ、サル起源のMetに結合するが、マウスMetとの相互作用は非常に弱いことを示した。
本発明者らは、新規のDN30誘導体が、高感度のアッセイである分散アッセイにおいてMetアゴニスト活性を示すことができるかどうか試験した。HGF刺激に応答する細胞運動を判定するための標準的な系を代表するHPAF-IIヒト膵臓癌腫細胞を、増加する濃度の抗体を用いて24時間刺激した。陽性コントロールとして、HGFおよび二価DN30 mAbをアッセイに含めた。陽性コントロールを用いて刺激された細胞は明らかに分散したが、一価DN30誘導体(MvDN30、chOA-DN30、およびhOA-DN30抗体)で処理した細胞の表現型は全て、未処理のものから区別できなかった(図3)。
また、本発明者らは、hOA-DN30が、受容体シェディングおよび下方調節を促進する能力を維持するかどうか試験した。A549細胞を、増加する濃度のchOA-DN30およびhOA-DN30抗体とともにインキュベートした。参照として、MvDN30をアッセイに含めた。48時間後、馴化培地内に放出されたMet外部ドメインを、Metの細胞外部分に対して向けられるモノクローナル抗体を用いた免疫ブロッティングによってスコア化した。また、Metの全細胞レベルを、同一抗体を用いて細胞溶解物に対して決定した。この分析により、全てのOA-DN30抗体がMetシェディングを誘導し、細胞外空間における可溶性Met外部ドメインの放出をもたらし、細胞表面からMetを物理的に除去することが明らかにされた(図4)。予期せずに、hOA-DN30-cl03E08の活性は、試験に含められた全ての他のDN30誘導体と比較して優れていた。
本発明者らは、chOA-DN30およびhOA-DN30抗体が、ヒト癌腫に由来する細胞(すなわちGTL-16)においてMetリン酸化を阻害するかどうか試験した。これらの細胞は、遺伝子増幅に起因する受容体過剰発現の結果として構成的に活性のMetを有する。Met活性化を、抗-phosphoMet抗体を用いた免疫ブロッティングによって判定した。図5に示されるように、全ての分子が、用量応答モダリティでMetリン酸化/活性化を損なった。hOA-DN30-cl03E08は、細胞においてMetレベルの最も強い欠陥(impairment)を誘導し、より活性のDN30誘導体であった。
細胞増殖(生存能力)は、増殖/生存のためにMetシグナル伝達に頼っているMET依存性細胞においてのみ、Met-阻害剤によって損なわれ得る。DN30誘導体の活性を試験するために、指数関数的に増殖しているGTL-16細胞(MET依存性ヒト胃癌腫細胞)を、増加する濃度のchOA-DN30またはhOA-DN30抗体とともにインキュベートした。MvDN30を陽性コントロールとしてアッセイ内に含めた。72時間後、細胞生存能力を、発光に基づくATPアッセイを用いて判定した。全てのDN30誘導体は、MET依存性細胞増殖を用量依存的な様式で阻害した(図6)。hOA-DN30-cl03E08は、最も高い阻害を示し、IC50は、MvDN30よりも2.5倍低く、chOA-DN30よりも5.4倍低く、他のhOA-DN30抗体よりも少なくとも5.2倍低かった(図6の表を参照)。
DN30誘導体によって発揮されるMET依存性細胞増殖の阻害を強調する(underlining)メカニズムをさらに分析するために、本発明者らは、MvDN30、chOA-DN30、およびhOA-DN30-cl03E08と比較して、細胞増殖および細胞毒性を評価した。GTL-16細胞を、単回投与(1μM)のDN30誘導体でインキュベートして、細胞周期S相中の細胞によるEdU-チミジンアナログ-の取り込みを、ClickIT Eduフローサイトメトリーアッセイを用いて測定することによって、細胞増殖を評価した。MvDN30を陽性コントロールとしてアッセイに含めた。この分析は、S相の処理された細胞のパーセンテージがコントロールと比較して劇的に減少したので、DN30誘導体が増殖に影響を及ぼすことが明らかになった。特に、最も効果的な分子はhOA-DN30-cl03E08であり、増殖している細胞はたった4.9%であった(コントロールに対して84.2%減少)。chOA-DN30を用いて処理された集団における増殖性細胞は14.97%であった(コントロールに対して52%減少)(図7A)。
本発明者らは、HPAF-IIヒト膵臓癌腫細胞のHGF-依存性の細胞運動をhOA-DN30-cl03E08が阻害する能力を試験した。細胞を、HGFとインキュベートし、またはインキュベートせずに、増大する用量のhOA-DN30-cl03E08を用いて処理した。24時間後、細胞コロニーを染色して分析した。このアッセイにおいて、hOA-DN30-cl03E08は、HGF依存性の細胞散乱を強く減少させた(図8)。
本発明者らは、HPAF-II細胞のHGF依存性の細胞浸潤をhOA-DN30-cl03E08が阻害する能力を試験した。hOA-DN30-cl03E08(0.5μM)を単独またはDecoyMetK842E(1μM)と組み合わせて含む血清フリー培地中、マトリゲルでコーティングされたトランスウェルフィルターの上側チャンバー内に細胞を蒔いた。下側チャンバーを、HGF(25ng/ml)を含んでいる培地で満たした。24時間後、フィルターの下側部分に遊走している細胞を、染色および顕微鏡観察によって評価した。このアッセイにおいて、hOA-DN30-cl03E08は、HGF依存性の細胞浸潤を強く減少させて;細胞応答は、hOA-DN30-cl03E08とDecoyMetK842Eの組み合わせによってほとんど消失した(図9)。
プログラム細胞死リガンド1(PD-L1)およびプログラム細胞死受容体1(PD-1)は、重要な調節分子であり、免疫応答と腫瘍微小環境の間の境界面で中心的な役割を果たす免疫チェックポイントとして知られている30。それらは、免疫系が腫瘍進行を制御する能力を著しく損ない得る。腫瘍細胞によるPD-L1の発現は誘導性であり、インターフェロンγ(IFNγ)が最も強力な誘導因子である31。
本発明者らは、MvDN30およびキメラDN30 mAbと比較して、hOA-DN30-Cl03E08の薬物動態特性を試験した。上述の分子の単回投与を、静脈内注入によって免疫不全マウスに送達した。処置されたマウス由来の末梢血を、送達後の異なる時点に回収した。試験分子の循環濃度を、血清サンプルに対して行なわれるELISAによって決定した。hOA-DN30-cl03E08の循環レベルは、mAbに関して測定されるものと同等であり、常にMvDN30よりも高かった(図11)。
