JP2016503069A - 新規な抗体フラグメント、組成物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
これより添付図面を参照しながら、単に説明を目的とする非限定的な例により本発明を詳細に説明する。
これより、肝細胞増殖因子受容体と特異的に結合することができる抗体フラグメントに関して、非限定的な例により本発明を詳細に説明する。
キメラDN30 Fabの作製ならびにその生化学的および生物学的特性の特徴付け
治療効果の可能性のある他のモノクローナル抗体と同様に、DN30はマウスで作製されたものである。したがって、これを治療目的で直接ヒトに用いることは、マウス分子がヒト抗マウス抗体(HAMA)により認識され、免疫を介して抗体活性が除去されるため、適切ではない。抗体のマウス定常領域をヒト免疫グロブリン由来の配列に置き換えれば(抗体のキメラ化)、HAMA応答を大幅に低下させることができる。現時点では、キメラ化したmAbおよびFabが臨床で用いられている。本発明者らは、古典的な分子生物学的技術を用いてDN30 Fabの重鎖および軽鎖の定常ドメインをヒト免疫グロブリン由来の定常ドメインに置き換えた。つまり、軽鎖定常ドメインを天然のヒト抗体に多くみられるヒトカッパ型ドメインに置き換え、重鎖CH1定常ドメインをヒトIgG1由来の相同ドメインに置き換えた。この組合せは有効である。それは、キメラ化したDN30 Fab(MvDN30)が高い親和性でMetと結合し、Metシェディングを誘導してMet依存性細胞の増殖を阻害するが、この特性は対応するマウス分子のものと重複するからである(図1および図2)。
本発明者らは、MvDN30配列を鋳型として用いて軽鎖および重鎖それぞれの定常ドメインを重複させた(二重定常ドメイン−Fab)。この新規な操作された分子は予測分子量が75kDである。本発明者らは2種類の異なるDCD−Fabを作製した。1つ目の分子では、ヒト定常ドメインを直列に重複させることによりVH−CH1−CH1キメラ重鎖およびVL−CL−CLキメラ軽鎖を生じさせた。2つ目の分子では、末端のドメインを相互に交換することによりVH−CH1−CLキメラ重鎖およびVL−CL−CH1キメラ軽鎖を生じさせた(図3)。これに対応する二量体組換え分子をDCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2と命名した。この新規な分子をコードするcDNAを発現プラスミドにクローン化した後、真核細胞に発現させた。配列のC末端に挿入されたStrepタグにより細胞培養上清からタンパク質を精製した。図4は、分子量の大きさが正確な精製組換え分子の還元性条件下でのSDS−Pageを示している。
精製したDCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2をMet受容体との結合能について特徴付けた。この目的に向けて、本発明者らは固相にMet外部ドメイン、液相にMvDN30、DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2を用いて、ELISAアッセイを実施した。抗strepタグ抗体を用いて結合を明らかにした(図5)。この分析から、3種類のDN30由来の一価分子が同程度の親和性(MvDN30、Kd=0.141±0.03nM;DCD−MvDN30.1、Kd=0.133±0.02nM;DCD−MvDN30.2、Kd=0.130±0.03nM)でMetと結合することがわかった。
本発明者らは、新規なDN30由来分子がMetアゴニスト活性を示すかどうかをMetリン酸化アッセイで試験した。これはA459ヒト肺癌細胞を用いて分析したものであり、急性リガンド刺激に応答したMet活性化を判定する標準的なシステムである。実際、A549細胞は生理学的レベルのMetを発現し、基本条件下では不活性であるが、HGFまたはリガンド模倣分子によって活性化される傾向がある(4、10)。MvDN30、DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2の量を漸増させて細胞を15分間刺激した。このほか、陽性対照として細胞をHGFおよびDN−30 mAbで刺激した。抗リン酸Met抗体を用いたイムノブロッティングによりMet活性化を判定した。図6に示される通り、新規な分子は有意なアゴニスト活性を示さなかった。DCD−MvDN30.1にはアゴニスト活性が全くみられず、MvDN30と区別できなかった。DCD−MvDN30.2は最小限の残留アゴニスト活性を保持していたが、DN30 mAbまたはHGFと比較していずれもごくわずかなものであった。本発明者らはほかにも、Metの下流エフェクターとして作用する分子の活性化を検討した。HGFによる刺激が細胞外シグナル制御キナーゼ1および2(ERK−1およびERK−2)とAKT/タンパク質キナーゼB(AKT)の活性化をともに誘導したのに対して、DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2はMvDN30と同じく、上記シグナル伝達物質のリン酸化状態に影響を及ぼさなかった(図7)。