DN30誘導体がインビボで腫瘍増殖を阻害する能力を、MET依存性モデルに対して試験した。1×106 GTL-16細胞を、NOD-SCIDマウスの脇腹に皮下注入した。1週後、触知可能な腫瘍を保有するマウスを4つの均一な処置グループ:ビヒクル(n=6)、MvDN30(n=6)、hOA-DN30-cl03E08(n=5)、chOA-DN30(n=5)にランダム化した。抗体を、静脈内注入によって、2回/週、30mg/Kgで送達して;同量の分子を投与するために、MvDN30を、1本アーム抗体の分子量はMvDN30に対して2倍なので、同様のスケジュールに従って15mg/kgで送達した(すなわち、OA-DN30形式に関して約100KDaおよびMvDN30に関して約50KDa)。MvDN30は-その短い血漿半減期から予想されるとおり-効果的でなかったが、1本アーム誘導体は両方とも、腫瘍増殖を阻害した(図12A)(hOA-DN30-cl03E08およびchOA-DN30に関してそれぞれ、ビヒクルに対してP=0.0007および0.05)。驚くべきことに、hOA-DN30-cl03E08は、chOA-DN30よりも非常に効果的であった:処置後の腫瘤(treated masses)は、コントロールよりも、hOA-DN30-cl03E08の場合では87.8%、chOA-DN30の場合では52.9%小さかった(図12B)(hOA-DN30-cl03E08対chOA-DN30に関してP=0.009)。本発明者らは、用量応答実験を行なってhOA-DN30-cl03E08の阻害活性をさらに分析した。上述の実験的条件を維持して、マウスを5つの均一なグループにランダム化して、異なる用量のhOA-DN30-cl03E08を用いて、3回/週、i.v.注入によって処置した。10、30、および60mg/kgの用量は、腫瘍増殖をブロックするのに非常に効果的であったが、3.3mg/kgによる処置はコントロールから統計的に差がなかった(図13)。
細胞培養
A549ヒト肺腺がん細胞、HPAF-IIヒト膵臓腺がん細胞、C2C12マウス筋肉の筋芽細胞、H9C2(2-1)ラット心臓の筋芽細胞、MDCKイヌ腎臓細胞、およびCos-7サル腎臓細胞は、ATCC/LGC Standards S.r.l.(Sesto San Giovanni,Italy)から取得した;GTL-16細胞株は、MKN-45細胞(Japanese Collection of Research Bioresources,Osaka,Japanによって利用可能なヒト胃癌腫細胞)から得られたクローンであり、親細胞株とはMET遺伝子コピー数が異なる32。GTL-16細胞株は、Advanced Biotechnology Center(ABC)、Interlab Cell Line Collection(ICLC)Italyによって、アクセッションナンバーICLC PD 08003で利用可能である。EBC-1、ヒト肺がんは、Japanese Collection of Research Bioresources)由来である。DN30ハイブリドーマは、Advanced Biotechnology Center(ABC)、Interlab Cell Line Collection(ICLC)Italyによって、アクセッションナンバーICLC PD 05006で利用可能である。
キメラDN30抗体について:軽鎖(VL-CL)、重鎖(VH-CH1-cH2-CH3)、およびFcドメイン(CH2-CH3)をそれぞれコードする3つの別個のcDNAを、遺伝子合成によって生産した。可変領域(マウス配列)はDN30抗体由来であり(配列番号15および16);ヒト免疫グロブリン由来のヒト起源の定常領域、特に軽鎖は、ヒトκタイプ定常ドメイン(GenBank配列番号:DI165992)を含み、重鎖はヒトIgG1定常ドメイン(GenBank配列番号:DJ392898)を含む。コード配列のC末端において、重鎖はHis-TAG(配列番号38、39)を含み、Fcはstrep-TAG(配列番号40、41)を含む。
(i)配列番号15に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン;
(ii)配列番号16に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン;
(iii)配列番号9に示されるアミノ酸配列を有するヒト軽鎖定常(CL)ドメイン;
(iv)配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するヒト重鎖定常CH1ドメイン;
(v)配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する第1のヒトFcポリペプチド;および
(vi)配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する第2のヒトFcポリペプチド。
(i)配列番号7に示されるアミノ酸配列を有するヒト化軽鎖可変ドメイン;
(ii)配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するヒト化重鎖可変ドメイン;
(iii)配列番号9に示されるアミノ酸配列を有するヒト軽鎖定常(CL)ドメイン;
(iv)配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するヒト重鎖定常CH1ドメイン;
(v)配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する第1のヒトFcポリペプチド;および
(vi)配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する第2のヒトFcポリペプチド。
(i)配列番号17に示されるアミノ酸配列を有するヒト化軽鎖可変ドメイン;
(ii)配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するヒト化重鎖可変ドメイン;
(iii)配列番号9に示されるアミノ酸配列を有するヒト軽鎖定常(CL)ドメイン;
(iv)配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するヒト重鎖定常CH1ドメイン;
(v)配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する第1のヒトFcポリペプチド;および
(vi)配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する第2のヒトFcポリペプチド。
(i)配列番号19に示されるアミノ酸配列を有するヒト化軽鎖可変ドメイン;
(ii)配列番号20に示されるアミノ酸配列を有するヒト化重鎖可変ドメイン;
(iii)配列番号9に示されるアミノ酸配列を有するヒト軽鎖定常(CL)ドメイン;