本発明者らはほかにも、MvDN30由来の新規な分子が受容体シェディングおよびダウンレギュレーションを促進する能力を維持しているかどうかを検討した。A549細胞をDCD−MvDN30.1、DCD−MvDN30.2およびMvDN30とインキュベートした。48時間後、Metの細胞外部分に対するモノクローナル抗体を用いたイムノブロッティングにより、訓化培地中のMet外部ドメインの有無を分析した。このほか、同じ抗体を用いて、細胞溶解物についてMetの細胞内レベルを測定した。この解析から、DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2がともに効率的にMetシェディングを誘導し、Metのダウンレギュレーションを促進することにより、細胞外間隙に可溶性Met外部ドメインが放出され、細胞内のMetレベルが低下することが明らかになった(図8)。したがって、新規なMvDN30由来分子は、MvDN30のように親DN−30 mAbのアンタゴニスト特性とアゴニスト特性が完全に分離した。
本発明者らは、DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2がHGF誘導性のMetリン酸化および下流のシグナル伝達を阻害することができるかどうかを検討した。A549細胞をDCD−MvDN30.1、DCD−MvDN30.2およびMvDN30と24時間インキュベートした後、HGFにより15分間刺激した。抗リン酸Met抗体を用いたイムノブロッティングによりMet活性化を判定した。図9に示される通り、2種類の操作された分子はMvDN30と同じく、効率的にMet受容体をダウンレギュレートし、そのリン酸化のレベルを大幅に低下させた。これによりAKTおよびERK−1、2の活性化が阻害された(図9)。
本発明者らは、DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2がA549細胞の足場依存性増殖を阻害する能力を試験した。細胞をHGFとインキュベートするものとしないものに分けて半固形培地に播き、DCD−MvDN30.1、DCD−MvDN30.2およびMvDN30の単回投与により処置した。2週間後、細胞コロニーを染色し定量化した。このアッセイでも、DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2はMvDN30の場合とほぼ同じようにHGF依存性のコロニー形成を減少させた(図11)。
本発明者らは、DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2の薬物動態特性をMvDN30と比較して検討した。免疫不全マウスに単回用量の上記分子を腹腔内注射により送達した。送達後、様々な時点で処置マウスの末梢血を採取した。血清試料にELISAを実施して被験分子の循環血中濃度を求めた。DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2の方がMvDN30よりも高い循環血中レベルに達した。さらに、両分子とも半減期の増大を示し、循環血中に存在する時間が長くなり、生物学的に利用可能な時間が長くなっている。DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2のクリアランスはMvDN30に比して大幅に改善されており(MVDN30と比較したクリアランスの減少は、DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2がそれぞれ9.6倍および13.7倍である)(図12および表1)。
細胞培養
EBC−1ヒト肺癌細胞およびMKN−45胃癌細胞系をJapanese Collection of Research Bioresources(Osaka、Japan)から入手した。GTL−16ヒト胃癌細胞を記載されている通りにMKN−45細胞から誘導した(11)。他のすべての細胞系をATCC−LGC Standards社(Sesto San Giovanni、Italy)から入手した。DMEMで維持したHs746T細胞系、IMDMで維持したSNU−5以外の全細胞系をRPMIで維持した。細胞培地に10%(SNU−5では20%)ウシ胎仔血清および2mMグルタミンを添加した(培地、血清およびグルタミンはSigma Life Science社(St.Louis、Missouri)製)。
DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2は重鎖と軽鎖とからなる。