(iv)配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するヒト重鎖定常CH1ドメイン;
(v)配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する第1のヒトFcポリペプチド;および
(vi)配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する第2のヒトFcポリペプチド。
(i)配列番号21に示されるアミノ酸配列を有するヒト化軽鎖可変ドメイン;
(ii)配列番号22に示されるアミノ酸配列を有するヒト化重鎖可変ドメイン;
(iii)配列番号9に示されるアミノ酸配列を有するヒト軽鎖定常(CL)ドメイン;
(iv)配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するヒト重鎖定常CH1ドメイン;
(v)配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する第1のヒトFcポリペプチド;および
(vi)配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する第2のヒトFcポリペプチド。
(i)配列番号23に示されるアミノ酸配列を有するヒト化軽鎖可変ドメイン;
(ii)配列番号24に示されるアミノ酸配列を有するヒト化重鎖可変ドメイン;
(iii)配列番号9に示されるアミノ酸配列を有するヒト軽鎖定常(CL)ドメイン;
(iv)配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するヒト重鎖定常CH1ドメイン;
(v)配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する第1のヒトFcポリペプチド;および
(vi)配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する第2のヒトFcポリペプチド。
上述の軽鎖(ヌクレオチド配列は、ヒト化軽鎖に関して配列番号25、26、27、28、29に示され、キメラ軽鎖に関して配列番号30に示される)、重鎖(ヌクレオチド配列は、ヒト化重鎖に関して配列番号31、32、33、34、35に示され、キメラ重鎖に関して配列番号36に示される)、および、Fc(ヌクレオチド配列は、配列番号37に示される)をコードするcDNAを、一般に利用可能な発現ベクター(例えばpcDNA3.1プラスミドcat.# V79020 Invitrogen Corporation,Camarillo,CA)内にクローニングして、ExpiCHO-S細胞(cat.#:A29127,ThermoFisher Scientific)をトランスフェクトするために用いた。ベクター比は、所望の97.5kDaヘテロ二量体(OA-Ab)の産出を最大にして、いかなる150kDa二価ホモ二量体(本物のMab)の存在も最小にするように最適化された。最適な比は、軽鎖、重鎖の全サイズ(「ノブ」ベクター)およびFc(「ホール」ベクター)に関してそれぞれ1:1:2であった。この条件は、最少量のホモ二量体の存在をもたらし、ヘテロ二量体は全タンパク質のおよそ85%であった。一過性発現を、ExpiFectamine(商標)CHOトランスフェクション試薬(cat.# A29130,ThermoFisher Scientific)によって生じさせた(powered)。生産の9日後に上清を回収した。OA-DN30抗体を、AKTA Pure 25クロマトグラフィーシステム上のHitrap MabSelect Sureカラム(cat.# GE29-0491-04,Sigma Aldrich)を用いて精製した。OA-DN30抗体をその後、0.1Mクエン酸バッファー(pH3.0)を用いて溶出させた。溶出画分を回収して、1M Tris-HCl(pH9.0)を用いて中和させた(溶出タンパク質1mlあたり0.15mlの比で)。OA-DN30抗体を、GE AKTA Prime Liquid Chromatography System(GE Healthcare Life Sciences)上の1×PBS(pH7.4)-平衡化Superdex 200 26/600サイズの溶出カラム(cat.# GE28-9893-36,Sigma Aldrich)に対してさらに精製して、OA-Abを含む画分を、ホモ二量体画分(mAbまたはFc)から分離した。OA-DN30抗体を含む予備SEC画分をプールして、SDS-PAGEによって分析して純度を確認した。プールした画分は、エンドトキシンレベルに関しても試験した。予備SEC精製からの最終的なプール画分は、いかなる二価ホモ二量体も存在しないこと、および、ノブ-ノブFcホモ二量体に相当する少量(<5%)のより小さな約70kDaのバンドの存在を示した。
単一アミノ酸置換を保有するヒトMET外部ドメイン(DecoyMet)のcDNA配列を、GenBankにおいて寄託番号X54559で開示されるヒトMet外部ドメイン配列からスタートして、QuickChange II部位特異的突然変異誘発キット(cat.# 200524 Agilent Technologies,Santa Clara,CA)を用いて、製造元の説明書に従って合成的に生産した。手順は、所望の点突然変異を含むセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計が必要である。以下のオリゴを用いた:
-突然変異K842E:
sn. 5’-gtacataatcctgtgtttgagccttttgaaaagccagtg-3’(配列番号42);
as. 5’-cactggcttttcaaaaggctcaaacacaggattatgtac-3’(配列番号43)。
精製されたOA-DN30抗体(1μg)を、標準的な方法に従って、β-メルカプトエタノールの不存在下で、存在下で、SDS-PAGEによって4~12%アクリルアミドの勾配ゲル内へ分離させた。分子量マーカー(cat.# 1610374,Bio-Rad)を分析に含めた。ゲル内で分離したポリペプチドを、Gel Code Blue Stain試薬によって明らかにした(cat.# 24590,Thermo Fisher Scientific)。
MetとDN30誘導体の間の相互作用の分析のために、精製されたMet-Fcキメラ(cat #. 358-MT-100 R&D Systems,100ng/ウェル)をELISAプレート上に固定化した。37℃で1時間、0.5%BSAのインキュベートにより飽和させた後、増加する濃度の抗体(MvDN30、chOA-DN30またはhOA-DN30抗体(PBS-BSA 0.5%-Tween0.1%中、0~500nMに調製))を液相内に添加した。結合を、HRP-コンジュゲート抗-ヒトk鎖抗体(cat.# A7164,Sigma-Aldrich)を用いて、その後に、TMB(cat.# T8665,Sigma Aldrich)とのインキュベーションにより明らかにした。比色分析法を、マルチラベルプレートリーダーVICTOR-X4(Perkin Elmer Instruments INC.,Whaltman,MA)によって定量化した。データを分析して、Prismソフトウェア(GraphPad)を用いてフィットさせた。
細胞の表面に発現されたMetに対するhOA-DN30-cl03E08結合について、2×105のEBC-1、C2C12、H9C2、MDCK、またはCos-7細胞を、StemPro(商標)Accutase(商標)細胞解離試薬(cat.# A1110501,ThermoFisher Scientific)で処理して、回収し、PBS-2% FCS中で4℃にて1時間インキュベートした。抗体染色を、PBS-2% BSA中、10μg/mlのhOA-DN30-cl03E08と4℃にて30分間、細胞をインキュベートすることによって、抗体染色を行なった。PBS-2% BSAを用いて6回洗浄した後、細胞を、1:100に希釈された抗-ヒトIgG-APC(cat.# 109-606-088 Jackson Immuno Research)と4℃にて30分間インキュベートして、それから洗浄して、結合しなかった抗体を除去した。DAPI(3μlの1μg/ml使用液、Sigma-Aldrich,cat.# 10236276001)を用いて4℃にて5分間、細胞を共染色して、Summit 4.3ソフトウェア(Dako)によってMet発現について分析した。アイソタイプコントロール(抗-ヒトAPC IgG)に由来する蛍光シグナルを閾値(0<MFI<101)として設定した。細胞は、平均蛍光強度(MFI)が閾値よりも高い場合に(MFI>101)、Met発現に関してポジティブと考えた。
サブコンフルエントなA549単層をPBSで2回洗浄して、それから、増加する濃度(37、111、333、1000nM)のDN-30誘導体とともに血清フリー培地内でインキュベートした。48時間後、馴化培地を回収して、Laemmliバッファーで細胞を溶解させた。Metタンパク質レベルを、抗-Met抗体(3D4,cat.# 08-1366 Invitrogen Corporation)を用いたウエスタンブロットによって15μgの全細胞タンパク質において決定して;ローディングコントロールとして、フィルターを抗-ビンキュリン抗体(クローンhVIN-1,cat.# V9131 Sigma Life Science)でもプローブした。Met外部ドメインレベルを、受容体の細胞外ドメインに対して向けられた抗-ヒトHGFR/Met抗体(cat.# AF276,R&D Systems)を用いたウエスタンブロッティングにより、15μlの細胞培養上清において決定した。抗‐マウスIgG1 HRP-コンジュゲート二次抗体(cat.# JI115035003,Jackson ImmunoResearch)およびECL System(cat.# W1015,Promega,)をタンパク質検出に用いた。ウエスタンブロットバンドを、ImageJソフトウェアを用いて定量化した。
血清不足のGTL-16細胞を、DN30誘導体とともに24時間インキュベートした(1000または250nM)。全細胞溶解物を、以下の一次抗体:抗-Met phospho-Tyr1234/1235(D26,cat.# 3077 Cell Signaling Technology);抗-Met(3D4,cat.# 08-1366 Invitrogen Corporation);および抗-ビンキュリン(クローンhVIN-1、cat.# V9131 Sigma Life Science)を用いて、ウエスタンブロットにより分析した。抗-マウスIgG1および抗-ウサギIgG(cat.# JI111035003)HRP-コンジュゲート二次抗体およびECL Systemをタンパク質検出に用いた。ウエスタンブロットバンドを、ImageJソフトウェアを用いて定量化した。
細胞散乱アッセイのために、HPAF-II細胞(8000/ウェル)を、完全培養培地中、96ウェルプレート内に蒔いた。抗体のアゴニスト活性を分析するために、24時間後、HGF(8ng/ml、ポジティブコントロール、cat.# 294-HG-025,R&D Systems)または抗体(DN30 mAb、MvDN30、chOA-DN30、hOA-DN30抗体、全て200nMの濃度)を、培養培地に添加した。阻害活性を分析するために、増加する濃度(0~4μM)のhOA-DN30-cl03E08を、単独またはDecoyMetK842Eとの1:1の組み合わせで添加した。さらに24時間後、細胞を6.25ng/ml HGFで24時間刺激した。それから、細胞を11%グルタルアルデヒド(cat.# 340855 Sigma-Aldrich)で固定化して、0.1% Crystal Violet(cat.# C3886 Sigma-Aldrich)で染色して、顕微鏡観察(顕微鏡Leica DM2000)によって分析した。画像を、QICAM Fast 1394カラーデジタルカメラ(QImaging)を用いてキャプチャーした。
サブコンフルエントなGTl-16細胞を、50ng/mlのIFNγ-1b(Miltenyi Biotec,cat.# 130-096-484)を用いて48時間(24時間ごとに交換)、250nMのhOA-DN30-cl03E08と組み合わせて処理した。それから、単層をLaemmliバッファー中に溶解させて、45μgの全タンパク質を8%SDS-PAGEゲルに供した。標準的な方法に従って、タンパク質をゲルからiBlot Transferニトロセルロース膜(Life technologies,cat.# IB23001)上に移した。PD-L1発現を、抗-PD-L1抗体(E1L3N,cat.# 13684,Cell Signaling Technology)によって検出した。P-Metレベルを、抗-MET phospho-Tyr1234/1235(D26)抗体によってチェックした。ローディングコントロールとして、フィルターを抗-GAPDH(D4C6R,cat.# 97166Cell Signaling Technology)でプローブした。二次HRP-コンジュゲートヤギ抗-マウスIgG(cat.# JI115035003)または抗-ウサギIgG(cat.# JI111035144)(両方ともJackson Immuno Research)およびECL Systemをタンパク質検出に用いた。