DO−24抗Met mAb(4)を用いて、記載されている通りに免疫沈降を実施した(12)。以下の抗体:Metの細胞外部分に位置するドメインを認識する抗ヒトMet mAbクローンDL−21(4);抗リン酸化チロシンmAbクローン4G10 mAb(Millipore、Temecula、California);ならびに抗ホスホMet(Tyr1234/1235)、抗ホスホ−Met(Tyr1349)、抗ホスホAkt(Ser473)、抗Akt、抗ホスホERK(Thr202/Tyr204)および抗ERKポリクローナルAb(Cell Signaling Technology、Beverly、Massachusetts)を用いて、ウエスタンブロッティングを実施した。
固相にMet−Fcキメラを使用したELISA(R&D Systems、Minneapolis、Minnesota)により、液相のFLAG標識組換え抗体の濃度を漸増させてMvDN30、DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2の結合を測定した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗strepTAG II抗体(IBA、Olivette、Missouri)を用いて結合を明らかにした。Prismソフトウェア(Graph Pad Software、San Diego、California)を用いて、データを分析しフィットさせた。Met−FcキメラはヒトIgG由来のFcドメインとMet細胞外部分がインフレームで融合した融合タンパク質である。
記載されている通りに、サブコンフルエントのA549ヒト肺癌細胞を無血清培地で48時間インキュベートした後、示される濃度の組換えHGF(R&D Systems)または精製したDN−30 mAb、MvDN30、DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2により10分間刺激した(13)。刺激後、記載されている通りに直ちに細胞を溶解させ処理した(12)。抗Met抗体(DO−24)により細胞抽出物を免疫沈降させ、SDS−PAGEにより分離し、抗リン酸化チロシン抗体(Millipore)を用いたウエスタンブロッティングにより分析した。同ブロットを抗Met抗体(DL−21)で再検出して、免疫沈降したMetの量を正規化した。
サブコンフルエントのA549単層をPBSで2回洗浄した後、無血清培地中、示される濃度のDN−30 FAbまたはmAbとインキュベートした。48時間後、訓化培地を回収し、細胞をレリム緩衝液で洗浄した。抗Met DL−21 mAbを用いたウエスタンブロッティングにより、全細胞溶解物50μg中および細胞培養上清50μl中のMetタンパク質レベルを測定した。
細胞増殖の分析では、10%FBSを含有する培地の入った96ウェルディッシュに細胞を播いた(1,000細胞/ウェル)。24時間後、培地を、示される濃度のDN30由来の分子と5%FCS抗体を含有する新鮮な培地と交換した。72時間後、CellTiter−Glo luminescent cell viability assay(Promega Corporation、Madison、Wisconsin)を製造業者の指示に従って用いて細胞数を評価した。Multilabel Reader PerkinElmer 2030装置(PerkinElmer Life and Analytical Sciences、Turku、Finland)でChemo−luminescenceを測定した。
成体の免疫不全NOD−SCIDマウス(体重18〜22g、平均20g)にDCD−MvDN30.1、DCD−MvDN30.2またはMvDN30を100μg腹腔内注射した。様々な時間(MvDN30では、送達の10分、20分および30分後、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、10時間、16時間、24時間、48時間後;DCD−MvDN30.1およびDCD−MvDN30.2では、送達の30分後、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、10時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、144時間後)に末梢血を採取した。上の結合アッセイの節に記載したELISAを実施し、様々な精製分子の段階希釈によって得られた標準曲線の直線部分に試料の吸光度値を内挿することによって、治療分子の濃度を評価した。各時点を少なくとも3匹のマウスの平均値とした。
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Claims (21)
- 軽鎖可変ドメインおよび2つの定常ドメインを含む第一のポリペプチドと、重鎖可変ドメインおよび2つの定常ドメインを含む第二のポリペプチドとを含み、2つの定常ドメインが軽鎖定常ドメインであり、2つの定常ドメインが重鎖CH1定常ドメインである、抗体フラグメント。
- 前記軽鎖可変ドメインが、非ヒト軽鎖可変ドメインまたは非ヒト抗体由来の相補性決定領域(CDR)を含むヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインから選択される、請求項1に記載の抗体フラグメント。