全ての動物手順は、Fondazione Piemontese per la Ricerca sul Cancroの動物実験に関する倫理委員会およびイタリア保健省によって承認されたプロトコルに従って行われた。NOD-SCIDマウスはCharles River(Calco,Italy)から購入した。
平均および標準偏差(SD)は、Microsoft Office Excel 2010ソフトウェア(Microsoft Corporation)を用いて計算した。Kd値を計算するために、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPadソフトウェア)を用いて、非線形回帰、1サイト結合双曲線に従って、ELISAアッセイからのデータを分析およびフィッティングした。IC50およびEC50値を計算するために、GraphPad Prismソフトウェアを用いて、非線形回帰、シグモイド用量応答曲線に従ってデータを分析およびフィッティングした。全ての実験は、少なくとも2回繰り返した。図は1つの代表的な実験を示す。
Claims (19)
- 単一の抗原結合アームおよびFc領域を含む抗-Met抗体フラグメントであって(Fc領域は、前記抗原結合アームを含むFab分子と比較して前記抗体フラグメントの安定性を増大させる)、
前記Fc領域は、第1および第2のFcポリペプチドの複合体を含み、ここで、前記抗体フラグメントは、以下を含む:
(i)1つのヒト化軽鎖可変(VL)ドメインおよび1つのヒト軽鎖定常(CL)ドメインを含む第1のポリペプチド、
ここで前記ヒト化VLドメインは、N末端からC末端の方向で、前記ヒトCLドメインに融合されて、ここで、前記ヒト化VLドメインは、配列番号1、2および3に示されるアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、前記ヒト化VLドメインは、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有する;
(ii)1つのヒト化重鎖可変(VH)ドメイン、1つのヒト重鎖定常CH1ドメインおよび前記第1のFcポリペプチドを含む第2のポリペプチド、
ここで前記第1のFcポリペプチドは、1つのヒンジ領域、1つのヒト定常CH2ドメインおよび1つのヒトCH3定常ドメインを含み、ここで、N末端からC末端の方向で、前記ヒト化VHドメインが前記ヒトCH1ドメインに融合されて、それがヒトヒンジ領域に融合されて、それが前記ヒトCH2ドメインに融合されて、それが前記ヒトCH3ドメインに融合されて、ここで、前記ヒト化VHドメインは、配列番号4、5および6に示されるアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、ここで前記ヒト化VHドメインは、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する;および
(iii)第2のヒトFcポリペプチドを含む第3のポリペプチド、
ここで前記第2のヒトFcポリペプチドは、1つのヒトヒンジ領域、1つのヒト定常CH2ドメインおよび1つのヒトCH3定常ドメインを含み、ここで、N末端からC末端の方向で、前記ヒトヒンジ領域が前記CH2ドメインに融合されて、それが前記ヒトCH3ドメインに融合されて、ここで、前記ヒトヒンジ領域は、N末端がトランケートされている、
抗-Met抗体フラグメント。 - 請求項1に記載の抗-Met抗体フラグメントであって、
前記ヒトCLドメインは、ヒト軽鎖κタイプドメインである、
抗-Met抗体フラグメント。 - 請求項1または2に記載の抗-Met抗体フラグメントであって、
前記ヒトヒンジ領域および前記ヒト定常ドメインCH1、CH2およびCH3は、ヒトIgG1由来である、
抗-Met抗体フラグメント。 - 請求項1から3のいずれか一項に記載の抗-Met抗体フラグメントであって、
前記の2つのFcポリペプチドは、ヒンジ領域において分子間ジスルフィド結合によって連結されている、
抗-Met抗体フラグメント。 - 請求項1から4のいずれか一項に記載の抗-Met抗体フラグメントであって、
前記第1のFcポリペプチドおよび前記第2のFcポリペプチドは、境界面において接触していて(meet)、前記第1および前記第2のFcポリペプチドの間の一方は前記境界面にノブを含み、前記第1および前記第2のFcポリペプチドの間の他方は前記境界面にホールを含み、ここで、前記ノブは前記ホール内に配置可能である、
抗-Met抗体フラグメント。 - 請求項5に記載の抗-Met抗体フラグメントであって、
前記第1および前記第2のFcポリペプチドの間の一方は、突然変異したCH3定常ドメインを含み、ここで、前記の突然変異したCH3定常ドメインは、389位にアミノ酸突然変異を保有し、ここで、389位の元のアミノ酸は、元のアミノ酸よりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸を取り込むように突然変異されていて;
前記第1および前記第2のFcポリペプチドの間の他方は、突然変異したCH3定常ドメインを含み、ここで、前記の突然変異したCH3定常ドメインは、3つのアミノ酸突然変異を389位、391位および438位に保有し、ここで、元のアミノ酸は、元のアミノ酸よりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸を取り込むように突然変異されていて、
ここで、アミノ酸ナンバリングはKabatのEUナンバリング・スキームに従っている、
抗-Met抗体フラグメント。 - 請求項6に記載の抗-Met抗体フラグメントであって、
389位、391位および438位の元のアミノ酸は、それぞれ、トレオニン、ロイシンおよびチロシンであり;
ここで、前記第1および前記第2のFcポリペプチドの間の一方において、389位のトレオニンはトリプトファンに突然変異されていて;
ここで、前記第1および前記第2のFcポリペプチドの間の他方において、389位のトレオニンはセリンに突然変異されていて、391位のロイシンはアラニンに突然変異されていて、438位のチロシンはバリンに突然変異されている、
抗-Met抗体フラグメント。 - 請求項1から7のいずれか一項に記載の抗-Met抗体フラグメントであって、
前記ヒトCLドメインは、配列番号9に示されるアミノ酸配列を有し、前記ヒトCH1ドメインは、配列番号10に示されるアミノ酸配列を有する、
抗-Met抗体フラグメント。 - 請求項1から8のいずれか一項に記載の抗-Met抗体フラグメントであって、
第1のヒトFcポリペプチドは、配列番号11に示されるアミノ酸配列を有し、第2のヒトFcポリペプチドは、配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する、
抗-Met抗体フラグメント。 - 請求項1から9のいずれか一項に記載の抗-Met抗体フラグメントであって、
前記抗-Met抗体フラグメントは、Metに結合すると、Metの細胞外ドメインのシェディングを誘導する、
抗-Met抗体フラグメント。 - 請求項1から10のいずれかの抗-Met抗体フラグメントをコードする、
単離された核酸。 - 請求項1から10のいずれかの抗-Met抗体フラグメントを、集合的に(collectively)コードする2以上の組み換え核酸を含む、
組成物。 - 単一のボトル内または2つのボトル内に、(a)請求項1から10のいずれか一項に記載の抗-Met抗体フラグメントおよび薬学的に許容できるビヒクル、および(b)ヒトMetの細胞外部分および薬学的に許容できるビヒクルを含む生産物であって、
ヒトMetの前記細胞外部分は、安定した様式で肝細胞増殖因子(HGF)に結合することが可能であり、前記抗-Met抗体フラグメントによって認識されるエピトープにおいて、前記抗-Met抗体フラグメントがそれに結合するのを防ぐための少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含む、
生産物。 - 請求項13に記載の生産物であって、
ヒトMetの前記細胞外部分は、SEMA、PSI、IPT-1、IPT-2、IPT-3およびIPT-4ドメインを含む、
生産物。 - 請求項13または14に記載の生産物であって、
ヒトMetの前記細胞外部分は、配列番号13に示されるアミノ酸配列を有し、
ここで、配列番号13の797位と875位の間のアミノ酸の少なくとも1つは、前記抗-Met抗体フラグメントがそれに結合するのを防ぐために突然変異されている、
生産物。 - 請求項13から15のいずれか一項に記載の生産物であって、
ヒトMetの前記細胞外部分は、配列番号14に示されるアミノ酸配列を有する、
生産物。 - 腫瘍および/または転移を患っている患者の治療での使用のための、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗-Met抗体フラグメントまたは請求項13から16のいずれか一項に記載の生産物であって、
前記患者は、MET遺伝子の遺伝子変異を保有している、
抗-Met抗体フラグメントまたは生産物。 - 腫瘍および/または転移を患っている患者の治療での使用のための、請求項13から16のいずれか一項に記載の生産物であって、
前記患者は、野生型MET遺伝子を保有している、
生産物。 - 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗-Met抗体フラグメントを製造する方法であって、
前記方法は以下のステップ:
(i)前記抗-Met抗体フラグメントを構成する第1、第2および第3のポリペプチドのcDNA配列の合成、
(ii)1または2以上のプラスミドへの前記3つのcDNA配列の挿入、ここで、前記プラスミドは哺乳類細胞株における発現に適する、
(iii)哺乳類細胞株への、前記プラスミドを用いた一過的または安定した共トランスフェクション、
(iv)培養上清の回収、
(v)アフィニティークロマトグラフィーによる前記抗-Met抗体フラグメントの精製、
を含む、
方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT102018000009282 | 2018-10-09 | ||
IT102018000009282A IT201800009282A1 (it) | 2018-10-09 | 2018-10-09 | Nuovo agente terapeutico per il trattamento di un tumore e/o metastasi |
PCT/EP2019/077116 WO2020074459A1 (en) | 2018-10-09 | 2019-10-07 | Anti-met fab-fc for the treatment of a tumor and/or metastasis |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022504392A JP2022504392A (ja) | 2022-01-13 |
JPWO2020074459A5 JPWO2020074459A5 (ja) | 2022-05-12 |
JP7371093B2 true JP7371093B2 (ja) | 2023-10-30 |
Family
ID=65010823
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021518891A Active JP7371093B2 (ja) | 2018-10-09 | 2019-10-07 | 腫瘍および/または転移の治療のための抗-met fab-fc |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210395372A1 (ja) |
EP (2) | EP3864050B1 (ja) |
JP (1) | JP7371093B2 (ja) |
KR (1) | KR20210075121A (ja) |
CN (1) | CN113330032A (ja) |
AU (1) | AU2019358417A1 (ja) |
CA (1) | CA3115582A1 (ja) |
DK (1) | DK3864050T3 (ja) |
ES (1) | ES2938714T3 (ja) |
FI (1) | FI3864050T3 (ja) |
HR (1) | HRP20230154T1 (ja) |
HU (1) | HUE060843T2 (ja) |
IL (1) | IL282033A (ja) |
IT (1) | IT201800009282A1 (ja) |
LT (1) | LT3864050T (ja) |
PL (1) | PL3864050T3 (ja) |
PT (1) | PT3864050T (ja) |
RS (1) | RS63960B1 (ja) |
SG (1) | SG11202103575RA (ja) |
SI (1) | SI3864050T1 (ja) |
WO (1) | WO2020074459A1 (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008504007A (ja) | 2003-12-19 | 2008-02-14 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 治療薬として有用な一価抗体断片 |