- 前記重鎖可変ドメインが、非ヒト重鎖可変ドメインまたは非ヒト抗体由来の相補性決定領域(CDR)を含むヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインから選択される、請求項1または2に記載の抗体フラグメント。
- 前記第一のポリペプチドが軽鎖可変ドメインと2つのヒト軽鎖定常ドメインとを含み、前記軽鎖可変ドメインが1つのヒト軽鎖定常ドメインと融合し、前記2つのヒト軽鎖定常ドメインが互いに融合している、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体フラグメント。
- 前記第二のポリペプチドが重鎖可変ドメインと2つのヒト重鎖定常ドメインとを含み、前記重鎖可変ドメインが1つのヒト重鎖CH1定常ドメインと融合し、前記2つのヒト重鎖CH1定常ドメインが互いに融合している、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体フラグメント。
- 前記第一のポリペプチドが、軽鎖可変ドメインと、1つのヒト軽鎖定常ドメインと、1つのヒト重鎖CH1定常ドメインとを含み、前記軽鎖可変ドメインが前記ヒト軽鎖定常ドメインと融合し、前記ヒト軽鎖定常ドメインが前記ヒト重鎖CH1定常ドメインと融合している、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体フラグメント。
- 前記第二のポリペプチドが、重鎖可変ドメインと、1つのヒト重鎖CH1定常ドメインと、1つのヒト軽鎖定常ドメインとを含み、前記重鎖可変ドメインが前記ヒト重鎖CH1定常ドメインと融合し、前記ヒト重鎖CH1定常ドメインが前記ヒト軽鎖定常ドメインと融合している、請求項1〜3または6のいずれか1項に記載の抗体フラグメント。
- 前記軽鎖定常ドメインがヒトカッパ軽鎖定常ドメインである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体フラグメント。
- 前記重鎖CH1定常ドメインがヒトガンマ重鎖CH1定常ドメインである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体フラグメント。
- 前記重鎖CH1定常ドメインがヒトIgG1由来である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の抗体フラグメント。
- 前記抗体フラグメントが、前記軽鎖可変ドメインと前記重鎖可変ドメインとを含むFab分子よりもin vivoで安定である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体フラグメント。
- 前記抗体フラグメントが肝細胞増殖因子受容体(HGFR)と特異的に結合する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗体フラグメント。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 腫瘍および/または転移が認められる患者の治療に使用する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体フラグメント。
- 前記腫瘍および/または転移が、HGFRのシグナル伝達および/または活性化の調節異常によるものである、請求項14に記載の抗体フラグメント。
- 腫瘍および/または転移、好ましくはHGFRのシグナル伝達および/または活性化の調節異常による腫瘍および/または転移の治療で同時に、別個に、または逐次的に使用する併用製剤として、請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体フラグメントと、HGF阻害薬およびHGFR阻害薬のうちの少なくとも1つとを含有する、製品。
- 前記少なくとも1つの阻害薬が、抗HGF抗体、HGFと競合する組換え分子、小分子HGFR阻害薬、抗HGFR抗体または阻害薬から選択される、請求項16に記載の製品。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体フラグメントをコードする、単離核酸。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体フラグメントをコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む、ベクター。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体フラグメントをコードする核酸を2つ以上含む、組成物。
- 腫瘍および/または転移、好ましくはHGFRのシグナル伝達および/または活性化の調節異常による腫瘍および/または転移が認められる患者の治療に使用する、請求項18に記載の単離核酸、請求項19に記載のベクターまたは請求項20に記載の組成物。
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