JP2014533700A (ja) | 2011-11-21 | 2014-12-15 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗c−MET抗体の精製 |
JP2016503069A (ja) | 2013-01-09 | 2016-02-01 | メセレシス・トランスレイショナル・リサーチ・ソシエタ・アノニマMetheresis Translational Research S.A. | 新規な抗体フラグメント、組成物およびその使用 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK1981981T3 (da) | 2006-02-06 | 2011-09-26 | Metheresis Translational Res Sa | Monoklonalt anti-met antistof, fragmenter og vektorer deraf til behandling af tumorer, samt tilsvarende produkter |
RU2460540C2 (ru) * | 2006-04-28 | 2012-09-10 | Деленекс Терапьютикс Аг | Антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом тирозинкиназного рецептора (alk) |
AU2009335798B2 (en) * | 2008-12-19 | 2014-11-27 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
MX2011010265A (es) * | 2009-04-01 | 2011-10-11 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-fcrh5 e inmunoconjugados y metodos de uso. |
AU2012236068A1 (en) * | 2011-04-01 | 2013-10-17 | Eureka Therapeutics, Inc. | T cell receptor-like antibodies specific for a WT1 peptide presented by HLA-A2 |
MX2014002289A (es) * | 2011-08-26 | 2015-03-20 | Merrimack Pharmaceuticals Inc | Anticuerpos fc especificos en tandem. |
GB201403875D0 (en) * | 2014-03-05 | 2014-04-16 | Cantargia Ab | Novel antibodies and uses thereof |
CN110418802A (zh) * | 2017-01-20 | 2019-11-05 | 朱诺治疗学有限公司 | 细胞表面缀合物及相关的细胞组合物和方法 |
-
2018
- 2018-10-09 IT IT102018000009282A patent/IT201800009282A1/it unknown
-
2019
- 2019-10-07 FI FIEP19808675.3T patent/FI3864050T3/fi active
- 2019-10-07 CN CN201980080611.2A patent/CN113330032A/zh active Pending
- 2019-10-07 US US17/283,482 patent/US20210395372A1/en active Pending
- 2019-10-07 SG SG11202103575RA patent/SG11202103575RA/en unknown
- 2019-10-07 WO PCT/EP2019/077116 patent/WO2020074459A1/en unknown
- 2019-10-07 HU HUE19808675A patent/HUE060843T2/hu unknown
- 2019-10-07 RS RS20230107A patent/RS63960B1/sr unknown
- 2019-10-07 SI SI201930456T patent/SI3864050T1/sl unknown
- 2019-10-07 LT LTEPPCT/EP2019/077116T patent/LT3864050T/lt unknown
- 2019-10-07 PT PT198086753T patent/PT3864050T/pt unknown
- 2019-10-07 JP JP2021518891A patent/JP7371093B2/ja active Active
- 2019-10-07 KR KR1020217013513A patent/KR20210075121A/ko unknown
- 2019-10-07 ES ES19808675T patent/ES2938714T3/es active Active
- 2019-10-07 CA CA3115582A patent/CA3115582A1/en active Pending
- 2019-10-07 AU AU2019358417A patent/AU2019358417A1/en active Pending
- 2019-10-07 EP EP19808675.3A patent/EP3864050B1/en active Active
- 2019-10-07 EP EP22206743.1A patent/EP4194469A1/en active Pending
- 2019-10-07 DK DK19808675.3T patent/DK3864050T3/da active
- 2019-10-07 HR HRP20230154TT patent/HRP20230154T1/hr unknown
- 2019-10-07 PL PL19808675.3T patent/PL3864050T3/pl unknown
-
2021
- 2021-04-04 IL IL282033A patent/IL282033A/en unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008504007A (ja) | 2003-12-19 | 2008-02-14 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 治療薬として有用な一価抗体断片 |
JP2014533700A (ja) | 2011-11-21 | 2014-12-15 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗c−MET抗体の精製 |
JP2016503069A (ja) | 2013-01-09 | 2016-02-01 | メセレシス・トランスレイショナル・リサーチ・ソシエタ・アノニマMetheresis Translational Research S.A. | 新規な抗体フラグメント、組成物およびその使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3864050B1 (en) | 2022-11-23 |
EP3864050A1 (en) | 2021-08-18 |
HUE060843T2 (hu) | 2023-04-28 |
WO2020074459A1 (en) | 2020-04-16 |
IL282033A (en) | 2021-05-31 |
IT201800009282A1 (it) | 2020-04-09 |
CA3115582A1 (en) | 2020-04-16 |
RS63960B1 (sr) | 2023-02-28 |
FI3864050T3 (fi) | 2023-03-14 |
EP4194469A1 (en) | 2023-06-14 |
DK3864050T3 (da) | 2023-02-20 |
ES2938714T3 (es) | 2023-04-14 |
SG11202103575RA (en) | 2021-05-28 |
AU2019358417A1 (en) | 2021-05-27 |
KR20210075121A (ko) | 2021-06-22 |
PT3864050T (pt) | 2023-01-18 |
LT3864050T (lt) | 2023-03-27 |
HRP20230154T1 (hr) | 2023-03-31 |
CN113330032A (zh) | 2021-08-31 |
SI3864050T1 (sl) | 2023-03-31 |
AU2019358417A2 (en) | 2021-06-24 |
PL3864050T3 (pl) | 2023-04-11 |
JP2022504392A (ja) | 2022-01-13 |
US20210395372A1 (en) | 2021-12-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7369127B2 (ja) | Tigitに対する単一ドメイン抗体及びその変異体 | |
CN111601826B (zh) | 针对tigit的抗体及其变体 | |
JP7410024B2 (ja) | Pd-l1に対する単一ドメイン抗体とその多様体 | |
JP6033783B2 (ja) | Pan−her抗体組成物 | |
JP7366908B2 (ja) | Pd-1に対する単一ドメイン抗体及びその変異体 | |
JP7383617B2 (ja) | Pd-l1に対する抗体及びそのバリアント | |
KR20160146770A (ko) | 레날리도마이드 또는 포말리도마이드 및 cd38 항체-감쇠 인터페론-알파 구성체의 조합, 및 이의 용도 | |
AU2009255305B2 (en) | Monoclonal antibodies to basic fibroblast growth factor | |
CN115697419A (zh) | 多聚体抗dr5结合分子与癌症疗法组合治疗癌症的用途 | |
JP2023508218A (ja) | 抗ox40抗体およびその使用 | |
TW200948380A (en) | Combination of HGF inhibitor and PTEN agonist to treat cancer | |
JP6382842B2 (ja) | 新規な抗体フラグメント、組成物およびその使用 | |
US20120010388A1 (en) | LeY SPECIFIC BIOTHERAPEUTIC | |
RU2652880C2 (ru) | Антитело против рецептора эпидермального фактора роста | |
JP7371093B2 (ja) | 腫瘍および/または転移の治療のための抗-met fab-fc | |
JP7381555B2 (ja) | 腫瘍および/または転移の治療のための抗-hgfr抗体およびhegfrの組み合わせ | |
JP2022531894A (ja) | がんの処置において使用するための抗dr5抗体の組み合わせの投与レジメン | |
TW202417483A (zh) | 結合nkg2d、cd16及ceacam5之蛋白質 | |
TW202317629A (zh) | 抗ox40單株抗體及其使用方法 | |
EP3440111A1 (en) | Anti-vegfr-1 antibodies and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210524 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210705 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220428 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220428 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20220509 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220510 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230508 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230929 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231018 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7371093 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |